4. Degradace bílkovin
souhrn
Degradace bílkovin probíhá v buce neustále = „celullar housekeeping“ Degradace: 1. odstrauje abnormální, chybné bílkoviny (mutace, chyba v translaci, uspoádávání bílkoviny)
REGULACE TRANSLACE
2. podporuje akumulaci podjednotek u oligomérních bílkovin pro zachování správné stochiometrie 3. udr uje správn kvantitativní pomr mezi enzymem a substrátem 4. hraje klíovou roli v mnoha biologickch procesech – likviduje spou tecí, signální bílkovinu v kaskád dj 5. zásobuje buku aminokyselinami z recyklací
DEGRADACE BÍLKOVIN
4. Degradace bílkovin Degradace - nkolik proteolytickch cest, specifickch pro urit bunn kompartment
4. Degradace bílkovin
souhrn
Proteolytické systémy jednotliv ch bun n ch kompartment – nesou stopy svého fylogenetického v voje Mitochondrie + chloroplasty = prokaryontní buka Vakuola (m e tvoit a 90% obsahu buky) je obdobou lysosomu „Protein body“ v semenech – specializovaná vakuola, reservoár zásobních bílkovin pro první fáze klí ení semen
Nejlépe prostudován degrada ní systém v cytosolu
4. Degradace bílkovin
4. Degradace bílkovin
stabilita bílkovin dána jejich N-terminální sekvencí (Met, Thr, Ser, Gly, Val) nebo postranslaní modifikací typu acetylace
Pidání argininu – „znaka“ pro degradaci
nestabilita bílkovin také urována sekvencí aminokyselin ( Lys, Arg, His, Phe, Tyr, Trp, Leu, Glu)
4. Degradace bílkovin
4. Degradace bílkovin = ubiquitinace
souhrn
souhrn kovalentn navázan ubiquitin (76 AMI) „oznauje“ protein pro následnou degradaci
komplex enzym: • E1 = ubiquitin-aktivaní • E2 = ubiquitin konjuganí • E3 = ubiquitin liganí
1. 2. 3. 4. 5. 6.
protein s degradaním signálem rozpoznán E3 dvma kroky navázán ubiquitin na protein pro degradaci je nutné o navázat 4 ubiquitiny translokace proteinu na místo degradace ubiquitiny uvolnny protein degradován
souhrn 4. Degradace bílkovin
souhrn Ubiquitinace
Regulace translace
1.
Translaní aparát
2.
Translace
3.
Posttranslaní modifikace bílkovin
4.
Lokalizace bílkovin v buce a jejich degradace
5.
Translace v chloroplastech a mitochondriích
REGULACE TRANSLACE TRANSLACE V CHLOROPLASTECH A MITOCHONDRIÍCH
5. Translace v chloroplastech a mitochondriích
5. Translace v chloroplastech a mitochondriích
souhrn
Endosymbiotické organely
Vlastní DNA, mRNA, rRNA, tRNA, ale informa ní obsah nesta í pokr t pot eby organel, 80-90% bílkovin kódováno jadern Iniciace translace prokaryontního typu, bez úpravy 5´UTR mRNA SD sekvence R st a d lení organel v interfázi, není synchronní s d lením bun k, závisí na inkorporaci bun n ch bílkovin a lipid
Chloroplasty
5. Translace v chloroplastech a mitochondriích
souhrn
Chloroplastov genom sekvenován 120 000 – 160 000 pb, v závislosti na druhu 60 000 pb = translaní aparát 20 000 pb = bílkoviny fotosyntetického aparátu Souinnost jadernch a chloroplastovch gen (Rubisco)
Chloroplasty úzká spoluprace jaderné a chloroplastové DNA
chloroplasty
Rubisko:
Rubisko tém 50% celkov ch rozpustn ch bílkovin v listech malá podjednotka je kódována jadernou DNA velká podjednotka je kódována chloroplastovou DNA tRNA: kodována jadern m i chloroplastov m genomem Ribosomy vypl ují obsah chloroplast z víc jak 40% ribosomální bílkoviny: malá podjednotka velká podjednotka chloroplastov genom
12
8
jadern genom
13
25
chloroplasty
chloroplasty Grana = PSII Stroma = PSI, ATPsyntáza Cytochrom b6f = v obou typech mambrán
chloroplasty
chloroplasty
Chloroplasty
chloroplasty – translaní regulace exprese bilkoviny D1
souhrn
D1 bílkovina z komplexu RCII
její exprese je transla n regulována D1 je kódována chl-genem Transkript stále v nadbytku pítomen Pepis transkriptu regulován vazebnou bílkovinou Vazebná bílkovina kódována jadern , exprese regulována sv tlem
první detailní popis transla ní regulace genové exprese v rostlinné bu ce a regulace je píkladem sou innosti jadern ch a chloroplastov ch gen
chloroplasty – translaní regulace exprese bilkoviny D1
chloroplasty – translaní regulace exprese bilkoviny D1
souhrn
D1 bílkovina – polo as rozpadu 30 minut Optimální podmínky: po 30 minutách D1 vyt sn na a lokalizována nová molekula D1 Vysoká ozá enost = pot eba sní ení po tu RCII komplex: 1. Degradace 2. Blokace funkce = po kozená D1 není vyt sn na, ale je fosforylována a v této podob nem e opustit RCII komplex Zm na podmínek = D1 defosforylována, vyt sn na, vstup nové D1 molekuly, = aktivace RCII komplexu Signálem pro transla ní regulaci D1 bílkoviny je ozá enost a ta reguluje: Expresi D1mRNA kódována chloroplastovou DNA Expresi D1mRNA-vazebné bílkoviny (kódována jadern ) Expresi kináz a fosfatáz modujících aktivitu D1 (kódovány jadern )
translaní regulace exprese bilkovi D1
souhrn
chloroplasty, LHCII
souhrn
LHCII = svtlosbrn komplex = anténa pro PSII Jeho funkce regulována fosfyrylací Fosforylace: negativní náboj molekuly LHCII odpoutání se molekuly od hydrofobního povrchu granalních membrán pokles svtelné absorbce do PSII
chloroplasty, organizace cytochromového komplexu PetG, cytf, PetL a PetM = jednovláknová roubovice v membrán Cyt b6, Podjednotka IV = nkolik transmembránovch roubovic
mitochondrie
Mitochondrie
souhrn
mitochondrie = základní organela respirace u eukaryontních bunk biogeneze mitochondrií stále nejasná mitochondrie vykazují heterogenitu morfologickou i funkní (aktivita ADH oxidázy) promnlivé je slo ení lipid a bílkovin heterogenita i ve spektrech bílkovin poet mitochondrií per buka velmi variabilní, ale koncentrace mitochonrií per objem buky mnohem stabilnj í hodnotou poet mitochondrií v rostlinné buce je men í ne v buce ivoi né respiraní rychlost rostlinné buky je vy í V rostlinn ch mitochondriích: existují plazmidy a to integrované i volné, jedno i dvouvláknové RNA voln se replikující
Mitochondrie
souhrn
Mitochondriální DNA (mtDNA) je maternáln (cytoplasmaticky) ddiná Objem DNA druhov charakteristick: lidské 16 000 pb kvasinkové 78 000 pb rostlinné 150 000- 2 500 000 pb
U rostlin více typ mtDNA
Penos mt-gen z mitochondrií do jádra (reverzní transkripce viz psedogeny) Dlouhé nekódující oblasti tRNA u p enice jadern kódován Mutace mt-gen = heteroplasma – problém v bukách i tkáních s vysokm nárokem na dostupnost ATP:
tapetum u rostlin, cytoplasamatická samí sterilita ada záva nch chorob, ischemická choroba srdení
rostlinné mitochondrie
souhrn
1.Translaní aparát- ribosomy
Ribosomální podjednotky: Bakterií (70S), Eukaryot (80S) , Mitochondrií (55S) Velká podjednotka 50S 60S 39S 23S 28S 16S rRNAs 5S 5S 5S 5.8S bílkoviny 33 49 48 Malá podjednotka rRNAs bílkoviny
30S 16S 20
40S 18S 33
28S 12S 29
mitochondrie
translace velmi variabilní délky transkript, sestih, editace ojedinl jev: translace i aberantních transkript a díky patné nebo ádné editaci: nefunkní ribosomální bílkoviny – selekce a na úrovni bílkovin otvírání nov ch tecích rámc ( nedostaten sestih? nedostatená proteázová aktivita?) fosforylace mitochondriálních bílkovin: u savc b ná, má regulaní charakter u rostlin mt kináza nenalezena, nepím m dkazem autofosforylace HSP70 Úloha mitochondrií za stresu: exprese sHSP – aktivace glutation-askorbátového cyklu Úloha mitochondrií v apoptose, mitochondrie = sensor stresu
Alternativní oxidáza – jedinen komplex u rostlin
Mitochondrie
souhrn
mirochondrie: oxidace organick ch látek = oxidativní fosforylace – ATP Pesná organizace penosu elektron v rotlinné mitochondrii komplexy I – IV Ubiquinon (UQ), redukovan ubiquinol (UQH2) voln difundují ve vnitní membrán Penos elektron od dehydrogenázy bu na komplex III nebo na alternatrivní oxidázu
ervená = cesta elektron modrá = translokace proton Pohyb proton pes membrány vytváí protonov elektrochemick gradient ten rozjí dí syntézu ATP z ADP + P pomocí 1TP syntázy
Mitochondrie u rostlin
souhrn
Regulace genové exprese? nebyla nalezen systém regulující exprese mt gen kódujících základní bílkoviny mt komplex (pesn systém pro COX 1 -3 popsána u ivo ich) díky plastidm nezávislé na zdrojích kyslíku a uhlíkat ch látek Známé induk ní podmínky: alternativní oxidáza = stres citrát syntáza = kv tní meristémy Rf2 (jadern kódovan gen) = ovlivn ní funkce b hem zrání pylu
Mitochondrie, funkce alternativní oxidázy
U zralého kv tu se v apendixu aktivuje alternativní oxidáza, Volná energie je uvoln na v podob tepla, teplota se zví z 10 na 25o C, zví se uvol ování „vonnch látek“
rostlinné mitochondrie
Vztah mezi mitochodriemi a plastidy nevye en zm na zavád cí sekvence bílkovin patící do jedné organely naru í translokaci u obou fotosyntéza je závislá na oxidativní fosforylaci mitochondrií zastavení ATP syntázy a tím i oxidativní fosforylace v razn sni ovalo uvol ování kyslíku fotosyntézou
Metody studia bílkovin
P ehled nej ast ji pouívan ch technik
Metody studia bílkovin
Na „intaktních tkáních“, sledování exprese jednotliv ch bílkovin : GFP, imunodetekce Po homogenizaci bunk: Oddlení bílkovin jednotliv ch bunn ch kompartment Vyu ití celé ady metod pro vydlení urité bílkoviny a pro její charakterizaci Homogenizace ( zpsob rozbití bunk, délka homogenizace, volba pufru ) = klíov bod úsp né a reprodukovatelné anal zy
Píprava vzorku- neiontové detergenty
Úloha detergentu pi separaci sekreních protein
Subcelulární frakcionace
ástené peptidové mapy
Dlení bílkovin -SDS PAGE
Identifikace bílkovin Nativní PAGE a následné dlení vysokomolekulárních komplex
Dlení bílkovin – 2D SDS PAGE Identifikace bílkovin - Western blot
Vyuití radioizotop autoradiografie, fluorografie
Identifikace bílkovin indukovanch stresem puls experiment + 2D SDS PAGE fluorografie
Zjitní lokalizace a stability bílkovin pokus pulse-chase
Identifikace bílkovin transkripce-translace, glykosylace a deglykosylace in vitro
Dkuji za pozornost
Doufám e jste si vytvoili pedstavu o syntéze a v znamu bílkovin a e vám to pom e nahlí et na va e v sledky z dal ího horizontu poznání rostlinné buky
