REALIZACE GENETICKÉ INFORMACE transkripce, posttranskripční modifikace, translace, posttranslační modifikace
Realizace genetické informace = syntéza proteinů - proteosyntéza • nejprve přepis informace z DNA do mRNA = transkripce • úprava primárního transkriptu = posttranskripční modifikace • potom překlad informace z mRNA do sekvence AK = translace • úprava polypeptidového řetězce do fukční a aktivní podoby = posttranslační modifikace • současně je třeba syntetizovat proteosyntetický aparát = enzymy, ribosomy a tRNA
SYNTÉZA RNA - TRANSKRIPCE • přepis z DNA zajišťuje RNA polymeráza - vždy ve směru 5’ → 3’ (matrice se čte ve směru 3’ → 5’) • rychlost transkripce asi 30 nukleotidů / sec • nasedá na DNA v místě promotoru = charakteristické místo na DNA, obvykle několik desítek párů bazí před začátkem přepisovaného genu; jeho důležitou součástí je TATA box, asi 25 bp „proti proudu“ • na promotor se naváží proteiny zvané transkripční faktory - na ně se pak naváže RNA polymeráza - tak vzniká transkripční iniciační komplex = promotor + transkripční faktory + RNA polymeráza • pro každý gen je kódující jen 1 řetězec DNA - podle orientace promotoru
INICIACE TRANSKRIPCE hnRNA
RNA POLYMERÁZA • u prokaryont syntetizuje všechny typy RNA jeden enzym • u eukaryont existují 3 typy polymerázy: I - v jadérku, velkou molekulu rRNA II - v jádře, molekuly pre-mRNA (hnRNA) III - v jádře, tRNA + malé molekuly rRNA
Průběh transkripce
iniciace (lokální odvinutí asi 17 bp)
elongace (krátký hybridní úsek DNA-RNA v délce asi 12 bp)
terminace (v krátkém úseku je RNA dvouvláknová ve tvaru vlásenky, to vyvolá konformační změnu a uvolnění RNA-polymerázy); detaily terminace transkripce nejsou dosud známy
Posttranskripční modifikace • capping na 5’ konci - před ukončením transkripce k prvnímu nukleotidu se připojí modifikovaný guanin jako tzv. Gppp čepička – chrání primární transkript před nukleázami a – umožní napojení mRNA na malou podjednotku ribozomu
• připojení polyA konce - po skončení transkripce se na 3’ konec pre-mRNA asi 15-30 nukl. za terminačním signálem AAUAAA připojí 100 - 200 adenosinů – nutný pro export mRNA z jádra do cytoplazmy – nutný pro rozpoznání molekuly RNA ribosomem – chrání primární transkript před nukleázami
POSTTRANSKRIPČNÍ MODIFIKACE • u eukaryont primární transkript obsahuje 10 - 20 tis. nukleotidů, tj. asi 10x více nukleotidů, než je potřeba pro běžný protein; pre-mRNA obvykle obsahuje introny, ty jsou pomocí částic snRNP vystřiženy a exony připojeny k sobě - tzv. sestřih RNA (modifikace se týkají všech typů RNA) • snRNP se nachází v jádře a jsou tvořeny z tzv. snRNA a proteinů • snRNA = small nuclear RNA, je dlouhá cca 150 nukleotidů • několik různých snRNA se spojují s proteiny za vzniku snRNP (small nuclear ribonucleoproteins) • snRNP se spojují ještě s dalšími proteiny za vzniku spliceosomu • výsledná mRNA může opustit jádro a v cytoplazmě podléhá translaci
SESTŘIH hnRNA (splicing, processing) • na začátku a konci intronu signální sekvence jsou rozpoznány spliceosomy (intron vytvoří smyčku)
• význam intronů ? – akumulace mutací – stavebnicový princip - umožňuje rekombinaci exonů a vznik více molekul mRNA z jednoho primárního transkriptu ⇒
alternativní sestřih
PROTEOSYNTÉZA - TRANSLACE • proces energeticky náročný - na vznik peptidové vazby nutné 4 molekuly GTP • syntéza proteinu o 400 AK trvá asi 20 sec. (rychlost syntézy je 20 AK / sec.) • místem translace ribosomy • každá AK určena kodonem (tripletem bazí v mRNA) 61 tripletů pro 21 AK - iniciační kodon AUG (kodony mezi sebou nemají mezery, čtou se jako třípísmenková slova. Čtecí rámec specifikuje první písmeno iniciačního kodonu AUG.
- terminační kodony - UAA, UAG, UGA • genetický kód - rozluštěn na počátku 60. let 20. století: – tripletový – univerzální – nepřekryvný – degenerovaný © Espero Publishing, s.r.o.
tRNA • přenašečem aktivovaných AK • každá tRNA může nést jen jednu z 21 možných AK - specifitu zajišťuje aminoacyl-tRNA-syntetáza • pro každou AK je vlastní enzym, (rozpozná i více typů tRNA, existují-li pro danou AK) • aminokyselinové rameno - AK se váže na 3’ konec tRNA makroergní vazbou (vždy končí sekvencí CCA) • antikodonové rameno - antikodon v tRNA během translace „čte“ pořadí kodonů v mRNA
RIBOSOMY • složeny z rRNA + proteinů, tvoří 2 podjednotky • prokaryontní ribosom - průměr 30 nm, 70S (50S+30S) • eukaryontní ribosom - průměr 32 nm, 80S (60S+40S), v cytoplazmě asi 104 - 105 ribosomů
• podjednotky ribosomů se spojují při iniciaci translace • polyzom - více ribozomů na 1 molekule mRNA
© Espero Publishing, s.r.o.
RIBOSOMY - pokračování • menší podjednotka váže mRNA • větší podjednotka má 3 funkční místa pro tRNA: – A-místo (aminoacylové) - pro vazbu tRNA – P-místo (peptidylové) - pro vazbu peptidyl-tRNA, zde vzniká peptidová vazba mezi -COOH iniciační AK a -NH2 následující AK – E-místo (exit) - zde opouští volná tRNA ribozom
• funkcí ribosomů - prostorová orientace mRNA a dvou aminoacyl-tRNA s navázanými AK (komplementarita kodonu a antikodonu) • ribosom se posunuje po mRNA ve směru 5’ → 3’ (syntéza proteinu začíná N-, končí C-koncem)
INICIACE TRANSLACE • 5’ konec mRNA se spojí s menší podjednotkou ribozomu • do P-místa v menší podjednotce nasedne tRNA s Met + iniciační faktory • komplex klouže po mRNA až se antikodon spojí s kodonem AUG • nyní se připojí větší podjednotka ribozomu • do A-místa nasedne další tRNA
PRŮBĚH TRANSLACE elongace Met Met
Asn
UAC
UUG
5´ AUG AAC UGG UAG
Asn
UAC
UUG
5´ AUG AAC UGG UAG © JKP, 1999
vznik peptidové vazby katalyzován peptidyltransferázou enzymovou aktivitu vykazuje (např. u E. coli) 23S rRNA (jde o ribozym) - energii si nese AK vázaná na tRNA
Met Met
UAC
Asn Asn
Trp
UUG
ACC
5´ AUG AAC UGG UAG
UAC
Trp
UUG
ACC
5´ AUG AAC UGG UAG © JKP, 1999
energii pro posun ribozomu po mRNA dodávají translační faktory – spotřeba asi 4 GTP na 1 triplet
PRŮBĚH TRANSLACE - terminace Met
Asn
Trp
Met Asn Trp
UUG
ACC
5´ AUG AAC UGG UAG
UUG
ACC
5´ AUG AAC UGG UAG © JKP, 1999
dosáhne-li se terminačního kodonu – do A-místa nepřichází žádná tRNA, ale uvolňovací faktory – uvolní se polypeptid od tRNA a ukončí translaci – translační komplex se rozpadne
POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE • chemické úpravy polypeptidového řetězce: – odštěpení formylové skupiny z methioninu na N-konci – odštěpení methioninu na N-konci polypeptidu – metylace, fosforylace, hydroxylace – tvorba S-S můstků mezi SH- skupinami AK – glykosylace (v ER a Golgiho komplexu) – odstranění signálních sekvencí – vyštěpení bloků AK z polypeptidů (např. vznik pepsinu z pepsinogenu, vznik insulinu) – spojování více podjednotek (např. Hb = 2α α + 2β β) – připojení prostetických skupin (např. hem v Hb)
BIOMEMBRÁNY STRUKTURA A FUNKCE MEMBRÁNOVÝCH ORGANEL
BIOMEMBRÁNY • základní princip strukturální a funkční organizace buněk - silná 7,5 nm (v TEM se jeví jako dvojitá kontura na povrchu všech buněk i dalších organel uvnitř buňky)
• ohraničují a současně spojují všechny buňky s okolím • uvnitř bb. ohraničují a propojují jednotlivé kompartmenty • umožňují regulovanou výměnu látek, energie a informací mezi buňkou a okolím i mezi vnitřními kompartmenty • tvoří jeden funkčně i morfologicky propojený systém (mimo vnitřní membr. mitochondrií)
TEORIE KOMPARTMENTŮ • v buňce je mnoho různých prostorů, které rozdělují složitý systém na fyzicky oddělené subsystémy (např. organely) • umožňují zajistit různé optimální reakční podmínky uvnitř buňky - např.: – kyselé pH v lysosomech, – vysoká koncentrace Ca2+ v ER, – různé koncentrace substrátu aj.
CYTOPLAZMATICKÁ MEMBRÁNA • u prokaryontních bb. – ohraničuje buňku vůči okolí, – zároveň vykonává další funkce – např. tylakoidy, mesozomy (zastupují funkci chloroplastů a mitochondrií) • z evolučního hlediska je cytopl. membrána jednou z primárních buněčných struktur – přesto na ni připadá jen malá část (asi 2 – 5 % povrchu všech biomembrán eukaryontních buněk), většina membrán připadá na ostatní membránové struktury (zejména drsné ER a jaderný obal)
Chemické složení biomembrán (ve vahových procentech)
u všech živočišných bb. podobné (poměr lipidy/proteiny 1:2) rostlinné a živočišné buňky se liší obsahem cholesterolu
proteiny plazmatická membrána 54 jaderná membrána 66 endopl. retikulum 62 Golgiho komplex 64 mitochondrie - vnější m. 55 mitochondrie - vnitřní m. 78 erytrocyt 49 myelinová pochva 18
lipidy 36 32 27 26 45 22 43 79
cukry 10 2 10 10 0 0 8 3
MEMBRÁNOVÉ PROTEINY
• globulární
– integrální proteiny: jsou zanořeny do hydrofobní oblasti transmembránové proteiny pronikají celou membránou (zejména receptorové proteiny mohou procházet membránou opakovaně – např. bakteriorhodopsin prochází 7x)
– periferní proteiny: jsou přiloženy k membráně z jedné či druhé strany; často se dotýkají integrálních • některé transmembránové proteiny jsou na vnější straně navázány k extracelulární matrix a na vnitřní straně k cytoskeletu buňky. Tím je vytvořena požadovaná pevnost živočišných buněk. • laterální migrace – pohyb molekul proteinů v ploše membrány – (rozhoduje tekutost lipidové vrstvy a vazba proteinů na další buněčné struktury)
Hlavní funkce membránových proteinů např.: enzymy, receptory, transportní systémy, imunoglobuliny, antigeny, rodopsin v buňkách sítnice • rozpoznání jednotlivých • transport látek buněk mezi sebou • enzymatická aktivita • připevnění k extracelulární • vedení signálů matrix • spojování buněk mezi sebou
MEMBRÁNOVÉ LIPIDY • Fosfolipidy - glycerol + 2 MK (z toho 1 nenasycená) + fosfátová skupina - vznik amfifilie - hydrofilní a hydrofobní konce • ve vodném prostředí autoagregace v micely nebo lipidovou dvouvrstvu • asymetrie membrán (s tím souvisí polarita) – vnější: fosfatidyllecithin, glykolipidy – vnitřní: fosfatidylserin, fosfatidylethanolamin
• Cholesterol - u živočiš. bb. tvoří až 25 % lipidů, u prokar. bb. se nevyskytuje vůbec – ovlivňuje fluiditu membrány (při teplotě okolo 37°C cholesterol brání pohybu fosfolipidů a tím zvyšuje tuhost membrány) – snižuje bod přechodu (při nízkých teplotách cholesterol naopak brání úplnému ztuhnutí membrány)
BIOMEMBRÁNY jsou tekuté • řetězce MK jsou volně pohyblivé pohyblivější jsou kratší a nenasycené MK (řetězce se ohýbají, rotují kolem své osy, vyměňují si místo se sousedy až 107 x/sec.) • laterální difuse - pohyb lipidů i proteinů v ploše membrány - např. u prokaryontních buněk až 2 µm/s • flip-flop pohyb - překlápění mezi vrstvami fosfolipidů = fluidita membrány • membrána se snižující se teplotou tuhne - při poklesu teploty se sníží pohyblivost MK = rigidita membrány
MEMBRÁNOVÉ CUKRY • na vnější straně membrány – membránové sacharidy jsou obvykle rozvětvené oligosacharidy s méně než 15 monosacharidy – některé se kovalentně vážou k membránovým lipidům za vzniku tzv. glykolipidů – většina se ovšem váže k membránovým proteinům za vzniku glykoproteinů • složení oligosacharidů v membránách je různé u různých druhů a dokonce i v rámci jednoho druhu (např. krevní skupiny A, B, AB a 0 jsou dány jinými oligosacharidy v membránách erytroc.)
• glykokalyx - u živoč. bb. vně cytopl. membrány = několik nm silná vrstva proteinů a polysacharidů napojená na oligosacharidové řetězce biomembrány není to samostatná biomembrána
fluidně mozaikový model biomembrány 1974 - model Singer - Nicolsona
Důkazy fluidity membrány • časosběrný film - membrány se stále přestavují a pohybují • capping - shlukování receptorů po jejich vazbě s antigeny • fúze buněk - vznik syncicií, zygoty, využívají se při hybridizaci buněk a v genovém inženýrství • fúze membrán - zajišťuje kontinuitu membrán, endocytózu a exocytózu, dělení buněk do 1 hodiny po fúzi se proteiny kompletně promíchají laterálním pohybem
© Espero Publishing, s.r.o.
ENDOPLAZMATICKÉ RETIKULUM • největší nitrobuněčný kompartment - 15 % objemu b. (asi polovina všech membrán buňky); • velikost se může rychle měnit (během několika minut) podle potřeby vnějších i vnitřních faktorů • systém cisteren a trubiček • podle vazby s ribozómy se dělí na hladné a drsné ER • souvisí s vnější membránou jaderného obalu i s cytoplazmatickou membránou • syntéza stavebních jednotek ostatních organel • syntéza proteinů a glykoproteinů na export • zásobárna Ca+2
DRSNÉ ER
EM snímek krysího hepatocytu
• váže ribozomy • tvoří 40 - 60 % povrchu všech membrán buňky • v sekrečních buňkách (pankreas, plazmatické bb.) • proteosyntéza na ribozomech - řetězec jde hned do lumen DER • posttranslační modifikace = N-glykosilace • proteiny ve váčcích jdou k další modifikaci do GK
glykogen obr. 4.39; J.Darnell a kol.: Molecular Cell Biology, Scientific Americal Books, Inc., 1990
© Espero Publishing, s.r.o.
HLADKÉ ER • metabolismus lipidů (hepatocyty) - fosfolipidy - cholesterol - steroidní hormony
2
• v játrech se účastní přeměny glykogenu na glukózu • detoxikace (hepatocyty – barbituráty, jedy, drogy)
• vápníková pumpa ve svalových bb. = sarkoplazmatické retikulum
4
Leydigova b. ve varleti (1-HER, 2-DER, 3-mitochondrie, 4-peroxizomy, 5-sekundární lysozom) obr. 63; K. Kapeller: Cytomorfológia, Osveta, Martin, 1990
(transport Ca2+ do lumina)
• při homogenizaci buňky se rozpadá na mikrosomy
GOLGIHO APARÁT • stálá struktura v blízkosti jádra (v b. může být i několik GA) • cisterny = cis strana - dictyosomy • sekreční měchýřky = strana trans 1 • vnitřní obsah cisteren není propojen 2
•nikdy se neváže s ribosomy • zdrojem primárních lyzosomů
3 4
1 – membr. váčky; 2 – Golgiho aparát; 3 – ER; 4 – jaderný obal © Espero Publishing, s.r.o.
obr. 4.41; J.Darnell a kol.: Molecular Cell Biology, Scientific Americal Books, Inc., 1990
FUNKCE GOLGIHO KOMPLEXU • další modifikace látek a jejich distribuce: – glykosilace – sulfatace – fosforylace – připojování MK
albumin, parathormon, glukagon, gastrin, insulin, glykoproteiny membrány, lysosomální enzymy, proteoglykany buněčné stěny aj. -
nejvíce rozvinut v žlázových buňkách, např. pankreatu
• skladování proteinů zymogenní granula • koncentrování proteinů • doprava na místo určení - exocytóza z buňky, do jádra, mitochondrií, lysosomů, ER, membrány • membrány sekrečních měchýřků se „recyklují“, opačným směrem probíhá endocytóza
cesta sekrečních proteinů v pankreatu
© Espero Publishing, s.r.o.
obr. 4.40; J.Darnell a kol.: Molecular Cell Biology, Scientific Americal Books, Inc., 1990
LYZOSOMY • obsahují kyselé hydrolázy (pH = 5) je udržováno aktivním transportem protonů do lumina lyzosomů • rozpoznávací molekuly v membráně určují, se kterými kompartmenty mohou lyzosomy fúzovat
• hlavní funkcí - rozklad a trávení nepotřebných látek • nejsou přítomny u rostlinných buněk funkci zde přebírají vakuoly
Primární lyzosomy • vznikají odštěpováním z cisteren GK na straně trans (velikost 50 nm) • enzymy glykosylovány v drsném ER • po fúzi s jiným kompartmentem vzniká
sekundární lyzosom
Sekundární lyzosomy • trávicí vakuoly - fúze s fagosomy • multivesikulární tělíska - fúze s pinocytickými měchýřky • autofagické vakuoly - s vlastními nefunkčními organelami (produkty hydrolýzy reutilizovány v cytoplazmě nebo exocytovány z buňky) • realizují programovanou smrt buňky • specializované funkce: – akrosom spermií – v leukocytech likvidace mikrobů • se špatnou funkcí lyzosomů spojeny některé nemoci
Lyzosomální choroby • revmatická arthritida aktivace lyzosomálních enzymů uvolněných z makrofágů do extracelulární matrix
• střádací choroby (tesaurismózy) asi 20 dědičných chorob podmíněných hromaděním neodbouraných látek v lyzosomech při defektu hydrolytických enzymů (mukopolysacharidy, gangliosidy) - např. Tay-Sachsova choroba
PEROXISOMY • podobné lyzosomům - odštěpují se z HER • obsahují: – oxidázy - odnímají ze substrátu H+ za vzniku H2O2 – katalázy - rozkládají vzniklý H2O2 • funkce: účastní se oxidací při odbourávání lipidů a při fotorespiraci ⇒ ochrana buňky před toxickým peroxidem vodíku uvolněný kyslík využívá k detoxikacím (např. v hepatocytech oxidace ethanolu na acetaldehyd, oxidace fenolu, formaldehydu) • vrozené chybění peroxisomů či katalázy ⇒ těžké poruchy vývoje mozku, smrt do 6 měs. po naroz.
GLYOXISOMY • jsou analogem peroxisomů u rostlinných b. • enzymaticky přeměňují zásobní tuky na cukry během klíčení semen
VAKUOLY • jsou analogem lyzosomů u rostlinných b. • Druhy vakuol: – potravní vakuola prvoků – kontraktilní vakuola u sladkovodních prvoků pumpuje vodu ven z těla – centrální vakuola u starších rostlinných bb.
• jejich membrána = tonoplast • vznikají z ER a GA v buňkách apikálních meristémů • v mladých bb. je množství malých vakuol, dospělá b. obsahuje zpravidla jednu centrální vakuolu, která vyplňuje až 90 % objemu buňky
VAKUOLY • vakuoly obsahují: – meziprodukty buněčného metabolismu (AK, cukry…) – ionty (K+, Na+, Ca2+, Cl-, NO3-) – rezervní látky (sacharidy, bílkoviny) – barviva rozpustná ve vodě (antokyany a flavony) – alkaloidy (nikotin, kofein, kokain, kolchicin, kodein, morfin) – odpadní látky – někdy dochází ke krystalizaci obsahu vakuol = BUNĚČNÉ INKLUZE
• Funkce – udržování stálosti cytoplazmy (např. pH) – zásobní – odpadní – ukládají se zde zplodiny buněčného metabolismu po celý život buňky
