M. Červenková, P. Kušnierová, Š. Štěpánková, 1. Abstrakt Práce je věnována problematice matrixových metaloproteináz se zaměřením na matrixové metaloproteinázy 2, 3, 9 a asymetrického dimethylargininu, metodám stanovení těchto enzymů a jejich metabolitů a stanovení jejich referenčních intervalů. Matrixové metaloproteinázy jsou proteolytické enzymy podílející se na štěpení bílkovin extracelulární matrix. Jejich význam je možné spatřovat např. při regeneraci tkání, hojení, zánětu. Asymetrický dimethylarginin vzniká při metabolizaci bílkovin z argininu působením enzymů methyltransferáz. Přirozeně se vyskytuje v lidském organismu a významně brání tvorbě oxidu dusnatého. Volba těchto enzymů a jejich metabolitů vychází z jejich provázanosti s kardiovaskulárními onemocněními, stenózami a in stent restenózami. V případě matrixových metaloproteináz spočívá konkrétní vazba v tom, že zvýšená aktivita právě těchto enzymů a jejich metabolitů byla prokázána uvnitř aterosklerotických plátů v porovnání s hodnotami matrixových metaloproteináz u normální arteriální stěny. Rovněž mechanické poškození koronární artérie vyvolává expresi matrixových metaloproteináz a zvyšuje jejich aktivitu. Pokud se jedná o asymetrický dimethylarginin, ten prostřednictvím nitroxidsyntázy ovlivňuje nejen reaktivitu, ale taktéž strukturu cév. Po poškození endotelu se zvyšuje intracelulární koncentrace asymetrického dimethylargininu v buňkách překrývajících defekt, čímž se snižuje také vazodilatační schopnost těchto buněk. Stupeň poškození endotelové funkce a intracelulární koncentrace asymetrického dimethylargininu přímo souvisí s tloušťkou intimy postižené cévy. Zvyšující se koncentrace asymetrického dimethylargininu odráží zvyšující se riziko aterosklerózy.
2. Teoretická část 2.1 Metaloproteinázy Matrixové metaloproteinázy (MMPs) jsou zinek dependentní enzymy patřící do skupiny proteáz. Jsou secernovány buňkami v neaktivní formě, teprve proteolytickým procesem dochází k jejich aktivaci. Jejich schopnost spočívá v proteolytickém štěpení téměř všech složek extracelulární matrix (ECM). Účastní se v podstatě všech biologických procesů, při kterých dochází k degradaci a remodelaci ECM. Může se jednat jak o procesy fyziologické (hojení ran, angiogeneze a další), tak také procesy patologické (kardiovaskulární onemocnění, nádorová onemocnění a další) [1-4]. Z obecného úhlu pohledu mají MMPs schopnost zcela rozkládat kolagen i většinu ostatních komponent ECM, modifikují rozpustné proteiny, cytokiny, chemokiny a taktéž zajišťují fyziologickou remodelaci ECM [5-8]. Účastní se řady fyziologických procesů, při nichž dochází k degradaci pojivové tkáně, také procesů zánětlivých, degenerativních a maligních spojených se zvýšenou syntézou, degradací nebo porušenou maturací a organizací ECM [8]. Význam MMPs lze spatřovat také v oblasti hojení ran, obnově tkání v návaznosti na jejich poškození (např. infarkt myokardu), při progresi onemocnění, jakými jsou artritida, chronické ulcerace tkání, nadměrné množství tuku v tepnách [2,3,5,9]. MMPs a jejich aktivita jsou regulovány na několika úrovních, transkripční, post-transkripční a posttranslační úrovni. Mimo to jsou regulovány prostřednictvím svých vnitřních inhibitorů, tkáňových metaloproteinázových inhibitorů (TIMPs) a jejich intracelulární a extracelulární lokalizací [10].
úvodem varia
Stanovení referenčních hodnot matrixových metaloproteináz 2, 3, 9 a asymetrického dimethylargininu (bakalářská práce)
2.2 Asymetrický dimethylarginin Asymetrický dimethylarginin (ADMA) vzniká při metabolizaci bílkovin působením enzymů methyltransferáz. Je metabolitem L-argininu. V lidském organismu se vyskytuje přirozeně a v poměrně značném množství. Hromadí se v buněčném cytosolu a z něj je uvolňován do plazmy. Hlavní metabolická degradace probíhá hydrolýzou na dimethylamin a Lcitrulin, reakci katalyzuje enzym dimethylarginin dimethylaminohydroláza. Právě aktivita tohoto enzymu se jeví jako klíčová pro regulaci koncentrace ADMA a tím ovlivnění funkce endotelu (příp. endotelových buněk) [11-13]. ADMA inhibuje nitroxidsyntázu (NOS), čímž nepřímo brzdí produkci oxidu dusnatého (NO), příp. jeho radikálu (NO·), který vzniká dvoustupňovou reakcí z L-argininu působením NOS. Kromě asymetrického dimethylargininu způsobuje inhibici syntézy NO také další derivát L-argininu, a to NG-
33
monomethyl-L-arginin (L-NMMA). Vzhledem k tomu, že koncentrace ADMA v krvi je desetkrát vyšší než koncentrace tohoto druhého derivátu (L-NMMA), je za hlavní inhibitor NOS považován ADMA [11].
úvodem varia
Zvýšená koncentrace ADMA v plazmě je sama o sobě jedním z nejsilnějších ukazatelů rizika kardiovaskulární příhody. Mimo to jsou zvýšené hladiny ADMA v plazmě prokazovány u pacientů s hypercholesterolémií, hypertenzí, chronickým ledvinovým selháním a dalšími poruchami [14,11,12]. 2.3 Spojitost matrixových metaloproteináz a asymetrického dimethylargininu s aterosklerózou, kardiovaskulárním rizikem a stenózou V patogenezi aterosklerózy lze za klíčové elementy považovat dysfunkci endotelu, zánět, dyslipidémii a autoimunitní reakce. MMPs, endopeptidázy s proteolytickou aktivitou, stejně jako TIMPs, byly navrženy na faktory, které přispívají k patogenezi aterosklerózy, přičemž klíčová úloha MMPs v procesu aterogeneze byla potvrzena rovněž studiemi [15]. Uvnitř aterosklerotických plátů byla prokázána zvýšená aktivita několika MMPs (MMP-1, MMP-3, MMP-13) v porovnání s hodnotami MMPs u normální arteriální stěny. Zároveň při těchto procesech dochází ke změně jejich koncentrace v krevním řečišti [8,16]. Úlohu důležitého markeru plní rovněž asymetrický dimethylarginin. Konkrétně ve vztahu k prognóze rizika kardiovaskulárních onemocnění a komplikací, u pacientů s hypercholesterolémií, hypertenzí, chronickým ledvinným selháním a dalšími poruchami. ADMA vzniká při metabolizaci bílkovin. V důsledku toho, že inhibuje nitroxidsyntázu, brzdí produkci oxidu dusnatého. Zvýšená koncentrace ADMA v plazmě také vede k poškození funkce cévního endotelu. Nedostatečné působení NO a dysfunkce endotelu má následně dopad na zvýšené riziko koronárních příhod, vznik aterosklerózy, diabetu, hypertenze, poškození různých orgánů [14,11,12]. Přínos MMPs a ADMA lze spatřovat jak v jejich diagnostické hodnotě, tak také v prognostické [12,17]. Jednou z celé řady oblastí, kde tyto markery sehrávají významnou roli z hlediska své vypovídací schopnosti, jsou tak stenózy a in stent restenózy. Při postižení koronární artérie je jako hlavní revaskularizační technika využívána implantace stentu, přičemž limitující faktor pro její použití představuje právě in stent restenóza [18].
34
3. Experimentální část Cílem této práce bylo vybrat vhodnou populaci pro stanovení referenčních mezí, stanovit koncentrace matrixových metaloproteináz (MMP-2, MMP-3, MMP-9) a asymetrického dimethylargininu.
Do studie bylo zahrnuto celkem 180 probandů Krevního centra Fakultní nemocnice Ostrava, kteří byli před odběrem krve seznámeni se záměrem studie a následně podepsali informovaný souhlas. 3.1 Stanovení koncentrace vybraných matrixových metaloproteináz a asymetrického dimetylargininu K analýze prováděné v rámci této práce byla použita imunochemická metoda ELISA. Analyzovány byly vzorky plazmy a séra 180 jedinců, při analýze MMP-2, MMP-3, MMP-9 byla využita plazma, při analýze ADMA sérum. Pro stanovení koncentrace matrixových metaloproteináz a asymetrického dimethylargininu byly použity diagnostické soupravy firmy BioVendor - Laboratorní medicína a.s., Brno, Czech Republic. Ke statistickému zpracování dat a k výpočtu referenčních intervalů sledovaných markerů byly použity statistické programy MedCalc Version 14.12., NCSS 2007 a Cbstat5, R software. Při výpočtu referenčních hodnot byla sledována závislost parametrů na pohlaví a věku [14,19-21]. 3.2 Určení referenčního intervalu Pro zpracování získaných experimentálních dat byla pro určení referenčních intervalů použita přímá (induktivní) metoda. Tato metoda je založena na statistickém zpracování naměřených referenčních hodnot, přičemž získaná data lze vyhodnotit jedním ze dvou postupů – parametrickým nebo neparametrickým. 4. Výsledky, statistické zpracování dat K základním předpokladům o datech patří normalita, nezávislost a homogenita, tzn. nepřítomnost vybočujících měření, odlehlých dat a hrubých chyb. Výpočet referenčních mezí vychází z předpokladu, že data mají symetrické, normální (Gaussovo) rozdělení, data musí vykazovat normalitu a symetrii. Ke statistickému hodnocení dat byly z řady testů normality použity dva, a to momentový test normality, který matematicky hodnotí současně špičatost a šikmost, a D´Agostiniho test, který je zdokonalením momentového testu, je podstatně citlivější a posuzuje výběrové momenty dat. Tab. 1 shrnuje výsledky statistické analýzy. Při výpočtu referenčních mezí byl použit parametrický i neparametrický postup. Získané výsledky jsou shrnuty v tab. 2. 5. Závěr V návaznosti na provedenou analýzu imunochemickou metodou ELISA byly stanoveny referenční intervaly pro předem vybrané enzymy, a to MMP-2, MMP-3 a MMP-9 v plazmě a pro ADMA v séru v závislosti na věku a pohlaví.
Tab. 1 Statistické hodnocení Statistické testy
MMP-2
MMP-3
MMP-9
ADMA
MMP-3 (muži)
MMP-3 (ženy)
Šikmost
Významná
Významná
Špičatost
Významná Nevýznamná Významná Nevýznamná Nevýznamná Nevýznamná
Významná Nevýznamná Nevýznamná Nevýznamná
Testy normality Momentový
Nepřijata
Přijata
Nepřijata
Přijata
Přijata
Přijata
D’Agostiniho
Nepřijata
Přijata
Nepřijata
Přijata
Přijata
Přijata
Pozn. Statistická významnost na hladině α=0.05 Tab. 2 Referenční meze Dolní mez 2,5% kvantil
90% interval spolehlivosti
Horní mez 97,5% kvantil
90% interval spolehlivosti
110,0
97,1-124,1
590,9
520,8-670,0
Parametricky (mocn. transf.)
113,9
93,8-133,9
636,1
536,8-735,4
Neparametricky (Bootstrap)
MMP-3 (µg/l) (n=60) MUŽI
16,99
14,98-19,14
41,09
37,65-44,67
Parametricky (Mocn. transf.)
MMP-3 (µg/l) (n=60) ŽENY
11,71
10,37-13,15
30,06
27,17-33,16
Parametricky (mocn. transf.)
MMP-9 (µg/l) (n=60) MUŽI
34,0
37,6-37,9
135,6
106,1-176,6
Parametricky (mocn.transf.)
MMP-9 (µg/l) (n=60) ŽENY
25,8
22,8-29,4
145,0
104,6-206,3
Parametricky (mocn.transf.)
0,227
0,189-0,267
0,877
0,812-0,945
Parametricky (mocn. transf.)
0,238
0,205-0,272
0,849
0,735-0,963
Neparametricky (bootstrap)
MMP-2 (µg/l) (n=180)
ADMA (µmol/ l) (n=120)
Analýza prokázala, že hodnoty MMP-2 v plazmě nejsou závislé na pohlaví ani na věku. V literatuře nebyla nalezena analogická data pro možnost srovnání výsledků s provedenou analýzou. V případě hodnot MMP-3 v plazmě byla prokázána statisticky významná závislost na pohlaví. Ve srovnání s dostupnými studiemi [22,23] byly v našem souboru prokázány vyšší koncentrace MMP-3 v plazmě. Tato skutečnost může být způsobena použitím odlišných diagnostických souprav. Hodnoty MMP-9 v plazmě vykazovaly nižší koncentraci u žen ve srovnání s muži. Iizasa et al. studoval plazmatickou koncentraci MMP-9 u 138 zdravých dobrovolníků za použití jednokrokové enzymové imunoanalýzy (Fuji Chemical Industries, Toyama, Japan). Stanovili normální hodnoty MMP-9 v plaz-
Typ výpočtu
úvodem varia
Analyt (jednotky, počet)
mě, které byly nižší než námi vypočtené hodnoty. Navíc autoři neuvedli věkový rozsah zdravých dobrovolníků ani blíže nespecifikovali použitý primární materiál, jen uvedli, že se jednalo o plazmu. Další publikované práce prokázaly, že naměřené koncentrace MMP-9, jakož i jiné MMPs v krvi jsou výrazně závislé na postupu odběru vzorků a na typu antikoagulačního činidla [24-26]. Takové rozdíly v metodice by mohly být základem pozorovaných rozdílů mezi výsledky těchto studií. Analýzou ADMA v séru bylo zjištěno, že jeho koncentrace není závislá na pohlaví ani na věku. Ve srovnání s publikovanými daty [27,28] Ekim et al., Celik et al., dosáhly koncentrace ADMA v rámci provedené analýzy vyšších hodnot. Rozdíly mohou plynout z použití odlišných diagnostických souprav.
35
úvodem varia 36
6. Použitá literatura 1. Gerlach R. F., Demacq C., Jung K., Tanus-Santos J. E. Rapid separation of serum does not avoid artificially higher matrix metalloproteinase (MMP)-9 levels in serum versus plasma, Clinical Biochemistry, 2007, 40, s. 119-123. 2. Nagase H., Visse R., Murphy G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs, Cardiovascular Research, 2006, 69, s. 562-573. 3. URL:
[cit. 2014-03-05] 4. Brinckerhoff C. E., Matrisian L. M. Matrix metalloproteinases: a tail of a frog that became a prince, Nature reviews. Molecular cell biology, 2002, 3(3), s. 207-214. 5. Roy R., Yang J., Moses M. A. Matrix Metalloproteinases As Novel Biomarkers and Potential Therapeutic Targets in Human Cancer, Journal of Clinical Oncology, 2009, 27(31), s. 52875297. 6. Tveita A., Rekvig O. P., Zykova S. N. Glomerular matrix metalloproteinases and their regulators in the pathogenesis of lupus nephritis, Arthritis Research & Therapy, 2008, 10(6):229, DOI: 10.1186/ar2532. 7. Newby A. C. Metalloproteinase Expression in Monocytes and Macrophages and its Relationship to Atherosclerotic Plaque Instability, Arterioscler Thrombosis, and Vascular Biology, 2008, 28, s. 2108-2114. 8. Kukačka J., Zikmundová K., Kotaška K., Halačová M., Vajtr D., Průša R. PAPP-A a matrixové metaloproteinázy 3 a 9 u pacientů se smíšenou dyslipoproteinémií, Klinická biochemie a metabolismus, 2/2007, 15(36), 2, s. 85-88. 9. Malik J., Stulc T., Ceska R. Matrix metalloproteinases in isolated hypercholesterolemia, International Angiology, September 2005, 24(3), s. 300-303. 10. Kandasamy A. D., Chow A. K., Ali M. A. M., Schulz R. Matrix metalloproteinase-2 and myocardial oxidative stress injury: beyond the matrix, Cardiovascular Research, 2010, 85, s. 413-423. 11. Široká R., Racek J., Filipovský J. Asymetrický dimethylarginin (ADMA), Klinická biochemie a metabolismus, 2005, 13(34), 3, s. 131-134. 12. Nový marker kardiovaskulárního rizika: asymetrický dimethylarginin, Medicína odborné fórum lékařů a farmaceutů, 2002, 2, Roč. IX, s. 11. 13. Vargová V., Pytliak M., Mechírová V., Fedačko J. Koncentrácie asymetrického dimethylarginínu
ako marker kardiovaskulárneho rizika, Cardiology, 2008; 17(4), s. 157-161. 14. Product Data Sheet, ADMA ELISA, Cat. No.: REA201/96, BioVendor – Laboratorní medicína a.s. verze 08 260912. 15. Musial K., Zwolińska D. Matrix metalloproteinases (MMP-2,9) and their tissue inhibitors (TIMP-1,2) as novel markers of stress response and atherogenesis in children with chronic kidney disease (CKD) on conservative treatment, Cell Stress and Chaperones, 2011, 16, s. 97-103. 16. Koh K. K., Ahn J. Y., Jin D. K., Han S. H., Kim H. S., Choi I. S., Ahn T. H., Shin E. K., Jeong E.-M. Comparative effects of statin and fibrate on nitric oxide bioactivity and matrix metalloproteinase in hyperlipidemia, International Journal of Cardiology, 2004, 97, s. 239-244. 17. Gerlach R. F., Uzuelli J. A., Souza-Tarla C. D., Tanus-Santos J. E. Effect of anticoagulants on the determination of plasma matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 activities, Analytical Biochemistry, 2005, 344, s. 147-149. 18. Ge J., Shen Ch., Liang Ch., Chen L., Qian J., Chen H. Elevated matrix metalloproteinase expression after stent implantation in associated with restenosis, International Journal of Cardiology, 2006, 112, s. 85-90. 19. Product Data Sheet, Human Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) ELISA, Cat. No.: BBT0459R, BioVendor – Laboratorní medicína a.s., version 51 021112 46. 20. Product Data Sheet, Human Matrix Metalloproteinase-3 (MMP-3) ELISA, Cat. No.: RIM001R, BioVendor – Laboratorní medicína a.s., ENG.001.A. 21. Product Data Sheet, Human Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) ELISA, Cat. No.: RBMS2016/2R, BioVendor – Laboratorní medicína a.s. 22. Ribbens C., Martin y Porras M., Franchimont N., Kaiser M. J., Jaspar J. M., Damas P., Houssiau F. A., Malaise M. G. Increased matrix metalloproteinase-3 serum levels in rheumatic diseases: relationship with synovitis and steroid treatment. Annals of the Rheumatic Diseases, 2002, 61, s. 161-166. 23. Brennan F. M., Browne K. A., Green P. A., Jaspar J. M., Maini R. N., Feldmann M. Reduction of serum matrix metalloproteinase 3 in rheumatoid arthritis patients following anti-tumor necrosis factor-a (cA2) therapy. British Journal of Rheumatology, 1997, 36, s. 643-650.
27. Ekim M., Sekeroglu M. R., Balahoroglu R., Ozkol H., Ekim H. Roles of the oxidative stress and ADMA in the development of deep venous thrombosis. Biochemistry Research International, 2014, Article ID 703128, http://dx.doi. org/10.1155/2014/703128. 28. Celik M., Cerrah S., Arabul M., Akalin A. Relationship of asymmetric dimethylarginine levels to macrovascular disease and inflammation markers in type 2 diabetic patients. Journal of Diabetes Research, 2014, Article ID 139215, http://dx.doi.org/10.1155/2014/139215.
úvodem varia
24. Mannello F. Effects of blood collection methods on gelatin zymography of matrix metalloproteinases. Clinical Chemistry, 2003, 49, s. 339340. 25. Jung K., Meisser A., Bischof P. Blood sampling as critical preanalytical determinant to use circulating MMP and TIMP as surrogate markers for pathological processes. International Journal of Cancer, 2005, 116, s. 1000-1001. 26. Jung K., Gerlach R. F., Tanus-Santos J. E. Preanalytical pitfalls of blood sampling to measure true circulating matrix metalloproteinase 9 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinases. Clinica Chimica Acta, 2006, 373, s. 180-181.
37
