MECHANISMUS DEGRADACE ALIFATICKÝCH POLYESTERŮ
RIGORÓZNÍ PRÁCE
Mgr. Jana Vilímová
UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ TECHNOLOGIE
Školitel: Doc. RNDr. Milan Dittrich, CSc.
Prohlašuji, ţe jsem prezentované výsledky získala samostatně pod vedením školitele. Věškeré zdroje, ze kterých bylo čerpáno, jsem uvedla v seznamu literatury.
Hradec Králové, 9.9. 2010
Mgr. Jana Vilímová
2
Děkuji vedoucímu práce Doc. RNDr. Milanu Dittrichovi, CSc., za odborné vedení při zpracování diplomové práce a poskytování cenných rad.
3
ABSTRAKT
V práci byly studovány některé projevy procesu degradace matric z biodegradabilních nosičů připravených polykondenzační reakcí alifatických αhydroxykyselin, jako je kyselina DL-mléčná a kyselina glykolová, větvených tripentaerytritolem a dipentaerytritolem. Bylo prokázano, ţe eroze je proces, který se liší dobou počáteční diskontinuální fáze (lag-time nebo burst efekt), ve druhé fázi dochází k jejímu zpomalení. Botnání oligomerních a polymerních matric je velmi citlivé na změny parametrů nosiče, matric i kapalného média. Jeho časový průběh se vyznačuje jedním nebo několika extrémy (maximy a minimy). Bylo prokázáno, ţe hodnoty čísla kyselosti značně souvisí s průběhem botnání. Jeho hodnoty těsně korelují s odpovídajícími hodnotami stupně botnání v časové řadě odběru vzorků, coţ je předpokladem k vysvětlení mechanismu pulzního průběhu botnání nosičů.
ABSTRACT
In this thesis some manifestations of matrices degradation were studied. Matrices were prepared from biodegradable carriers synthesized by polycondensation reaction of aliphatic α-hydroxyacids, such as DL-lactic acid and glycolic acid, and of tripentaeryhritol or dipentaerythritol applied as the branching agent. Matrices erosion was revealed as the process which varies by the duration and type of the initial phase of discontinuity (lag-time and burst effect). During second folowing phase proceeds erosion by the slower way. The swelling of the oligomeric and polymeric matrices is very susceptible to changes of parameters of carrier, matrices, and also of liquid medium. The time-course of swelling is characterised by one or more extremes (i.e. maximal and minimal values). It was showed that the acid number values in various time intervals for the taking of matrices samples are in connection with corresponding swelling degree values. It is a prerequisite aspect for the elucidation of the mechanism of pulse time-course of swelling. 4
OBSAH 1.
ÚVOD....................................................................................................................7
2.
TEORETICKÁ ČÁST ............................................................................................8 A. MECHANISMUS BIODEGRADACE ALIFATICKÝCH POLYESTERŮ................................8 2.1 Biodegradabilní polymery ............................................................................8 2.1.1 Syntéza biodegradabilních alifatických polyesterů....................................8 2.1.2 Biodegradace alifatických polyesterů .......................................................9 2.1.2.1 Mechanismy ovlivňující vlastnosti polyesterů a výsledné lékové formy .........................................................................................................9 2.1.2.1.A Botnání .................................................................................... 10 2.1.2.1.B Mechanismus degradace a faktory ovlivňující dobu rozkladu polymerů ................................................................................................... 10 2.1.2.1.B.a Degradace během výroby .................................................. 11 2.1.2.1.B.b Degradace během činnosti ................................................. 12 2.1.2.1.C Eroze ........................................................................................ 13 2.1.2.2 Dalším významným procesem pro uvolňování léčiva z nosiče je difuze ....................................................................................................... 14 2.2 Farmakokinetika a farmakodynamika polyesterů ....................................... 14 2.2.1 Farmakokinetika biodegradabilních polyesterů ....................................... 14 2.2.1.1 Mechanismy uvolňování léčiv ......................................................... 15 2.2.2 Farmakodynamika biodegradabilních polyesterů .................................... 16 2.3 Uţití PLGA a dalších alifatických polyesterů v řízených lékových formách .. .................................................................................................................. 17 2.3.1 Částicové systémy tvořící implantáty ..................................................... 17 2.3.1.1 Nano- a mikročástice....................................................................... 17 2.3.1.2 Nano- a mikrosféry ......................................................................... 18 2.3.1.3 Nano- a mikrokapsuly ..................................................................... 18 2.3.1.4 Liposomy ........................................................................................ 18 2.3.2 Speciální perorálně aplikovaná forma pelety ..........................................18 2.3.3 Úprava vláken jako rezervoárů pro léčiva .............................................. 19 2.3.4 Pegylace jako stabilizace léčiv a úprava povrchu polymerních částic ......19 2.3.5 Novodobé vyuţití polymerních adsorbčních vrstev ................................. 19 2.4 Popis vlastností alifatických polyesterů a jejich následného vyuţití ............ 20 2.4.1 Kyselina polyglykolová, PGA ................................................................ 20 2.4.2 Kyselina polymléčná, PLA ..................................................................... 20 2.4.3 Poly(ε-kaprolakton), PCL ....................................................................... 21 2.4.4 Poly(laktid-ko glykolid), PLGA ............................................................. 21 B. METODY MĚŘENÍ VYUŢITÉ PŘI BIODEGRADACI ALIFATICKÝCH POLYESTERŮ ........ 23 2.5 Alkalimetrie ............................................................................................... 23 2.6 Seznam pouţitých zkratek..........................................................................24
3.
CÍL PRÁCE ......................................................................................................... 25 5
4.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ................................................................................ 26 4.1 POUŢITÉ PŘÍSTROJE A CHEMIKALIE ..................................................................... 26 4.1.1 Chemikalie ................................................................................................ 26 4.1.2 Přístroje ..................................................................................................... 26 4.1.3 Charakteristika pouţitých oligoesterových nosičů ......................................27 4.2 STANOVENÍ STUPNĚ BOTNÁNÍ A STUPNĚ EROZE TESTOVANÉHO NOSIČE ................ 28 4.2.1 Příprava materiálu...................................................................................... 28 4.2.2 Příprava vzorků ......................................................................................... 28 4.2.3 Měření ....................................................................................................... 28 4.2.4 Stupeň botnání ........................................................................................... 29 4.2.5 Stupeň eroze .............................................................................................. 29 4.2.6 Stanovení čísla kyselosti ............................................................................ 29
5.
VÝSLEDKY - TABULKY A OBRÁZKY ........................................................... 31
6.
DISKUSE ............................................................................................................ 49 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7
K TÉMATU PRÁCE .............................................................................................. 49 NOSIČ 1T ..........................................................................................................50 NOSIČ 3T ..........................................................................................................50 NOSIČ 5T ..........................................................................................................51 NOSIČ 2D ..........................................................................................................51 VLIV VELIKOSTI MATRIC Z NOSIČE 3T................................................................. 52 VLIV NOSIČŮ NA CHARAKTERISTIKY DEGRADACE .............................................. 53
7.
ZÁVĚRY ............................................................................................................. 54
8.
SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY ................................................................... 55
6
1.
ÚVOD Polymery jsou velmi rozsáhlou skupinou látek různého charakteru, vlastností a
uţití. Intenzívní výzkum polymerů započal jiţ během druhé světové války, kdy se na něm podílel také významný český vědec Otto Wichterle. Výsledkem byl původní postup syntézy látky polyamid-6, nazývané téţ SILON. Od té doby výzkum syntetických polymerů výrazně pokročil. Důleţitým zlomem byla myšlenka řízené degradace polymerů, která se vyskytla v době, kdy se projevil problém s vysokou stabilitou, a tedy pomalým odbouráváním některých syntetických polymerů. Řízená degradace má pro farmacii nepopiratelný význam, například v implantátech, kde je důleţité mnoţství i načasování probíhajícího uvolnění účinné látky. Samozřejmě biodegradace je ovlivňována řadou dalších faktorů, které přispívají k ovlivnění charakteru polymeru, tj. flexibilitou řetězce, takticitou, krystalinitou, molekulovou hmotností, typy substituentů a v neposlední řadě přidávanými aditivy nebo plnivy. (1) Předmětem nejintenzívnějšího výzkumu jsou v dnešní době převáţně látky odvozené od kyseliny mléčné, hlavně jejího kopolymeru s kyselinou glykolovou, PLGA. Jedinečnost této látky spočívá v její schopnosti plně se metabolizovat v lidském těle. Proto se vyuţívá nejen jako nosič léčiv nebo medium pro růst kmenových buněk, ale také jako chirurgické vlákno. Dalším směrem vyuţití této látky je snaha o obnovení spojení mezi míšními nervovými drahami, kde PLGA vytváří strukturu umoţňující vysokou regeneraci s částečným obnovením původní funkce. Výzkum ale rozšiřuje spektrum vyuţití této látky i jako kultivačního média, např. pro lidské osteoblasty a dokonce funkční plicní tkáň.
7
2.
TEORETICKÁ ČÁST
A.
Mechanismus biodegradace alifatických polyesterů
2.1
Biodegradabilní polymery Výzkum biodegradabilních polymerů byl podnícen snahou o řešení problémů
ţivotního prostředí, které vznikají pouţíváním klasických polymerů s dlouhou dobou rozpadu. Následně se také objevila moţnost jejich vyuţití i v ostatních odvětvích. Hlavní vlastností těchto látek je jejich schopnost se po určité době úplně rozloţit bez hromadění, a to jak v biologických organismech, tak i v okolním prostředí. Proto vzrůstá zájem o jejich pouţití nejen ve farmacii, ale téţ ve zdravotnictví, zemědělství a jinde. Z hlediska vyuţití jsou velmi zajímavé alifatické polyestery. Mezi tyto látky patří kyselina poly(mléčná) (PLA), tzv. polylaktid, kyselina poly(glykolová) (PGA), tzv. polyglykolid a hlavně jejich kopolymer PLGA, dále polykaprolakton, polyalkylkyanoakryláty, polyhydroxyalkanoáty (polyhydroxybutyrát) nebo ţelatina a polysacharidy jako pomocné látky. (2)
2.1.1 Syntéza biodegradabilních alifatických polyesterů Polyestery jsou syntetizovány buď polykondenzací hydroxykyselin, diolů a dikyselin, anebo polymerizací za otevření kruhu. Druhá metoda je výhodná nejen pro kratší reakční čas i mírnější podmínky reakce, ale hlavně pro niţší riziko vzniku nedegradabilních vedlejších produktů. (3, 4) Vzhledem k tématu se budu zabývat hlavně alifatickými polyestery, které jsou vhodnými kandidáty jako nosiče léčiv. Patří sem PLA, PGA a PLGA. Na příkladu kopolymeru PLGA , které se syntetizují polykondenzací kyseliny mléčné a kyseliny glykolové, můţeme názorně sledovat průběh reakce (obr. 1). Další moţnou cestou je polymerace 1,4-dioxan-2,5-dionů, za otevření kruhu, který se skládá ze dvou kyselin mléčných a dvou jednotek kyseliny glykolové (obr. 2). Polymerizace je výrazně ovlivněna výběrem katalyzátoru, který ovlivňuje typ reakce. Nejpouţívanější sloučeninou je oktanoát cínatý, schválený FDA (U. S. Food and Drug Administration). (5) 8
Obr. 1 Polykondenzace glykolové a mléčné kyseliny. (6)
Obr. 2 Polymerizace 1,4-dioxan-2,5-dionů za otevření kruhu. (7)
2.1.2 Biodegradace alifatických polyesterů Jedná se o proces přeměny polyesterů na menší komplexní meziprodukty nebo koncové produkty, vznikající solubilizací, hydrolýzou nebo činností dalších produktů organismu ( např. enzymů). (8) Polymery se mohou v některých případech vlivem stávajících podmínek rozlomit; tím se sníţí integrita materiálů a dochází i k ovlivnění procesu biodegradace. Vytvořené fragmenty mohou být sice odstraněny z místa působení, ale nemusí uţ být odstraněny z těla. Vzniklý problém se řeší hlavně při pouţití těchto látek jako implantátů v krevním řečišti, kde jsou zbytková rezidua nevhodná, tedy i vyuţití PLGA, pro kterou je vznik fragmentů typický. (9) Právě u kopolymeru PLGA sledujeme charakteristické štěpení esterové vazby. Polyester nejdříve nabobtná a poté začíná hydrolytické štěpení. Kaţdé hydrolytické rozštěpení esterové vazby dává vznik koncové karboxylové skupině. Ta má následně moţnost katalyzovat další hydrolýzu esterových vazeb, coţ je typické pro homogenní degradaci. (10)
2.1.2.1
Mechanismy ovlivňující vlastnosti polyesterů a výsledné lékové
formy Pro správné dodání léčiva do cílové tkáně se studuje mechanismus několika procesů, ovlivňujících vlastnosti polyesteru jako nosiče léčivé látky. Z tohoto hlediska je důleţitá rychlost rozkladu biodegradabilního alifatického polyesteru, jenţ sestává ze tří procesů:
9
-botnání polymeru -degradace vazeb mezi polymerními jednotkami v polymerním řetězci -eroze "bulk" polymeru Čím je rychlejší průběh těchto procesů, tím získáváme rychleji biodegradabilní materiál. Zároveň je zde důleţitý proces zajišťující dodání léčiva na místo určení coţ je fyzikální jev difuze. 2.1.2.1.A
Botnání
Pomocí mechanismu botnání polyesterů můţeme kontrolovat uvolňování léčiv z nosiče. Během procesu dochází pomocí difuze ke zvýšenému vychytávání vody polyesterovým řetězcem, ta má vliv na sníţení teploty skelného přechodu polyesteru a ovlivnění pohyblivosti polyesterového řetězce. Léčiva obsaţená uvnitř polyesterové matrix jsou pak rychleji uvolňována v důsledku zvýšené flexibility polyesterů. (11) 2.1.2.1.B
Mechanismus degradace a faktory ovlivňující dobu rozkladu
polymerů Polyesterové materiály jsou během ţivota vystaveny dvěma degradačním stupňům: 1. K první fázi degradace dochází vlivem mechanického stresu, tepla a kyslíku během transformace, formování, extruze, tání, zvlákňování. 2. Druhá fáze degradace se projevuje při úpravě materiálu k určitému typu aplikace, tedy během jejich ovlivnění světlem, kyslíkem, polutanty a speciálními činidly. (12) Polyestery degradují působením různých vnějších nebo vnitřních vlivů. Dále je rozdělujeme podle působení fyzikálních nebo chemických faktorů: Fyzikální faktory:
Světlo Teplo Mechanická deformace
Chemické faktory:
Kyslík Voda 10
Do světelné degradace můţeme zařadit působení jak UV-záření, tak i γ-záření. Pro teplotní degradaci je specifické, ţe kaţdý polyester má svou teplotu skelného přechodu, jinak vliv teploty je zásadní hlavně u nedegradabilních polyesterů. Pro mechanickou degradaci je typické, ţe ovlivňuje všechny druhy polyesterů (biodegradabilní, nedegradabilní), které jsou vystaveny mechanickému stresu (fixní, šicí materiál). Výrazný vliv má také přítomnost iontových léčiv. Při výskytu kyselých léčiv lze očekávat rychlejší hydrolýzu esterových vazeb. V případě bazických léčiv je důleţitá acidobazická rovnováha ( LČ v nadbytku oproti kyselým koncům řetězců vede k zásadité katalýze vazeb esteru, a naopak sniţuje rychlost degradace). (13) Většina biodegradabilních polyesterů obsahuje hydrolyzovatelné a oxidovatelné vazby, materiál je pak náchylnější na teplo a vlhkost a to vytváří z biodegradabilních polyesterů látky, které jsou velmi citlivé na podmínky v průběhu výroby a skladování. 2.1.2.1.B.a
Degradace během výroby
Degradace polyesterů způsobuje změny molekulové hmotnosti, viskoelastických vlastností a následně mechanických vlastností. Tyto změny jsou způsobené kombinací mechanického stresu, tepla a chemických činidel. (14, 15) Pro alifatické polyestery je typická oxidace alifatických jednotek autokatalytickou reakcí. Během transformačního procesu zde dochází k dosaţení kritického bodu ( kdy dojde ke změně skupenství z tekutého na pevné), při kterém je polymer oxidován vzdušným kyslíkem. Tepelná degradace vytváří nízkomolekulární produkty, které významně ovlivňují finální vlastnosti výsledných makromolekul s typickými vinylovými a alkoholovými skupinami. Enzymatické (hydrolytické) štěpení je nejrychlejším a nejvíce škodlivým degradačním procesem způsobujícím významnou redukci molekulové hmotnosti a chemických vlastností polyesterů. (16, 17) Během mechanicko-chemické degradace se tedy projevují určité fyzikální nebo chemické fenomeny. Při procesu tání a transportu můţeme očekávat hlavně chemické fenomeny, projevující se hlavně zvýšenou enthalpií. Naopak během modelování a
11
chladící fáze se projevují fyzikální vlivy, mezi něţ hlavně zařazujeme sdílení toků a prodlouţený tok. a. Teorie sdílení toků je vytvořena pro jednoduchý řetězec a zapletený řetězec s určitým stupněm překáţky. U druhého případu dochází k vytvoření stresu překáţkou, coţ ovlivní propletení řetězce (zauzlí nebo poškodí centrum řetězce) a můţe v závěru ovlivnit jak viskozitu, rychlost, tak i délku řetězce. b. Prodlouţený tok můţe také způsobit štěpení řetězce, ale méně neţ v předchozím případě. Zato je zodpovědný za většinu fenoménů. 2.1.2.1.B.b
Degradace během činnosti
Nejdůleţitější mechanismem biodegradace je chemická degradace, nejčastěji buď hydrolýza, nebo enzymaticko-katalyzovaná degradace. Průběh těchto reakcí je velmi sloţité kontrolovat i předvídat vlivem vysoké variability biologických systémů. V organismu biodegradace zajišťuje dostupnost přirozených biopolyesterů, jako jsou polysacharidy, proteiny (ţelatina, kolagen) a poly(L-hydroxylové kyseliny). Zde je hlavním cílem zkoumání vlivu některých faktorů na chování potenciálních nosičů léčiv (PLGA polymerů). (18) Proto je velmi důleţité znát faktory, které mohou mít vliv na degradaci. Patří sem:
chemická stavba (typ chemické vazby, molekulová hmotnost a její rozloţení) pH, iontová síla, iontová výměna, teplota kopolymerní kompozice re-uptake vody, lipidy, ionty morfologie (vliv popouštění, zmraţení, zbytkové napětí, porozita) přítomnost enzymů
Z hlediska chemické vazby má největší význam na ovlivnění charakteru reakce typ vazby v hlavním řetězci polyesteru, který současně ovlivňuje rozsah hydrolýzy. Dále také působí morfologie, tedy hlavně krystalinita a řetězcová orientace. Příkladem můţe být porovnání molekuly v amorfním prostředí polymerů, v němţ jsou molekuly k
12
působení reaktivních skupin více citlivé neţ v krystalickém prostředí. (Krystalizující polymery nevytvářejí duté struktury). Tyto faktory jsou velmi důleţité právě pro zkoumání vlivů při vmezeření léčiva do nosičového (PLGA) systému v závislosti na jeho hydrofilně lipofilní rovnováze a pro uvolňování daného léčiva ze systému. (19) 2.1.2.1.C
Eroze
Eroze je proces, při kterém dochází nejdříve ke sníţení molekulové hmotnosti, ztrátě mechanických vlastností a nakonec ztrátě hmoty aţ rozpadem tělesa na malé části. Tento proces, který následuje po degradaci, začíná vniknutím vody do polymerního jádra a vlivem působení vody se spouští chemická degradace polyesteru, která v jádře vede k změnám struktury za vzniku pórů uvolňující mono- a oligo-mery. Rozlišují se dva typy erozí:
homogenní heterogenní
Homogenní (objemová) eroze probíhá v případě rovnoměrné hydrolýzy po celém tělese (obr. 3) a tím je zajištěn stejnoměrný projev eroze i v jádře. Je to typické pro polymery obsahující esterové, amidové a etherové skupiny, jako kyselina polymléčná, polyglykolová, poly(ε-kaprolaktát) polyamid, proteiny a celulosa (i její deriváty). Heterogenní (povrchová) eroze se vyskytuje na povrchu tělesa nebo v jeho blízkosti (obr. 3). Začíná v povrchové vrstvě a do tělesa se dostává aţ nakonec. Příkladem jsou poly(orthoester), PAH a některé uhlovodíky. (20) Kinetika eroze je významně ovlivňována jak difuzí vody do tělesa polyesteru, tak i degradační rychlostí esterové vazby. V případě, ţe difuze vody do tělesa je rychlejší neţ degradace vazeb v polyesteru, jedná se o objemovou erozi. Naopak při rychlejším štěpení polyesterových vazeb je situace opačná. Celkově je polyesterová eroze velmi komplexní jev, ovlivňovaný mnoha dalšími procesy (difuze, rozpouštění, difuze mono- i oligomerů a morfologické změny). Je zajímavé, ţe během degradace vytvořené mono- a oligomery nejsou ihned uvolňovány, 13
některé jsou nejdříve převáděny do formy soli (mléčná kyselina), která má odlišné vlastnosti od sloučenin iontového charakteru. Monomery vytvořené degradací jsou schopné krystalizovat i během eroze. (21)
Obr. 3 Schematická ukázka povrchové a objemové eroze. (22)
2.1.2.2 Dalším významným procesem pro uvolňování léčiva z nosiče je difuze Difuze je jedním z nejdůleţitějších transportních mechanismů. Jedná se o pohyb po koncentračním gradientu z místa o větší koncentraci do místa s menší koncentrací. Difuze má také význam při botnání (sníţení teploty skelného přechodu) a erozi (lepší uvolnění léčiva z nosiče). Proces je do značné míry závislý na počátečních podmínkách (jako je koncentrace léčiva uvnitř nosiče, koncentrace léčiva u membrány).Výhodou systému je snadné předpovídání kinetiky (tzv. diffusion controlled drug-delivery systems), nevýhodou je pak přesycení, kdy při vyrovnání koncentrací cílová tkáň uţ nepřijímá další molekuly. (23)
2.2
Farmakokinetika a farmakodynamika polyesterů
2.2.1 Farmakokinetika biodegradabilních polyesterů Pro účinné dodání léčiva do cílové tkáně je důleţitý jak charakter léčiva, tak popř. nosiče, který je vhodný pro jeho transport. Musí být zajištěno uvolnění léčiva za určitý čas, přičemţ nosič má být schopný léčivo ve stanovenou dobu uvolnit. Proto je důleţitá koordinace nosiče s vlastnostmi samotného léčiva (např. permeabilita nosiče s molekulovou hmotností léčiva). Navíc by měl nosič zajistit adekvátní uvolnění léčiva, přizpůsobit se tvarem a podpořit průnik léčiva v dostatečném mnoţství k cílovým buňkám. (24) 14
Obr. 4 Schematické znázornění typů uvolňování léčiva (nepřerušované křivky) a vysledných tkáňových koncentrací (přerušované křivky) (a) pulzní uvolňování (b) konstantní uvolňování (c) kinetika konkávního uvolňování (d) kinetika opakovaného pulzního uvolňování. (25)
Zpoţděné a pulzní uvolňování je vyvinuto individuálně pro kaţdý typ léčiva, vzhledem k denním a nočním biorytmům a fyziologickým funkcím pacienta se jejich význam projevil u potřeby nočního uvolnění stahů průdušek (astmatické záchvaty), u předčasného probouzení nebo u nutnosti opakované denní aplikace (pulzní uvolňování, např. u inzulinu) (obr. 4).
2.2.1.1 a.
Mechanismy uvolňování léčiv
Kontrolované uvolnění difuzí (Diffusion controlled release systems) Léčivo je rozpuštěno nebo dispergováno v matrix. Při kontaktu s cílovou tkání difunduje dovnitř.
b.
Kontrolované uvolnění botnáním (Swelling controlled release systems) Léčivo je v suchém, kompaktním stavu, ale při kontaktu s kapalinou začíná botnat. Poté pomocí difuze vstupuje do cílové tkáně. (26)
c.
Biodegradace (Biodegradation release systems) Nosič je biodegradován a léčivo je uvolněno do matrix. (27) (obr. 5)
15
Obr. 5 Třífázová kinetika uvolnění léčiva z mikročástic PLGA v prostředí fosfátového pufru za určitý čas.
V průběhu tohoto experimentu (Monte Carlo simulations) byly objeveny tři fáze v průběhu uvolňování léčiva z nosiče. První je initial burst, další kinetika podle nultého řádu a poslední fáze je second rapid release typické právě pro PLGA nosiče. Tento model umoţnuje příbliţný odhad chování léčiva vázaného na daný typ polymeru. (28)
2.2.2 Farmakodynamika biodegradabilních polyesterů Zde můţeme hovořit o efektu působení polymerů na cílové tkáně. Z tohoto hlediska je důleţitá jejich biokompatibilita a netoxicita. U PGA a PLGA byl tento parametr splněn uţ před více neţ 30 lety, kdy byli pouţity Dexon (PGA) a Vicryl (LPLGA) v klinické praxi. Odpověď organismu na přítomnost polymerního materiálu jako nosiče léčiva je závislá na fyzikálních a chemických vlastnostech polyesteru (objem, tvar a povrchový charakter), také na samotném léčivu (vlastnostech, mechanismu účinku). Dalším předpokladem je orgánová nebo druhová specifičnost. Testy provedené na zvířatech sice prokázaly přítomnost malé nebo ţádné zánětlivé odpovědi, ale nebyla zkoušena toxicita ani výskyt alergických reakcí. V měkkých tkáních se odpověď na PLA, PGA a PLGA objevuje ve třech fázích. Během první je pozorována zánětlivá reakce s přítomností buněk zánětu ( leukocytů, 16
lymfocytů, plasmatických buněk a monocytů). Druhá fáze je charakteristická akumulací monocytů jako reakcí na přítomnost cizího tělesa. Nejdříve makrofágy fúzují nebo se spojují v obrovské buňky, poté vniknutím fibroblastů dochází k enkapsulaci. Také se tvoří nová síť kapilár (neoangiogeneze), která daný polymer(implantát) obklopuje. Třetí fáze je charakteristická fragmentací implantátu a fagocytozou malých částic makrofágy. Dále dochází k fibrogenezi a další neovaskularizaci a také k posunu resorbovaného polymeru. Doba trvání druhé a třetí fáze závisí na průměru polymerní degradace. Implantáty jsou nakonec úplně resorbovány a odstraněny z tkáně. (29) Cílem farmakodynamiky je zjistit, jakým způsobem reaguje organismus na léčivo a jeho nosič a zajistit co nejvhodnější působení v závislosti na biologických rytmech člověka.
2.3
Užití PLGA a dalších alifatických polyesterů v řízených lékových
formách Při studiu materiálů byla objevena hlavně u PLGA její netoxicita a biokompatibilita, která přinesla další moţnosti pouţití tohoto polyesteru jako implantátu. Tím se otevřela jeho cesta do mnoha oborů: orthodoncie (zubní opravy), chirurgie (šití), traumatologie (opravy fraktur), rekonstrukční chirurgie (vazivová, šlachová rekonstrukce) aj. Prvními látkami pouţitými v řízených lékových formách byly antagonisté narkotik a kontraceptivní hormony. (30) Z hlediska lékových forem jsou pro řízené uvolňování především vyuţívány implantáty, pelety a částicové systémy.
2.3.1 Částicové systémy tvořící implantáty 2.3.1.1
Nano- a mikročástice
Nanočástice mají rozměry pohybující se okolo 100 nm a niţších hodnot. U mikročástic mluvíme o 100 µm. Jsou získávány (ko)polymerizací nebo formulací komplexů elektrostatickými silami za pomoci kationových peptidů či polymerů. (31)
17
2.3.1.2
Nano- a mikrosféry
Pro tyto částice je typické jejich zachycení v polymerní membráně. Jedná se o kombinaci polymeru a léčiva, kde jsou léčiva homogenně rozptýlena v polymerní matrix. U nanosfér je moţné léčivo včlenit nebo přichytit k povrchu. (32)
2.3.1.3
Nano- a mikrokapsuly
Charakteristická je přítomnost vnitřní dutiny, která je obklopena polymerní membránou. To je vhodné zejména pro případy, kdy nechceme, aby došlo k opsonizaci nebo rozpoznání částic fagocyty. Pro lepší zajištění účinku je moţná pegylace. (33)
2.3.1.4
Liposomy
Jedná se o fosfolipidové částice o velikosti kolem 2 μm. Strukturně mají vnější lipidovou vrstvu, tvořenou dvěma lipidovými membránami a vnitřní prostor, do kterého je inkorporováno léčivo. Mají dobrou prostupnost do nádorových tkání, kde právě novotvořené cévy nemají souvislý endotel a postranní pericyty, a průnik do tkání s nefenestrovaným endotelem je naopak ztíţen. Tím se získává potřebná tkáňová specifita, která zajišťuje sníţení neţádoucích účinků v okolních tkáních. (34, 35)
2.3.2 Speciální perorálně aplikovaná forma pelety Jedná se o malé sférické částice o průměru kolem 0,5 - 2,0 nm. Pouţívají se hlavně pro tvorbu násobných ( z více druhů částic sloţených) lékových forem. Do konečné formy je nutné je zpracovat buď lisováním do tablet nebo do naplněné ţelatinové tobolky. Jsou oblíbené pro své výhody: řeší inkompatibilitu dvou a více léčiv v dávce, umoţňují kombinaci několika léčiv, mají ideální tvar pro obalování a mají zjednodušený dávkovací reţim. Hlavním problémem vyuţití těchto léčiv je jejich vysoká cena, daná hlavně sloţitou výrobou. Základem pro výrobu pelety je neaktivní jádro, které se zvlhčí ve fluidním zařízení roztokem léčivé látky. Následně se vyuţívá postup aglomerace (shlukování částic větších rozměrů spojované pomocí vlhčiv), poté se sférické částice za působení odstředivé síly zpracovávají metodou extruze (sféronizace). Konečné obalování probíhá potaţením polymery. (36)
18
2.3.3 Úprava vláken jako rezervoárů pro léčiva Pro šití jsou pouţívána vlákna sloţená především z polyglykolové kyseliny (PGA), jde o lineární alifatický polyester rozsáhle pouţívaný v klinické praxi. Toto PGA šití má obchodní název, DEXON. Působí 2-4 týdny, poté se samovolně rozkládá. Dalším rozsáhle vyuţívaným chirurgickým šicím materiálem je polyglactin 910, známý jako VICRYL, který je sloţený z 90% jednotek z kyseliny glykolové a 10% jednotek z kyseliny L-mléčné. Pouţívá se hlavně v měkkých tkáních, nedoporučuje se však pro srdeční nebo nervovou tkáň. Velmi úspěšná byla úprava vicrylového vlákna, inkorporací léčiva, IGRACARE MP (triklosanu), antibakteriální látky na VICRYL PLUS antibakteriální šití. Inhibují vznik infekce v místě pouţití po chirurgických zákrocích. (37)
2.3.4 Pegylace jako stabilizace léčiv a úprava povrchu polymerních částic Pro pegylaci je typické navázaní léčiva na polyethylenglykol, který výrazně omezuje degradaci látky. Tento mechanismus je vyuţíván u cytostatik, kde zamezuje jejich degradaci v tělní cirkulaci, zaručuje delší poločas vylučování a významně ovlivňuje toxicitu bez sníţení účinku. Pegylují se i liposomální přípravky (př. doxorubicin). Zde se výrazně projevuje omezení rozpoznání a pohlcení léčiva fagocyty. (38)
2.3.5 Novodobé využití polymerních adsorbčních vrstev V dnešní době je vyţadována výrobní technika, která nabízí vysokou kvalitu, moţnost kontroly a řešení rizikových aplikací. Tímto druhem pouţití jsou povrchové úpravy implantovaných umělých částí těla (protéza kyčle, katetry nebo kardiostimulátory), u kterých je potřeba zajistit ochranu před imunitními reakcemi těla. Zároveň jsou tyto filmy upraveny pro vyšší účinnost potahem obsahujícím farmakologická agens nebo růstové faktory. Příkladem můţe být řízené uvolňování steroidů, které zmírňuje vedlejší efekty a sniţuje zánět v rozhraní implantát/tkáň. Polymery PLA, PGA, PCL (polykaprolakton) jsou nejčastěji pouţívanými nosiči léčiv v tkáňové aplikaci. Kopolymery polyesterů s amidy, imidy, urethany, anhydridy a ethery se přípravují pro ovlivnění vlastností a zlepšení kontroly nad průběhem
19
degradace. PCL a jeho kopolymery se osvědčily jako systémy ve formě nano- a mikročástic, polymerních past a micel. (39) Klasickým vyuţitím filmů jsou vnější filmové obaly lékových forem, nejčastěji tablet. Technologický postup u přípravy filmů je nejdříve rozpuštění polymeru v anorganických rozpouštědlech (aceton, chloroform), následné přidání léčiva a odpaření rozpouštědla.
2.4
Popis vlastností alifatických polyesterů a jejich následného
využití 2.4.1 Kyselina polyglykolová, PGA
Obr. 6 Polyglykolová kyselina. (40)
Jedná se o krystalický polymer s teplotou tání okolo 225°C a Tg 36°C. Rozpouští se v běţných polymerních rozpouštědlech. Tato látka má výborné vláknotvořící vlastnosti, komerčně byla představena jako materiál DEXON. Právě nízká rozpustnost a vysoký bod tání omezuje vyuţití PGA jako nosiče léčiv. Z toho hlediska nemůţe být pouţit na tvorbu filmů, tyčinek, kapslí, mikrosfér vyuţívajících rozpouštění nebo tání. (41)
2.4.2 Kyselina polymléčná, PLA
Obr. 7. Polymléčná kyselina. (40)
PLA je tvrdý materiál s určitou elasticitou, který je při pokojové teplotě velmi křehký. Teplota tání se pohybuje v hodnotách 173-178°C a Tg je v rozmezí 60-65°C. Polyester je velmi dobře rozpustný v halogenovaných uhlíkatých sloučeninách, 20
ethylacetátu, tetrahydrofuranu, dioxanu a jiných. Dá se vyuţít jako šicí materiál, transplantáty, kostní šrouby, pláty pro dočasné vnitřní fixace fraktur a v neposlední řádě se stává i nosičem léčiv. (42) Pozornost je věnována kopolymerům PLA s PEG (polyethylglykolem). Přidání PEG má vliv na zvýšení hydrofility a průměru degradace materiálu, tedy jeho ţivotnosti, zároveň vytváří micely. Speciální struktura micel by mohla do budoucna být vhodných nosičem různých druhů léčiv. Příkladem mohou být kontracepční steroidy, narkotická analgetika a antimalarika.
2.4.3 Poly(ε-kaprolakton), PCL
Obr. 8 Polykaprolakton. (40)
Jedná se o látku se semikrystalickými vlastnostmi. Její struktura je charakteristická opakujícími se esterovými jednotkami a pěti methylenovými. Je velice dobře rozpustná ve vodě s teplotou tání mezi 58°-63°C. Syntéza probíhá polymerizací za otevření kruhu, po jejímţ průběhu je charakteristická degradace povrchovou nebo objemovou hydrolýzou esterových spojení, ústících v degradační produkt, kapronovou kyselinu. Ale vzhledem k době degradace, v in vivo podmínkách aţ 2 roky, je PCL kopolymerizována s kolagenem, kyselinou poly(glykolovou), poly(mléčnou) a polyethylen oxidem. Výhodou této látky je právě její snadná kopolymerizace s těmito sloučeninami a následné rozdílné vyuţití v mnoha oblastech. (43)
2.4.4 Poly(laktid-ko glykolid), PLGA
Obr. 9 Poly(laktát-co-glykolová) kyselina. (40)
Jedná se o velmi zajímavou sloučeninu, v praxi nejvíce vyuţívanou sloučeninu, která spojuje vlastnosti PGA a PDLLA vjedno. Vlastnosti jsou odvozeny podle toho, v 21
jakém poměru je ta která sloţka obsaţena, degradace pak závisí na poměru monomerů a podmínkách reakce. Nejčastěji se vyuţívá PLGA obsahující monomery v poměru 50:50. Je výhodným materiálem pro pouţití v tkáňových reparačních systémech, dále jako filmy a nosiče léčiv, kde se nejčastěji vyuţívají ve formě mikrosfér. (44)
Obr. 10 Komerčně vyuţívané PLGA šití, ortopedické fixační prostředky a nosiče léčiv. (45)
22
B.
Metody měření využité při biodegradaci alifatických polyesterů
2.5
Alkalimetrie Pomocí této metody stanovujeme organické kyseliny. V případě, ţe jsou
rozpustné ve vodě, je můţeme titrovat ve vodných roztocích. Slabší kyseliny se však titrují v nevodném prostředí (roztok alkoholu nebo etheru). Zmíněné alifatické polymery podstupují během degradace hydrolýzu, kdy za uvolnění vody vznikají nejdříve estery a následně karboxylová kyselina a alkohol. Právě díky přítomnosti karboxylové skupiny můţeme určit stupeň degradace, a to stanovením čísla kyselosti. Pro určení slabších kyselin musíme nejdříve připravit roztoky kyselin v alkoholu nebo etheru, které zvyšují disociační konstantu látek, a lze je titrovat na fenoftalein. Odměrným roztokem je pak KOH. Jelikoţ jediným odměrným stanovením nelze určit procentuální obsah kyselin ve vzorku, vyuţívá se tzv. číslo kyselosti. Toto číslo udává počet miligramů KOH spotřebovaného k neutralizaci volných kyselin. (46)
23
2.6
Seznam použitých zkratek
D-PLGA
pravotočivá forma PLGA
DL-PLGA
směs pravo- a levotočivé PLGA
KOH
hydroxid draselný
L-PLGA
levotočivá forma PLGA
PCL
polykaprolakton
PDLLA
poly (D-, L-) mléčná kyselina
PEG
polyethylenglykol
PGA
polyglykolová kyselina
PLA
polymléčná kyselina
PLGA
kopolymer kyseliny mléčné a glykolové
24
3.
CÍL PRÁCE
Pro moţné vyuţití nově syntetizovaných polymerních látek jako nosičů léčiv je důleţité rozsáhlé prozkoumání jejich vlastností a vlivů, které mohou určitým způsobem ovlivnit dodání léčiva do cílového orgánu . Cílem experimentálně zaměřené práce bylo rozšířit a doplnit znalosti o průběhu botnání a eroze vybraných oligoesterů a polyesterů alifatických hydroxykyselin s větvenou konstitucí řetězce. Dalším cílem bylo přispět k objasnění mechanismu nerovnováţného botnání matric doprovázeného jejich erozí. Doporučenou metodou byla alkalimetrická titrace roztoků matric odebraných v různých fázích degradačního děje probíhajícího v hydrofilním médiu za konstantní teploty. Získané hodnoty čísla kyselosti byly indikátorem nejen koncentrace koncových karboxylů, ale také číselně střední relativní molekulové hmotnosti Mn. Získané specifické charakteristiky degradačních procesů jednotlivých polyesterů mohou vést k následné optimalizaci syntézy nových polyesterů alifatických hydroxykyselin jako nosičů léčivých látek.
25
4.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
4.1
Použité přístroje a chemikalie
4.1.1 Chemikalie Oligoesterové nosiče, Katedra farmaceutické technologie, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Aceton p.a., Lachema a.s. Destilovaná voda, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Ethanol 96%, Penta Chrudim Hydroxid draselný, p.a., Lachema a.s. Methanol p.a., Lachema a.s. Phenolphtalein, Zdravotnické zásobování, Říčany u Prahy
4.1.2 Přístroje Analytické digitální váhy, KERN ABS (max. 220 g, d = 0,1 mg) Biologický termostat, BT 120, Laboratorní přístroje Praha Digitální váhy, KERN 440-35N (max. 400 g, d = 0,01 g) Horkovzdušná sušárna MEMMERT ULE 400 Magnetická míchačka HEIDOLPH MR 3001 Vakuová sušárna HSPT 200, Memmert
26
4.1.3 Charakteristika použitých oligoesterových nosičů Pouţité oligomery a polymery byly syntetizovány na katedře farmaceutické technologie Farmaceutické fakulty v Hradci Králové. Syntéza probíhala pomocí stupňové kopolymerace ternární směsi sloţené z ekvimolárního podílu kyseliny DL-mléčné a kyseliny glykolové doplněné dipentaerytritolem v koncentraci 2% nebo tripentaeythritolem v koncentraci 1%, 3% nebo 5%. Nosič
Mn
Mw
Mw/Mn
MP
Mz
Mz+1
ΔCp
Tg
g΄
1T
2877
12035
4,18
16849
26284
41062
0,656
25,3
0,42
3T
3355
13334
3,97
9074
27152
43224
0,508
21,7
0,31
5T
3016
8555
2,84
6379
15025
22625
0,471
17,2
0,34
2D
2645
6174
2,33
6287
9271
12391
1,618
17,9
0,52
Tab. 1: Charakteristiky testovaných oligoesterových nosičů. (47)
Pouţité symboly: D
dipentaerythritol
T
tripentaerythritol
Mn
číselně střední relativní molekulová hmotnost
Mw
hmotnostně střední relativní molekulová hmotnost
Mw/Mn
stupeň polydisperzity
MP
pík relativní molekulární hmotnosti
Mz
charakteristika frakce velkých molekul ve vzorku
Mz+1
charakteristika úzké frakce extrémně velkých molekul ve vzorku
ΔCp
tepelná kapacita v J.K-1.g-1
Tg
teplota skelného přechodu ve °C
g΄
index větvení molekul 27
4.2
Stanovení stupně botnání a stupně eroze testovaného nosiče
4.2.1 Příprava materiálu Úkolem bylo připravit matrice ze čtyř druhů polymerů, 1T, 3T, 5T, 2D. Pracovalo se s ţiletkou a kladívkem, kterými se tvrdé polymery rozrušovaly. Následně se váţily na digitálních vahách. Výsledná hmotnost se pohybovala kolem 150 mg ± 5 % a u polymeru 3T byly vytvořeny vzorky o hmotnosti 1g pro porovnání. Důleţitým faktorem v průběhu práce bylo vzhledem k hygroskopičnosti materiálu suché prostředí.
4.2.2 Příprava vzorků Byla připravena prázdná lahvička označená typem polymeru v ní umístěného, aby mohla být zváţena na analytických vahách. Získaná hodnota byla zapisována jako mx. Následně se do lahvičky vloţil přesně naváţený polymer a po dalším zváţení s lahvičkou se hodnota napsala jako (mx + mo). Do lahviček s polymery o hmotnosti 150mg, bylo nalito 15 ml čištěné vody, k polymeru (1g) se přidalo 80 ml vody, poté byly uzavřeny a vloţeny do termostatu vytopeného na 37°C.
4.2.3 Měření Pro kaţdý polymer byly nastaveny intervaly měření po1, 3, 7, 14, 21 a 28 (1g) dnech od přidání vody (kromě prvního dne, kdy se voda nepřidávala). Od kaţdého polymeru byly vytvořeny dva vzorky. Po vyndání lahvičky s polymerem se slilo vodné medium. Vzorek byl poté vysušen pomocí vatového tamponu a dosušen fénem, ale jen mírně, aby nedošlo k ovlivnění vlastností vzorku. Lahvička byla zváţena, naměřené hodnoty byly označeny jako (mx+mb). Poté byla lahvička zase navrácena do sušárny, kde se sušila při teplotě 70°C po dobu jednoho dne. Po vyndání byla lahvička zase zváţena a hodnoty byly zapsány (mx+ms). Postup se opakoval u kaţdého vzorku. Z těchto hodnot se velmi dobře vypočítaly stupně eroze i botnání.
28
4.2.4 Stupeň botnání B= B
stupeň botnání
mb
hmotnost zbotnalého tělíska (g)
ms
hmotnost vysušeného tělíska (g)
4.2.5 Stupeň eroze E = (1 -
) . 100
E
stupeň eroze (%)
mo
počáteční hmotnost tělíska (g)
ms
hmotnost vysušeného tělíska (g)
4.2.6 Stanovení čísla kyselosti Nejdříve se připravil roztok hydroxidu draselného rozpuštěním 5,6110 g KOH v methanolu ve 2000 ml odměrné baňce. Koncentrace byla stanovena jako 0,05 mol/l. Následně byl připraven roztok fenoftaleinu, kdy se 1,00 g látky rozpustil v 80 ml 96% ethanolu a doplnil se do objemu 100,00 ml destilovanou vodou. Poté byl vzorek vyndán z termostatu a po zváţení rozpuštěn v 5 ml acetonu. Po přikápnutí fenoftaleinu se vloţilo do kádinky magnetické míchadlo a spustila se magnetická míchačka. Po zanoření byrety naplněné titrovacím roztokem KOH se titrovalo aţ do prvního růţového zbarvení roztoku, který si udrţel barvu minimálně 5 sekund. Spotřeba se označila jako VKOH.
29
Číslo kyselosti: x=
KOH
x
číslo kyselosti
mo
počáteční hmotnost (g)
VKOH
spotřeba odměrného roztoku KOH (l)
30
5. VÝSLEDKY - TABULKY A OBRÁZKY Tab. 2: Hodnoty získané při měření polymeru 1T: ....................................................... 33 Tab. 3: Časový průběh stupně eroze nosiče 1T: ........................................................... 33 Tab. 4: Průběh stupně botnání nosiče 1T: .................................................................... 33 Tab. 5: Časový průběh čísla kyselosti nosiče 1T: ......................................................... 33 Tab. 6: Hodnoty získané při měření polymeru 3T: ....................................................... 34 Tab. 7: Časový průběh stupně eroze nosiče 3T: ........................................................... 34 Tab. 8: Časový průběh stupně botnání nosiče 3T: ........................................................ 34 Tab. 9: Časový průběh čísla kyselosti nosiče 3T: ......................................................... 34 Tab. 10: Hodnoty získané při měření nosiče 5T: .......................................................... 35 Tab. 11: Časový průběh stupně eroze nosiče 5T: ......................................................... 35 Tab. 12: Časový průběh stupně botnání nosiče 5T: ...................................................... 35 Tab. 13: Časový průběh čísla kyselosti nosiče 5T: ....................................................... 35 Tab. 14: Hodnoty získané při měření nosiče 2D: .......................................................... 36 Tab. 15: Časový průběh stupně eroze nosiče 2D: ......................................................... 36 Tab. 16: Časový průběh stupně botnání nosiče 2D: ...................................................... 36 Tab. 17: Časový průběh čísla kyselosti nosiče 2D: ....................................................... 36 Tab. 18: Hodnoty získané při měření nosiče 3T (1g): ................................................... 37 Tab. 19: Časový průběh stupně eroze nosiče 3T (1g): .................................................. 37 Tab. 20: Časový průběh stupně botnání nosiče 3T (1g): ............................................... 37 Tab. 21: Časový průběh stupně botnání nosiče 3T (1g): ............................................... 37 Tab. 22: Časový průběh pro průměrné hodnoty eroze u nosičů 1T, 3T, 5T, 2D a 3T (1g): 38 Tab. 23: Časový průběh pro průměrné hodnoty botnání u nosičů 1T, 3T, 5T, 2D a 3T (1g): ............................................................................................................................ 38 Tab. 24: Časový průběh pro průměrné hodnoty čísla kyselosti u nosičů 1T, 3T, 5T, 2D a 3T (1g): ....................................................................................................................... 38 Obrázek 1: Eroze nosiče 1T ......................................................................................... 39 Obrázek 2: Botnání nosiče 1T...................................................................................... 39 Obrázek 3: Číslo kyselosti nosiče 1T ...........................................................................40 31
Obrázek 4: Eroze nosiče 3T ......................................................................................... 40 Obrázek 5: Botnání nosiče 3T...................................................................................... 41 Obrázek 6: Číslo kyselosti nosiče 3T ...........................................................................41 Obrázek 7: Eroze nosiče 5T ......................................................................................... 42 Obrázek 8: Botnání nosiče 5T...................................................................................... 42 Obrázek 9: Číslo kyselosti nosiče 5T ...........................................................................43 Obrázek 10: Eroze nosiče 2D ...................................................................................... 43 Obrázek 11: Botnání nosiče 2D ................................................................................... 44 Obrázek 12: Číslo kyselosti nosiče 2D ......................................................................... 44 Obrázek 13: Eroze nosiče 3T (1g) ............................................................................... 45 Obrázek 14: Botnání nosiče 3T (1g) ............................................................................ 45 Obrázek 15: Číslo kyselosti nosiče 3T (1g) .................................................................. 46 Obrázek 16: Průměr eroze nosičů 1T, 3T, 5T, 2D a 3T(1g) ..........................................46 Obrázek 17: Průměr botnání nosičů 1T, 3T, 5T, 2D a 3T(1g) ......................................47 Obrázek 18: Průměr čísla kyselosti nosiče 1T, 3T, 5T, 2D a 3T(1g)............................. 47 5.1 Vysvětlivky ...........................................................................................................48
32
Tab. 2: Hodnoty získané při měření polymeru 1T: Polymer 1T: VELIČINA
DNY
VZOREK
1
3
7
14
21
m
A
0,1592
0,1590
0,1516
0,1554
0,1535
m0 [g]
B
0,1502
0,1595
0,1563
0,1374
0,1524
mb [g]
A
0,1697
0,1853
0,1652
0,0690
0,0200
mb [g]
B
0,1556
0,1604
0,1685
0,0548
0,0257
ms [g]
A
0,1609
0,1609
0,1364
0,0616
0,0184
ms [g]
B
0,1513
0,1412
0,1421
0,0509
0,0183
VKOH [ml]
A
2,0900
2,9400
3,7100
1,8700
0,4100
VKOH [ml]
B
1,9600
2,6800
3,3200
1,4000
0,5300
Tab. 3: Časový průběh stupně eroze nosiče 1T: VZOREK [%]
DNY 1
3
7
14
21
A
101,07
101,19
89,97
39,64
11,97
B
100,73
110,34
90,91
37,05
12,01
průměr 1T
100,90
105,77
90,44
38,35
11,99
Tab. 4: Průběh stupně botnání nosiče 1T: VZOREK [%]
DNY 1
3
7
14
21
A
5,47
15,16
21,15
12,01
8,70
B
2,84
13,60
18,58
7,66
40,44
průměr 1T
4,16
14,38
19,87
9,84
24,57
Tab. 5: Časový průběh čísla kyselosti nosiče 1T: VZOREK [%]
DNY 1
3
7
14
21
A
13,13
18,49
24,47
12,03
2,67
B
13,05
19,21
21,24
10,19
3,48
průměr 1T
13,09
18,85
22,855
11,11
3,075
33
Tab. 6: Hodnoty získané při měření polymeru 3T: Polymer 3T: VELIČINA
VZOREK
m
DNY 1
3
7
14
21
A
0,1588
0,1587
0,1541
0,1003
0,1563
m0 [g]
B
0,1539
0,1455
0,1571
0,092
0,1541
mb [g]
A
0,1646
0,1776
0,1758
0,1131
0,0596
mb [g]
B
0,1596
0,1585
0,2035
0,1103
0,0667
ms [g]
A
0,1599
0,1604
0,1517
0,0850
0,0387
ms [g]
B
0,1556
0,1475
0,1562
0,0761
0,0457
VKOH [ml]
A
1,6000
2,3700
3,2500
1,6200
0,7000
VKOH [ml]
B
1,4800
2,2300
3,7400
1,4600
0,7300
Tab. 7: Časový průběh stupně eroze nosiče 3T: VZOREK [%]
DNY 1
3
7
14
21
A
100,69
101,07
98,46
84,78
75,24
B
101,10
101,37
96,56
82,56
70,34
průměr 3T
100,90
101,22
97,51
83,67
72,79
Tab. 8: Časový průběh stupně botnání nosiče 3T: VZOREK [%]
DNY 1
3
7
14
21
A
2,94
10,72
15,89
33,06
54,01
B
2,57
7,46
30,28
44,94
45,95
průměr 3T
2,76
9,09
23,09
39,00
49,98
Tab. 9: Časový průběh čísla kyselosti nosiče 3T: VZOREK [%]
DNY 1
3
7
14
21
A
10,08
14,93
21,52
10,20
4,48
B
9,62
15,33
23,81
10,08
4,74
průměr 3T
9,85
15,13
22,665
10,14
4,61
34
Tab. 10: Hodnoty získané při měření nosiče 5T: Polymer 5T: VELIČINA
DNY
VZOREK
1
3
7
14
21
m
A
0,1550
0,1513
0,1465
0,1396
0,1584
m0 [g]
B
0,1557
0,1514
0,1592
0,1468
0,1456
mb [g]
A
0,1657
0,1662
0,1805
0,1097
0,0768
mb [g]
B
0,1634
0,1705
0,1934
0,1033
0,1022
ms [g]
A
0,1561
0,1521
0,1350
0,0877
0,0609
ms [g]
B
0,1569
0,1508
0,1455
0,0909
0,0531
VKOH [ml]
A
1,4200
2,0600
2,3700
1,0900
0,6600
VKOH [ml]
B
1,4700
1,9600
3,0000
1,1900
0,6400
Tab. 11: Časový průběh stupně eroze nosiče 5T: VZOREK [%]
DNY 1
3
7
14
21
A
100,71
100,53
92,15
62,82
38,45
B
100,77
99,60
91,39
61,92
36,45
průměr 5T
100,74
100,07
91,77
62,37
37,45
Tab. 12: Časový průběh stupně botnání nosiče 5T: VZOREK [%]
DNY 1
3
7
14
21
A
6,15
9,27
33,70
25,09
26,11
B
4,14
13,06
32,92
13,64
92,43
průměr 5T
5,15
11,17
33,31
19,37
59,27
Tab. 13: Časový průběh čísla kyselosti nosiče 5T: VZOREK [%]
DNY 1
3
7
14
21
A
9,16
13,62
16,18
7,81
4,17
B
9,44
12,95
18,84
8,11
4,40
průměr 5T
9,3
13,285
17,51
7,96
4,285
35
Tab. 14: Hodnoty získané při měření nosiče 2D: Polymer 2D: VELIČINA
DNY
VZOREK
1
3
7
14
21
m
A
0,1595
0,1439
0,1532
0,1444
0,1581
m0 [g]
B
0,1542
0,1517
0,1563
0,1497
0,1583
mb [g]
A
0,1748
0,1682
0,1055
0,0728
0,0337
mb [g]
B
0,1676
0,1822
0,1062
0,0620
0,0054
ms [g]
A
0,1461
0,1185
0,0986
0,0342
0,0121
ms [g]
B
0,1377
0,1251
0,0980
0,0381
0,0075
VKOH [ml]
A
4,7900
2,7800
2,5700
0,8200
0,2900
VKOH [ml]
B
3,3400
2,7500
2,6000
0,8700
0,2300
Tab. 15: Časový průběh stupně eroze nosiče 2D: VZOREK [%]
DNY 1
3
7
14
21
A
91,60
82,35
64,36
23,68
7,65
B
89,30
82,46
63,08
25,45
4,74
průměr 2D
90,45
82,41
63,72
24,57
6,20
Tab. 16: Časový průběh stupně botnání nosiče 2D: VZOREK [%]
DNY 1
3
7
14
21
A
19,64
41,94
7,00
112,87
178,51
B
21,71
45,64
8,37
62,73
-28,00
průměr 2D
20,68
43,79
7,69
87,80
75,26
Tab. 17: Časový průběh čísla kyselosti nosiče 2D: VZOREK [%]
DNY 1
3
7
14
21
A
30
19,32
16,78
5,68
1,83
B
21,66
18,13
16,63
5,81
1,45
průměr 2D
25,83
18,725
16,705
5,745
1,64
36
Tab. 18: Hodnoty získané při měření nosiče 3T (1g): Polymer 3T (1g): VELIČINA
VZOREK
m
DNY 1
3
7
14
21
28
A
1,1062
0,9403
1,0336
1,0705
0,9379
1,0962
m0 [g]
B
0,9879
1,0477
1,0866
0,9674
0,9135
0,8796
mb [g]
A
1,1227
0,9921
1,2383
0,8042
0,3650
0,1615
mb [g]
B
1,0188
1,1399
1,2291
0,6840
0,2679
0,0982
ms [g]
A
1,1135
0,9529
1,0576
0,6987
0,2887
0,1379
ms [g]
B
0,9975
1,0635
1,1166
0,6062
0,2598
0,0982
VKOH [ml]
A
8,1400
11,9200
13,8600
16,5000
5,3500
2,2900
VKOH [ml]
B
9,2000
12,5500
19,1000
14,6000
4,4700
2,0400
Tab. 19: Časový průběh stupně eroze nosiče 3T (1g): VZOREK [%]
DNY 1
3
7
14
21
28
A
100,66
101,34
102,32
65,27
30,78
12,59
B
100,97
101,51
102,76
62,66
28,44
11,16
průměr 3T
100,82
101,43
102,54
63,97
29,61
11,88
Tab. 20: Časový průběh stupně botnání nosiče 3T (1g): VZOREK [%]
DNY 1
3
7
14
21
28
A
0,83
4,11
17,08
15,10
26,43
17,11
B
2,14
7,18
10,08
12,83
3,12
0,00
průměr 3T
1,49
5,65
13,58
13,97
14,78
8,56
Tab. 21: Časový průběh stupně botnání nosiče 3T (1g): VZOREK [%]
DNY 1
3
7
14
21
28
A
7,36
12,68
13,71
15,41
5,70
2,09
B
9,31
11,99
17,58
15,09
4,03
2,32
průměr 3T
8,335
12,335
15,645
15,25
4,865
2,205
37
Tab. 22: Časový průběh pro průměrné hodnoty eroze u nosičů 1T, 3T, 5T, 2D a 3T (1g): VZOREK [%]
DNY 1
3
7
14
21
průměr 1T
100,90
105,77
90,44
38,35
11,99
průměr 3T
100,90
101,22
97,51
83,67
72,79
průměr 5T
100,74
100,07
91,77
62,37
37,45
průměr 2D
90,45
82,41
63,72
24,57
6,20
průměr 3T
100,82
101,43
102,54
63,97
29,61
Tab. 23: Časový průběh pro průměrné hodnoty botnání u nosičů 1T, 3T, 5T, 2D a 3T (1g): VZOREK [%]
DNY 1
3
7
14
21
průměr 1T
4,16
14,38
19,87
9,84
24,57
průměr 3T
2,58
8,69
13,43
11,92
22,79
průměr 5T
3,37
11,54
16,65
10,88
23,68
průměr 2D
20,68
43,79
7,69
87,80
75,26
průměr 3T
1,49
5,65
13,58
13,97
14,78
Tab. 24: Časový průběh pro průměrné hodnoty čísla kyselosti u nosičů 1T, 3T, 5T, 2D a 3T (1g): DNY VZOREK [%] 1
3
7
14
21
průměr 1T
13,09
18,85
22,86
11,11
3,08
průměr 3T
9,85
15,13
22,67
10,14
4,61
průměr 5T
9,30
13,29
17,51
7,96
4,29
průměr 2D
25,83
18,73
16,71
5,75
1,64
průměr 3T
8,34
12,34
15,65
15,25
4,87
38
Obrázek 1: Eroze nosiče 1T
Obrázek 2: Botnání nosiče 1T
39
Obrázek 3: Číslo kyselosti nosiče 1T
Obrázek 4: Eroze nosiče 3T
40
Obrázek 5: Botnání nosiče 3T
Obrázek 6: Číslo kyselosti nosiče 3T
41
Obrázek 7: Eroze nosiče 5T
Obrázek 8: Botnání nosiče 5T
42
Obrázek 9: Číslo kyselosti nosiče 5T
Obrázek 10: Eroze nosiče 2D
43
Obrázek 11: Botnání nosiče 2D
Obrázek 12: Číslo kyselosti nosiče 2D
44
Obrázek 13: Eroze nosiče 3T (1g)
Obrázek 14: Botnání nosiče 3T (1g)
45
Obrázek 15: Číslo kyselosti nosiče 3T (1g)
Obrázek 16: Průměr eroze nosičů 1T, 3T, 5T, 2D a 3T(1g)
46
Obrázek 17: Průměr botnání nosičů 1T, 3T, 5T, 2D a 3T(1g)
Obrázek 18: Průměr čísla kyselosti nosiče 1T, 3T, 5T, 2D a 3T(1g)
47
5.1 Vysvětlivky m0
počáteční hmotnost tělesa
mb
hmotnost zbotnalého tělesa
ms
hmotnost vysušeného tělesa
VKOH spotřeba odměrného roztoku KOH A, B
opakování vzorku
48
6.
DISKUSE
6.1
K tématu práce Na katedře farmaceutické technologie jsou jiţ dvacet let syntetizovány a
vyuţívány k formulaci potenciálních léků oligoestery a polyestery alifatických hydroxykyselin. Ty jsou zvláště výhodné pro daný účel jednak z hlediska postupů přípravy, jednak z hlediska formulace medikovaných systémů produkty polykondenzační reakce s vícesytnými alkoholy, které se vyznačují zvýšenou koncentrací koncových skupin s převaţujícím podílem hydroxylů. Větvená konstituce molekuly hvězdicovitého typu má výhodné parametry degradace, především kontinuální erozi a niţší stupeň botnání. Mechanismus degradace je smíšený s výrazným podílem heterogenní a je výhodný především z hlediska zachování integrity degradujícího tělesa. Při studiu průběhu procesu botnání byly zjištěny některé zajímavé projevy, především unimodální aţ trimodální průběh. Příčina jevu spontánního pulzního botnání byla studována, většina předpokladů o moţných příčinách se nepotvrdila. Předloţená práce se zaměřila na potvrzení nebo vyvrácení hypotézy o vlivu měnící se koncentrace koncových skupin v matrici na průběh botnání z hlediska reálné moţnosti jeho osmotického mechanismu a vlivu obstrukčních jevů na difúzi a na rychlost difúze degradací vzniklých osmoticky aktivních molekul. Pro daný účel byly vybrány čtyři oligomerní a polymerní nosiče, které se lišily středními hodnotami molekulové hmotnosti (hodnoty Mw od 6200 do 13 300), polydisperzitou velikostí molekul (od 2,33 do 4,18), stupněm větvení (g´od 0,31 do 0,52) a enthalpickými parametry (Tg od 17,2 °C do 25,3 °C). Tři nosiče se lišily pouţitou koncentrací tripentaerythritolu (od 1% do 5%), jeden byl syntetizován z 2% dipentaerythritolu. Tělíska měla hmotnost 150 mg, u nosiče 3T byla testována ještě tělíska hmotnosti 1000 mg. Byl studován průběh hodnot stupně eroze a stupně botnání po téměř celou nebo významnou dobu degradace tělísek. Časový profil hodnot byl srovnán s průběhem hodnot čísla kyselosti stanovených destrukční zkouškou titrace roztoků z testovaných tělísek odebraných a rozpuštěných k analýzám ve stejných intervalech jako byly intervaly ke stanovení stupně eroze a stupně botnání.
49
6.2
Nosič 1T Polyester byl syntetizován s 1% tripentaerytritolem. Při dokonalém větvení by se
jednalo o hvězdicovitou konstituci. Při nízké koncentraci větvící sloţky byl tento stav dosaţen v menším rozsahu, o čemţ svědčí hodnota stupně větvení 0,42 a relativně vyšší teplota skelného přechodu 25,3 °C. Vzorek byl značně polydisperzní s relativně vysokou hodnotou Mw, která byla 12 000. Průběh eroze 150 mg matric z nosiče 1T je na obr. 1. Začíná aţ po několika dnech , její rychlost je v intervalu do 10. dne vyšší, potom se mírně sniţuje. Za 21 dní zbývala necelá pětina neerodovaného tělesa. Botnání (obr. 2) má unimodální průběh s výrazným maximem kolem 7. dne působení vody jako média. Pozoruhodný je odlišný průběh po 12. dnu. U jednoho vzorku pokračuje sniţování stupně botnání, u druhého byl zjištěn prudký nárůst charakteristiky. Na obr. 3 je časová řada hodnot čísla kyselosti. Obě křivky jsou výrazně unimodální, poloha extréma je stejně jako u botnání v blízkosti intervalu odběrů 7. dne, kdy erodoval velmi malý podíl matrice. To tedy znamená, ţe v době kolem 7. dne působení hydrofilního média je v matrici nejvyšší koncentrace koncových karboxylů. Z uvedeného plyne, ţe botnání je v této fázi řízeno do značné míry osmotickými jevy. Sniţování stupně botnání je patrně způsobeno difuzí nízkomolekulárních ve vodě rozpustných oligomerů z matrice do jejího okolí.
6.3
Nosič 3T Po přidání tripentaerytritolu v 3% koncentraci do reakční směsi při
polykondenzaci byla dosaţena relativně vysoká molekulová hmotnost polyesteru, Mw bylo 13 300, polydisperzita byla vysoká, kolem 4,00. Nosič 3T měl ze všech testovaných nejvyšší stupeň větvení, hodnota g´ byla 0,31 (tab.1). Eroze probíhala relativně pomalu (obr. 4), začala asi za 4 dny v prostředí vody, za 21 dní byl nalezen přibliţně čtvrtinový úbytek hmotnosti polymeru vlivem eroze tělesa. Na obr. 5 je zaznamenán průběh hodnot stupně botnání. Do 21. dne bylo zjištěno progresívní zvyšování hodnot.
50
Hodnoty čísla kyselosti se stejně jako u nosiče 1T měnily v časové řadě s maximem kolem 7. dne. Znamená to tedy, ţe v tomto případě přírůstek a následný úbytek koncových hydroxylů v matrici neměl vliv na změny ve stupni botnání matric. Střední hodnota molekulové hmotnosti byla dostatečně vysoká, aby vytvářela strukturu, která je dostatečně odolná ke kolapsu vlivem poklesu osmotického tlaku po úniku malých molekul vzniklých degradací z matric do média. Číslo kyselosti se v průběhu degradace u matric z 1T a 3T příliš nelišilo (obr. 3 vs. obr. 6). Další odlišností matric z obou polymerů je velikost tělísek. Větší rozměr tělísek z polyesteru 3T vedl k jejich větší odolnosti proti objemovému kolapsu.
6.4
Nosič 5T Nosič obsahoval relativně vysoký podíl tripentaerythritolu, coţ se odrazilo
v markantním sníţení molekulové hmotnosti, hodnota Mw byla 8 600, stupeň polydisperzity byl logicky za daných okolností niţší, měl hodnotu 2,84. Stupeň větvení byl vysoký, tomu odpovídala nízká hodnota teploty skelného přechodu a nízká hodnota specifického tepla této entropické změny (tab. 1). Eroze je vidět na obr. 7. Její průběh byl podobný jako u nosičů 1T a 3T. Přibliţně po 4 dnech působení vody začínal a pokračoval podle kinetiky, která se blíţila nultému řádu. Za 21 dní erodovalo asi 60 % matrice, coţ je téměř trojnásobek matric z 3T a víc neţ dvojnásobek matric z 1T. Průběh botnání je velmi podobný nosiči 1T z hlediska polohy maxima, hodnoty však byly asi o 50 % vyšší. Totéţ platí o časové řadě hodnot čísla kyselosti. Její vyšší hodnoty u 1T jsou vysvětlitelné rychlejší degradací a niţší molekulovou hmotností v příslušných srovnatelných intervalech.
6.5
Nosič 2D Jak je dokumentováno v tabulce 1, podle klasického terminologického hlediska
se jedná o oligomer s relativně nízkou polydisperzitou, nízkou hodnotou teploty skelného přechodu a vysokou hodnotou specifického tepla tání. Větvení měl tento nosič nejniţší ze všech testovaných.
51
Eroze probíhala jiţ od počátku po ponoření matric do vody, její kinetika se blíţila nultému řádu, koeficient determinace byl vysoký, měl hodnotu 0,983. Za 21 dní byl prokázán malý zbytek neerodovaného materiálu (obr. 10). Botnání se značně lišilo od nosičů větvených tripentaerythritolem. Po třech dnech po zahájení pokusu se projevilo maximum hodnot, následované minimem v přibliţně šestidenním intervalu a pokračující dalším stoupáním hodnot (obr. 11). Totéţ, co platí o botnání, je moţno prohlásit o časové řadě hodnot čísla kyselosti (obr. 12). Hodnoty čísla kyselosti zpočátku prudce klesají, následuje zpomalení aţ zastavení poklesu přibliţně mezi 3. a 6. dnem a pokračuje další pokles hodnot. Zajímavé je, ţe úbytek matrice při stejné koncentraci karboxylů je doprovázen sníţením hodnot stupně botnání. V další fázi, po 7. dnu působení média, se stupeň botnání zvyšuje a koncentrace karboxylů klesá. Patrně dochází k výraznému úbytku malých molekul difúzí a k perzistenci větších a méně větvených molekul, které mají schopnost tvořit vysoce zbotnalé gely.
6.6
Vliv velikosti matric z nosiče 3T Z nosiče 3T byly připraveny matrice o hmotnosti 150 mg a 1000 mg. Pokud jde
o erozi, vliv velikosti matric je patrný z obr. 4 a 13. Menší matrice erodovaly značně pomaleji, za 3 týdny ubylo asi 25 % materiálu, z větších přibliţně 70 %. Přitom začátek eroze u menších tělísek nastal dříve. Také z hlediska botnání je moţno dojít k závěru o silném vlivu této proměnné na průběh děje (obr. 5 a 14). Rychlá eroze a delší difúzní dráha pro degradační vodorozpustné produkty měly za následek pulzní charakter hodnot stupně botnání (obr. 14). V případě obou testovaných tělísek o počáteční hmotnosti 1000 mg je moţno předpokládat bimodální distribuci hodnot naměřených v časové řadě. V případě botnání 150 mg matric z nosiče 3T není vyloučeno, ţe při velmi pomalé degradaci se v dalším průběhu děje po 21. dnu neprojeví maximum hodnot stupně botnání. Pokud jde řadu hodnot čísla kyselosti, v případě matric hmotnosti 1000 mg jeho hodnoty kopírují hodnoty stupně botnání u jedné z testovaných matric (obr. 15 a 14). Z uvedeného vyplývá, ţe při malé rychlosti eroze u tělísek menších rozměrů se změny v koncentraci koncových hydroxylů nemusí projevit v průběhu botnání. Příčina je diskutována v části 3. 52
6.7
Vliv nosičů na charakteristiky degradace Na obr. 16 jsou uvedeny všechny naměřené hodnoty stupně eroze. Průběh je u
většiny obdobný, odlišuje se především nosič 2D, který eroduje nejrychleji, protoţe má nejniţší stupeň větvení a nejniţší parametry molekulové hmotnosti. Nejpomaleji eroduje nosič 3T, který má nejvyšší molekulovou hmotnost a nejvyšší podíl vysoce větvených molekul. Zajímavý je prodlouţený lag-time s následnou značně rychlejší erozí u matric ze stejného nosiče 3T lišícího se vyšší hmotností. Nosič 2D se také lišil průběhem botnání jednak z hlediska bimodální distribuce hodnot v časové řadě, jednak z hlediska vyšších naměřených hodnot. Odlišné bylo také botnání větší matrice z 3T (obr. 17), které mělo progresívní nárůst hodnot, avšak při jejich značné variabilitě způsobené pravděpodobně různým tvarem nebo umístěním tělísek. Totéţ platí o zjištěných hodnotách čísla kyselosti, které mají odlišný průběh v případě nízkomolekulárního nosiče 2D a rozměrově odlišných matric z nosiče 3T.
53
7.
ZÁVĚRY A. Eroze matric z větvených polyesterů je degradační proces, který po počáteční diskontinuální fázi pokračuje kontinuálně podle kinetiky nultého řádu s koeficientem korelace vyšším neţ 0,990.
B. Botnání je jev, který doprovází erozi a který je značně citlivý na změny parametrů nosiče, tj. molekulové hmotnosti, polydisperzity molekulové hmotnosti, dále konstituce molekul, termálních charakteristik, krystalinity atd. i na změny parametrů matric v době trvání degradačního procesu - jejich tvaru, umístění v nádobě, a také na změnách sloţení média, teploty média apod.
C. Číslo kyselosti je parametr, který souvisí se stavem zbotnalého tělesa a je jednou z moţností objasnění mechanismu pulzního průběhu botnání matric z oligoesterů a polyesterů alifatických hydroxykyselin.
54
8.
Seznam použité literatury
(1) Fakirov S., Bhattacharyya D., Handbook of engineering biopolymers: Hopopolymers, blends and composites, Hanser Verlag, 2007, p. 801 (2)
Rabišková M., Nanočástice pro lékové systémy, Remedia, 2007, 17:495-501
(3)
Albertsson A.-Ch., Degradable aliphatic polyesters, Springer, 2002, p. 78
(4) Hollander A. P., P. Hatton V., Biopolymer methods in tissue engineering, Humana Press, 2004, p. 257 (5) Wnek G. E., Bowlin G.L., Encyklopedia of biomaterials and biomedical engineering, Informa Health care, 2004, p. 1163, 1246 (6) Wnek G. E., Bowlin G. L., Encyclopedia of biomaterials and biomedical engineering, svazek 3, 2008, p. 2260 (7) Wnek G. E., Bowlin G. L., Encyklopedia of biomaterials and biomedical engineering, svazek 3, 2008, p. 2261 (8)
Mark J. E., Physical properties of polymers handbook, 2006, p. 951
(9) Camenzind E., De Scheerder I. K., Local drug delivery for coronary artery disease, Taylor and Francis, 2005, p. 133 (10) Pitt C.G., Gratzel M. M., Kimmel G. L., Surles J. and Schindler A., Aliphatic polyesters. 2. The degradation of poly(DL-lactide), poly(ε-caprolactone) and their complexes in vivo. Biomaterials, 1984, 2: p. 215-220 (11) Fisher J. P., Mikos A. G., Bronzino J. D., Tissue Engineering and artificial organs, 2007, p. 42-4 (12) Fakirov S., Bhattacharyya D., Handbook of engineering biopolymers: homopolymers, blends and composites, Hanser Verlag, 2007, p. 802-3 (13) Li S. M., Girod-Holland S., and Vert M.,. Hydrophobic degradation of poly(DLlactic acid) in the presence of caffeine base. J. Controlled Release, 1996, 40: 41-53 (14) Ehrenstein G. W., Theriault R. P., Polymeric materials: structure, properties, processing, Hanser Verlag, 2001, p.236 (15)
Sinclair R. G., Pre Rheological properties of poly (lactides), 1996, p. 585
(16) 77
Scott G., Degradable polymers: principles and applications, Springer, 2002, p.
55
(17) La Mantia F. P., Loultcheva M. K., Proietto M., Competition between degradation and chain extension during processing of reclaimed poly(ethylene terephthalate), 1998, p. 417-420 (18)
Gӧpferich A., Mechanism of polymer degradation and erosion, 1996, 103-114
(19) Brekke, J. H., 1989. Biodegradable, osteogenic, bone graft substitute, UK Patent 2215209A, Sept. 20, 1989, Osmed Inc. (20)
Gӧpferich A., Langer R., Modeling of polymer erosion, 1993, p. 4105-4112
(21) Li S. M., Vert M., Morphological changes resulting from the hydrolytic degradation of stereocopolymers derived from L- and DL-lactide, 1994, p. 1307-1310 (22)
Gӧpferich, A. and Tessmar, J., adv. Drug deliv., 2002, Rev., 54, p. 911
(23) Kasapis S., Norton I. T., Ubbink J. B., Modern biopolymer science: bridging the divide between fundamental treatise, 2009, p. 521 (24) Camenzind E., De Schreerder I. K., Local drug delivery for coronary artery disease, Taylor and Francis, 2005, p. 130-132 (25) Fisher J. P., Mikos A. G., Bronzino J. D., Tissue Engineering and artificial organs, 2007, 13-5 (26)
Shi D., Biomedical devices and their applications, p. 23-26
(27) Camenzind E., De Scheerder I. K., Local drug delivery for coronary artery disease, Taylor and Francis, 2005, p. 127-129 (28) Macheras P., Iliadis A., Modeling in biopharmaceutics, pharmacokinetics and pharmacodynamics. Springer science+business media. Inc. New York, 2006. p. 85 (29) Wnek G. E., Bowlin G. L., Encyklopedia of biomaterials and biomedical engineering, svazek 3, 2008, p. 2265-2266 (30) Chasin M, Langer S., Biodegradable polymers as drug delivery systems, 1990, p.1,2 (31)
Pray L. A., Nanotechnology in food products: Workshop summary, p. 46
(32)
De Villers M. M., Aramwit P., Nanotechnology in Drug Delivery, 2008, p. 551
(33) Becker M., Becker M. D., Davis J. L., Surgical Management of inflammatory eye disease, 2008, p. 26 (34) Klener P., Klener P., jr., Nová protinádorová léčiva a léčebné strategie v onkologii, Grada Publishing, 2010, p. 45 56
(35)
Kumar Ch. S. S. R., Nanocomposites, 2010, p. 320
(36) 608
Rabišková M., Pelety-moderní perorální léková forma, Remedia, 2006, 16: 605-
(37) Basu B., Katti D. S., Kumar A., Advanced biomaterials: Fundamentals, processing and applications, 2009, p. 462-463 (38)
Schӧfer-Korting M, Drug delivery, Springer, 2010, p. 237
(39) Venugapalan R., Medical device materials 3.: Proceedings from the processes for medical devices conference 2005, 2006, p. 174 (40) Bronzino J. D., Tissue engineering and artifitial organs, svazek 2, CRC Press, 2006, p. 37-7 (41) 41
Rogers M. E., Long T. E., Synthetic Methods in step-growth polymers, 2003, p.
(42) Zaikov G. E., Jimener A., Homolytic and heterolytic reactions, Nova Publishers, 2004, p. 9 (43) Bronzino J. D., Tissue engineering and artificial organs, svazek 2, CRC Press, 2006, p. 37-7,8 (44) 12
Bronzino J. D., The biomedical engineering handbook, CRC Press, 2000, p.39-
(45) Wnek G. E., Bowlin G. L., Encyklopedia of biomaterials and biomedical engineering, svazek 3, 2008, p. 2266-7 (46)
Holzbecher Z., Jeník J. a kol., Analytická chemie, SNTL, 1968, str. 298
(47) p.20
Čambalová R., Diplomová práce: Biodegradace větvených oligoesterů, 2008,
57
