Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Katedra biochemie
HLAVNÍ MARKERY EPIGENETICKÉ REGULACE A JEJICH VIZUALIZACE Bakalářská práce
Michaela Křížová
Brno 2006
Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Katedra biochemie
HLAVNÍ MARKERY EPIGENETICKÉ REGULACE A JEJICH VIZUALIZACE Bakalářská práce
Michaela Křížová
Školitel:
RNDr. Irena Koutná, Ph.D. Centrum analýzy biomedicínského obrazu Masarykova univerzita, ILBIT 3A, Kamenice 3, 625 00 Brno
Brno 2006
2
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci „Hlavní markery epigenetické regulace a jejich vizualizace“ vypracovala samostatně, pouze s pomocí uvedené literatury. Michaela Křížová
3
Poděkování Děkuji paní RNDr. Ireně Koutné, Ph.D. za vedení a poskytnutí mnoha cenných informací. Dále děkuji Davidu Potěšilovi za to, že mě naučil vyhledávat na Web of Science a za kritické připomínky k práci.
4
Obsah Obsah .....................................................................................................................................5 Seznam použitých zkratek......................................................................................................6 1.
Úvod.......................................................................................................................................9
1.1.
Struktura chromatinu............................................................................................................10
1.2.
Regulace genové exprese .....................................................................................................11
1.3.
Cíl práce ...............................................................................................................................11
2.
Markery epigenetické regulace.............................................................................................12
2.1.
Heterochromatin...................................................................................................................12
2.1.1
PEV (position effect variegation).........................................................................................13
2.1.2.
Formace heterochromatinu...................................................................................................14
2.2.
Methylace DNA ...................................................................................................................14
2.2.1.
Genový imprinting ...............................................................................................................15
2.2.2.
Kompenzace dávky ..............................................................................................................16
2.2.3.
Umlčení chromozómu X u savců .........................................................................................16
2.3.
Kovalentní modifikace histonů ............................................................................................17
2.3.1
Acetylace histonů .................................................................................................................18
2.3.2.
Methylace histonů ................................................................................................................20
2.4.
Místa aktivní transkripce ......................................................................................................23
2.5.
Jaderná topologie..................................................................................................................25
2.5.1
Chromozomální teritoria ......................................................................................................26
2.5.2
ICD kompartment.................................................................................................................27
2.5.3
Jaderná matrix ......................................................................................................................27
2.5.4
Další modely organizace chromatinu v jádře .......................................................................28
2.6.
RNA interference (RNAi) ....................................................................................................28
3.
Metody vizualizace a kvantifikace epigenetických markerů................................................30
3.1.
ChIP (chromatin imunoprecipitation)...................................................................................30
3.2.
FISH (Fluorescenční in situ hybridizace).............................................................................31
3.3.
LM-PCR a metody identifikace 5-methylcytosinů...............................................................33
3.3.1.
Metoda využívající hydrazin a LM-PCR .............................................................................34
3.3.2.
Metoda využívající hydrogensiřičitan a konvenční PCR .....................................................34
3.4.
Měření aktivity histon acetyltransferas a histon deacetylas..................................................35
3.4.1.
Měření aktivity HDACasy....................................................................................................35
3.4.2.
Měření aktivity HATasy.......................................................................................................36
3.5.
Nukleotidové analogy ..........................................................................................................36
3.6.
PRINS (primed in situ) technika ..........................................................................................37
3.7.
RNA-FISH (RNA fluorescenční in situ hybridizace)...........................................................37
3.8.
RNA-FISH (RNA fluorescenční in situ hybridizace) v živých buňkách..............................38
3.9.
TRAP-FISH (tagging and recovery of associated proteins - FISH) .....................................39
5
4.
Závěr ....................................................................................................................................40
5.
Seznam použité literatury:....................................................................................................42
Seznam použitých zkratek
A. Thaliana
Arabidopsis thaliana
AS
Angelmanův syndrom
asRNA
antisense RNA
bp
páry bazí
C. elegans
Caenorhabditis elegans
CD
chromodoména
cDNA
komplementární (complementary) DNA
CT
chromozomální teritorium
DIG
digioxigenin
Dnmt
gen kódující DNA methyltransferasu
DNMTasa
DNA methyltransferasa
dNTP
deoxyribonukleosidtrifosfát
dsRNA
dvouřetězcová RNA (double stranded RNA)
EGF
epidermální růstoý faktor (epidermal growth factor)
Fab
fragment vázající antigen (fragment antigen binding)
FISH
fluorescenční in situ hybridizace
FITC
fluorescein isothiokyanát
FRAP
fluorescence recovery after photobleaching
FRET
fluorescenční rezonanční transfer energie (Fluorescence resonance energy transfer)
GFP
green fluorescent protein
HATasa
histon acetyltransferasa
Hbb
gen pro β-globin
HDACasa
histon deacetylasa
HMG
high mobility group
HMTasa
histon methyltransferasa
hnRNP
heterogenní jaderný ribonukleoprotein (heterogenous nuclear ribonucleoprotein)
HP1
heterochromatin protein 1 6
ChIP
chromatin immunoprecipitation
ICD
inter chromatin domain
ICG
interchromatin granule clusters
Igf2
insulin-like growth factor 2
K
lysin
LCR
locus control region
LM-PCR
ligation-mediated PCR
MeCP2
methyl-CpG binding protein 2
MLS
multi-loop subkompartment
MOF
males-absent on the first
mRNA
mediátorová RNA
Pc-G
polycomb group
PCR
polymerasová řetězová reakce (polymerase chain reaction)
PEV
position effect variegation
PRINS
primed in situ
PRMT
protein arginin methyltransferasa
PTGS
post-transkripční
umlčení
genu
(post-transcriptional
gene
silencing) PWS
Prader-Willi syndrom
Rb
retinoblastoma
RISC
RNA-induced silencing complex
RNA polI (II, III) RNA polymerasa I (II, III) RNAi
RNA interference
rRNA
ribosomální RNA
RW/GL
random walk/giant loop
S.cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
S.pombe
Schizasaccharomyces pombe
SDS
sodium dodecyl sulfát
SET
Su(var), E(z) trithorax
siRNA
malé interferující RNA (small interfering RNA)
snoRNP
malý
jadérkový
ribonukleoprotein
(small
nucleolar
ribonucleoprotein) snRNP
malý jaderný ribonukleoprotein (small nuclear ribonucleoprotein)
SR protein
Serine/Arginine-residue protein
7
sRNA
sense RNA
ssDNA
jednořetězcová DNA (single stranded DNA)
su(var)
suppressor of variegation
TRAP – FISH
tagging and recovery of associated proteins – FISH
tRNA
transferová RNA
XIC
X – inaktivačním centrum
Xist
gen nacházející se v XIC
8
1. Úvod Genom eukaryotického organismu obsahuje řádově tisíce genů. V každé buňce organismu ale nejsou exprimovány (tj. vyjádřeny ve formě proteinu) všechny přítomné geny. Buňky syntetizují pouze proteiny, které slouží k jejich funkci. Například nervové buňky nepotřebují ke své činnosti produkovat hemoglobin, zatímco pro funkci červených krvinek transportovat kyslík je naprosto nezbytný. Avšak genetická výbava všech typů buněk stejného jedince je identická, z čehož vyplývá, že spolu s informacemi kódovanými v sekvenci DNA musí být předávány ještě další informace, které určují buněčný typ a soubor genů, které v něm budou exprimovány. Tato forma dědičnosti byla Conradem Waddingtonem roku 1940 nazvána epigenetickou, což doslovně znamená „navíc“ nebo „mimo“ ke konvenční genetice. Studiem epigenetické dědičnosti se zabývá vědní obor zvaný epigenetika. Aby však buňka získala svůj „typ“, musí u mnohobuněčných organismů nejprve projít procesem buněčné diferenciace. Během diferenciace v době vývoje embrya se z pluripotentních (tj. nespecializovaných) buněk vyvíjí mnoho specializovaných buněčných typů, potřebných k tvorbě tkání a struktur budoucího organismu. Diferenciace buněk je doprovázena rozsáhlými změnami v jejich morfologii i metabolismu, avšak genetická výbava zůstává ve většině případů zachována. Diferenciační proces spočívá ve změně exprese genů - aktivní mohou být vypínány a inaktivní naopak zapínány, přičemž výsledkem je diferenciovaná buňka, nesoucí „vzor“ genové exprese , který je dědičný a specifický pro daný buněčný typ. Termín epigenetická regulace lze tedy použít v souvislosti se změnami v genové expresi, které jsou dědičné, avšak nedějí se následkem změny sekvence bazí. Tyto změny jsou esenciální během diferenciace a vývoje, v dospělosti ke změnám exprese genů dochází zřídka, vlivem prostředí nebo náhodně, což může mít často za následek například vznik nádorového onemocnění. K pochopení složitých mechanismů, jimiž je genová exprese regulována, je zapotřebí nejprve dokonale poznat jednak jednotlivé pochody, které během buněčného cyklu v jádře probíhají, a jednak samotnou strukturu jádra a způsob uložení genetické informace v podobě chromatinu.
9
1.1.
Struktura chromatinu V
jádře eukaryotického organismu
je DNA sbalena do podoby
nukleoproteinového komplexu, chromatinu [Rozsypal 1998]. Kromě DNA obsahuje malé basické proteiny histony a proteiny nehistonové povahy. Základní strukturní jednotkou chromatinu je nukleozóm. Tvoří jej oktamerní histonové jádro, kolem kterého se dvěma závity obtáčí 146 bp dlouhá DNA. Jádro se skládá z tetrameru histonů (H2)2 · (H3)2 a přilehlých dimerů (H2A · H2B)2. Histon H1 (linker histon) vazbou na DNA nukleozóm uzavírá. Jednotlivé nukleozómy spojuje přibližně 55bp dlouhý úsek DNA, tzv. spojníková DNA. Nukleozomový řetězec bývá podle své tloušťky označován jako 10-nm vlákno. Co se týče exprese genů, je 10-nm vlákno represivní, protože kvůli vazbě jádra nukleozómu je DNA nepřístupná pro regulační proteiny. Kondenzací 10nm vlákna, zprostředkovanou především interakcemi histonů H1, vzniká solenoidní 30nm vlákno, které je ještě dále organizováno do tzv. struktur vyššího řádu (higher-order structure). Molekula DNA může být v konečné fázi zabalena tak, že je 50 000krát kratší, než v rozvinuté formě.
Obrázek 1: Struktura nukleohistonového vlákna, převzato z http://www.mun.ca/biology/scarr/ 4241F2_DNA.html
10
1.2.
Regulace genové exprese Struktura a míra kondenzace chromatinu hraje při regulaci genové exprese
zásadní roli. Obecně se regulační mechanismy genové exprese řadí do tří úrovní [van Driel 2003]. První zahrnuje lineární organizaci transkripčních jednotek a regulačních sekvencí. Tato úroveň je nejlépe prostudována a vztahuje se k regulaci individuálních genů. Účastní se jí regulační sekvence (cis-acting elementy) jako jsou promotory, enhancery a silencery, a na tyto sekvence se vázající regulační proteiny (trans-acting faktory), tj. transkripční faktory či RNA polymerasy. Předpokládá se, že geny s podobnými vlastnostmi transkripce se mohou v jádře shlukovat do klastrů a jejich regulace pak probíhá na úrovni klastrů nebo samostatných genů. Do druhé skupiny se řadí regulace na úrovni chromatinu. Pozorování ukázala, že v různých místech interfázního jádra se chromatin nachází v mnoha odlišných konformačních stavech, odrážejících aktivitu obsažených genů. Přechody mezi jednotlivými konformacemi chromatinu vedou ke změnám v genové expresi. Konformaci chromatinu ovlivňuje řada faktorů, z nichž k nejvýznamnějším patří methylace DNA, kovalentní modifikace histonů a činnost ATP-dependentních chromatin-remodelujících enzymů. Třetí typ regulace působí na úrovni buněčného jádra. Existuje mnoho důkazů svědčících o tom, že architektura jádra silně koreluje s funkcí genomu. Každý interfázní chromozóm v jádře zaujímá pouze omezený prostor, tzv. chromozomální teritorium. Z tohoto pohledu pak lze kromě lokální struktury nukleohistonového vlákna zkoumat organizaci chromatinu v rámci chromozomálního teritoria a topologii chromozomálních teritorií uvnitř buněčného jádra. Bylo identifikováno mnoho jaderných domén s odlišnými funkcemi a makromolekulárním složením a předpokládá se, že lokalizace genů v rámci těchto domén ovlivňuje jejich aktivitu.
1.3.
Cíl práce Je tedy zřejmé, že k regulaci genové exprese je zapotřebí souhry řady
různorodých represivních a aktivačních mechanismů, působících na více úrovních. V současné době se pozornost vědců zaměřuje především na studium epigenetické regulace zprostředkované methylací DNA, kovalentními modifikacemi histonů a uspořádáním jádra do funkčních subkompartmentů. Pokrok v dané oblasti je značnou měrou závislý na vývoji metod vhodných ke studiu epigenetických regulací.
11
Jedním z nejpoužívanějších přístupů je vizualizace jednotlivých zapojených komponent – markerů (např. chromatinu, genů, molekul RNA, enzymů či modifikovaných histonů) a následné určení jejich vzájemných prostorových vztahů, které často odhalí např. funkční propojení jednotlivých komponent. Přestože v posledních letech prožívá sféra výzkumu epigenetické regulace prudký vzestup, studium vedoucí k úplnému objasnění příslušných mechanismů je teprve ve svých počátcích. Cílem této práce je popsat v současnosti nejvíce zkoumané typy epigenetické regulace a utvořit přehled metod vizualizace, popřípadě kvantifikace odpovídajících markerů. Práce poskytuje informace o: heterochromatinu methylaci DNA na CpG místech methylaci a acethylaci histonů místech transkripce, tzv. transkripčních továrnách jaderné topologii RNA interferencích Metody ke studiu jednotlivých typů epigenetické regulace jsou abecedně seřazeny v samostatné kapitole.
2. Markery epigenetické regulace 2.1.
Heterochromatin Jak bylo již uvedeno, DNA je v jádře eukaryotického organismu uložena
v podobě nukleoproteinového komplexu, chromatinu. Již v roce 1928 Emil Heitz pozoroval v jádře oblasti chromatinu, u kterých nedochází k postmitotické dekondenzaci, a nazval je heterochromatin. Naopak rozvolněné oblasti byly pojmenovány euchrochromatin. Současné znalosti definují heterochromatin jako rigidní část jádra, obsahující hustě sbalený, neaktivní chromatin, nepřístupný transkripčnímu aparátu. Heterochromatin se replikuje až na konci S-fáze a obecně se
12
nejčastěji vyskytuje v telomerách a centromerách. Euchromatin obsahuje množství aktivně transkribovaných genů, proto je sbalený volně do podoby 10nm vlákna. Díky objevu proteinů modifikujících strukturu chromatinu se během posledních let pojetí míry kondenzace chromatinu jako jeho statické vlastnosti výrazně změnilo. Studie s využitím exprese GFP (green fluorescent protein) ukázaly, že v interfázním jádře je organizace chromatinu naopak velmi dynamická. Chromatin může přecházet mezi různými konformačními stavy a ovlivňovat tak aktivitu obsažených genů. 2.1.1
PEV (position effect variegation) Obecně, zaujme-li DNA vysoce kondenzovanou formu heterochromatinu,
geny v ní obsažené se stávají inaktivní. Tato změna konformace chromatinu může probíhat různými mechanismy epigenetické regulace, jejichž společným znakem je asociace
DNA
se
specifickými
multiproteinovými,
popřípadě
ribonukleo-
proteinovými komplexy, které jsou potřeba k dosažení represivního stavu. Bylo jištěno, že eukaryotické geny jsou podmíněně, avšak reversibilně umlčovány, nacházejí-li se v kontaktu s heterochromatinem, a tento jev byl označen jako PEV (position effect variegation) [Hendrich 1995]. Poprvé byl pozorován u Drosophily, kdy se po inverzi genu „white“, zodpovědného za červenou barvu očí, do blízkosti heterochromatinu změnila barva jejích očí zčásti na bílou. Předpokládá se, že umlčení genů nacházejících se v těsné blízkosti heterochromatinových oblastí, je způsobeno jejich „heterochromatinizací“, tedy přestavěním struktury chromatinu do úrovně heterochromatinu [Hennig 1999]. Byly popsány dva proteiny, které s formací heterochromatinu souvisí. Jsou to Pc-G (Polycomb group) komplex a HP1 (heterochromatin protein 1). HP1 je kódován genem Su(var)2-5, který je-li deletován, PEV se zeslabuje a je-li duplikován, PEV se zesiluje. Z toho vyplývá významná role pro HP1 jako modifikátoru
PEV.
HP1
obsahuje
evolučně
stálou
chromodoménu
(CD)
a chromoshadow doménu . Bylo zjištěno, že pomocí CD domény se HP1 váží k histonům H3 a pomocí chromoshadow domény mohou interagovat s řadou dalších proteinů, jako lamin B receptory nebo s dalšími HP1. Především vzájemná interakce HP1 mezi sebou se ukázala klíčovou při formaci heterochromatinu (popsáno níže). Také Pc-G komplexy obsahují chromodoménu a vyskytují se v oblastech transkripčně neaktivních genů, což nasvědčuje jejich účasti na aktivním přetváření struktury chromatinu.
13
Efekty PEV byly také popsány u telomer S.cerevisiae,
centromer
S.pombe
a
také
u centromer savčích buněk. I u těchto organismů byly identifikovány proteiny homologní s Pc-G a HP1 a předpokládá se, že PEV zde probíhá podobnými mechanismy. 2.1.2. Formace heterochromatinu Esenciální roli při umlčování genů a formaci heterochromatinu [Nielsen 2001a] hrají epigenetické signály, jako je methylace DNA a kovalentní modifikace histonů (více v příslušných kapitolách, str.
14 a 17). Po
inaktivaci genů musí být nejprve činností deacetylas z lysinů
odstraněny 9 a 14
methyltransferasa
histonu
acetylové H3,
aby
skupiny mohla
SUV39H1 histon H3 na
lysinu 9 následně namethylovat. Methylované
Obrázek 2: Formace heterochromatinu, převzato z [Zhang 2001]
H3K9 slouží jako vazebná místa pro HP1, které je specificky rozpoznávají pomocí chromodomén. Vzájemnými interakcemi HP1 proteinů skrz jejich chromoshadow domény je heterochromatinizace iniciována a šířena dále. Tímto způsobem jsou umlčovány např. geny v pericentické oblasti u savců nebo geny mat u S. pombe.
2.2.
Methylace DNA Methylace je post-replikační modifikace DNA, která se u obratlovců
přednostně nachází na cytosinu v dinukleotidové sekvenci CpG [Jaenisch 2003]. U rostlin je místem methylace DNA trinukleotid CpNpG. Předpokládá se, že methylace stabilizuje kondenzovanou konformaci chromatinu a tak udržuje přítomné geny v inaktivním stavu. Esenciální roli hraje během procesu diferenciace a vývoje obratlovců, při genovém imprintingu a inaktivaci chromozómu X. Enzymy zodpovědné za přidání methylové skupiny na cytosin se nazývají DNA methyltransferasy (DNMTasy). Některé methylují DNA de novo, ale většina methyluje pouze nemethylované vlákno v hemimethylované DNA, to je tzv. dědičná
14
methylace.
Za účelem
porozumění
funkci methylace DNA v organismu bylo
provedeno
mnoho
analýz
fenotypů myší s mutacemi v genech pro různé DNMTasy. Delece genu Dnmt1 měla za následek rozsáhlou demethylaci DNA a letalitu embrií, což vedlo k závěru, že enzym Dnmt1 slouží
k zachování
methylace.
Produkty genů Dnmt3a a Dnmt3b, silně exprimovaných během vývoje myšího
embria,
byly
shledány
Obrázek 3: Methylace DNA na CpG místech,
zodpovědné za de novo methylaci po
převzato z http://www.designeduniverse.com/
usazení vajíčka v děloze. Z těchto
articles/Nobel_Prize/Nobel_DNA2.htm
studií tedy plyne, že methylace DNA je u obratlovců nezbytná pro normální vývoj a její ztráta vede k zániku embrií. Methylace DNA se podílí na umlčování genů. Provedené studie ale ukazují, že inaktivaci genů vyvolává spíše methylace H3-K9, zatímco methylace DNA slouží jako „buněčná paměť“, která inaktivní stav genů zaznamená a dále jej udržuje. Zřejmě existuje několik cest, kterými methylace DNA transkripci potlačuje. Jednou z nich je zabránění vazbě transkripčních faktorů na DNA, způsobené zaplněním velkého žlábku šroubovice methylovými skupinami. Druhou cestou je modifikace konformace chromatinu vlivem proteinů, vázajících se na methyl-CpG sekvence. Jedním z proteinů, zprostředkovávajících represi transkripce prostřednictvím specifické vazby na methylovaná CpG místa, je MeCP2. Bylo zjištěno, že interaguje s histon deacetylasami, enzymy způsobujícími inaktivaci genů (viz acetylace histonů, str. 18). 2.2.1. Genový imprinting U imprintovaných genů se exprese jejich alel liší v závislosti na tom, zda pocházejí od otce nebo matky [Hendrich 1995].
Prvním charakterizovaným
imprintovaným genem byl Igf2, kódující růstový faktor. Při pokusu vykazovaly heterozygotní myši s mutovanou otcovskou alelou růstovou retardaci, zatímco myši s mutovanou alelou matky měly obvyklou velikost. Podrobnější studie ukázaly, že
15
umlčené alely Igf2 a dalších imprintovaných genů jsou methylovány na CpG a že tato methylace je vyžadována k ustavení i zachování inaktivního stavu alel. Genový imprinting může mít za následek různé projevy téhož genetického onemocnění. U člověka se tak stane, vyskytne-li se poškození genů v imprintované oblasti nacházející se na chromozómu 15. Příčinou může být lokální genová mutace, translokace nebo delece příslušného úseku DNA. Poškození zděděné od matky vyvolává tzv. Angelmanův syndrom (AS). Postižení jedinci mají typický vzhled obličeje a způsoby chování, jako je hyperaktivita, problémy s příjmem potravy nebo absence řeči. Poškození pocházející od otce dává vzniknout Prader-Willi syndromu (PWS), mezi jehož hlavní projevy patří nadměrný příjem jídla a nízký svalový tonus. Odpovědné geny ale dosud nebyly odhaleny. 2.2.2. Kompenzace dávky Vzhledem k tomu, že samičí buňky heterogametických živočichů obsahují dva chromozómy X (XX) a samčí buňky pouze jeden chromozóm X (XY), je zapotřebí mezi pohlavími vyrovnat míru exprese genů, kódovaných na chromozómu X, což se děje procesem tzv. kompenzace dávky (dose compensation). U Drosophily je kompenzace dosaženo zdvojnásobením exprese genů na X u samce, u savců včetně člověka je to umlčením jednoho z chromozómů X u samice. Proces kompenzace dávky byl prvně podrobně studován u Drosophily a následně byly znalosti aplikovány na buňky savčí. 2.2.3. Umlčení chromozómu X u savců V interfázním jádře samic je pozorovatelný heterochromatický komponent, který u samců chybí. Podle svého objevitele se nazývá Barr Body a jedná se o inaktivovaný chromozóm X. Barr Body je v jádře vždy o jeden méně, než je počet X chromozómů. Z toho plyne, že je spíše primárně určován aktivní chromozóm a druhý je následně inaktivován, než naopak. Výběr probíhá zřejmě náhodně. Předpokládá se, že k umlčení jednoho z chromozómů X dochází způsobem změny konformace chromatinu indukované multiproteinovým komplexem obdobně, jako je tomu u heterochromatinizace. Gen zapojený v tomto procesu se nazývá XIST a nachází se v X-inaktivačním centru (XIC) na chromozómu X. XIST kóduje nukleární RNA, která není translatována a byla nalezena rozprostřená po celé délce
16
inaktivního chromozómu X. Právě XIST RNA je považovány za jednu z komponent ribonukleoproteinových koplexů, které by zajišťovaly inaktivaci X chromozómu. Inaktivní chromozóm X je charakteristický nízkou acetylací histonů H4 a silně methylovanými CpG místy v promotorových oblastech přítomných genů. Vzhledem k tomu, že aktivace genu XIST de novo methylaci inaktivovaného chromozómu X o několik dní předchází, není zřejmě methylace DNA do navození inaktivního stavu zapojená, ale její přítomnost je nutná pro kontinuální produkci XIST RNA a deacetylaci histonů.
2.3.
Kovalentní modifikace histonů Na struktuře chromatinu se podílí 5 tříd histonů, H2A, H2B, H3 a H4, které
tvoří jádro nukleozómu, a linkerový histon H1, umožňující vznik struktur vyššího řádu. Histony jádra jsou evolučně velice stabilní a strukturně podobné, variabilita vyskytující se u histonu H1 odráží jeho odlišnou úlohu. Každý jádrový histon se sestává z centrální globulární části a dvou nestrukturovaných vláknitých konců, které z jádra nukleozómu vyčnívají. Především N-terminální konce obsahují vysoký podíl kladně nabytých aminokyselinových zbytků argininu a lysinu a předpokládá se, že interagují s negativně nabitými fosfáty DNA nebo jinými proteiny, spojenými s chromatinem. Specifické aminokyselinové zbytky vláknitých konců histonů jsou místem celé škály post-translačních modifikací, jako je acetylace, methylace, fosforylace, ubikvitinace nebo ADP-ribosylace. Tyto kovalentní modifikace byly známy po mnoho let, ale teprve díky identifikaci odpovědných enzymů začaly být postupně odhalovány biologické funkce jednotlivých modifikací. Bylo zjištěno, že modifikace histonů ovlivňují strukturu chromatinu a tak se podílejí na regulaci genové exprese, DNA replikace nebo segregace chromosomů. Na strukturu chromatinu mohou mít vliv buď přímo, změnou charakteru vazeb mezi DNA a histony, nebo nepřímo, interakcemi s dalšími proteiny. Podle teorie „histonového kódu“ představují modifikace histonů chemické značky, umožňující vazbu proteinů nebo proteinových komplexů. Různé histonové modifikace na různých aminokyselinových zbytcích mohou mít podobné, nebo zcela protichůdné funkční efekty a výsledná konformace chromatinu je závislá na jejich kombinaci.
17
Mezi převládající a nejvíce studované modifikace patří acetylace, methylace a fosforylace histonů. Ubikvitinace a ADP-ribosylace jsou pravděpodobně stejně důležité, ale doposud málo prozkoumané. Ve své bakalářské práci se zaměřuji především na acetylaci a methylaci.
Obrázek 4: Mapa histonových modifikací, převzato z [Zhang 2001]
2.3.1
Acetylace histonů Acetylace
acetyltransferasami
histonových (HATasy)
konců [Rice
je 2001].
katalyzována Bylo
enzymy
zjištěno,
že
histon histon
acetyltransferásovou aktivitu vykazuje poměrně velké množství již dříve identifikovaných komponent transkripčního aparátu, a že acetylace histonů je spojena s aktivací transkripce. Místem acetylace jsou ε-amino skupiny lysinů na Nterminálních koncích jádrových histonů. Kladný náboj lysinů je přidáním acetylových skupin neutralizován, tím se sníží celkový kladný náboj histonových konců a výsledkem je nižší afinita histonových konců k záporně nabité DNA. Takto může acetylace histonů usnadnit přístup regulačních proteinů k DNA. Obecně je tedy vysoká míra acetylace na histonech, tzv. hyperacetylace, spojována s aktivitou genů, zatímco hypoacetylace, čili nízký stupeň acetylace, s transkripční represí. Za přidání acetylových skupin na lysiny jsou zodpovědné enzymy histon acetyltransferasy (HATasy) a za jejich odebrání histon deacetylasy (HDACasy). Výsledná hladina acetylace chromatinu tedy závisí na celkové společné aktivitě HATas a HDACas. Aby mohly obě tyto skupiny enzymů zodpovídat za acetylaci histonů napříč celým genomem, je pravděpodobné, že jejich působení bude specificky usměrňováno do konkrétních genomových oblastí. Toto usměrnění může
18
být zprostředkováno vazbou HATas a HDACas na celou řadu proteinů interagujících s DNA. Např. studie genů řízených regulátorem transkripce UME6, který svou činností zabraňuje jejich umlčení, ukázala, že UME 6 zprostředkovává vazbu mezi geny a vysokomolekulárním komplexem, obsahujícím mimo jiné deacetylasu RPD3 a umlčující protein SIN3. U rdp3 mutantů bylo pozorováno několikanásobné zvýšení hladiny acetylace H4K5, u sin3 mutantů acetylace H4K5 a H4K12, v obou případech se změna týkala nukleozómů vzdálených od promotoru genů přibližně 1 kb. Z výsledků plyne, že komplexy s deacetylásovou aktivitou mohou selektivně deacetylovat konkrétní lysinové zbytky histonů, a že o volbě lysinových zbytků může rozhodovat složení komplexu.
Obrázek 5: Mechanismus acetylace lysinu a vliv acetylace lysinu na vazbu histonu k DNA, převzato z http://nobelprize.org/medicine/educational/dna/a/ transcription/acetylation.html
Předpokládá se, že acetylace histonů hraje podstatnou roli také při zachování epigenetické informace během buněčného cyklu a při jejím přenosu z jedné generace do druhé [Turner 2000]. U Drosophily je acetyltransferasa MOF esenciální složkou komplexu zajišťujícího kompenzaci dávky zdvojnásobením aktivity samčího chromozómu X. MOF acetyluje histony H4 v celé délce chromozómu X na lysinu 16. V případě, že samci Drosophily MOF nemají, nedochází u nich ke zvýšené transkripci genů na chromozómu X a umírají v ranném stádiu vývoje. Komplex obsahující MOF zůstává s DNA asociován během celého buněčného cyklu. Více obecným mechanismem při zachování modelu transkripce je interakce komplexu 19
obsahujícího HDCAsu s proteinem MeCP2, specificky se vázajícím na methylovaná CpG místa v DNA, což vede k represi genové exprese a zachování vysoké míry kondenzace heterochromatinu. V oblastech heterochromatinu se tedy methylace DNA a hypoacetylace histonů logicky vyskytují společně. Acetylaci ovlivňuje i další histonová modifikace, a sice fosforylace, která může mít na acetylaci synergistický efekt [Cheung 2000]. Po stimulaci savčích buněk epidermálním růstovým faktorem (EGF) dochází k fosforylaci histonů H3 na S10 a pak následně k jejich acetylaci na K14 za vzniku dimodifikovaných histonů. Bylo zjištěno, že acetyltransferasy z rodiny Gcn5 vykazují desetkrát vyšší afinitu k histonům H3 fosforylovaným na serinu 10, než k nefosforylovaným. Fosforylace H3K10 tedy zvyšuje efektivitu následující acetylace H3K14, což může mít silnější vliv na aktivaci transkripce. Acetylace histonů může být klíčovou modifikací i v případě, kdy je třeba genovou aktivitu změnit pouze krátkodobě. Studie u různých organismů ukázaly, že acetylace histonů H3 a H4 v nukleozómech, blízkých promotoru inducibilních genů, vede k aktivaci jejich transkripce. Přestože konkrétní lysinové zbytky, které by se této regulace účastnily, ještě nebyly určeny, z provedených pozorování lze usoudit, že se jedná o změny acetylace pouze lokálního charakteru. V některých případech se účastní jen dva nebo tři nukleozómy v těsné blízkosti promotoru, avšak silně ovlivňující iniciaci transkripce. Zanedlouho po tom, co se míra transkripce opět sníží, je stupeň acetylace navrácen do původního stavu. 2.3.2. Methylace histonů Za methylaci histonů zodpovídají enzymy histon methyltransferasy (HMTasy) [Zhang 2001]. Cílovým místem modifikace jsou především konzervativní zbytky lysinu 4, 9, 27 a 36 na N-terminálním konci histonu H3 a 20 na histonu H4, ale vyskytuje se i na histonech H2A a H2B (viz obr.4). Lysiny mohou být mono- dinebo tri-methylovány. Enzym z rodiny protein arginin methyltransferáz PRMT1 methyluje in vitro argininy histonů a přestože experimenty po dlouhou dobu prokazovaly, že in vivo se methylace histonů vyskytuje pouze na lysinech, pomocí hmotnostní spektrometrie byla odhalena methylace argininu 3 na histonu H4 a potvrzena role H4 jako substrátu pro PRMT 1 in vivo. Rodina HMTas methylujících lysiny obsahuje evolučně konzervativní SET doménu, jejíž funkce je obecně spojována s modulací genové aktivity. Narozdíl od acetylace je methylace
20
histonů považována za modifikaci spíše irreversibilní povahy, protože doposud nebyly identifikovány žádné demethylující enzymy. Předpokládá se, že demethylace by mohla probíhat buď postupně, přirozenou výměnou methylovaných histonů za nové, nebo jejich řízenou degradací. Methylace nijak neovlivňuje celkový náboj histonových konců, ale zvyšuje jejich bazicitu a hydrofóbnost, což má za následek zvýšení afinity modifikovaných N-konců k DNA a větší odolnost DNA proti štěpení trypsinem [Rice 2001]. Stejně jako acetylace, ovlivňuje methylace strukturu chromatinu prostřednictvím interakcí s regulačními proteiny. Nejlépe prozkoumaná je pravděpodobně methylace histonu H3 na lysinu 9, která plní v regulaci genové exprese mnoho různých funkcí [Lachner 2002]. Jednou z hlavních rolí H3K9 je její účast na formaci a stabilizaci heterochromatinu (str. 14, obr. 2).
Dva homology su(var)3-9 (modifikátoru PEV u Drosophily), lidský
SUV39H1 a S. pombe Clr4 byly jako první shledány, že vykazují
HMTasovou
aktivitu a methylují H3 na lysinu 9. Tyto methyltransferasy obsahují konzervativní SET doménu a dvě oblasti bohaté na cystein, přičemž pro HMTasovou aktivitu jsou žádány všechny tři součásti. Při pokusech bylo zjištěno, že na H3K9 methylovaný SUV39H1 (Clr4) se specificky váže protein HP1 (Swi6 – analog HP1 u S.pombe),
jehož
oligomerizací
chromatin
kondenzuje a dochází k umlčení genů. U savců hrají methyltransferasy SUV39H důležitou roli během
vývoje
methylace
a předpokládá
v pericentrické
se,
oblasti
že může
H3K9 mít
potencionální tumor-supresorovou funkci, protože se
podílí
na
zajištění
vyrovnané
segregace
chromozómů. Studie genu pro cyklin E ukázala, že methylace H3K9 se může účastnit umlčování genů také v euchromatických oblastech [Nielsen 2001b]. Zde hraje důležitou roli tumorový represor Rb
Obrázek 6: Umlčování
(retinoblastoma), který je směřován do místa
v euchromatinu,
cílového promotoru vazbou na transkripční faktor
z [Zhang 2001]
21
genů
převzato
E2F. S proteinem Rb pak interaguje komplex histon methylatransferasy SUV39H1 a proteinu HP1. HMTasa methyluje histon H3 na lysinu 9, na který se následně může vázat HP1 a reprimovat transkripci. Rb protein je přitom nezbytný jak pro methylaci H3K9, tak pro navázání HP1 na promotor. V blízkosti promotoru genu cyklin E bývá tímto způsobem methylován pouze jeden nukleozóm. Je pravděpodobné, že i v tomto případě spolupracuje methylace histonů s jejich acetylací, stejně jako v případě umlčování vývojově regulovaných genů v rámci inaktivace jednoho z chromozómů X u samic savců. Analýza pomocí ChIP odhalila, že methylace H3K9 se vyskytuje po cele délce inaktivního chromozómu X. Zároveň je chromozóm X hypoacetylován. Tato skutečnost logicky vyplývá z antagonismu, který mezi methylací H3K9 a acetylací histonů existuje. Zatímco methylace H3K9 souvisí s transkripční represí, acetylace histonů vede k transkripční aktivaci. Ovšem ne všechny typy methylace histonů musí nutně vést k umlčení genů. V souladu s hypotézou histonového kódu se může výsledný efekt methylací histonů na transkripci lišit v závislosti na tom, na jakém histonu a lysinovém zbytku se methylace nachází a jestli jsou spolu různě kombinovány. Jak již bylo zmíněno na začátku kapitoly, na histonu H3 mohou být kromě lysinu 9 methylovány také lysiny 4 a 27 a na histonu H4 lysin 20. Předpokládá se, že pokud je methylace H3K4 přítomna osamotě, má za následek transkripční represi, zatímco pokud se vyskytuje ještě spolu s H3K27 nebo spolu s H3K27 a H4K20, může vyústit v transkripční aktivaci. V aktivních makronukleích Tetrahymeny převládá methylace H3K4, navíc se zde objevuje spolu s acetylací, což svědčí o spojitosti methylace H3K4 s aktivními geny. Tuto myšlenku podpořilo i zjištění, že Set-1 protein, vázající se na H3K4, je součástí komplexu obsahujícího aktivátory transkripce. Mimo acetylace může účinek methylace histonů na transkripci ovlivňovt i methylace DNA. Studie genu Dim-5 u N. Crassa a genu Kryptonite u A. Thaliana vedly k přesvědčení, že H3K9 methylace může buď přímo nebo prostřednictvím specifického proteinu vázat DNA methyltranferasy a tak podporovat methylaci DNA. Na druhou stranu, DNA methylace může prostřednictvím interakce MeCP2 s HDACasami zpětně posilovat methylaci histonů. Obě úrovně methylace takto vzájemně zesilují svojí schopnost umlčovat geny.
22
2.4.
Místa aktivní transkripce Během procesu transkripce jsou aktivní geny přepisovány do podoby
primárních RNA transkriptů. U eukaryotických organismů podléhá transkripce komplexním regulačním mechanismům, které řídí, jaké geny, kdy a v jakém množstvím budou transkribovány. V jádře se vyskytují různé typy RNA polymeras (RNA polymerasy I, II a III), které se liší lokalizací v rámci jádra a typem genů, jež přepisují (viz níže). Nejvíce zkoumaná je RNA polymerasa II (RNA polI) transkribující převážně geny kódující proteiny. K iniciaci transkripce je třeba sestavení iniciační komplexu, obsahujícího kromě podjednotek RNA pol II také celou řadu transkripčních faktorů, a jeho vazba na promotor genu. Původně se předpokládalo, že transkripčně aktivní geny poutají volně difundované transkripční faktory a RNA pol II za tvorby iniciačnícho komplexu, který pak putuje podél vlákna přepisované DNA. Vizualizace primárních transkriptů ihned po jejich vzniku však ukázala, že místa transkripce nejsou náhodně rozptýlena v závislosti na distribuci chromatinu, ale že transkripce je v jádře soustředěna do mnoha „ohnisek“ [Jackson 1993]. Tato ohniska
jsou označována jako transkripční továrny, jaderné subkompartmenty
obsahující vysokou koncentraci RNA polII a transkripčních faktorů. Vzhledem k tomu, že ohniska zůstávají viditelná i po odstranění více jak 90 % chromatinu, lze předpokládat, že transkripční továrny včetně primární RNA jsou ukotveny na pevné fázi - jaderné matrix, jejíž existence je předmětem bádání a dosud nebyla potvrzena. Geny tedy za účelem transkripce spíše migrují do již sestavených transkripčních továren, než aby byla při každé aktivaci genu sestavována továrna nová. Bylo prokázáno, že i vzdálené aktivní geny se seskupují a sdílí spolu místa transkripce [Osborne 2004]. Porovnáním počtu aktivních genů a transkripčních továren lze vyvodit, že jednu transkripční továrnu spolu sdílí více než jeden aktivní gen. Aktivní geny se dynamicky přesouvají i za hranice svého chromozomálního teritoria, takže je možné, aby jednu transkripční továrnu sdílely geny pocházející z různých chromozómů. Transkripce vysoce aktivních genů neprobíhá kontinuálně, ale geny prochází tzv. on-off cykly. Stav „on“ je spojen s aktivní transkripcí a pobytem v transkripční továrně, zatímco stav „off“ vede k opuštění továrny a dočasnému potlačení transkripce. Frekvence těchto cyklů může být jedním z faktorů udávajících míru
23
exprese daného genu. Předpokládá se, že gen musí být určitým způsobem stimulován, aby vytvořil s transkripční továrnou funkční spojení. Afinitu genů k místům transkripce by mohly zvyšovat např. některé trans-acting faktory, zesilovače nebo modifikace chromatinu.
Obrázek 7: Model transkripční továrny, převzato z [Chakalova 2005]
Interakce vzdálených zesilovačů (enhancerů) s transkribovanými geny byly studovány u komplexu genů pro β-globin (Hbb) [Carter 2002]. K vysokému stupni exprese β-globinových genů je nutná účast zesilovače HS2, který se nachází na vzdálené regulační sekvenci LCR (locus control region). I přes to, že vzdálenost genu a LCR je 50kb, byla mezi těmito dvěma úseky potvrzena přímá interakce. Schopnost přímé interakce mezi genem a jeho vzdálenou regulační oblastí je vysvětlován tvorbou aktivních chromatinových center (active chromatin hub) [Chakalova 2005], v nichž je během transkripce chromatin uspořádán do specifických smyček. Vytvoření aktivního chromatinového centra by mohlo napomoci efektivnímu spojení genu s transkripční továrnou a dále jej stabilizovat. Vzhledem k tomu, že je transkribováno přibližně 15% genomu, musí limitovaným počtem transkripčních továren projít mimořádně velké množství genů.
24
Tato skutečnost musí zcela jistě silně ovlivňovat organizaci genomu v jádře (viz jaderná topologie, str. 24). Na začátku této kapitoly již bylo zmíněno, že kromě RNA polymerasy II se v jádře vyskytují ještě RNA polymerasy I a III, které vytváří také své vlastní transkripční továrny [Bartlett 2006]. RNA polymerasa I (RNApolI) je obsažená v jadérku, jaderném subkompartmentu, kde transkribuje skupinu genů kódujících 45S ribosomální RNA (rRNA). V jadérku je obsažen jeden nebo více shluků obsahujících RNA polI, ve kterých probíhá syntéza, zpracování i začleňování rRNA do podjednotek ribosomu. RNA polymerasa III (RNA polIII) je lokalizována stejně jako RNA polII v nukleoplasmě, kde transkribuje především geny pro transferovou RNA (tRNA), 5S rRNA a jiné malé RNA molekuly. Transkripční továrny se liší i obsahem transkripčních faktorů a existují důkazy o tom, že se určité transkripční továrny mohou specializovat k transkripci odlišných skupin genů.
2.5.
Jaderná topologie Epigenetické změny struktury chromatinu, jako je methylace DNA
a modifikace histonů, v současnosti zaujímají ve výzkumu regulace genové exprese přední místo. Avšak některé jevy, jako např. PEV (position effect variegation), naznačují, že aktivita genů je regulována nejen na úrovni chromatinového vlákna, ale že může být ovlivněna také prostorovou organizací genů v jádře. Po dlouhou dobu se předpokládalo, že po dekondenzaci mitotických chromosomů se chromatinová vlákna náhodně propletou a rozprostřou v prostoru jádra. Již na přelomu 18. a 19. století Rabl a Boveri vyslovili myšlenku, že chromatin podléhá jistému stupni organizace během celého buněčného cyklu a že v interfázi zaujímají jednotlivé chromozómy v jádře pouze omezený prostor. Teprve využití moderních metod, jako je elektronová mikroskopie a vizualizační techniky užívající fluorescenční sondy (FISH aj.), však umožnilo podrobné studie architektury jádra, jež odhalily, že jádro je vysoce organizovanou organelou obsahující další funkční subkompartmenty. Barvení chromozómů pomocí FISH (fluorescence in situ hybridization) skutečně potvrdilo skutečnost, že každý chromozóm zabírá v jádře samostatnou oblast, tzv. chromozomální teritorium (CT). Prostor mezi chromozomálními teritorii
25
se spolu s jeho obsahem nazývá ICD (inter chromatin domain) kompartment. Na existenci těchto dvou složek je založen TC - ICD model, který vysvětluje funkční uspořádání genomu v jádře [Cremer 2000; Cremer 2001] 2.5.1
Chromozomální teritoria Chromosomální teritoria vykazují různé tvary a svou velikostí odpovídají
velikostem chromosomů. Studie struktury CT v živých buňkách ukazují, že chromozómy jsou sestaveny z tzv. subchromozomálních domén o velikostech ~100 Mbp nebo ~100 kbp DNA [Zink 1998]. Předpokládá se, že Mbp subchromozomální domény odpovídají pruhům na ramenech chromozómů během mitosy, a že by se mohlo jednat o replikační jednotky. V rámci 1 Mbp mohou být 100 kbp domény samostatně regulované. Poloha genů v rámci odpovídajícího CT není náhodná a často bývá dávána do souvislosti s transkripční aktivitou. Bylo by logické, kdyby se aktivní geny vyskytovaly na povrchu CT, kde by byly dostupné pro transkripční faktory a další proteinové komplexy nacházející se v ICD prostoru, zatímco neaktivní geny by ležely uvnitř CT, nedostupné pro složky transkripčního aparátu. Provedené studie odhalily, že na povrchu CT jsou přednostně lokalizovány aktivní, ale i neaktivní geny a uvnitř CT byl pozorován výskyt nekódující sekvence [Kurz 1996]. Avšak později bylo zjištěno, že transkripčně aktivní geny jsou přítomny i uvnitř CT. Vysvětlení může poskytnout představa, že ICD kompartment se větví a proniká i do prostoru CT mezi subchromozomální domény, na jejichž povrchu jsou geny umístěné. Některé intenzivně transkribované geny, jako např. geny hlavního histokompatibilitního komplexu, vybíhají v době své aktivity v podobě smyček ven z CT a zasahují do prostoru ICD. Tyto smyčky obsahují několik megabází DNA a frekvence, s jakou se nachází mimo oblast CT odráží počet aktivních genů obsažených v daném úseku. Poloha jednotlivých CT v rámci jádra není náhodná, pravděpodobně souvisí s obsahem genů. Sledování lokalizace lidských chromosomů 18 a 19 v jádře ukázalo, že CT na geny bohatého chromosomu 19 se převážně nachází ve středu jádra, zatímco CT chromosomu 18, neobsahujícího takové množství genů jako chromosom 19, na okraji jádra. Později byl u lidských buněk popsán vztah mezi polohou chromosomu a jeho velikostí, kdy jsou velké chromosomy situovány spíše směrem ke středu jádra a malé chromosomy na okraj.
26
2.5.2
ICD kompartment ICD kompartment zahrnuje prostor bez chromatinu ohraničený povrchem
subchromosomálních domén. Fúzí histonu H2B s GFP (green fluorescent protein) bylo dosaženo vizualizace celkového chromatinu v jádře, zatímco oblast ICD zůstala neoznačená. Ukázalo se, že v nejširších místech dosahují mezery až několik mm a v nejužších větveních pouze pár nm. V prostoru ICD se nacházejí proteinové komplexy nezbytné pro transkripci, sestřih RNA, replikaci a reparaci DNA, jejichž seskupováním zřejmě vznikají různé jaderné domény (nuclear bodies). Např.
ICG
(interchromatin
granule
clusters)
jsou
elektronovým
mikroskopem pozorovatelné regiony nepravidelného tvaru. ICG obsahují faktory související se sestřihem RNA (snRNP, SR proteiny) a vyskytují se v blízkosti aktivních genů. Podobně Cajal bodies jsou jaderné domény s obsahem snRNP a snoRNP. Existence těchto domén podněcuje hypotézu, že procesy jako je transkripce, sestřih a další zpracování RNA transkriptů jsou v rámci jádra neodlučitelné a prostorově organizované. Přesto není doposud jasné, zda jaderné domény slouží pouze ke skladování a sestavování proteinových, případně nukleoproteinových komplexů, které jsou následně uvolňovány do míst působení, nebo zda slouží přímo jako funkční místa pro příslušné děje. Hranice ICD kompartmentu tvořené povrchem chromozomálních domén umožňují volně difundovat ven z prostoru ICD pouze proteinům omezené velikosti. Velké komplexy transkripčních faktorů působí pouze na dostupné geny, což se shoduje s lokalizací transkripce na povrchu chromozomálních domén. Dovnitř chromozomálních domén mohou prostupovat pouze malé proteiny, např. receptory hormonů nebo histon acetyltransferasy, potřebné pro otevření chromatinu a zpřístupnění genů dalším aktivačním faktorům. Při sledování pohybu primárních RNA transkriptů v jádře bylo pozorováno, že transport molekul RNA probíhá difúzí skrz ICD kompartment a ven z jádra póry v jaderné membráně. 2.5.3
Jaderná matrix Celým prostorem jádra prochází síť jederných filament, jejichž hlavní
složkou jsou hnRNP proteiny. Význam jaderné matrix je prozatím nejasný, ale patrně bude hrát roli při stabilizací struktury jádra. Zachování integrity jednotlivých CT napomáhají proteiny CTAP (chromosome interior anchoring protein), umístěné
27
uvnitř 1 Mbp domén, takže se usuzuje, že síť tvořená hnRNP bude spíše procházet prostorem ICD a obklopovat jednotlivé subchromozomální domény. K narušení teritoriální struktury chromozómů je třeba odstranit obě tyto struktury. 2.5.4
Další modely organizace chromatinu v jádře Vedle CT – ICD modelu bylo různými skupinami vědců základě získaných
poznatků o struktuře jádra vytvořeno několik dalších modelů popisujících strukturu chromatinu vyššího řádu v rámci chromozomálních teritorií. Jedním z nich je Random walk/giant loop (RW/GL) model [Sachs 1995; Yokota 1995], který předpokládá uspořádání chromatinového vlákna do flexibilních smyček o velikosti několika megabazí, uchycených k náhodně jdoucí nosné „páteři“. V dalším modelu zvaném MLS (multi-loop subkompartment ) jsou 1 Mbp domény tvořeny růžicemi menších smyček (100 kbp) a tyto růžice jsou spojeny chromatinovým vláknem podobné délky. Hypotéza, že transkripční stav genů je závislý na jejich jaderné topologii, nebyla dosavadním studiem potvrzena. Zmíněné modely nepočítají s tím, že by byla určitá poloha genu v jádře nutná pro jeho aktivaci či umlčení. Na druhou stranu je známo, že v důsledku dlouhodobých změn v genové expresi k přemisťování genů v rámci subchromozomálních domén dochází. Není však prozatím jasné, zda je změna polohy genu zodpovědná za změnu jeho aktivity, nebo naopak je přemístění genu pouze následkem jiné formy regulace. Obecně vzato by se dalo říci, že topologie chromatinu v jádře ovlivňuje genovou expresi jako součást komplexního mechanismu fungujícího na několika úrovních.
2.6.
RNA interference (RNAi) Procesem RNAi dochází k umlčení genů na post-transkripční úrovni, tzv.
PTGS (post- transcriptional gene silencing) [Ambion® 2002; SzweykowskaKulinska 2003]. To znamená, že homologní transkript genu je vytvořen, ale v cytoplazmě je působením nukleas zahrnutých v mechanismu RNAi rychle degradován a nedochází k jeho translaci. Předpokládá se, že RNAi byly vyvinuty za účelem umlčování transpozonů a jako obrana proti virům.
28
RNAi byly poprvé pozorovány u rostlin (petunie), kdy po zavedení transgenu do oblasti se silným promotorem navzdory očekávání nedošlo k vytvoření odpovídajícího produktu, a dokonce byl umlčen i homologní endogenní gen. Tento fenomén byl pojmenován kosuprese a byl nalezen také v mnoha dalších exemplářích rostlin, hub (Neurospora crassa) nebo hmyzu (Drosophila). Vědci pozorovali, že PTGS se může přenášet z hostitelské rostliny do roubů, z čehož vyvodili, že PTGS zprostředkovává difundující molekula. Studie na červech (Caenirhabditis elegans) prokázaly, že touto molekulou je dsRNA, která byla-li injektovaná do těla červa, umlčela homologní geny s mnohem větší účinností, než molekula sRNA (sence RNA) nebo asRNA (antisence RNA). Později se ukázalo, že k efektivnímu umlčení homologních genů stačí pouhých pár molekul dsRNA a že účinek se projevuje i v první generaci potomků. Umlčení genu nastalo i po namočení červů v roztoku obsahující příslušnou dsRNA. U Drosophily se jako účinný způsob osvědčila mikroinjekce dsRNA do embrií nebo transfekce sekvence nesoucí obrácené repetice umlčovaného genu. Výzkum RNAi z biochemického i genetického hlediska vedl k vytvoření současné představy mechanismu RNAi, zahrnujícího dva kroky. V iniciačním kroku je dsRNA, vložená přímo nebo s využitím transgenu, rozštípána enzymem Dicer (dsRNA - specifická ribonukleasa) na molekuly malé interferující RNA (siRNA). Duplexy siRNA jsou velké 21 – 23 bp a na 3´konci mají dvounukleotidový přesah [Zamore 2000]. Následuje efektorový krok, kdy se siRNA váže na nukleasový komplex za vzniku RISC (RNA-induced silencing complex). RISC je aktivován rozvolněním siRNA duplexu a na principu kompementárního párování bazí může RISC zacílit homologní RNA
transkript.
Transkript
je
rozštěpen na přibližně 12 nukleotidové úseky, avšak mechanismus štěpení je doposud neznámý. U savců dlouhou dobu trvalo, než byly RNAi vůbec prokázány.
Obrázek 8: Mechanismus
Transfekce dlouhých dsRNA však na
RNAi,
převzato
z http://www.med.lu.se/plain/expmed/forskning/
rozdíl od jiných organismů vyvolává
olekylaer_metabolism/manipulation_of_metaboli
v savčích
sm_in_vitro
buňkách
pouze
29
nespecifickou supresi genové exprese. Potlačení genové exprese je připisované antivirální odpovědi, která probíhá jednou ze dvou drah. Buď mohou dlouhé dsRNA aktivovat proteinkinasu PKR, která fosforyluje a tím inaktivuje translační iniciační faktor eIF2a, nebo mohou aktivovat RNAasu L, což vede k nespecifické degradaci mRNA. Na základě znalostí mechanismu RNAi u červů a Drosophily, byly do savčích buněk transfekcí vloženy geny kódující přímo siRNA. Tato aplikace se ukázala být úspěšnou a měla za následek specifické umlčení homogenních genů. Efekt však trvá pouze několik dní a i když je přenášen i na dceřinné buňky, časem mizí. Přestože u savců není umlčení genů indukcí RNAi vždy efektivní, vědci se o RNAi zajímají zejména jako o potenciální nástroj pro funkční genomiku. RNAi již byly využity k zjištění funkce mnoha genů u Drosophily, C. elegans nebo u rostlin a díky vývoji speciálních expresních vektorů, umožňujících kontinuální expresi siRNA v savčích buňkách, se RNAi využívají i ke studiu funkce genů v kulturách myších nebo lidských buněk.
3. Metody vizualizace a kvantifikace epigenetických markerů 3.1.
ChIP (chromatin imunoprecipitation) Chip je běžná in situ metoda umožňující určení míst interakcí DNA-protein
[Spencer 2003]. Využívá se především ke zmapování polohy modifikovaných histonů, transkripčních faktorů a proteinů nehistonové povahy na genomu. Postup zahrnuje krátkou inkubaci buněk s formaldehydem. Formaldehyd funguje jako činidlo, které vytvoří vazby (kroslinky) mezi proteiny asociovanými s chromatinem a DNA a tak zabrání jejich uvolnění, ke kterému by mohlo dojít během následujících kroků. Buňky jsou pak lyzovány a sonifikovány, což má za následek fragmentaci DNA. Lyzát se zcentrifuguje, aby se odstranily zbytky buněk, ve kterých se nacházela DNA. Následujícím krokem je inkubace vzorku s primární protilátkou, specificky se vázající k cílovému proteinu, tj. k tomu, jehož polohu na genomu chceme určit. Komplexy antigen-protilátka jsou izolovány pomocí A- nebo G-
30
sepharosy
v závislosti
na
povaze
vzorku.
Sepharosa je několikrát promyta a komplexy antigen-protilátka jsou eluovány detergentním pufrem. Nakonec je z imunokomplexů odstraněn i cílový protein, DNA je izolována a analyzována metodou Southernova přenosu (Southern slotblot) nebo real time – PCR. 1% Formaldehyd dokáže vytvořit kroslink mezi proteinem a DNA, RNA nebo proteinem, pokud jejich vzdálenost není větší než 2Å. Kroslink tedy vznikne, ať už bude protein k DNA vázán přímo nebo se bude nacházet pouze v její těsné blízkosti. Obdobně se může kroslink utvořit například mezi dvěma histony, takže nelze rozeznat, jestli je asociace proteinu s DNA přímá nebo nepřímá. Proto lze využít alternativních činidel, jako je cis-platina nebo ozáření UV. Cisplatina
netvoří
kroslinky
mezi
proteinem
a proteinem, ale vzdálenost jejího působení je oproti formaldehydu větší, 4Å. Technologie ChIP sehrály ve výzkumu epigenetické regulace významnou roli, neboť umožnily
objasnit
základní
mechanismy
dynamiky chromatinu a klíčovou roli posttranslačních modifikací histonů v regulaci funkce
Obrázek 9: Schéma jednotlivých kroků metody ChIP, převzato z [Spencer 2003]
genomu.
3.2.
FISH (Fluorescenční in situ hybridizace) Fluorescenční in situ hybridizace je metoda, sloužící k identifikaci
chromozómů nebo jejich částí (jednotlivé sekvence DNA, geny, centromery, telomery) přímo v buňkách nebo tkáních [Raap 1997]. Principem detekce specifické sekvence DNA je hybridizace fluorescenčně značené cDNA (complementary DNA) sondy s cílovou DNA v jádře buňky.
31
Obrázek 10: princip Fluorescenční in situ hybridizace, převzato z http://www.mtsinai.on.ca/pdmg/Genetics/cytogenetics.htm
Podle záměru studia se používají různé typy sond. Genově specifické sondy hybridizují s konkrétním genem na chromozómu. Tento typ sondy se využívá k přímé lokalizaci genů, k detekci jejich amplifikace a k detekci strukturních chromosomových aberací. Centromerické sondy jsou generovány z repetitivních sekvencí nacházejících se v centromerách. Vzhledem k tomu, že každý chromozóm lze zvýraznit jinou barvou, využívá se těchto sond při např. při zjišťování početních odchylek chromozómů. Celochromozové sondy se skládají ze sady kratších sond, jež hybridizují po celé délce jednoho chromozómu. Technice se pak říká barvení chromozómů
(chromosomal
painting)
a
slouží
k
analýze
strukturních
chromosomových aberací a složitých komplexních přestaveb v mitosách. Oligonukleotidové sondy mohou značit přímo, kdy je nick translací včleněn deoxyribonukleosidtrifosfát (dNTP) nesoucí fluorescenční barvivo, např. Texas red, Rhodamin (červená) nebo Fluorescein isothiokyanát (FITC, zelená). Mnohem více se však využívá značení nepřímé, kdy je do sondy inkorporován dNTP konjugovaný s haptenem digioxigeninem (DIG) nebo biotinem. Detekce sondy je dosaženo teprve přidáním protilátky specifické k danému haptenu a fluorescenčně značené sekundární protilátky. U digioxigeninu je to anti-DIG protilátka a k biotinu se specificky váže avidin nebo streptavidin. FISH technika zahrnuje několik kroků: I. Fixace a příprava biologického vzorku. Fixace suspenze buněk se liší pro 2D a 3D studie chromatinové struktury. Při 2D fixaci se naruší cytoplazma a jaderná membrána, fixační směs obsahuje kyselinu octovou a methanol (3:1). 3D fixace se provádí formaldehydem. Tkáně se buď zmražují (cryosekce) a řezy se fixují
32
paraformaldehydem, nebo se fixují formaldehydem a před řezáním jsou zapuštěny do parafínu. II. Denaturace DNA sond a hybridizace. DNA denaturuje vlivem vysoké teploty nebo vysokého pH. Značená sonda se komplementárně váže s denaturovanou DNA vzorku a poté pomalým ochlazením nebo snížením pH dojde k renaturaci molekul DNA. III. Promývání. Promývání slouží k odstranění přebytku nenavázaných sond, který by jinak mohly vytvářet nespecifický signál. Postup při promývání závisí na typu použité templátové DNA. IV.Získávání obrazu pomocí fluorescenční mikroskopie. Analýza obrazu se provádí pomocí speciálně vyvinutého softwaru. V současnosti je za pomoci moderního vybavení možné dosáhnout rozlišení, které dovolí identifikaci DNA sekvencí vzdálených od sebe pouze několik Mbp. Metoda FISH významně přispívá především ke studiu vyšších struktur chromatinu. Lze díky ní určit polohu sekvencí DNA a genů v prostoru, což napovídá mnohé o 3D uspořádání jádra. V současné době se využívá také pro mapování genů a pro identifikaci genových či chromozomálních abnormalit, často spojených s dědičnými chorobami nebo rakovinou.
3.3.
LM-PCR a metody identifikace 5-methylcytosinů K
pochopení úlohy, kterou hraje methylace DNA při regulaci genové
exprese, je třeba získat údaje o lokalizaci 5-methylcytosinů v jednotlivých genech i v rozsahu
celého
genomu.
Principem
následujících
metod
identifikace
5-methylcytosinu je odlišná reakce cytosinu a 5-methylcytosinu na působení modifikujících chemických činidel a následné sekvencování DNA na bázi PCR. Velikým přínosem v této oblasti bylo vyvinutí techniky LM-PCR (ligation-mediated PCR), která umožňuje exponenciální amplifikaci molekul s variabilními nebo neznámými konci pomocí linkeru o známé sekvenci, jež je k nim ligací připojen [Pfeifer 1989]. LM-PCR zahrnuje následující 4 kroky. V prvním je k denaturovanému úseku DNA, který chceme amplifikovat, přidán první genově specifický primer a DNA polymerasa. Prodloužením primeru vznikne na jedné straně DNA úseku tupý dvouřetězcový konec. Druhý krok obnáší DNA ligázou sprostředkované navázání
33
druhého, částečně dvouřetězcového a na jedné straně tupého linkeru, k tupému konci DNA úseku. Linker je navržen tak, že se k DNA úseku připojí pouze jeden, delší z obou řetězců. Tento úsek bude dále sloužit jako templát. Ve třetím kroku je k templátu přidán primer komplementární k linkeru a ještě druhý genově specifický primer, komlementární k opačnému konci templátu.
A nakonec, ve čtvrtém kroku
jsou ještě amplifikované produkty pomocí třetího
genově
specifického
primeru
označeny. 3.3.1. Metoda
využívající
hydrazin
a LM-PCR Reakce klasickou
DNA
s hydrazinem
pyrimidin-specifickou
je
reakcí,
Obrázek 11 : Schéma kroků LM-PCR, převzato z [Pfeifer 1989]
kterou využili již Maxam a Gilbert při proceduře sekvenace DNA. Hydrazin modifikuje cytosin a thimin a po štěpení takto ošetřené DNA piperidinem dojde za specifických podmínek k otevření pouze cytosinového kruhu a následně se v tomto místě štěpí i cukrfosfátová kostra DNA. Vzniká populace heterogenních molekul DNA, naštěpených v místě zájmu. 5-methyl cytosiny s hydrazinem téměř nereagují, takže se jejich přítomnost v DNA projevuje jako chybějící pruhy ve výsledku sekvenačního gelu. Citlivost cytosinu k hydrazinu je dostatečně odlišná od citlivosti 5-methylcitosinu a srovnatelná pro cytosiny umístěné v různých místech DNA, že může být touto metodou v jednom kroku provedena globální analýza populace úseků DNA s odlišným stupněm methylace. Jednokroková analýza výhodná zejména při analýze velkého počtu vzorků. 3.3.2. Metoda využívající hydrogensiřičitan a konvenční PCR Za specifických podmínek hydrogensiřičitan selektivně deaminuje cytosin za vzniku uracylu, zatímco 5-methylcytosin nereaguje a zůstává nezměněn. V tomto případě DNA není štěpena a může být amplifikována konvenční PCR. PCR produkty
34
jsou pak sekvenovány jako populace nebo klonovány a sekvenovány individuálně. Reakce je silně ovlivňována pH, při kyselém pH pobíhá rychle a v ssDNA může docházet k nežádoucí deaminaci 5-methylcytosinů, při alkalickém pH je spíše vratná. Jako optimum byla stanovena hodnota pH 5,5. Po úspěšné konverzi cytosinů na uracyly již nejsou řetězce DNA vzájemně komplementární, proto musí být při jejich amplifikaci použito více různých primerů. I přes zmíněné nevýhody je tato technika v posledních letech hojně využívána. Je vhodná zejména pro analýzu DNA s malým obsahem methylovaných cytozinů a pro malá množství vzorků. Oproti metodě s hydrazinem je méně komplikovaná.
3.4.
Měření aktivity histon acetyltransferas a histon deacetylas Výsledná hladina acetylace histonů je dána rovnováhou mezi působením
histon acetyltransferas (HATasy) a histon deacetylas (HDACasy). Ustálená hladina acetylace v určité oblasti chromatinu je tedy určována pomocí měření lokálních aktivit těchto enzymů [Sun 2003]. Do specifických míst genomu jsou HATasy a HDACasy zacilovány pomocí transkripčních faktorů, s nimiž interagují a tvoří komplexy. Díky měření aktivity lze zjistit, jaká činnost, zdali acetyltransferasová nebo deacetylasová, je spojena s daným transkripčním faktorem. 3.4.1. Měření aktivity HDACasy K měření HDACasové aktivity využívá značení acetylových skupin na lysinech histonových konců tritiem, biotinem nebo fluorescenčnim barvivem a ty acetylové skupiny, které jsou HDACasami odstraněny, jsou poté monitorovány. Kromě značených histonů vyrábí některé firmy peptidy odvozené od N-konců histonů H3 a H4. Pokud by bylo cílem studia určení substrátové specifity, lze jako substrát pro HDACasy použít různé histony a nehistonové chromatinové proteiny. Níže popsaná metoda využívá jako substrát jádrové histony značené na acetylu tritiem. Vzorek je inkubován spolu s (3H)acetyl histony za optimálních podmínek po dobu 1h a teplotě 37°C, reakce je ukončena přidáním směsi kyseliny octové a kyseliny chlorovodíkové. Pro kontrolní vzorek platí stejný postup, před zahájením reakce je ale navíc po dobu 5 minut povařen, aby došlo k zničení enzymové aktivity.
35
Uvolněný radioaktivní acetát je vyextrahován do ethyl acetátu a centrifugován. V horní fázi je poté scintilačním počítáním stanoveno množství uvolněného radioaktivního acetátu. 3.4.2. Měření aktivity HATasy Histon acetyltransferasam slouží jako kofaktor acetyl-koenzym A, z kterého přenáší acetylovou skupinu na specifické lysiny N-terminálních konců histonů. Ke zjištění jejich aktivity se obvykle aplikuje acetyl-koenzym A značený 3H nebo
14
C.
Jako substrát mohou být využity histony, ale i jiný potenciální substrát pro HATasy, jako jsou transkripční faktory nebo HMG (high mobility group) proteiny nacházející se v chromatinu. Vzorek je inkubován po dobu 1h při teplotě 37°C v optimálním prostředí spolu s acetyl-koenzymem A značeným 3H, histony a sodium butyrátem. Sodium butyrát slouží jako inhibitor histon deacetylas, které by jinak svou činností výsledky zkreslovaly. Po skončení reakce je vzorek rozprostřen na fosfocelulosový papír P81 a nepřipojené acetyl-koenzymy A jsou z papíru odmyty velkým objemem roztoku uhličitanu sodného. Radioaktivita papíru P81 je změřena opět scintilačním počítáním. HATasovou a HDACasovou aktivitu lze stanovovat v různých frakcích izolovaných z buňěčného jádra, nebo přímo v určitých proteinových komplexech. Izolace
proteinových
komplexů
z jádra
se
nejčastěji
provádí
metodou
imunoprecipitace, kdy jsou cílové proteiny označeny specifickou protilátkou. Oproti běžné imunoprecipitaci (str. 29) nesmí žádné používané pufry obsahovat SDS (sodium dodecyl sulfát), který by zničil enzymovou aktivitu. Výhodou je možnost stanovovat aktivitu enzymů v komplexech ještě navázaných na A/G protein.
3.5.
Nukleotidové analogy Jedním ze způsobů, jak detekovat primární transkripty přímo v místě vzniku,
je inkorporace nukleotidových analogů do nově se syntetizující molekuly RNA. Nejčastěji bývá inkorporován bromuridin tri-fosfát (Br-UTP) [Haukenes 1997]. Působení Br-UTP se vystaví živé permeabilizované buňky nebo se pomocí mikroinjekce vpraví přímo do jádra. Bromdeoxyuridiny jsou pomocí protilátky (anti-
36
bromdeoxyuridin) označeny fluorescenční značkou a bromovanou RNA pak lze detekovat fluorescenční mikroskopií. Br-UTP je však špatně přijímán buňkami v buněčné kultuře. Proto byly vyvinuty látky, zprostředkovávající lepší absorpci Br-UTP buněčnými kulturami, tzv. transfekční reagenty. Mezi komerčně vyráběné patří Lipofectin, CellFectin, Transfectam, Effectene, DOTAP, DOSPER nebo FuGENE 6.
3.6.
PRINS (primed in situ) technika Primed in situ technika je rychlejší alternativou k FISH [Cinti 1993]. Je
založená na hybridizaci krátké neznačené ssDNA-sondy k cílové sekvenci. Tato sonda slouží jako primer pro prodloužení řetězce katalyzované vhodnou DNA polymerasou. Během syntézy jsou do nově vznikajícího řetězce inkorporovány nukleotidy konjugované s digioxigeninem nebo biotinem, nově vzniklá DNA je pak detekována fluorescenčně značenou protilátkou. Možné je také použít přímo značený nukleotid, např. rhodamin – dUTP. Aby bylo docíleno požadované specifičnosti a citlivosti reakce, je především třeba při krocích denaturace, nasedání primeru a elongace zvolit optimální teploty. Technika PRINS je využívána k fyzickému mapování lidských chromosomů. K identifikací jedné kopie genu může jako zdroj oligonukleotidové sondy posloužit jakákoli známá sekvence v genu. metodou PRINS lze pomocí sond o velmi krátkých sekvencích odhalit deleci pouze jediného exonu, narozdíl od FISH, kde by dlouhá sonda mohla s celou sekvencí i přes deleci hybridizovat.
3.7.
RNA-FISH (RNA fluorescenční in situ hybridizace) RNA fluorescentní in situ hybridizace (RNA-FISH) je nejvhodnější metodou
k vizualizaci primárních transkriprtů v jádře [van de Corput 2001]. Umožňuje citlivou detekci specifických mRNA molekul, simultánní detekci několika cílů a v kombinaci s imunofluorescenčními metodami i současnou vizualizaci mRNA a proteinů podílejících se na struktuře chromatinu, transkripci nebo zpracování RNA. V porovnání s DNA-FISH není senzitivita RNA-FISH ještě dokonale definována, ale tato metoda bude zajisté dále vyvíjena. Postup u RNA-FISH sestává se stejných kroků, jako při DNA-FISH, výhodou je, že není potřeba sondu ani cílovou sekvenci denaturovat. Pro detekci primárních
37
transkriptů se využívají oligonukleotidové sondy označené na několika místech biotinem nebo digioxigeninem. Tyto sondy by neměly obsahovat úseky homologní k ostatním sekvencím, repetitivní sekvence nebo dlouhé GC úseky, jež by mohly k sobě vzájemně hybridizovat. Optimální poměr AT/GC by měl být asi 40-55%. Při detekci proteinů v kombinaci s RNA-FISH je třeba zvolit takové podmínky, aby zůstaly zachovány epitopy proteinů. Tomu napomáhá použití fixátoru, nejčastěji formaldehydu (který mezi RNA a proteinem vytvoří kroslinky) nebo ethanolu či methanolu (dehydratující). Na epitopy se pak naváží specifické protilátky a po jejich označení fluorescenčním barvivem se provede analýza proteinů. Následuje RNA-FISH stejného vzorku.
3.8.
RNA-FISH (RNA fluorescenční in situ hybridizace) v živých buňkách Vzhledem k tomu, že ve fixovaných buňkách nelze sledovat dynamické
aspekty procesu transkripce, byly vyvinuty metody vizualizace RNA v živých buňkách [Dirks 2003]. Techniky in vivo umožňují simultánní vizualizaci genů, genových transkriptů a proteinových faktorů, a tak poskytují informace o místech syntézy a zpracování RNA. Hlavními kroky jsou navržení a dopravení fluorescenčně označených RNA sond do buňky, hybridizace sond k cílovým molekulám RNA a analýza signálu pomocí fluorescenční mikroskopie. Nejúčinnější způsob, jak vpravit sondu do živé buňky, je mikroinjekcí. K tomu je zapotřebí speciální vybavení a technická zručnost. Z alternativních způsobů je také účinná permeabilizace buněk streptolysinem O nebo narušení integrity buněk pomocí skleněných mikrokuliček. Pokud je již sonda jednou zavedena do živé buňky, následné odmytí nepřihybridizovaných sond je neproveditelné. Proto musí být množství sondy určeno tak, aby volné difundované sondy nedávaly vzniknout nespecifickým signálům. Ukázalo se, že oligonukleotidové sondy, běžně využívané při hybridizaci in situ, nejsou pro aplikaci v živých buňkách příliš vhodné. Jednak kvůli citlivosti oligonukleotidů ke štěpení nukleasami, a také proto, že se mohou elektrostatickými silami vázat k jaderným proteinům a výrazně tím snižovat afinitu ke komplementární cílové sekvenci. Naopak ideální pro studie v živých buňkách se zdá být použití 2‘-OMethyl RNA sond, které nepodléhají degradaci nukleasami a mají vysokou specifitu. 2‘-O-
38
methyl RNA sondy již byly úspěšně využity pro specifickou detekci různých typů RNA, jako snRNA, tRNA, rRNA, nebo poly(A)RNA. Další možností, avšak dosud pro detekci RNA v živých buňkách netestovanou jsou proteinnukleové kyseliny. Místo cukrfosfátové kostry mají kostru proteinovou, ale stále se řídí WatsonCrieckovými
pravidly
pro
párování
bazí.
Nukleasy je neštěpí a jejich hybridy s RNA jsou Obrázek 12: struktura 2‘-O-
velmi stabilní. Sondy
v podobě
molekulárních
lamp
methyl RNA, převzato z [Dirks 2003]
využívají zhášení fluorescence. Jsou to ssRNA sekvence, které zaujímají konformaci vlásenky, komplementární k cílové RNA. Na jednom konci vlásenky je připojen autofluorescentní molekula, na druhém konci je zhášeč. V roztoku jsou se tyto dvě části nachází blízko u sebe, takže k fluorescenci nedochází. Po hybridizaci s cílovou RNA způsobí konfirmační změna oddálení fluoroforu a zhášeče od sebe a fluorescence se stane pozorovatelnou. Molekulární lampy se uplatňují hlavně v kombinaci s real-time PC, ale jinak je jejich využití omezené. Nevýhodou je častý výskyt nespecifických vazeb sond na proteiny. Vyšší specifitu vazby k cílové sekvenci mohou poskytnout sondy založené na principu fluorescenčního rezonančního transferu energie (FRET). Nutné jsou dvě sondy, tj. dva oligonukleotidy, komplementární k těsně sousedícím sekvencím na cílové RNA. Jeden nese akceptorní fluorofor a druhý donorní fluorofor. Pokud dojde k hybridizaci obou, akceptor a donor se k sobě přiblíží a dojde k fluorescenčnímu rezonančnímu transferu energie, který se měří. Detekce specifických RNA v živých buňkách je však teprve ve svých počátcích a žádá si mnoho zdokonalení. Především úprava složení sond by mohla vést ke zvýšení senzitivity a specifity signálu.
3.9.
TRAP-FISH (tagging and recovery of associated proteins FISH) Tato metoda byla vyvinuta za účelem označit a izolovat chromatin,
nacházející se v těsné blízkosti aktivně transkribovaných genů. Byla využita např. při
39
studiu regulace komplexu genů pro β-globin pomocí vzdáleného zesilovače HS2 [Carter 2002]. Vzorky se nejprve fixují formaldehydem, poté se přidají genově specifické intronové sondy označené digioxygeninem, které přihybridizují k primárním transkriptům.
Fragment
Fab
(fragment
antigen
binding)
protilátky
proti
digioxygeninu konjugovaný s křenovou peroxidázou zajistí vazbou na digioxygenin lokalizaci peroxidázové aktivity výhradně do míst transkripce. Přidá se biotintyramid, jenž se v kontaktu s peroxidázou stává vysoce reaktivním radikálem a kovalentně se váže do míst s elektronovou hustotou, konkrétně na tyroziny ležící v bezprostřední blízkosti. Navázání konjugátu avidin-Texas red na biotin-tyramid umožní pozorovat místa transkripce fluorescenční mikroskopií. Poté je chromatin sonikací rozštípán na fragmenty o průměrné délce 400bp a sekvence pocházející z blízkosti primárních RNA jsou kvantifikovány pomocí PCR nebo Slot blot analýzou.
4. Závěr Genetická informace je v eukaryotickém organismu exprimována odlišně, v závislosti na stádiu jeho vývoje a typu buňky. Regulace genové exprese probíhá na mnoha úrovních, mezi nimiž hrají důležitou roli mechanismy epigenetické regulace, uskutečňované prostřednictvím modifikací buď samotné DNA nebo s ní sdružených proteinů. Tyto procesy, jako methylace DNA, kovalentní modifikace histonů a další, ovlivňují aktivitu genů pomocí změn konformace chromatinu. Stav chromatinu je výsledkem rovnováhy mezi složkami jednotlivých typů epigenetické regulace, tj mezi těmi, které udržují geny umlčené (např. HDACasy, H3K9 methyltransferasy) a těmi, jež podporují transkripční aktivitu (HATasy, H3K4 methyltransferasy). Studium regulačních mechanismů do jisté míry podléhá dostupnosti metod vhodných k vizualizaci jednotlivých komponent epigenetického aparátu v jádře. V současnosti se uplatňují zejména techniky využívající fluorescenčně značených sond, které jsou detekovány fluorescenčním mikroskopem. Ke specifickému zacílení sondy na místo určení dochází při vizualizaci DNA a RNA na principu hybridizace, při vizualizaci proteinů na principu interakce antigen-protilátka. Většina technik je prováděna in situ, tedy ve fixovaných vzorcích buněk či tkání. Tento přístup však 40
nedokáže vyloučit, že během přípravy vzorku nedojde ke změně uspořádání chromatinu nebo vzniku artefaktů. Z tohoto důvodu stále častěji směřuje snaha vědců studovat procesy epigenetické regulace přímo v živých buňkách. V současnosti je již dobře známo, že vlivem deregulace epigenetických mechanismů ve spolupráci s genetickými změnami dochází ke vzniku některých genetických chorob včetně rakoviny. Díky znalostem nabytých studiem regulace genové exprese je možné jednak zjistit konkrétní příčiny onemocnění a na základě toho vyvinout terapeutické strategie, které by mohly vést k obnovení normálního epigenetického stavu. Avšak aby mohlo být dosaženo např. specifického ovlivnění aktivity určitých genů, je třeba ještě mnohem lépe porozumět všem složkám aparátu epigenetické regulace a jejich vzájemné kooperaci. Cílem této bakalářské práce bylo poskytnout přehled nejvíce studovaných typů epigenetické regulace a metod jejich vizualizace. Získané poznatky budou uplatněny při vypracování diplomové práce, která se bude zabývat studiem epigenetických regulačních mechanismů v primárních kulturách leukemických buněk a v kulturách ovlivněných cytostatiky. Práce bude realizována na pracovišti Centra analýzy biomedicínského obrazu, ILBIT 3A, Kamenice 3, Brno (www. fi. muni.cz/lom/ag).
41
5. Seznam použité literatury: 1. Ambion®, The RNA Company (2002). RNA Interference and Gene Silencing - History and Overview. http://www.ambion.com/techlib/ hottopics/rnai/rnai_may 2002_print.html. 2. Bartlett, O., et al. (2006). Specialized transcription factories. In Transcription, pp. 67. PORTLAND PRESS LTD, London. 3. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F. , and Fraser, P. (2002). Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature Genetics 32, 623. 4. Cinti, C., Santi, S. , and Maraldi, N. M. (1993). Localization of Single-Copy Gene by Prins Technique. Nucleic Acids Res. 21, 5799. 5. Cremer, T. , and Cremer, C. (2001). Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nat. Rev. Genet. 2, 292. 6. Cremer, T., et al. (2000). Chromosome territories, interchromatin domain compartment, and nuclear matrix: An integrated view of the functional nuclear architecture. Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 10, 179. 7. Dirks, R. W., Molenaar, C. , and Tanke, H. J. (2003). Visualizing RNA molecules inside the nucleus of living cells. Methods 29, 51. 8. Haukenes, G., Szilvay, A. M., Brokstad, K. A., Kanestrom, A. , and Kalland, K. H. (1997). Labeling of RNA transcripts of eukaryotic cells in culture with BrUTP using a liposome transfection reagent (DOTAP(R)). Biotechniques 22, 308. 9. Hendrich, B. D. , and Willard, H. F. (1995). Epigenetic Regulation of GeneExpression - the Effect of Altered Chromatin Structure from Yeast to Mammals. Hum. Mol. Genet. 4, 1765. 10. Hennig, W. (1999). Heterochromatin. Chromosoma 108, 1. 11. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S. , and Fraser, P. (2005). Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6, 669.
42
12. Cheung, P., et al. (2000). Synergistic coupling of histone H3 phosphorylation and acetylation in response to epidermal growth factor stimulation. Mol. Cell. 5, 905. 13. Jackson, D. A., Hassan, A. B., Errington, R. J. , and Cook, P. R. (1993). Visualization of Focal Sites of Transcription within Human Nuclei. Embo J. 12, 1059. 14. Jaenisch, R. , and Bird, A. (2003). Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics 33, 245. 15. Kurz, A., et al. (1996). Active and inactive genes localize preferentially in the periphery of chromosome territories. J. Cell Biol. 135, 1195. 16. Lachner, M. , and Jenuwein, T. (2002). The many faces of histone lysine methylation. Curr. Opin. Cell Biol. 14, 286. 17. Nielsen, A. L., et al. (2001a). Heterochromatin formation in mammalian cells: Interaction between histones and HP1 proteins. Mol. Cell. 7, 729. 18. Nielsen, S. J., et al. (2001b). Rb targets histone H3 methylation and HP1 to promoters. Nature 412, 561. 19. Osborne, C. S., et al. (2004). Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription. Nature Genetics 36, 1065. 20. Pfeifer, G. P., Steigerwald, S. D., Mueller, P. R., Wold, B. , and Riggs, A. D. (1989). Genomic Sequencing and Methylation Analysis by Ligation Mediated Pcr. Science 246, 810. 21. Raap, A. K. (1997). Overview of Fluorescence In Situ Hybridization Techniques for Molecular Cytogenetics. In Current Protocols in Cytometry, pp. 8.1.1. John Wiley & Sons, Inc. 22. Rice, J. C. , and Allis, C. D. (2001). Histone methylation versus histone acetylation: new insights into epigenetic regulation. Curr. Opin. Cell Biol. 13, 263. 23. Rozsypal, S. (1998). Úvod do molekulární biologie 1, Brno. 24. Sachs, R. K., Vandenengh, G., Trask, B., Yokota, H. , and Hearst, J. E. (1995).
A Random-Walk
Giant-Loop
Model
Chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92, 2710.
43
for
Interphase
25. Spencer, V. A., Sun, J. M., Li, L. , and Davie, J. R. (2003). Chromatin immunoprecipitation: a tool for studying histone acetylation and transcription factor binding. Methods 31, 67. 26. Sun, J. M., Spencer, V. A., Chen, H. Y., Li, L. , and Davie, J. R. (2003). Measurement of histone acetyltransferase and histone deacetylase activities and kinetics of histone acetylation. Methods 31, 12. 27. Szweykowska-Kulinska, Z., Jarmolowski, A. , and Figlerowicz, M. (2003). RNA interference and its role in the regulation of eucaryotic gene expression. Acta Biochim. Pol. 50, 217. 28. Turner, B. M. (2000). Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays 22, 836. 29. van de Corput, M. P. C. , and Grosveld, F. G. (2001). Fluorescence in situ hybridization analysis of transcript dynamics in cells. Methods 25, 111. 30. van Driel, R., Fransz, P. F. , and Verschure, P. J. (2003). The eukaryotic genome: a system regulated at different hierarchical levels. Journal of Cell Science 116, 4067. 31. Yokota, H., Vandenengh, G., Hearst, J. E., Sachs, R. K. , and Trask, B. J. (1995). Evidence for the Organization of Chromatin in Megabase PairSized Loops Arranged Along a Random-Walk Path in the Human G0/G1 Interphase Nucleus. J. Cell Biol. 130, 1239. 32. Zamore, P. D., Tuschl, T., Sharp, P. A. , and Bartel, D. P. (2000). RNAi: Double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101, 25. 33. Zhang, Y. , and Reinberg, D. (2001). Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343. 34. Zink, D., et al. (1998). Structure and dynamics of human interphase chromosome territories in vivo. Human Genetics 102, 241.
44
