Modifikace dědičné informace rostlin
Lukáš Fischer, KFR PřF UK
• Jak zlepšit vlastnosti rostlin • Principy a klasické způsoby přípravy geneticky modifikovaných rostlinných buněk a celých rostlin – Genový přenos do jaderného genomu – Selekce a odvození transgenních rostlin
• Umlčování exprese transgenů a rostlinných genů • Pokročilé metody cílené modifikace genů či jejich aktivity • Využití GM rostlin ve výzkumu – Inzerční mutageneze – Modulace exprese genů – Fúze s reportérovými geny
• Analýzy transgenních rostlin – Analýzy inserce transgenů – Analýzy exprese transgenů
Legislativa:
Genetická modifikace (GM)
= vnesení genetické informace (úseku DNA) či změna > 20 nt způsobem, který se v přírodě nevyskytuje přirozeně (jiné změny nejsou považovány za GM) • Transgenoze – vnesen jakýkoli úsek DNA (nekřížitelné druhy, syntetické molekuly, …) • Intragenoze – vnesen úsek DNA vytvořený výhradně z fragmentů DNA z téhož či křížitelného druhu (včetně např. konstruktů navozujících RNAi) • Cisgenoze – vnesen nezměněný celistvý úsek DNA z téhož či křížitelného druhu (velmi blízké přirozeným procesům)
Cisgenoze napodobuje klasické křížení - ale nutnost dlouhé řady zpětných křížení!
Vloha (gen) → (protein) → vlastnost (znak) Geny předurčují vlastnosti organismů!
→
J. G. Mendel
→↑
Jak změnit vlastnosti (fenotyp) organismu?
Genotyp
Fenotyp - výběr lokality změnou prostředí: - zálivka, hnojení - hubení škůdců - další péče (řez, …)
změnou genetické informace: (či jejího stavu)
- šlechtění klasické, hybridizace (i vzdálená) - mutageneze náhodná či cílená - genetické modifikace, epimutageneze, …
Cíl: vylepšené či zcela nové vlastnosti klíčové je vymyslet:
jaké vlastnosti měnit? jak toho dosáhnout?
Strategie při přípravě GMR Jak geneticky podmínit různé vlastnosti? Vnesení jednoho genu – jeden „výkonný“ protein: -
produkce rekombinantních proteinů (např. pro medicínské účely) antigenu - jedlá vakcína navození odolnosti (Bt toxin) odolnost x herbicidům – degradační enzym či necitlivý isozym zásobní protein (zvýšený obsah esenciálních amk)
Vnesení více genů – př. vytvoření celých biosyntetických drah: - zvýšený obsah určitých metabolitů (ß-karoten; mastné kyseliny, …)
Lze některých vlastností dosáhnout i bez genetické modifikace?
Strategie při přípravě GMR Jak geneticky podmínit různé vlastnosti?
Vnesení regulačních genů – transkripční fakory, enzymy syntézy fytohormonů: - zvýšení odolnosti vůči stresu - zvýšení/snížení obsahu určitých metabolitů
Lze dosáhnout stejného cíle i bez genetické modifikace?
Strategie při přípravě GMR Jak geneticky podmínit různé vlastnosti?
Blokování rostlinného genu - vnesením RNAi konstruktu – RNAi (antisense RNA, vlásenka, …): - snížení obsahu určitého metabolitu (blokování enzymu syntézy) - snížení obsahu alergenního proteinu - prodloužení trvanlivosti – antisense PG
Lze dosáhnout stejného cíle i bez genetické modifikace?
Transformace • stabilní
• transientní
dochází / nedochází k integraci vnesené DNA do genomu
• inzerce do jaderné či organelové DNA Exprese genu (= tvorba funkčního proteinu, popř. tvorba specifické RNA) v jiném organismu: - nutné regulační sekvence, které jsou rozpoznány transkripčním (i translačním) aparátem příjemce, jinak nejsou bariéry ani při přenosech mezi vzdálenými organismy
Exprese genu (jaderného): 1. krok - transkripce = tvorba (pre-)mRNA RNA polymeráza
Transkripční faktor
polyA mRNA
TERMINÁTOR transkripce = polyA signál
PROMOTOR
PROMOTOR - určuje začátek a směr transkripce - konstitutivní, inducibilní promotory, orgánově (pletivově) specifické - rostlinné, či z rostlinných patogenů (DNA virů, agrobaktéria) Schopnost promotoru vázat určité transkripční faktory a přítomnost těchto faktorů v buňce ovlivňují, kde a jak bude gen exprimován!
Exprese genu: 2. krok translace = syntéza proteinu AACAATG
terminační kodón mRNA
kódující sekvence
Faktory ovlivňující expresi transgenu (sílu, místo, čas) • • • • •
promotor charakter sekvence před iniciačním kodónem (nasedání ribosomu) stabilita transkriptu (množství, síla terminátoru, introny, UTR, …) počet kopií transgenu místo integrace (enhancery, SAR, MAR…)
- u rostlin nelze jednoduše navodit vložení do určitého místa genomu - malá účinnost homologní rekombinace, kromě mechu Physcomitrella patens)
Metody transformace (stabilní i transientní) „přirozené“ metody • via Agrobacterium – varianty (agroinfiltrace - transientní, floral dip, …)
• pomocí rostlinného viru – přechodná (transientní) transformace – vnesení – přirozenou infekcí virovými částicemi (ale často agroinfiltrací či nastřelením konstruktu, jehož transkripcí vzniká virový RNA+ genom)
biolistika („particle bombardment“, „microprojectile bombardment“) direct gene transfer vnesení DNA do protoplastu pomocí:
– elektroporace – působením PEG (polyethylenglykol)
mikroinjekce
Přirozená transformace agrobaktériem (Agrobacterium tumefaciens) • půdní baktérie G- (Rhizobiaceae), Ti plasmid • „genetický parazitismus“ na dvouděložných rostlinách (pro transformaci jednoděložných rostlin je nutné indukovat vir geny agrobaktéria externě)
• přenáší několik svých genů do rostlinné buňky v místě poranění • z transformované buňky se tvoří nádor: ipt – isopentenyl transferase iaaH – indolacetamid hydrolase • produkce výživných látek (opinů) pro agrobaktérium
Přirozená transformace agrobaktériem
Upravené agrobaktérium - geny způsobující vznik nádoru a syntézu opinů odstraněny - T-DNA v binárním plasmidu (vir geny, zodpovědné za přenos T-DNA alokovány na pomocném plasmidu in trans) Využita jen schopnost agrobaktéria přenášet T-DNA (definovanou krátkými hraničními sekvencemi) do genomu rostlinných buněk Výhody: • poměrně vysoká frekvence stabilní transformace • menší počet kopií (menší riziko umlčení exprese) • možnost přenosu delších úseků DNA (desítky kbp)
Balistická metoda, transformace biolistická, biobalistická, nastřelování,“particle/gene gun“
• • • •
nabalení DNA na zlaté či wolframové kuličky nastřelení na rostlinný orgán, celé rostliny, buněčnou kulturu,... univerzální použitelnost bez druhových limitací možnost transformace organel (plastidů)
Balistická metoda transformace
nastřelování pomocí podtlaku či přetlaku
Jak udělat z jedné buňky celou rostlinu? - organogeneze (kalus – prýt – rostlina)
- somatická embryogeneze (som. embryo – rostlina)
Princip přípravy transgenních rostlin 1.
Na začátku je jedna transformovaná buňka! (nelze transformovat všechny buňky rostliny naráz)
2.
Pomnožení transformovaných buněk na „selekčním médiu“
3.
Indukce organogeneze či somatické embryogeneze (aplikací regulátorů rostlinného růstu v in vitro podmínkách)
vnesení genu
selekce
organogeneze
transformovaná buňka
embryogeneze transformovaný kalus
Selekce transformovaných buněk (rostlin) Selekční geny
- pouze transformované, rezistentní buňky se mohou dělit a vytvořit rostlinu - rezistence k antibiotikům (kanamycin, hygromycin) - rezistence k herbicidům (Roundup® - glyphosate, Liberty® - glufosinate) (produkt selekčního genu buďto degraduje selekční látku, či komplementuje zasaženou buněčnou funkci) - schopnost využití určité živiny: př. PMI (fosfomanóza isomeráza) – přeměna manóza-6-P na fruktóza-6-fosfát, …
Reportérové geny (vizuální selekce transformantů): - GFP (zelený fluorescenční protein), - glukuronidáza, luciferáza, …
Transformace bramboru pomocí agrobaktéria agrobaktérium
vstup agrobaktéria v místě poranění
časný kalus
kokultivace s poraněnými listy kalus – 3 týdny
regenerace – 6 týdnů
Transformace Arabidopsis thaliana pomocí agrobaktéria – floral dip Ponoření květenství s poupaty do suspenze agrobaktéria Použito i u dalších druhů: pšenice, rýže, kukuřice, len, vojtěška, …
Transformace Arabidopsis thaliana pomocí agrobaktéria - cílem transformace je zřejmě vajíčko (samičí gametofyt) - z vaječné buňky po oplození transformovaná embrya (semena) a následně rostliny
modře zbarvený produkt enzymové aktivity glukuronidázy, která byla použita jako reportérový gen pro visualizaci transformovaných buněk
Agroinfiltrace - předběžné testování exprese transgenů - komerční produkce proteinů (vč. protilátek) - bez nutnosti práce in vitro
Ochrana proti inaktivaci exprese (RNAi) – kotransformace virovým supresorem silencingu zpravidla p19 (Tombusviry) či přímo virové vektory
• Lokální exprese - jednoduchá T-DNA
se supresorem
bez
• Systemická (virový konstrukt): - sekvence a geny nutné pro pomnožení viru - sekvence pro šíření rostlinou (geny pro movement proteiny)
Umlčování exprese transgenů: nechtěné x cílené, kosuprese - integrace transgenu do jaderného genomu nezajistí jeho stabilní expresi (zatímco do plastidového genomu zpravidla ano!) - transgen může být umlčen a/nebo může indukovat umlčení homologních sekvencí v rostlinném genomu
Společný mechanismus – RNA interference - umlčování exprese genů prostřednictvím malých RNA homologních k promotoru či transkribované sekvenci genu
Úroveň umlčování exprese transgenů TGS: Transcriptional Gene Silencing
Gen není přepisován - metylace DNA promotoru (+ modifikace histonů) - tvorba heterochromatinu (zamezení přístupu TF)
PTGS: PostTranscriptional Gene Silencing
Gen je přepisován - transkript není překládán do proteinu - transkript je zpravidla degradován či blok translace - sekvenčně specifické prostřednictvím malých RNA
Antisense RNA - využití ve výzkumu i praxi od 80. let 20.stol. Funkční genomika – vliv inaktivace genu na fenotyp rostliny ⇒ hledání funkce proteinu 1994: rajčata „Flavr Savr“ s prodlouženou trvanlivostí – blokování tvorby enzymu degradujícího BS (polygalakturonáza)
Kosuprese u Petůnie Cíl: zvýšení exprese genu pro enzym syntézy pigmentu
Výsledek: ztráta pigmentace v částech květu
antisense RNA
Napoli et al. 1990 Plant Cell 2:279–289
Tvorba malých RNA 21-24 nt dlouhých RNA, homologních s umlčovanými geny (velikost odpovídá specifickým primerům PCR) (jakákoli) dsRNA v buňce je štěpena enzymem DICER (DCL) na krátké fragmenty
malá RNA (jedno z vláken) zprostředkuje rozpoznání transkriptů genů určených k umlčení
Mechanismus účinku siRNA
PTGS: - specifická degradace transkriptu, komplex RISC - (blokování translace) TGS:
- metylace DNA, heterochromatinizace (kompaktní uspořádání znemožňující vazbu transkripčních faktorů)
Jak může vznikat dsRNA?
x
• RdRP = RNA dependentní RNA Polymeráza - syntéza komplement. vláken na „divných“ transkriptech - bez polyA či čepičky (např. přestřižených RISC) či transkriptech RNA polymerázy IV (přepisuje heterochromatin)
Příčiny samovolného (nechtěného) umlčování exprese transgenů Vysoká exprese (slabý terminátor) - indukce vzniku patrně při vysoké expresi – zvýšený výskyt aberantních mRNA – přepis RDR6 (RNA dependentní RNA polymerázou) do dsRNA
Poziční efekt a charakter vnášené sekvence - TGS (poloha na chromozómu, charakter sousedních sekvencí) - vzdálenost od heterochromatinu, MARs a SARs (také zprostředkováno malými RNA, pol IV …)
Cílená indukce umlčování navození tvorby dsRNA: 1) gen v antisense orientaci (za promotor vložen opačně) 2) vnesení vlásenkového konstruktu (např. sense-intron-antisense, alternativně ze sekvence promotoru) 3) vnesení genu bez terminátoru (dsRNA díky aktivitě RdRP) 4) amiRNA – umělé miRNA (složitá terciární vlásenková struktura RNA) intermolekulární párování
+ intramolekulární párování RdRP
syntéza komplement. vlákna k transkriptu
- štěpení dsRNA DCL, tvorba siRNA, sekvenčně specifická degradace mRNA, popř. zastavení transkripce v důsledku metylace DNA promotoru
Pokročilé metody modifikace genů či jejich aktivity (zpravidla ne GM, ale často na pomezí)
• mutageneze - klasická chemická - necílená (EMS), fyzikální (RTG) cílená: - navozená oligonukleotidy - zprostředkovaná cíleným štěpením genomu
• epimutageneze - navození změn v epigenetických modifikacích chromatinu (zpravidla inaktivace genu metylací promotoru) - přechodná exprese konstruktu k navození metylace - roubování na GM podnož (sRNA transport)
Cílené modifikace genomu • Oligonucleotide directed mutagenesis • Indukce DSB (dvouvláknového zlomu DNA)
Oligonucleotide directed mutagenesis syn.: oligonucleotide-mediated gene modification, targeted gene correction, targeted gene repair, RNA-mediated DNA modification, RNA-templated DNA repair, …
• mutace navozené oligonukleotidy komplementárními k cílovému místu (s kýženou změnou) • mutace bodové, krátké delece, krátké inzerce • ne zcela jasný mechanismus (reparační procesy) • DNA oliga s modifikovanými konci, DNA/RNA duplexy, RNA, …
Oligonucleotide directed mutagenesis • • • •
vnesení elektroporací, PEG transfekcí doprovázeno mutacemi v necílových sekvencích nízká účinnost, problémy se selekcí detekce špatného párování opravnými mechanismy a oprava dle původní sekvence (řešení: DNA s modifikovanými nukleotidy: 2'-Fluoro-Uridine, 5-Methyl-deoxyCytidine, 2,6-Diaminopurine or Iso-deoxyGuanosine)
• využití zatím jen okrajové, ale BASF 2009: CLEARFIELD ®Production System
Cílené vytvoření dvouvláknového zlomu DNA (DSB) – 1. generace ZFN, TALEN • zlom v konkrétním místě genomu (je-li znám) • štěpení chimerickými (fúzními) proteiny - nukleázová doména restriktázy Fok I + - Zn-finger DNA vazebné domény - ZnF nucleases (ZFN) • analogicky TALEN - DNA vazebná doména transcription activator-like effektorů baktérií rodu Xanthomonas (TAL effector nucleases)
CRISPR/Cas9 - bakterie a archea – obrana proti invazním DNA (virům a plasmidům) – adaptivní imunita - crRNA guide
- rozpoznání cílového místa – cca 20 nt (přesnost ?) - účinná indukce štěpení (dvouvláknový zlom)
Reparace DSB Místně specifická inzerce (transgenu = GM) - integrace transgenu s homologními koncovými sekvencemi (homologní rekombinací) - integrace nehomologní rekombinací v místě DSB
Místně specifická mutageneze - samovolná reparace, NHEJ (non-homologous end joining) - často s lokální delecí různého rozsahu - rozsáhlejší: př. pomocí 2 guide crRNA - řízená mutageneze (DNA templátem) HOMOLOGNÍ REKOMBINACE
Zn-finger domény – možnost designovat na míru sekvenčně specifické rozpoznání DNA: 3(-4) nt/finger
- vyznačené konzervované amk - černá kolečka – amk interagující s DNA
- místně specifické štěpení - využití k cílené modifikaci DNA (integraci transgenu)
Zn-finger nukleázy v kombinaci s virovými vektory - indukce DSB v určité sekvenci – nepřesná reparace (inaktivace) - regenerace ne GM rostlin (a potenciálně i bez in vitro kultivace)
Epimutageneze
(bez změny sekvence DNA)
• malými RNA lze bránit translaci mRNA určitého genu (např. jejím rozštěpením) či indukovat dědičné změny v modifikaci (malé RNA rostliny mohou ovlivňovat chromatinu (DNA a histonů) genovou expresi i u herbivorů!)
mRNA malá RNA
štěpení
genomová DNA
metylace DNA
•
malé RNA vznikají: - z transgenu - z virového vektoru - přicházejí z podnože
není GM
Malé RNA se symplasticky (plasmodesmy a floémem) šíří rostlinou
systémová rezistence
umlčování exprese GFP podél cévních svazků
Reverse breeding • generativní pomnožení elitních hybridů s využitím GM mezistupně crossing-over při meióze
→ F1 uniformní - pokud jsou rodiče plně homozygotní (= dihaploidní) → F2 – nekonečně kombinací (Mendel studoval geny na různých chromozómech!)
Jak získat velké množství identických hybridů? - vegetativní pomnožení (in vitro) - získání dihaploidních rodičů, jejichž křížením bude vznikat (uniformně)
Reverse breeding • získání dihaploidních rodičů s rodičovskými kombinacemi genů na chromozómech
! Chan, Trends in Biotech (2010) 28:605-610
Blokování crossing-overu – inaktivace esenciálních genů (např. DMC1, Spo11) – transformací RNAi konstruktem Tvorba haploidů a posléze dihaploidů Výběr dihaploidů s danými kombinacemi chromozómů (a bez transgenů)
Význam GM rostlin pro výzkum Hledání genů na základě fenotypového projevu (přímá genetika) - inzerční či aktivační mutageneze (úsekem DNA)
Studium funkce vybraných proteinů/genů (reverzní genetika) - zvýšení či snížení množství proteinu - fůze promotoru či kódující sekvence genu s reportérovým genem - analýza mutantů s inzerčně inaktivovaným genem (z kolekce)
Izolace genů na základě fenotypového projevu původní gen inzerční mutageneze - inaktivace genu v důsledku začlenění úseku DNA - T-DNA tagging - transposon tagging
aktivační mutageneze transformace promotorem (enhancerem), který může v místě začlenění aktivovat expresi jinak neaktivního genu
promotor a enhancer-trap linie - transformace T-DNA s reportérovým genem bez promotoru či s minimálním promotorem
Fúze promotoru studovaného genu s reportérovým genem pro glukuronidázu a GFP reportérový gen - transkripční fúze P gen T - hledání místa exprese genu na úrovni pletiv a orgánů
Arabidopsis thaliana
Nelze měnit v genomu, vkládá se další kopie genu
Tvorba fúzního proteinu s GFP
Zrušení stop kodónu studovaného genu a připojení GFP genu ve čtecí fázi
Tvorba fúzního proteinu s GFP Studium lokalizace proteinů, proteinových interakcí, Sledování různých pochodů v živé buňce – značení buněčných struktur … Golgiho komplex
chromozómy
mikrotubuly
Analýzy exprese transgenu Na úrovni: mRNA
transkripce a stabilita mRNA
DNA (Genome) Protein
translace a stabilita proteinu
Sledování hladiny transkriptu Hybridizace na Northern blotu
Metody založené na PCR Real time PCR
Semikvant. RT-PCR
qRT-PCR a Semikvantitativní RT-PCR množství produktu či počet cyklů potřebných k dosažení určité koncentrace odráží množství výchozího templátu
Izolace celkové RNA (mRNA) Semikvantitativní RT-PCR
Reverzní transkripce (oligo T-primer, či specifický reverze primer)
cDNA qRT-PCR
Detekce nukleových kyselin hybridizací sonda (proba) = značené vlákno NK (DNA či RNA) o známé sekvenci, využívané k detekci komplementárních NK
Typy značení
- radioaktivní (nejčastěji 32P) - fluorescenční značení - digoxygenin, biotin apod. – následná detekce protilátkou (avidinem, …)
Značení sondy probíhá zpravidla při syntéze na příslušném templátu: - např. PCR se značenými dNTP, nick translace Klenowem, - ale možné i koncové značení (T4 DNA polymerázou, ….)
Hybridizace na Northern blotu Izolace RNA Rozdělení na elektroforéze Macroarrays
Přenos RNA z gelu na membránu - blotování Hybridizace se značenou sondou, detekce (autoradiograficky, enzymaticky, …)
Sledování hladiny určitého proteinu
- Sledování aktivity (použitelné pouze pro enzymy) - Imunodetekce - proteinová elektroforéza (SDSPAGE), Western blot
Detekce konkrétního proteinu Proteinová elektroforéza (SDS-PAGE) transfer proteinů z gelu na membránu = Western blot detekce proteinu protilátkou (komplexu primární a sekundární protilátky)
vizualizace pomocí barevné reakce nebo chemiluminiscence
W. blot
Sekundární protilátky konjugované s enzymem či fluorescenční značkou Primární protilátka
membrána s navázanými proteiny
Protilátky (Ig): Primární = specifické pro protein Sekundární = specifické pro Ig z určitého (jiného) organismu
Analýzy inserce transgenu • počet kopií – Southernova hybridizace - qRT-PCR • místo inserce – TAIL-PCR, plasmid rescue, iPCR, adaptorová PCR, …
degenerovaný primer
H3
H3
