Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Idegtudományi Doktori Iskola NUKLEOTID RECEPTOR KARAKTERIZÁCIÓ PRIMER AGYI KAPILLÁRIS ENDOTHEL SEJTEKEN

Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Idegtudományi Doktori Iskola

NUKLEOTID RECEPTOR KARAKTERIZÁCIÓ PRIMER AGYI KAPILLÁRIS ENDOTHEL SEJTEKEN A SZABADGYÖK TERMELÉS VIZSGÁLATA IN SITU NEURONÁLIS EREDETÛ MITOKONDRIUMOKBAN

Ph.D értekezés dr Sipos Ildikó

Témavezetõ: Prof. Ádám Veronika

Szigorlati bizottság: Prof. Mandl József Prof. Nagy Zoltán Dr Komjáthy Katalin

Opponenesek: Dr Deli Mária Dr Ligeti László

BUDAPEST

2003

TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK.............................................................................................1 RÖVIDÍTÉSEK............................................................................................................4 TUDOMÁNYOS HÁTTÉR ........................................................................................5 I. Az agyi endothelium nukleotid receptorai és a vér-agy gát permeabilitásának ...............................................................................................................5 II. Légzési komplexek gátlása és a következményes szabadgyök keletkezés mérése in situ agyi mitokondriumokban ....................................................................................9 CÉLKITÛZÉSEK ......................................................................................................13 MÓDSZEREK............................................................................................................14 a) Primer patkány agyi kapilláris endothel tenyészet...........................................14 b) Marha korneális endotheliumból származó extracelluláris mátrix készítése...14 c) Patkányfarok kollagénnel borított üveg fedõlemezek készítése. .....................15 d) Intracelluláris [Ca2+] mérés képalkotó fluorimetriás módszerrel.....................15 e) Izolált agyi idegvégzõdés (szinaptoszóma) preparálása. .................................16 f) Mitokondriális légzési komplexek aktivitásának meghatározása.....................16 g) Akonitáz aktivitás mérése................................................................................16 h) Hidrogén peroxid felszabadulás mérése Amplex Red módszerrel. .................17 EREDMÉNYEK.........................................................................................................18 I. Primer patkány agyi kapilláris endothel sejteken végzett kisérletek....................18 A. Primer patkány agyi kapilláris endothel tenyésztés módszerének továbbfejlesztése és adaptálása a fluoreszcens mérési technika követelményeihez 18 B. Nukleotid receptor mintázat farmakológiai karakterizációja primer RBCE sejteken mikrofluorimetriás módszerrel...................................................................22 a) Nukleotid receptor agonisták hatására kialakuló intracelluláris kalcium ...........................................................................................22 b) Farmakológiai bizonyíték a P2Y1 és a P2Y2 nukleotid receptorok együttes jelenlétére primer patkány agyi kapilláris endothel sejteken...............................24 c) A P2Y2 és P2Y4 nukleotid receptor altípusok farmakológiai elkülönítése RBCE sejtekben...................................................................................................26 d) Adenozin receptor karakterizáció agyi kapilláris endothel sejteken................27 e) A nukleotid receptor fenotípus jellemzése RBCE sejteken; az ECM sejtdifferenciációt-génexpressziót segítõ hatásának vizsgálata............................28 II. A légzési komplex gátlás és a reaktív oxigén származékok termelõdése közötti kapcsolat kvantitatív jellemzése izolált agyi idegvégzõdésekben ............................29 a) Mitokondriális légzési komplexek aktivitásának vizsgálata szelektív ......................................................................................29

2

b) A légzési komplex gátlás során bekövetkezõ akonitáz aktivitás csökkenés, mint a reaktív oxigén származékok keletkezésének indikátora ...........................30 c) Kvantitatív összefüggés a légzési lánc gátlás és a reaktív oxigén származékok keletkezése között szinaptoszómákban................................................................32 e) Hidrogén peroxid felszabadulás vizsgálata a komplex I és a komplex III ....................................................................................35 f) A mitokondriális membránpotenciáltól nem függõ ROS termelés rotenon és antimycin hatására................................................................................................36 g) Komplex I és komplex III gátlás hatására bekövetkezõ H2 O2 felszabadulás oligomycin jelenlétében.......................................................................................38 h) A komplex I gátlás hatása az antimycin kiváltotta ROS felszabadulásra........39 MEGBESZÉLÉS........................................................................................................41 I. Nukleotid receptorok farmakológiai karakterizációja primer agyi kapilláris endothel sejteken......................................................................................................41 II. Kvantitatív kapcsolat a légzési lánc gátlás és a reaktív oxigén származékok .....................................................................................................43 ÖSSZEFOGLALÁS...................................................................................................48 SUMMARY................................................................................................................49 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ...................................................................................50 AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ SAJÁT KÖZLEMÉNYEK ..........51 KONGRESSZUSI ABSZTRAKTOK ......................................................................52 HIVATKOZÁSOK.....................................................................................................54

3

RÖVIDÍTÉSEK

BBB

vér-agy gát

ECM

extracelluláris mátrix

RBCEC

patkány agyi kapilláris endothel sejtkultúra

[Ca2+]i

intracelluláris kalcium koncentráció

ROS

reaktív oxigén származékok

ÄØm PGI2

mitokondriális membránpotenciál prosztaciklin

NO

nitrogén monoxid

PLC

foszfolipáz C

PKC

protein kináz C

MAPK

mitogén aktiválta protein kináz

MPP+

1-Methyl-4-Phenylpyridinium

MPTP

N-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin

á,â- meATP

á,â-methylen-ATP

2-MeSATP

2-methylthio-ATP

2-MeSADP

2-methylthio-ADP

PAPS

adenosine 3’-phosphate 5’-phosphosulfate

CPA

N6 – Cyclopentyladenosine

NECA

N ethylcarboxamidoadenosine

CGS 21680

2-p-(2-Carboxyethyl) phenethylamino-5’-N-ethylcarboxamido adenosine

H2 O2

hidrogén peroxid

FCCP

carbonyl cyanide p-(trifluoro-methoxy) phenylhydrazone

DNP

dinitro-phenol

4

TUDOMÁNYOS HÁTTÉR

Disszertációmban két, egymással szorosan nem összefüggõ témát foglaltam össze: i) primer

patkány

agyi

kapilláris

endothel

sejtek

nukleotid

receptorainak

in situ komplex bénítók hatására bekövetkezõ reaktív oxigén származék termelõdés vizsgálatát. E kettõsség abból adódik, hogy munkám kezdetén az agyi kapilláris endothel sejtek tenyésztésének elsajátítása és a tenyészetek karakterizációja volt a cél, azonban hosszútávú célunk az agyi kapilláris endothel sejtek oxidatív stressz iránti érzékenységének és az oxidatív stresszben betöltött szerepének vizsgálata. Ez utóbbi mérések módszertani elõkészítése során egy, a primer agyi endothelnél könnyebben vizsgálható rendszert -izolált idegvégzõdéseket- használtam, azt a preparátumot, amelyrõl

a

munkacsoport

hosszú

évekre

visszanyúlóan

nagy

ismeretekkel

rendelkezik. Ezért a disszertáció második felét az izolált idegvégzõdések vizsgálata során kapott eredmények képezik.

I. Az agyi endothelium

nukleotid receptorai és a vér-agy gát permeabilitásának

in vitro agyi kapilláris endothel preparálási módszer ismert (Joó 1985, Abbott et al. 1992, Joó 1993, Laterra and Goldstein 1993), melyek során a vér-agy gátra (BBB) in vivo

megismeréséhez. A primer patkány agyi kapilláris endothel sejtek (RBCEC) növekedésük során konfluens monolayert alkotnak és a BBB-re in vivo jellemzõ morfológiai és biokémiai tulajdonságokkal bírnak (Audus and Borchardt 1987, Miller et al. 1992). Az RBCE sejteket mûanyag aljzaton növesztve a rendszer kiválóan alkalmas sejtfelszíni receptorok, transzporterek, ioncsatornák mûködésének és az endothelre jellemzõ fehérjék génexpressziójának vizsgálatára, míg a sejteket mikropórusos membránon növesztve az oldott anyagok transzcelluláris transzportja

5

A nukleotid receptorok jelenlétét az endothel sejtek felszínén számos in vivo és in vitro modellen végzett vizsgálat igazolta. A vizsgálatokhoz használt endothel preparátumok különbözõ speciesekbõl és szervekbõl származtak, mint például patkány izolált mezenterális artéria (Ralevic and Burnstock 1996), béka in situ mezenterális artéria (He et al. 1996), humán cotyledon (Ralevic et al. 1997) valamint több jólismert sejtkultúra-típus, mint a marha pulmonáris artériából, mellékvese mikroerekbõl vagy humán köldökvéna endothel (HUVEC) sejtekbõl készített tenyészetek. Az agyi endothelium nukleotid receptoraira vonatkozó ismereteinket in situ piális mikroerein végzett (Olesen 1989), izolált agykérgi mikroerek kanülálásával nyert (Janigro et al. 1996), valamint primer és immortalizált sejtkultúrákon végzett kisérletek gazdagították (Albert et al. 1997, Vigne et al. 1994, Nobles et al. 1995). Az endothel sejtek felszínén található adenozin receptorokat A1 -A3 csoportba soroljuk, míg a nukleotid receptorokat általánosságban P2-vel jelöljük. A P2 család két nagy csoportra oszlik, a P2X és P2Y receptorcsaládokra. Az elõbbiek szerkezetüket

tekintve

ligand-vezérelt

ioncsatornák,

míg

az

utóbbiak

hét

transzmembrán doménnel rendelkezõ, G-fehérjéhez kapcsolt receptorok (Fredholm et al. 1997). A különbözõ nukleotid receptor alcsaládok között farmakológiailag az agonisták hatáserõsségi sorrendje alapján és specifikus antagonisták segítségével tehetünk különbséget. A P2X receptorokról általánosságban elmondható, hogy leginkább ATP-re szenzitívek. A P2Y1 származékaira érzékeny, a P2Y2 és P2Y4

típusú receptorok ATP-re és UTP-re

egyaránt érzékenyek, az utóbbi UTP iránti affinitása valamivel nagyobb (Barnard et al. 1996). Az endothel sejtek felszínén ható nukleotidok lehetnek citoszolikus eredetûek, ekkor a sejtek lízise során vagy transzmembrán transzport útján jutnak az extracelluláris térbe, vagy lehetnek exocitózissal felszabaduló vezikuláris eredetû nukleotidok. Az exocitózissal felszabaduló nukleotidok elsõdleges forrásai a vérlemezkék és a kapilláris fal simaizmait beidegzõ szimpatikus idegvégzõdések, ugyanakkor az endothel sejtek ekto-nukleotidáz aktivitásának köszönhetõen az így felszabaduló nukleotidok gyorsan el is bomlanak. A nukleotidokra specifikus transzmembrán transzporterek nukleotid receptorok által szabályozottak (részletesebben lásd Boarder and Hourani 1998).

6

A vér-agy gátat alkotó agyi kapilláris endothel sejtek barrier funkciójukat az endothel sejtek közötti szoros kapcsolódásnak (zonula occludens, angolul tight junction) köszönhetik. Az agyi endothelium azonban nem teljesen átjárhatatlan, a BBB-en keresztüli

szigorúan

szabályozott

anyagáramlást

az

endothel

sejtek

transzporterek biztosítják (Abbott and Romero 1996, Tamai and Tsui 1996, Grant et al. 1998). Membránreceptorokon keresztül szabályozott pl. a véralvadási faktorok az endotheliumból, az endothelium simaizom tónusra kifejtett hatása (Boarder and Hourani 1998).

1. ábra A simaizom tónust, és ezáltal a vér-agy gát permeabilitását szabályozó nukleotid receptorok az agyi kapilláris endothel sejtek felszínén (Boarder and Hourani 1997 alapján). Receptor-mediált úton a sejtek közötti tight junction-ok számának változtatásával a sejtek permeabilitását is változtatni lehet (Abbott and Revest 1991, Abbott 2000). A

7

sejtfelszíni purin és pirimidin receptorokon keresztül érkezõ szignálok befolyásolják az NO és prosztaciklin felszabadulás mértékét az endotheliumból, és ezen keresztül a kapillárisok simaizom tónusát (Boarder and Hourani 1998) valamint a BBB permeabilitását (Olesen 1989). A nukleotid receptorok természetes ligandjai (ATP, ADP, UTP) hatásukat kifejthetik a luminális (vér felõli) és az abluminális (agy felõli) oldalon egyaránt. A nukleotidok a vérben fõleg vérlemezkékbõl származnak (Boarder and Hourani 1998), míg 1986). található P2Y nukleotid receptorokon hatva szabályozzák az endotheliális NO és prosztaciklin (PGI2 ) szintézist, ezen keresztül antiproliferatív és simaizom relaxáló hatást fejtenek ki (1.ábra). A P2Y receptor aktiválás következtében az endotheliális nitrogén monoxid szintáz aktiválódik, és ezáltal fokozódik a NO termelés. A P2Y1 receptoron közvetített jel a cAMP szint szabályozásán keresztül vezet intracelluláris [Ca2+]i) (Albert et al. 1997), míg a P2Y2 receptor a PLC által aktivált jelátviteli úton keresztül okoz [Ca2+]i emelkedést (Frelin et al. 1993). A PLC hatására bekövetkezõ MAPK út aktivációja a foszfolipáz A2 szint, és következményesen a PGI2 termelés megnövekedéséhez vezet, amely folyamatot az emelkedett [Ca2+]i

2

receptoron közvetített

hatásokat csökkenti, de a P2Y1 hatásokat nem befolyásolja (Purkiss et al. 1994). A különféle nukleotid receptor alcsaládok együttes jelenléte az agyi kapilláris endothel sejtek felszínén azt sugallja, hogy a különbözõ receptorokon közvetített in vivo. A P2Y1 és P2Y2 receptorokon közvetített hatások, mint a NO és a PGI2 használnak. Ugyanakkor a különbözõ G-fehérjékhez kapcsolt jelátviteli utak különbözõ feedback szabályozásra és kontrollra adnak lehetõséget (Boarder and Hourani, 1998). Az agyi endothelen egy adenilát-ciklázt gátló atipikus P2Y1 receptor (Webb et al. 1996, Vigne et al. 1998) és egy részletesen nem azonosított adenilátciklázt serkentõ ATP receptor (Albert et al. 1997) jelenléte felveti a lehetõségét egy még specifikusabb, csak a vér-agy gátra jellemzõ szignáltranszdukciós útnak. Ezek a megfigyelések egyben hozzájárulnak az agyi endothel sejtekben feltételezett másodlagos messengerek közötti cross-talk egyre növekvõ bizonyítékaihoz (Vigne et al. 1994, Nobles and Abbott 1998).

8

II. Légzési komplexek gátlása és a következményes szabadgyök keletkezés mérése in situ agyi mitokondriumokban

a neurodegeneratív betegségek, melyek eltérõ klinikai képpel, genetikai és etiológiai háttérrel bírnak. Napjainkban azonban egyre szélesebb körben nyer bizonyítást, hogy a mitokondriális diszfunkció lehet a neurodegeneratív kórképek kialakulásának egyik közös kóroki tényezõje (részletesebben lásd Beal, 1998). Röviden: a mitokondriális légzési komplexek mûködésének hibája csökkent energiatermeléshez vezet, melynek következtében megnövekszik az intracelluláris kalcium szint, megnõ a proteáz és foszfolipáz aktivitás, valamint a szabadgyök termelés. Ezek a hatások együttesen a hibás mitokondriális komplexet tartalmazó neuronok szelektív pusztulását okozzák. Langston és mtsi. (1983) szolgáltatták az elsõ bizonyítékot arra, hogy mitokondriális funkciózavar állhat a Parkinson-kór kialakulásának hátterében. Leírták, hogy szintetikus kábítószert (MPTP-t) fogyasztó fiatalokban az idiopathiás Parkinsonkórhoz hasonló kórkép alakult ki a kábítószer metabolizmusa során keletkezõ MPP+ hatására. Az MPP+ a komplex I-et gátló mitokondrium méreg, mely különösen a substantia nigra sejtjeiben halmozódik fel, melyek szelektív pusztulása jól ismert Parkinson-kórban. Ezt követõen számos közlemény jelent meg, amely szelektív komplex I aktivitás csökkenésrõl számolt be Parkinson-kóros betegek post mortem agyi preparátumában (Parker et al. 1989, Schapira et al. 1990, Mann et al. 1992). Széles körben használt peszticid a komplex I gátló rotenon, mely rendkívül hidrofób és így specifikus transzporter nélkül is könnyedén átjut a sejtmembránon. A rotenon támadáspontja a komplex I-en a mitokondriális DNS által kódolt ND-1 géntermék (Earley et al. 1987). E fehérje szerkezet a legkonzervatívabb a mitokondriális DNS által kódolt fehérjék közül, ami arra utal, hogy a komplex I mûködésében alapvetõ szerepet játszik (Attardi 1985). Patkányokban a szisztémásan adott rotenon hatására az agy egész területén komplex I gátlás alakult ki, ugyanakkor szelektív nigrostriatális dopaminerg neuron pusztulás, és a Lewy testekhez hasonló citoplazmatikus inklúziós testek megjelenése volt megfigyelhetõ a dopaminerg neuronok citoplazmájában (Betarbet et al. 2000). Az irodalomból ismert, hogy rotenon adagolásra az izolált agyi mitokondriumok megnövekedett reaktív oxigén származék (ROS) képzõdéssel reagálnak (Votyakova and Reynolds 2001, Liu et al. 2002). Parkinson-kórban a

9

substantia nigra sejtjei különösen érzékenyek lehetnek a szabadgyökökre, hiszen nagy mennyiségben tartalmaznak szabad vasat, mely a Fenton-reakcióban további szabadgyök képzõdés forrása lehet. A komplex I gátlás az oxidatív foszforiláció gátlását is erdeményezi; a komplex I 25%-os gátlása már szignifikáns csökkenést mutatott az ATP szintézisben és az oxigénfogyasztásban, mely bioenergetikai deficit sejtpusztuláshoz vezethet (Davey et al. 1996). Ugyanakkor Parkinson-kóros betegekben a mitokondriális komplex I gátlás megnövekedett szabadgyök képzõdéssel járt együtt, és apoptotikus sejthalálhoz vezetett (Swerdlow et al. 1996). Azt, hogy a szabadgyök képzõdés oka vagy következménye a mitokondriális károsodásnak nem tudjuk, de egyre több bizonyítékkal rendelkezünk arról, hogy a ROS keletkezés fontos tényezõ a Parkinsonkór etiológiájában. A sejtekben a mitokondriumok fiziológiás mûködése során is keletkeznek reaktív oxigén származékok (Lochen et al. 1971, Boveris et al. 1972). ROS termelésre termodinamikailag mind a négy légzési komplex képes, de izolált mitokondriumon végzett kutatások kimutatták, hogy a komplex I és a komplex III a ROS keletkezés kiemelt helyei a mitokondriumban (Boveris et al. 1976, Turrens and Boveris 1980, Votyakova and Reynolds 2001). Újabb közlemények azonban vitatják a komplex III pathológiás ROS termelésben betöltött szerepét (Liu et al. 2002). Izolált mitokondriumon végzett kisérletek azt bizonyították, hogy a mitokondriális ROS termelés függ az alkalmazott légzési szubsztrát fajtájától. A szukcináttal lélegeztetett mitokondrium ROS termelése jelentõs (Votyakova and Reynolds 2001, Cadenas et al. 1977, Liu et al. 2002), azonban a ROS képzõdés a komplex I inhibitor rotenon jelenlétében lecsökkent (Votyakova and Reynolds 2001, Liu et al. 2002, Korshunov et al. 1997, Hansford et al. 1997). A glutamát/maláttal lélegeztetett mitokondriumok esetén mind a rotenon, mind a komplex III inhibitor antimycin stimulálta a ROS képzõdést (Starkov et al. 2002, Votyakova and Reynolds 2001). Arról azonban, hogy a mitokondriális membránpotenciál ( ÄØm) változás miként befolyásolja a ROS termelést ellentmondó erdemények jelentek meg. Annak tekintetében,

hogy

szukcináttal

lélegeztetett

izolált

mitokondriumokban

a

depolarizáció hatására csökken a H2 O2 termelés egységes a vélemény (Votyakova and Reynolds 2001, Korshunov et al. 1997, Hansford et al. 1997), a glutamát/maláttal ÄØ

m

10

ellentmondó publikációk jelentek meg. Votyakova and Reynolds (2001) közlése szerint a protonofór FCCP okozta depolarizáció nem okozott változást a 2O2

termelésben, mig Starkov et al. (2002) közleményében az FCCP

okozta ÄØm változástól függött a H2 O2 lélegeztetett izolált mitokondriumokban. A különbözõ légzési komplex gátlók in situ mitokondriumok ÄØm-jára kifejtett hatása igen eltérõ. A rotenon okozta komplex I gátlás nem befolyásolta a mitokondriális membránpotenciált szinaptoszómákban, a komplex III

antimycin okozta gátlása

közben azonban jelentõs depolarizáció volt megfigyelhetõ (Chinopoulos et al. 1999). Számos neurodegeneratív betegség kialakulásában feltételezhetõ a mitokondriális légzési komplexek mûködészavara, és ehhez kapcsolódóan az oxidatív károsodás kóroki szerepe. Komplex I károsodást mutattak ki Parkinson-kór esetén (Schapira et al. 1990), Huntington-kórban a komplex II-III hibáját feltételezik (Beal 1998), és egyre több bizonyíték áll rendelkezésünkre a komplex IV károsodás Alzheimer-kór kialakulásában betöltött szerepérõl (Kish et al. 1992, Mutisya et al. 1994, Parker et al. 1994). Nagyon keveset tudunk azonban arról, hogy milyen mértékû légzési komplex gátlást viselnek el a sejtek anélkül, hogy megnövekedett ROS képzõdés és ennek következtében sejtkárosodás alakulna ki. A ROS termelõdés detektálásának sokféle módszere ismert, ezek egyike a citrátköri akonitáz aktivitásának mérése. Az akonitáz rendkívül érzékeny a szuperoxidra (Gardner et al. 1995), ezért számos kisérletben használták a szuperoxid keletkezés intracelluláris indikátoraként, bizonyítván a szuperoxid keletkezés szerepét az excitotoxikus sejthalál kialakulásában (Patel et al. 1996, Liang et al. 2000, Li et al. 2001). Az enzim érzékeny szenzora a peroxinitritnek is (Andersson et al. 1998), és az extracellulárisan adott hidrogén peroxid (H2 O2 mérve ugyancsak az akonitáz bizonyult a legérzékenyebbnek a Krebs-ciklus enzimei közül (Tretter and Adam-Vizi 2000). A mitokondriális légzési lánc mûködése során keletkezõ szuperoxid a mitokondriális szuperoxid dizmutáz hatására nagyon gyorsan H2 O2-dá alakul (Forman and Azzi, 1997). Mivel a H2 O2 könnyedén átjut a sejtmembránon, ezért a H2 O2 felszabadulás mértékét a mitokondriális szuperoxid termelés jó indikátorának tekinthetjük (Lochen et al. 1973). Az Amplex Red reagens rendkívül érzékeny a H2 O2 -ra, amellyel sztöchiometrikusan 1:1 arányban reagál, s a reakció során termelõdõ színes termék

11

mennyisége fotometrálással meghatározható (Mohanty et al. 1997). Azonban az extracellulárisan alkalmazott Amplex Reddel csak a H2 O2 felszabadulás mértékére tudunk következtetni, hiszen a mitokondriumokban képzõdõ H2 O2 egy részét a sejtekben mûködõ peroxid elimináló mechanizmusok semlegesítik. Az irodalmi adatok arra utalnak, hogy a neurodegeneratív betegségek kialakulásának hátterében feltételezhetõ

a közös mitokondriális eredet. Ezek az eredmények

fordították figyelmünket a mitokondriális légzési komplex gátlás és a ROS keletkezés közötti

összefüggések

alaposabb

vizsgálatára

in

situ

neuronális eredetû

mitokondriumokban. Az in situ mitokondriumok vizsgálata azért fontos, mert ilyenkor a mitokondriumokat -szemben az izolált mitokondriumokkal, amelyek kivülrõl hozzáadott szubsztráttal mûködnek és számos funkciójuk a szubsztrát fajtájától függ - a fiziológiás citoplazmatikus közeg veszi körül. Így a légzési szubsztrátok a fiziológiásnak megfelelõen a glukóz oxidációja során keletkeznek, és a mitokondriumban illteve a környezetükben mûködnek a szabadgyököket elimináló mechanizmusok.

mitokondriális membránpotenciál változás és a ROS keletkezés között. A kisérleteket szinaptoszóma preparátumokon végeztük, ami azért kiemelendõ, mert számos neurodegeneratív betegségben a neurodegeneráció az axon terminálisban kezdõdik (Betarbet et al. 2000). Ezen túlmenõen, az izolált mitokondriumok vizsgálata során is eltérõ érzékenységet mutattak az egész agyból, illetve a szinaptoszómából preparált mitokondriumok a légzési komplex gátlás és ennek következményei tekintetében (Davey and Clark 1996, Davey et al. 1998).

12

CÉLKITÛZÉSEK

Munkánk során a következõ célokat kívántuk megvalósítani:

1. Primer agyi kapilláris endothel tenyésztés módszerének tovább adaptálása a fluoreszcens mérési technika követelményeinek megfelelõen úgy, hogy a sejtkultúra tisztasága és növekedésének sebessége ne változzon.

2. Biológiai mátrixon tenyésztett agyi kapilláris endothel sejtek purinerg receptorainak

farmakológiai

karakterizálása

képalkotó

fluorimetriás

3. In situ mitokondriális légzési komplexek aktivitásának vizsgálata gátlószereik jelenlétében izolált agyi idegvégzõdésekben (szinaptoszómákban).

4. Mitokondriális légzési komplex gátlók szabadgyök képzõdést elõsegítõ hatásának vizsgálata in situ az akonitáz enzim aktivitásának mérésével.

5. felszabadulás vizsgálata fluorimetriás módszerrel szinaptoszómákban.

6. Légzési lánc gátlás során bekövetkezõ szabadgyök termelés vizsgálata a membránpotenciál függvényében szinaptoszómákban.

13

MÓDSZEREK

a) Primer patkány agyi kapilláris endothel tenyészet. A sejttenyésztés során a Semmelweis Egyetem etikai kódexének állatkisérletekre vonatkozó utasításainak megfelelõen jártunk el. A kb. 300 grammos hím Wistar patkányokat dekapitáltuk és a patkányok agyából primer endothel kultúrát készítettünk az Abbott és mtsi. (1992) által leírtak alapján. Ez összefoglalva a következõ: a fehérállományt eltávolítottuk, a szürkeállományból homogenizálás és centrifugálási lépések után mikroér darabokat nyertünk. 3 órás kollagenáz/diszpázos emésztést

követõen

Percoll

grádiens

centrifugálással

izoláltuk

a

kapilláris

fragmentumokat, melyeket ezután extracelluláris mátrixszal elõzetesen bevont (ld. alább) üveglemezekre ültettünk ki. Kisérleteinket 6-9 napos, konfluens agyi endothel sejttenyészeteken végeztük. A sejtek endotheliális eredetét immuncitokémiai módszerrel (von Willebrand faktor pozitivitás) bizonyítottuk. A tenyésztõ médium 20% marha szérumot tartalmazó

standard Dulbecco’s modified Eagle’s médium

(DMEM) oldatból készült a következõ anyagok hozzáadásával: 75 µg ml-1 endotheliális növekedési faktor, 100 i.u. ml-1 penicillin / 100 µg ml-1 streptomycin, 2 mM glutamin, 80 µg ml-1 glutation, inzulin, transzferrin és szelén.

b) Marha korneális endotheliumból származó extracelluláris mátrix készítése. A módszer kisebb módosításokkal (ld. részletesebben Dömötör et al., 1998) a Gospodarowicz által leírtakon (1984) alapul. Összefoglalva: a vágóhídról beszerzett friss marhaszemek korneájából primer korneális endothel tenyészetet készítettünk, amelyet 3-4 passage után végül steril üveg fedõlemezekre ültettünk ki. Az elõzetesen 70%-os ethanolban ázó üveg fedõlemezeket nyílt láng felett sterilizáltuk. Miután a korneális endothel sejtek konfluenssé váltak, a sejteket 20mM NH4 OH segítségével denudáltuk. Az így visszamaradó sértetlen extracelluláris mátrixszal bevont lemezek ezután 3-6 hónapig eltarthatók steril izotóniás sóoldatban 4 ºC-on.

14

A steril üveg fedõlemezeket 0.4 mg/ml koncentrációjú patkányfarok kollagénnel (Sigma) vontuk be, majd a lemezeket egy órán át szárítottuk a steril fülkében, végül 10 perig ammóniagõzben fixáltuk a kollagént az fedõlemezekre. Az RBCE sejtek kiültetése elõtt a lemezeket háromszor mostuk izotóniás sóoldattal.

d) Intracelluláris [Ca 2+] mérés képalkotó fluorimetriás módszerrel. A [Ca2+]i méréshez az endothel sejteket kalcium szenzitív festékkel (Fura-2 AM, 6 µM, 1 h, 37 ºC) töltöttük fel. Ezután a fedõlemezeket áthelyeztük az inverz Nikon Diaphot 200 mikroszkópra helyezett fûtött (37 ºC) perfúziós kamrába, majd a kisérleteket megelõzõen 10 percig normál HEPES pufferral perfundáltuk a sejteket. A különféle perfúziós oldatokat a kisérletek során a sejtek közelébe helyezett üvegkapillárison keresztül juttattuk a perfúziós kamrába (0.5 mm kapilláris átmérõ, 10 µl s-1 perfúziós ráta);

ºC-on tartottuk.

A [Ca2+]i szignálokat képalkotó fluorimetriás mikroszkóp (Fluor 40/1.3 objektív, Nikon) segítségével mértük, a digitális képet CCD kamera (Princeton Instruments) és Metafluor software (Universal Imaging Corp.) felhasználásával nyertük. A mérések során polikromátorral (Visitron GmbH, Germany) elõállított 340 és 380 nm excitációs hullámhosszakat használtunk, a fluoreszcens emissziót 510 nm-en mértük, a fluoreszcens képeket 2 másodperces gyakorisággal vettük fel. legalább három különbözõ lemezen mért adatok átlagát jelentik, egy látómezõben átlagosan 20-40 sejt volt látható. A [Ca2+]i nagyságát a fluoreszcens ratio-ból a Grynkiewicz et al. (1985) által közölt egyenlet alapján számoltuk. Az egyenletben max )

és a minimum (Rmin ) ratio értékét, valamint 380 nm-en a

2+

szabad festék és a Ca -kötött festék arányát (Sf2/Sb2 ) az in vitro kalibráció során határoztuk meg.

15

Az eljárás során a Semmelweis Egyetem etikai kódexének állatkisérletekre vonatkozó utasításainak megfelelõen jártunk el. A tengerimalacokat dekapitáltuk, majd az állatok agykérgébõl szinaptoszómát készítettünk, a módszert lásd részletesebben Chinopoulos and Adam-Vizi (2001).

A 20 mg/ml protein tartalmú szinaptoszómát 0.32 M

szukrózban szuszpendáltuk fel, ezután a törzsoldatot jégen tartva abból mintákat vettünk ki a további kisérletekhez. A standard inkubáló médium összetétele

a

következõ volt (mM): 140 NaCl, 3 KCl, 2 MgCl2 , 2 CaCl2 , 10 PIPES, 10 glukóz, pH 7.38.

f) Mitokondriális légzési komplexek aktivitásának meghatározása. Az 1 mg proteint tartalmazó szinaptoszóma mintákat 20 percig 37ºC-on 1 ml standard médiumban inkubáltuk (összetételét lásd az e. pontban) különbözõ koncentrációjú légzési komplex gátlók (rotenon, antimycin vagy cianid) jelenlétében. A mintákból háromszori gyors fagyasztás / kiolvasztás után 200 µl-t áttettünk a mérõmédiumba (2 ml). A kisérletek során az abszorbancia változásokat GBC UV/VIS 920 spektrofotométeren követtük. A komplex I aktivitás meghatározásánál a Ragan et al. (1987) által leírt módszert követtük; a NADH oxidációt 340 nm-en mértük az elektron akceptor koenzim Q1 jelenlétében. A komplex III aktivitás mérését Rieske (1967) módszerével végeztük; a redukált koenzim Q2 oxidációját mértük 550 nm-en, az elekton akceptor a citokróm c volt. A komplex IV aktivitás mérése során a citokróm c oxidációját mértük 550 nm-en a Wharton and Tzagoloff (1967) által leírt módon.

Az akonitáz aktivitás meghatározásánál a Hausladen and Fridovich (1996) által közölt A mérõmédiumba (2 ml) szinaptoszóma aliquotokat (200 ìg protein) tettünk, amelyeket elõzõleg különbözõ légzési lánc gálókkal együtt 20 percig 37 ºC-on inkubáltunk. A mérõelegy összetétele a következõ volt: 50 mM Tris-HCl, 0.6 mM MnCl2 , 30 mM nátrium-citrát, 0.2 % Triton X-100, 2 U/ml izocitrát dehidrogenáz (NADP +

+

16

hozzáadásával indítottuk, a fluoreszcens intenzitást 344 nm-es excitációs és 460 nmes

emissziós

hullámhosszakon A

NADPH

mértük koncentráció

PTI

Deltascan

változását

fluoreszcens

kalibrációs

görbe

h) Hidrogén peroxid felszabadulás mérése Amplex Red módszerrel. A H2 O2 felszabadulás meghatározáshoz Amplex Red Hydrogen Peroxide Assay Kit-et (Molecular Probes) használtunk. Torma-peroxidáz jelenlétében az Amplex Red reagens 1:1 sztöchiometriai arányban reagál a H2 O2 -dal, miközben fluoreszcens rezorcin képzõdik (Mohanty et al., 1997). Miután a szinaptoszómát (1 mg/ml) különbözõ koncentrációjú rotenon ill. antimycin jelenlétében 20 percig inkubáltuk, 100 µl mintát hozzáadtunk 100 µl Amplex Red reakcióelegyhez és a H2 O2 képzõdést Wallac Victor 2 mikroplate fluoriméterrel követtük 25 ºC-on. hullámhossz 560 nm volt, a fluoreszcens emissziót 590 nm-en mértük. Az egyes 2 O 2-dal.

17

EREDMÉNYEK

I. Primer patkány agyi kapilláris endothel sejteken végzett kisérletek

A. Primer patkány agyi kapilláris endothel tenyésztés módszerének továbbfejlesztése és adaptálása a fluoreszcens mérési technika követelményeihez

Az RBCEC tenyésztés során általánosan alkalmazott I típusú kollagénnel bevont mûanyag aljzat olyan nagy háttér fluoreszcenciával bírt, amely intracelluláris kalcium méréseink során elfedte a biológiai szignált. Ezért az Abbott és mtsi. (1992) által kifejlesztett sejttenyésztési módszert továbbfejlesztettük a képalkotó fluorimetriás mérések követelményeinek megfelelõen (Dömötör et al. 1998). A sejteket extracelluláris biológiai mátrixszal (ECM) bevont üveglemezen tenyésztettük (Gospodarowicz 1984), ezáltal a háttér fluoreszcencia jelentõsen csökkent. Így a sejttenyészet alkalmassá vált mikrofluorimetriás vizsgálatokra, pl. Fura-2 kalcium szenzitív festékkel végzett intracelluláris kalcium mérésre. Ugyanakkor meg kellett bizonyosodnuk arról, hogy az új sejttenyésztési technika során a primer RBCEC tenyészet megõrizte tisztaságát, morfológiai tulajdonságai nem változtak, és növekedésének sebessége sem csökkent. Ezért a sejteket négy különbözõ aljzatra ültettük ki (ECM-mel bevont mûanyag és üveglemez, kollagénnel borított mûanyag és üveg aljzat), az üveglemez kollagénes bevonásakor karbodiimides kezelést alkalmaztunk, mely elõsegítette a kollagén jobb letapadását az üvegre (Nobles and Abbott 1996). Ezután összehasonlítottuk a párhuzamos RBCE tenyészetekben a kapillárisok letapadási készségét valamint az endothel sejtek növekedésének

Bár az RBCE sejtek mind a négy felszínen idõvel összefüggõ monolayert alkottak, a kapilláris fragmentek kitapadásának valószínûsége és a sejtek növekedésének üteme jelentõs eltérést mutatott (2. ábra).

18

kiültetett kapilláris fragmentumok és az azokból kinövõ endothel sejtek láthatók 150x-es nagyításban.

A legtöbb kapilláris darabka az ECM-mel bevont üveglemez felszínén horgonyzódott ki és az endothel sejtek növekedésének üteme is itt volt a leggyorsabb. Ugyanakkor a háttér fluoreszcencia mértéke 5-20x kisebb volt, mint a mûanyag aljzat alkalmazásakor.

19

A továbbiakban immunocitokémiai vizsgálattal bizonyítottuk az ECM-mel bevont üveglemezen tenyésztett sejtek endothel eredetét, elektronmikroszkópos vizsgálattal kimutattuk az agyi kapilláris endothelre jellemzõ kapcsoló struktúrák (tight junction) jelenlétét.

a

b

3. ábra RBCE sejtek (a) fénymikroszkópos és (b) elektronmikroszkópos képe a tenyésztés hetedik napján.

20

Az ECM-mel bevont üvegfelszínen tenyésztett sejtek (3./a ábra, 150x nagyítás) az immuncitokémiai festés során az endothelre jellemzõ von Willebrand faktor pozitivitást mutattak. Az elektronmikroszkópos felvételen két egymáshoz szorosan kapcsolódó

endothel

sejt

látható,

a

nyilak

a

tight

junction-ra

jellemzõ

membránkapcsolódásokra mutatnak. A sejtekben (m) mitokondriumok és (* ) kiterjedt

21

B. Nukleotid receptor mintázat farmakológiai karakterizációja primer RBCE sejteken

Mivel az agyi kapilláris endothelium nukleotid receptoraira vonatkozó ismereteink fõleg endothel sejtvonalakból származnak (Nobles et al. 1995, Feolde et al. 1995, Vigne et al. 1998), amelyekben a receptor mintázat sok tekintetben eltérhet a fiziológiásan jellemzõ receptor mintázattól. Ezért munkánkban az elõzõekben bemutatott biológiai mátrixon növesztett primer patkány agyi kapilláris endothel sejtek nukleotid receptor karakterizációját végeztük el. A primer sejtkultúrák, fenntartásokkal bár, de a fiziológiáshoz leginkább közelálló rendszereknek tekinthetõk. a) Nukleotid receptor agonisták hatására kialakuló intracelluláris kalcium

Az ioncsatorna P2X család extracelluláris kalciumot enged be a sejtekbe, a P2X receptor

agonisták

hatáserõsségi

sorrendje

általában

a

következõ:

α,β-

meATP>ATP>2MeSATP ~ADP (Abbracchio and Burnstock 1994). Primer RBCE sejtekben a P2X agonista á,â-meATP hatására nem következett be [Ca2+]i változás, és az ATP kiváltotta [Ca2+]i emelkedést a külsõ kalcium jelenléte nem befolyásolta (Dömötör et al. 1999). A P2X/P2Y agonista 2-MeSATP kiváltotta [Ca2+]i szignál nagysága és alakja az extracelluláris kalcium megvonás hatására nem változott (4./a ábra). A továbbiakban a P2Y nukleotid receptorok karakterizációjához az RBCE sejteket ATP-vel és több más nukleotid receptor agonistával kezeltük. Az 2+

]i

emelkedések

nagyságát

összehasonlítva

megállapítottuk a nukleotidok hatáserõsségi sorrendjét (4./b ábra). Az UTP kiváltotta [Ca2+]i

jel nagysága kissé nagyobb volt

(ÄR=0.82±0.017 és

ÄR=0.74±0.018, p<0.05, (ÄR= fluoreszcens ratio v áltozás)). A 2-MeSATP okozta kalcium jel (ÄR=0.69±0.04) kisebb volt mint az ATP kiváltotta, de nem volt közöttük szignifikáns különbség. Az ADP-re és adenozinra bekövetkezõ [Ca2+]i

változás

(ÄR=0.39±0.04 és ÄR=0.19±0.05, p<0.05) szignifikánsan kisebb volt, mint az ATP okozta [Ca2+]i emelkedés. A P2Y1 agonista 2-MeSADP kiváltotta [Ca2+]i szignál (ÄR=0.36±0.02) szignifikánsan kisebb volt mint az ATP jel, de nem különbözött az ADP okozta [Ca2+]i változástól.

22

a 700

standard médium Ca2+-mentes médium

600

[Ca2+]i nM

500

400

300

200

100

2-MeSATP 2-MeSATP 0 0

10

20

30

40

50

60

idõ (sec)

b 1.6

UTP

Fluoreszcens ratio

1.4

ATP 1.2

2-MeSATP

1.0

ADP

2-MeSADP

0.8

Ade 0.6

0.4

0.2

50 sec

4. ábra (a) 2-MeSATP kiváltotta [Ca2+]i szignál RBCE sejtekben. A 2-MeSATP (100 ìM, 8s) által kiváltott [Ca 2+]i jel nagysága Ca2+-os (standard) és Ca2+-mentes médiumban nem különbözött szignifikánsan egymástól (454 ± 25.2 nM, n=37, versus 442 ± 27.5 nM, n=36). (b) Az agonisták által okozott [Ca2+] i változás reprezentatív átlaggörbéi RBCE sejtekben. Az µM koncentrációban 8 szekundumon át alkalmaztuk, minden kisérletet friss, még stimulálatlan mintán végeztünk. (n= a vizsgált sejtek száma; ATP (n=140), UTP (n=147), 2-MeSATP (n=90), 2MeSADP (n=50), ADP (n=60), adenozin (Ade) (n=50)).

23

b) Farmakológiai bizonyíték a P2Y1 és a P2Y2 nukleotid receptorok együttes jelenlétére primer patkány agyi kapilláris endothel sejteken Vigne és mtsi. (1989) B7 patkány agyi endothelium eredetû sejtvonalon kimutatták a P2Y receptor család két altípusát, az ATP-re és UTP-re egyformán szenzitív P2Y2 altípust, és a P2Y1 MeSATP>ADP>ATP volt. A 4./b ábrán jól látható, hogy primer kapilláris endothel sejtekben az ATP és az UTP közel azonos nagyságú [Ca2+]i emelkedést okozott. Kisérleteinkben ATP-vel [Ca2+]i emelkedést váltottunk ki az RBCE sejtekben, majd a jel lecsengése után ATP folyamatos jelenlétében UTP-t (5./a ábra) vagy

2-MeSATP-t (5./b ábra) adtunk a sejtekhez. Az 5.

kisérletekben bizonyítottuk, hogy az ATP és az UTP közös receptoron hat, míg a 2MeSATP kiváltotta szignál ettõl eltérõ eredetû. ATP folyamatos jelenlétében az UTP kiváltotta [Ca2+]i jel elhanyagolható volt (5./a ábra), míg a 2-MeSATP-re adott [Ca2+]i szignál változatlan maradt (5./b ábra). ATP és UTP együttes alkalmazásakor az endothel sejtekben a [Ca2+]i

emelkedés nem különbözött attól, mint amikor az

agonistákat önmagukban alkalmaztuk. Ezzel szemben ATP-t és 2-MeSATP-t együttesen adva a [Ca2+]i jel összeadódott (5./c ábra). a

b

1000

2-MeSATP

800

800

600

[Ca 2+ ]i nM

[Ca2+ ]i nM

1000

UTP

400

600

400

200

200 ATP

0

0 0

40

80 120 idõ (sec)

160

200

ATP

0

40

80

120 idõ (sec)

5. ábra A kereszt-deszenzitizáció jelensége, mint bizonyíték a P2Y1 és P2Y2 nukleotid receptor altípusok együttes jelenlétére RBCE sejtekben. Az µM koncentrációban, 8 szekundumon át alkalmaztuk minden kisérletnél. Az (a) és (b) ábra két reprezentatív on line mérést mutat be.

24

160

200

c 800

[Ca 2+ ]i emelkedés (nM)

700 600 500 400 300 2MeSATP

UTP

ATP

200

ATP + UTP

2MeSATP + ATP

100 0

5. ábra 2+ (c) ]i emelkedés átlaga ± standard error látható (ATP n=140, UTP n=50, 2-MeSATP n=90, ATP+UTP n=40, ATP+2-MeSATP n=50).

Az adenozin 3’-foszfát 5’-foszfoszulfát (PAPS) a P2Y1 receptorok szelektív antagonistája (Bültmann et al., 1998). PAPS jelenlétében a P2Y1 receptor agonista 2-MeSADP nem okozott [Ca2+]i változást az RBCE sejtekben (6. ábra), ezzel további bizonyítékot szolgáltatott a P2Y1 és P2Y2 altípus együttes jelenlétére az agyi kapilláris endothel sejtekben. b

350

350

300

300

250

250

[Ca 2+ ]i nM

[Ca 2+ ] i nM

a

200 150 100

150 100

2-MeSADP

2-MeSADP

200

2-MeSADP

50

2-MeSADP+PAPS

50

0

0 0

20

40

60

80

100

120

140

idõ (sec)

0

20

40

60

80

idõ (sec)

6. ábra P2Y1 receptor agonista és antagonista együttes hatása primer RBCE sejtek [Ca2+]i [Ca2+]i emelkedés (n=37). (b) A 2-MeSADP (100 µM) kiváltotta [Ca2+]i jel, ) 2+ ]i jel összehasonlítása (n=35).

25

100

c) A P2Y2 és P2Y4 nukleotid receptor altípusok farmakológiai elkülönítése RBCE sejtekben Mivel a klónozott P2Y2 és P2Y4 receptorok egyformán szenzitívek ATP-re és UTP-re is (King et al., 1998), ezért további vizsgálatokat végeztünk, melynek eredményeként eldönthetõ, hogy az RBCE sejtekben melyik altípus található meg.

a

ik

el sõ

ad

m 700

600

600

500

500

[Ca2+] i nM

700

400 300

l je

ha

ás

rm

ik

je

je l

je ik

je

0

ha

ás

od

ik

je l m

*

100

l

*

0

200

od

100

300

l

200

400

ad

300

kontroll teszt

500

rm

400

el sõ

[Ca 2+]i nM

Increase in [Ca 2+ ]i nM

500

l

Increase in [Ca2+ ] i nM

b kontroll teszt

400 300

200 200 100

Suramin

100

Suramin

0

ATP 0

ATP 50

100

0

ATP 150

200

250

300

UTP 0

UTP 50

100

UTP 150

200

250

idõ (sec)

idõ (sec)

7. ábra Suramin hatása az ATP és UTP kiváltotta [Ca2+]i emelkedésre. Az elsõ (a) ATP vagy (b) UTP (100 µM, 10 s) kiváltotta [Ca2+]i jel lecsengése után a sejteket suramin (100 µM, 100 s) jelenlétében másodszor is stimuláltuk az agonistákkal. Az antagonista kimosása után (a) ATP-vel (100 µM, 10 s) vagy (b) UTP-vel (100 µM, 10 s) harmadszor is agonista-indukálta [Ca2+]i választ váltottunk ki az RBCE sejtekben. Az ábrán három párhuzamos mérésbõl származó adatok (40-50 sejt) átlaggörbéje látható. Az oszlopdiagramm az agonisták (a) ATP és (b) UTP hatására bekövetkezõ [Ca2+]i emelkedések mértékét mutatja. A kisérletek kontrolljaként az agonistákat háromszor egymás után antagonista jelenléte nélkül alkalmaztuk (*szignifikáns különbséget jelent, p< 0.05).

26

300

Az agonistákat suramin jelenlétében teszteltük, amely a P2Y2 receptor altípus szelektív gátlószere (King et al., 1998, Bogdanov et al., 1998). A sejteket elõször ATP-vel kezeltük, melyre azok [Ca2+]i emelkedéssel válaszoltak. Amikor az agonista megvonása után a [Ca2+]i szint visszatért a kiindulási értékre, az ATP-t és a suramint együttesen alkalmaztuk, de ekkor a

[Ca2+]i emelkedés elmaradt. Az antagonista

kimosása után az ATP kiváltotta [Ca2+]i választ ismét visszakaptuk (7./a ábra). Hasonló kisérleti kondiciókban az UTP-re adott [Ca2+]i jelet a suramin jelentõsen (66%) csökkentette (7./b ábra).

d) Adenozin receptor karakterizáció agyi kapilláris endothel sejteken Az adenozin receptor altípus-specifikus agonistáinak alkalmazásával kerestük a választ arra a kérdésre, hogy milyen típusú adenozin receptorok találhatók az RBCE sejtekben.

300

[Ca2+]i nM

250

200

150

100 nM CPA 100 0

10

20

30

40

50

60

idõ (sec)

8. ábra A1 típusú adenozin receptor jelenléte RBCE sejtekben. A szelektív A1 agonista CPA (100 nM, 10 s) hatására a vizsgált sejtek 40%-a [Ca2+]i emelkedéssel válaszolt (n=38), míg egyéb altípus-szelektív agonisták (NECA, CGS 21680) alkalmazásakor a válasz elmaradt.

Kisérleteink során mind a CGS-21680, amely az A2A család specifikus agonistája (Poulsen and Quinn, 1998), mind az A2B specifikus agonista NECA (Dubey et al., 2000) jelelétében elmaradt az RBCE sejtekben az agonista kiváltotta [Ca2+]i válasz. 27

Az A1 receptor agonista CPA a vizsgált sejtek 40%-ban okozott [Ca2+]i emelkedést (8. ábra), és a jel nagysága kb. 25%-a volt az ATP kiváltotta [Ca2+]i válasznak, amely arányaiban megegyezik a 4./b ábrán látottakkal.

e) A nukleotid receptor fenotípus jellemzése RBCE sejteken; az ECM sejtdifferenciációt-génexpressziót segítõ hatásának vizsgálata

Nobles et al., 1995 RBE4

Albert et al., 1997 primer RBCEC

Sipos et al., 2000 primer RBCEC ECM-on növesztve

Agonista

Sipos et al., 2000 primer RBCEC patkányfarok kollagénen növesztve

választ adó sejtek száma % -ban

∆FR/∆FR ATP %

választ adó sejtek száma % -ban

∆FR/∆FR ATP %

választ adó sejtek száma % -ban

∆FR/∆FRATP %

választ adó sejtek száma % -ban

∆FR/∆FR ATP on ECM %

ATP

100

100

100

100

100

100

100

43

UTP

100

92

71

100

100

105

98

42

ADP

100

58

84

100

100

72

100

41

17

75

70

100

100

102

66

51

nincs adat

-

nincs adat

-

63

30

0

0

2-MeSATP

adenozin

1. táblázat Agonista-indukált [Ca2+]i válaszok összehasonlítása különféle RBCE sejtekben. A kollagénes és a biológiai ECM-os felszínen nevelt RBCE sejtek farmakológiai vizsgálatából

kiderült,

hogy

a

kollagénes

aljzaton

nevelt

sejtekben

nem

expresszálódott adenozin-szenzitív receptor. Továbbá a 2-MeSATP-re kevesebb sejt [Ca2+]i emelkedéssel, és az agonista-indukálta Ca2+-jel nagysága is kisebbnek bizonyult (1. táblázat).

28

II. A légzési komplex gátlás és a reaktív oxigén származékok termelõdése közötti kapcsolat kvantitatív jellemzése izolált agyi

Figyelembe véve, hogy számos neurodegeneratív betegségben a mitokondriális komplexek gátlását figyelték meg, ezért azt kivántuk vizsgálni, hogy az egyes komplexek

esetén

milyen

mértékû

gátlás

szükséges

ahhoz,

hogy

a

mitokondriumokban fokozott ROS termelés történjen. Megmértük a légzési komplexek (I-es, III-as és IV-es komplex) aktivitását szelektív gátlószereik jelenlétében izolált agyi idegvégzõdésekben (szinaptoszóma), és ezzel párhuzamosan a szinaptikus mitokondriumokban in situ követtük a ROS keletkezés mértékét az akonitáz aktivitás mérésének segítségével. Emellett közvetlenül is megmértük a H2 O2 felszabadulást szinaptoszómákban az Amplex Red módszer segítségével a rotenon ill. antimycin kezelést követõen.

a)

Mitokondriális

légzési

komplexek

aktivitásának

vizsgálata

szelektív

A szinaptoszómákat elõinkubáltuk különbözõ koncentrációjú rotenon (komplex I gátló), antimycin (komplexet III gátló), vagy a IV-es komplexre specifikus cianid jelenlétében (20 perc, 37 ºC), majd megmértük az egyes légzési komplexek aktivitását. Miközben a rotenon koncentrációját 5-1000 nM között változtattuk az I-es komplex aktivitása a kiindulási értékrõl (50.0 ± 2.3 nmol/min/mg protein) a nullára csökkent (9./a ábra). A III-as komplex aktivitása (30.14 ± 0.92 nmol/min/mg protein) a növekvõ antimycin koncentráció (1-2000 nM) hatására folyamatosan csökkent, de némi reziduális aktivitás magas antimycin koncentrációk esetén is mérhetõ volt (9./b ábra). A cianid (1-2000 µM) dózis-függõen csökkentette a IV-es komplex aktivitását (9./c ábra).

29

b

a 50

*

40 30

*

20 10

*

(nmol/min/mg protein)

35

komplex III aktivitás

(nmol/min/mg protein)

komplex I aktivitás

60

30 25 20

*

10

*

*

*

5

0 0.01 kontroll

*

15

0 0.1

1

10

100

1000

10000

0.01 kontroll

0.1

1

(nmol/min/mg protein)

komplex IV aktivitás

rotenon (nM)

10

100

1000

10000

antimycin (nM) 120 100 80

*

60 40

* * *

20

*

0

c

0.01 kontroll

0.1

1

10

100

1000

10000

CN - ( µM)

9. ábra Légzési komplex aktivitások meghatározása specifikus légzési komplex inhibitorok jelenlétében. Komplex I gátlás rotenon (a), komplex III gátlás antimycin (b) és komplex IV gátlás cianid (c) hatására. A kontroll aktivitások az egyes komplexek esetén a következõk voltak (nmol/min/mg): 50.0±2.3 a komplex I; 30.14±0.92 a komplex III és 88.2±9.15 a komplex IV Az adatok négy kisérlet átlagát jelentik ± standard error. Ahol a az átlagot jelzõ szimbólum fedi. *-gal a p<0.05).

a reaktív oxigén származékok keletkezésének indikátora A kisérletek során rotenon, antimycin vagy cianid növekvõ koncentrációjának függvényében követtük az akonitáz aktivitás csökkenésének mértékét (10. ábra). Kötelezõ kontrollként megmértük, hogy a légzési komplex gátlók önmagukban a

30

tisztított enzim aktivitását nem csökkentették. Rotenon jelenlétében (10-2000 nM) az akonitáz aktivitás kismértékû csökkenést mutatott (10./a ábra), és a legnagyobb alkalmazott koncentráció esetén is megmaradt a kontroll aktivitás 82%-a. Az antimycin akonitázt gátló hatása ennél jóval kifejezettebb volt, 1 µM

antimycin

jelenlétében a kontroll aktivitás 19%-a volt mérhetõ (10./b ábra). Cianid jelenlétében az akonitáz aktivitás dózisfüggõ csökkenést mutatott, a legmagasabb alkalmazott cianid koncentráció esetén (2 mM) a megmaradó enzimaktivitás a kontroll 57%-a volt

b

akonitáz aktivitás (nmol/min/mg protein)

100

* *

80

* *

60 40 20

100

akonitáz aktivitás (nmol/min/mg protein)

a

0

kontroll 0.1

80

* *

60 40

* 20

*

0 1

10

100

1000

10000

kontroll 0.1

1

10

rotenon (nM)

100

1000

antimycin (nM)

c

akonitáz aktivitás (nmol/min/mg protein)

100 80

*

*

60

*

*

40 20 0

kontroll 1

10

100

1000

10000

CN - ( µM)

10. ábra Akonitáz aktivitás mérés légzési komplex inhibitorok jelenlétében. A mintákat (1mg/ml szinaptoszóma) (a) rotenon, (b) antimycin és (c) cianid növekvõ koncentrációival 20 percig 37 ºC-on inkubáltuk. A kontroll akonitáz aktivitás 82.0±2.7 nmol/min/mg protein volt. Az adatokat legalább négy kisérletbõl számolt átlag ± standard error formájában tüntettük fel. *gal a kontrolltól szignifikánsan eltérõ értékeket jelöltük (p<0.05).

31

10000

c) Kvantitatív összefüggés a légzési lánc gátlás és a reaktív oxigén származékok keletkezése között szinaptoszómákban A 11. ábrán a rotenon, antimycin vagy cianid növekvõ koncentrációjának jelenlétében mért légzési lánc gátlás függvényében ábrázoltuk a relatív akonitáz aktivitásokat, és megállapítottuk azt a gátlás küszöböt, amelyet meghaladva már kifejezett akonitáz

b

*

*

(10) (50)

80

akonitáz aktivitás (kontroll %-a)

100

* (100) (1000)

60 40 20 0 0

20

40

60

80

100

c

* (5)

80

(25)

(10)

*

60 40 20

(50)

*

(1000)

*

0

100

0

komplex I gátlás (kontroll %-a) akonitáz aktivitás (kontroll %-a)

a

akonitáz aktivitás (kontroll %-a)

gátlás mérhetõ.

20

40

60

80

100

komplex III gátlás (kontroll %-a) (0.01)

100

*

80

(0.1)

(0.25) (0.5)

60

*

(2)

* *

40 20 0 0

20

40

60

80

100

komplex IV gátlás (kontroll %-a)

11. ábra A légzési komplex gátlás és a reaktív oxigén származékok keletkezése közötti kvantitatív összefüggés jellemzése. Az akonitáz aktivitást a komplex I (a), komplex III (b) és a komplex IV (c) gátlásának függvényében fejeztük ki. Az enzimaktivitás és komplex gátlás %-os értékei a 9. adataiból származnak, 100%-nak a kontroll értéket tekintettük. A zárójelbe tett számok a megfelelõ gátlószer koncentrációját jelentik, a rotenon és antimycin esetén nM-ban, a cianidnál µM-ban. Az adatok négy kisérlet átlagát jelentik ± standard error. *-gal a megfelelõ kontrolltól szignifikánsan eltérõ értékeket jelöltük (p<0.05).

32

Növekvõ rotenon koncentrációk okozta komplex I gátlás hatására folyamatos akonitáz aktivitás csökkenés következett be, de a komplex I teljes gátlása is mindössze 18%-os csökkenést okozott az enzimaktivitásban (11./a ábra). Az is megfigyelhetõ azonban, hogy már kismértékû (16%) komplex I gátlás hatására is szignifikáns akonitáz aktivitás csökkenés következett be. Ezzel ellentétben

71%-os antimycin okozta

komplex III gátlás esetén csak jelentéktelen akonitáz gátlás volt megfigyelhetõ, ha azonban a komplex gátlás ezt a küszöböt meghaladta, akkor drámai akonitáz aktivitás csökkenés következett be (11./b ábra). Hasonló képet mutatott a komplex IV gátlásának függvényében kifejezett akonitáz aktivitás is, itt a 71%-os küszöböt meghaladó komplex IV gátlás után jelentkezett az enzimaktivitás jelentõs csökkenése (11./c ábra).

felszabadulás mérése szinaptoszómában. Az Amplex Red módszer alkalmasnak bizonyult a rotenon vagy antimycin okozta légzési lánc gátlás során felszabaduló H2 O2 direkt detektálására, a cianid azonban reakcióba lép az Amplex Red reagenssel, ezért a komplex IV gátlás során a 2O2

meghatározni.

A

mennyiségét ezzel a módszerrel nem tudtuk

szinaptoszómákat

rotenonnal

(10-1000

nM)

20

percig

elõinkubáltuk, majd az Amplex Red módszer segítségével meghatároztuk a felszabaduló H2 O2 mennyiségét . 50 nM-os, vagy ezt meghaladó rotenon koncentrációk esetén a kontrollhoz képest szignifikánsan nagyobb H2 O2 felszabadulás látottakkal (10./a ábra). Az antimycin okozta ROS termelés miatti akonitáz aktivitás csökkenéshez (10./b ábra) hasonló eredményt kaptunk a H2 O2 felszabadulás mérése során, kivéve a 10 nM-os antimycin koncentrációt, ahol a H2 O2 felszabadulás mértéke nem különbözött a kontrolltól (12./b). Az antimycin jelenlétében nagyobb mértékû H2 O2 felszabadulást tapasztaltunk mint a rotenon jelenlétében, mely jól tükrözi a 10. ábrán bemutatott jelenséget, ahol az antimycin csökkenést okozott mint a rotenon.

33

kifejezettebb akonitáz aktivitás

a H2 O2 (pmol/ min/ mg protein)

70 60 50 40

*

30

*

*

20 10 0 kontroll

10

50

100

1000

Rotenon (nM)

b H2O 2 (pmol/ min/ mg protein)

70

*

60 50

*

40 30 20 10 0 kontroll

5

10

25

50

Antimycin (nM)

12. ábra Légzési komplex gátlás során a szinaptoszómákból felszabaduló hidrogén peroxid mennyiségének meghatározása. (1mg/ml protein) (a) rotenon és (b) antimycin különbözõ koncentrációival 20 percig 37 ºC-on inkubáltuk, majd Amplex Red kit segítségével mértük a 2 O 2 mennyiségét. Kezeletlen szinaptoszóma esetén 21.1±0.66 pmol/min/ mg protein volt a kontroll H2 O2 felszabadulás. Az adatok legalább három kisérletbõl számolt átlag ± standard error formájában vannak feltüntetve. *-gal a kontrolltól szignifikánsan eltérõ értékeket jelöltük (p<0.05).

34

e) Hidrogén peroxid felszabadulás vizsgálata a komplex I és a komplex III

Az elõzõekben bemutattuk, hogy a légzési lánc gátlása in situ mitokondriumokban a

az Amplex Red módszer segítségével közvetlenül mértük a szinaptoszómában a komplex gátlásra bekövetkezõ H2 O2 felszabadulás mértékét, és bizonyítottuk a különbözõ légzési lánc gátló jelenlétében bekövetkezõ ROS képzõdés eltérõ jellegét. 280

*

H 2O 2 felszabadulás (a kontroll %-a)

(50)

240

komplex I gátlás rotenonnal komplex III gátlás antimycinnel

*

(25)

*

200

(1000)

* (100)

*

160

(50)

(10)

120

(5) (10)

80 0

20

40

60

80

100

%-os komplex gátlás

13. ábra Hidrogén peroxid felszabadulás szinaptoszómából a légzési lánc gátlásának A kontroll értéket tekintve 100%-nak a felszabaduló H2 O2 mennyiségét ill. a komplex I ( ) rotenonnal és a komplex III ( ) antimycinnel okozott gátlásának mértékét %-ban fejeztük ki ± standard error. A szinaptoszómákat 20 percig inkubáltuk a gátlószer jelenlétében, majd 25 ºC-on megmértük a felszabaduló H2 O2 mennyiségét. Zárójelben feltüntettük az alkalmazott gátlószer koncentrációkat (nM). A kontroll H2 O2 felszabadulás mennyisége 21.1 ± 0.9 pmol/min/mg protein volt. A 13. ábra a különbözõ koncentrációjú rotenonnal ill. antimycinnel elõkezelt szinaptoszóma H2 O2 függvényében. Az akonitázzal végzett kisérletekhez (11. ábra) hasonlóan a komplex I kismértékû (10%) gátlása is szignifikáns növekedést okozott a H2 O2 felszabadulásban, 35

míg kb. 70%-os komplex III gátlás után következett csak be szignifikáns változás a H2 O2 felszabadulásban (13. ábra). Kisérleteinkben a rotenonra kapott jelnél nagyobb volt a hasonló koncentrációban (50nM) alkalmazott antimycin kiváltotta H2 O2 felszabadulás, míg izolált agyi mitokondriumokban a rotenon bizonyult erõsebb ROS

f) A mitokondriális membránpotenciáltól nem függõ ROS termelés rotenon és antimycin hatására. Izolált mitokondriumon végzett kisérletek ellendmondó adatokat szolgáltattak arról, hogy vajon a mitokondriális ROS termelés függ-e a membránpotenciáltól (Votyakova and Reynolds 2001, Starkov et al. 2002). 250 nM FCCP-vel depolarizált mitokondriumokban megvizsgáltuk a rotenon és antimycin ROS termelõ hatását, azt a kérdést megválaszolandó, hogy neuronális eredetû in situ mitokondriumok ROS termelését miként befolyásolja a ÄØm változás. Az FCCP önmagában nem okozott változást a H2 O2 felszabadulás mértékében. Rotenonnal együtt alkalmazva annak hatását kissé növelte (14./a ábra), míg az antimycinét csökkentette (14./b ábra), de egyik esetben sem okozott szignifikáns változást. Mivel antimycin és FCCP együttes jelenlétében a membránpotenciál teljesen megszûnik (Chinopoulos et al. 1999), ezért bizonyítottnak látjuk, hogy in situ mitokondriumokban a légzési komplex gátlók által kiváltott ROS termelés független a ÄØm-tól. A kapott erdemény hasonló a glutamát/maláttal lélegeztetett izolált mitokondriumokon tapasztaltakhoz (Votyakova and Reynolds 2001), de eltér a Starkov et al. (2002) által közöltektõl, ahol a az FCCP okozta membránpotenciál csökkenés jelentõs csökkenést okozott a glutamát/maláttal lélegeztetett izolált mitokondriumok ROS termelésében.

36

a

80

H2O2 felszabadulás

H2 O2 felszabadulás (pmol/min/mg protein)

100 80

FCCP

60 40

rotenon

20 200

400

600

800

idõ (sec)

*

*

* 40

*

*

0 0

60

*

20

0 -

10 10 - +

-

50 50 - +

- 100 100 - - +

- 1000 1000 rotenon (nM) - + FCCP (250 nM)

b H2 O2 felszabadulás (pmol/min/mg protein)

400

*

*

300

*

* *

*

- 25 25 - - +

- 50 50 - - +

200

* *

100

0 -

10 10 - +

- 250 250 antimycin (nM) - - + FCCP (250 nM)

14. ábra Az FCCP hatása a rotenon ill. antimycin kiváltotta H2 O2 felszabadulásra szinaptoszómákban. A H2 O2 felszabadulást az Amplex Red módszer segítségével mértük, az inzertben egy reprezentatív online mérési görbe látható. Standard médiumban 200 sec-on át mértük a H2 O2 felszabadulást, 250 nM FCCP hozzáadása követett. A rotenont (a) 10-1000 nM-os, míg az antimycint (b) 10-250 nM-os koncentrációkban alkalmaztuk. 37 ºC-on végeztük, a kontroll H2 O2 felszabadulás (a) 27.8 ± 1.1 ill. (b) 30.3 ± 1.5 pmol/min/mg protein volt. 37

átlag ± standard error formájában vannak feltüntetve. *-gal a kontrolltól szignifikánsan eltérõ értékeket jelöltük (p<0.05).

Ez a hatás nem volt specifikus a szétkapcsolószerre, egy másik protonofór a DNP (50

H2 O2 felszabadulás (pmol/min/mg protein)

µM) jelenlétében hasonló eredményre jutottunk, mint FCCP-vel (15. ábra).

80

*

60

*

*

40

20

0 -

+ -

+ +

+ + -

rotenon (1 µ M) FCCP (250 nM) DNP (50 µ M)

15. ábra Az FCCP és DNP hatásának összehasonlítása a rotenon kiváltotta H2 O2 felszabadulás mértékére. A kisérletek a 13. ábránál leírtakkal megegyezõen végeztük. Rotenonnal (1 µM) H2 O2 felszabadulást indukáltunk, majd a jelölésnek megfelelõen FCCP-vel (250 nM), vagy DNP-lal (50 µM) kisütöttük a membránpotenciált. A kontroll H2 O2 felszabadulás 39.4 ± 1.5 pmol/min/mg protein volt. *jelöltük (p<0.05).

2 O2

felszabadulás

oligomycin jelenlétében A mitokondriális membránpotenciál ROS képzõdésben betöltött szerepének további vizsgálatához a mitokondriális ATP-szintázt (F1 Fo ATP-áz) gátló oligomycint használtuk fel. Antimycin jelenlétében a mitokondrium erõsen depolarizált, de a

38

membránpotenciál kis részben megmarad az F1 Fo ATP-áz reverz mûködésének

H2O 2 felszabadulás (pmol/min/mg protein)

köszönhetõen (Kauppinen and Nicholls 1986, Chinopoulos et al. 1999).

300

*

250

** 200 150 100 50 0 -

+ -

+

+ +

antimycin (250 nM) oligomycin (10 µ M)

16. ábra Antimycin okozta H2 O2 felszabadulás oligomycin jelenlétében. A kisérleteket a 14. ábránál leírtakhoz hasonlóan végeztük, az antimycin (250 nM) alkalmazása után 200 sec-mal oligomycint (10 µM) adtunk. A kontroll H2 O2 felszabadulás 38.0 ± 2.4 pmol/min/mg protein volt. *- gal a kontrolltól, **-gal a kontrolltól és az antimycin jelenlétében mért értékektõl egyaránt szignifikánsan eltérõ értékeket jelöltük (p<0.05).

Oligomycin és antimycin együttes hatására a memránpotenciál teljesen kisül, ennek 2O2

felszabadulás 15%-al csökkent (16. ábra).

h) A komplex I gátlás hatása az antimycin kiváltotta ROS felszabadulásra Az in situ feltöltõ elektronok nagy része nagy valószínûséggel NADH eredetû, és a komplex I-

komplex I gátlás esetén van-e elektron input a légzési láncba, ami hozzájárulhat a 39

ROS keletkezéshez ha a további légzési lánc komponenseket gátoljuk. Vagyis megvizsgáltuk, hogy rotenon jelenlétében van-e H2 O2 felszabadulás akkor, amikor antimycinnel gátoljuk a komplex III-at. A mintákhoz elõször rotenont adtunk, majd 50 másodperccel késõbb antimycint, miközben Amplex Red módszerrel online

H2O 2 felszabadulás (pmol/min/mg protein)

mértük a H2 O2 felszabadulást (17. ábra).

350

**

300 250 200

**

150 100

*

50 0 -

+ -

+

+ +

rotenon (1 µ M) antimycin (25 nM)

17. ábra Légzési komplex gátlók együttes hatása a H2 O2 felszabadulásra izolált agyi idegvégzõdésekben. A szinaptoszómát standard médiumban inkubáltuk, majd külön-külön rotenont vagy antimycint adtunk a mintákhoz, illetve egyszerre alkalmaztuk a gátlószereket. Az adatok vannak feltüntetve. *-gal a kontrolltól szignifikánsan eltérõ értékeket jelöltük, a **-gal jelölt oszlopok egymástól is szignifikánsan eltérnek (p<0.05).

A rotenon jelenlétében adott antimycin hatása kb. fele volt annak, mint amikor az antimycint önmagában alkalmaztuk. A komplex III gátlás okozta ROS képzõdés a komplex I gátlás következtében szignifikánsan csökken, de nem szûnik meg teljesen. A rotenon jelenlétében is megmaradó antimycin hatás esetén valószínû, hogy a rotenon gálás helyétõl disztálisan elektronok lépnek be a légzési láncba, és a komplex III-at elérve antimycin jelenlétében ROS termelést okoznak.

40

MEGBESZÉLÉS

I. Nukleotid receptorok farmakológiai karakterizációja primer agyi kapilláris endothel sejteken

A passzálatlan primer agyi endothel kultúrák frissen izolált mikroerekbõl készülnek, ezért valószínûleg jobban tükrözik az in situ állapotot, mint a passzált vagy immortalizált endothel sejtekbõl készített tenyészetek. Az 1. táblázat adataiból kiderül, hogy az ECM-on nevelt primer RBCE sejtek agonista-indukálta Ca2+-válaszai jóval egységesebbek és jobban reprodukálhatók, mint a saját illetve más szerzõk (Nobles et al. 1995, Albert et al. 1997) által közölt kollagénes felszínen nevelt RBCE sejtekbõl származó adatok. A primer RBCE sejtek ATP-re és UTP-re adott válaszai hasonlóak az RBE4 sejtvonalon elõzetesen tapasztaltakkal, ugyanakkor a 2-MeSATPre jóval kevesebb RBE4 sejt reagált [Ca2+]i válasszal (Nobles et al. 1995). Ez a különbség arra utal, hogy amíg a P2Y2 receptor közel azonos módon fejezõdik ki primer RBCE és immortalizált RBE4 sejtekben, addig a P2Y1 receptor expressziója alacsonyabb az RBE4 esetében. á,â-MeATP jelenlétében az RBE4 sejtek 40%-a válaszolt [Ca2+]i emelkedéssel, míg a primer RBCE sejtek nem reagáltak az agonistára. Albert és mtsi. (1997) kimutatták, hogy a nem passzált (P0) RBCE sejtek á,â-MeATP-re, de az elsõ passage után (P1) már igen. Ez azt sugallja, hogy az á,â-MeATP-re szenzitív RBE4 sejtek megõriztek néhány, a korai passzált sejtfenotípusra jellemzõ tulajdonságot. Az irodalomból ismert, hogy az ECM számos, a sejtdifferenciálódásban szerepet játszó komponens expresszióját segíti (Lin and Bissell 1993). A vér-agy gátra jellemzõ tulajdonságok közül az ECM megnöveli (upregulálja) a tight junctionok (Arthur et al. 1987, Tilling et al. 1998, Hoheisel et al. 1998), a P-glikoprotein (Tatsuta et al. 1994) és néhány enzim, így az alkalikus ã-glutamil transzpeptidáz expresszióját (Mischeck et al. 1989, Mizuguchi et al. 1994, 1997). Kisérleteink elsõként szolgáltattak bizonyítékot arról, hogy az ECM differenciációt-génexpressziót segítõ hatása a farmakológiai fenotípusban is megjelenik. Primer marha aorta endotheliumon (Brown et al. 1995), marha pulmonáris endotheliumon (Chen et al. 1996), és mellékvese velõbõl származó primer endothel 41

preparátumon végzett kisérletek (Mateo et al. 1996) a P2Y1 és P2Y2 receptorok ko-

1

aktivitás már nem volt detektálható. Vigne és munkatársai

számos eredménnyel gazdagították a P2Y1 és P2Y2 receptorokra vonatkozó ismereteinket. RBCE sejtekbõl származó B7 sejtvonalon bizonyították a két receptor együttes jelenlétét, de nincs adat arról, hogy a vizsgált sejtek hány %-ában fejezõdött ki mindkét receptor altípus (Frelin et al. 1993, Vigne et al. 1994). B10 sejtvonalon 1 2+

[Ca ]i emelkedést és adenilát-cikláz gátlást (Feolde et al. 1995, Webb et al. 1996, Vigne et al. 1998). Ez utóbbi hatás primer RBCE sejtekben nem volt tapasztalható (Albert et al. 1997). RBCE sejteken a P2Y1 irodalmi adatok sokszor éles eltérést mutattak. Míg egyes szerzõk a P2Y1 -agonista 2MeSATP jelenlétében kiváltott [Ca2+]i válaszról számoltak be, és bizonyítottnak látták P2Y1 receptorok jelenlétét primer RBCE sejteken (Albert et al. 1997), addig mások RT-PCR technikával sem tudták kimutatni a P2Y1 receptort kódoló mRNS-t az RBCE sejtekben (Anwar et al. 1999). Kisérleteinkben az ATP és 2MeSATP jelenlétében mérhetõ additív válasz, a 2-MeSADP kiváltotta jel és annak gátlása PAPS-al világos farmakológiai bizonyítékul szolgáltak egy funkcionális P2Y1 -

2

receptortól, de további vizsgálatok

szükségesek annak eldöntéséhez, hogy szerkezetileg a már klónozott P2Y1 receptor családba tartozik-e, vagy egy új altípust képvisel. Kisérleteinkben az adenozin [Ca2+]i emelkedést okozott a primer RBCE sejtekben. Az ATP in vivo és in vitro gyorsan lebomlik ADP-re, AMP-re és végül adenozinra a sejtekben található ekto-ATPázok hatására (Marcus et al. 1997). Jelen esetben az ATP és ADP bomlásából származó adenozin, az agonisták rövid expozíciós ideje (8 sec) és a kihígulás miatt, valószínûleg nem okozott önmagában [Ca2+]i jelet. Az adenozinra kapott [Ca2+]i szignál származhat az adenozin P2Y1 receptoron közvetített hatásából, de az A1 -szelektív agonista CPA által kiváltott [Ca2+]i jel hasonló nagysága miatt úgy gondoljuk, hogy az adenozin hatás fõleg az A1 -receptoron keresztül közvetített primer RBCE sejtekben. Az 1. táblázatban ismertetett különbségek azt sugallják, hogy a növekvõ sejtek által termelt biológiai ECM komplexebb forrása a lokális differenciációs szignáloknak,

42

mint az egyszerûbb mátrixok, pl. a patkányfarok kollagén vagy a tisztított I. típusú kollagén (lásd még Tagami et al. 1992). Így a kollagénen tenyésztett sejtekben az [Ca2+]i válaszoknál megfigyelt különbségekre az alacsonyabb receptorszám, vagy az alteráló szignáltranszdukciós utak jelenléte szolgálhat

Az agyi endotheliumra specifikus, receptor-mediált szignáltranszdukciós utak közül a cAMP vagy PLC okozta [Ca2+]i emelkedés után, vagy tirozin-kináz/MAPK kaszkád jelátviteli úton ható, a tight junctionok permeabilitását szabályzó út jobb megismerése nagy terápiás lehetõségeket rejt magában. Ennek segítségével megkönnyíthetnénk a gyógyszerek vér-agy gáton keresztüli átjutását, illetve elõsegíthetnénk a BBB zárását olyan pathológiás esetekben, amikor a vér-agy gát permeabilitása kórosan megnõ, így gyulladásos mediátorok felszaporodása, agyi hipoxia vagy ischémia esetén (Abbruscato and Davis 1999, Abbott 2000).

II. Kvantitatív kapcsolat a légzési lánc gátlás és a reaktív oxigén származékok

Izolált mitokondriumok esetén a ROS termelés mértéke nagyban függ attól, hogy a méréseket milyen légzési szubsztrát jelenlétében végzik. A szukcináttal lélegeztetett mitokondriumok ROS termelése nagyobb a glutamát/malát jelenlétében mértnél (Starkov et al. 2002, Votyakova and Reynolds 2001). Szukcináttal lélegeztetett preparátumok esetén a hozzáadott rotenon meggátolta, míg glutamát/malát légzési szubsztrát jelenlétében serkentette a ROS képzõdést (Liu et al. 2002). Saját kisérleteinket in situ a glükóz normál metabolizmusa során képzõdõ NADH- és FADH-termelõ légzési szubsztrátok egyaránt rendelkezésre álltak. Ez egy jóval összetettebb, az in vivo körülményekhez közelebb álló rendszer mint az izolált mitokondrium preparátumok, ahol a légzési szubsztrát fajtája meghatározza a keletkezõ ROS mennyiségét és kérdés, hogy ez mennyiben tükrözi a fiziológiás viszonyokat (Votyakova and Reynolds 2001, Liu et al. 2002). A komplex I, III és IV gátlása egyaránt ROS termelés növekedéséhez vezetett, de a folyamatok dinamikájában jelentõs eltérések mutatkoztak. A komplex III és IV

43

esetében nem történt változás a ROS termelésben ameddig a gátlás meg nem haladta a 70%-os küszöböt, ennek elérése után drámai növekedése következett be (13. ábra). A komplexek

gátlásának

hasonló

küszöbértékét

figyelték

szubsztráttal lélegeztetett izolált agyi mitokondriumon, ahol az ATP termelés és oxigén fogyás mennyisége csak 80%-ot meghaladó komplex III ill. 70%-ot meghaladó komplex IV gátlás után csökkent szignifikánsan (Davey and Clark 1996, Davey et al. 1998). Ez a nagymétékû gátlás kérdésessé teszi, hogy ezeknek a komplexeknek a gátlása állhat-e a neurodegeneratív betegségek hátterében. Úgy tûnik, hogy mind a komplex III, mind a komplex IV nagy kapacitásfelesleggel mûködik, és az enzimek gátlása, míg az a 70%-ot el nem éri, nem okoz sem az energiatermelésben sem a ROS keletkezésben észrevehetõ változtást. Ettõl eltérõen, is súlyos következményekkel jár, bár e téren különbség van az egész agyból, illetve csak az idegvégzõdésekbõl származó mitokondriumok viselkedése között. Míg a sejttestben található mitokondriumokban a komplex I, hasonlóan a másik két komplexhez, közel 70%-ban gátolható volt anélkül, hogy az ATP termelés csökkent volna (Davey and Clark 1996), addig az idegvégzõdésekben az energiatermelés sokkal érzékenyebbnek bizonyult a komplex I gátlásra: a komplex I 25%-os gátlása esetén az oxigén fogyasztás és az ATP termelés már szignifikánsan csökkent (Davey et al. 1998). Kisérleteinkben a komplex I gátlás és a ROS képzõdés között éles határ nem volt megfigyelhetõ, a két paraméter közötti összefüggés közel lineáris volt, de már kismértékû (16 ± 2%) komplex I gátlás esetén is szignifikáns ROS termelõdést tapasztaltunk (11./a ábra). A maximális komplex III ill. IV gátlás okozta ROS termelõdés nagysága ugyanakkor jelentõsen nagyobb volt a maximális komplex I gátlás esetén keletkezõ ROS mennyiségénél. Kisérleteink során az in situ ROS keletkezés detektálására az akonitáz aktivitás mérését használtuk. Az emlõs sejtekben a citoszolban és a mitokondriumban egyaránt megtalálható az akonitáz enzim. A mitokondriális akonitáz a citromsav ciklus egyik enzime, míg a citoplazmatikus enzim a vas homeosztázis regulációjában vesz részt (Klausner et al. 1993). Az enzim [4Fe-4S]2+ magja rendkívül érzékeny a reaktív oxigén származékokra, és szuperoxid, peroxinitrit vagy H2 O2 jelenlétében gyorsan inaktiválódik (Gardner et al. 1995, Hausladen and Fridovich 1996, Tretter and AdamVizi 2000). Mivel patkány kortikális neuron kultúrában a teljes aktivitás mindössze 12-25%-át tette ki a citoplazmatikus akonitáz aktivitás (Liang et al. 2000), ezért a

44

tulajdonítható. Ugyanakkor az akonitáz a ROS keletkezésben is szerepet játszhat, az enzim [4Fe-4S]2+ magja a szuperoxiddal reakcióba lépve szabad Fe2+ felszabadulást okozhat, amely a Fenton reakcióban H2 O2 -dal reagálva a rendkívül reaktív hidroxil gyök képzõdését eredményezheti (Vasquez-Vivar et al. 1990). A hidroxil gyök, mely a komplex I legerõsebb inhibitora (Zhang et al. 1990), további ROS keletkezést okozhat, így a komplex I gátlás és az akonitáz inaktiváció egymást gerjesztõ folyamattá válhat. A H2 O2 közvetlen mérése azt mutatta, hogy a küszöb koncentrációt meghaladó antimycin jelenlétében nagymértékû H2 O2 felszabadulás volt tapasztalható, míg emelkedõ rotenon koncentrációra folyamatosan emelkedõ H2 O2 felszabadulás volt a válasz (13. ábra).

Ezek az erdemények jó egyezést mutatnak az akonitázos

mérésekkel és az izolált mitokondriumon mért adatokkal, ahol a mitokondriumok az antimycin koncentrációtól függõen minden-vagy-semmi típusú H2 O2 válasszal, míg emelkedõ rotenon koncentrációra emelkedõ H2 O2

felszabadulással reagáltak

(Votyakova and Reynolds 2001). Az Amplex Red módszerrel végzett méréseinkbõl kiderül (13. ábra), hogy a komplex gátlás hatására felszabaduló H2 O2 koncentrációja okozott. Ellentmondásnak tûnhet, hogy hasonló mértékû akonitáz aktivitás csökkenés 2 O 2 -ot

mikromólos nagyságrendben kellett alkalmazni

(Tretter and Adam-Vizi 2000). Figyelembe kell vennünk azonban azt, hogy az 2O2

termelõdés, hanem a H2 O2 felszabadulás mértékét

lehet követni. A szinaptoszómákban nagy mennyiségben található kataláz és egyéb ROS-t bontó enzimek, így elképzelhetõ hogy a mitokondriumokban a komplex gátlás 2O2

Kisérleteinkbõl kiderül, hogy a komplex I kritikus helye a mitokondriális ROS képzõdésnek, mert már kismértékû komplex I gátlás is jelentõs ROS felszabadulással jár. Parkinson-kór esetén

30%-kal csökkent komplex I aktivitást figyeltek meg

(Schapira et al. 1990), amely súlyos következményekkel járhat a nigrostriatális neuronokban. Ezekben a sejtekben ugyanis a komplex I gátlás során és a dopamin nem-enzimatikus oxidációja során is képzõdhet H2 O2 (Jakel and Maragos, 2000). Részlegesen gátolt mitokondriális komplex I mellett a H2 O2 kiváltotta oxidatív stressz

45

a mitokondriális membránpotenciál csökkenését eredményezte, és ezzel együtt csökkent az ATP keletkezés is (Chinopoulos and Adam-Vizi 2001). Ezért valószínûsíthetõ, hogy Parkinson-kórban az oxidatív stressz és a kialakuló káros bioenergetikai változások együttesen okozzák az idegsejtek pusztulását. További kisérleteinkben kimutattuk, hogy in situ ROS termelése nem függ a ÄØ m tapasztaltakkal (Votyakova és Reynolds 2001), ugyanakkor eltérõen a Starkov et al. (2002) által közöltektõl, ahol az FCCP okozta membránpotenciál csökkenés jelentõs csökkenést okozott a glutamát/maláttal lélegeztetett izolált mitokondriumok ROS

In situ antimycin jelenlétében kifejezett membránpotenciál csökkenés mérhetõ (Chinopoulos and Adam-Vizi 2001). Ilyenkor a maradék membránpotenciál fenntartásáért a mitokondriális ATP-szintáz reverz mûködése a felelõs (Scott and Nicholls 1980, Chinopoulos et al. 1999). Légzési komplex gátlók és az ATP-szintáz gátló oligomycin együttes jelenlétében a membránpotenciál teljesen kisül, de kisérleteink során ilyenkor is jórészt megtartott maradt a ROS képzõdés (16. ábra). Ez újabb bizonyíték m

nem befolyásolja a légzési komplex gátlók által kiváltott ROS

képzõdést in situ agyi mitokondriumokban. A szinaptoszómákban sokkal szélesebb a mitokondriumok számára rendelkezésre álló szubsztrátok skálája, mint izolált mitokondriális preparátumok esetén. A glikolízisbõl származó NADH a glicerol-foszfát shuttle segítségével lép be a mitokondriumba, ahol a citromsav ciklusban termelõdõ NADH-val együtt a komplex I szintjén kapcsolódik a légzési lánchoz. Ugyanakkor a citromsav ciklusban és az endogén zsírsavak metabolizmusa során keletkezõ FADH a komplex II-n keresztül táplálja a mitokondriális elektrontranszport láncot. A többirányú szubsztrát belépés lehetõségét bizonyítja, hogy az antimycin-indukálta H2 O2 mértékû volt, amikor a komplex I-et rotenonnal teljesen gátoltuk (17. ábra). Ebben az esetben valószínûnek látszik, hogy a komplex III-ra érkezõ elektronok a rotenon hatás helyétõl disztálisan lépnek be a légzési láncba. Szukcináttal lélegeztetett izolált mitokondriumok esetén a komplex II-rõl a komplex I felé irányuló reverz elektron áramlást teszik felelõssé a ROS képzõdésért, amely rotenonnal meggátolható (Starkov et al. 2002, Votyakova and Reynolds 2001, Liu et al. 2002, Hansford et al. 1997).

46

Ezzel szemben in situ esetén) a komplex I erõsen redukált állapotban van, amely nem kedvez a reverz elektron áramlásnak. Ezért a légzési láncot a komplex II szintjén elérõ elektronok még akkor is bekapcsolódhatnak a ROS termelésbe, amikor a komplex I rotenonnal

Összefoglalva: Szinaptoszómákban a rotenon-szenzitív komplex I a ROS képzõdés egyik fõ helye, továbbá a légzési láncban ettõl disztálisan található egy antimycinszenzitív ROS képzõ hely, amely azonos lehet az ubiquinonnal (Boveris et al. 1976). Ez utóbbi a komplex I gátlása esetén is képes ROS termelésre, ilyenkor a rotenon gátlás helyétõl disztálisan belépõ elektronok járulnak hozzá a ROS képzéshez. In situ agyi mitokondriumokban a komplex I és a komplex III gátlása okozta ROS termelés ÄØm-tól.

47

ÖSSZEFOGLALÁS

Az Abbott és mtsi. (1992) által kifejlesztett patkány agyi kapilláris endothel (RBCE) sejttenyésztési módszert továbbfejlesztettük a képalkotó fluorimetriás mérések követelményeinek megfelelõen. A sejteket extracelluláris biológiai mátrixszal (ECM) bevont üveglemezen tenyésztettük, ezáltal a háttér fluoreszcencia jelentõsen csökkent. Az ECM-on nevelt primer RBCE sejtek agonista-indukálta Ca2+-válaszai jóval uniformabbnak bizonyultak, mint a kollagénes felszínen nevelt RBCE sejteké. Farmakológiai kisérletekkel kimutattuk az ECM-on nevelt RBCE sejtekben a P2Y2 és egy P2Y1 [Ca2+]i

1 -receptoron

keresztül jön létre.

Egyre több bizonyíték áll rendelkezésünkre arról, hogy a komplex I csökkent mûködése fontos tényezõ a Parkinson-kór etiológiájában. Kisérleteinkben a mitokondriális légzési komplex gátlás és a reaktív oxigén származék (ROS) termelés in situ

z in

situ ROS hatás detektálására az akonitáz aktivitás mérést használtuk, illetve H2 O2 felszabadulást. Kimutattuk, hogy a komplex I kritikus helye a mitokondriális ROS képzõdésnek, már kismértékû 16%-os komplex I gátlás is jelentõs ROS felszabadulással járt. A komplex III és IV esetében a ROS termelésben nem történt változás addig, ameddig a komplex gátlás meg nem haladta a 70%-os küszöböt, ennek élérése után drámai növekedés következett be. in situ agyi mitokondriumokban a komplex I és a komplex III gátlása okozta ROS termelés független a ÄØ m-tól. FCCP ill. DNP jelenléte nem okozott szignifikáns változást a komplex gátlás hatására bekövetkezõ ROS ÄØ m de a ROS termelés ilyenkor is csupán 15%-kal csökkent. Kimutattuk, hogy in situ

de a légzési láncban ettõl disztálisan található egy antimycin-szenzitív ROS képzõ hely is. Ez utóbbi a komplex I gátlása esetén is képes ROS termelésre, ilyenkor a rotenon gátlás helyétõl disztálisan belépõ elektronok járulnak hozzá a ROS képzéshez.

48

SUMMARY

We adapted and modified the rat brain capillary endothelial cell (RBCEC) culturing method, originally described by Abbott et al. (1992), to the requirements of fluorescence measurement techniques. The biological extracellular matrix (ECM) coated glass coverslips have much less background fluorescence than the commonly used collagen-coated plastic surfaces. Moreover, RBCE cells grown on ECM produced by corneal endothelial cells grow more rapidly and uniformly to confluence, and show a more uniform spindle-shaped cell morphology characteristic of differentiated brain endothelial cells. We demonstrated pharmacologically the presence of P2Y2 and P2Y1 –like nucleotide receptors in RBCE cells, and in addition the presence of an A1 -type adenosine receptor. The agonist-induced [Ca2+]i changes were significantly higher when cells were grown on ECM, than in identical culture conditions without ECM, which highlights the role of ECM in the regulation of pharmacological phenotype of brain endothelial cells. Reactive oxygen species (ROS) generated in the respiratory chain was measured and the quantitative relationship between inhibition of the respiratory chain complexes and ROS formation was investigated in isolated nerve terminals. Inactivation of complex I to a small extent (16± 2 %) resulted in a significant increase in ROS formation, while 71 % threshold inhibition were detected for complex III and IV, above that substantial aconitase inactivation was observed, indicating an enhanced ROS generation. This was confirmed by direct detection of H2 O2 under similar conditions. Dissipation of ÄØm by FCCP or DNP had no effect on the H2 O2 production induced by rotenone or antimycin. When antimycin was applied together with oligomycin, ÄØm was totally dissipated, but the ROS production decreased only by 15%. In the presence of rotenone, antimycin remained capable of inducing an enhanced ROS formation, though to a smaller extent than without inhibition of complex I. These experiments suggest that in in situ mitochondria of synaptosomes when complex I is completely inhibited electrons entering the respiratory chain distal from the rotenone site could fuel ROS formation. 49

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

munkámhoz nyújtott segítségét. Közös munkánk során megtanultam, hogy az eredményesség nem szerencse kérdése, a kitûzött cél elérése elsõsorban rajtunk múlik. Szakmai igényessége, munkabírása és kitartása volt erre a példa, és a jövõben is például szolgál számomra. Köszönöm Prof. Joan Abbottnak, hogy megismertette velem a vér-agy gát kutatás világát, lelkesedése és a téma iránti elkötelezettsége engem is magával ragadott. Dr Tretter Lászlónak köszönöm a barátságát és türelmét; az utóbbit laborbeli ténykedéseim során sokszor próbára tettem. Köszönöm munkatársaim kitartó segítségét, és örülök, hogy sokukat egyben

Végül köszönetet szeretnék mondani a családomnak, akik akkor is hittek bennem, amikor önmagam kételkedtem a sikerben.

50

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ SAJÁT

1. Dömötör, E., Sipos, I., Kittel, A., Abbott, N.J. and Adam-Vizi, V. (1998). Improved growth of cultured brain microvascular endothelial cells on glass coated with a biological matrix. Neurochem. Int., 33, 473-478. IF: 2,175

2. Sipos, I., Dömötör, E., Adam-Vizi, V. and N.J. Abbott. (2000). The pharmacology of nucleotide receptors on primary cultured brain endothelial cells grown on a biological extracellular matrix: effects on intracellular calcium concentration. Br. J. Pharmacol., 131, 1195-1203. IF: 3,689

3. Sipos, I., Tretter, L. and Adam-Vizi, V. (2003). Quantitative relationship between inhibition of respiratory complexes and formation of reactive oxygen species in isolated nerve terminals. J. Neurochem. 84, 1-7. IF: 4,834

4. Sipos, I., Tretter, L. and Adam-Vizi, V. (2003). ÄØm- independent production of reactive oxygen species in intact isolated nerve terminals. Neurochem. Res. (közlésre elfogadva). IF: 1,638

A DOLGOZAT TÉMÁJÁHOZ SZOROSAN NEM KAPCSOLÓDÓ

1. Sipos, I., Törõcsik, B. and Adam-Vizi, V. (2003). Alteration of pH homeostasis by oxidative stress in rat brain capillary endothelial cells. Cell Mol. Neurobiol. (kézirat).

51

KONGRESSZUSI ABSZTRAKTOK

1. Sipos, I. és Ádám-Vizi, V. NUKLEOTID RECEPTOR KARAKTERIZÁCIÓ PRIMER AGYI KAPILLÁRIS ENDOTHEL SEJTEKEN. (poszter) Magyar Idegtudományi Társaság VI. Konferenciája, Harkány-Pécs, 1999.

2. Sipos, I. and Adam-Vizi, V. NUCLEOTIDE RECEPTORS IN PRIMARY RAT BRAIN CAPILLARY ENDOTHELIAL CELLS. (poszter) British Council- Hungarian Government Workshop, Dobogókõ, 1999.

3. Sipos,

I.

and

Adam-Vizi,

V.

NUCLEOTIDE

RECEPTOR

CHARACTERIZATION ON PRIMARY RAT BRAIN ENDOTHELIAL CELL CULTURE. (poszter) 2nd European Congress of Pharmacology, Budapest, 1999.

4. Sipos, I. And Adam-Vizi, V. NUCLEOTIDE RECEPTORS IN PRIMARY RAT

BRAIN

CAPILLARY

ENDOTHELIAL

CELLS.

(poszter)

J.

Neurochem. 73: S145-S145 Suppl. S 1999. Joint Meeting of International Society for Neurochemistry and European Society for Neurochemistry, Berlin, 1999.

5. Sipos, I., Tretter, L. and Adam-Vizi, V. OXIDATIVE STRESS INDUCED INTRACELLULAR CALCIUM AND pH CHANGES IN RAT BRAIN CAPILLARY

ENDOTHELIAL

CELLS.

(elõadás)

IVth

Conference of Cerebral Vascular Biology, Cambridge, 2001.

52

International

6. Sipos, I., Tretter, L. & Adam-Vizi, V. CALCIUM AN pH HOMEOSTASIS IN RAT BRAIN CAPILLARY ENDOTHELIAL CELLS. (poszter) J. Neurochem. 77, P0411 Suppl. 1 Jun 2001. “Advances in molecular mechanisms

of

neurological

disorders”,

European

Society

for

Neurochemistry, Perugia, 2001.

7. Tretter, L., Sipos, I., Környei, Á. and Adam-Vizi, V. INHIBITION OF ACONITASE BY FREE RADICALS PRODUCED IN SITU IN ISOLATED NERVE TERMINALS. (poszter) Society for Neuroscience 32nd Annual Meeting, Orlando, Florida, USA, 2002.

53

HIVATKOZÁSOK

1. Abbott, N.J. (2000). Inflammatory mediators and modulation of blood-brain barrier permeability. Cell and Mol. Neurobiology, 20,131-147. 2. Abbott, N.J. and Revest, P.A. (1991). Control of brain endothelial permeability. Cerebr. Brain Metab. Rev., 3, 39-72. 3. Abbott, N.J. and Romero, I.A. (1996). Transporting therapeutics across the blood-brain barrier. Mol. Med. Today, 2, 106-113. 4. Abbott, N.J., Hughes, C.C.W, Revest, P.A. and Greenwood, J. (1992). Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J. Cell Sci., 103, 23-38. 5. Abbracchio, M. and Burnstock, G. (1994). Purinoceptors: are there families of P2X and P2Y purinoceptors? Pharmacol. Ther., 64, 445-475. 6. Abbruscato, T.J. and Davis, T.P (1999). Combination of hypoxia/aglycemia compromises in vitro blood-brain barrier integrity. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 668-675. 7. Albert, J.L., Boyle, J.P., Roberts, J.A., Challiss, R.A.J., Gubby, S.E. and Boarder, M.R. (1997). Regulation of brain capillary endothelial cells by P2Y receptors coupled to Ca2+, phospholipase C and mitogen-activated protein kinase. Br. J. Pharmacol., 122, 935-941. 8. Andersson, U., Leighton, B., Young, M.E., Blomstrand, E. and Newsholme, E.A. (1998) Inactivation of aconitase and oxoglutarate dihydrogenase in skeletal muscle in vitro by superoxide anions and/or nitric oxide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 249, 512-516. 9. Anwar, Z., Albert, J.L., Gubby, S.E., Boyle, J. P., Roberts, J.A., Webb, T.E. and Boarder, M.R. (1999). Regulation of cyclic AMP by extracellular ATP in cultured brain capillary endothelial cells. Br. J. Pharmacol. 128, 465-471. 10. Arthur, F.E., Shivers, R.R. and Bowman, P.D. (1987). Astrocyte-mediated induction of tight junctions in brain capillary endothelium: an efficient in vitro model. Developmental Brain. Res. 36, 155-159. 11. Attardi, G. (1985). Animal mitochondrial DNA: an extreme example of genetic economy. Int Rev Cytol. 93, 93-145.

54

12. Audus, K.L. and Borchardt, R.T. (1987). Bovine brain microvessel endothelial cell monolayers as a model system for the blood-brain barrier. Ann. N.Y. Acad. Sci., 507, 9-18. 13. Barnard, E.A., Webb, T.E., Simon, J. and Kanapuli, S.P. (1996). P2 purinoceptors, localization and transduction mechanism. Wiley, Chichester (Ciba Foundation Symposium 198) pp 166-188. 14. Beal, M.F. (1996). Mitochondria, free radicals, and neurodegeneration. Curr. Opin. Neurobiol. 6, 661-666. 15. Beal, M.F. (1998). Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim. Biophys. Acta 1366, 211-223. 16. Betarbet, R., Sherer, T.B., MacKenzie, G., Garcia-Osuna, M., Panov, A.V. and Greenamyre, J.T. (2000). Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease. Nat Neurosci. 3, 1301-1306. 16. Boarder, M.R. and Hourani, S.M.O. (1998). The regulation of vascular function by P2 receptors: multiple sites and multiple receptors. TiPS., 19, 99107. 17. Bogdanov, Y.D., Wildman, S.S., Clements, M.P., King, B.F. and Burnstock, G. (1998). Molecular cloning and characterization of rat P2Y4 nucleotide receptor. Br. J. Pharmacol., 124, 428-430. 18. Boveris, A., Cadenas, E. and Stoppani, A.O.M. (1976). Role of ubiquinone in the mitochondrial generation of hydrogen peroxide. Biochem. J. 156, 435-444. 19. Boveris, A., Oshino, N. and Chance, B. (1972). The cellular production of hydrogen peroxide. Biochem. J. 128, 617-630. 20. Bültmann, R., Tuluc, F. and Starke, K. (1998). On the suitability of adenosine 3’-phoshpate 5’- phosphosulphate as a selective P2Y receptor antagonist in intact tissues. Eur. J. Pharmacol., 351, 209-215. 21. Cadenas, E., Boveris, A., Ragan, C.I. and Stoppani, A.O. (1977). Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome c reductase from beef-heart mitochondria. Arch. Biochem. Biophys. 180, 248-57. 22. Chen, B.C., Lee, C.-M. and Lin, W.-W. (1996). Inhibition of ecto-ATPase by PPADS, suramin anf reactive blue in endothelial cells, C6 -glioma cells and RAW 267.7 macrophages. Br. J. Pharmacol. 119, 1628-1634. 23. Chinopoulos, C. and Adam-Vizi, V. (2001). Mitochondria deficient in complex I activity are depolarized by hydrogen peroxide in nerve terminals: relevance to Parkinson’s disease. J. Neurochem. 76, 302-306.

55

24. Chinopoulos, C., Tretter, L., and Adam-Vizi, V. (1999). Depolarization of in situ mitochondria due to hydrogen peroxide-induced oxidative stress in nerve terminals: inhibition of alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J.Neurochem. 73, 220-228. 25. Davey, G.P. and Clark- J.B. (1996). Threshold effects and control of oxidative phosphorylation in nonsynaptic rat brain mitochondria. J. Neurochem. 66, 1617-1624. 26. Davey, G.P., Peuchen, S. and Clark, J.B. (1998). Energy thresholds in brain mitochondria. Potential involvement in neurodegeneration. J. Biol. Chem. 273, 12753-12757. 27. Dömötör, E., Abbott, N.J. and Adam-Vizi, V. (1999). Na+ -Ca2+ exchange and its implications for calcium homeostasis in primary cultured rat brain microvascular endothelial cells. J. Physiol. (Lond.), 515, 147-155. 28. Dömötör, E., Sipos, I., Kittel, A., Abbott, N.J. and Adam-Vizi, V. (1998). Improved growth of cultured brain microvascular endothelial cells on glass coated with a biological matrix. Neurochem. Int., 33, 473-478. 29. Dubey, R.K., Gillespie, D.G., Shue, H. and Jackson, E.K. (2000). A2B receptors mediate animitogenesis in vascular smooth muscle cells. Hypertension. 35, 267-272. 30. Earley, F.G., Patel, S.D., Ragan, I. and Attardi, G. (1987). Photolabelling of a mitochondrially encoded subunit of NADH dehydrogenase with [3H]dihydrorotenone. FEBS Lett. 219, 108-12. 31. Feolde, E., Vigne, P., Breittmayer, J.P. and Frelin, C. (1995) ATP, a partial agonist of atypical P2Y purinoceptors in rat brain microvascular endothelial cells. Br. J. Pharmacol. 121,1121-1126. 32. Forman, H.J. and Azzi, A. (1997). On the virtual existence of superoxide anions in mitochondria: thoughts regarding its role in pathophysiology. FASEB J. 11, 374-375. 33. Fredholm, B.B., Abbracchio, M.P., Burnstock, G., Dubyak, G.R., Harden, T.K. Jacobson, K.A., Schwabe, U. and Williams, M. (1997). Towards a revised nomenclature for P1 and P2 receptors. TiPS., 18, 79-82. 34. Frelin, C., Breittmayer, J.P. and Vigne, P. (1993). ADP induces inositol phosphate-independent intracellular [Ca2+] mobilization in brain capillary endothelial cells. J. Biol. Chem., 268, 8787-8792.

56

35. Gardner, P.R., Raineri, I., Epstein, L.B. and White, C.W. (1995) Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells. J. Biol. Chem. 270, 13399-13405. 36. Gordon, J.L. (1986). Extracellular ATP: effects, sources and fate. Biochem. J., 233, 309-319. 37. Gospodarowicz, D. (1984) Preparation of extracellular matrices produced by cultured bovine corneal endothelial cells and PF-HR-9 endodermal cells: their use in cell culture. In Methods for Preparation of Media Supplements and Substrata for Serum-free Animal Cell Culture, ed. Barnes, D.A., pp.275-293. Alan R. Liss 38. Grant, G.A., Abbott, N.J. and Janigro, D. (1998). Understanding the physiology of the blood-brain barrier: in vitro models. News Physiol. Sci., 13, 287-293. 39. Grynkiewicz, G., Poenie, M. and Tsien R.Y. (1985). A new generation of calcium indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem., 260, 3440-3450. 40. Hansford, R. G., Hogue, B. A., and Mildaziene, V. (1997). Dependence of H2O2 formation by rat heart mitochondria on substrate availability and donor age. J.Bioenerg.Biomembr. 29: 89-95. 41. Hausladen, A. and Fridovich, I. (1996). Measuring nitric oxide and superoxide: rate constants for aconitase activity. Methods Enzymol. 269, 3741. 42. He, P., Zhang, X. and Curry, F.E. (1996). Ca2+-entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability. Am. J. Physiol., 271, H2377-H2387. 43. Hoheisel, D. Nitz, T., Franke, H., Wegener, J. Hakvoort, A., Tilling, T. and Galla, H.J. (1998). Hydrocortisone reinforces the blood-brain barrier properties in a serum free culture system. Biochem. Biophys. Res. Com., 244, 312-316. 44. Jakel, R.J. and Maragos, W.F. (2000). Neuronal cell death in Huntington’s disease: a potential role for dopamine. Trends Neurosci. 23, 239-245. 45. Janigro, D., Nguyen, T.S., Gordon E.L. and Winn H.R. (1996). Physiological properties of ATP-activated cation channel in rat brain microvascular endothelial cells. Am. J. Phys. 270, H1423-H1434. 46. Joó, F. (1985). The blood-brain barrier in vitro: ten years of research on microvessels isolated from the brain. Neurochem. Int. 7, 1-25.

57

47. Joó, F. (1993). The blood-brain barrier in vitro: The second decade. Neurochem. Int. 23, 499-521. 48. Kauppinen, R. A. and Nicholls, D. G. (1986). Failure to maintain glycolysis in anoxic nerve terminals. J.Neurochem. 47: 1864-1869. 49. King, B.F., Townsend-Nicholson, A. and Burnstock, G. (1998). Metabotropic receptors for ATP and UTP: exploring the correspondance between native and recombinant nucleotide receptors. TiPS., 19, 506-514. 50. Kish. S.J., Bergeron. C., Rajput. A., Dozic. S., Mastrogiacomo. F., Chang. L.J., Wilson, J.M., DiStefano. L.M. and Nobrega. J.N. (1992). Brain cytochrome oxidase in Alzheimer's disease. J. Neurochem. 59, 776-779. 51. Klausner, R.D., Rouault, T.A. and Harford, J.B. (1993). Regulating the fate of mRNA: the control of cellular iron metabolism. Cell 72, 19-28. 52. Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., and Starkov, A. A. (1997). High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Lett. 416: 15-18. 53. Langston, J.W., Ballard, P., Tetrud, J.W. and Irwin, I. (1983). Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219, 979-80. 54. Laterra, J. and Goldstein, G.W. (1993). Brain microvessels and microvascular cells in vitro. In The blood-brain barrier: Cellular and molecular biology, ed. W.M. Partridge, pp. 1-24. new York: Raven Press. 55. Li Q-Y., Pedersen C., Day B.J. and Patel M. (2001). Dependence of excitotoxic neurodegeneration on mitochondrial aconitase inactivation. J. Neurochem. 78, 746-755. 56. Liang, L.P., Ho, Y.S. and Patel, M. (2000). Mitochondrial superoxide production in kainite-induced hippocampal damage. Neurosci. 101, 563-570. 57. Lin, C.Q. and Bissell, M.J. (1993). Multi-faceted regulation of cell differentiarion by extracellular matrix. FASEB J., 9, 737-743. 58. Liu, Y., Fiskum, G. and Schubert, D. (2002). Generation of reactive oxygen species by the mitochondrial electron transport chain. J. Neurochem. 80, 780787. 59. Lochen, G., Azzi, A. and Flohe, L. (1973). Mitochondrial H2 O2 formation: relationship with energy conservation. FEBS Lett. 18, 84-88.

60. Lochen, G., Flohe, L. and Chance, B. (1971). Respiratory chain linked H2 O2 production in pigeon heart mitochondria. FEBS Lett. 18, 261-264.

58

61. Mann, V.M., Cooper, J.M., Krige, D., Daniel, S.E., Schapira, A.H. and Marsden, C.D. (1992). Brain, skeletal muscle and platelet homogenate mitochondrial function in Parkinson's disease. Brain. 115, 333-42. 62. Marcus, A.J., Broekman, M.J., Drosopoulos, J.H.F., Islam, N., Alyonycheva, T.N., Safier, L.B., Hajjar, K.A., Posnett, D.N., Schoeneborn, M.A., Schooley, K.A., Gayle,R.B. and Maliszewski, C.R. (1997). The endothelial cell ectoATPase responsible for inhibition of platelet function in CD39. J.Clin. Invest., 99,1351-1360. 63. Mateo, J., Miras-Portugal, M.T. and Castro, E. (1996). Co-existence of P2Yand PPADS-insensitive P2U-purinoceptors in endothelial cells from adrenal medulla. Br. J. Pharmacol., 119, 1223-1232. 64. Miller, D.W., Audus, K.L. and Borchardt, R.T. (1992). Application of cultured endothelial cells of the brain microvasculature in the study of the blood-brain barrier. J. Tiss. Cult. Meth. 14, 217-224. 65. Mischeck, U., Meyer, J. and Galla, H.J. (1989). Characterization of γ-glutamyl transpeptidase activity of cultured endothelial cells from porcine brain capillaries. Cell Tissue Res., 256, 221-226. 66. Mizuguchi, H., Hashioka, Y., Fuyii, A., Utoguchi, N., Kubo, K., Nagakawa, S., Baba, A. Mayumi, T. (1994). Glial extarcellular matrix modulates γglutamyl transpeptidase activity in cultured bovine brain capillary and bovine aortic endothelial cells. Brain Res. 651, 155-159. 67. Mizuguchi, H., Utoguchi, N. and Mayumi, T. (1997). Preparation of glial extracellular matrix: a novel method to analyze glial-endothelial cell interaction. Brain Res. Prot., 1, 339-343. 68. Mohanty, J.G., Jaffe, J.S., Schulman, E.S. and Raible, D.G. (1997). A highly sensitive fluorescent micro-assay of H2 O2 release from activated human leukocytes using a dihydroxyphenoxazine derivative. J. Immunol. Methods 202, 133-141. 69. Mutisya, E.M., Bowling, A.C. and Beal, M.F. (1994). Cortical cytochrome oxidase activity is reduced in Alzheimer's disease. J Neurochem. 63, 21792184. 70. Nobles, M. and Abbott, N.J. (1998). Modulation of the effects of extracellular ATP on [Ca2+]I in rat brain microvascular endothelial cells. Eur. J. Pharmacol., 361, 119-127. 71. Nobles, M., Revest, P.A., Couraud, P.O. and Abbott, N.J. (1995). Characteristics of nucleotide receptors that cause elevation of cytoplasmic calcium in immortalized rat brain endothelial cells (RBE4) and in primary cultures. Br. J. Pharmacol.115, 1245-1252.

59

72. Olesen, S.-P. (1989). An electrophysiological study of microvascular permeability and its modulation by chemical mediators. Acta Physiol. Scand., 136, S1-S28. 73. Parker, W.D., Parks, J., Filley, C.M. and Kleinschmidt-DeMasters, B.K. (1994). Electron transport chain defects in Alzheimer's disease brain. Neurology 44, 1090-1096. 74. Parker, W.D., Boyson, S.J. and Parks, J.K. (1989). Abnormalities of the electron transport chain in idiopathic Parkinson's disease. Ann. Neurol. 6, 71923. 75. Patel, M., Day, B.J., Crapo, J.D., Fridovich, I. and McNamara, J.O. (1996). Requirement for superoxide in excitotoxic cell death. Neuron 16, 345-355. 76. Poulsen, S.A. and Quinn, R.J. (1998). Adenosine receptors: new opportunities for future drugs. Bioorg. Med. Chem., 6, 619-641. 77. Ragan, C.I., Wilson, M.T., Darley-Usmar, V.M. and Lowe, P.N. (1987). Mitochondria, a practical approach. (Darley-Usmar V.M., Rickwood D. and Wilson M.T., eds) pp. 79-112, IRL Press, London. 78. Ralevic, V. and Burnstock, G. (1996). Discrimination by PPADS between endothelial P2Y- and P2U-purinoceptors in the rat isolated mesenteric arterial bed. Br. J. Pharmacol., 118, 428-434. 79. Ralevic, V., Burrell, S., Kingdom, J. and Burnstock G. (1997). Characterization of P2 receptors for purine and pyrimidine nucleotides in human placental cotyledons. Br. J. Pharmacol., 121,1121-1126. 80. Rieske, J.S. (1967). Preparation and properties of reduced coenzyme Qcytochrome c reductase. Methods Enzymol. 10, 239-245. 81. Schapira, A.H.V., Cooper, J.M., Dexter, D., Clark, J.B., Jenner, P. and Marsden, C.D. (1990). Mitochondrial complex I deficiency in Parkinson’s disease. J. Neurochem. 54, 823-827. 82. Scott, I. D. and Nicholls, D. G. (1980). Energy transduction in intact synaptosomes. Influence of plasma-membrane depolarization on the respiration and membrane potential of internal mitochondria determined in situ. Biochem.J. 186: 21-33. 83. Starkov, A. A., Polster, B. M., and Fiskum, G. (2002). Regulation of hydrogen peroxide production by brain mitochondria by calcium and Bax. J.Neurochem. 83: 220-228. 84. Swerdlow, R.H., Parks, J.K., Miller, S.W., Tuttle, J.B., Trimmer, P.A., Sheehan, J.P., Bennett, J.P. Jr, Davis R.E. and Parker W.D. (1996). Origin and

60

functional consequences of the complex I defect in Parkinson's disease. Ann Neurol. 40, 663-71 85. Tagami, M., Yamagata, K., Fujino, H., Kubota, A., Nara, Y. and Yamori, Y. (1992). Morphological differences of endothelial cells co-cultured with astrocytes on type I. and type IV. Collagen. Cell and Tissue Res. 268, 225232. 86. Tamai, I. and Tsuji, A. (1996). Drug delivery through the blood-barrier barrier Adv. Drug. Delivery Rev., 19, 401-424. 87. Tatsuta, T., Naito, M, Miakami, K. and Tsuruo, T. (1994). Enhanced expression by the brain matrix of P-glycoprotein in brain capillary endothelial cells. Cell Growth Diff., 5, 1145-1152. 88. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D. and Galla, H.J. (1998). Basement membrane proteins influence brain capillary endothel barrier function in vitro. J.Neurochem., 71, 1151-1157. 89. Tretter, L. and Adam-Vizi, V. (2000). Inhibition of Krebs cycle enzymes by NADH production under oxidative stress. J. Neurosci. 20, 8972-8979. 90. Turrens, J.F. and Boveris, A. (1980). Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Biochem. J. 191, 421427. 91. Vasquez-Vivar, J., Kalyanaraman, B. and Kennedy M.C. (2000). Mitochondrial aconitase is a source of hydroxyl radical. J. Biol.Chem. 275, 14064-14069. 92. Vigne, P., Champigny, G., Marsault, R., Barbry, P., Frelin, C. and Lazdunski, M. (1989). A new type of amiloride sensitive cationic channel in endothelial cells of brain microvessels. J. Biol. Chem., 264, 7663-7668. 93. Vigne, P., Feolde, E., Breittmayer, J.P.and Frelin, C. (1998/a). Analysis of the influence of nucleotidases on the apparent activity of exogenous ATP and ADP at P2Y1 receptors. Br. J. Pharmacol., 125, 675-680. 94. Vigne, P., Lund, L. and Frelin, C. (1994). Cross-talk among Cyclic AMP, cyclic GMP, and Ca2+-dependent intracellular signalling mechanisms in brain capillary endothelial cells. J. Neurochem., 62, 2269-2274. 95. Votyakova, T.V. and Reynolds, I.J. (2001). ∆Ψm-dependent and –independent production of reactive oxygen species by rat brain mitochondria. J. Neurochem. 79, 266-277. 96. Webb, T.E., Feolde, E., Vigne, P., Neary, J.T., Runberg, A., Frelin, C. and Barnard, E.A. (1996). The P2Y purinoceptor in rat brain microvascular

61

endothelial cells couple to inhibition of adenylate cyclase. Br. J. Pharmacol., 119, 1385-1392. 97. Wharton, D.C. and Tzagoloff, A. (1967). Cytochrome oxidase from beef heart mitochondria. Methods Enzymol. 10, 245-250. 98. Zhang, Y., Marcillat, O., Giulivi, C., Ernster, L. and Davies, K.J. (1990). The oxidative inactivation of mitochondrial electron transport chain components and ATPase. J. Biol. Chem. 265, 16330-16336.

62