Regulace translace REGULACE TRANSLACE PROTEINY A JEJICH POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE. 1. Translační aparát. 2. Translace

Regulace translace

1. Translační aparát 2.

Translace

3.

Proteiny a jejich posttranslační modifikace

4.

Lokalizace bílkovin v buňce a jejich degradace

5.

Translace v mitochondriích a chloroplastech

Aminokyseliny

Ø  Ø  Ø  Ø 

Aminokyseliny = velmi malé biomolekuly, mw. 135 daltonů Jsou stavebními kameny proteinů Kostra aminokyselin určuje primární sekvenci proteinů Vedlejší řetězce určují biochemické vlastnosti proteinů Polární řetězce směřují na povrch proteinu a mohou reagovat s vodným prostředím buňky

REGULACE TRANSLACE PROTEINY A JEJICH POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE

Aminokyseliny

Základní složení všech aminokyselin

1

Proteiny, vytváření polymerních řetězcú

Proteiny– primární struktura

Peptidové vazby: mezi 2 aminokyselinami – 20-30 aminokyselin = peptid vetší počty aminokyselin uspořádaných do vyšších struktur = polypeptid

Primární struktura proteinů – peptidové vazby mezi aminokyselinami

3. Proteiny - primární struktura Peptidové, pevné kovalentní vazby = řetězení aminokyselin určené geneticky

N- a C- terminílní konce jsou ve fyziologickém pH ionizovány R=reaktivní místa = navazování vedlejších řetězců

2

3. Proteiny- sekundární struktura

Bílkoviny, typy vazeb v polymérech Vazby mezi aminokyselinami na základě fyzikálně chemických interakcí

Sekvence aminokyselin – samouspořádávání nascentní bílkoviny

Voda je polárním roztokem

Proteiny - aminokyseliny

Proteiny, typy aminokyselin – hydrofobní

3

Proteiny, typy aminokyselin – hydrofilní a ostatní

Proteiny, typy vazeb v polymérech

Aminokyseliny Alanin Arginin Glutamová kyselina Glutation Glycin Prolin Hydroxyprolin Leucin Methionin Fenylalanin Serin Tryptofan Tyrosin Valin

druhá nejjednoduší, nejčastěji zastoupenou (hydrofobní) často v aktivních místech bílkoviny (basická, hydrofilní) negativně nabitá, na povrchu bílkoviny (kyselá, hydrofilní) podíl na likvidaci volných radikálů nejdnodušší aminokyselina hromadí se za stresu součást stěny buněk tvoří kostru proteinu (hydrofobní) iniciace proteosyntézy, nejméně zastoupenou aminokyselinou nejčastější aromatickou aminokyselinou (velmi hydrofobní) v aktivních místech pro fosforylace velmi málo zastoupena součást stěnových bílkovin drží bílkoviny pohromadě

Proteiny, typy vazeb v polymérech

kovalentní vazba:

jednotlivé aminokyseliny mezi sebou do primární struktury bílkovín

nekovalentní vazba sekundární uspořádávání bílkovin, vazba reversibilní

Reversibilita reakcí:

závisí na rychlostních konstantách reakcí poměr konstant=relativní míra produktů, směr reakce

Vytváření disulfidických vazeb mezi 2 cysteiny

4

Bílkoviny Proteiny

20-30 aminokyselin = peptid vetší počty aminokyselin uspořádaných do vyšších struktur = polypeptid

Bílkoviny = proteiny (z řeckého slova proto = primární důležitost) První popis bílkovin: Berzelius 1838 První důkaz bílkoviny ve funkci enzymu: urea Sumner 1926 První bílkovinná sekvenace: insulin Sanger 1958 První strukturní studie bílkovin: hemoglobin, myoglobin Perutz a Kendrew 1958

Bílkoviny, jejich velikost

Bílkoviny – jejich lokalizace: Zviditelnění GFP

5

Cytochrom - bílkovina není statickou strukturou

Bílkoviny, sekundární uspořádávání

Alfa + beta šroubovice, beta list sekundární uspořádání dáno sekvencí aminokyselin, tvorba vodíkových můstků

Beta list



6

Bílkoviny, terciární a quarterní uspořádávání

Bílkoviny, terciární a quarterní uspořádávání

2 dvoušroubovice spojené smyčkou Motiv typický pro vápník a DNA vazebné bílkoviny

Bílkoviny, terciální a quarterní struktura

1 alfa helix spojen s beta šroubovicí

2 alfa šroubovice ovinuté kolem sebe

Motiv typický pro DNA vazebné bílkoviny

Motiv typický pro transkripční faktory

Bílkoviny, funkční uspořádání a) 

Molekula hemaaglutininu Bílkovina složena ze 3 domén, jako membránová bílkovina Nglykosylována kyselinou sialavou

Myosin je dimer, tvořený 2 identickými těžkými řetězy (bílé) a 4 lehkými řetězy (zelené a modré) b)  trojrozměrný model „hlavové domény“

7

Bílkoviny, jejich pohyb

Bílkoviny, funkční proměnlivost

Calmodulin je bílkovina se 4 šroubovicemi (EF1 – EF4) a v každé z nich je Ca2+ -vazebné místo Při zvýšení koncentrace Ca2+ nad 5 x 10-7 M, se navazuje Ca 2+ na Calmodulin, mění jeho konformaci a Calmodulin se stává funkční bílkovinou ve fosforylaci Model spojující hydrolýzu ATP s pohybem myosinu podél aktinového vlákna

Bílkoviny, funkční proměnlivost Různé podoby struktury Ras, guanin nukleotid-vazebné bílkoviny (bílkovina v inanktivní podobe, s navázaním GDP ( modrá) a)Uhlíková kostra bílkoviny b) Lokalizace všech atomů c) Beta listy (azurová) alfa šroubovive (červená) d) Povrch bílkoviny ve vodném prostředí, pozitivně nabité částice (šedá), negativně nabité (červená)

Bílkoviny, funkční proměnlivost Model katalytické podjednotky kinázy A v uzavřené funkční konformaci „glycin rich“ sekvence „uloví“ ATP ve štěrbině mezi doménami

(b) Schéma otevřené a zavřené konformace v nepřítomnosti substrátu je otevřená, po vazbě substrátu se uzavírá, konformační změny bílkoviny vyvolané vazbou na substrát

8

3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace

Uspořádávání nascentních bílkovin

Cesta od nascentní podoby k správně modifikované, lokalizované a plně funkční bílkovině Nascentní protein – endoplasmatické retikulum Ø  Ø  Ø  Ø 

prostorové uspořádávání postranslační modifikace oligomerizace třídění – translokace – lokalizace

nezbytný podíl chaperonů buněčné kompartmenty májí své chaperony Nestávají se součástí bílkovinné molekuly Nenesou sterickou informaci Konformují bílkoviny tím, že zabraňují nežádoucím interakcím

Uspořádání nascentních bílkovin

chaperony

Proteiny endoplasmatického retikula obsahují chaperony: Ø  Ø  Ø  Ø 

Chaperony:

zvyšují rychlost s jakou proteiny získávají konečnou podobu udržují protein v kompetentním stavu zabraňují nežádoucím interakcím stabilizují proteiny

Chaperony = stresové bílkoviny Ø  část konstitutivního spektra bílkovin buňky Ø  krátkodobě vyšší hladina exprese v určitých fázích ontogenese Ø  rychlá a intezivní exprese za stresu (za 1h stresu až 5% podíl stresových bílkovin) Buňka „pozná a monitoruje“ nepořádek (neuspořádané nebo špatně uspořádané bílkoviny)

nomenklatura chaperonů (HSP) podle molekulové hmotnosti na SDS PAGE (Drosophila) : Eukaryota – 10-35kDa=sHSP 60kDa 70, 90, 110 kDa

skupina I – HsP70 kDa – blokování nežádoucích interakcí mezi aminokyselinami bílkovinného řetězce Skupina II – HsP60 kDa – nezbytná doprovodná součást putování a translokace bílkoviny na místo místo určení Chaperoniny pro Prokaryonta = GroEL + GroES: 60 kDa GroEL uspořádávání bílkoviny odstraňování špatně uspořádané bílkoviny

9

Chaperony a chaperoniny GroEL: komplex 14 identických 60kDa podjednotek GroES: komplex 7 identických 10 kDa podjednotek „tight“ = -ATP+ADP = uzavřená struktura s navázanou bílkovinou „relax“ = +ATP=uvolnění bílkoviny

GroES/GroEL systém

chaperony

HSP70 = regulátor množství a aktivity chaperonů v buňce snížená hladina HSP70 = aktivace HSF (heat shock transkription factor) nestresovaná buňka = HSF inaktivován interakcí s HSP

GroEL+GroES = funkční interakce = stabilní komplex Sílá a stabilita vazby ovlivněna vazbou substrátu- ADP xx ATP GroES nasedá smyčkou tvořenou 20 aminokyselinami nasednutí mění konformaci GroEL a podpoří tak naskládání bílkoviny do cylindru Ø  komplex nasedá jen na nesložené bílkoviny Ø  Ø  Ø  Ø 

Ø  HSP70- stálá ATPázová aktivita (konzervativní oblast molekuly) – ovlivnitelná inhibitory enzymů, Ca ionty a je nezbytná pro uvolnění „doprovázené molekuly“ Ø  jedna bílkovinná molekula se správnou nativní konfiguraci = až 100 ATP

10

Nascentní bílkovina

3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace Ko-translační modifikace bílkovin

Získání translokační kompetence kompetence udělena: Ø  ko-translační N-glykosylací

Ø  skládáním polypeptidu Ø  tvorbou disulfidických vazeb Ø  vytvářením oligomerů Ø  odstraněním signální sekvence

Získání funkčnosti po translokaci


modifikace bílkovin ko-translační nebo post-translační adice nebo delece

Ø  Ø  Ø  Ø 

stabilizují strukturu regulují enzymatické aktivity modifikují strukturu a tím i schopnost translokace slouží pro transport a lokalizaci proteinu v buňce

( pozor na možnost nežádoucích modifikací rekombinantních proteinů v heterologní buňce)

Ø  nelze je odvodit z DNA sekvence Ø  modifikace typu deaminace, acetylace, fosforylace, glykosylace a oxidace mění molekulovou hmotnost proteinu a jsou detekovatelné na elektroforéze (možnost srovnání s nascentním nebo de-modifikovaným proteinem)

3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace N- a C- terminální modifikace = acylace, methylace, amidace Acylace (acetyl-, formyl-, pyroglutamyl-, myristyl-) ochrana proti aminopeptidázám Ø  Acetylace: Ser, Ala, Met na N-konci charakterizuje většinu rozpustných proteinů Ø  Formylace: Met, typická pro prokaryota Ø  Myristylace: modifikace N-terminálního Gly nezbytnou součástí funkčnosti většiny signálních proteinů + membránových proteinů Nejčastější příčinou „zablokování“ N-konce při charakterizaci proteinů N-terminální mikrosekvenací (postupným odbouráváním jednotlivých AMI z N- konce degradací podle Edmana, kdy je třeba volit metodu hmotnostní spektrometrie)

11



N- a C- terminální modifikace = methylace, amidace Methylace Ø  charakteristické pro histony, DNA-vazebné a ribosomální bílkoviny Ø  metylovány jsou alfa-amino skupiny Ala, Met, Lys Ø  často metylace omezeny jen na část proteinové molekuly Ø  specifické metyltransferázy pro jednotlivé bílkoviny Amidace Ø  modifikace AMI na C-terminálním konci



modifikace jednotlivých AMI v celém řetězci prenylace, adenylace, hydroxylace, oxidace, fosforylace, glykosylace Hydroxylace významná u stěnových proteinů – hydroxyproliny (hydroxylace až v stěně)

Fosforylace a glykosylace mají největší podíl na funkčnosti proteinu Ø  Ø  Ø  Ø 

Fosforylace nejvíce zastoupeny O-fosforylace serinu, threoninu, tyrosinu až 1/3 cytosolických bílkovin fosforylována řada klíčových enzymů je funkčních ve formě fosforylované a neaktivní po obsazení téhož tripletu AMI O-glykosylací

12


N-glykosylace

Glykosylace glykoprotein = polypeptid + glykan N- a O-glykosylace, obě rozhodují o funkčnosti proteinů N-glykosylace – glykan připojen na amid kyseliny asparagové: Asn – X – Ser/Thr Ø  ko-translačně = začíná na nascentním proteinu v ER přesně regulovaným procesem Ø  významnou regulační funkci u rostlin, jejich exprese se podílí na nástupu jednotlivých etap ontogenese Ø  N-glykoproteiny nedílnou součástí strukturálních bílkovin stěny buňky 0-glykosylace – glykan připojen na hydroxyl serinu / treoninu Ø  post-translační glykosylace až v Golgi a je reversibilní, cukerným zbytkem glukosaminem

Polyglykanový komplex

= glykosid dolicholdifosfátu dolicholy: polyisoprenoly s řetězcem (n=14-24), tvořené nasycenými jednotkami alfa isoprenolu po navázání dolicholu do membrány je fosfátovým můstkem navázán první glykan tato makroergická vazba umožní vazby s asparaginem nascentní bílkoviny

Ø  C-glykosylace, S-glykosylace – velice řídké

3. Posttranslační modifikace - N-glykosylace I dolichol je dlouhý řetězec isoprenů = polyisoprenoid, výrazně hydrofobní a víc jak jednou smyčkou je zanořen do membrány UDP-aktivované cukry přiváděny do membránového systému pomocí lipidového nosiče dolicholu

3. Posttranslační modifikace bílkovin N-glykosylace N-glykosylace – mnohostupňový proces: Ø  probíhá ko-translačně a UDP-aktivované cukry přiváděny do membránového systému pomocí lipidového nosiče dolicholu Ø  dolichol je dlouhý řetězec isoprenů = polyisoprenoid, výrazně hydrofobní a víc jak jednou smyčkou je zanořen do membrány Ø  po navázání dolicholu do membrány je fosfátovým můstkem navázán první glykan Ø  tato makroergická vazba umožní vazby s asparaginem nascentní bílkoviny Syntéza oligosacharidu začíná na cytosolické straně a pokračuje na straně hrubého ER

13

3. Postranslační modifikace- N-glykosylace II

N-glykosylace – úloha dolicholu

Asn – X – Ser/Thr

N-glykosylace – proměnlivost glykanové struktury

14

3. Postranslační modifikace - N-glykosylace

manozové typy glykoproteinů: man5-9(GlcNAc)2 také u živočišnýcu buněk a u kvasinek komplexní typy glykoproteinů odlišné u rostlin: Ø  neobsahují kyselinu sialovou Ø  vazba xylozy a fukozy na manozovou kostru jen u rostlin a bezobratlých Ø  vazba fukozy je poslední úpravou a neexistuje bez xylozy Ø  vazba xylozy může být jedinou konečnou úpravou


napojení glykanu má: nepřímý účinek Ø  stabilita proteinu Ø  přesnost prostorové orientace Ø  ochrana před agregací Ø  ochrana před proteolyzou Ø  transport buňkou přímý účinek Ø  syntéza biologicky aktivní molekuly = syntéza biologicky Ø  aktivních glykanových anten Výskyt: glykoproteiny buněčné stěny sekreční proteiny Funkce: rozpoznávací, receptorová, signální?


Asn – X – Ser/Thr: napojení oligosacharidového řetězce na nascentní bílkovinu Ø  1. stupeň glykosylace na ER, 2. stupeň v Golgi Ø  2. stupeň = konečná podoba: manozové nebo komplexní typy Ø  Komplexní typy: fukozy, xylozy, (ne kyselinu sialovou) Konečná podoba = anténové glykany

3. Postranslační modifikace - N-glykosylace výskyt a funkce stěnové bílkoviny exprese regulována vývojově, kódovány mnohočetnými genovými rodinami Ø  jejich relativní množství tkáňově a druhově specifické Ø  jsou kotranslačně N-glykosylovány, mají signální peptid Ø  4 hlavní typy: glykoproteiny bohaté na hydroxyprolin (HRPG) glykoproteiny bohaté na prolin (PRPG)

15

3. Postranslační modifikace – typy n-glykoproteinů

3. Postranslační modifikace – typy n-glykoproteinů

stěnové bílkoviny - arabinogalaktany (AGP)

•  molekuly obsahují až 95% glykanových zbytků •  druhově specifická vysoká rozdílnost v relativním obsahu i složení •  repetice Pro(Hyp), Ala, Ser(Tyr) •  funkce nejasná, jeví se jako nespecifická, prostředník mnoha vzájemných vazeb polymerů

Lektiny – glykoprotyeiny bez glykanu Ø  Lokalizovány ve vakuole v „lipidových raftech“ na Golgi Ø  Mají schopnost se vázat na glykany jiných glykoproteinů

Ø  Komplex glykoprotein-lektin- glykolipid = důležitá složka v procesu cell-cell-recognition


3. Postranslační modifikace - N-glykosylace Účinek inhibitoru tunicamycinu = postupná deglykosylace castasnosperminu = „přeglykosylováno“

inhibitory syntézy N-glykoproteinů: inhibice napojení primárního oligosacgaridu TUNICAMYCIN (antibiotikum) DEOXYJIRIMYCIN (alkaloid)

inhibice glukozidázy I a II CASTANOSPERMIN (alkaloid)

inhibice manozidáz SWAINSONIN

(alkaloid)

16

3. Posttranslační modifikace reversilní: O-glykosylace - fosforylace

O-glykosylace a fosforylace:

Ø  Ser/Tre/Tyr Ø  Vratné, rychlé, funkční modifikace

3. Posttranslační modifikace O-glykosylace - fosforylace 1.  2.  3.  4.  5. 

nejčastěji zjištěny 2 molekuly GLcNAc navázány na Ser/Thr polypeptid mnohem stabilnější než glykan O- glykosylace je dynamickým procesem O – a N – glykosylace probíhají zřejmě na stejném místě v cis-Golgi nejznámější příklady: arabinogalaktany proteiny bohaté hydroxyprolinem RNA-polymeráza II (O-glykosylovaná --- fosforylovaná) extensiny: obsahují repetice Ser-(HYP)4 a Tyr-Lys-Tyr lektiny

Glykanové řetězce určují krevní skupiny

17

Regulace translace REGULACE TRANSLACE PROTEINY A JEJICH POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE. 1. Translační aparát. 2. Translace

Recommend Documents