Regulace translace REGULACE TRANSLACE BÍLKOVINY A JEJICH POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE. Bílkoviny - aminokyseliny. 1. Translační aparát. 2

Regulace translace

Bílkoviny - aminokyseliny

1. Translační aparát 2.

Translace

3.

Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace

4.

Lokalizace bílkovin v buňce a jejich degradace

5.

Translace v mitochondriích a chloroplastech

Aminokyseliny

Základní složení všech aminokyselin

REGULACE TRANSLACE BÍLKOVINY A JEJICH POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE

1

Aminokyseliny Alanin Arginin Glutamová kyselina Glutation Glycin Hydroxyprolin Leucin Methionin Phenylalanin Prolin Serin Tryptofan Tyrosin Valin

druhá nejjednoduší, nejčastěji zastoupenou (hydrofobní) často v aktivních místech bílkoviny (basická, hydrofilní) negativně nabitá, na povrchu bílkoviny (kyselá, hydrofilní) malý peptid, podíl na likvidaci volných radikálů nejdnodušší aminokyselina součást stěny buněk tvoří kostru proteinu (hydrofobní) esenciální, iniciace proteosyntézy, nejméně zastoupenou aminokyselinou nejčastější aromatickou aminokyselinou (vedlmi hydrofobní) hromadí se za stresu v aktivních místech pro fosforylace velmi málo zastoupena součást stěnových bílkovin drží bílkoviny pohromadě

Bílkoviny, typy aminokyselin – hydrofilní a ostatní

: Esenciální aminokyseliny: histidin, isoleucin, leucin, lysin, methioneni (cystein), phenylalanin (tyrosin), treonin, tryptofan

Bílkoviny, vytváření polymerních řetězcú

Bílkoviny, typy aminokyselin – hydrofobní

2

Primární struktura bílkovin – peptidové vazby mezi aminokyselinami

Bílkoviny – primární struktura Peptidové vazby: mezi 2 aminokyselinami – 20-30 aminokyselin = peptid vetší počty aminokyselin uspořádaných do vyšších struktur = polypeptid N- a C- terminílní konce jsou ve fyziologickém pH ionizovány R=reaktivní místa = navazování vedlejších řetězců

3. Bílkoviny - primární struktura Peptidové, pevné kovalentní vazby = řetězení aminokyselin určené geneticky

3. Bílkoviny - sekundární struktura

Sekvence aminokyselin – samouspořádávání nascentní bílkoviny

Voda je polárním roztokem

3

2. translace – elongace

Bílkoviny, typy vazeb v polymérech Vazby mezi aminokyselinami na základě fyzikálně chemických interakcí

Syntéza bílkovin na polysomech

Aminokyseliny

¾ ¾ ¾ ¾

Aminokyseliny = velmi malé biomolekuly, mw. 135 daltonů Jsou stavebními kameny bílkovin Kostra aminokyselin určuje primární sekvenci bílkovin Vedlejší řetězce určují biochemické vlastnosti bílkovin Polární řetězce směřují na povrch bílkoviny a mohou reagovat s vodným prostředím buňky

Bílkoviny

20-30 aminokyselin = peptid vetší počty aminokyselin uspořádaných do vyšších struktur = polypeptid

Bílkoviny = proteiny (z řeckého slova proto = primární důležitost) První popis bílkovin: Berzelius 1838 První důkaz bílkoviny ve funkci enzymu: urea Sumner 1926 První bílkovinná sekvenace: insulin Sanger 1958 První strukturní studie bílkovin: hemoglobin, myoglobin Perutz a Kendrew 1958

4

Bílkoviny

Bílkoviny – jejich lokalizace: Zviditelnění GFP

Bílkoviny, jejich velikost

Cytochrom - bílkovina není statickou strukturou

5

Bílkoviny, typy vazeb v polymérech

Bílkoviny, sekundární uspořádávání Alfa + beta šroubovice, beta list sekundární uspořádání dáno sekvencí aminokyselin, tvorba vodíkových můstků

Beta list

Vytváření disulfidických vazeb mezi 2 cysteiny

Bílkoviny, typy vazeb v polymérech

Bílkoviny, sekundární uspořádávání

kovalentní vazba: jednotlivé aminokyseliny mezi sebou do primární struktury bílkovín

nekovalentní vazba sekundární uspořádávání bílkovin, vazba reversibilní

Reversibilita reakcí: závisí na rychlostních konstantách reakcí poměr konstant=relativní míra produktů, směr reakce

6

Bílkoviny, sekundární uspořádávání

Bílkoviny, terciární a quarterní uspořádávání

2 dvoušroubovice spojené smyčkou Motiv typický pro vápník a DNA vazebné bílkoviny

Bílkoviny, terciární a quarterní uspořádávání

1 alfa helix spojen s beta šroubovicí

2 alfa šroubovice ovinuté kolem sebe

Motiv typický pro DNA vazebné bílkoviny

Motiv typický pro transkripční faktory

Bílkoviny, terciální a quarterní struktura

Molekula hemaaglutininu Bílkovina složena ze 3 domén, jako membránová bílkovina Nglykosylována kyselinou sialavou

7

Bílkoviny, funkční uspořádání

Bílkoviny, funkční proměnlivost

a)

Myosin je dimer, tvořený 2 identickými těžkými řetězy (bílé) a 4 lehkými řetězy (zelené a modré) b) trojrozměrný model „hlavové domény“

Calmodulin je bílkovina se 4 šroubovicemi (EF1 – EF4) a v každé z nich je Ca2+ -vazebné místo Při zvýšení koncentrace Ca2+ nad 5 x 10-7 M, se navazuje Ca 2+ na Calmodulin, mění jeho konformaci a Calmodulin se stává funkční bílkovinou ve fosforylaci

Bílkoviny, jejich pohyb

Bílkoviny, funkční proměnlivost Různé podoby struktury Ras, guanin nukleotid-vazebné bílkoviny (bílkovina v inanktivní podobe, s navázaním GDP ( modrá) a)Uhlíková kostra bílkoviny b) Lokalizace všech atomů c) Beta listy (azurová) alfa šroubovive (červená) d) Povrch bílkoviny ve vodném prostředí, pozitivně nabité částice (šedá), negativně nabité (červená)

Model spojující hydrolýzu ATP s pohybem myosinu podél aktinového vlákna

8

Bílkoviny, funkční proměnlivost

Uspořádávání nascentních bílkovin

Model katalytické podjednotky kinázy A v uzavřené funkční konformaci „glycin rich“ sekvence „uloví“ ATP ve štěrbině mezi doménami

(b) Schéma otevřené a zavřené konformace v nepřítomnosti substrátu je otevřená, po vazbě substrátu se uzavírá, konformační změny bílkoviny vyvolané vazbou na substrát

3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace

Cesta od nascentní podoby bílkoviny k správně lokalizované a plně funkční bílkovině Nascentní protein – endoplasmatické retikulum ¾ ¾ ¾ ¾

prostorové uspořádávání postranslační modifikace oligomerizace třídění – translokace – lokalizace


Proteiny endoplasmatického retikula obsahují chaperony: ¾ ¾ ¾ ¾

zvyšují rychlost s jakou proteiny získávají konečnou podobu udržují protein v kompetentním stavu zabraňují nežádoucím interakcím stabilizují proteiny

9


Chaperony:

Chaperony a chaperoniny GroEL: komplex 14 identických 60kDa podjednotek GroES: komplex 7 identických 10 kDa podjednotek „tight“ = -ATP+ADP = uzavřená struktura s navázanou bílkovinou „relax“ = +ATP=uvolnění bílkoviny

Skupina I – HsP70 kDA – blokování nežádoucích interakcí mezi aminokyselinami bílkovinného řetězce

Skupina II – HsP60 kDa – nezbytná doprovodná součást putování a translokace bílkoviny na místo místo určení Chaperoniny: GroEL + GroES: uspořádávání bílkoviny odstraňování špatně uspořádané bílkoviny

Nascentní bílkovina Ko-translační modifikace bílkovin

Získání translokační kompetence kompetence udělena: ¾ ko-translační N-glykosylací

GroES/GroEL systém

¾ skládáním polypeptidu ¾ tvorbou disulfidických vazeb ¾ vytvářením oligomerů ¾ odstraněním signální sekvence

Získání funkčnosti po translokaci

10



modifikace bílkovin ko-translační nebo post-translační adice nebo delece ¾ ¾ ¾ ¾

stabilizují strukturu regulují enzymatické aktivity modifikují strukturu a tím i schopnost translokace slouží pro transport a lokalizaci proteinu v buňce ( pozor na možnost nežádoucích modifikací rekombinantních proteinů v heterologní buňce)

¾ ¾

nelze je odvodit z DNA sekvence modifikace typu deaminace, acetylace, fosforylace, glykosylace a oxidace mění molekulovou hmotnost proteinu a jsou nebo detekovatelné na elektroforéze (srovnáním s nascentním

de-modifikovaným proteinem)



N- a C- terminální modifikace = acylace, methylace, amidace Acylace (acetyl-, formyl-, pyroglutamyl-, myristyl-) ochrana proti aminopeptidázám ¾ Acetylace: Ser, Ala, Met na N-konci charakterizuje většinu rozpustných proteinů ¾ Formylace: Met, typická pro prokaryota ¾ Myristylace: modifikace N-terminálního glycinu nezbytnou součástí funkčnosti většiny signálních proteinů Nejčastější příčinou „zablokování“ N-konce při charakterizaci proteinů N-terminální mikrosekvenací (postupným odbouráváním jednotlivých AMI z N- konce degradací podle Edmana, kdy je třeba volit metodu hmotnostní spektrometrie)

11


3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace Glykosylace

N- a C- terminální modifikace = methylace, amidace Methylace ¾ charakteristické pro ribosomální proteiny ¾ metylovány jsou alfa-amino skupiny ala, met, lys ¾ různé metyltransferasy pro jednotlivé bílkoviny ¾ často metylace omezeny jen na část proteinové molekuly (u histonů, u DNA-vazebných bílkovin) Amidace ¾ modifikace AMI na C-terminálním konci

glykoprotein = polypeptid + glykan N- a O-glykosylace, obě rozhodují o funkčnosti proteinů N-glykosylace – glykan připojen na amid kyseliny asparagové ¾ Ko-translačně = začíná na nascentním proteinu v ER přesně regulovaným procesem ¾ významnou regulační funkci u rostlin, jejich exprese se podílí na nástupu jednotlivých etap ontogenese ¾ N-glykoproteiny nedílnou součástí strukturálních bílkovin stěny buňky 0-glykosylace – glykan připojen na hydroxyl serinu / treoninu ¾ post-translační glykosylace až v Golgi a je reversibilní, cukerným zbytkem glukosaminem ¾ C-glykosylace, S-glykosylace – velice řídké


modifikace jednotlivých AMI v celém řetězci prenylace, adenylace, hydroxylace, oxidace, fosforylace, glykosylace Hydroxylace významná u stěnových proteinů - hydroxyproliny

N-glykosylace

Polyglykanový komplex = glykosid dolicholdifosfátu Dolicholy: polyisoprenoly s řetězcem (n=14-24), tvořené nasycenými jednotkami alfa isoprenolu

Fosforylace a glykosylace mají největší podíl na funkčnosti proteinu ¾ Fosforylace ¾ nejvíce zastoupeny O-fosforylace serinu, threoninu, tyrosinu ¾ až 1/3 cytosolických bílkovin fosforylována ¾ řada klíčových enzymů je funkčních ve formě fosforylované a neaktivní po obsazení téhož tripletu AMI O-glykosylací

12

3. Posttranslační modifikace - N-glykosylace I

3. Postranslační modifikace- N-glykosylace II

N-glykosylace – úloha dolicholu

3. Posttranslační modifikace bílkovin N-glykosylace N-glykosylace – ¾ Mnohostupňový proces: ¾ Probíhá ko-translačně a UDP-aktivované cukry přiváděny do membránového systému pomocí lipidového nosiče dolicholu ¾ Dolichol je dlouhý řetězec isoprenů = polyisoprenoid, výrazně hydrofobní a víc jak jednou smyčkou je zanořen do membrány ¾ Po navázání dolicholu do membrány pevnou vazbou je fosfátovým můstkem navázán první glykan ¾ Tato makroergická vazba umožní vazby s asparaginem nascentní bílkoviny Syntéza oligosacharidu začíná na cytosolické straně a pokračuje na straně hrubého ER

13

N-glykosylace – proměnlivost glykanové struktury

3. Postranslační modifikace - N-glykosylace

manozové typy glykoproteinů: man5-9(GlcNAc)2 také u živočišnýcu buněk a u kvasinek komplexní typy glykoproteinů odlišné u rostlin: ¾ neobsahují kyselinu sialovou ¾ vazba xylozy a fukozy na manozovou kostru jen u rostlin a bezobratlých ¾ vazba fukozy je poslední úpravou a neexistuje bez xylozy ¾ vazba xylozy může být jedinou konečnou úpravou


Asn – X – Ser/Thr: napojení oligosacharidového řetězce na nascentní bílkovinu ¾ 1. stupeň glykosylace na ER, 2. stupeň v Golgi ¾ 2. stupeň = konečná podoba: manozové nebo komplexní typy ¾ Komplexní typy: fukozy, xylozy, (ne kyselinu sialovou) Konečná podoba = anténové glykany

14


3. Postranslační modifikace – typy n-glykoproteinů stěnové bílkoviny - arabinogalaktany (AGP)

napojení glykanu má: nepřímý účinek ¾ stabilita proteinu ¾ přesnost prostorové orientace ¾ ochrana před agregací ¾ ochrana před proteolyzou ¾ transport buňkou přímý účinek ¾ syntéza biologicky aktivní molekuly = syntéza biologicky ¾ aktivních glykanových anten Výskyt: glykoproteiny buněčné stěny sekreční proteiny Funkce: rozpoznávací, receptorová, signální?

3. Postranslační modifikace - N-glykosylace výskyt a funkce stěnové bílkoviny exprese regulována vývojově, kódovány mnohočetnými genovými rodinami ¾ jejich relativní množství tkáňově a druhově specifické ¾ jsou kotranslačně N-glykosylovány, mají signální peptid ¾ 4 hlavní typy: glykoproteiny bohaté na hydroxyprolin (HRPG) glykoproteiny bohaté na prolin (PRPG)

• molekuly obsahují až 95% glykanových zbytků • druhově specifická vysoká rozdílnost v relativním obsahu i složení • repetice Pro(Hyp), Ala, Ser(Tyr) • funkce nejasná, jeví se jako nespecifická, prostředník mnoha vzájemných vazeb polymerů

3. Postranslační modifikace – typy n-glykoproteinů

Lektiny – glykoprotyeiny bez glykanu ¾ Lokalizovány ve vakuole v „lipidových raftech“ na Golgi ¾ Mají schopnost se vázat na glykany jiných glykoproteinů ¾ Komplex glykoprotein-lektin- glykolipid = důležitá složka v procesu cell-cell-recognition

15


3. Posttranslační modifikace reversilní: O-glykosylace - fosforylace

inhibitory syntézy N-glykoproteinů: inhibice napojení primárního oligosacgaridu TUNICAMYCIN (antibiotikum) DEOXYJIRIMYCIN (alkaloid)

O-glykosylace a fosforylace:

inhibice glukozidázy I a II

¾ Ser/Tre/Tyr ¾ Vratné, rychlé, funkční modifikace

CASTANOSPERMIN (alkaloid)

inhibice manozidáz SWAINSONIN

(alkaloid)

3. Posttranslační modifikace O-glykosylace - fosforylace

3. Postranslační modifikace - N-glykosylace Účinek inhibitoru tunicamycinu = postupná deglykosylace castasnosperminu = „přeglykosylováno“ 1. 2. 3. 4. 5.

nejčastěji zjištěny 2 molekuly GLcNAc navázány na Ser/Thr polypeptid mnohem stabilnější než glykan O- glykosylace je dynamickým procesem O – a N – glykosylace probíhají zřejmě na stejném místě v cis-Golgi nejznámější příklady: arabinogalaktany proteiny bohaté hydroxyprolinem RNA-polymeráza II (O-glykosylovaná --- fosforylovaná) extensiny: obsahují repetice Ser-(HYP)4 a Tyr-Lys-Tyr lektiny

16

Glykanové řetězce určují krevní skupiny

Děkuji za pozornost

Přijďte zase příště na kus řeči o translaci

17

Regulace translace REGULACE TRANSLACE BÍLKOVINY A JEJICH POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE. Bílkoviny - aminokyseliny. 1. Translační aparát. 2

Recommend Documents