Rheumatoid kórképek autoimmun patomechanizmusának vizsgálata. Ortutay Zsuzsanna

Rheumatoid kórképek autoimmun  patomechanizmusának vizsgálata Doktori értekezés

Ortutay Zsuzsanna Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Buzás Edit egyetemi docens, az orvostudományok kandidátusa Hivatalos bírálók:

Dr. Sármay Gabriella PhD, DSc Dr. Dérfalvi Beáta PhD

Szigorlati bizottság elnöke:  Dr. Füst György PhD, DSc Szigorlati bizottság tagjai:

Dr. Kacskovics Imre PhD Dr. Treszl András MD, PhD

1

Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke..........................................................................................................4 Bevezetés...........................................................................................................................7 Irodalmi áttekintés..............................................................................................................9 Az egészséges ízületek felépítése és működése.............................................................9 Az ízületek felépítése................................................................................................9 RA, OA, SNSA patomechanizmusa és klinikuma.......................................................13 Rheumatoid arthritis................................................................................................13 Osteoarthritis...........................................................................................................20 Seronegativ spondarthritis.......................................................................................21 A synoviális folyadék összetevőinek változása gyulladásban. Az RA markerei és prediktorai ..................................................................................................................22 Prediktorok kutatásának szükségessége rheumatoid arthritisben............................22 Genetikai markerek.................................................................................................23 Immunológiai markerek..........................................................................................25 Érképződés..............................................................................................................30 Az ízületből származó markerek.............................................................................31 A porckárosodásban szerepet játszó proteázok.......................................................31 Glikozidázok...........................................................................................................39 Célkitűzések.....................................................................................................................45 Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata..............................45 Az RA patomechanizmusában esetlegesen szerepet játszó porc alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata..................................................................46 Betegek és módszerek......................................................................................................47 Mintagyűjtés................................................................................................................47 Betegek...................................................................................................................47 Szérum és synoviális folyadék minták....................................................................48 Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata..............................48 Glikozidáz tesztek...................................................................................................48 Mátrix metalloproteináz (MMP) aktivitás mérése...................................................49 A glikozidáz és MMP-tesztek statisztikai analízise.................................................49 A porcszövet vizsgálata glükózaminoglikán-specifikus Safranin O festéssel..........50 Glikozidáz-specifikus antitestek kimutatása synoviális folyadékban ELISA módszerrel..............................................................................................................52 Glikozidáz enzimek aktivitásának vizsgálata áramlási citometria segítségével.......53 A RA patomechanizmusában esetlegesen szerepet játszó porc alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata..................................................................53 A porcmátrix komponensek ellen termelt IgG és IgM típusú ellenanyagok kimutatása ELISA módszerrel................................................................................53 A porcmátrix komponensek ellen termelt, ELISA módszerrel kimutatott ellenanyagok statisztikai analízise..........................................................................55 Eredmények ....................................................................................................................56 Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata..............................56 Különböző ízületi bántalmakban szenvedő betegek synoviális folyadékában mérhető enzimaktivitások.......................................................................................56

1

A synoviális folyadék glikozidáz aktivitása, mint a rheumatoid arthritis prediktora... 57 A synoviális folyadék enzimaktivitásainak korrelációja.........................................59 A porcmátrix glükózaminoglikán-tartalmának kiürülése exoglikozidáz enzimek hatására...................................................................................................................61 A szérumban illetve a synoviális folyadékban mérhető, exoglikozidázokat felismerni képes ellenanyagok szintje.....................................................................63 Perifériás vérsejtek -D-glükuronidáz aktivitásának vizsgálata áramlási citometriával...........................................................................................................63 Az RA patomechanizmusában esetlegesen szerepet játszó porc alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata..................................................................65 IgG és IgM szintek összehasonlítása a különböző betegcsoportok szérumában és SF-ében...................................................................................................................65 A különböző porcmátrix-antigéneket felismerő emelkedett szintű ellenanyagok relatív gyakorisága..................................................................................................68 Klinikai és laboratóriumi paraméterek és az ellenanyag-szint összefüggéseinek vizsgálata RA betegcsoport esetén..........................................................................70 A különböző porcmátrix-komponensekre specifikus ellenanyagok közötti összefüggések vizsgálata.........................................................................................71 Megbeszélés.....................................................................................................................74 Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata..............................74 Az RA patomechanizmusában esetlegesen szerepet játszó porc alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata..................................................................79 Következtetések...............................................................................................................82 Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata..............................82 Az RA patomechanizmusában esetlegesen szerepet játszó porc alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata..................................................................83 Összefoglalás....................................................................................................................84 Summary..........................................................................................................................85 Irodalomjegyzék...............................................................................................................86 Saját publikációk jegyzéke.............................................................................................115 A disszertáció témájához kapcsolódó közlemények...................................................115 A disszertáció témájához nem kapcsolódó közlemények...........................................115 Köszönetnyilvánítás.......................................................................................................117

2

Rövidítések jegyzéke ACAST

Anti­calpastatin antibody

ADAM

A disintegrin and metalloproteinase

ADAM­TS

A   disintegrin   and   metalloproteinase   with   thrombospondin­like  motifs

AFA

Anti­fillagrin antibody

AKA

Anti­keratin antibody

ANA

Anti­nuclear antibody

ANCA

Anti­neutrophil cytoplasmic antibody

AP

Arthritis psoriatica

APF

Anti­perinuclear factor

APMA

 p­aminophenylmercuric acetate

AS

Ankylopoetica spondylitis

BSP

Bone sialoprotein

CCP

Cyclic citrullinated peptide

CIA

Collagen induced arthritis

CII

II. típusú kollagén

COMP

Cartilage oligomeric matrix protein

CRP

C­reactive protein

CSIF

Cytokine synthesis inhibitory factor

DMARD

Disease­modifying anti­rheumatic drug

EBV

Epstein­Barr vírus

ECM

Extracelluláris mátrix

EGF

Epidermal growth factor

ELISA

Enzyme­linked immunosorbent assay

EMMPRIN

Extracellular matrix metalloproteinase inducer

ESR

Erythrocyta sedimentációs ráta, vörösvértest süllyedés

3

FGF

Fibroblast growth factor

GAG

Glükózaminoglikán

GLUC

­D­glükuronidáz

GM­CSF

Granulocyte­macrophage colony­stimulating factor

HA

Hyaluronic acid

HB­EGF

Heparin­binding EGF­like growth factor

HC gp­39

Human cartilage glycoprotein­39

HEV

High endothelial venule

Hex

Hexosaminidase

HLA

Human leukocyte antigen

HMGB­1

High mobility group protein­1

IBD

Inflammatory bowel disease

ICAM­1

Intercellular adhesion molecule­1

ICTP

I. típusú kollagén karboxiterminális telopeptid

IGF

Insulin­like growth factor

IFN

Interferon gamma

Ig

Immunglobulin

IGF­1

Insulin­like growth factor­1

IGFBP­3

IGF binding protein­3

IL

Interleukin

IU

International unit

KO

Knock out

MHC

Major histocompatibility complex

MMP

Matrix metalloproteinase

NAG

­D­N­acetil­glükózaminidáz

NSAID

Non­steroidal anti­inflammatory drug

OA

Osteoarthritis

OD

Optikai denzitás

4

PAD

Peptidylarginine deiminase

PERCP

Peridinin chlorophyll protein

PIIINP

III. típusú prokollagén aminoterminális telopeptid

RA

Rheumatoid arthritis

ReA

Reactive arthritis

RECK

Reversion­inducing cystein­rich protein with Kazal motifs

RF

Reumafaktor

SF

Synovial fluid

SI

Sport injury

SNSA

Seronegative spondylarthritis

TGF­

Transforming growth factor­beta

h

Helper T lymphocyte

TIMP

Tissue inhibitor of metalloproteinases

TNF­ 

Tumor necrosis factor­alpha

VEGF

Vascular endothelial growth factor

5

Bevezetés A   gyulladásos   és   degeneratív   ízületi   kórképek   napjainkban   egyre   inkább   a  figyelem előterébe kerülnek. E nagy betegségcsoport esetében az életminőség súlyos  romlása   következik   be,   krónikus   fájdalom   jelentkezik,   a   kialakuló   deformitások  gyakran   mozgáskorlátozottsághoz   és   ennek   következtében   a   munkavégző   képesség  csökkenéséhez,   gyakran   teljes   elvesztéséhez   vezetnek.   A   fentiekben   vázolt  népegészségügyi probléma megoldása mindmáig  várat magára,  hiszen a  gyulladásos  ízületi   kórképek   autoimmun   etiológiája   nem   ismert   pontosan,   így   oki   terápia   és  megelőzés sem tervezhető. Az   ízületi   betegségekben   a   legjelentősebb   klinikai   tüneteket   és   a   beteg  mozgáskorlátozottá válását a hialinporc visszafordíthatatlan károsodása okozza. Ebben  a folyamatban a porc alapállomány komponenseinek (II. típusú kollagén és aggrekán)  hasítására   képes   enzimeket   tartják   a   legfőbb   effektor   molekuláknak.   A   porcmátrix  degradálódásával párhuzamosan a porcsejteket közvelenül is érhetik citotoxikus illetve  apoptózis­indukáló hatások.  Újabban   mind   több   ismeret   áll   rendelkezésre   a   porcdegradáció   illetve   a  proteolitikus   hasítás   folyamataira   vonatkozóan.   Elsősorban   különböző   proteázokat  hoztak   összefüggésbe   a   porcdestrukciós   folyamatokkal,   köztük   a   mátrix  metalloproteinázokat, az ADAM család (1), az ADAM­TS család (2) tagjait és szerin­ proteázokat   (elasztáz,   katepszinek   és   granzimok)   (3,4,5).   A   glikohidrolázok  enzimcsaládja azonban az utóbbi évtizedekben kikerült az arthritis­kutatások fókuszából  annak ellenére, hogy az 1970­es években számos kutatócsoport leírta a glikozidázok  emelkedett szintjét rheumatoid betegségekben (6,7,8). Az érdeklődés hiánya meglepő  annak   fényében,   hogy   a   legtöbb   porc   alapállományt   felépítő   molekula   glikozilált, 

6

közülük néhány extrém mennyiségben hordoz cukoroldalláncot. A szénhidrátok, főként  a glükózaminoglikán oldalláncok (melyek pl. az aggrekán esetében a molekulatömeg  közel 90 %­át teszik ki!) szignifikánsan gátolhatják a sejtközötti állomány proteolitikus  hasítását az ízületben. Az utóbbi években számos autoimmun betegség esetében sikeresen  azonosították  az   autoantigéneket.   Azonban   a   széleskörű   kutatások   ellenére   az   RA   autoantigénje  mindez   idáig   ismeretlen   maradt.   Mivel   az   autoimmun   ízületi   destrukció   elsődleges  célpontja a hialinporc, az ennek felépítésében résztvevő molekulák, mint az autoimmun  folyamatok   nyilvánvaló   célpontjai   vehetők   számításba.   Az   immunrendszer   általi  felismerésük krónikus, progresszív autoimmun gyulladást eredményezhet. A hialinporc sejtközötti állományát felépítő molekulák közül a II. típusú kollagént  tanulmányozták   legbehatóbban   (9,10,11,12,13).   Szintén   ismert,   hogy   az   aggrekánt  ellenanyagok illetve T­sejtek ismerik fel számos különböző ízületi kórkép esetén (14).  A   fibronektin   egy   másik   porcmátrix   komponens,   mely   RA­ban   szenvedő   betegek  szabad ízületi felszínén található, és az immunfelismerés célpontja lehet (15). Számos  kutatócsoport foglalkozott az utóbbi években a HC gp­39 molekulával, mint az RA egy  lehetséges   autoantigénjével   (16,17).   Azonban   az   RA   autoantigénjének   molekuláris  természetére vonatkozó kérdés mindeddig megválaszolatlan maradt.

7

Irodalmi áttekintés Az egészséges ízületek felépítése és működése Az ízületek felépítése Szöveti felépítés

A   synoviális   ízületekben   az   ízületi   felszíneket   hialinporc   (üvegporc)   borítja  (3. ábra),   mely   a   nagyfokú   mechanikai   igénybevételnek   megfelelően   módosult.  Felnőttekben   lényegében   avascularis,   nyirokelvezetése,   idegellátása   nincs.  Alapállománya   közvetlenül   érintkezik   az   ízület   üregében   található   synoviális  folyadékkal   (SF).   A   porc   alapállományának   termeléséért   és   állandóságának  fenntartásáért a porcsejtek felelősek. A   porcsejtek   (kondrociták)   csupán   kis   számban   vannak   jelen.   Többnyire  párosával   helyezkednek   el   a   kondronokban.   Porcsérülést   követően   nem,   vagy   alig  képesek osztódni, és a mátrixba ágyazott kondrociták sem tudnak a sérült porcterületre  vándorolni, így a hialinporc regenerációra nem képes. A porcszövet alapállománya felelős a porcszövet rendkívüli rugalmasságáért és  ellenállóságáért. Szerkezete nagyfokú molekuláris rendezettséget  mutat (3. ábra). Az  ízfelszíntől,   a   porcsejtektől   való   távolságtól,   valamint   a   rendszeres   mechanikai  terheléstől függően más és más a mátrix szerkezete. A porcfelszínnel párhuzamosan  megfigyelhető a felületi, az intermedier, a mély vagy radier, valamint az elmeszesedett  porc zónája, míg a porcsejtek felől távolodva a pericelluláris (capsula), territoriális és  interterritoriális mátrixrégiókat különböztethetjük meg (18). A mátrix felépítésében számos molekula vesz részt, ezek minősége és mennyisége  a mechanikai megterheléssel változik.

8

1. ábra: Az ízület felépítése A csontok teherviselő felszíneit porcszövet borítja, mely a fizikai igénybevétlenek megfelelően alakult ki.   A porcszövet alapállományában a kodorciták kondronokban helyezkednek el. Az alapállomány szerkezete   az   ízfelszíntől   és   a   porcsejtektől   való   távolságtól   függően   változik.   A   mátrix   felépítésében   résztvevő   molekulák nagy  részét proteoglikánok  teszik ki, melyek  a rosthálózatot  képező kollagénmolekulákhoz   kapcsolódnak.

Molekuláris felépítés

Az   ízületi   porcmátrix   tömegének   legnagyobb   részét   (65­80   %)   víz   teszi   ki,  amelyet az erősen negatív töltésű (szulfát csoportokat tartalmazó) glükózaminoglikán  (GAG)­molekulák kötnek meg másodlagos kötéssel. A GAG­ok ismétlődő diszacharid  egységekből   épülnek   fel,   melynek   egyik   tagja   mindig   egy   aminocukor,   a   másik  általában   hexuronsav   (2.   ábra).   Terminális   cukormolekulájukkal   egy   központi  fehérjeszálhoz (core protein) kapcsolódnak, így proteoglikánokat képeznek. Ilyen GAG­ molekula   pl.   a   kondroitin   szulfát.   A   proteoglikánok   közül   a   leggyakoribb   a   nagy 

9

aggregáló proteoglikán, azaz aggrekán, amely a porc nedves súlyának kb. 3­10 %­át  teszi ki.

2. ábra: A proteoglikánok sematikus felépítése (19) A proteoglikánok felépítésében a központi fehérjelánchoz (magfehérje) számos cukor oldallánc kapcsolódik. A cukor oldalláncok (glükózaminoglikánok) ismétlődő diszacharid egységekből épülnek föl, melyek egyik tagja egy aminocukor, a másik általában hexuronsav. A GAG-ok erősen negatív töltésűek, így másodlagos kötésekkel nagy mennyiségű vízmolekula kapcsolódik hozzájuk.

A   kis   proteoglikánok   jóval   rövidebb   fehérjelánccal   rendelkeznek,   mint   az  aggrekán,   és   a   fehérjevázhoz   mindössze   néhány   glükózaminoglikán   oldallánc  kapcsolódik.   Egyik   képviselőjük   a   dekorin,   egyetlen   dermatán­szulfát/   kondroitin­ szulfát oldalláncot visel, és feltehetőleg a kollagénrostok átmérőjének szabályozásában  játszik   szerepet.   A   biglikán   esetében   két   dermatán­szulfát   oldallánc   kapcsolódik   a  fehérjéhez, míg a fibromodulin négy keratán­szulfát oldallánccal rendelkezik. A   porcmátrix makromolekulák  másik  nagy családja  a kollagén család,  mely a  nedves súly 10­30 %­áért felelős. A hialinporcban előforduló kollagének 90­95 %­a II.  típusú   kollagén,   mely   rosthálózatot   képez   az   alapállományban.   A   minor   kollagének  közül   a   rostképzésben,   illetve   a   rostátmérő   szabályozásában   a   IX.   és   a   XI.   típusú 

10

kollagén játszik szerepet. A X. típusú kollagén hipertrófiás porcsejtek környezetében  fordul  elő, a VI. kollagén a kondron  alkotásában vesz  részt, az V. kollagén szintén  megtalálható az üvegporc alapállományában. A kollagének és proteoglikánok mellett egyéb mátrixproteinek is részt vesznek az  alapállomány   felépítésében.   A   link   protein   a   proteoglikán­aggregátumok  stabilizálásában   játszik   szerepet.   A   fibronektin   és   az   ankorin   II   a   sejt   ­   mátrix  kölcsönhatásban   vesz   részt.   A   COMP   (cartilage   oligomeric   matrix   protein)   az  interterritoriális   mátrix   fontos   alkotója.   Ezek   mellett   számos   egyéb,   jelenleg   nem  tisztázott funkciójú fehérje is ismert az alapállományban. Mindezek   a   makromolekulák   szövevényes   hálózatot   alakítanak   ki,   melynek  középpontjában a porcsejtek állnak. A hozzájuk horgonyzott kollagén II. és a minor  kollagének a porc húzószilárdságát, a hialuronsav ­ link protein ­ aggrekán aggregátum  pedig a porc rugalmasságát biztosítja (18). A synoviális membrán

Synoviális membránnak nevezzük az ízületi üregeket bélelő hártyát. Ez borítja az  ízületek  nem  teherviselő  felszíneit,   az  intraarticularis  képleteket   (szalagok,  inak),  az  ízületi   tokot,   valamint   fedi   a   csontnak   az   ízületi   felszínét.   A   synoviális   membrán  bolyhos felszínű, laza, mesenchymális eredetű kötőszövet. Sejtjei termelik a synovium  proteoglikánokban, illetve hialuronsavban gazdag alapállományát, melyben többnyire  kevés, lazán rendezett kollagén rostot találunk. Normál körülmények között a synoviális  membrán   csupán   egy   ­   két   sejtréteg   vastagságú   (18,20).   Ennek   felszínén   1   ­   3,  viszonylag laza rétegben helyezkednek el a synoviális fedősejtek vagy synoviocyták,  melyeknek két típusát különböztetjük meg: az A­típusú fagocita tulajdonságú és a B­ típusú   fibroblaszt­szerű   synoviocytát.   Ez   utóbbi   termeli   a   hialuronsavat,   illetve  hozzájárul   az   ízületi   nedv   termeléséhez,   míg   az   A­típusú   synoviocyták   a   monocita­

11

makrofág rendszer részét képezik. A   fedősejtek   alatti   kötőszövetes   réteg   fibroblasztokat,   dendritikus   sejteket,  hízósejteket, vér­ és nyirokereket foglal magában. Az egészséges synoviális fedősejtek  MHC   II   molekulát   expresszálnak   felszínükön  (21,22),   így   adott   esetben  hozzájárulhatnak a lokális T­sejt aktivációhoz (23,24). A synoviális folyadék (SF)

A   synovia   elnevezés   Paracelsustól   származik,   akit   az   ízületi   folyadék   a  tojásfehérjére   emlékeztetett.   Az  egészséges   synoviális   folyadék   tiszta,   világossárga,  viszkózus, nem rögös folyadék, lényegében plazmaultrafiltrátumnak tekinthető, melyet  a   porcszövet   és   a   synoviális   membrán   sejtjei   által   termelt   anyagok   módosítanak.  Kémhatása enyhén bázikus (pH=7­7,8). Nagy  mennyiségben tartalmaz  hialuronsavat,  melyet  a synoviocyták,  illetve az  alattuk   elhelyezkedő   kötőszövetes   rétegben   található   fibroblasztok   termelnek.   Ez   a  molekula felelős az SF normális viszkozitásának biztosításáért. Az   SF   fehérjetartalma   majdnem   teljes   egészében   a   vérplazmából   származik.  Legfontosabb   feladatai   az   ízületi   porc   táplálása,   az   ízület   "kenése",   az  anyagcseretermékek forgalma (25).

RA, OA, SNSA patomechanizmusa és klinikuma Rheumatoid arthritis A  rheumatoid   arthritis   (RA)  lényegét   a   18.   században   írták   le   először.   Ez   a  betegség   elsősorban   az   ízületeket   támadja   meg,   és   lassú   károsodásukhoz   vezet,   de  esetenként   egyéb   szervrendszereket   is   érint.   Nemcsak   fájdalommal,   a   munka­   és  mozgásképesség   elvesztésével,   így   az   életminőség   romlásával   jár,   de   a   várható  élettartamot is csökkenti.

12

Kezdetben különböző  klinikai megfigyelések alapján különböztették  meg ezt  a  betegséget az egyéb nagy ízületi kórképektől, mint a köszvény, a reumás láz. Olyan  megkülönböztető jegyeket ismertek föl, mint a betegség krónikussága, a nőkben való  gyakoribb   előfordulása   és   az   ízületek   deformálódása.   A   "rheumatoid"   megjelölés   a  görög   "rheumos"   szóból   származik,   melynek   jelentése  folyadék.   A   "rheumatoid   arthritis" megjelölést először Alfred Baring Garrod használta 1859­ben (26). Ő volt az  első, aki elkülönítette az RA­t a köszvénytől, bár az osteoarthritis (OA) betegség még  benne foglaltatott az általa RA­nak nevezett betegségcsoportban. 1907­ben Garrod fia  volt  az, aki a RA és  az OA  között a mai napig  használt  megkülönböztető  jegyeket  felismerte és leírta, bár az OA kifejezést már 1888­ban is használták (27). Rheumatoid arthritis klinikai képe

Az RA első tünetei az ízületi fájdalom és duzzanat, majd néhány óra inaktivitás  után  jelentkező általános  fáradtság és merevség. A leggyakrabban érintett  ízületek a  proximális   interphalangealis   ízületek,   csukló,   térd,   boka   és   a   metatarsophalangeális  ízületek  (.   ábra)   (28,29).   A   visszatérő   gyulladás   végső   soron   különböző   mértékű  porckárosodáshoz, illetve rokkantsághoz vezet. A   tudományos   irodalomban   az   RA   diagnózisának   felállításához   az   American  College   of   Rheumatology   által   kidolgozott   kritériumokat   használják   (30).  Ezek   a  kritériumok a tünetek és a laboratóriumi eredmények azon részét foglalják magukban,  amelyek az RA­ban szenvedő betegek túlnyomó többségére jellemzőek, de ezek közül  egy sem jelenik meg minden RA­ban szenvedő beteg esetén kötelező érvénnyel. Az RA prevalenciája világszerte körülbelül 0,5­1%, nőkben az előfordulása 2­3­ szor gyakoribb, mint férfiakban (32,33). Az RA idő előtti halálozáshoz vezethet, mely  leggyakrabban   szív­   és   érrendszeri   okokra   vezethető   vissza   (34,35).   A   rheumatoid 

13

3. ábra: Rheumatoid elváltozások a kézen (31)

arthritis az osteoporosis fokozott kockázatával jár (36). A rheumatoid arthritis etiológiája

Az   RA   kialakulásának   okai   mindmáig   nem   teljesen   tisztázottak.   Számos  tanulmány   családon  belüli   halmozódásról   tudósít.   Az   RA   konkordanciája   egypetéjű  ikrek esetén kb. 15 %, mely a betegség kifejlődésében a genetikai tényezők mellett a  környezeti faktorok szerepére is felhívja a figyelmet (37,38). Az RA kialakulásával számos környezeti tényező mutat összefüggést. Ezek közül  a   dohányzás   tűnik   a   legfontosabbnak   (39,40,41),   de   a   szoptatás,   a   korábbi  vérátömlesztés   és   az   elhízás   is   fontos   rizikófaktorok   (42).   Többféle   fertőzést   is  összefüggésbe   hoztak   a   betegség   kialakulásával,   úgymint   a   mycobaktériumokat,  proteust, E. colit, a vírusok közül pedig az Epstein­Barr vírust (EBV), a rubeola vírusát,  a parvovírus B19­et és a retrovírusokat (18). Úgy tűnik, az ízületi károsodásban és a gyulladás kialakulásában a fő szerepet már  a betegség korai stádiumában is a citokinek és a hasító enzimek játsszák (43). A citokin 

14

expresszió mértéke jelentős heterogenitást mutat az egyes RA­ban szenvedő betegek  esetében   (44).   Az   általános   vélemény   az,   hogy   az   RA­ban   a   citokinegyensúly   a  proinflammatorikus   citokinek   irányába   billen   az   antiinflammatorikus   citokinek  ellenében. Az   RA   igen   összetett   betegség,   és   bár   a   kiváltó   ok   nem   teljesen   tisztázott,   a  tünetek   kialakulásának   hátterében   autoimmun   patomechanizmus   áll.   Azok   között   az  antigének között, melyek az autoimmunitás célpontjai  lehetnek, szerepel a II. típusú  kollagén, a HC gp 39, valamint hősokk proteinek (45). Azonban annak is felvetődik a  lehetősége,   hogy   az   autoimmunitás   egyetlen   porcspecifikus   autoantigén   helyett  ubikviter antigénnel szemben alakul ki (46,47,48). Mindent egybevetve, az RA kifejlődésében mind genetikai, mind pedig környezeti  tényezők szerepet játszanak. A betegség egyes HLA DR (pl. HLA DR4) allélekhez való  asszociációja feltételezi, hogy RA­ban a T­sejt ­ közvetített immunválasz játszik fontos  szerepet,   habár   külső   körülmények   is   fontosnak   tűnnek   a   betegség   kifejlődése  szempontjából. A rheumatoid arthritis patogenezise

Széles körben elterjedt nézet szerint az RA a synovium gyulladása, melynek során  az ízületi hártya sejtjei számos osztódáson mennek keresztül; így alakul ki a pannus,  mely azután rákúszik a porc felszínére és annak károsodását idézi elő (4. ábra) (50). Az  RA kifejlődésében számos különböző gyulladásos sejt (például T­sejtek, makrofágok)  és   az   ízület   állandó   sejtjei   közötti   kommunikáció   játszik   lényeges   szerepet.   Az   RA  patogenezisének   megértése   igen   fontos   a   specifikus   és   hatásos   terápiás   eljárások  kifejlesztése szempontjából.

15

4. ábra: A rheumatoid arthritis kialakulása a térdízületben (49) Egészséges térdízületben a synovium csupán az egy-két sejtrétegből álló synoviális membránt és az alatta húzódó kötőszöveti réteget tartalmazza. Korai RA-ban a synoviális membrán megvastagszik a synoviális fedősejtek osztódása és megnagyobbodása miatt. A synoviumban új erek képződnek. T- és B-sejtek szűrődnek be a synoviális membránba. Ezek a sejtek az SF-ben is megtalálhatók, ahol nagyszámú neutrofil granulocita is kimutatható. Az RA korai fázisában a synoviális membrán kezd ráhúzódni a porcállományra. Későbbi fázisban (az ábrán: kifejlett RA) a synoviális membrán gyulladásos szövetté, az ún. pannusszá alakul át. Ez ráhúzódik a szomszédos porc- és csontterületekre és degradálja azokat.

Rheumatoid synovium

RA­ban a synoviális fibroblasztok osztódnak, a synovium megvastagszik, új erek  képződnek.   Az   endothelium,   mely   ezeket   az   új   ereket   is   béleli,   sajátos   struktúrává,  magas   endotheliumú   venulává   (HEV)   alakul   (51).   A   HEV   ­   szerkezet   specifikus 

16

adhéziós   molekulák   és   kemokin   receptorok   expressziójával   elősegíti   a  fehérvérsejteknek az erek üregéből a synoviális szövet terébe történő  vándorlását  (51, 52). A synoviális membránban található T­ sejtek főként CD4+, érett, aktivált memória  sejtek   (53).   Ezek   mellett   B­   sejtek,   monocyták,   hízósejtek,   makrofágok,   dendritikus  sejtek,   fibroblasztok   és   mesenchymális   sejtek   is   közreműködnek   a   gyulladásban.  Ráadásul   számos   pro­   és   antiinflammatorikus   citokin   is   expresszálódik   a   szövetben  (49).   A   citokin   ­   mintázatban   az   RA­ban   szenvedő   betegek   óriási   heterogenitást  mutatnak, s ez eltérő megbetegedési útvonalakra utal (44). Időközben kialakul a pannus. Ez nagy mennyiségű synoviális membránsejtből áll,  és ráterjed mind a porcra, mind a csontra. Az RA pannus szövete a transzformált sejtek  számos jellemvonását mutatja: rákúszik a porcra és a csontra, és erodálja őket, új erek  képződnek benne, sejtjeiben onkogén expresszió is megfigyelhető (54). A pannus és a  porc közötti rést főként aktivált makrofágok és synoviális fibroblasztok veszik birtokba.  A gyulladási mediátorok magas szintje stimulálja a mesenchymális sejtek (synoviális  fibroblasztok, oszteoklasztok és kondrociták) szövetbontó mátrix metalloproteinázainak  (MMP) szekrécióját, így további szövetkárosodást okoznak (49,55). Az interleukin­1  (IL­1)   és   a   TNF­  stimulálják   az   endotheliális   sejtek   adhéziós   molekuláinak  expresszióját, és fokozzák a neutrofil granulociták toborzását az ízületbe. Ezek a sejtek  elasztázt és proteázokat termelnek, melyek a porc felszíni rétegének proteoglikánjait  emésztik (56). A proteoglikánok kiürülése lehetővé teszi az immunkomplexek számára,  hogy precipitálják a felszíni réteg kollagénjeit (57). A kondrociták és a fibroblasztok az  IL­1, TNF­  illetve aktivált CD4+  T­sejtek stimulatív hatására fokozzák a különböző  szövetbontó proteázok termelését. A proteolitikus enzimek mind a négy nagy családja  (aszparagin­, cisztein­, szerin­ és metalloproteinázok) részt vesz a porcszövet normális 

17

turn overében illetve a patológiás szövetroncsolásban. Ezek a szövetbontási útvonalak  nem   kizárólagosak,   és   igen   valószínű,   hogy   a   porcszövet   alapállományának   teljes  lebontásában többféle útvonal, illetve a proteázok több családja is részt vesz (27). Állatmodellekben az aktivált CD4+ T­ sejtek stimulálják az oszteoklasztogenezist,  így ízületi károsodást okozhatnak az IL­1­től, illetve a TNF­­tól független módon is.  Újabban   fontos   szerepet   tulajdonítanak   a   HMGB­1­   nek   (high   mobility   group   box  chromosomal protein 1) is. Ezt a citokint az aktivált monociták és makrofágok termelik  és szecertálják az SF­be, illetve a synoviális membránba (58,59). HMGB­1 szabadulhat  fel   számos   sejttípus,   köztük   az   endotheliális   sejtek   nekrózisa,   vagy   egyéb   típusú  károsodása   során   is   (60).  Az   extracelluláris   HMGB­1   hatására   a   makrofágok  proinflammatorikus   citokineket   (TNF,   IL­1,   IL­6)   termelnek   (59).   Ezen   molekula  expressziója   fokozódott   TNF­  stimuláció   hatására   (58).   A   HMGB­1   késői  mediátorként hat, és hozzájárul a szisztémás gyulladás fenntartásához (59,61,62,63). Összegzésképpen elmondhatjuk, hogy a rheumatoid arthritis etiológiája mindmáig  ismeretlen,   bár   genetikai,   fertőzéses,   környezeti   és   hormonális   faktorok   is   előtérbe  kerültek   a   betegség   okainak   kutatása   során.   A   betegség   molekuláris   szinten   való  megértése   számos   okból   fontos.   Tudásunk   alapján   új   modelleket   dolgozhatunk   ki,  melyek  segíthetnek   több   szemszögből   megérteni   a   betegséget.   A   molekuláris   szintű  megértés alapján az orvosok elmagyarázhatják a betegnek és családtagjainak a betegség  okait   és   tüneteit.   Azonban   talán   a   legfontosabb,   hogy   ez   a   tudás   segíthet   hozzá   a  hatékonyabb   kezeléshez   specifikus   célmolekulák   azonosításával,   melyekkel   szemben  potenciális terápia fejleszthető ki.

Osteoarthritis Az osteoarthritis (OA) az arthritisek egyik legrégebben ismert és leggyakoribb 

18

típusa.   Az  ízületi  porc   kopása  jellemzi,   melyet  gyakran  az   ízület  összecsontosodása  követ. Leggyakrabban a középkorú és idős embereket érinti, nőket gyakrabban, mint  férfiakat.   Legtöbbször   a   kéz,   valamint   a   testsúly   hordozásában   résztvevő   ízületek  érintettek, mint a csípő, a térd, a lábak és a gerinc ízületei (5. ábra).

5. ábra: Az osteoarthritis megjelenése kézen   (31)

Az OA kialakulásának oka sokféle lehet, ami azonban leggyakrabban ismeretlen  marad, ilyenkor elsődleges OA­ ről beszélünk. Ha ismert az ok, akkor másodlagos OA­  ről   van   szó.   Bár   az   öregedéssel   fokozódik   az   OA   kialakulásának   kockázata,   ez   a  betegség nem elkerülhetetlen velejárója az idős kornak. Másodlagos OA kialakulásához  vezethet például az elhízás. Ezen kívül sportolásból származó, baleseti, vagy bármely  egyéb   okból   kialakult   ízületi   sérülés   fokozott   kockázati   tényezőt   jelent   az   OA  kialakulása szempontjából. Szintén fontos rizikófaktor a születéstől fogva rendellenes  ízület,   a   köszvény,   a   cukorbetegség   és   egyéb   hormonális   zavarok.   A   környezeti  tényezők mellett a genetikai háttérnek is szerepe lehet a betegség megjelenésében. Míg az arthritis számos formája szisztémás betegség, addig az OA nem támad  meg más szervet, kizárólag az ízületek betegsége. (18,64,65,66).

19

Seronegativ spondarthritis A   seronegativ   spondarthritis   (SNSA)   betegségcsoportot   jelent,   mely   három  évtizednél   alig   idősebb. 

A   spondarthritisek   kombinált   prevalenciája   az 

átlagpopulációban körülbelül 1 %, amely nagyságrendjét tekintve összehasonlítható az  RA­ val (67). Ebbe a betegségcsoportba soroljuk a spondylitis ankylopoetica­ t (AS), a  reaktív arthritiseket (ReA), az arthritis psoriatica­ t (AP), a Reiter ­ kórt, valamint az  idült   gyulladásos   bélbetegségekhez   társuló   spondarthritiseket.   Ezen   betegségek   egy  csoportba foglalását Moll és Wright javasolták főként klinikai adatokra támaszkodva  (68).  Az idesorolt betegek jellemzően nem rendelkeznek reuma faktor pozitivitással,  innen a szeronegatív elnevezés. Az ízületek és a gerinc egyaránt érintettek lehetnek. E  betegségek kialakulásának feltehetőleg genetikai alapja van, mivel ezek a kórképek a  70­es   évek   elején   felfedezett   HLA   B27   génnel   mutatnak   asszociációt,   valamint   a  betegségek családi halmozódása is gyakori (18). Intenzív kutatások ellenére a HLA B27  szerepe a betegség patogenezisében ismeretlen maradt, bár számos elméletet állítottak  fel az összefüggés magyarázatára  (69).    A  kutatások azt igazolták, hogy a HLA B27  génje   mellett   még   legalább   négy   további   genetikai   marker   mutat   asszociációt   a  betegségcsoporttal (70).  Az   SNSA   betegségcsoport   további   közös   jellemzői,   hogy   asszimmetrikus  eloszlásban, főként az alsó végtagi nagy ízületeken lép fel gyulladás, és radiológiai úton  kimutatható   sacroileitis,   szalagmeszesedés,   gyulladásos   reaktív   csontjelenségek  figyelhetők   meg   a   gerincen.   Az   ízületi   érintettség   mellett   jellemzőek   a   bőr­   és  nyálkahártyatünetek   és   az   iritis.   A   betegség   gyakran   spondylitis   ankylopoeticahoz  asszociált  szívmanifesztációkat is mutat. Az RA­ val szemben rheumatoid csomó nem  fordul   elő.   Számos   tanulmány   szolgáltat   indirekt   bizonyítékot   arra   nézve,   hogy   a  spondyloarthopathiáknak   immunmediált   patogenezise   van.   Reaktív   arthritisben 

20

szenvedő betegek nagy részének véréből és SF­éből aktivált T­ limfocitákat mutattak ki  (71). Gyulladt sacroilialis ízületből biopsziával vett mintán egyértelműen kimutathatóak  különféle proinflammatorikus citokinek, például a TNF­ (72) fokozott expressziója, és  a betegség nagy mértékben javul anti­TNF­ kezelés hatására (73).

A   synoviális   folyadék   összetevőinek   változása   gyulladásban.   Az  RA markerei és prediktorai  Prediktorok kutatásának szükségessége rheumatoid  arthritisben A mechanizmus, amely kivédi a fertőzést és megvéd a malignus transzformációtól  ugyanaz, mint amely RA­ban a szövetet károsítja. A rheumatoid arthritisben szenvedő  egyén esetében ezek a szövetkárosító folyamatok az egészséges szövetet veszik célba  kórokozó mikroorganizmusok, illetve malignus sejtek helyett. Az RA diagnózisának korai  felállítása  és  a betegség kimentelének  megbízható  előrejelzése a korai arthritisszel foglalkozó klinikák legfontosabb feladata a betegség  kezdeti szakaszában (74). Az RA lefolyása igen eltérő lehet az egyes betegek esetén, az  enyhe,   a   kezelésekre   jól   reagáló   formától   az   agresszív,   a   klasszikus   terápiás  beavatkozásokra   nem   reagáló   formáig.   Meglehetősen   gyakori   a   porc   komoly  károsodásának   és   a   betegség   extra­artikuláris   manifesztációjának   korai   megjelenése,  mely megrövidítheti a beteg életét (75). Azok a betegséget befolyásoló gyógyszerek és  új biológiai anyagok egy része, amelyeket bevezettek a klinikai gyakorlatba, képesek  csökkenteni a betegségnek mind a klinikai, mind pedig a laboratóriumi tüneteit, illetve  gátolni a porckárosodás kialakulását. Ezért ezeket a gyógyszereket korán és megfelelő  dózisban kell adni a betegnek. Azonban tekintettel arra, hogy a hibásan alkalmazott  agresszív kezelés deformitásokhoz és rokkantsághoz vezethet, illetve ezen gyógyszerek 

21

költségei   igen   magasak,   szükséges   olyan   paramétereket   találni,   melyek   hatékonyan  jelzik előre az agresszív kórlefolyást. Mindez megmagyarázza, miért került az érzékeny  és specifikus prognosztikus faktorok keresése a kutatások középpontjába. Mivel   a   synoviális   membrán   a   gyulladás   fő   helye   RA­ban,   nagy   szükség   van  olyan módszerekre is, melyekkel a synoviális szövetben közvetlenül kimutathatók és  mérhetők   egyes   citokinek,   kemokinek   és   szövetbontó   enzimek,   s   ezek   alapján   a  betegség   progressziója   nyomon   követhetővé   válik.   Mindazonáltal   igen   nehéz  továbblépni   az   RA­ban   szenvedő   betegcsoportok   kórlefolyásának   prediktálásától   az  egyes betegek esetének előjelzésére.

Genetikai markerek Az   RA   családi   halmozódása   régóta   ismeretes.   A  rheumatoid   arthritist   kiváltó  fertőző   ágens   azonosítására   irányuló   kitartó   kutatások   mindez   idáig   nem   jártak  eredménnyel. Egypetéjű ikreken végzett konkordancia vizsgálatok azt jelezték, hogy a  nem érintett ikrek több, mint egyharmada idővel érintetté válik. Ráadásul a kétpetéjű  ikrek és az érintett szülők utódai esetén tapasztalható kissé emelkedett prevalencia arra  utal,   hogy   a   betegségre   való   fogékonyság   egy   polimorf   genetikai   komponenset   is  magában foglalhat. A   szerológiai   tipizálás   elérhetővé   válásával   megállapították,   hogy   az   RA   a   fő  hisztokompatibilitási   génkomplex   II.   osztályához   tartozó   HLA­DR4­gyel   mutat  asszociációt.  A  betegek közel  75%­a hordoz  egy specifikus  aminosav  szekvenciát  a  HLA­DR   molekula  ­láncában,   a   71.   pozíció   közelében,   az   úgy   nevezett   "shared"  (közös) epitópot (77). Számos tanulmány tudósít ezen allélek és a betegség lefolyásának  hevessége   közötti   összefüggésről   (78,79).   A   "shared"   epitóp   az   MHC   II   molekula  antigénkötő zsebében helyezkedik el, így egy arthritogén peptid kötőhelye lehet, vagy 

22

6. ábra: A "shared" epitóp elhelyezkedése az MHC II molekulában (76) Az - és a -láncok közösen alkotják az MHC II molekula antigén-kötő zsebét. A "shared" epitópként ismert szekvencia a -láncban található (sötéttel jelzett terület). A "shared" epitópot RA-val asszociált gének betegséggel kapcsolt allélei kódolják (pl. HLA-DR4). A "shared" epitóp egy arthritogén peptid kötőhelye lehet, vagy maga szolgálhat olyan autoantigénként, mely T-sejteket aktivál.

maga szolgálhat autoantigénként, mely T­ sejtet aktivál (6. ábra) (76).  Az is kiderült,  hogy ez a szekvencia az EBV gp 100 és az E. coli dnaJ géntermékeiben is megtalálható,  így felvetődik annak a lehetősége, hogy ezen szekvencia alapvető lehet az EBV vagy E.  coli fertőzés utáni immunreakció beindításában, illetve később az RA kifejlődésében. A  molekuláris mimikri elmélete szerint ugyanis a fertőzést követően ezen epitóp elleni  immunválasz a gazdaszervezet MHC II fehérjéjével is kapcsolatba lép keresztreakció  révén.   A   "shared"   epitóp   allélek   és   az   ízületi   károsodás   kifejlődése   közötti 

23

összefüggésre hatással lehet az aggresszív betegséget befolyásoló kezelés megkezdése a  betegség korai stádiumában (80).

Immunológiai markerek Az   ellenanyagok   számos   autoimmun   betegség   esetén   előjelzik   a   betegség  kimenetelét.  Ezzel  szemben  RA­ban nem  ilyen egyértelmű az  összefüggés  az  egyes  ellenanyagok jelenléte és a betegség kimenetele között. Számos tanulmány vizsgálta az  egyes   ellenanyagok   jelenlétét   és   prediktív   szerepét.   Úgy   tűnik,   hogy   az   egyes  ellenanyagok külön ­ külön történő kimutatásával szemben több ellenanyag jelenlétének  egyidejű vizsgálata fokozza a betegség diagnózisának szenzitivitását és specificitását,  korai RA esetén lehetőséget teremthet a betegség lefolyásának predikciójára (81). Reumafaktor

A reumafaktor (RF) az IgG molekula Fc fragmense ellen termelődő ellenanyag. A  hagyományos   technikákkal   (agglutináció   és   immunoturbidimetriás   eljárásokkal)  elsősorban   IgM   osztályú   RF­eket   mutattak  ki,   de   radioimmunoassay   illetve   ELISA­ technikával mindegyik nagy immunoglobulin osztályhoz (IgM, IgG, IgA) tartozó RF  kimutatható (82). Az   RF   a   legtöbb   esetben   kimutatható   RA­ban   szenvedő   betegek   véréből,   de  esetenként  egészségesek szérumában is megtalálható,  és más betegségek esetében is  kimutatható   RF   a   betegek   szérumában   (83,84).  Sőt,   a   bizonyítottan   RF   ­   pozitív  egyének kisebbségében mutatható ki RA radiológiai vagy/és klinikai jelenléte (85). Más  oldalról nézve azonban az RF megjelenése gyakran évekkel megelőzi a RA kialakulását  (86,87). Egy felmérés szerint az RF ­ pozitív egészséges egyéneknek 40­szeres esélye  van arra, hogy megbetegedjenek RA­ban az elkövetkezendő 10 évben, mint az RF ­  negatív egyéneknek (83).

24

Az   RF   magas   szintje   hevesebb   betegség   lefolyással   párosul   (88,89).   Ez   az  immunkomplex   lerakódása   és   a   komplementrendszer   aktivációja   miatt   fokozott  gyulladás   eredménye   lehet,   vagy   egyszerűen   erőteljesebb   autoimmun   válaszra   is  utalhat. Bár egyes tanulmányok nem találták az RF­ et prediktívnek az erózióra nézve  (90), de ebben az összefüggésben meg kell jegyeznünk, hogy az RF ­ pozitív betegek a  kezelések során szeronegatívvá válhatnak és fordítva (91). Összességében   elmondhatjuk,   hogy   az   RF   ­   negatív   betegeken   általában  előnyösebb a betegség lefolyása és kimenetele, mint az RF ­ pozitív egyének esetében. Egyéb marker ellenanyagok

A   keringő   RF   jelenléte   illetve   hiánya   alapján   sokáig   a   szeronegatív   és   a  szeropozitív   kategóriákba   soroltuk   a   krónikus   perifériás   arthritiseket   (92).   Azonban  széles körben felismerték, hogy az RF tesztelése túlságosan aspecifikus ahhoz, hogy ez  alapján azonosítsák az RA­ban szenvedő betegeket (92,93). Többféle ellenanyagot mutattak ki és teszteltek RA­ban szenvedő betegek esetén.  Közülük vélhetőleg  a citrullinált antigéneket (SA, fillagrin, keratin és CCP) felismerő  ellenanyagok a legspecifikusabbak RA­ra nézve, és ezek a betegség korai szakaszában  is   kimutathatóak   (94).  Újabban   azt   indítványozzák   a   szeropozitív   RA   megjelölést  kiterjesztését azokra az esetekre is, amelyekben az RA­ ra jellemző újabban megismert  marker ellenanyagok valamelyike előfordul. Anti­fillagrin ellenanyagok (AFA)

Az   anti­fillagrin   ellenanyagok   (AFA)   RA­ban   a   legspecifikusabb   szerológiai  markerek, melyek a hámszövetekben citrullint tartalmazó epitópokat ismernek fel. Az  AFA­k   specificitása,   olyan   paraméterekkel   való   asszociációja,   amelyek   a   betegség  aktivitására   és   súlyosságára   utalnak,   valamint   a   betegség   kialakulásának   igen   korai 

25

stádiumában   való   megjelenésük   arra   utal,   hogy   szerepet   játszhatnak   a   betegség  patofiziológiájában. Ezt a feltevést megerősíti az AFA prognosztikus értéke, valamint  az,   hogy   fillagrin   ­   ellenes   B­   sejtes   autoimmunitást   az   RA­ban   szenvedő   betegek  kétharmadában ki tudtak mutatni (95). Az   AFA­   t   eredetileg   "anti­keratin   ellenanyagok"   (AKA)   néven   írták   le   (96)  Azonban kiderült, hogy ezek az ellenanyagok a fillagrin, a citokeratin filamentumokat  aggregáló fehérje semleges / savas izoformáját ismerik fel az epidermiszben (97). Az  anti­perinukleáris faktort (APF (98))  szintén igen specifikusnak és a betegségre még  szenzitívebbnek találták, mint az AKA­ t (99). Az APF is profillagrin változatokat ismer  fel  a  humán  nyálkahártya felszíni keratinocitáiban  (100). Mára  felismerték, hogy az  RA­ ra specifikus anti­fillagrin ellenanyagok családjának az AKA és az APF két olyan  alcsaládja, melyek szubsztrátjai átfednek. Az AFA célpontjainak további tanulmányozása során kiderült, hogy ezek olyan  poszttranszlációsan módosult fehérjék, melyekben az argininek citrullinná módosultak  (101,102, 7. ábra).

26

7. ábra: Citrullinált fehérjék rheumatoid arthritisben (102) A: Citrullin képződése argininből a PADI enzim hatására B: A harmadlagos szerkezet változása annál erőteljesebb, minél több arginin citrullinálódik. A citrullinált molekula antigenikus tulajdonsága megváltozik, bemutatódik a Tsejtnek, mely stimulálja a B- sejtek anti-citrullinált peptid ellenanyag (a-cit-pepAb) termelését. C: A harmadlagos szerkezet változása a citrullinizáció hatására

Az AFA mindig megjelenik az RA klinikai tüneteinek megjelenése előtt (103,104, 105). Jelenléte és titere összefügg a betegség aktivitásával és súlyosságával (106,107, 108). Az AFA­ t a rheumatoid pannus plazmasejtjei termelik (109) RA­ban az AFA fő  célpontja a reumatoid synoviális membránban lerakódó fibrin deiminált formája. Úgy  tűnik,   hogy   a   deiminált   fibrinnel   szemben   kialakuló   autoimmunitás   az   RA  patogenezisének kritikus lépése (110). Bár mind az AKA, mind pedig az APF igen specifikus RA­ ra nézve, használatuk 

27

mégsem   terjedt   el   széles   körben,   mivel   technikai   nehézségek   adódnak   a   szubsztrát  standardizálásával,   és   az   immunfluoreszcens   tesztek   kiértékelése   is   szubjektív  természetű (111). A harmadik autoantigén­ / ­autoantitest rendszer, melyről újabban leírták, hogy  specifikus   az   RA­   ra,   nem   más,   mint   az   úgy   nevezett   anti­Sa   rendszer.   Az   anti­Sa  ellenanyag   antigénje   ismeretlen,   és   nagy   mennyiségben   van   jelen   a   méhlepény  szövetében illetve a rheumatoid synoviumban (112). Az  APF­ hez és  az  AKA­  hoz  hasonlóan   ezen   ellenanyag   molekuláris   célpontjai   feltételezhetően   szintén   deiminált  (citrullinált) fehérjék (113), így ez a rendszer is az AFA­ k családjának része (95). Az  olyan   betegeknél,   akik   már   hosszabb   ideje   szenvednek   RA­ban   szignifikáns  összefüggést találtak az anti­Sa jelenléte, illetve az RF, AKA, APF valamint a HLA  DRB1*04   vagy   *01   között   (114).   Ugyanakkor   az   anti­Sa   ellenanyag   jelenléte   nem  mutat asszociációt sem az RF, sem pedig az anti­RA33 ellenanyag jelenlétével (115). Megoldatlan   kérdés   azonban,   hogy   vajon   a   fibrin   deiminációja   a   synoviális  szövetben   a   reumatoid   gyulladásra   specifikus   folyamat­e,   mely   peptidil­arginin  deimináz enzim vagy enzimek érintettek, illetve hogy mely sejttípus(ok) szintetizálják  és szecernálják az enzim(ek)et. Ciklikus citrullinált peptid ellenes ellenanyag (anti­CCP)

Az   anti­CCP­k  az   ellenanyagok   olyan  heterogén   csoportját  alkotják,   melyek  a  citrullinált molekula különböző epitópjait ismerik fel, s így minden beteg szérumában  különböző típusa található ennek az ellenanyag molekulának (116). Egyes tanulmányok szerint az anti­CCP ellenanyag szintje korrelál az APF, AKA  illetve az RF szintjével, de nem teljesen fed át velük, így új diagnosztikai markere lehet  az   RA­nak   (117).   Sikerült   asszociációt   találni   az   anti­CCP   szintje   illetve   az   ízület 

28

radiológiai   elváltozásai   között,   ugyanakkor   független   prediktora   a   radiológiai  károsodásnak és a betegség kialakulásának (118). A gyulladási folyamatra utaló markerek

A szövetkárosodás bármely formája gyulladáshoz vezet, melyre a szervezet akut  fázis reakcióval válaszol. E folyamat során számos egyéb szisztémás válaszon (mint pl.  a láz, leukocitózis, izom proteolízis) kívül a szérumban megjelennek az ún. akut fázis  fehérjék,   melyek   mérése   a   gyulladási   folyamat   jelenlétére   és   kiterjedtségére   utalhat  (119). Vörösvértest süllyedés (ESR)

Az ESR mérése széles körben használt a klinikai gyakorlatban. Reumatológiai  megbetegedéseknél a betegség aktivitásának indikátoraként használják. C­reaktív protein (CRP)

A   CRP     mérésének   prognosztikus   értékével   becsülik   meg   általában   az   RA  közeljövőben   történő   változását,   jelenleg   ez   a   legelterjedtebben   használt   marker   a  betegség   kifejlődésének   monitorozására   a   klinikai   gyakorlatban.   A   CRP   ­szint   jól  korrelál a betegség klinikai aktivitásával, radiológiai fejlődésével illetve a kezelésekre  adott válasszal (120, 121).

29

Érképződés A   betegség   során   a   synoviális   térben   jelenlévő   sejtek   száma   ugrásszerűen  növekszik,   ezen   sejtek   szükségleteinek   biztosítására   új   erek   képződnek,   angiogén  faktorok   (pl.   VEGF)   jelennek   meg.   Angiogenezis   hiányában   a   betegség   nem   terjed  tovább,   a   synoviális   sejtek   nem   képesek   a   túlélésre,   így   nem   károsítják   a   szövetet.  Egyes megfigyelések szerint a VEGF szérumban mérhető szintje korrelál a betegség  aktivitásával (122,123).

Az ízületből származó markerek A   rheumatoid   arthritis   legjellemzőbb   tünete   az   ízületek   károsodása.   A   porc  alapállomány   bontásával   párhuzamosan   a   porcból   felszabaduló   komponensek  mennyisége növekszik a beteg vérében, s ez a betegség előrehaladásának jó markere  lehet. Számos, a porcmátrix molekulát tanulmányoztak ebből a szempontból, többek  között   a   II.   típusú   kollagént   (CII)   (9,10,11,12,13),   a   III.   típusú   prokollagén  aminoterminális   propeptidjét   (PIIINP)   (124,125,126,127),   az  I.   típusú   kollagén  karboxiterminális keresztkötött telopeptidjét (128,129,130), az aggrekánt (131,132,133),  a keratán szulfátot (134,135), a human cartilage glycoprotein 39­et (16,136,137,138, 139,140),  a  cartilage   oligomeric   matrix  proteint  (COMP)  (133,141),  a  hialuronsavat  (HA) (133,142,143). Az   ízületek   károsodása   RA­ban   enzimatikus   folyamat   eredménye,   melyben   a  szakirodalom a mátrix metalloproteinázok (MMP) szerepét emeli ki, de fontos szerepet  töltenek   be   a   cisztein­proteázok,   a   szerin­proteázok,   valamint   a   glükozidázok   is.  Mechanikai   károsodás   és   szabad   gyökök   jelenléte   szintén   fokozza   a   degradatív  folyamatot.   A   porckárosító   enzimek   mennyiségének   vizsgálata   szintén   utalhat   a  betegség   előrehaladottságára;   a   szérumban   illetve   a   synoviális   folyadékban   mérhető 

30

enzimkoncentráció és az enzimek egymáshoz viszonyított mennyisége prediktálhatja a  betegség enyhébb vagy súlyosabb formáját.

A porckárosodásban szerepet játszó proteázok Mátrix metalloproteinázok (MMP)

Az MMP­enzimcsalád az egészséges és patológiás szövetátépítésben vesz részt.  Hagyományosan   az   MMP­kről   azt   gondolták,   hogy   a   sejtközötti   állomány  (extracelluláris mátrix ­ ECM) komponenseit hasítják. Az ECM­et hosszú ideig passzív  szövetalkotónak tekintették, melynek szerepe a sejtek tartása, mechanikai támaszték, s  ennek megfelelően az MMP­k szerepét sem vélték egyébnek, mint az ECM átépítése a  homeosztázis   fenntartására,   illetve   a   sejtvándorlás   elősegítésére.   Ma   azonban   már  ismert, hogy az ECM növekedési faktorokat, azokat megkötő fehérjéket, egyéb bioaktív  molekulákat   is   tartalmaz,   illetve   sejtfelszíni   molekulák   kötőhelyeit,   melyek   közül  számos   csak   proteolízist   követően   válik   hozzáférhetővé.   Ezzel   párhuzamosan  megváltozott az MMP­kről alkotott képünk is: ma már tudjuk, hogy számos sejtfelszíni  illetve szolubilis molekula hasításával befolyásolják a sejtek működését. Kulcsszerepet  játszanak az egészséges és  malignus sejtek migrációjában.  Szabályozó funkciójuk is  ismert,   részben   az   enzimkaszkádban   betöltött   szerepük   alapján,   részben   pedig  mátrixproteinek,   citokinek,   növekedési   faktorok   és   adhéziós   molekulák   feldolgozása  révén, melynek során olyan fragmentumokat hozhatnak létre, melyek biológiai hatást  fokoznak vagy csökkentenek (144).   Az   MMP­enzimcsalád  tagjai   cink­   és   kalcium­dependens   endopeptidázok,  melyek hatásukat extracellulárisan fejtik ki (145). Ma 23 humán MMP ismert, de ez a  szám folyamatosan növekszik. Számos MMP­gént azonosítottak gerinctelen állatokban,  sőt növényekben illetve zöld algákban is találtak MMP­t (144).

31

Szubsztrátok és nevezéktan

A   korai   szakirodalom   azt   sugallta,   hogy   minden   egyes   MMP­nek   van   egy  meghatározott szubsztrátja, ez vezetett az MMP­k szubsztrát­központú elnevezéséhez.  Újabban azonban felismerték, hogy az egyes MMP­k számos szubsztrát emésztésére  képesek, az egyedi MMP­k szubsztrátjai átfedhetnek. Így aztán minden MMP kapott  egy számot. Azonban ebben a rendszerben is vannak hiányosságok, például nem létezik  MMP­4, ­5 és ­6, mivel az enzimaktivitáshoz nem rendelhető egyedi géntermék, illetve  a MMP­18 Xenopus­enzim. Az ismert MMP­ket foglalja össze az 1. táblázat. A   MMP­ket   főként   a   monociták­/­makrofágok   szecernálják.   Ezek   az   enzimek  képesek   számos,   a   sejtközötti   állományt   felépítő   fehérje,   így   a   kollagének,  proteoglikánok,  fibronektin  és  laminin   bontására (146).  A  MMP­ket  négy  csoportba  soroljuk:   kollagenázok,   sztromelizinek,   zselatinázok   és   membrán­típusú   (membrane­ type ­ MT­) MMP­k (1. táblázat). 

32

Fehérje neve

Alternatív név

Kollagén szubsztrát

Nem­kollagén ECM szubsztrát

Nem­struktúr ECM szubsztrát

MMP­1

Kollagenáz­1

I, II, III, VII, VIII, X. típusú  Aggrekán, kazein, nidogén, szerpinek,   1­antikimotripszin,   1­ kollagén, zselatin verzikán,   proteoglikán   link   protein,  antitripszin, 1­proteináz inhibitor,  tenaszcin­C IGF­BP3,   IGF­BP5,   IL­1,   L­ szelektin,   ovosztatin,   rekombináns  TNF­ peptid, SDF­1

MMP­2

Zselatináz­A

I, IV, V,  VII, X, XI, XIV.  Aggrekán,   elasztin,   fibronektin,  Aktív MMP­9, aktív MMP­13, FGF  típusú kollagén, zselatin laminin,   nidogén,   proteoglikán   link  RI,   IGF­BP3,   IGF­BP5,   IL­1,  protein, verzikán rekombináns TNF­ peptid, TGF­

MMP­3

Sztromelizin­1

II,   IV,   IX,   X.   típusú  Aggrekán,   kazein,   dekorin,   elasztin,  1­antikimotripszin, 1­proteináz  kollagén, zselatin fibronektin,   laminin,   nidogén,  inhibitor,   antitrombin   III,   E­ perlekán,   proteoglikán   link   protein,  kadherin,   fibrinogén,   IGF­BP3,   L­ verzikán szelektin, ovosztatin, pro­HB­EGF,  pro­IL­1, pro­MMP­1, pro­MMP­ 8, pro­MMP­9, pro­ TNF­, SDF­1

MMP­7

Mátrilizin­1, kollagenáz

MMP­8

Kollagenáz­2

 

neutrofil  I,   II,   III,   IV,   V,   X.   típusú  Aggrekán,   kazein,   elasztin,   enaktin,  b4­integrin,   dekorin,   defenzin,   E­ kollagén laminin, proteoglikán link protein kadherin, Fas­L, plazminogén, pro­ MMP­2,   pro­MMP­7,   pro­TNF­,  transzferrin, szindekán I,   II,   II,   V,   VII,   VIII,   X.  Aggrekán, laminin, nidogén típusú kollagén, zselatin

33

2­antiplazmin, pro­MMP­8

Fehérje neve

Alternatív név

Kollagén szubsztrát

Nem­kollagén ECM szubsztrát

Nem­struktúr ECM szubsztrát

MMP­9

Zselatináz­B

IV, V, VII, X, XIV. típusú  Fibronektin,   laminin,   nidogén,  CXCL5,   IL­1,   IL­2R,  kollagén proteoglikán link protein, verzikán plazminogén,   pro­TNF­,   SDF­1,  TGF­ 

MMP­10

Sztromelizin­2

III,  IV,  V.  típusú  kollagén,  Fibronektin, laminin, nidogén zselatin

MMP­11

Sztromelizin­3

Laminin

1­antikimotripszin, 1­proteináz  inhibitor, IGF­BP1

MMP­12

Makrofág metalloelasztáz

Elasztin

plazminogén

MMP­13

Kollagenáz­3

I, II, III, IV, V, IX, X, XI.  Aggrekán,   fibronektin,   laminin,  Plazminogén   aktivátor   2,   pro­ típusú kollagén, zselatin perlekán, tenaszcin MMP­9, pro­MMP­13, SDF­1

MMP­14

MT1­MMP

I,   II,   III.   típusú   kollagén,  Aggrekán,   dermatán   szulfát  v3 integrin, CD 44, gCIqR, pro­ zselatin proteoglikán,   fibrin,   fibronektin,  MMP­2, pro­MMP­13, pro­TNF­ laminin, nidogén, perlekán, tenaszcin,  SDF­1, szöveti transzglutamináz vitronektin

MMP­15

MT2­MMP

I,   II,   III.   típusú   kollagén,  Aggrekán,   fibronektin,   laminin,  Pro­MMP­2,   pro­MMP­13,   szöveti  zselatin nidogén,   perlekán,   tenaszcin,  transzglutamináz vitronektin

MMP­16

MT3­MMP

I,   III.   típusú   kollagén,  Aggrekán,   kazein,   fibronektin,  Pro­MMP­2, pro­MMP­13 zselatin laminin, perlekán, vitronektin

MMP­17

MT4­MMP

zselatin

Fibrin, fibronektin

34

Pro­MMP­1,   pro­MMP­8,   pro­ MMP­10

Fehérje neve

Alternatív név

MMP­19

RASI­1

MMP­20

Enamelizin

Kollagén szubsztrát

Nem­kollagén ECM szubsztrát

Nem­struktúr ECM szubsztrát

I,   IV.   típusú   kollagén,  Aggrekán,   kazein,   fibronektin,  zselatin laminin, perlekán, vitronektin Aggrekán, amelogenin, porc oligomer  protein

MMP­21

1­antitripszin

MMP­23

CA­MMP

zselatin

MMP­24

MT5­MMP

zselatin

MMP­25

Leukolizin, MT6­MMP

IV. típusú kollagén, zselatin Fibrin, fibronektin

Pro­MMP­2

MMP­26

Matrilizin­2, endometáz

IV. típusú kollagén, zselatin Kazein, fibrinogén, fibronektin

1­proteináz inhibitor

MMP­28

Epilizin

Kondroitin­szulfát,   dermatán­szulfát,  Pro­MMP­2, pro­MMP­13 fibronektin

kazein

1. táblázat: A humán MMP­k rendszere (144).

35

Fiziológiás és patológiás szerep

Fiziológiás   állapotban   a   kötőszövetben   termelődő   MMP­k   fontos   szerepet  játszanak az egyedfejlődés során a szövetek újjáépülésében, a menstruációs ciklusban  illetve a szöveti károsodást követő javítási folyamatokban. Az MMP­k nyilvánvaló szövetkárosító képessége számos betegség kutatása során  előtérbe   kerül,   ahol   kötőszöveti   leépülés   történik   (például   daganatok,   rheumatoid  arthritis,   periodontális   betegségek).   Az   MMP­k   fő   forrásai   a   leukociták,   részben   a  makrofágok. A leukociták által termelt MMP­k kulcsszerepet játszanak abban, hogy a  fehérvérsejtek képesek legyenek elhagyni az ereket és a szövetekbe áramoljanak. Ezzel  analóg   módon   a   metasztatikus   daganatsejtek   is   MMP­ket   használnak,   hogy   a  szövetekből ki­ illetve belépjenek, és vérellátásukat megoldják (147). Az MMP­k szerepe arthiritisben

A porckárosodás elsődleges oka arthritisben az, hogy aktív proteázok emésztik a  porc   két   legfontosabb   alkotóját:   a   kollagéneket   és   a   proteoglikánokat.   Az   MMP­k  neutrális   pH­n   hasítják   legaktívabban   a   szöveti   makromolekulákat   (148).   Ezen  molekulák hasítása által egyrészt a porc stabilitása csökken, másrészt olyan terminális  neoepitópok jönnek létre, melyek antigén tulajdonságai eltérnek az intakt fehérjében  elhelyezkedő azonos aminosav­szekvenciáétól (149). Míg a proteoglikánok lebomlása reverzibilis folyamat, a kollagén emésztődése a  sejtközötti   állomány   visszafordíthatatlan   leépüléséhez   vezet,   ezért   a   kollagenázok  tűnnek a folyamat kulcsenzimeinek (150). Ma még vitatott, hogy pontosan mely MMP­ k felelősek a kollagén hasításáért az arthritis különböző formái esetében. OA és RA  esetén   nyilvánvaló   különbség   van   a   kollagén   anyagcseréjében,   tekintettel   a   korai  változások helyének különbözőségére. Ez azt is jelentheti, hogy a kollagén hasításában 

36

elsősorban szerepet játszó MMP eltér az arthritis különböző formái esetén, illetve, hogy  a különböző metalloproteinázok részvétele az egyes betegségek kialakulásában időben  eltérő lehet (148). Egyes szerzők úgy tartják, hogy RA­ban a kollagenáz­1 az elsődleges  szerepet játszó kollagenáz, míg OA esetén a kollagenáz­3 dominál (151, 152). A   sztromelizinek   közül   a   sztromelizin­1   (MMP­3)   expresszióját   találták  emelkedettnek   különböző   klinikai   diagnózissal   és   betegségtörténettel   rendelkező  betegek   esetében,   ugyanakkor   ez   az   enzim   hiányzik   az   egészséges   synoviális  folyadékból (153).  RA­ban az MMP­3 szérumszintje, a betegség klinikai paraméterei  (154,  155) és az ízületkárosodás mértéke (156), a proteoglikán degradáció súlyossága  (157) között is felfedezhető korreláció.  Az   MT1­MMP   és   a   zselatináz   A   szintén   lokalizálható   a   kialakuló   rheumatid  arthritises pannusban, ami azt sugallja, hogy szerepük lehet a betegség folyamatában  (50).   Konttinen   és   csoportja   16   MMP   expresszióját   tanulmányozta   mRNS   szinten  sérülések illetve RA esetében, és azt találták, hogy egyesek (pl. a kollagenáz­3 és a  MT2­MMP) kizárólag a rheumatid szövetben fordulnak elő (158). A TIMP­1 szintje emelkedett RA szérumban (159) és SF­ban (160), azonban az  egyensúly felborult az MMP­k javára: az emelkedett TIMP­szint sem képes az MMP­k  megfelelő mértékű gátlására. Egyéb metalloproteinázok

Az   ízületben   a   mátrix   metalloproteinázok   mellett   egyéb   metalloproteinázok,  főként   az   ADAM   (a   disintegrin   and   metalloproteinase)   proteáz   család   tagjai   is  expresszálódnak (161), bár jelenleg még nem tisztázott a szerepük a fiziológiás illetve  patológiás szöveti folyamatokban. Az ADAM proteázok egy alcsaládjának (ADAMTS  – ADAM with thrombospondin motifs) egyes tagjairól vált ismertté újabban, hogy az  aggrekánt   egy   patológiásan   releváns   helyen   hasítják   (162,163,164).   Ezek   közül   az 

37

enzimek   közül   legalább   egyről   (ADAMTS­5)   bizonyított,   hogy   a   synoviumban   is  kifejeződik   (165).   Bár   ezek   az   enzimek   nem   MMP­k,   úgy   tűnik,   hogy   a   TIMP­3  ezeknek is hatásos inhibitora (166). Cisztein­proteázok  (B­   és   L­katepszin,   melyek   a   porc   és   a   csont   bontására  képesek)   szintén   expresszálódnak   RA   synoviumban   (167),   és   érintettek   a   porc  lebontásában (168). A K­katepszin újabban kapott nagy figyelmet, miután úgy tűnik,  hogy jelenléte erősen kapcsolódik a patológiás csont­ és porcoldódáshoz (169,170). A  szerin­proteázok   közül   főként   a   plazmin­kaszkádhoz   kapcsoltaknak   szintén  feltételezhető a szerepük a szöveti destrukcióban (171,172).

Glikozidázok A   lizoszomális   glikozidázok   és   glikozid­szulfatázok   a   glükózaminoglikánok  bontásában szerepet játszó enzimek egy másik fontos csoportja (173,174), melyek a  cukor   oldallánc   hidrolitikus   bontását   végzik.   A   hidrolízis   helyétől   függően   két  típusukról   beszélünk:   az   exoglikozidázok   a   cukorlánc   szélső   monoszacharid  komponensét   hasítják   le,   míg   az   endoglikozidázok   a   cukorlánc   valamely   belső  glikozidos kötését hidrolizálják. Ezen   enzimek   szerepe   a   porcmátrix   homeosztázisában   és   patológiájában  mindeddig   részben   ismeretlen.   Hagyományosan   a   glükózaminoglikán­degradációt  elsősorban   intralizoszomális   eseménynek   tekintik,   és   a   glükózaminoglikánok  bontásában szerepet játszó enzimek pH­optimumát 3,5 és 5,5 között határozták meg,  semleges kémhatású közegben az enzimek aktivitása szignifikánsan csökkent (173,174). A   porcmátrix   lebontásában   szerepet   játszó   kollagenázok,   sztromelizinek,  aggrekanázok,   cisztein­proteázok   működését   befolyásolhatja   a   célfehérjék  glikoziláltsága   (175).   A   GAG­ok   bontásában   fő   szerepet   játszó   glikozidázokra   és 

38

glikozid­szulfatázokra újabban   méltánytalanul   kevés figyelmet   fordít  a  szakirodalom  annak ellenére, hogy ismert, hogy RA­ban szenvedő betegek szérumában és vizeletében  emelkedett GAG­koncentráció mutatható ki (176). Az egyes glikozidázok és glikozid­ szulfatázok   glükózaminoglikánok   bontásában   betöltött  szerepére  vonatkozó  tudásunk  főként a mukopoliszacharidózisok tanulmányozásából származik (177). A glükózaminoglikánok szintjében illetve molekuláris természetében bekövetkező  változásokat   korábban   többféle   kötőszöveti   betegséghez   kapcsolták,   például   RA­ban  illetve   sclerodermában   szenvedő   betegek   vérében   és   synoviális   folyadékában  emelkedett   mennyiségüket   mutatták   ki   (178),   és   RA­ban   az   érintett   ízületek  károsodásának mértéke pozitívan korrelált a synoviális folyadékban mért magas GAG­ szinttel   (179).   Ezzel   párhuzamosan   arthritisben   szenvedő   betegek   ízületi   porcára  jellemző   az   extracelluláris   mátrixban   a   proteoglikánok   mennyiségének,   illetve   a  proteoglikánok és glükózaminoglikánok méretének csökkenése (180,181,182). OA­ban  az ízületek elveszítik GAG­tartalmuk egy részét, és ez a veszteség arányos a betegség  súlyosságával (183,184,185). A proteoglikánok glikoziláltságának mértéke a korral is  változik   (181).   Ezek   a   változások   az   érintett   ízület   biomechanikai   tulajdonságainak  változásához, majd a későbbiekben a porcállomány elvesztéséhez vezetnek. A szénhidrátokat általában nem vagy gyengén immunogéneknek tartják, melyek  nem váltanak ki sem celluláris, sem humorális immunválaszt. Ez a felfogás hosszú időn  át   megakadályozta   a   GAG­ok,   mint   különböző   autoimmun   betegségekkel   asszociált  antigének   vizsgálatát.   Ugyanakkor   viszont   jól   ismert,   hogy   a   GAG­okban   gazdag  sejtközötti   állomány   számos   növekedési   faktor   és   egyéb   olyan   anyag   tárolóhelye,  amelyek   a   sejtek   viselkedését   befolyásolják.   A   GAG­ok   számos   fehérjével   lépnek  kölcsönhatásba,   és   szabályozzák   a   sejtek   fejlődését,   adhézióját,   differenciációját   és  osztódását  (186,187,188,189).   Tekintettel   a   GAG­ok   ilyen   változatos   biológiai 

39

aktivitására,   RA­hoz   és   ezzel   rokon   betegségekhez   való   szoros   asszociációjukra,  valamint   a   kötőszövetekben   előforduló   nagy   mennyiségükre,   felvetődik   annak   a  lehetősége,   hogy   a   GAG­ok   ellen   irányuló   kóros   immunválasz   szerepet   játszhat   a  kötőszöveti betegségekben. A   porc   alapállományt   felépítő   legtöbb   fehérje   glikoprotein,   melyek   cukor  oldallánca   hasonló   ismétlődő   diszacharid­egységekből   épül   fel;   ezek   a  glükózaminoglikánok   főként   hexuronsavból   és   hexózaminból   állnak   (190).   Az  oligoszacharid­oldallánc befolyásolja a glikoproteinek térszerkezetét, s ezáltal hatással  lehet annak egyes vagy akár összes funkciójára (191,192). Ezen molekulák bontásában  a proteázok mellett a glikozidázok is szerepet kapnak. A glikozidázokat jelenleg több, mint nyolcvan családba soroljuk (193).  Ezek az  enzimek végzik a szénhidráton belüli kötések hidrolízisét. Két nagy csoportjuk az exo­  és   endoglikozidázok.   Az   exoglikozidázok   a   szénhidrátok   végső   monoszacharidjának  hidrolízisét   végzik,   míg   az   endoglikozidázok   a   poliszacharidlánc   valamely   belső  glikozidkötését   bontják.   A   glikozidázok   szerepe   igen   sokrétű:   a   sejtváz  komponenseinek,   a   sejtfal   polimerjeinek   turnoverétől   kezdve   a   biológiailag   aktív  molekulák,   mint   pl.   az   antibiotikumok   módosításán   át   a   kórokozók   és   az  immunrendszer közötti interakciókban betöltött szerepükig számos funkciót  látnak el  (194). A porc bontásában szerepet játszó egyes exoglikozidázok ­D­glükuronidáz (E.C. 3.2.1.31.)

A  ­glükuronidáz   bármely   poliszacharid   végén   található  ­glükuronozidot  hidrolizálja.   Ez   az   enzim   a   gyulladás   során   stimulált   neutrofil   granulocitákból  származik.   A   neutrofil   granulociták   beáramlása   a   gyulladt   ízületbe   a   betegség 

40

fellángolása   során   a   rheumatoid   betegek   jellemző   tulajdonsága.   A   neutrofilek   által  okozott porckárosítás a sejtek degranulációja során felszabaduló enzimek aktivitásának  eredménye (195). A  ­glükuronidáz emelkedett aktivitását mutatták ki perifériás vérsejtekből, míg  ezen sejtek fehérje tartalma csökkent (176). A biológiai folyadékok ­glükuronidáz­ és  GAG­tartalma  jól   tükrözi a  gyulladási  folyamat  hevességét.  A   betegek vérsejtjeiben  mérhető ­glükuronidáz­ és GAG­szint jól korelált az RA súlyosabb formájával illetve  szisztémás  megjelenésével   (196).  Azt  is  megfigyelték,   hogy az  ízület  gyulladásának  fellángolásával egyidejűleg fokozódik ezen enzim aktivitása, és az SF szulfatált GAG­ tartalma is emelkedik. Ezzel párhuzamosan a sejtek enzimaktivitása és a SF hialuronsav  tartalma csökkent (197). Erős   korrelációt   találtak   a  ­glükuronidáz   aktivitása   és   a   szövet   morfológiai  változásai között is aktív arthritis esetén (198). A ­glükuronidáz koncentrációját a SF­ ban vizsgálva OA esetében körülbelül kétszeres koncenráció volt mérhető a fiziológiás  szinthez viszonyítva, míg RA, szeronegatív arthropathia és szeptikus arthritis esetén az  enzimszint messze magasabb volt, és jól korrelált a polimorfonukleáris sejtek számával  ezekben a csoportokban. A mért enzimszintek között jelentős átfedések mutatkoztak az  egyes betegségcsoportok között (199). ­D­N­acetil­glükózaminidáz / hexózaminidáz (E.C. 3.2.1.52)

A   hexózaminidáz   (Hex),   a   terminális   N­acetil­­D­glükózamin   (­D­N­acetil­ glükózaminidáz   (NAG))   és   N­acetil­­D­galaktózamin   (­D­N­acetil­ galaktózaminidáz)   hidrolízisét   katalizálja   a   különböző   glikoproteinek,  glükózaminoglikánok   (pl.   kondroitin­4­szulfát,   kondroitin­6­szulfát,   hialuronsav,  keratán­szulfát, dermatán­szulfát) esetén (173,174).

41

A kondrociták által termelt és a sejtközötti térbe ürített / leadott enzimek közül a  legfontosabb a hexózaminidáz  (200).  RA­ban a synoviális folyadékban nagy számban  vannak jelen leukociták, ezek a sejtek lehetnek a Hex­nek további forrásai (201). Azt is  kimutatták, hogy a Hex aktivitása RA­ban szenvedő betegek synoviális folyadékában  szignifikánsan magasabb volt, mint OA­ban szenvedő betegekében, és rheumatoid SF­ ban nagyobb aktivitást mutatott, mint ugyanazon beteg szérumában (6).  Kimutatták, hogy a Hex aktivitása emelkedett olyan ízületi kondrocita­tenyészet  médiumában, melyet IL­1­val inkubáltak, mi több, az IL­1  szelektíven fokozta az  extracelluláris térben a Hex aktivitását (200,201,202). A humán szérum Hex aktivitásának nagy része a vérlemezkéktől származik,  a  plazma Hex­aktivitása szignifikánsan emelkedik vérlemezke­stimuláció hatására (203).  Egyes RA­ban szenvedő betegek szérum Hex aktivitása szignifikánsan magasabb az  egészséges egyénekénél (204), azonban  RA­ban a betegek vérlemezke­száma gyakran  emelkedett, s ez oka lehet az emelkedet Hex­aktivitásnak.  A   legtöbb   lizoszomális   enzim   savas   pH­n   fejti   ki   optimális   aktivitását;   ez   a  glükózaminoglikánokat bontó glikozidázokra is igaz. Az extracelluláris térben azonban  a  közeg  közel   neutrális.  A  Hex  enzimaktivitása  80  %­os   csökkenést  mutatott   pH=7  esetén,   de   aktivitása   még   így   is   szignifikánsan   magasabb   volt,   mint   más  glikozidázoknak és glikozid­szulfatázoknak (200). ­D­mannozidáz (E.C. 3.2.1.24)

Az  ­mannozidáz   fontos   szerepet   játszik   az   N­kötött   szénhidrátok  felszabadításában   a   glikoproteinek   anyagcseréje   során.   Az  ­mannozid   kapcsolatok  összes   ismert   típusát   hasítja,   a   terminális   nem­redukáló  ­D­mannózt   hidrolizálja   a  különböző  ­mannozidokról.   Ez   az   enzim   alegységenként   egy   Zn­iont   tartalmaz. 

42

Szintézise során először 3 peptid keletkezik (70 kDa, 42 kDa (D) és 13/15 kDa (E)),  majd   70   kDa   peptidből   újabb   3   peptid   processzálódik   (A,   B   és   C   peptidek),   mely  utóbbiak   diszulfid­hidakkal   kapcsolódnak   egymáshoz.   Az  ­D­mannozidáz   maga   is  erősen glikozilált fehérje, mely a glikozil­hidroláz 38 fehérjecsalád tagja. Az  ­mannozidáz   rheumatoid   arthritisben   betöltött   szerepéről   kevés   utalás  található   a   szakirodalomban.   Egy   RA­ban   szenvedő   beteg   esetén   leírták,   hogy   a  szérumában található IgM ellenanyagok felismerték az alkalikus foszfatáz (AP) számos  epitópját,   míg   ha   az   IgM­t  ­mannozidázzal   kezelték,   akkor   a   kezelést   követően  kizárólag a placenta eredetű AP­t ismerte fel, és a csontból, májból, bélből származó  AP­t   nem   (205).   Egy   másik   tanulmányban   a   mononukleáris   fagocitasejtek   FcR­ funkcióit   vizsgálták  in   vitro.   Az   eredmények   arra   utaltak,   hogy   RA­ban   szenvedő  betegekből   származó   IgG   erősebben   gátolja   a   monociták   FcR­funkcióit,   és   ez  összefügghet   a   molekulák   Fc   domenjén   található   glikozid   oldalláncok   magasabb  számban hozzáférhető mannozil­gyök – tartalmával (206). ­D­galaktozidáz (E.C. 3.2.1.23)

A ­galaktozidáz a terminális, ­kötött nem­redukáló galaktóz­maradékot hasítja  különböző szubsztrátokról. A szakirodalomban kevés utalást találunk ennek az enzimnek az RA­ban betöltött  szerepéről. A  ­D­galaktozidáz extracelluláris  aktivitásának szignifikáns emelkedését  mutatták ki IL­1  stimuláció hatására, azonban neutrális pH­n ezen enzim aktivitása  drámaian csökken (200).

43

Célkitűzések Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata Mint láthattuk, az utóbbi évtizedekben a porcdegradáció folyamatában főként az  MMP­k   szerepét   vizsgálták,   a   glikozidáz   enzimek   szerepének   vizsgálata   háttérbe  szorult.   Ez   a   tény   meglepő   annak   ismeretében,   hogy   a   porcszövet   alapállományát  felépítő fehérjék erősen glikoziláltak. Munkánk során a porcdegradációban érintett effektor mechanizmusok vizsgálatát  tűztük ki célul. Figyelmünket a glikozidázok és az MMP­k porcdegradációban betöltött  szerepére   összpontosítottuk.   Kísérleteink   célja   volt   megvizsgálni   a   glikozidázok  enzimaktivitását   RA­ban   szenvedő   betegek   SF­ében.   Kíváncsiak   voltunk   arra,   hogy  vajon ezek az enzimek szerepet játszanak­e abban az RA esetén ismert folyamatban,  melynek   során   a   porcmátrix   felépítésében   fontos   GAG­molekulák   kiürülnek   a  hialinporcból.   Kérdésként   merült   föl,   hogy   a   glikozidáz   és   az   MMP   enzimek  együttműködhetnek­e a degradációs folyamatban. RA­ban   a   betegség   lefolyása   igen   eltérő   lehet   az   egyes   betegekben   az   enyhe  lefolyású,   gyógyszerekkel   jól   kezelhető   formától   az   agresszív,   a   klasszikus   terápiás  beavatkozásokra nem reagáló formáig. Újabban kifejlesztett gyógyszerekkel azonban  lehetőség nyílik az agresszív forma tüneteinek enyhítésére, ha ezeket a beteg a betegség  korai szakaszában megfelelő dózisban kapja. Azonban a hibásan alkalmazott agresszív  kezelés   nem   kockázatmentes,   így   fontos   a   betegség   kezdeti   szakaszában   előre  meghatározni,   hogy   vajon   mennyire   agresszív   a   kórfolyamat   az   egyes   egyének  esetében.   Ennek   szellemében   kutatásaink   során   arra   is   kíváncsiak   voltunk,   vajon   a  vizsgált enzimek rendelkeznek­e prediktív értékkel.

44

Az   RA   patomechanizmusában   esetlegesen   szerepet   játszó   porc  alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata Az   RA   olyan   szisztémás   autoimmun   betegség,   melynek   autoantigénjét   nem  ismerjük annak ellenére, hogy kutatása évtizedekre nyúlik vissza. Az ízületi károsodás  elsődleges   célpontja   a   hialinporc,   így   kézenfekvő   feltételezés,   hogy   a   porcmátrix  felépítésében résztvevő molekulák között kell keresnünk a betegség autoantigénjét. A porcszövet sejtközötti állományát felépítő molekulák közül számossal történtek  vizsgálatok. Sokan tanulmányozták a II. típusú kollagén szerepét a betegségben, de ma  már tudjuk, hogy ezt a molekulát az immunrendszer másodlagosan ismeri fel az RA  során.   Szintén   erősen   kutatott   az   aggrekánnak   a   betegségben   betöltött   szerepe.   A  fibronektin is azok közé a molekulák közé tartozik, mely az immunválasz célpontja  lehet.   Vizsgálatainkban   az   ezekre   a   molekulákra   vonatkozó   ismereteket   használva  tudásunk bővítéséra törekedtünk. A porcalapállomány kis proteoglikánjai az összes proteoglikán tömegének csak  kis   részét   képezik,   mégis   a   nagy   proteoglikánokkal   azonos   moláris   mennyiségben  vannak   jelen.   Hasonló   szerkezetű   központi   fehérjeláncot   tartalmaznak   jellegzetes,  leucinban   gazdag   szekvenciákkal.   A   glikoproteinek   ezen   családjából   a   dekorin  fehérjeláncához egy kondroitin­szulfát ­/­ dermatán­szulfát oldallánc csatlakozik, míg a  biglikánéhoz kettő (207,208). A   porcmátrix   kis   proteoglikánjai   ellen   fellépő   immunválaszt   még   nem  tanulmányozták RA­ban. Ez arra indított bennünket, hogy megvizsgáljuk a biglikán és a  dekorin   ellen   fellépő   humorális   immunválaszt   RA­ban   illetve   egyéb   ízületi  betegségekben.

45

Betegek és módszerek Mintagyűjtés Betegek Az Országos Reumatológiai és Fizioterápiás Intézetben (ORFI) kezelt 62 beteg  (16   férfi   és   46   nő)   szérum   és   synoviális   folyadék   mintáit   gyűjtöttük   össze.  Vizsgálatunkba foglaltunk még 14 beteget (9 férfi, 5 nő), akik a Debreceni Egyetem  Orvos­   és   Egészségtudományi   Centrum   (DEOEC)   Orthopédiai   Klinikáján   térdízületi  arthroscopián estek át akut sérülést követően. A   tanulmányba   foglalt   betegek   rheumatoid   arthritisben,   szeronegatív  spondylarthritisben,   illetve   osteoarthritisben   szenvedtek   (2.  táblázat).   Az   SNSA­ban  szenvedő betegek közül 12 esetben diagnosztizáltak arthritis psoriaticát (AP). Minden  RA­ban szenvedő beteg megfelelt az American College of Rheumatology (korábban  American  

Rheumatism

 

Association)

 

által

 1987­ben

 

kidolgozott 

követelményrendszernek   (30).   Az   összes   AP­ban   szenvedő   beteg   megfelelt   a   Moll­ Wright   kritériumoknak  (209).  Minden   SNSA­ben   szenvedő   beteg   sacroiliitises  tüneteket mutatott, közülük négy esetben (3 férfi, 1 nő) felvetődött a spondylarthritis  ankylopoetica   diagnózisának   lehetősége,   de   nem   feleltek   meg   a   New   York  kritériumoknak   (210).   Az  OA­ben   szenvedő   betegek   nem   mutatták   a   gyulladás  semmiféle jelét, vörösvértest süllyedésük kevesebb volt, mint 30 mm/h. A   betegek   demográfiai   és   klinikai   jellemzőit   a  2.  táblázat  foglalja   össze.   A  betegek klinikai és laboratóriumi adatai magukban foglalják a duzzadt ízületek számát,  a vérlemezkék számát, a fehérvérsejt­számot, a szérum reumafaktor szintjét és az ESR  értékeket.

46

2. táblázat: A vizsgált betegek demográfiai és klinikai jellemzői Betegség

Rheumatoid  arthritis

Betegek  száma

Férfiak száma

Nők száma

Életkor  években,  átlag±szórás  (tartomány)

Betegség  időtartama  hónapokban  átlag±szórás 

5

26

53±3,2 (30­ 86)

79,3±138,6

31

Szeronegatív  spondylarthritis

16

9

7

46,2±11,7  (27­67)

53,1±60,8

Arthritis  psoriatica

12

6

6

46,4±9,8 (30­ 64)

66±47

Osteoarthritis

15

2

13

67,8±15,9  (58­82)

99,3±135,1

Akut   ízületi  sérülés

14

9

5

42,9±11,6  (21­70)

<6 a traumát  követően

Szérum és synoviális folyadék minták Natív vér­ és SF­mintákat gyűjtöttünk steril körülmények között, és 2000 fordulat  / perc sebességgel 10 percig centrifugáltuk. A mintákat 500 l­es aliqutokban tároltuk  ­20 °C­on felhasználásig.

Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata Glikozidáz tesztek Az SF­  és  szérum­minták enzimaktivitását  kromogén  szubsztrátok segítségével  mértük:   a  ­D­glükuronidáz   aktivitását   p­nitrofenil­­D­glükuronid,   a  ­D­N­acetil­ glükózaminidáz   aktivitását   p­nitrofenil­N­acetil­­D­glükózaminid,   a  ­D­N­acetil­ galaktózaminidáz   aktivitását   p­nitrofenil­N­acetil­­D­galaktózaminid,   az

 ­

mannozidáz aktivitását p­nitrofenil­­D­mannopiranozid, a ­D­galaktozidáz aktivitását 

47

p­nitrofenil­­D­galaktopiranozid   felhasználásával.   Az   összes   szubsztrátot   a   Sigma­ Aldrich Co.­tól vásároltuk (St. Louis, MO.). A humán SF­mintákat (80 l) 1:1 arányban  hígítottuk 0,15 M NaCl oldattal, illetve 0,2 M Na­acetát oldattal (pH=5,8 – a hialinporc  alapállományának hozzávetőleges pH­értéke). Ezt követően 40  l 0,05 M szubsztrátot  adtunk a mintákhoz (211). A csöveket 2 órán keresztül 37°C­on inkubáltuk, majd az  enzimreakció leállítása céljából 500 l 0,05 M NaOH­oldatot adtunk hozzájuk. Minden   reakciócsőből   200  l   terméket   ELISA­lemezre   (MaxiSorp;   Nunc  Interned, Koppenhága, Dánia) vittünk, majd 405 nm­en megmértük az optikai denzitást  (OD;   referenciaként   620   nm­en   mért   OD­t   használtuk)   MS   Reader   (Multiskan   MS,  Labsystems,   Helsinki,   Finnország)   segítségével.   Az   enzimaktivitásokat   nemzetközi  egységekben   (IU)   fejeztük   ki,   amelynek   meghatározásához   ismert   aktivitású  enzimstandardok   hígításait   használtunk,   az   adott   mérésnek   megfelelően  ­D­ glükuronidáz (EC 3.2.1.31), ­D­N­acetil­glükózaminidáz (EC 3.2.1.52), ­mannozidáz  (EC   3.2.1.24)   és  ­D­galaktozidáz   (EC   3.2.1.23)   enzimstandardokat.   Valamennyi  enzimet   a   Sigma­Aldrichtól   szereztük   be.   Az   összes   enzim   assay   standardizált  körülmények között játszódott le.

Mátrix metalloproteináz (MMP) aktivitás mérése Az SF­minták MMP­1 és MMP­9 aktivitását Biotrak MMP­1 és MMP­9 aktivitás  assay rendszerekkel mértük (Amersham Pharmacia Biotech) a gyártó utasításait követve  (a  proMMP­1­et   és   a   proMMP­9­et   APMA­val   aktiváltuk   a  kit   leírása   alapján).   Az  enzimaktivitásokat   összehasonlítottuk   a   kit   részét   képező   aktív   rekombináns   humán  enzim aktivitás­értékeivel, és eredményeinket ng/ml egységekben fejeztük ki.

A glikozidáz és MMP­tesztek statisztikai analízise A statisztikai számításokhoz a Splus6 for Windows programot (212) használtuk. 

48

A   betegcsoportok   enzimaktivitását   Tukey  honest   significant   difference  módszere  alapján hasonlítottuk össze. Tukey módszere elkerüli a sokszoros tesztelés problémáját,  és az Splus többváltozós műveleteinek "legjobb" megközelítéseként választottuk ki. Az enzimaktivitásokat annak tükrében is megvizsgáltuk, hogy vajon alkalmasak­e  az   RA   és   nem­RA   csoportok   elkülönítésére.   A   cél   érdekében   stepwise   logistic  regressziót alkalmaztunk.

A porcszövet vizsgálata glükózaminoglikán­specifikus  Safranin O festéssel Az általunk vizsgált, autopsziás humán újszülött porcminták a femur patelláris  felszínéről (SE I.  számú Pathológiai  és  Kísérleti  Rákkutató Intézet)  származtak.  2­3  mm3  méretű porcdarabkákat az alábbi enzimatikus emésztéseknek vetettük alá 500  l  térfogatban, 37 °C hőmérsékleten (8. ábra): 1. A porcminták egy részét 0,187 egység (IU)  ­D­N­acetil­glükózaminidáz (Sigma­ Aldrich) és 30 egység ­D­glükuronidáz (Sigma­Aldrich) jelenlétében emésztettük 2  órán át. 2. További porcmintákat 15  ng APMA­aktivált MMP­9 enzimmel emésztettük 1 órán  át, majd 15 ng APMA­aktivált MMP­1 enzimmel inkubáltuk további 1 órán keresztül  (a MMP­1­et és a MMP­9­et az Amersham Pharmacia Biotechtől vásároltuk). Annak érdekében, hogy végsősoron minden minta azonos időt (4 órát) töltsön 37  °C­on, az 1. és 2. pontban leírt emésztésen átesett mintákat további 2 órán keresztül  0,15 M NaCl oldatban inkubáltuk 37 °C­os hőmérsékleten. 3. A porcminták harmadik csoportjának esetében a 2. pontban leírtak alapján az MMP­ kkel történő emésztést a glikozidázokkal történő emésztés követte az 1. pont szerint. 4. Újabb porcminták esetében a glikozidázokkal való emésztést (1. pont) az MMP­kkel  történő emésztés (2. pont) követte.

49

5. A kontroll csoportban a porcdarabkákat 500 l 0,15 M NaCl oldatban tároltuk 37 °C­ on 4 óra hosszat enzim hozzáadása nélkül.

8. ábra: A glikozidázokkal illetve MMP-kkel való kombinált emésztési eljárás

A   szövetdarabkákat   a   fenti   emésztéseket   követően   4   %­os  neutralizált 

50

formalinban fixáltuk és paraffinba ágyaztuk, majd 8­10 mm vastag metszeteket Safranin  O­val   (Sigma­Aldrich)   festettünk;   ez   a   festék   sztöchiometrikus   arányban   kötődik   a  glükózaminoglikánhoz (213). A   porcszeletek   képét   Olympus   DP50   kamerával   (Olympus   Optical,   Hamburg,  Németország)   digitalizáltuk.   Az   adott   porcdarabka   felszíni   1   mm   mély   rétegét  elemeztük. Minden emésztéstípus esetén 4 blokkot vizsgáltunk. Minden blokkból 20  mérést   végeztünk;   az   összes   méréssorozat   esetében   a   felszín   felől   haladva   a   porc   

 

mélyebb rétegei felé a porcállományt 10 darab 100 m x 100 m négyzet alakú területre  osztottuk.   Ezen   területek   optikai   denzitását   Image­Pro   Plus   képanalizáló   rendszer  (Media   Cybernetics,   Silver   Spring,   MD)   segítségével   határoztuk   meg.   A   20  méréssorozat átlagos relatív optikai denzitását számítottuk ki minden réteg esetén. Az  eredmények megadták a relatív OD ± SEM átlagát.

Glikozidáz­specifikus antitestek kimutatása synoviális  folyadékban ELISA módszerrel Nunc­Immunoplateket ­D­glükuronidázzal (EC 3.2.1.31; Sigma­Aldrich), illetve  ­D­N­acetil­glükózaminidázzal   (EC   3.2.1.52;   Sigma­Aldrich)   érzékenyítettünk.   A  polisztirén felszín szabad kötőkapacitását 200 l 1 % borjú szérum albuminnal (Sigma­ Aldrich) fedtük be. Korábbi kísérletek alapján a 100  l térfogatú szérum­ illetve SF­ mintákat 1:100 hígításban inkubáltuk (2 óra, 37°C). Ezt követte a torma­peroxidázzal  konjugált, nyúlban termelt anti­humán polivalens immunoglobulinnal (Sigma­Aldich)  való inkubálás 1:30000 hígításban, 100  l térfogatban. Hidrogén­peroxid hozzáadását  követően az OD­t 492 nm hullámhosszon mértük (a referencia hullámhossz 620 nm  volt).

51

Glikozidáz enzimek aktivitásának vizsgálata áramlási  citometria segítségével A   perifériás   vérsejtek  ­D­glükuronidáz   aktivitásának   méréséhez   az   ImaGreen  GUS   Gene   Expression   Kit   (Molecular   Probes,   Eugene,   OR)   áramlási   citometriás  rendszerben  történő   alkalmazását   dolgoztuk   ki.   Vizsgálataink   során   FACSCalibur  áramlási   citométert   és   CellQuest   Software   3.1.   kiadású   kiértékelő   programot   (BD  Biosciences, San Jose, CA) használtunk. Vörösvértest­lízist   követően   heparinnal   alvadásgátolt   vérmintákból   106  magvas  sejtet 0,5  l ImaGene Green C12FDGlcU szubsztráttal inkubáltunk, és meghatározott  időpontokban detektáltuk a fluoreszcenciát limfocita, monocita és granulocita kapukon  belül.   A   reakció   specificitását   megerősítette,   hogy   a   folyamat   gátolható   volt,   ha   a  mintákat 1  l  D­glükuronsav­1,4­laktonnal előinkubáltuk, amely vegyület ismert  ­D­ glükuronidáz inhibitor, és amelyet a szubsztrát hozzáadása előtt 30 perccel adtunk a  mintákhoz 100 l össztérfogatban. Néhány   kísérlet   esetében   a   limfocitákat   anti­humán   CD3­PE   vagy   anti­humán  CD19­PERCP monoklonális ellenanyaggal (BD Biosciences, NJ) jelöltük (1 g antitest  / 106 sejt / 100 l, 20 perc) a fluorogén glikozidáz szubsztrát hozzáadását megelőzően.

A   RA   patomechanizmusában   esetlegesen   szerepet   játszó   porc  alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata A porcmátrix komponensek ellen termelt IgG és IgM típusú  ellenanyagok kimutatása ELISA módszerrel Nunc   Immunoplateket   (Maxisorp,   Nunc   Intermed   Ltd,   Koppenhága,   Dánia)  antigénnel (0,2 g fehérje/ reakciótér) érzékenyítettünk; ötféle antigént használtunk erre  a célra: aggrekánt (Sigma­Aldrich Co. Tt. Louis, Mo),   biglikánt (Sigma­Aldrich) és 

52

dekorint (Sigma­Aldrich), II. típusú kollagént (Sigma­Aldrich) és fibronektint (Sigma­ Aldrich). A polisztirén felszín szabad kötőkapacitását 200 l 1 % borjú szérum albuminnal  (Sigma­Aldrich) fedtük be. Korábbi kísérletek alapján a 100 l térfogatú szérum­ illetve  SF­mintákat 1:100 hígításban inkubáltuk (2 óra, 37 °C). Ezt követte 100 l térfogatban  a  torma­peroxidázzal konjugált,  anti­humán  immunoglobulinnal   (Sigma­Aldich)  való  inkubálás,   mely   a   humán   IgG­hez   és   IgM­hez   kapcsolódik;   ezeket   az  immunoglobulinokat   1:30000   illetve   1:50000   arányban   hígítottuk.   A   színreakció   a  korábban leírtak alapján játszódott le (214). Az OD­t 492 nm hullámhosszon mértük (a  referencia hullámhossz 620 nm volt). Mivel   egészséges   ízületben   az   SF   mennyisége   minimális   (szemben   az   ízületi  betegségek exsudatív fázisával, amikor a vizsgált betegekből SF mintavétel történt), így  egészséges   egyének   SF­mintái   nem   hozzáférhetőek,   ezért   kontrollként   nem  alkalmazhattuk   a   fiziológiás   ellenanyag­szint   felső   küszöbét.   Ezért   azon   minták  előfordulásának   gyakoriságát   (%)   határoztuk   meg,   melyek   értéke   az   OA   minták  átlagértéke   +2SD   érték   fölé   esett   (ez   az   elsősorban   degeneratív   betegség   szolgált   a  primeren gyulladásos betegségek kontrolljaként).

A porcmátrix komponensek ellen termelt, ELISA módszerrel  kimutatott ellenanyagok statisztikai analízise A   kísérleti   elrendezés,   beleértve   a   betegcsoportok   hozzávetőleges   méretét,  korábbi tanulmányok alapján terveztük (215,216). Ezek a korábbi vizsgálatok olyan,  szérumban   illetve   synoviális   folyadékban   előforduló   ellenanyagok   szintjét   mérték,  melyek  reagáltak  a porcmátrix komponenseivel vagy a reumatológiai betegségekben  szenvedő   egyének   más   antigénjeivel,   és   statisztikusan   szignifikáns   különbségekhez  vezettek a betegségcsoportok között.

53

Az adatok statisztikai analíziséhez SPSS programot használtunk (217). A változók  korrelációjának   jellemzésére   Pearson   korrelációs   koefficienst   használtunk,   míg   a  csoportok közötti különbségeket varianciaanalízissel (ANOVA) vizsgáltuk. A post hoc  összehasonlításokat   Tukey   teszttel   (218)   végeztük   el.   A   szignifikancia   jelölésére   *  (P<0,05), ** (P<0,01) és *** (P<0,001) jeleket használtunk. A   klinikai/laboratóriumi   eredmények   és   az   antitest­szint,   illetve   a   különböző  porcmátrix   komponensekre   specifikus   ellenanyagok   szintje   közötti   összefüggések  mérésére „Spearman rank order” korrelációs koefficienst használtunk. Hogy elkerüljük  az álpozitív eredményeket, amelyek a többszörös tesztelés következtében állhatnak elő,  szigorítottuk   a   kritériumokat,   és   e   vizsgálatok   értékelésekor   a   korrelációt   p<0,01  (jelölés: *) illetve p<0,001 (jelölés: **) esetén tekintettük szignifikánsnak. Annak érdekében, hogy kiválaszthassunk egy olyan paramétert, mely elkülöníti az  RA­ban   szenvedő   betegeket   az   egyéb   ízületi   betegségekben   szenvedőktől  „stepwise  logistic regression” analízist hajtottunk végre.

Eredmények  Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata Különböző ízületi bántalmakban szenvedő betegek synoviális  folyadékában mérhető enzimaktivitások Vizsgálataink   során   ötféle   exoglikozidáz   (­D­glükuronidáz,  ­D­N­acetil­ glükózaminidáz, ­D­N­acetil­galaktózaminidáz, ­D­mannozidáz és ­D­galaktozidáz)  aktivitását   mértük   humán   mintákban   kromogén   szubsztrátok   segítségével.   Az  enzimaktivitásokat  mind a minta eredeti  pH­ján, mind pedig  pH=5,8 (az egészséges  porc  alapállományának  hozzávetőleges pH­ja) mellett 4 betegségcsoport (31 RA, 16  SNSA, 15 OA, 14 akut térdsérüléses beteg (SI)) esetén határoztuk meg.

54

Az SF­ek enzimaktivitása (átlag ±SEM OD értékek a minta eredeti pH­ján, illetve  pH=5,8­n)  egységesen nagyon  alacsony  értéknek adódtak  a  ­D­galaktozidáz  (0,017  ±0,058   és   0,016  ±0,018),  ­D­N­acetil­galaktózaminidáz   (0,039  ±0,021   és   0,047  ±0,028)   és  ­D­mannozidáz   (0,015  ±0,018   és   0,032  ±0,021)   enzimek   mérésekor.  Ugyanakkor   szignifikánsan   magasabbak   voltak   a  ­D­glükuronidáz   (GLUC)   (0,175  ±0,126 és 0,178  ±0,116), illetve  ­D­N­acetil­glükózaminidáz (NAG) (0,16  ±0,14 és  0,2 ±0,28) esetében. Az ezt követő kísérletekben ezért az utóbbi két enzim (GLUC, NAG) aktivitását  vetettük össze a különböző ízületi bántalmakban szenvedő betegek MMP­1 és MMP­9  szintjével.   Amint   a  9.  ábrán  látható,   RA­ban   szenvedő   betegek   esetében   a  ­D­ glükuronidáz és a ­D­N­acetil­glükózaminidáz aktivitása (az SF minta eredeti pH­ján  mérve) szignifikánsan magasabb volt, mint az OA­ban, SNSA­ban szenvedő, illetve a  sportsérült betegek esetében (p<0,05). Ezzel szemben az MMP­1 és az MMP­9 esetében  nem volt megfigyelhető szignifikáns különbség a csoportok között (9. ábra).

55

9.

ábra: A különböző enzimek aktivitásainak összehasonlítása az egyes betegségcsoportok esetén

Az oszlopok az átlag ±SEM értékeket mutatják a minta eredeti pH-ján mérve. Szignifikáns eltérést találtunk az RA és nem-RA betegcsoport között (* = P < 0,05).

A synoviális folyadék glikozidáz aktivitása, mint a  rheumatoid arthritis prediktora „Stepwise logistic regression” analízist hajtottunk végre annak érdekében, hogy  kiválaszthassunk egy olyan paramétert, mely elkülöníti az RA­ban szenvedő betegeket  az egyéb ízületi betegségekben szenvedőktől (3.  táblázat). Azt találtuk, hogy a  ­D­ glükuronidáz   és   a  ­D­N­acetil­glükózaminidáz   aktivitása,   ha   az   SF   eredeti   pH­ján  mértük, az RA szignifikáns prediktoraként szolgál. Ezzel ellentétben sem ugyanezek az  enzimek pH=5,8­n mérve, sem pedig az MMP­1 illetve az MMP­9 szintje nem mutatott 

56

különbséget a betegségcsoportok között (3. táblázat).  3. táblázat: Az RA és az egyéb ízületi betegségek megkülönböztetése enzimaktivitás  alapján Enzim

Deviáció

Teljes

Szabadsági fokok

Maradék deviáció

Mallows' Cp

31

44,36

46,34

P

GLUC (eredeti pH)

15,831

30

28,52

32,49

0,000069

NAG (eredeti pH)

3,681

29

24,84

30,79

0,055036

GLUC (pH=5,8)

0,325

28

24,52

32,45

0,568238

NAG (pH=5,8)

0,088

27

24,43

34,35

0,765952

MMP-1

0,427

26

24,00

35,90

0,513070

MMP-9

0,100

25

23,90

37,79

0,751537

Hogy   a   „stepwise   logistic   regression”   eredményeit   láthatóvá   tegyük,   a  betegségcsoportok   két­két   típusát   olyan   koordinátarendszerben   ábrázoltuk,   melynek  ordinátája a ­D­glükuronidáz és abszcisszája a ­D­N­acetil­glükózaminidáz aktivitása  volt   (10.  ábra).   Az   ábrán   minden   egyes   beteg   egy   meghatározott   pontot   képvisel   a  koordinátarendszerben az SF­ében mért NAG és GLUC aktivitása alapján. Az RA­ban  és  a  nem­RA­ban szenvedő betegek csoportja tisztán elkülöníthető  volt.  Az RA­ban  szenvedő betegek mindkét enzimre nézve magasabb aktivitással jellemezhetők, míg az  egyéb  betegségekben szenvedők  értékei a diagram bal alsó sarkában csoportosulnak  (10. ábra).

57

10. ábra: Az RA és nem-RA betegek elkülönítése GLUC aktivitásuk és NAG aktivitásuk alapján Minden beteg egy-egy pontot képvisel az SF-ében mért GLUC- és NAG-aktivitás alapján. A nem RA-ban szenvedő betegek a bal alsó sarokban csoportosulnak.

A synoviális folyadék enzimaktivitásainak korrelációja Ezután megvizsgáltuk az SF két fő exoglikozidáz (­D­glükuronidáz és  ­D­N­ acetil­glükózaminidáz)   aktivitásának,   illetve   az   MMP­1   és   az   MMP­9   aktivitásának  korrelációját.   Amint   azt   a  11.  ábra  mutatja,   a   két   enzimcsoport   (vagyis   az  exoglikozidázok   és   az   MMP­k)   tagjai   közötti   korreláció   sokkal   kevésbé   kifejezett 

58

(r=0,39­0,52),   mint   az   enzimcsoporton   belüli   korreláció  (r=0,79­0,90).   A   csoporton  belüli   illetve   a   csoportok   közötti   korreláció   eltérése   azt   sugallja,   hogy   az   azonos  csoportba tartozó enzimek együtt szabályozódnak, míg maguk a csoportok regulációja  egymástól független (11. ábra).

11. ábra: Az enzimaktivitások páronkénti összehasonlítása minden betegségcsoport esetén Az egyenes vonalak az illesztett lineáris regressziós értékeket mutatják (r – korrelációs koefficiens érték) Az összes korreláció szignifikáns volt p < 0,05 értéknél, de az azonos csoportba tartozó enzimek (glikozidázok illetve MMP-k) közötti korreláció erősebb, mint a különböző csoportba tartozók között.

Arra is kísérletet tettünk, hogy összefüggést találjunk a glikozidázok aktivitása és  az RA­ban szenvedő betegek valamely klinikai vagy laboratóriumi paramétere között (a  beteg   kora,   betegség   időtartama,   érintett   ízületek   száma,   fehérvérsejt­   és 

59

vérlemezkeszám,   reumafaktor­szint,   illetve   vörösvértest   süllyedés).   Az   egyetlen  megerősített összefüggést az SF ­D­N­acetil­glükózaminidáz aktivitása és az RF­szint  között   találtuk   (Pearson­féle   product­moment   korrelációs   koefficiens:   r=0,819,  p<0,001)

A porcmátrix glükózaminoglikán­tartalmának kiürülése  exoglikozidáz enzimek hatására

60

12. ábra: Az ízületi porc GAG-ból való kiürülése különböző enzimekkel történt emésztés hatására A: A szöveti metszetek képe a különböző emésztési eljárások esetén Safranin O festést követően. A képek a -D-glükuronidázzal és -D-N-acetil-glükózaminidázzal (glikozidázok); az MMP-1-gyel és MMP-9-cel (MMPk); illetve az enzimek kombinációjával történt emésztést mutatják (az MMP-emésztést követte a glikozidázokkal való emésztés (MMPk + glikoz.) illetve fordítva (glikoz. + MMPk)). Jól látható a GAGból kiürült világos zóna különböző mélysége az egyes esetekben. B: A relatív OD változása a szöveti felszíntől való távolság függvényében. (20 méréssorozat átlagos OD ± SEM – lásd a Betegek és módszerek fejezetben.)

61

A   következő   kérdésünk   arra   vonatkozott,   van­e   eredményeinknek   klinikai  relevanciája.   Az   a   megfigyelés,   hogy   az   RA­ban   szenvedő   betegek   SF­ében   az  exoglikozidázok  közül  emelkedett  ­D­glükuronidáz  és  ­D­N­acetil­glükózaminidáz  aktivitást mértünk, felvetette a kérdést, hogy vajon a porc elveszti­e glükózaminoglikán  ­tartalmát a fenti enzimek aktivitása nyomán. Az enzimek által történő porcemésztés  vizsgálatához   humán   porcdarabkákat   inkubáltunk   exoglikozidáz   és/vagy   MMP­1  és  MMP­9   enzimek   jelenlétében   (8.   ábra).   Az   emésztést   követően   a   porcdarabkákat  Safranin­O­val   festettük,   hogy   láthatóvá   tegyük   az   extracelluláris   mátrix   GAG­ tartalmának változását. Eredményeink szerint (12. ábra), míg a domináns exoglikozidázok (GLUC, NAG)  hatékonynak bizonyultak a porc GAG­tartalmának kiürítésében, a legjelentősebb hatást  (a   legalacsonyabb   relatív   OD­értéket)   a   kombinált   emésztési   eljárás   eredményeként  láthattuk   (melynek   során   az   MMP­kkel   való   emésztést   glikozidáz   kezelés   követte).  Ugyanakkor   a   kombinált   emésztési   eljárások   nem   egyszerű   additív   hatást  eredményeztek.  

A szérumban illetve a synoviális folyadékban mérhető,  exoglikozidázokat felismerni képes ellenanyagok szintje RA­ban   szenvedő   betegek   SF­ében   kimutatott   magas   enzimaktivitási   értékek  kapcsán felvetődött annak a lehetősége, hogy a betegek autoszenzibilizálódhatnak ezen  enzimfehérjékkel szemben. Egyes RA­ban szenvedő betegek szérumából illetve SF­éből  sikerült   anti­­D­glükuronidáz   ellenanyagokat   kimutatni.  Az   emelkedett  ­D­ glükuronidáz­ellenes   antitestekkel   rendelkező   betegek   gyakoriságának  meghatározásához azt vettük figyelembe, hogy a vizsgált minták hány %­a esetében  volt mérhető az OA minták átlaga  +2SD érték fölötti antitest­szint érték. Az RA­ban 

62

szenvedő betegek szérumának 48,27 %­ában és SF­ének 21,74 %­ában volt mérhető  emelkedett   anti­­D­glükuronidáz   ellenes   antitest   szint.   Ezek   az   antitestek   irodalmi  adatok alapján megfelelhetnek az RA­ban korábban leírt  ­D­glükuronidáz­specifikus  perinukleáris antineutrofil citoplazmatikus antitesteknek (219).

Perifériás vérsejtek ­D­glükuronidáz aktivitásának  vizsgálata áramlási citometriával Hogy bepillantást nyerjünk a megemelkedett glikozidáz aktivitással összefüggő  sejtfolyamatokba,   olyan   lipofil   glükuronidáz­szubsztrátot   használtunk,   mely   az   élő  sejtek membránján szabadon átdiffundál. Ez lehetővé tette számunkra, hogy a perifériás  vérsejtek ­D­glükuronidáz aktivitását áramlási citometriával mérjük.  Az   enzimhasítás   nyomán   keletkező   fluoreszcens   termékek   mennyisége   RA  eredetű   vérsejtek   esetén   jól   láthatóan   magasabb   volt,   mint   a   korban   és   nemben  egyeztetett   egészséges   egyénekben   (13.  ábra),   vagyis   az   RA­ban   szenvedő   betegek  magasabb GLUC­aktivitással rendelkeztek. A különbség a granulociták esetében volt a  legkifejezettebb; ezen sejttípus esetében volt mérhető a legnagyobb  ­D­glükuronidáz  aktivitás,   de   szignifikáns   különbség   volt   kimutatható   a   monociták   és   a   limfociták  esetében is. A T (CD3+) és a B (CD19+) ­limfocitákat összehasonlítva nem sikerült  szignifikáns különbséget kimutatni a két limfocita populáció között.  Nem találtunk szignifikáns összefüggést egyazon RA­ban szenvedő beteg (n=4)  SF­ében   mérhető   és   limfocita­asszociált  ­D­glükuronidáz   aktivitása   között.   Ez   arra  utal,   hogy   a   megemelkedett,   limfocitákkal   asszociált   glikozidáz   aktivitási   értékek  jelentősége   korlátozott.   Azonban   adataink   arra   is   rávilágítanak,   hogy   az   RA­ban  szenvedő  betegek glikozidáz  expressziós  szintje általánosan  emelkedett  a  szisztémás  keringés sejtjeiben.

63

13 . ábra: ­D­glükuronidáz aktivitásának vizsgálata áramlási citometria segítségével A fluoreszcens enzimhasítási termék visszamaradt a sejtekben. 30, 60 és 90 perccel a szubsztrát hozzáadását követően mértük a fluoreszcenciát, melyet a csatornaszám átlagával és szórásával jellemeztünk. A nyílhegyek a pontdiagramokon azt mutatják, hogy adott esetben a vérsejteket mely kapukon belül mértük (FSC – forward scatter, SSC – side scatter). A betegek és az egészséges egyének enzimaktivitásai között szignifikáns különbségek figyelhetőek meg (* = P < 0,05 és ** = P < 0,01 MannWhitney U teszt alapján)

Az   RA   patomechanizmusában   esetlegesen   szerepet   játszó   porc  alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata IgG és IgM szintek összehasonlítása a különböző  betegcsoportok szérumában és SF­ében Annak   érdekében,   hogy   megállapíhassuk,   vajon   az   egyes   betegségcsoportok  jellemezhetők­e a különböző ellenanyagok emelkedett szintjével, összehasonlítottuk az  RA­ban, OA­ban, AP­ben illetve egyéb SNSA­ban szenvedő betegek mintáit.

64

RA átlag IgG Biglikán IgM IgG Aggrekán IgM Kollagén II

IgG IgM

Fibronektin

IgG IgM

Dekorin

IgG

AP szórás

átlag

SNSA szórás

átlag

OA szórás

átlag

szórás

se

0,448

± 0,247

0,423

± 0,275

0,375

± 0,284

0,284

± 0,070

SF

0,331

± 0,221

0,403

± 0,268

0,319

± 0,186

0,234

± 0,088

se

0,313

± 0,098

0,216

± 0,079

0,299

± 0,067

0,325

± 0,125

SF

0,215

± 0,055

0,141***

± 0,047

0,202

± 0,083

0,131

± 0,061

se

0,389

± 0,173

0,386

± 0,136

0,335

± 0,139

0,351

± 0,139

SF

0,280

± 0,119

0,351

± 0,225

0,282

± 0,154

0,236

± 0,063

se

0,268

± 0,124

0,219

± 0,117

0,255

± 0,077

0,209

± 0,014

SF

0,206

± 0,069

0,162

± 0,067

0,190

± 0,071

0,186

± 0,200

se

0,436

± 0,187

0,549

± 0,413

0,361

± 0,093

0,393

± 0,099

SF

0,389

± 0,117

0,279***

± 0,118

0,308

± 0,090

0,232

± 0,031

se

0,462

± 0,140

0,394

± 0,050

0,486

± 0,109

0,469

± 0,047

SF

0,437

± 0,140

0,332**

± 0,081

0,358

± 0,091

0,297

± 0,057

se

0,453

± 0,240

0,476

± 0,313

0,345

± 0,138

0,389

± 0,061

SF

0,286

± 0,106

0,257*

± 0,125

0,252

± 0,109

0,182

± 0,061

se

0,311

± 0,106

0,257

± 0,078

0,362

± 0,151

0,373

± 0,039

SF

0,258

± 0,077

0,207

± 0,087

0,218

± 0,089

0,159

± 0,047

se

0,322

± 0,119

0,206

± 0,065

0,296

± 0,087

0,345

± 0,143

SF

0,178

± 0,064

0,150

± 0,033

0,198

± 0,075

0,128

± 0,030

0,229

± 0,082

0,153

± 0,071

0,250

± 0,092

0,155

± 0,009

65

RA átlag IgM

se

0,197

AP szórás

± 0,088

átlag 0,173

SNSA szórás

± 0,080

átlag 0,208*

OA szórás

± 0,097

átlag 0,125

szórás ± 0,020

SF

 4. táblázat: IgG és IgM szintek ELISA módszerrel történt összehasonlításának eredményei a különböző betegcsoportok szérumában és SF­ ében (OD=492 nm) * P < 0,05, ** P < 0,01 és  *** P < 0,001

66

A   szérumban   nem   találtunk   szignifikáns   eltérést   a   különböző   csoportok  porcantigén­specifikus   ellenanyag   szintjei   között.   Ezzel   szemben   az   SF   ellenanyag  szintjei markánsan megkülönböztették az egyes betegségcsoportokat (4. táblázat). A biglikán antitestek által való felismerése az SF­ben minden betegségcsoportra  jellemző volt, és nagy változékonyságot mutatott, akár az IgG, akár az IgM szintjét  vizsgáltuk.   Azonban   az   RA­ban   szenvedő   betegek   szignifikánsan   nagyobb   IgM  reaktivitást mutattak, mint az OA­ban szenvedő betegek (p<0,001). Az egyéb SNSA betegek csoportját a szignifikánsan magasabb SF anti­dekorin  IgG szint különböztette meg az OA­ban szenvedő betegek csoportjától (p<0,05). A többi általunk vizsgált, klasszikus porcmátrix­antigén közül a natív II. típusú  kollagén antitestek általi felismerése volt a legkiemelkedőbb. Az SF­ben mind az IgG,  mind pedig az IgM szintje szignifikánsan magasabb volt az RA csoportban, mint azok  között a betegek között, akik OA­ban (p<0,001 IgG esetében és p<0,01 IgM esetében),  vagy AP­ben szenvedtek (p<0,05 IgG esetében). A fibronektin­specifikus IgG­szint is emelkedett volt az RA csoport SF­ében az  OA   csoporthoz   viszonyítva   (p<0,05).   Ugyanakkor   nem   találtunk   a   betegcsoportok  között szignifikáns különbséget a klasszikus porcantigénként számontartott aggrekánra  specifikus synoviális antitestek esetében.

A különböző porcmátrix­antigéneket felismerő emelkedett  szintű ellenanyagok relatív gyakorisága Hogy bepillantást  nyerjünk a különböző porcmátrix­komponensekre specifikus,  emelkedett ellenanyag­szinttel rendelkező betegek relatív gyakoriságába, az OA csoport  esetében   mért   átlag   +2SD   értéket   tekintettük   kiindulópontnak   (14.  ábra).   A  legmagasabb (79,16 %) prevalenciát az RA­ban szenvedő betegek SF mintáiban a natív  II.   típusú   kollagén­specifikus   IgG   típusú   ellenanyag   esetében   találtuk.   Ez   az   érték 

67

14. ábra: A különböző porcmátrix komponensekre specifikus, emelkedett ellenanyag­ szinttel rendelkező betegek relatív gyakorisága Az   egyes   betegségcsoportokban   mért   értékeket   az   OA   csoport   esetében   mért   átlag   +2SD   értéket   tekintettük kiindulópontnak (ezt az elsősorban degeneratívnak tartott betegséget használtuk kontrollként   a gyulladásos arthritisek vizsgálatánál).

lényegesen   magasabb   volt   mint   akár   az   AP­ben   (40   %),   akár   az   egyéb   SNSA­ban 

68

szenvedő   betegek   (33,33   %)   esetében   mérhető   kollagén­specifikus   ellenanyag­ prevalencia. Az RA­ban kimutatható volt biglikán és dekorin ellenes IgG válasz, de  prevalenciája számottevően kisebb a CII elleni humorális immunválasznál (29,2 illetve  37,5 %). Érdekességképpen mind RA­ban, mind pedig SNSA­ban szenvedő betegek esetén  a dekorinra specifikus IgM ellenanyag SF­ban mérhető emelkedett szintje bizonyult a  legjellemzőbbnek   (50   illetve   55,5   %).   Mi   több,   az   SNSA   csoportban   a   SF­ban   az  általunk   vizsgált   IgG   ellenanyagok   közül   a   dekorinra   specifikusakat   jellemezte   a  legmagasabb precalencia­érték (44,4 %). Másrészről   az   AP­ben   szenvedő   betegek   jellemző   vonása   volt   a   porcmátrixot  felismerő ellenanyagok mindenütt általánosan alacsonyabb prevalenciája.  Ez részben  talán   azzal   magyarázható,   hogy   AP   esetén   az   elsődleges   károsodás  enthesis,  míg   a  synovitis másodlagos folyamat (220).

Klinikai és laboratóriumi paraméterek és az ellenanyag­szint  összefüggéseinek vizsgálata RA betegcsoport esetén Nem találtunk összefüggést a szérumban mérhető ellenanyag­szint és a betegek  klinikai/ laboratóriumi paraméterei között az RA csoportban. Ezzel szemben a II. típusú  kollagénre   specifikus   IgG   ellenanyagok   szintje   a   SF­ban   korrelált   a   szérum   RF­ tartalmával (P<0,01). Nem találtunk szignifikáns összefüggést a SF ellenanyag­tartalma és a betegek  életkora, a betegség időtartama, az érintett ízületek száma, az ESR, a fehérvérsejt­ és  vérlemezkeszám, illetve a szérum CRP­szintje között.

69

A különböző porcmátrix­komponensekre specifikus  ellenanyagok közötti összefüggések vizsgálata Kísérleteink során elvégeztük a különböző antigénekre specifikus ellenanyagok  szintjeinek   összehasonlítását   esetleges   korreláció   tesztelése   érdekében.   Az   RA­ban  szenvedő betegekre jellemző korrelációs mátrixot a 5. táblázat mutatja be. Meglepő   módon   erős   korrelációt   találtunk   a   II.   típusú   kollagénre   illetve   a  fibronektinre   specifikus   ellenanyag   szintek   között.   Szintén   megfigyelhető   volt   az  aggrekánra   illetve   a   biglikánra   specifikus   ellenanyagok   szintjeinek   korrelációja.  Ugyanezek   a   korrelációk   akkor   is   szignifikánsnak   mutatkoztak,   ha   az   összes   beteg  adatait teszteltük, nem csak az RA­ben szenvedő betegekét.

70

Biglikán IgG Se Dekorin

IgG se

IgM SF

0,264 0,24

SF 0,325 0,301 IgM se

Dekorin

Se

IgG SF

Se

Aggrekán IgM

SF

Se

IgG SF

Se

Kollagén II. IgM

SF

Se

IgG SF

0,504 0,58 0,386 0,131

-0,042 -0,181 0,363 0,334

SF -0,341 0,078 0,148 -0,206 Aggrekán

IgG se

0,950* 0,880* 0,533* 0,521 * *

SF 0,857* 0,918* 0,559* 0,056 * * IgM se

0,597* 0,441 *

SF 0,36 Kollagén II IgG se

0,389

0,104 0,032

-0,002 -0,264

0,636* 0,432* -0,024 0,229

0,728* 0,368 *

0,457 0,650* 0,447 0,207

0,696* 0,669 **

0,54

0,541* 0,513 0,129

0,488 0,726* 0,446 0,268 0,416 0,046

SF 0,743* 0,297 IgM se

0,413 0,477

-0,263 -0,634 0,508 0,747* 0,292 0

0,482 0,391

0,683* 0,261 -0,071 -0,062 0,859* 0,418 0,361 0,285 *

0,158 0,422

0,54

SF 0,346 0,125 0,393 0,27

0,259

0,774* 0,373 *

0,019 -0,053 0,15 0,125 0,331

71

0,189 -0,078 0,065

0,486 0,262 0,221 0,262

Se

IgM SF

Se

SF

Biglikán IgG Se Fibronektin IgG se

IgM SF

Se

IgG SF

0,655* 0,685* 0,529 0,493

SF 0,838* 0,378 * IgM se

Dekorin

0,579 0,28

-0,274 -0,072 0,265 0,296

SF 0

Se

Aggrekán IgM

SF

Se

IgG SF

Se

Kollagén II. IgM

SF

Se

IgG SF

Se

IgM SF

Se

SF

0,626* 0,325

-0,086 -0,402 0,774* 0,894* 0,483 0,274 0,853* 0,864* 0,477 0,521 * * * *

0,564 0,33

-0,082 -0,105 0,925* 0,449 *

0,686* 0,41 *

0,292 0,311 -0,154 0,127 0,098 0,268 0,229 0,435

0,630* 0,828 * **

0,393 0,397

0,732* 0,735 * **

-0,421 0,293 0,085 0,602 0,233

0,482 0,188 0,741* 0,853* 0,612* 0,536 * * *

0,077 -0,247 0,279 -0,074 -0,171 0,238

5. táblázat: A különböző porcmátrix­komponensekre specifikus ellenanyagok közötti összefüggések RA­ban (Spearman­féle korrelációs  koefficiens, a korreláció szignifikáns * P < 0,01 és ** P < 0,001 esetén)

72

Megbeszélés Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata Az   arthritis­kutatások   általában   a   porcszövet   bontásában   főként   a   proteázok,  elsősorban   az   MMP­k   szerepére   összpontosítanak.   Azonban   a   porcdegradáció  folyamatának teljes megértéséhez az események összetettebb elemzése szükséges, mely  magában foglalja a glikozidáz enzimek vizsgálatát is, hiszen a porcszövet felépítésében  résztvevő fehérjék nagy mértékben glikoziláltak. Doktori munkám egyik fontos célja  volt,   hogy   megvizsgáljam,   vajon   az   ízületi   kórképek   kialakulásában   szerepet  játszhatnak­e   azok   a   glikozidázok,   melyek   elméletileg   képesek  az   aggrekán   (a   porc  alapállományában   legnagyobb   mennyiségben   előforduló   proteoglikán)  glükózaminoglikánjainak   illetve   N­   és   O­kötött   oligoszacharidjainak   hasítására.   A  vizsgált enzimek (­D­N­acetil­glükózaminidáz, ­D­galaktozidáz, ­D­mannozidáz, ­ D­glükuronidáz) közül kettőt azonosítottam humán SF mintákban: a ­D­glükuronidáz  (GLUC) és a ­D­N­acetil­glükózaminidáz (NAG) enzimeket. A glikozidázokról közismert, hogy lizoszomális enzimek, s mint ilyenek, erősen  savas   kémhatású   közegben   fejtik   ki   maximális   aktivitásukat.   A   synoviális   folyadék  azonban enyhén bázikus kémhatású (221), s ez arra indított minket, hogy ezen enzimek  aktivitását optimális pH­juk mellett az SF minta aktuális pH­ján is megvizsgáljuk. Ez a  megközelítés vezetett minket ahhoz a megfigyeléshez, hogy a domináns glikozidázok  (GLUC, NAG) az SF eredeti pH­ján is igen aktívak, vagyis enyhén bázikus közegben is  képesek a porc alapállományát felépítő molekulák bontására. Ezen a pH­n mérve mind  a  ­D­glükuronidáz, mind pedig a  ­D­N­acetil­glükózaminidáz enzim aktivitása erős  asszociációt mutatott az RA betegséggel, mi több, ezen enzimek aktivitása, ha az SF  eredeti pH­ján mérjük, az RA szignifikáns prediktoraként szolgál, míg sem ugyanezen 

73

enzimek savas pH­n mérve, sem pedig a vizsgálataink tárgyát képező MMP­enzimek  nem különítették el az RA­t az általunk vizsgált egyéb ízületi betegségektől. A domináns glikozidázok szubsztrátspecificitása képessé teszi őket a hialuronsav  teljes lebontására, amennyiben alternáló módon hasítják azt. Ezzel összhangban RA­ban  az  SF   viszkozitása valóban csökkent az egészséges egyénekéhez képest, és  ennek a  jelenségnek a legkézenfekvőbb magyarázata, hogy hialuronsavat hidrolitikus enzim(ek)  emészti(k) (222). Az SF hialuronsav tartalmának emésztődésén és ennek megfelelően a  lubrikatív tulajdonságok csökkenésén felül  adataink  azt  is sugallják,  hogy a fentebb  említett   enzimek   porcmátrix­degradációs   képességgel   is   rendelkeznek.   Ez   a  megállapítás összhangban van egy újkeletű tanulmánnyal, melynek szerzői úgy találták,  hogy   a   hialuronsav­degradáció   a   proteoglikán   felszabadulásnak   egy   alternatív  mechanizmusa   az   ízületből   (223).   A   hialuronsav   degradációjának   ma   ismert   három  mechanizmusa   a   reaktív   oxigén­gyökök   által   okozott   depolimerizáció   (224),   a  hialuronidázok aktivitásával bekövetkező hasítások, illetve a ­D­glükuronidáz és a ­ D­N­acetil­glükózaminidáz   enzimek   aktivitása   révén   bekövetkező   alternatív   hasítás.  Bár úgy tudtuk, hogy a ­D­glükuronidáz és a ­D­N­acetil­glükózaminidáz katabolikus  szerepe   a   hialuronidáz   aktivitása   során   képződő   oligoszacharidok   hidrolízisére  korlátozódik   (225),   az   exoglikozidázok   relatív   fontosságát   erőteljesen   alátámasztja  ízületi specificitásuk: a  ­D­glükuronidáz és a  ­D­N­acetil­glükózaminidáz enzimek  szintje magasabb az SF­ben mint a szérumban, míg a hialuronidázt ellentétes szöveti  eloszlás   jellemzi   (6).   Az   exoglikozidázokat   feltételezhetően   lokálisan,   a   synoviális  membrán sejtjei termelik, s ez nagy jelentőséggel bírhat az SF­porc, illetve a pannus­ porc határfelületek esetében. Eredményeinknek   a   betegség   klinikai   tüneteihez   való   relevanciáját   jól  alátámasztja   az   a   megfigyelés,   hogy   a  ­D­glükuronidáz   és   a  ­D­N­acetil­

74

glükózaminidáz enzimek igen hatékonyak a GAG­ok porcból való kiürítésében, s ez a  tulajdonságuk a porc károsításában feltételezhető szerepükre utal. A GAG­ok központi  szerepet   játszanak   a   hialinporc   nyomási   szilárdságának   és   rugalmasságának  fenntartásában. A GAG­ok kiürülése folytán felpuhult porc nagyon sérülékennyé válik,  és a mechanikai megterhelés hatására elkopik. Az arthritis számos modelljében a GAG­ ok kiürülése a hialinporcból a betegség korai szöveti elváltozásaként demonstrálható  (226).   Az   általunk   glikozidázzal   illetve   glikozidázzal   és   MMP­vel   emésztett  porcmintákon a korai arthritishez erősen hasonló szöveti mintázatot láthattunk (mely a  GAG­ok igen hasonló kiürülését mutatta). Az arthritisben a glikozidázok jelentőségének másik fontos aspektusa a proteázok  és a glikozidázok lehetséges kölcsönhatása a porc degradációjában. Újabban kimutatták,  hogy   a   glikozilációs   végtermékek   mennyiségének   növekedése   az   MMP­k   általi  porcdegradáció   csökkenését   eredményezte   (227).   Ez   azt   sugallja,   hogy   a   porc  glikoziláltságának   szintje   befolyásolhatja   a   degradáció   folyamatát.   Ugyanakkor   a  proteázok   hatása   elősegítheti   a   glikozidázok   szövetbe   való   beáramlását,   illetve  hasítóhelyükhöz   való   hozzáférésüket.   Így   a   különböző   enzimcsoportok   kölcsönösen  elősegíthetik a hasítási helyhez való hozzáférést egymás számára. Azt is leírták, hogy  amennyiben   nagy  mennyiségű   aggrekán­vesztés   következik   be   (pl.   IL­1  stimuláció  hatására) proteolitikus hasítások által, ezzel mindig együtt jár alacsony molekulasúlyú  hialuronsav­fragmentumok felszabadulása.  Vizsgálatokat végeztünk arra vonatkozóan is, hogy vajon van­e összefüggés az SF  két fő glikozidázának (GLUC, NAG) illetve az MMP­enzimek aktivitása között. Míg a  két enzimcsoporton belül erős korrelációt találtunk, a glikozidázok és az MMP­k közötti  korreláció sokkal kevésbé volt kifejezett. Ez a megfigyelés azt sugallja, hogy az azonos  csoportba   tartozó   enzimek   együtt   szabályozódnak,   míg   a   csoportok   regulációja 

75

egymástól független. A porcszövetből való GAG­ürüléssel összefüggésben kizárólag az MMP­k hatását  emeli ki a szakirodalom a szöveti degradációban (228). Saját munkánk során a GAG­ok  nagymértékű   elvesztését   találtuk   azon   porcminták   felületi   és   középső   rétegében,  melyeket először MMP­vel, majd ezt követően glikozidázzal emésztettünk. Minthogy  az   MMP­1   és   az   MMP­9   elsődlegesen   kollagénbontó   aktivitással   jellemezhető,  feltételezzük,   hogy   a   II.   típusú   kollagén­hálózat   fragmentációja   megkönnyítette   az  exoglikozidázok szövetbe való bejutását rendszerünk esetében. A szöveti mátrixból a ­ D­glükuronidáz   és   a  ­D­N­acetil­glükózaminidáz  enzimek   hatására   bekövetkező  GAG­kiürülés   legvalószínűbb   módja   a   hialuronsav   degradációja   (és   az   aggrekán  komponens   ezt   követő   felszabadulása),   kiegészítve   a   GAG­ok   terminális  monoszacharid­egységének   (kondroitin­szulfátjának)   eltávolításával.   Hogy   a  glikozidázok     önmagukban   is   képesek   a   GAG­ok   kiürítésére   a   porcszövetből,  önmagában is meglepő, és az irodalomban mindez idáig nem vizsgált folyamat, mely az  arthritis­kutatások   újabb   fontos   adaléka   lehet.   Ugyanakkor   a   kombinált   emésztési  eljárások,   melyek   során   először   MMP­kkel   majd   glikozidázokkal   emésztettük   a  porcdarabkákat,   illetve   fordítva,   nem   egyszerű   additív   hatást   eredményeztek.  Egy  kontrollkísérletben kizártuk annak lehetőségét, hogy proteáz maradványok inaktiválnák  az exoglikozidázokat. Ezért feltételezzük, hogy a GAG­tartalom kiürülése diffúzió által  limitált   folyamatként   értelmezhető   a   kombinált   enzimkezelések   esetén.   A   GAG­ok  csökkent kiürülése azokból a mintákból, amelyeket először exoglikozidázokkal, majd  ezt   követően   proteázokkal   emésztettünk,   leginkább   azzal   magyarázható,   hogy  akadályozott a glikozidázok hasítási termékeinek porcból való ki­, és az MMP­enzimek  porc   alapállományba   történő   beáramlása.   Mindez   összefügghet   olyan  fehérjekonformációs   változásokkal,   amelyet   a   glikozidázok   emésztési   termékei   által 

76

létrehozott negatív töltésű diffúziós front idéz elő. Felvetődött az az izgalmas lehetőség, hogy a magas ­D­N­acetil­glükózaminidáz  aktivitás, melyet az RA­ban szenvedő betegek esetében mértünk, összefüggésben lehet  a közelmúltban megtisztított és klónozott nukleocitoplazmatikus enzimmel (229,230),  melyet ugyanilyen szubsztrátspecificitással jellemeztek. Azonban ezen lehetőség ellen  szól az SF­mintákban jelenlevő  ­D­N­acetil­glükózaminidáz savas pH­optimuma. A  glükuronidáz (egy klasszikusan lizoszómális enzim) és a ­D­N­acetil­glükózaminidáz  aktivitása közötti nagyfokú korreláció is általános lizoszomális enzimtermészetre utal.  Újabban tudósítottak arról is, hogy a stimulált porcsejtek felülúszójában és az RA­ban  szenvedő   betegek   szérumában   jelenlévő   legfőbb   glikozidáz   a   lizoszómális  hexózaminidáz,   melynek   aktivitása   valószínűleg   összefügg   vagy   azonos   az   SF­ben  mérhető magas glükózaminidáz aktivitással (200,201). Felvetődik   a   kérdés,   hogy   vajon   mi   lehet   ezen   enzimek   forrása   RA­ban?   A  porcsejtek   az   MMP­k   kézenfekvő   sejtforrásának   tűnnek   (főként   OA   esetén,   ahol  aránylag kevés gyulladásos sejt toborzódik, de RA esetén is) (231). Azonban az MMP­1  és   az   MMP­9,   két   IL­1   és   TNF­  által   indukálható   MMP   arról   is   ismert,   hogy  különböző gyulladásos sejtek, mint a neutrofil granulociták (MMP­9) és a monociták/  makrofágok (MMP­1 és MMP­9) is szekretálhatják őket (232). Az adhéziós receptorok  (L­szelektin   és   integrin   CD11b/CD18   (Mac1))   ligandkötéséről   kimutatták,   hogy  indukálja az MMP­9 felszabadulását humán neutrofilekből, ahol ez az enzim speciális  granulumokban   tárolódik   (233).   Szintén   újabban   írták   le,   hogy   a   synoviális  membránban megkülönböztetett MMP­9­termelés zajlik (234). Ami   a   glikozidázokat   illeti,   bár   a   porcsejtekből   kimutatták,   hogy   stimuláció  hatására D­N­acetil­glükózaminidázt szekretálnak (235), a lizoszomális glikozidázok  termelésének elsődleges jelöltjei mégis az ízület üregébe toborzott gyulladásos sejtek. A 

77

lizoszomális enzimek Ca2+­függő módon kerülnek exocitózisra vérlemezkék, neutrofil  granulociták, hízósejtek, makrofágok, citotoxikus T­sejtek és B­sejtek esetében (236, 237).   RA­ban   szenvedő   betegek   esetén   mi   is   magasabb  ­D­glükuronidáz   aktivitást  találtunk a sejtes véralkotókban (főként a granulociták esetén), és ez megerősíti azt az  elképzelést, hogy a glikozidázok elsődleges forrásai a gyulladásos sejtek. Eredményeink,   melyek   felhívják   a   figyelmet   a   proteázok   és   a   glikozidázok  esetleges   együttműködésére   RA­ban,   elősegíthetik   a   terület   további   kutatását.   A  fentebbi   enzimrendszerek   elemzése   fontos   része   az   RA   effektor   mechanizmusainak  teljes megértésére törekvő molekuláris és genetikai tanulmányoknak.

Az   RA   patomechanizmusában   esetlegesen   szerepet   játszó   porc  alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata Doktori munkám másik fontos kérdése, hogy a porcmátrix felépítésében szerepet  játszó   kis   méretű   proteoglikánokat   (biglikán   és   dekorin)   felsimerik­e   az   RA­ban  szenvedő betegek autoantitestjei, és amennyiben igen, milyen viszonylagos jelentőségű  a kis proteoglikánok felismerése RA­ban. A   gyulladt   synoviális   membránt   a   germinális   centrummal   rendelkező  nyirokcsomók jelenléte és nagy száma jellemzi RA­ban. Ez lokális B­sejt aktivációt és  plazmasejtté   való   differenciációt   sejtet,   mely   feltételezhetően   releváns   specificitású  ellenanyag­termelésre utal (10). Minthogy a legtöbb esetben az ellenanyag­termelés elengedhetetlen feltétele a T­ sejt – B­sejt együttműködés, a synoviális folyadékban található ellenanyagok minősége  közvetve utal a lokálisan aktiválódott T­helper sejtek antigén­specificitási mintázatára.  Így   a   lokálisan   termelődött   ellenanyagok   specificitása   információval   szolgálhat   a  feltételezhetően   a   hialinporc   alapállományában   elhelyezkedő   autoantigén  immunfelismeréséről,   esetleges   funkcionális   szerepéről.   Az   arthritis   kísérletes 

78

modelljeiből   származó   adatok   szintén   a   humorális   és   a   sejtes   immunitás   együttes  szerepére utalnak. RA esetén mindenképpen valamely az ízületből származó kulcsantigén jelenlétére  utal az a megfigyelés, hogy a synovectomia (a synoviális membrán eltávolítása) csupán  átmeneti javulást eredményez, míg a teljes ízület eltávolítása véglegesen megszünteti a  gyulladást (238). Elméletileg bármelyik porcmátrix molekula érintett lehet, mint elsődleges antigén,  vagy mint amelyet az arthritisben szenvedő betegek immunrendszere másodlagosan, a  molekulák közötti determináns­terjedés következtében ismer fel. Az összes  minta, amelyet ebben a tanulmányban vizsgáltunk, a betegség aktív  fázisát   élő   betegektől   származott   (erre   utal   exsudatív   synovitisük),   így   az   SF  ellenanyagainak epitóp­specificitása vélhetőleg releváns a betegségre nézve. Összehasonlító   tanulmányunkban   a   vizsgált   porcantigének   közül   a   II.   típusú  kollagén elsődleges felismerését találtuk az RA­ban szenvedő betegek esetében (az SF  kollagén­specifikus  ellenanyagainak  legmagasabb prevalenciája,  az SF IgG­ és IgM­ szintjének az OA­ban szenvedő betegekéhez képest szignifikáns eltérése, valamint a  klinikai és laboratóriumi paraméterekkel való legerősebb korreláció alapján). A jelen tanulmányban úgy találtuk, hogy az SF­ben mérhető anti­biglikán IgM  ellenanyag szintje szignifikánsan magasabb volt RA esetén mint OA­ban. Ugyanígy,  RA esetén a synoviális folyadékban az emelkedett dekorin­specifikus IgM ellenanyagok  relatív gyakorisága volt a legmagasabb a különböző porcmátrix molekulákra specifikus,  emelkedett   mennyiségben   jelenlévő   IgM   típusú   ellenanyagok   között.   Mivel   az   IgM  molekulák   a   komplementrendszer   kiváló   aktivátorai,   a   biglikánra   és   a   dekorinra  specifikus   ellenanyagok   jelenléte   az   SF­ben   szerepet   játszhat   az   ízületi   gyulladás  patomechanizmusában. 

79

A   kérdés   egy   másik   érdekes   aspektusa   a   dekorinról   leírt   immunmoduláló  funkcióhoz   kapcsolódik.   Ezek   a   funkciók   ugyanúgy   magukban   foglalják   a   C1q  komponens megkötését és a C1 komplex aktivitásának gátlását (239), akárcsak a TGF­ hatásainak a gátlását (240). A porcban levő dekorin ellenanyagokkal való megkötése a  betegekben   gátolhatja   a   molekulának   e   funkcióit   és   ezáltal   megváltoztathatja   a  gyulladásos folyamatokat. Nem várt eredményként erős korrelációt mutattunk ki a II. típusú kollagén­ és a  fibronektin­, illetve az aggrekán­ és a biglikán­specifikus ellenanyag szintek között. Ezt  okozhatja a fenti molekulák összehangolt felismerése, mely a lebomló mátrixból történő  egyidejű   felszabadulásuk   eredménye   lehet,   vagy   néhány   epitóp   közötti  keresztreaktivitás.   A   keresztreaktivitás   lehetőségét   támasztja   alá   egy   nemrégiben  megjelent tanulmány, melyben hasonlóságot írtak le az IgG­fibronektin komplexek és a  denaturált II. típusú kollagént felismerő ellenanyagok között (241). A mátrix molekulák immunológiai felismerése megváltozhat  a gyulladás során  glikoziláltságuk illetve konformációjuk változása miatt, s ez ismét a glikozidáz enzimek  szerepére irányítja a figyelmet. Munkánk   során   elsőként   tanulmányoztuk   a   porcmátrix   alapállományának  felépítésében   a   nagy   proteoglikánokkal   azonos   moláris   mennyiségben   jelenlevő   kis  proteoglikánok   ellen   fellépő   immunválaszt.   Eredményeink   arra   utalnak,   hogy   bár  ezekkel   szemben   nyilvánvalóan   termelődnek   ellenanyagok   az   RA­ban   szenvedő  betegekben,   ez   a   felismerés   másodlagos   lehet   az   autoimmun   folyamatban.   A   kis  proteoglikánokkal szemben RA­ban detektálható immunválasz nem éri el a kollagénnel  vagy a fibronektinnel szemben észlelhető mértéket, így ezen a ponton nem állíthatjuk,  hogy a  porcmátrix kis proteoglikánjai az RA fő autoantigénjei lehetnének. Azonban  komplement   aktiváló   hatásuk,   illetve   egyéb   járulékos,   az   autoimmun   folyamatot 

80

fenntartó hatásuk az ízületi gyulladásban jelentős lehet. Ahogyan az újonnan leírt porcmátrix komponensek száma nő, az RA potenciális  autoantigénjeinek   palettája   is   bővül.   A   közelmúlt   vizsgálatai   alapján   a   citrullinált  autoantigének kiemelt szerepe vetődik fel az RA patogenezisében. Minél többet tudunk  meg ezen kis molekulák relatív szerepéről az autoimmun folyamatban, annál közelebb  kerülünk az autoimmun gyulladás egészének megismeréséhez. Ez teheti majd lehetővé,  hogy egyre hatékonyabban tudjuk befolyásolni és ezáltal orvosolni az autoimmunitással  járó betegséget.

Következtetések Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata Munkánk   során   a   porcdegradációban   érintett   effektor   mechanizmusokat  vizsgáltuk,   különös   tekintettel   a   glikozidáz   enzimek   szerepére.   Két   domináns  exoglikozidáz enzimet azonosítottam humán SF mintákban: a ­D­glükuronidáz és a ­ D­N­acetil­glükózaminidáz enzimeket. Ezek az enzimek az SF eredeti pH­ján is aktívak  voltak, és ezen a pH­n mérve aktivitásuk asszociációt mutatott az RA betegséggel. Az  általunk   glikozidázzal   illetve   glikozidázzal   és   MMP­kkel   emésztett   porcmintákon   a  korai   arthritishez   hasonló   szöveti   mintázatot   láthattunk,   ez   jól   alátámasztja  eredményeinknek a klinikai tünetekhez való relevanciáját. A glikozidázok fő forrásai  RA­ban   szenvedő   betegek   esetén   a   gyulladásos   sejtek   lehetnek,   mivel   a   sejtes  véralkotókban magasabb GLUC­aktivitás volt kimutatható.

Az   RA   patomechanizmusában   esetlegesen   szerepet   játszó   porc  alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata A porcmátrix felépítésében szerepet játszó kis méretű proteoglikánok (biglikán és 

81

dekorin)   felismerésére   vonatkozóan   azt   találtuk,   hogy   bár   a   II.   típusú   kollagén  felismerése   az   elsődleges   RA­ban,   az   SF­ben   mérhető   anti­biglikán   IgM   ellenanyag  szintje szignifikánsan magasabb volt RA esetén, mint OA­ban. Az emelkedett dekorin­ specifikus   IgM   ellenanyagok   relatív   gyakorisága   volt   a   legmagasabb   a   különböző  porcmátrix   molekulákra   specifikus,   emelkedett   mennyiségben   jelenlevő   IgM   típusú  ellenanyagok közül. Erős korrelációt találtunk a II. típusú kollagén­ és a fibronektin­,  illetve az aggrekán­ és a biglikán­specifikus ellenanyag szintek között. A porcmátrix kis  proteoglikánjainak felismerése ezek alapján másodlagos az autoimmun folyamatban.

82

Összefoglalás A rheumatoid arthritis (RA) az ízületi porc pusztulásával jellemezhető autoimmun  betegség.   Számos   tanulmány   foglalkozik   a   mátrix   metalloproteinázok   (MMP)  porcdegradációban betöltött szerepével. A porcszövet proteoglikánjainak bontásában a  glikozidáz enzimek szerepét vizsgáltuk, melyekkel méltatlanul  keveset foglalkozik a  szakirodalom. A két enzimcsalád aktivitása közötti összefüggés ismerete fontos lehet a  betegség patomechanizmusának megértéséhez. RA   esetén   az   autoimmun   folyamatok   természetes   célpontjai   lehetnek   a  porcalapállomány felépítésében résztvevő kis, leucinban gazdag proteoglikánok, ezek  vizsgálatát végeztük el. RA­ban,   osteoarthritisben   (OA),   arthritis   psoriaticában   (AP)   és   szeronegatív  spondylarthritisben   (SNSA)   szenvedő,   és   akut   sportsérült   betegek   synoviális  folyadékában (SF) kimutattuk az MMP­k és a glikozidázok aktivitását. RA esetében az  SF ­D­glükuronidáz és ­D­N­acetil­glükózaminidáz aktivitása együttesen a betegség  szignifikáns prediktorának bizonyult. A betegek szérumában és synoviális folyadékában  anti­­D­glükuronidáz ellenanyagot mutattunk ki. RA eredetű vérsejtekben emelkedett  ­D­glükuronidáz aktivitást találtunk az egészséges kontrollokhoz képest. Kimutattuk,  hogy   az   MMP­k   és   a   glikozidázok   együttesen   igen   hatékonyan   járulnak   hozzá   a  glükózaminoglikánok porc alapállományból való kiürüléséhez. RA­ban,   OA­ban,   AP­ben,   SNSA­ban   szenvedő,   illetve   akut   sportsérülést  szenvedett  betegek szérumában és  SF­ában biglikán­, dekorin­. aggrekán­, II. típusú  kollagén­ és fibronektin­specifikus IgG és IgM típusú ellenanyag szinteket mértünk.  RA­ban   a   biglikán­specifikus   IgM­,   SNSA­ban   a   dekorin­specifikus   IgG­válasz  bizonyult jelentősen emelkedettnek.

83

Summary Rheumatoid   arthritis   (RA)   is   an   autoimmune   disease   characterized   by   joint  destruction. Several studies investigate the role of matrix metalloproteinases (MMPs) in  cartilage degradation. We examined the role of glycosidase enzymes in the degradation  of cartilage proteoglycans, since these enzymes are recently neglected by the literature.  Determining   the   relative   importance   of   the   above   groups   of   enzymes   might   be  important in the understanding of the pathomechanism of arthritic diseases. In   the   case   of   RA   the   small,   leucine­rich   proteoglycans   that   are   important  components   of   the   extracellular   matrix   might   be   trivial   targets   of   the   autoimmune  processes. We examined these molecules. The activity of MMPs and glycosidases in the synovial fluid (SF) of patients with  RA,   osteoarthritis   (OA),   psoriatic   arthritis   (AP),   seronegative   spondylarthritides  (SNSA)   and   acute   sports   injury   has   been   demonstrated.   We   have   shown   that   the  activities   of  ­D­glucuronidase   and  ­D­N­acetyl­glucosaminidase   in   the   SF   are  significant predictors of RA. We have detected anti­­D­glucuronidase antibodies in the  serum   and   SF   samples   of   patients   with   RA.   Also,   an   elevated   activity   of  ­D­ glucuronidase has been detected in the blood cells of patients with RA compared to the  healthy   controlls.   Glycosidases   alone   or   in   combination   with   MMPs,   proved   to   be  effective in depleting glycosaminoglycans (GAGs) from cartilage. We   tested   biglycan­,   decorin­,   aggrecan­,   collagen   type   II­   and   fibronectin­ specific IgG and IgM antibody levels in serum and SF of patients with RA, OA, AP,  SNSA. We have detected antibodies reactive to these cartilage components in the SF  samples. While the elevated biglycan­specific IgM response was characteristic for RA,  the decorin­specific IgG response proved to particularly elevated in SNSA.

84

Irodalomjegyzék 1. Primakoff P, Myles DG. The ADAM gene family: surface proteins with adhesion and protease activity. Trends Genet. 16:83-7. 2000. 2. Kaushal GP, Shah SV. The new kids on the block: ADAMTSs, potentially multifunctional metalloproteinases of the ADAM family. J Clin Invest. 105:1335-7. 2000. 3. Tak PP, Kummer JA, Hack CE, Daha MR, Smeets TJ, Erkelens GW, Meinders AE, Kluin PM, Breedveld FC. Granzyme-positive cytotoxic cells are specifically increased in early rheumatoid synovial tissue. Arthritis Rheum. 37:1735-43. 1994. 4. Cunnane G, FitzGerald O, Hummel KM, Gay RE, Gay S, Bresnihan B. Collagenase, cathepsin B and cathepsin L gene expression in the synovial membrane of patients with early inflammatory arthritis. Rheumatology (Oxford). 38:34-42. 1999. 5. Konttinen YT, Mandelin J, Li TF, Salo J, Lassus J, Liljestrom M, Hukkanen M, Takagi M, Virtanen I, Santavirta S. Acidic cysteine endoproteinase cathepsin K in the degeneration of the superficial articular hyaline cartilage in osteoarthritis. Arthritis Rheum. 46:953-60. 2002. 6. Stephens RW, Ghosh P, Taylor TK, Gale CA, Swann JC, Robinson RG, Webb J. The origins and relative distribution of polysaccharidases in rheumatoid and osteoarthritic fluids. J Rheumatol. 2:393-400. 1975. 7. Ganguly NK, Kingham JG, Lloyd B, Lloyd RS, Price CP, Triger DR, Wright R. Acid hydrolases in monocytes from patients with inflammatory bowel disease, chronic liver disease, and rheumatoid arthritis. Lancet. 1:1073-5. 1978. 8. Bartholomew BA. Synovial fluid glycosidase activity. Scand J Rheumatol. 1:69-74. 1972. 9. Clague RB, Moore LJ. IgG and IgM antibody to native type II collagen in rheumatoid arthritis serum and synovial fluid. Evidence for the presence of collagen-anticollagen immune complexes in synovial fluid. Arthritis Rheum. 27:1370-7. 1984. 10.Rowley MJ, Williamson DJ, Mackay IR. Evidence for local synthesis of antibodies to denatured collagen in the synovium in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 30:1420-5. 1987.

85

11.Williams DG.. Autoantibodies in rheumatoid arthritis. in Rheumatology. (Klippel JH, Dieppe PA ed.) Mosby. 1998. 12.Cuesta IA, Sud S, Song Z, Affholter JA, Karvonen RL, Fernandez-Madrid F, Wooley PH. T cell receptor (V beta) bias in the response of rheumatoid arthritis synovial fluid T cells to connective tissue antigens. Scand J Rheumatol. 26:166-73. 1997. 13.Park SH, Min DJ, Cho ML, Kim WU, Youn J, Park W, Cho CS, Kim HY. Shift toward T helper 1 cytokines by type II collagen-reactive T cells in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 44:561-9. 2001. 14.Glant T, Csongor J, Szucs T. Immunopathologic role of proteoglycan antigens in rheumatoid joint disease. Scand J Immunol. 11:247-52. 1980. 15.Glant TT, Hadhazy C, Mikecz K, Sipos A. Appearance and persistence of fibronectin in cartilage. Specific interaction of fibronectin with collagen type II. Histochemistry. 82:149-58. 1985. 16.Verheijden GF, Rijnders AW, Bos E, Coenen-de Roo CJ, van Staveren CJ, Miltenburg AM, Meijerink JH, Elewaut D, de Keyser F, Veys E, Boots AM. Human cartilage glycoprotein-39 as a candidate autoantigen in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 40:1115-25. 1997. 17.Kotzin BL, Falta MT, Crawford F, Rosloniec EF, Bill J, Marrack P, Kappler J. Use of soluble peptide-DR4 tetramers to detect synovial T cells specific for cartilage antigens in patients with rheumatoid arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 97:291-6. 2000. 18.Gömör Béla. Reumatológia. Medicina. 2001. 19.. Cell Biology Online www.cella.cn/book/10/01.htm 20.Rose NR, Mackay IR. The Autoimmune Diseases. Academic Press. 2005. 21.Klareskog L, Forsum U, Malmnas Tjernlund UK, Kabelitz D, Wigren A. Appearance of anti-HLA-DR-reactive cells in normal and rheumatoid synovial tissue. Scand J Immunol. 14:183-92. 1981. 22.Winchester RJ, Burmester GR. Demonstration of Ia antigens on certain dendritic cells and on a novel elongate cell found in human synovial tissue. Scand J Immunol. 14:439-44. 1981. 23.Klareskog L, Forsum U, Kabelitz D, Ploen L, Sundstrom C, Nilsson K, Wigren A, Wigzell H. Immune functions of human synovial cells. Phenotypic and T cell

86

regulatory properties of macrophage-like cells that express HLA-DR. Arthritis Rheum. 25:488-501. 1982. 24.Janossy G, Panayi G, Duke O, Bofill M, Poulter LW, Goldstein G. Rheumatoid arthritis: a disease of T-lymphocyte/macrophage immunoregulation. Lancet. 2:839-42. 1981. 25.Newton CD, Nunamaker DM. Textbook of Small Animal Orthopaedics. Lippincott. 1985. 26.Storey GD. Alfred Baring Garrod (1819-1907). Rheumatology (Oxford). 40:1189-90. 2001. 27.Rowan AD. Cartilage catabolism in arthritis: factors that influence homeostasis. Expert Rev Mol Med. 2001:1-20. 2001. 28.Matteson E. Atlas of rheumatology Current Medicine Inc.. 2002. 29.Ritchie DM, Boyle JA, McInnes JM, Jasani MK, Dalakos TG, Grieveson P, Buchanan WW. Clinical studies with an articular index for the assessment of joint tenderness in patients with rheumatoid arthritis. Q J Med. 37:393-406. 1968. 30.Klippel JH. Primer on the rheumatic diseases. Arthritis Foundation. 1997. 31.Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, McShane DJ, Fries JF, Cooper NS, Healey LA, Kaplan SR, Liang MH, Luthra HS. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 31:315-24. 1988. 32.Hochberg MC, Spector TD. Epidemiology of rheumatoid arthritis: update. Epidemiol Rev. 12:247-52. 1990. 33.Markenson JA. Worldwide trends in the socioeconomic impact and long-term prognosis of rheumatoid arthritis. Semin Arthritis Rheum. 21:4-12. 1991. 34.Bjornadal L, Baecklund E, Yin L, Granath F, Klareskog L, Ekbom A. Decreasing mortality in patients with rheumatoid arthritis: results from a large population based cohort in Sweden, 1964-95. J Rheumatol. 29:906-12. 2002. 35.Wolfe F, Mitchell DM, Sibley JT, Fries JF, Bloch DA, Williams CA, Spitz PW, Haga M, Kleinheksel SM, Cathey MA. The mortality of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 37:481-94. 1994. 36.Sambrook PN, Spector TD, Seeman E, Bellamy N, Buchanan RR, Duffy DL, Martin

87

NG, Prince R, Owen E, Silman AJ. Osteoporosis in rheumatoid arthritis. A monozygotic co-twin control study. Arthritis Rheum. 38:806-9. 1995. 37.Aho K, Koskenvuo M, Tuominen J, Kaprio J. Occurrence of rheumatoid arthritis in a nationwide series of twins. J Rheumatol. 13:899-902. 1986. 38.Silman AJ, MacGregor AJ, Thomson W, Holligan S, Carthy D, Farhan A, Ollier WE. Twin concordance rates for rheumatoid arthritis: results from a nationwide study. Br J Rheumatol. 32:903-7. 1993. 39.Heliovaara M, Aho K, Aromaa A, Knekt P, Reunanen A. Smoking and risk of rheumatoid arthritis. J Rheumatol. 20:1830-5. 1993. 40.Karlson EW, Lee IM, Cook NR, Manson JE, Buring JE, Hennekens CH. A retrospective cohort study of cigarette smoking and risk of rheumatoid arthritis in female health professionals. Arthritis Rheum. 42:910-7. 1999. 41.Silman AJ, Newman J, MacGregor AJ. Cigarette smoking increases the risk of rheumatoid arthritis. Results from a nationwide study of disease-discordant twins. Arthritis Rheum. 39:732-5. 1996. 42.Symmons D, Harrison B. Early inflammatory polyarthritis: results from the norfolk arthritis register with a review of the literature. I. Risk factors for the development of inflammatory polyarthritis and rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford). 39:835-43. 2000. 43.Houssiau FA. Cytokines in rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol. 14 Suppl 2:10-3. 1995. 44.Ulfgren AK, Grondal L, Lindblad S, Khademi M, Johnell O, Klareskog L, Andersson U. Interindividual and intra-articular variation of proinflammatory cytokines in patients with rheumatoid arthritis: potential implications for treatment. Ann Rheum Dis. 59:439-47. 2000. 45.Panayi GS. Targeting of cells involved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford). 38 Suppl 2:8-10. 1999. 46.Matsumoto I, Muraki Y, Yasukochi T, Hua Z, Kori Y, Hayashi T, Goto D, Ito S, Tsutsumi A, Ikeda K, Sumichika H, Sumida T. The exploration of joint-specific immunoreactions on immunoglobulins G of anti-glucose-6-phosphate isomerase antibody-positive patients with rheumatoid arthritis. Int J Mol Med. 16:793-800.

88

2005. 47.Schaller M, Stohl W, Tan SM, Benoit VM, Hilbert DM, Ditzel HJ. Raised levels of anti-glucose-6-phosphate isomerase IgG in serum and synovial fluid from patients with inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 64:743-9. 2005. 48.Muraki Y, Matsumoto I, Chino Y, Hayashi T, Suzuki E, Goto D, Ito S, Murata H, Tsutsumi A, Sumida T. Glucose-6-phosphate isomerase variants play a key role in the generation of anti-GPI antibodies: possible mechanism of autoantibody production. Biochem Biophys Res Commun. 323:518-22. 2004. 49.Konttinen YT, Ceponis A, Takagi M, Ainola M, Sorsa T, Sutinen M, Salo T, Ma J, Santavirta S, Seiki M. New collagenolytic enzymes/cascade identified at the pannushard tissue junction in rheumatoid arthritis: destruction from above. Matrix Biol. 17:585-601. 1998. 50.Choy EH, Panayi GS. Cytokine pathways and joint inflammation in rheumatoid arthritis. N Engl J Med. 344:907-16. 2001. 51.Yanni G, Whelan A, Feighery C, Fitzgerald O, Bresnihan B. Morphometric analysis of synovial membrane blood vessels in rheumatoid arthritis: associations with the immunohistologic features, synovial fluid cytokine levels and the clinical course. J Rheumatol. 20:634-8. 1993. 52.Godessart N, Kunkel SL. Chemokines in autoimmune disease. Curr Opin Immunol. 13:670-5. 2001. 53.Kohem CL, Brezinschek RI, Wisbey H, Tortorella C, Lipsky PE, Oppenheimer-Marks N. Enrichment of differentiated CD45RBdim,CD27- memory T cells in the peripheral blood, synovial fluid, and synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 39:844-54. 1996. 54.Zvaifler NJ, Firestein GS. Pannus and pannocytes. Alternative models of joint destruction in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 37:783-9. 1994. 55.Krane SM, Conca W, Stephenson ML, Amento EP, Goldring MB. Mechanisms of matrix degradation in rheumatoid arthritis. Ann N Y Acad Sci. 580:340-54. 1990. 56.Moore AR, Iwamura H, Larbre JP, Scott DL, Willoughby DA. Cartilage degradation by polymorphonuclear leucocytes: in vitro assessment of the pathogenic mechanisms. Ann Rheum Dis. 52:27-31. 1993.

89

57.Jasin HE, Taurog JD. Mechanisms of disruption of the articular cartilage surface in inflammation. Neutrophil elastase increases availability of collagen type II epitopes for binding with antibody on the surface of articular cartilage. J Clin Invest. 87:15316. 1991. 58.Taniguchi N, Kawahara K, Yone K, Hashiguchi T, Yamakuchi M, Goto M, Inoue K, Yamada S, Ijiri K, Matsunaga S, Nakajima T, Komiya S, Maruyama I. High mobility group box chromosomal protein 1 plays a role in the pathogenesis of rheumatoid arthritis as a novel cytokine. Arthritis Rheum. 48:971-81. 2003. 59.Wang H, Bloom O, Zhang M, Vishnubhakat JM, Ombrellino M, Che J, Frazier A, Yang H, Ivanova S, Borovikova L, Manogue KR, Faist E, Abraham E, Andersson J, Andersson U, Molina PE, Abumrad NN, Sama A, Tracey KJ. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science. 285:248-51. 1999. 60.Degryse B, Bonaldi T, Scaffidi P, Muller S, Resnati M, Sanvito F, Arrigoni G, Bianchi ME. The high mobility group (HMG) boxes of the nuclear protein HMG1 induce chemotaxis and cytoskeleton reorganization in rat smooth muscle cells. J Cell Biol. 152:1197-206. 2001. 61.Wang H, Yang H, Czura CJ, Sama AE, Tracey KJ. HMGB1 as a late mediator of lethal systemic inflammation. Am J Respir Crit Care Med. 164:1768-73. 2001. 62.Muller S, Scaffidi P, Degryse B, Bonaldi T, Ronfani L, Agresti A, Beltrame M, Bianchi ME. New EMBO members review: the double life of HMGB1 chromatin protein: architectural factor and extracellular signal. EMBO J. 20:4337-40. 2001. 63.Yang H, Wang H, Tracey KJ. HMG-1 rediscovered as a cytokine. Shock. 15:247-53. 2001. 64.The

Arthritis

Society.

Osteoarthritis

www.arthritis.ca/types%20of%20arthritis/osteoarthr 65.Medinfo. Osteoarthritis www.medinfo.co.uk/conditions/osteoarthritis.html 66.NIAMS/National

Institutes

of

Health.

Handout

on

Health:

Osteoarthritis

www.niams.nih.gov/hi/topics/arthritis/oahandout.html 67.Packham JC, Bowness P. Seronegative spondyloarthopathies. Rheumatic Disease: Topical Rewiews. 4:1-6. 2001. 68.Moll JM, Haslock I, Macrae IF, Wright V. Associations between ankylosing

90

spondylitis, psoriatic arthritis, Reiter s disease, the intestinal arthropathies, and Behcet s syndrome. Medicine (Baltimore). 53:343-64. 1974. 69.Allen RL, Bowness P, McMichael A. The role of HLA-B27 in spondyloarthritis. Immunogenetics. 50:220-7. 1999. 70.Brown MA, Pile KD, Kennedy LG, Campbell D, Andrew L, March R, Shatford JL, Weeks DE, Calin A, Wordsworth BP. A genome-wide screen for susceptibility loci in ankylosing spondylitis. Arthritis Rheum. 41:588-95. 1998. 71.Beacock-Sharp H, Young JL, Gaston JS. Analysis of T cell subsets present in the peripheral blood and synovial fluid of reactive arthritis patients. Ann Rheum Dis. 57:100-6. 1998. 72.Francois RJ, Neure L, Sieper J, Braun J. Immunohistological examination of open sacroiliac biopsies of patients with ankylosing spondylitis: detection of tumour necrosis factor alpha in two patients with early disease and transforming growth factor beta in three more advanced cases. Ann Rheum Dis. 65:713-20. 2006. 73.Brandt J, Haibel H, Reddig J, Sieper J, Braun J. Successful short term treatment of severe undifferentiated spondyloarthropathy with the anti-tumor necrosis factor-alpha monoclonal antibody infliximab. J Rheumatol. 29:118-22. 2002. 74.Ward MM. Clinical epidemiology: diagnostic and prognostic tests. Curr Opin Rheumatol. 15:104-9. 2003. 75.Corbett M, Dalton S, Young A, Silman A, Shipley M. Factors predicting death, survival and functional outcome in a prospective study of early rheumatoid disease over fifteen years. Br J Rheumatol. 32:717-23. 1993. 76.Smith JB, Haynes MK. Rheumatoid arthritis--a molecular understanding. Ann Intern Med. 136:908-22. 2002. 77.Gregersen PK, Silver J, Winchester RJ. The shared epitope hypothesis. An approach to understanding the molecular genetics of susceptibility to rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 30:1205-13. 1987. 78.MacGregor A, Ollier W, Thomson W, Jawaheer D, Silman A. HLA-DRB1*0401/0404 genotype and rheumatoid arthritis: increased association in men, young age at onset, and disease severity. J Rheumatol. 22:1032-6. 1995. 79.Valenzuela A, Gonzalez-Escribano MF, Rodriguez R, Moreno I, Garcia A, Nunez-

91

Roldan A. Association of HLA shared epitope with joint damage progression in rheumatoid arthritis. Hum Immunol. 60:250-4. 1999. 80.Lard LR, Boers M, Verhoeven A, Vos K, Visser H, Hazes JM, Zwinderman AH, Schreuder GM, Breedveld FC, De Vries RR, van der Linden S, Zanelli E, Huizinga TW. Early and aggressive treatment of rheumatoid arthritis patients affects the association of HLA class II antigens with progression of joint damage. Arthritis Rheum. 46:899-905. 2002. 81.Hueber W, Utz PJ, Robinson WH. Autoantibodies in early arthritis: advances in diagnosis and prognostication. Clin Exp Rheumatol. 21:S59-64. . 82.Harris ED. Rheumatoid synovium: Complex, and more than the sum of its parts. in Rheumatoid Arthritis, (Harris ED ed.) WB Saunders. 1997. 83.Aho K, Kurki P. Seropositive versus seronegative rheumatoid arthritis--time for a new definition. J Rheumatol. 21:388-90. 1994. 84.Ward MM. Laboratory testing for systemic rheumatic diseases. Postgrad Med. 103:93-100. 1998. 85.Kellgren JH. Epidemiology of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 9:658-74. 1966. 86.Aho K, Palosuo T, Raunio V, Puska P, Aromaa A, Salonen JT. When does rheumatoid disease start? Arthritis Rheum. 28:485-9. 1985. 87.Aho K, Palusuo T, Kurki P. Marker antibodies of rheumatoid arthritis: diagnostic and pathogenetic implications. Semin Arthritis Rheum. 23:379-87. 1994. 88.Masi AT, Maldonado-Cocco JA, Kaplan SB, Feigenbaum SL, Chandler RW. Prospective study of the early course of rheumatoid arthritis in young adults: comparison of patients with and without rheumatoid factor positivity at entry and identification of variables correlating with outcome. Semin Arthritis Rheum. 4:299326. 1976. 89.Jacoby RK, Jayson MI, Cosh JA. Onset, early stages, and prognosis of rheumatoid arthritis: a clinical study of 100 patients with 11-year follow-up. Br Med J. 2:96-100. 1973. 90.Fex E, Jonsson K, Johnson U, Eberhardt K. Development of radiographic damage during the first 5-6 yr of rheumatoid arthritis. A prospective follow-up study of a Swedish cohort. Br J Rheumatol. 35:1106-15. 1996.

92

91.Smolen JS, Steiner G. Are autoantibodies active players or epiphenomena? Curr Opin Rheumatol. 10:201-6. 1998. 92.Masi AT, Feigenbaum SL. Seronegative rheumatoid arthritis. Fact or fiction? Arch Intern Med. 143:2167-72. 1983. 93.Leslie D, Lipsky P, Notkins AL. Autoantibodies as predictors of disease. J Clin Invest. 108:1417-22. 2001. 94.Goldbach-Mansky R, Lee J, McCoy A, Hoxworth J, Yarboro C, Smolen JS, Steiner G, Rosen A, Zhang C, Menard HA, Zhou ZJ, Palosuo T, Van Venrooij WJ, Wilder RL, Klippel JH, Schumacher HR, El-Gabalawy HS. Rheumatoid arthritis associated autoantibodies in patients with synovitis of recent onset. Arthritis Res. 2:236-43. 2000. 95.Serre G. Autoantibodies to filaggrin/deiminated fibrin (AFA) are useful for the diagnosis and prognosis of rheumatoid arthritis, and are probably involved in the pathophysiology of the disease. Joint Bone Spine. 68:103-5. 2001. 96.Young BJ, Mallya RK, Leslie RD, Clark CJ, Hamblin TJ. Anti-keratin antibodies in rheumatoid arthritis. Br Med J. 2:97-9. 1979. 97.Simon M, Girbal E, Sebbag M, Gomes-Daudrix V, Vincent C, Salama G, Serre G. The cytokeratin filament-aggregating protein filaggrin is the target of the so-called "antikeratin antibodies," autoantibodies specific for rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 92:1387-93. 1993. 98.NIENHUIS RL, MANDEMA E. A NEW SERUM FACTOR IN PATIENTS WITH RHEUMATOID ARTHRITIS; THE ANTIPERINUCLEAR FACTOR. Ann Rheum Dis. 23:302-5. 1964. 99.Vincent C, de Keyser F, Masson-Bessiere C, Sebbag M, Veys EM, Serre G. Antiperinuclear factor compared with the so called "antikeratin" antibodies and antibodies to human epidermis filaggrin, in the diagnosis of arthritides. Ann Rheum Dis. 58:428. 1999. 100.Sebbag M, Simon M, Vincent C, Masson-Bessiere C, Girbal E, Durieux JJ, Serre G. The antiperinuclear factor and the so-called antikeratin antibodies are the same rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest. 95:2672-9. 1995. 101.Girbal-Neuhauser E, Durieux JJ, Arnaud M, Dalbon P, Sebbag M, Vincent C, Simon

93

M, Senshu T, Masson-Bessiere C, Jolivet-Reynaud C, Jolivet M, Serre G. The epitopes targeted by the rheumatoid arthritis-associated antifilaggrin autoantibodies are posttranslationally generated on various sites of (pro)filaggrin by deimination of arginine residues. J Immunol. 162:585-94. 1999. 102.Yamada R, Suzuki A, Chang X, Yamamoto K. Citrullinated proteins in rheumatoid arthritis. Front Biosci. 10:54-64. 2005. 103.Kurki P, Aho K, Palosuo T, Heliovaara M. Immunopathology of rheumatoid arthritis. Antikeratin antibodies precede the clinical disease. Arthritis Rheum. 35:914-7. 1992. 104.Paimela L, Gripenberg M, Kurki P, Leirisalo-Repo M. Antikeratin antibodies: diagnostic and prognostic markers for early rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 51:743-6. 1992. 105.Berthelot JM, Maugars Y, Castagne A, Audrain M, Prost A. Antiperinuclear factors are present in polyarthritis before ACR criteria for rheumatoid arthritis are fulfilled. Ann Rheum Dis. 56:123-5. 1997. 106.Meyer O, Combe B, Elias A, Benali K, Clot J, Sany J, Eliaou JF. Autoantibodies predicting the outcome of rheumatoid arthritis: evaluation in two subsets of patients according to severity of radiographic damage. Ann Rheum Dis. 56:682-5. 1997. 107.Serre G, Vincent C. Fillagrin (keratin) autoantibodies. in Autoantibodies. (Peter JB, Shoenfield Y ed.) Elsevier. 1996. 108.Vincent C, Serre G, Lapeyre F, Fournie B, Ayrolles C, Fournie A, Soleilhavoup JP. High diagnostic value in rheumatoid arthritis of antibodies to the stratum corneum of rat oesophagus epithelium, so-called

antikeratin antibodies . Ann Rheum Dis.

48:712-22. 1989. 109.Masson-Bessiere C, Sebbag M, Durieux JJ, Nogueira L, Vincent C, GirbalNeuhauser E, Durroux R, Cantagrel A, Serre G. In the rheumatoid pannus, antifilaggrin autoantibodies are produced by local plasma cells and constitute a higher proportion of IgG than in synovial fluid and serum. Clin Exp Immunol. 119:544-52. 2000. 110.Masson-Bessiere C, Sebbag M, Girbal-Neuhauser E, Nogueira L, Vincent C, Senshu T, Serre G. The major synovial targets of the rheumatoid arthritis-specific antifilaggrin autoantibodies are deiminated forms of the alpha- and beta-chains of

94

fibrin. J Immunol. 166:4177-84. 2001. 111.Bizzaro N, Mazzanti G, Tonutti E, Villalta D, Tozzoli R. Diagnostic accuracy of the anti-citrulline antibody assay for rheumatoid arthritis. Clin Chem. 47:1089-93. 2001. 112.Despres N, Boire G, Lopez-Longo FJ, Menard HA. The Sa system: a novel antigenantibody system specific for rheumatoid arthritis. J Rheumatol. 21:1027-33. 1994. 113.Menard HA, Lapointe E, Rochdi MD, Zhou ZJ. Insights into rheumatoid arthritis derived from the Sa immune system. Arthritis Res. 2:429-32. 2000. 114.Hayem G, Chazerain P, Combe B, Elias A, Haim T, Nicaise P, Benali K, Eliaou JF, Kahn MF, Sany J, Meyer O. Anti-Sa antibody is an accurate diagnostic and prognostic marker in adult rheumatoid arthritis. J Rheumatol. 26:7-13. 1999. 115.Hueber W, Hassfeld W, Smolen JS, Steiner G. Sensitivity and specificity of anti-Sa autoantibodies for rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford). 38:155-9. 1999. 116.van Jaarsveld CH, ter Borg EJ, Jacobs JW, Schellekens GA, Gmelig-Meyling FH, van Booma-Frankfort C, de Jong BA, van Venrooij WJ, Bijlsma JW. The prognostic value of the antiperinuclear factor, anti-citrullinated peptide antibodies and rheumatoid factor in early rheumatoid arthritis. Clin Exp Rheumatol. 17:689-97. . 117.Zeng X, Ai M, Tian X, Gan X, Shi Y, Song Q, Tang F. Diagnostic value of anticyclic citrullinated Peptide antibody in patients with rheumatoid arthritis. J Rheumatol. 30:1451-5. 2003. 118.Forslind K, Ahlmen M, Eberhardt K, Hafstrom I, Svensson B,. Prediction of radiological outcome in early rheumatoid arthritis in clinical practice: role of antibodies to citrullinated peptides (anti-CCP). Ann Rheum Dis. 63:1090-5. 2004. 119.Whicher JT, Dieppe PA. Acute phase proteins. Clin Immunol Allergy. 5:425-46. 1985. 120.Mallya RK, de Beer FC, Berry H, Hamilton ED, Mace BE, Pepys MB. Correlation of clinical parameters of disease activity in rheumatoid arthritis with serum concentration of C-reactive protein and erythrocyte sedimentation rate. J Rheumatol. 9:224-8. . 121.Otterness IG. The value of C-reactive protein measurement in rheumatoid arthritis. Semin Arthritis Rheum. 24:91-104. 1994. 122.Miotla J, Maciewicz R, Kendrew J, Feldmann M, Paleolog E. Treatment with soluble

95

VEGF receptor reduces disease severity in murine collagen-induced arthritis. Lab Invest. 80:1195-205. 2000. 123.Paleolog EM, Young S, Stark AC, McCloskey RV, Feldmann M, Maini RN. Modulation of angiogenic vascular endothelial growth factor by tumor necrosis factor alpha and interleukin-1 in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 41:1258-65. 1998. 124.Horslev-Petersen K, Bentsen KD, Junker P, Lorenzen I. Serum amino-terminal type III procollagen peptide in rheumatoid arthritis. Relationship to disease activity, treatment, and development of joint erosions. Arthritis Rheum. 29:592-9. 1986. 125.Horslev-Petersen K, Bentsen KD, Engstrom-Laurent A, Junker P, Halberg P, Lorenzen I. Serum amino terminal type III procollagen peptide and serum hyaluronan in rheumatoid arthritis: relation to clinical and serological parameters of inflammation during 8 and 24 months treatment with levamisole, penicillamine, or azathioprine. Ann Rheum Dis. 47:116-26. 1988. 126.Gressner AM, Neu HH. N-terminal procollagen peptide and beta 2-microglobulin in synovial fluids from inflammatory and non-inflammatory joint diseases. Clin Chim Acta. 141:241-5. 1984. 127.Horslev-Petersen K, Saxne T, Haar D, Thomsen BS, Bentsen KD, Junker P, Lorenzen I. The aminoterminal-type-III procollagen peptide and proteoglycans in serum and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis or reactive arthritis. Rheumatol Int. 8:1-9. 1988. 128.Hakala M, Risteli L, Manelius J, Nieminen P, Risteli J. Increased type I collagen degradation correlates with disease severity in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 52:866-9. 1993. 129.Kotaniemi A, Isomaki H, Hakala M, Risteli L, Risteli J. Increased type I collagen degradation in early rheumatoid arthritis. J Rheumatol. 21:1593-6. 1994. 130.Paimela L, Leirisalo-Repo M, Risteli L, Hakala M, Helve T, Risteli J. Type I collagen degradation product in serum of patients with early rheumatoid arthritis: relationship to disease activity and radiological progression in a 3-year follow-up. Br J Rheumatol. 33:1012-6. 1994. 131.Glant TT, Mikecz K, Roughley PJ, Buzas E, Poole AR. Age-related changes in protein-related epitopes of human articular-cartilage proteoglycans. Biochem J.

96

236:71-5. 1986. 132.Poole AR, Ionescu M, Swan A, Dieppe PA. Changes in cartilage metabolism in arthritis are reflected by altered serum and synovial fluid levels of the cartilage proteoglycan aggrecan. Implications for pathogenesis. J Clin Invest. 94:25-33. 1994. 133.Mansson B, Carey D, Alini M, Ionescu M, Rosenberg LC, Poole AR, Heinegard D, Saxne T. Cartilage and bone metabolism in rheumatoid arthritis. Differences between rapid and slow progression of disease identified by serum markers of cartilage metabolism. J Clin Invest. 95:1071-7. 1995. 134.Haraoui B, Thonar EJ, Martel-Pelletier J, Goulet JR, Raynauld JP, Ouellet M, Pelletier JP. Serum keratan sulfate levels in rheumatoid arthritis: inverse correlation with radiographic staging. J Rheumatol. 21:813-7. 1994. 135.Manicourt DH, Triki R, Fukuda K, Devogelaer JP, Nagant de Deuxchaisnes C, Thonar EJ. Levels of circulating tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 in patients with rheumatoid arthritis. Relationship to serum levels of hyaluronan and antigenic keratan sulfate. Arthritis Rheum. 36:490-9. 1993. 136.Nyirkos P, Golds EE. Human synovial cells secrete a 39 kDa protein similar to a bovine mammary protein expressed during the non-lactating period. Biochem J. 269:265-8. 1990. 137.Hakala BE, White C, Recklies AD. Human cartilage gp-39, a major secretory product of articular chondrocytes and synovial cells, is a mammalian member of a chitinase protein family. J Biol Chem. 268:25803-10. 1993. 138.Kirkpatrick RB, Emery JG, Connor JR, Dodds R, Lysko PG, Rosenberg M. Induction and expression of human cartilage glycoprotein 39 in rheumatoid inflammatory and peripheral blood monocyte-derived macrophages. Exp Cell Res. 237:46-54. 1997. 139.Johansen JS, Jensen HS, Price PA. A new biochemical marker for joint injury. Analysis of YKL-40 in serum and synovial fluid. Br J Rheumatol. 32:949-55. 1993. 140.Vos K, Steenbakkers P, Miltenburg AM, Bos E, van Den Heuvel MW, van Hogezand RA, de Vries RR, Breedveld FC, Boots AM. Raised human cartilage glycoprotein-39 plasma levels in patients with rheumatoid arthritis and other inflammatory conditions. Ann Rheum Dis. 59:544-8. 2000.

97

141.Forslind K, Eberhardt K, Jonsson A, Saxne T. Increased serum concentrations of cartilage oligomeric matrix protein. A prognostic marker in early rheumatoid arthritis. Br J Rheumatol. 31:593-8. 1992. 142.Laurent TC, Fraser JR, Laurent UB, Engstrom-Laurent A. Hyaluronan in inflammatory joint disease. Acta Orthop Scand Suppl. 266:116-20. 1995. 143.Paimela L, Heiskanen A, Kurki P, Helve T, Leirisalo-Repo M. Serum hyaluronate level as a predictor of radiologic progression in early rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 34:815-21. 1991. 144.Somerville RP, Oblander SA, Apte SS. Matrix metalloproteinases: old dogs with new tricks. Genome Biol. 4:216. 2003. 145.Nagase H. Matrix Metalloproteinases in Zinc Metalloproteases. in Health and Disease. (Hooper NM ed.) Taylor and Francis. 1996. 146.Woessner JF. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in connective tissue remodeling. FASEB J. 5:2145-54. 1991. 147.Opdenakker G, Van Damme J. Cytokines and proteases in invasive processes: molecular similarities between inflammation and cancer. Cytokine. 4:251-8. 1992. 148.Murphy G, Knauper V, Atkinson S, Butler G, English W, Hutton M, Stracke J, Clark I. Matrix metalloproteinases in arthritic disease. Arthritis Res. 4 Suppl 3:S39-49. 2002. 149.Mort JS, Buttle DJ. The use of cleavage site specific antibodies to delineate protein processing and breakdown pathways. Mol Pathol. 52:11-8. 1999. 150.Cawston TE, Billington C. Metalloproteinases in the rheumatic diseases. J Pathol. 180:115-7. 1996. 151.Tetlow LC, Woolley DE. Comparative immunolocalization studies of collagenase 1 and collagenase 3 production in the rheumatoid lesion, and by human chondrocytes and synoviocytes in vitro. Br J Rheumatol. 37:64-70. 1998. 152.Billinghurst RC, Dahlberg L, Ionescu M, Reiner A, Bourne R, Rorabeck C, Mitchell P, Hambor J, Diekmann O, Tschesche H, Chen J, Van Wart H, Poole AR. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartilage. J Clin Invest. 99:1534-45. 1997. 153.McCachren SS. Expression of metalloproteinases and metalloproteinase inhibitor in

98

human arthritic synovium. Arthritis Rheum. 34:1085-93. 1991. 154.Ichikawa Y, Yamada C, Horiki T, Hoshina Y, Uchiyama M. Serum matrix metalloproteinase-3 and fibrin degradation product levels correlate with clinical disease activity in rheumatoid arthritis. Clin Exp Rheumatol. 16:533-40. . 155.Keyszer G, Lambiri I, Nagel R, Keysser C, Keysser M, Gromnica-Ihle E, Franz J, Burmester GR, Jung K. Circulating levels of matrix metalloproteinases MMP-3 and MMP-1, tissue inhibitor of metalloproteinases 1 (TIMP-1), and MMP-1/TIMP-1 complex in rheumatic disease. Correlation with clinical activity of rheumatoid arthritis versus other surrogate markers. J Rheumatol. 26:251-8. 1999. 156.Posthumus MD, Limburg PC, Westra J, Cats HA, Stewart RE, van Leeuwen MA, van Rijswijk MH. Serum levels of matrix metalloproteinase-3 in relation to the development of radiological damage in patients with early rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford). 38:1081-7. 1999. 157.Martel-Pelletier J, Pelletier JP. Wanted--the collagenase responsible for the destruction of the collagen network in human cartilage! Br J Rheumatol. 35:818-20. 1996. 158.Konttinen YT, Ainola M, Valleala H, Ma J, Ida H, Mandelin J, Kinne RW, Santavirta S, Sorsa T, Lopez-Otin C, Takagi M. Analysis of 16 different matrix metalloproteinases (MMP-1 to MMP-20) in the synovial membrane: different profiles in trauma and rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 58:691-7. 1999. 159.Yoshihara Y, Obata K, Fujimoto N, Yamashita K, Hayakawa T, Shimmei M. Increased levels of stromelysin-1 and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 in sera from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 38:969-75. 1995. 160.Ishiguro N, Ito T, Obata K, Fujimoto N, Iwata H. Determination of stromelysin-1, 72 and 92 kDa type IV collagenase, tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1), and TIMP-2 in synovial fluid and serum from patients with rheumatoid arthritis. J Rheumatol. 23:1599-604. 1996. 161.McKie N, Edwards T, Dallas DJ, Houghton A, Stringer B, Graham R, Russell G, Croucher PI. Expression of members of a novel membrane linked metalloproteinase family (ADAM) in human articular chondrocytes. Biochem Biophys Res Commun. 230:335-9. 1997.

99

162.Abbaszade I, Liu RQ, Yang F, Rosenfeld SA, Ross OH, Link JR, Ellis DM, Tortorella MD, Pratta MA, Hollis JM, Wynn R, Duke JL, George HJ, Hillman MC, Murphy K, Wiswall BH, Copeland RA, Decicco CP, Bruckner R, Nagase H, Itoh Y, Newton RC, Magolda RL, Trzask. Cloning and characterization of ADAMTS11, an aggrecanase from the ADAMTS family. J Biol Chem. 274:23443-50. 1999. 163.Tortorella MD, Burn TC, Pratta MA, Abbaszade I, Hollis JM, Liu R, Rosenfeld SA, Copeland RA, Decicco CP, Wynn R, Rockwell A, Yang F, Duke JL, Solomon K, George H, Bruckner R, Nagase H, Itoh Y, Ellis DM, Ross H, Wiswall BH, Murphy K, Hillman MC, Hollis GF. Purification and cloning of aggrecanase-1: a member of the ADAMTS family of proteins. Science. 284:1664-6. 1999. 164.Kuno K, Okada Y, Kawashima H, Nakamura H, Miyasaka M, Ohno H, Matsushima K. ADAMTS-1 cleaves a cartilage proteoglycan, aggrecan. FEBS Lett. 478:241-5. 2000. 165.Vankemmelbeke MN, Holen I, Wilson AG, Ilic MZ, Handley CJ, Kelner GS, Clark M, Liu C, Maki RA, Burnett D, Buttle DJ. Expression and activity of ADAMTS-5 in synovium. Eur J Biochem. 268:1259-68. 2001. 166.Kashiwagi M, Tortorella M, Nagase H, Brew K. TIMP-3 is a potent inhibitor of aggrecanase 1 (ADAM-TS4) and aggrecanase 2 (ADAM-TS5). J Biol Chem. 276:12501-4. 2001. 167.Keyszer G, Redlich A, Haupl T, Zacher J, Sparmann M, Engethum U, Gay S, Burmester GR. Differential expression of cathepsins B and L compared with matrix metalloproteinases and their respective inhibitors in rheumatoid arthritis and osteoarthritis: a parallel investigation by semiquantitative reverse transcriptasepolymerase chain reaction Arthritis Rheum. 41:1378-87. 1998. 168.Creemers LB, Hoeben KA, Jansen DC, Buttle DJ, Beertsen W, Everts V. Participation of intracellular cysteine proteinases, in particular cathepsin B, in degradation of collagen in periosteal tissue explants. Matrix Biol. 16:575-84. 1998. 169.Kafienah W, Bromme D, Buttle DJ, Croucher LJ, Hollander AP. Human cathepsin K cleaves native type I and II collagens at the N-terminal end of the triple helix. Biochem J. 331 ( Pt 3):727-32. 1998. 170.Saftig P, Hunziker E, Everts V, Jones S, Boyde A, Wehmeyer O, Suter A, von Figura

100

K. Functions of cathepsin K in bone resorption. Lessons from cathepsin K deficient mice. Adv Exp Med Biol. 477:293-303. 2000. 171.Bryson H, Bunning RA, Feltell R, Kam CM, Kerrigan J, Powers JC, Buttle DJ. A serine proteinase inactivator inhibits chondrocyte-mediated cartilage proteoglycan breakdown occurring in response to proinflammatory cytokines. Arch Biochem Biophys. 355:15-25. 1998. 172.van der Laan WH, Pap T, Ronday HK, Grimbergen JM, Huisman LG, TeKoppele JM, Breedveld FC, Gay RE, Gay S, Huizinga TW, Verheijen JH, Quax PH. Cartilage degradation and invasion by rheumatoid synovial fibroblasts is inhibited by gene transfer of a cell surface-targeted plasmin inhibitor. Arthritis Rheum. 43:1710-8. 2000. 173.Winchester BG. Lysosomal metabolism of glycoconjugates. Subcell Biochem. 27:191-238. 1996. 174.Kresse H, Glossl J. Glycosaminoglycan degradation. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 60:217-311. 1987. 175.Pratta MA, Tortorella MD, Arner EC. Age-related changes in aggrecan glycosylation affect cleavage by aggrecanase. J Biol Chem. 275:39096-102. 2000. 176.Volkova ZI, Astakhova TA, Trofimova TM, Mul diiarov PIa. [Glycosaminoglycans and beta-glucuronidase in peripheral blood cells and biological fluids of patients with rheumatoid arthritis] Vopr Med Khim. 34:53-9. 1988. 177.Gieselmann V. Lysosomal storage diseases. Biochim Biophys Acta. 1270:103-36. 1995. 178.Engstrom-Laurent A, Feltelius N, Hallgren R, Wasteson A. Raised serum hyaluronate levels in scleroderma: an effect of growth factor induced activation of connective tissue cells? Ann Rheum Dis. 44:614-20. 1985. 179.Engstrom-Laurent A, Hallgren R. Circulating hyaluronate in rheumatoid arthritis: relationship to inflammatory activity and the effect of corticosteroid therapy. Ann Rheum Dis. 44:83-8. 1985. 180.Inerot S, Heinegard D, Audell L, Olsson SE. Articular-cartilage proteoglycans in aging and osteoarthritis. Biochem J. 169:143-56. 1978. 181.Hardingham T, Bayliss M. Proteoglycans of articular cartilage: changes in aging

101

and in joint disease. Semin Arthritis Rheum. 20:12-33. 1990. 182.Cs-Szabo G, Roughley PJ, Plaas AH, Glant TT. Large and small proteoglycans of osteoarthritic and rheumatoid articular cartilage. Arthritis Rheum. 38:660-8. 1995. 183.Bollet AJ. Connective tissue polysaccharide metabolism and the pathogenesis of osteoarthritis. Adv Intern Med. 13:33-60. 1967. 184.MATTHEWS BF. Composition of articular cartilage in osteoarthritis; changes in collagen/chondroitin-sulphate ratio. Br Med J. 4837:660-1. 1953. 185.Mankin HJ, Lippiello L. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. J Bone Joint Surg Am. 52:424-34. 1970. 186.Capila I, Linhardt RJ. Heparin-protein interactions. Angew Chem Int Ed Engl. 41:391-412. 2002. 187.Kuschert GS, Coulin F, Power CA, Proudfoot AE, Hubbard RE, Hoogewerf AJ, Wells TN. Glycosaminoglycans interact selectively with chemokines and modulate receptor binding and cellular responses. Biochemistry. 38:12959-68. 1999. 188.Fujii K, Tanaka Y, Hubscher S, Saito K, Ota T, Eto S. Cross-linking of CD44 on rheumatoid synovial cells up-regulates VCAM-1. J Immunol. 162:2391-8. 1999. 189.Tanaka Y, Fujii K, Hubscher S, Aso M, Takazawa A, Saito K, Ota T, Eto S. Heparan sulfate proteoglycan on endothelium efficiently induces integrin-mediated T cell adhesion by immobilizing chemokines in patients with rheumatoid synovitis. Arthritis Rheum. 41:1365-77. 1998. 190.Chakrabarti B, Park JW. Glycosaminoglycans: structure and interaction. CRC Crit Rev Biochem. 8:225-313. 1980. 191.Varki A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3:97-130. 1993. 192.Paulson JC. Glycoproteins: what are the sugar chains for? Trends Biochem Sci. 14:272-6. 1989. 193.Henrissat B, Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem J. 316 ( Pt 2):695-6. 1996. 194.Faure D. The family-3 glycoside hydrolases: from housekeeping functions to hostmicrobe interactions. Appl Environ Microbiol. 68:1485-90. 2002. 195.Elford PR, Cooper PH. Induction of neutrophil-mediated cartilage degradation by

102

interleukin-8. Arthritis Rheum. 34:325-32. 1991. 196.Astakhova TA, Volkova ZI, Trofimova TM, Mul diiarov PIa. [Clinical value of determining beta-glucuronidase and glycosaminoglycans in blood cells and biological fluids in patients with rheumatoid arthritis] Ter Arkh. 59:62-7. 1987. 197.Astakhova TA, Volkova ZI, Trofimova TM, Mul diiarov PIa. [Importance of betaglucuronidase activity and glycosaminoglycan concentration in synovial fluid in patients with rheumatoid arthritis in estimating local inflammation] Ter Arkh. 61:557. 1989. 198.Falkenbach A, Unkelbach U, Gottschalk R, Kaltwasser JP. [Serum level of betaglucuronidase as potential indicator of disease activity in rheumatoid arthritis (RA) and systemic lupus erythematosus (SLE)] Med Klin (Munich). 86:465-8. 1991. 199.Fawthrop F, Hornby J, Swan A, Hutton C, Doherty M, Dieppe P. A comparison of normal and pathological synovial fluid. Br J Rheumatol. 24:61-9. 1985. 200.Shikhman AR, Brinson DC, Lotz M. Profile of glycosaminoglycan-degrading glycosidases and glycoside sulfatases secreted by human articular chondrocytes in homeostasis and inflammation. Arthritis Rheum. 43:1307-14. 2000. 201.Berenbaum F, Le Gars L, Toussirot E, Sanon A, Bories C, Kaplan G, Loiseau PM. Marked elevation of serum N-acetyl-beta-D-hexosaminidase activity in rheumatoid rheumatoid arthritis. Clin Exp Rheumatol. 18:63-6. . 202.Clarris BJ, Fraser JR, Ash P, Leizer T, Hamilton JA. Interleukin-1 beta and interleukin-1 alpha stimulate the N-acetyl-beta-glucosaminidase activity of human synovial cells. Rheumatol Int. 7:271-5. 1987. 203.Emiliani C, Martino S, Orlacchio A, Vezza R, Nenci GG, Gresele P. Platelet glycohydrolase activities: characterization and release. Cell Biochem Funct. 13:31-9. 1995. 204.Kar NC, Pearson CM. Elevated levels of serum -acetylglucosaminidase in some patients with rheumatoid arthritis. Proc Soc Exp Biol Med. 142:398-400. 1973. 205.Koyama I, Sato M, Sakai H, Nagata A, Miura M, Sakagishi Y, Komoda T. Carbohydrate-mediated recognition of a circulating placental alkaline phosphataseimmunoglobulin M complex. Clin Chim Acta. 230:9-19. 1994. 206.Malaise MG, Franchimont P, Houssier C, Closset J, Hennen G, Mahieu PR. In vitro

103

studies on the Fc-receptor function of mononuclear phagocytes in rheumatoid arthritis: relation between the Fc-receptor blockade and the concanavalin A-binding capacity of autologous immunoglobulin G. J Clin Immunol. 6:442-56. 1986. 207.Stanescu V. The small proteoglycans of cartilage matrix. Semin Arthritis Rheum. 20:51-64. 1990. 208.Kresse H, Hausser H, Schonherr E. Small proteoglycans. Experientia. 49:403-16. 1993. 209.Wright V, Moll JMH. Seronegative polyarthritis. Elsevier North Holland. 1976. 210.Moll JM, Wright V. New York clinical criteria for ankylosing spondylitis. A statistical evaluation. Ann Rheum Dis. 32:354-63. 1973. 211.Lennarz WJ, Hart GW. Guide to techniques in glycobiology. in Methods in enzymology. (Abelson JN, Simon MI ed.) Academic Press. 1994. 212.Insightful CorporationS-PLUS version 7.0 for Windows (computer software).19882005 213.Arokoski J, Kiviranta I, Jurvelin J, Tammi M, Helminen HJ. Long-distance running causes site-dependent decrease of cartilage glycosaminoglycan content in the knee joints of beagle dogs. Arthritis Rheum. 36:1451-9. 1993. 214.Thonar EJ, Glant T. Serum keratan sulfate--a marker of predisposition to polyarticular osteoarthritis. Clin Biochem. 25:175-80. 1992. 215.Lettesjo H, Nordstrom E, Strom H, Moller E. Autoantibody patterns in synovial fluids from patients with rheumatoid arthritis or other arthritic lesions. Scand J Immunol. 48:293-9. 1998. 216.Karopoulos C, Rowley MJ, Handley CJ. Intrasynovial levels of sulphated glycosaminoglycans and autoantibodies to type II collagen in rheumatoid arthritis: a correlative analysis. Rheumatol Int. 13:15-20. 1993. 217.SPSS Inc. SPSS Base 10.0 for Windows User's Guide. SPSS Inc. 1999. 218.Hsu J. Multiple Comparisons: Theory and Methods. Chapman & Hall. . 219.Savige JA, Davies DJ, Gatenby PA. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA): their detection and significance: report from workshops. Pathology. 26:186-93. 1994. 220.McGonagle D, Conaghan PG, Emery P. Psoriatic arthritis: a unified concept twenty years on. Arthritis Rheum. 42:1080-6. 1999.

104

221.Kitano T, Ohashi H, Kadoya Y, Kobayashi A, Yutani Y, Yamano Y. Measurements of zeta potentials of particulate biomaterials in protein-rich hyaluronan solution with changes in pH and protein constituents. J Biomed Mater Res. 42:453-7. 1998. 222.Kofoed JA, Barcelo AC. The synovial fluid hyaluronic acid in rheumatoid arthritis. Experientia. 34:1545-6. 1978. 223.Sztrolovics R, Recklies AD, Roughley PJ, Mort JS. Hyaluronate degradation as an alternative mechanism for proteoglycan release from cartilage during interleukin1beta-stimulated catabolism. Biochem J. 362:473-9. 2002. 224.Tiku ML, Yan YP, Chen KY. Hydroxyl radical formation in chondrocytes and cartilage as detected by electron paramagnetic resonance spectroscopy using spin trapping reagents. Free Radic Res. 29:177-87. 1998. 225.Weissman B, Cashman DC, Santiago R. Concerted action of beta-glucuronidase and beta-acetylglucosaminidase on hyaluronodextrins. Connect Tissue Res. 3:7-15. 1975. 226.Buzas EI, Brennan FR, Mikecz K, Garzo M, Negroiu G, Hollo K, Cs-Szabo G, Pintye E, Glant TT. A proteoglycan (aggrecan)-specific T cell hybridoma induces arthritis in BALB/c mice. J Immunol. 155:2679-87. 1995. 227.DeGroot J, Verzijl N, Wenting-Van Wijk MJ, Bank RA, Lafeber FP, Bijlsma JW, TeKoppele JM. Age-related decrease in susceptibility of human articular cartilage to matrix metalloproteinase-mediated degradation: the role of advanced glycation end products. Arthritis Rheum. 44:2562-71. 2001. 228.Little CB, Hughes CE, Curtis CL, Janusz MJ, Bohne R, Wang-Weigand S, Taiwo YO, Mitchell PG, Otterness IG, Flannery CR, Caterson B. Matrix metalloproteinases are involved in C-terminal and interglobular domain processing of cartilage aggrecan in late stage cartilage degradation. Matrix Biol. 21:271-88. 2002. 229.Dong DL, Hart GW. Purification and characterization of an O-GlcNAc selective Nacetyl-beta-D-glucosaminidase from rat spleen cytosol. J Biol Chem. 269:19321-30. 1994. 230.Wells L, Gao Y, Mahoney JA, Vosseller K, Chen C, Rosen A, Hart GW. Dynamic O-glycosylation of nuclear and cytosolic proteins: further characterization of the nucleocytoplasmic beta-N-acetylglucosaminidase, O-GlcNAcase. J Biol Chem. 277:1755-61. 2002.

105

231.Cawston T. Matrix metalloproteinases and TIMPs: properties and implications for the rheumatic diseases. Mol Med Today. 4:130-7. 1998. 232.Chang JC, Wysocki A, Tchou-Wong KM, Moskowitz N, Zhang Y, Rom WN. Effect of Mycobacterium tuberculosis and its components on macrophages and the release of matrix metalloproteinases. Thorax. 51:306-11. 1996. 233.Wize J, Sopata I, Smerdel A, Maslinski S. Ligation of selectin L and integrin CD11b/CD18 (Mac-1) induces release of gelatinase B (MMP-9) from human neutrophils. Inflamm Res. 47:325-7. 1998. 234.Fraser A, Fearon U, Reece R, Emery P, Veale DJ. Matrix metalloproteinase 9, apoptosis, and vascular morphology in early arthritis. Arthritis Rheum. 44:2024-8. 2001. 235.Borzi RM, Mazzetti I, Cattini L, Uguccioni M, Baggiolini M, Facchini A. Human chondrocytes express functional chemokine receptors and release matrix-degrading enzymes in response to C-X-C and C-C chemokines. Arthritis Rheum. 43:1734-41. 2000. 236.Shaw JO, Pinckard RN, Ferrigni KS, McManus LM, Hanahan DJ. Activation of human

neutrophils

with

1-O-hexadecyl/octadecyl-2-acetyl-sn-glycerol-3-

phosphorylcholine (platelet activating factor). J Immunol. 127:1250-5. 1981. 237.Andrews NW. Regulated secretion of conventional lysosomes. Trends Cell Biol. 10:316-21. 2000. 238.Gaston JSH. Cellular immunity in RA. in Rheumatology, (Klippel JH, Dieppe PA ed.) Mosby. 1998. 239.Krumdieck R, Hook M, Rosenberg LC, Volanakis JE. The proteoglycan decorin binds C1q and inhibits the activity of the C1 complex. J Immunol. 149:3695-701. 1992. 240.Hausser H, Groning A, Hasilik A, Schonherr E, Kresse H. Selective inactivity of TGF-beta/decorin complexes. FEBS Lett. 353:243-5. 1994. 241.Mannik M, Kapil S, Merrill CE. IgG-fibronectin complexes mimic antibodies to denatured collagen type II. Ann N Y Acad Sci. 815:467-8. 1997.

106

Saját publikációk jegyzéke A disszertáció témájához kapcsolódó közlemények 1. Ortutay Z, Polgar A, Gomor B, Geher P, Lakatos T, Glant TT, Gay RE, Gay S, Pallinger E, Farkas C, Farkas E, Tothfalusi L, Kocsis K, Falus A, Buzas EI. Synovial fluid exoglycosidases are predictors of rheumatoid arthritis and are effective in cartilage glycosaminoglycan depletion. Arthritis Rheum. 48(8):216372. 2003 2. Polgar A, Falus A, Koo E, Ujfalussy I, Sesztak M, Szuts I, Konrad K, Hodinka L, Bene E, Meszaros G, Ortutay Z, Farkas E, Paksy A, Buzas EI. Elevated levels of synovial fluid antibodies reactive with the small proteoglycans biglycan and decorin in patients with rheumatoid arthritis or other joint diseases. Rheumatology (Oxford). 42(4):522-7. 2003

A disszertáció témájához nem kapcsolódó közlemények 1. Bosze S, Hudecz F, Igaz P, Ortutay Z, Csik G, Falus A, Toth S. Interleukin-6 Nterminal peptides modulate the expression of junB protooncogene and the production of fibrinogen in HepG2 cells. Biol Chem. 384(3):409-21. 2003 2. Bosze S, Igaz P, Szabo R, Tobisch Z, Toth S, Falus A, Hudecz F. Interleukin-6 peptides modulate the production of acute phase proteins and the expression of junb protooncogen on HepG2 cells. In: Peptides 1998. Proc. 25th European Peptide Symposium, (Ed.: Bajusz, S., Hudecz, F. ) Akadémiai Kiadó, pp. 568569. 1999 3. Bosze S, Igaz P, Szabo R, Tobisch Z, Toth S, Falus A, Hudecz F. Interleukin-6 peptides modulate the production of acute phase proteins and the expression of junb protooncogen on HepG2 cells. Journal of Peptide Science 4, 85, 1998 4. Bosze S, Igaz P, Takacs K, Szabo R, Tobisch Z, Toth S, Falus A, Hudecz F. Modulation of junB mRNA expression and of acute phase response of HepG2 cells by WSXWS motif related peptides and monoclonal antibodies. The Immunologist S1, 516, 1998.

107

108

Köszönetnyilvánítás Szeretnék   köszönetet   mondani   témavezetőmnek   Dr.   Buzás   Edit   egyetemi  docensnek, az orvostudományok kandidátusának és férjemnek Dr. Ortutay Csabának,  akik támogattak és buzdítottak, hogy ez a munka elkészüljön. Köszönöm Prof. Dr. Falus  András tanszékvezető egyetemi tanárnak, hogy lehetővé tette a PhD programban való  részvételemet. A vizsgált minták az  Országos Reumatológiai és Fizioterápiás Intézet betegeitől  származtak,   köszönöm   dr.   Polgár   Annának   a   SF­   és   szérummintákat,   valamint   dr.  Lakatos   Tamás   professzornak   a   porcszövet   mintákat.   A   sportsérülést   szenvedett  betegekből   származó   mintákért   dr.   Farkas   Csabának   mondok   köszönetet.   A   minták  feldolgozásában Farkasné Nagy Krisztina, Ördögh Judit és Mazán Mercédesz segítettek.  Köszönöm dr. Böhm Ute, dr. Nagy Erzsébet és dr. Tichy Mária főorvosoknak (Budai  Irgalmasrendi Kórház) a rutin laboratóriumi vizsgálatok elvégzését. A porcszeletek képének digitalizálásában dr. Kocsis Katalin (Humánmorfológiai  Intézet) segítségét köszönöm. Az áramlási citometriás mérésekben Dr. Pállinger Éva  tudományos munkatársnak mondok köszönetet. Az   eredmények   statisztikai   feldolgozásában   köszönöm   Dr.   Tóthfalusi   László  egyetemi   docens   és   dr.   Paksy   András   szaktanácsadó   (Semmelweis   Egyetem  Egészségtudományi Kar Orvosi Népegészségügyi Intézet) segítségét.

109