REGULACE TRANSLACE TRANSLAČNÍ APARÁT. 1. Translační aparát. 1. Translační aparát translační faktory

1. Translační aparát

a)  mRNA + mRNA-vazebné proteiny b)  tRNA c)  aminokyseliny d)  ribosomy e)  regulační proteiny – translační faktory

REGULACE TRANSLACE TRANSLAČNÍ APARÁT

1. Translační aparát – translační faktory

1. Translační aparát

A: Iniciační faktory Ø  Ø  Ø  Ø 

eIF2 komplex aminoacyl t-RNA eIF1 + eIF1A + eIF3 – 40S ribozomální podjednotka eIF6 + eIF5 60S ribozomální podjednotka eIF4B + eIF4F = eIF4A, eIF4G, eIF4E mRNA čepička

B: Elongační faktory

a)  mRNA + mRNA-vazebné proteiny b)  tRNA c)  aminokyseliny d)  ribosomy e)  regulační proteiny – translační faktory

eEF1, eEF2

C: Terminační faktory

eRF1, eRF3

(pro identifikaci modulačních bílkovinných faktorů byla v 70. letech použita metoda translace in vitro)

současný stav: víc jak 50 regulačních faktorů

1

Regulace translace

1. Translační aparát 2.

Translace

3.

Proteiny a jejich posttranslační modifikace

4.

Lokalizaceproteinů v buňce a jejich degradace

5.

Translace v mitochondriích a chloroplastech

2.

Translace

Translace má 3 fáze: iniciaci, elongaci a terminaci Iniciace je klíčovým procesem

2. Translace - iniciace

REGULACE TRANSLACE

Nezbytná přítomnost všech složek translačního systému Ø  RNA: mRNA, tRNA, rRNA, miRNA Ø  proteiny: ribosomální mRNA vazebné regulační (translační faktory) enzymy Ø  aminokyseliny Ø  energetika – ATP, GTP pro zahájení procesu: rRNA a ribosomální bílkoviny poskládány do funkčních ribosomálních podjednotek Narušení tohoto uspořádání: stres nebo hladovění

INICIACE TRANSLACE

2

2. translace- iniciace

Iniciace je mnohostupňovým procesem •  Aktivace aminokyselin •  Aktivace 40S ribosomální podjednotky •  Vytvoření ternárního komplexu •  Vytvoření preiniciačního komplexu •  Aktivace mRNA •  Vazba preiniciačního komplexu na čepičku mRNA •  „Scanování“ mRNA preiniciačním komplexem až po AUG kodón •  Vazba PABP na čepičku •  Recyklace eIF2.GDP

Aminokyseliny

Základní složení všech aminokyselin

Bílkoviny, typy aminokyselin – hydrofobní

3

Bílkoviny, typy aminokyselin – hydrofilní a ostatní

Iniciace translace – aktivace aminokyselin Úloha aminoacyl-tRNA syntetázy (aaRS)

Přesnost přepisu genetického kodu = navázání odpovídajících aminokyselin na odpovídající tRNA - zprostředkováno odpovídající aaRS Rozpoznává celou rodinu izoakceptorů

Vytvoření makroergické vazby mezi tRNA a odpovídající aminokyselinou

„nabitá Aa“ = aminoacyladenylát, za odštěpení Ppi esterifikačně váže „Aa“ na tRNA buď přes 2ńebo 3´-OH na A76 akceptorového ramene tRNA

Aminoacyl-tRNA syntetáza Funkce a) Přenos informace b) Chemická aktivace (charging) Průběh reakce 1) Rozpoznání aminokyseliny 2) Aktivace aminokyseliny (aa + ATP <-> aa~AMP + PPi) 3) Rozpoznání vhodných tRNA 4) Přenos aminokyseliny na tRNA (aa~AMP + tRNAaa <-> aa~tRNAaa + AMP) Zachování makroergické vazby

4

Enzym se připojí nejprve k antikodónu rozšířenému o tři baze + pevnou vlásenkou na akceptorovém rameni

katalyzuje aminoacylaci, vazbu mezi t-RNA a odpovídající aminokyselinou 1. specifický enzym hydrolyzuje ATP a kovalentně váže alfa-karboxylovou skupinu aminokyseliny k 5´fosfátu 2. aminokyselina je napojena na volnou hydroxylovou skupinu terminální ribosy na 3´konci tRNA

Glutamin- tRNA syntetáza s odpovídající tRNA Glutamin ARS je monomérní

vznik správné aminoacyl-tRNA s přesností 104 - 105 = hlavní sterochemická reakce v průběhu translace = propojení genotypu s fenotypem

pozice enzymu závislé na tvaru a velikosti Aa antikodón na bázi Akceptorové aktivní místo tRNA vpravo nahoře tRNA červeně

Aa + enzym monoméry diméry tetraméry

5

editační schopnosti aa-tRNA syntetázy


isoleucin

editační schopnosti aa-tRNA syntetázy

1. translační aparát - tRNA a genetický kód

isoleucin x valin: chybně acylovaná tRNA (valin) – hydrolyzovaná, „odplavena“ Přesnost výběru aminokyselin - editační schopnosti aa-tRNA syntetázy Izoleucin Ø  váže se do části katalytického místa – dutiny ve tvaru izoleucinu větší molekuly se nevejdou, a hydrofobní charakter vylučuje vazbu aminokyseliny s vedlejším polárním řetězcem)

Ø  nelze vyloučit vazbu valinu, (řetězec kratší jen o –CH2- můstek) s pravděpodobností 1:150 ----editace Ø  enzym má editační místo, kam se kovalentně navázaný izoleucin nedostane Ø  valin je v editačním místě s tRNA odštěpen editační místo: rozštěpí chybný aminoacyl adenylát = snížení chybování na 104 - 105

isoleucin

6

1. translační aparát - tRNA a genetický kód

ne všechny aminoacylsyntetázy mají editační místo rozlišení mezi strukturně podobnými tyrozinem a fenylalaninem OH-skupina tyrozinu se váže na enzym vodíkovou vazbou


Iniciace translace – aktivace aminokyselin

Strukturované domény jejich vzájemná komunikace nejasná

Aminoacyl- tRNA syntetáza: Ø  funkce enzymu shodná napříč všemi říšemi Ø  velikost od 334 aminokyselin (Trp) až po 1 112 (Phe) Ø  tvořeny homodiméry, některé heterodiméry nebo tetramery Ø  3 aktivní místa: vazba ATP, vazba tRNA, (editace) Rozděleny do 2 tříd podle: struktury, lokalizace vazby ATP, vazby aktivované aminokyseliny k ribose na akceptorovém rameni v pozici 2ÓH nebo 3ÓH Ø  Specifita rozpoznání tRNA enzymem: Ø  terciární struktura Ø  přímé vodíkové vazby mezi tRNA CCA a enzymem Ø  baze 73 (diskriminační): kys. asrágová diskriminační + 4 další báze kolem antikodónu a další guanin poblíž metylován Stabilizujzující síly těchto domén: Ø  vodíkové, iontové, van der Waalsovy vazby

7

Iniciace translace – aktivace aminokyselin rozpoznání vazebných oblastí tRNA pro aaRS

2 třídy aaRS: a) glutaminyl-aaRS b) aspartyl-aaRS 1.: dva motivy (HIGH= červená, KMSKS= tm. modrá), v.m. pro ATP = žlutá, pro tRNA sv. modrá), aktivace AMI v hluboké a značně široké kapse N-konce enzymu, (některé typy obsahují zinek)

tRNAGln

tRNAAsp

tRNASer

tRNA na aaRS červená nezbytné funkční komformace = zelená

. 2.: tři motivy (červená, t. modrá, zelená), aktivace AMI v hluboce zanořené kapse C-konce enzymu, proto aktivuje spíše menší a polární AMI

fosfodiesterové kontakty =fialová

tRNA identifikační elementy – hlavní a pomocné Ø antikodon Ø akceptorové rameno

Kontrola: Chybová frekvence při translaci: 10-3–10-4 (chybné rozpoznání kodónu)

aaRS prověřuje tRNA i mRNA Prověření vazby tRNA:tRNA synthetasy – kinetické AMI:tRNA synthetasy - chemické

izoleucin + valin = Typ I (2ÓH)

¨

k. glutamová fenylalanin + treonin = Typ II (3ÓH)

Iniciace translace – aktivace aminokyselin

AaRS mnoho dalších domén + inzercí během evoluce = zvýšená katalická aktivita = vysoká míra spolehlivosti translace Ø  slabě konzervovaná vazba kodón-antikodón = zvýšená afinita a tím schopnost rozeznat odlišnosti mezi typy tRNA Ø  schopnost „prověřovat“ vazebného partnera a chybného nepřijmout

AaRS mnoho dalších domén + inzercí během evoluce = součást velkých komplexů zahrnutých do regulačních, kontrolních systémů buňky

8

Lee SW. et al 2004, Aminoacyl-tRNA synthetase complexes… J Cell Sci 117

Non-canonic + non-catalytic functions

AaRS – vysoká funkční flexibilita – multifunkční proteiny regulované odlišnými mechanizmy (lidské buňky) Ø  další domény Ø  aminoacylační doménu Ø  extenze C- i N-konce Funkce: 1.  v komplexech až 9 typů AaRS z obou strukturních tříd tvoří komplexy spolu s kofaktory EPRS (k. glutamová a prolin) + p43, p38, p18 a funkcí více, i umlčení translace 2.  jednotlivě extenze C- i N-terminálních oblastí (tyrozin) sekretován za apoptózy, odštěpuje přídatné části a „čistí prostor“

9

Non-canonic + non-catalytic functions

Smirnova EV et al. 2012, Biochemistry 77

Lee SW. et al 2004, Aminoacyl-tRNA synthetase complexes… J Cell Sci 117


Iniciace je mnohostupňovým procesem •  Aktivace aminokyselin •  Aktivace 40S ribosomální podjednotky •  Vytvoření ternárního komplexu •  Vytvoření preiniciačního komplexu •  Aktivace mRNA •  Vazba preiniciačního komplexu na čepičku mRNA •  „Scanování“ mRNA reiniciačním komplexem až po AUG kodón •  Vazba PABP na čepičku •  Recyklace eIF2.GDP

Iniciace translace – aktivace 40S podjednotky Ø  Stabilita zásoby ribosomálních podjednotek zajištěna fyziologickou koncentrace solí ( K, Cl a Mg iontů) Ø  Aktivace 40S podjednotky vazbou příslušných iniciačních faktorů: 40S = eIF3,eIF1, eIF1A eIF3

složen ze 13 podjednotek (17-170kDa), stabilizuje a koordinuje navazování další faktorů: eIF2, eIF4B, eIF4F s 43S komplexem, zprostředkuje vazbu mezi mRNA and 43S eIF1, 1A podílejí se na stabilizaci zásoby 40S podjednotek, na tvorbě TC, na scanování, na vyhledání AUG a na připravovaném spojení s 60S podjednotkou , eIF5 spolupráce s eIF1 a eIF1A, při nalezení AUG a vytvoření ribosomu Ø  Inhibice předčasného spojení 40S a 60S: iniciační faktor eIF6 (25 kDa) na 60S

10

Další role eIF3 eIF3

složen ze 13 podjednotek (17-170kDa), stabilizuje a koordinuje navazování další faktorů: eIF2, eIF4B, eIF4F s 43S komplexem, zprostředkuje vazbu mezi mRNA and 43S Vysoký počet pojednotek = vysoká rozmanitost funkcí (asociační + mutační studie)

Ø  vazby na eEF a tím regulace elongace Ø  podíl na uspořádávání cytoskeletu (Hob3p, Cpc2p, Rack1) Ø  kvalitativní kontrola translace – úloha podjednotek (d + e) Neočekávaně vysoká hladina v jadérku i jádře Ø  biogeneze ribozomů – podíl na usazování 90S pre-ribozomálních struktur a dále na uspořádávání 40S a 60S (možnost napojení na 40S už v jadérku) Ø  konečná podoba prozomů v jádře

multifunkčnost = dynamický systém translazom

spojuje translaci s degradací abiogenezou ribozomů = zvýšená přesnost translace (možnost okamžité likvidace chybných nascentních proteinů) znázorněno v proporčních velikostech

Sha Z. et al. 2009, Miolecular Cell 36

eIF3 (kvasinka) – kvalitativní kontrola translace

Další role eIF3 složen ze 13 podjednotek (17-170kDa), stabilizuje a koordinuje navazování další faktorů: eIF2, eIF4B, eIF4F s 43S komplexem, zprostředkuje vazbu mezi mRNA and 43S Vysoký počet pojednotek = vysoká rozmanitost funkcí (asociační studie) Ø  vazby na eEF a tím regulace elongace Ø  podíl na uspořádávání cytoskeletu Ø  kvalitativní kontrola translace – úloha eIF3d a eIF3e Neočekávaně vysoká hladina v jadérku Ø  biogeneze ribozomů – podíl na usazování 90S pre-ribozomálních struktur a dále na uspořádávání 40S a 60S (možnost napojení na 40S už v jadérku) i jádře eIF3

Ø  konečná podoba prozomů v jádře multifunkčnost = dynamický systém translazom spojuje translaci s degradací abiogenezou ribozomů = zvýšená přesnost translace (možnost okamžité likvidace chybných nascentních proteinů) Sha Z. et al. 2009, Miolecular Cell 36

11

Model eIF3- v translasomu

MSC = multisyntetázový komplex , eEF1,2,3, iniciační faktory , eIF3

Iniciace translace - aktivace 40S podjednotky

Sha Z. et al. 2009, Miolecular Cell 36

Iniciace translace – ternární + preiniciační komplex

Aktivace 40S ribosomální podjednotky: Ø  Vazba eIF3 +eIF1 + eIF1A

Iniciace translace - aktivace 40S podjednotky Vytváření ternárního komplexu, napojení iniciačního faktoru eIF2 (se 6 doménami) k aktivované tRNA (vazebná místa na tRNA = červená)

Ternární komplex (TC): Ø  Met-tRNA + eIF2:GTP + Met-tRNA Preiniciační komplex (PIC): Ø  Ternární komplex + 40S ribosomální podjednotka aktivovaná eIF3 + eIF1A + eIF1A

12

Iniciace translace -ternární + preiniciační komplex Ø 

Ø  Ø  Ø  Ø  Ø 


specifita vazby zajištěna faktorem eIF2 eIF2 tvořen 3 podjednotkami: alfa = 36kDa beta = 38 kDa gama = 52 kDa eIF2 nejprve váže GTP komplex eIF2-GTP váže přes tRNA ternární komplex: eIF2-GTP-Met tRNA místem vazby GTP- tRNAiMet je gama podjednotka místem vazby rRNA je beta podjednotky místem vazby pro cytoskelet je alfa podjednotka (zvyšuje podíl F aktinu) ternární komoplex se navazuje na 40S podjednotku, kde už jsou navázány eIF3 a eIF1A (vazba eIF2 na ribosomální podjednotku velmi slabá vazba ternárního komplexu velmi silná – závisí na dostatku ATP: nukleosid difosfát kinasa: regenerace GDP na GTP)

eIF3 stabilizuje vazbu ternárního komplexu na povrchu 40S podjednotky




13

Iniciace translace – aktivace mRNA

eIF4B

eIF4G

Vazba 4 iniciačních faktorů : eIF4B (70 kDa) eIF4E (25 kDa), eIF4G (174 kDa), eIF4A (46 kDa) = komplex eIF4F eIF4B zvyšuje aktivity eIF4G a eIF4A eIF4G a eIF4A mají motivy pro vazbu na jednořetězcovou mRNA eIF4A patří mezi DEAD bílkoviny (helikázy, mají sekvenci asp-glu-ala-asp 7x opakovaná sekvence, váže ATP a má ATPázovou aktivitu

Navázáním eIF4B a komplexu eIF4 F je čepička 5ÚTR- aktivována a připravena pro navázání preiniačního komplexu

eIF4A

eIF4A 1.  2.  3.  4.  5. 

aktivace mRNA při vazbě 43S aktivita vzrůstá za přítomnosti 4B, 4F, 4H odstranění regulačních proteinů na 5ÚTR helikázovou aktivitou uspořádává mRNA proscanování navázání na 43S hydrolyzuje ATP = motorem scanování

Ø  3 kopie na ribozom (výjímečně!!!) má 3 podjednotky A1: aktivita v rostoucích pletivech A2: aktivita v klidovém stavu buněk

A3: funkce mimo translaci, součást konfigurace mRNA v jádře

A1 - A2 = 95% identita

Ø  Fosforylace (stres, vývojové procesy), zvyšuje translaci

eIF4B

- vazba na PABP - mnohočetná fosforylační místa - míra fosforylace = intenzita translace - stres = defosforylace - jednotlivé stresory - specifická místa defosforylace

eIF4G - adaptér aktivace čepičky - stres: navázání sHSP27 = vyřazení čepičky z funkce + odstranění faktoru do stres granulí zvýšená exprese HSP70 = uvolnění faktoru obnova funkce

Iniciace translace – aktivace mRNA

Speciální role eIF-4E – ne zcela objasněna

může být hledaným regulátorem iniciace i karcinogeneze Ø  nejnižší kvantitativní zastoupení ze šech eIF Ø  složena z mnoha podjednotek Ø  regulována na třech úrovních – transkripční, posttranslační fosforylací eIF4E-BP (fosfoproteiny) Ø  změny ve fosforylaci (serinu) – korelují s průběhem buněčného cyklu Ø  vazba fosfoproteinů (serin, treonin) - inhibice translac Karcinogeneze = porucha regulace translace, hyperaktivace, i slabě translatované mRNA přepisovány s vysokou účinností eIF4E: jedna z klíčových molekul při hledání cílových léků proti karcinogenezi

14

Iniciace translace – vazba preiniciačního komplexu na aktivovanou mRNA

2.translace - „scanování preiniačním komplexem k AUG



pohyb 40S podél mRNA od 5´- 3´ = scanování Ø  Ø  Ø  Ø  Ø  Ø  Ø 

1. AUG většinou použit jako iniciátor translace antikodon iniciátorové tRNA + (eIF1 + eIF1A ) rozhoduje o výběru AUG pro výběr 1. AUG je rozhodující sekvence kolem kodonu kritická u živočichů: -3 a +4 kritická u rostlin jen +4 nebyl nalezen žádný specifický protein řídící scanování (eIF4A?) scanovácí aktivitace přímo úměrná počtu smyček na 5ÚTR mechanismus pohybu iniciačního komplexu po mRNA mechanismus volby AUG objasněny???

15

Regulace iniciace

Iniciace translace – úloha iniciačních faktorů

Vzniklý preiniačního komplexu (PIC) a role eIF1 a eIF1A: Ø  podporují scanování a umístění AUG do P místa Ø  udržují otevřenou komformaci = štěrbinu mRNA - 40S Ø  zavrhnou při scanování jiný než AUG triplet tim, že blokují uvolnění Pi z částečně hydrolyzovaného eIF2-GDP.Pi = „gate keeper“ Ø  Interakcí Met-tRNAiMet s AUG = komformační změny a ty uvolní C-konec eIFA1 pro vazbu s eIF5 a N-konec eIF1A s PIC Ø  disociace eIF1 z blízkosti P místa: spolupráce TC, eIF1, eIF5, eIF 3

scanování i selekce AUG ukončena

Iniciační faktor eIF1A D: eIF1A(žlutá) + eIF5 (šedá)

2.translace - „scanování preiniačním komplexem k AUG spojení ribosomálních podjednotek Ø  Scanování ukončeno, navázání antikodonu tRNA na AUG startovací kodon Ø  připojení 60S blokují iniciační faktory navázané v iniciačním komplexu na 40S Ø  na uvolnění se podílí eIF5 (50 kDa), který odváže eIF1A a eIF3 Ø  eIF5 hydrolysuje GTP v ternárním komplexu eIF2-GTP-Met-tRNA a tato konformační změna uvolní iniciační faktory ze 40S Ø  eIF5 je in vitro schopen hydrolyzovat ATP i GTP, ale za in vivo podmínek působí jako aktivátor GTPázy

Ø  další faktor eIF5A (17 kDa se specifickou posttranslační modifikací lysinu na N-(4-amino-2-hydroxybutyl)lysin Ø  funkce eIF5A: asistuje při připojení 6OS a při přemístění obou jednotek z bodu A do kapsy bodu P

16

2.translace - „scanování preiniačním komplexem k AUG co podstatným způsobem ovlivňuje proces scanování: struktura 5ÚTR – smyčky

3.translace - „scanování preiniačním komplexem k AUG Výběr z více AUG iniciačních kodonů Leaky scanning

Ø  charakter iniciačního kontexu, volba 1. AUG Ø  mini-ORF = snížená účinnost přepisu, reiniciace = 40S nedisociuje po terminaco stop kodonem, další AUG z ORF = leaky scaning

dostupnost iniciačních faktorů

Ø  eIF2 vážící tRNA se podílí se na hledání iniciačního kodonu Ø  fosforylace eIF2 zajišťuje jeho pevnou vazbu na eIF2B, jeho recyklace zastavena, jeho nedostatek pro další iniciaci (u rostlin tato funkce dosud nepotvrzena)

u rostlin existence 2 forem na čepičku vázaného komplexu eIF4F:

eIF4F nebo iso-eI4F, to skýtá možnost výběru = regulační funkce Ø  4F (24 kDa + 220 kDa v poměru 4:1) má vyšší afinitu k monometylované čepičce Ø  iso-4F (28 kDA + 80 kDa v poměru 1:1) má vyšší afinitu k dimetylované čepičce Ø  smyčka v 5ÚTR stabilizuje vazbu 4F a iso formu destabilizuje




Ø  eIF2 vážící tRNA se podílí se na hledání iniciačního kodonu Ø  fosforylace eIF2 zajišťuje jeho pevnou vazbu na eIF2B, jeho recyklace zastavena, jeho nedostatek pro další iniciaci (u rostlin tato funkce dosud nepotvrzena)




Iniciace je mnohostupňovým procesem •  Aktivace aminokyselin •  Aktivace 40S ribosomální podjednotky •  Vytvoření ternárního komplexu •  Vytvoření preiniciačního komplexu •  Aktivace mRNA •  Vazba preiniciačního komplexu na čepičku mRNA •  „Scanování“ mRNA reiniciačním komplexem až po AUG kodón •  Recyklace eIF2.GDP •  Vazba PABP na čepičku

17

2.translace - „scanování preiniačním komplexem k AUG

2. translace-recyklace eIF2.GDP

k zahájení translace je nezbytné změnit eIF2 uvolněné z iniciačního komplexu do formy vážící GTP a tím zahájit další iniciaci Ø  vazba eIF2-GDP je asi 100 krát silnější než eIF2-GTP Ø  k překonání této bariery - další faktor eIF2B

eIF2B = recyklační faktor

2. Translace - recyklace eIF2.GDP Regulace účinnosti translace: dostatek eIF2.GTP Další funkce eIF2 je podmíněna změnou vazby eIF2:GDP na eIF2:GTP eIF2:GDP musí navázat další faktor eIF2B (guanidin nukledotid exchange faktor) fosforylace eIF2B zintensivní vazbu faktorů, komplex eIF2:eIF2B:GDP je stabilní = dramatický pokles iniciace a brání vytvoření eIF2:GTP

i u rostlin potvrzena role GCN2 kinázy Ladeix et al. BMC Plant Biol. 2008, 8:134

Fosforylace eIF2 inaktivuje i IF4A a eIF4G = signál k tvorbě stresových granulí (SG)

18




Ø  eIF2 vážící tRNA se podílí se na hledání iniciačního kodonu Ø  fosforylace eIF2 zajišťuje jeho pevnou vazbu na eIF2B, jeho recyklace zastavena, jeho nedostatek pro další iniciaci (u rostlin tato


Poslední fáze iniciace: Ø  Odpoutání iniciačních faktorů z 40S podhednotky a z čepičky (podíl ATP nezbytný)

Ø  Recyklace eIF2-GDP na eIF2-GTP Ø  Aktivace 60Sribosomální podjednotky uvolněním eIF6 (podíl aktivovaného faktoru eIF5-GTP nezbytný)

funkce dosud nepotvrzena)





znázorněno v proporčních velikostech

19

1. Translační aparát – mRNA a vazebné bílkoviny na 3ÚTR Poly-A konec = stimuluje translaci = kooperace PABP + bílkovinných faktorů navázaných na čepičku 3ÚTR – cytoplamatický polyadenylační element (CPE) = místo vazby CPEB Komplex: CPEB-Maskin-eIF4E = inhibice translace Fosforylace CPEB = navázání PAB (poly (A)polymerázy = prodloužení poly(A) = vazba dalších PABP = odstranění Maskin proteinu a aktivace translace

Iniciace translace – vazba PABP Vazba mRNA na ribosom a scanování vyžaduje PABP Ø  Poly(A) má nejméně 1 PABP vazebné místo Ø  PABP jsou fosforylovány, míra fosforylace se mění, má regulační funkci (heterogenní míra fosforylace) Ø  fosforylace určuje afinitu vazby PABP-mRNA, PABP –PABP a PABP- 4G - 4E, PABP-4B Ø  kompetice mezi 4G a 4E o PABP1 a složitá konfigurace jejich společné vazby podmíněna fosforylací všech tří typů proteinů PABP ovlivňují funkční aktivitu mRNA:

Regulace iniciace role PABP

Iniciace translace – scanování kruhová struktura mRNA Možnost dalších iniciací, přepis 1 molekuly mRNA serií ribozomů

20

Iniciace translace – vazba PABP Ø  Vazebná doména pro PABP u rostlin nalezen u 4E, zatím ne u 4G

Iniciace translace – vazba iniciačních faktorů na PABP jakou roli hraje fosforylace PABP v iniciaci translace???

Ø  kruhové uspořádání mRNA molekuly potvrzeno Ø  PABP se váže i na 4B (u rostlin druhově specifická) = zvýšení translační účinnosti pokud je 4B fosforylován (časné fáze vývoje semen) Ø  u živočichů tato vazba spojena s apoptosou ( caspasae-3 + proteása odbourávají 45 N-terminálních AMI 4B faktoru a tím zmizí místo vazby pro PABP = inhibice proteosyntesy za apoptosy)

Ø  vysoká hladina fosforylace 4A se podílí na účinnosti proteosyntézy víc než fosforylace ostatních složek 4F (nízká fosaforylace za stresu) Ø  zvýšení afinity vazby PABP a helikasové aktivity zajištěno nejen vazbou s 4E, 4G, ale i s kompletním 4F Ø  translační účinnost ovlivněna i koncentrací PABP (ježovka v prvním rýhování, jen 1 PABP)

Ø  dostatek PABP – přednostně přepisovány čepičkované, výrazně polyadenylované mRNA se strukurovanou 5ÚTR

míra fosforylace iniciačních faktorů a PABP selektivně ovlivňuje jejich vzájemné interakce, ovlivňuje intensitu translace

PABP

PABP: Ø  interakce s eIF4G Ø  stimulace vazbu mRNA – 43S PIC stimulací vazby eIF4F k čepičce Ø  stimulace připojení 60S podjednotky Ø  interakce s terminačními faktory eRF1, eRF3



21

2. Translace – modifikace iniciace

Regulace účinnosti translace:dostatek volného eIF4E

fosforylace a iniciace Ø  regulace translace = regulace iniciace = regulace aktivity iniciačních faktorů + PABP Ø  počet fosforylací koreluje s účinností translace Ø  zvýšený počet fosforylací = zvýšená účinnost translace Ø  míra poklesu translace neodpovídá ekvivaletně míře fosforylace, 80-95% pokles translace = 15-25% fosforylace F2 Ø  fosforylace 4F (4G) zvyšuje kompetivnost mRNA při obsazování translačního aparátu, hlavně méně aktivních typů mRNA existují výjímky: - fosforylace eIF2 nebo její alfa podjednotky = ztráta aktivity ( za stresu, při virové infekci)

!!!- defosforylace a tím recyklace eIF2 = aktivace translace

Úloha fosforylace v iniciaci translace

2. translace- iniciace Iníciace končí nalezením prvního AUG, uvolněním všech iniciačních faktorů a tím zformování ribosomu

22

2. translace- iniciace Iniciace je mnohostupňovým procesem •  Aktivace aminokyselin •  Aktivace 40S ribosomální podjednotky •  Vytvoření ternárního komplexu •  Vytvoření preiniciačního komplexu •  Aktivace mRNA 2. translace- iniciace •  Vazba preiniciačního komplexu na čepičku mRNA •  „Scanování“ mRNA reiniciačním komplexem až po AUG kodón •  Vazba PABP na čepičku •  Recyklace eIF2.GDPNapojení PABP na čepičku Iniciace – „čepička“ na 5ÚTR =

platí vždy ???

scanovací model

2. translace- iniciace Proč nový model pro iniciaci? celá řada poznatků není v souladu se scanovací hypotézou - nebere v úvahu proměnlivost ribosomů - proměnlivost afinity mRNA k iniciačním faktorů - v sekvenci mRNA nalezeny oblasti odpovídající sekvencím rRNA - přímá vazba mRNA na rRNA - 40S Ø  tyto interakce ovlivněny structurálními změnami ribosomů během ontogeneze Ø  rRNA-like sekvence nalezeny v mRNA v délce 7-14 nucleotidů Ø  sekvence GC-typu, komplementární v 13 místech 28S rRNA = site of IRES

iniciace prokaryontního typu

2. translace- iniciace, IRES

23

2. translace- iniciace, IRES Prokaryonta: mRNA bez čepičky , AUG se identifikuje iniciačním komplexem = 30S podjednotka + iniciátorová tRNA ( formylmethioninem fMet-tRNA) + 3 iniciační faktory ( IF1, IF2, IF3) Ø  iniciační kodon AUG, (GUG + UUG) Ø  iniciační komplex se váže přímo na iniciační kodon, který je umístěn za sekvencí Shine-Dalgarno (SD) Ø  SD = 7 purimových nukleotidů jež komplementují

2. translace- iniciace, IRES IRES – další způsob iniciace v eukaryontních buňkách některé eukaryontní mRNA bez čepičky, nepoužívají scanovací model Ø  jejich 5´ UTR oblast obsahuje určitou sekvenci (obdoba SD) = IRES (internal ribosomal entry side = místo vysoké afinity pro vazbu iniciačního komplexu) Ø  tento iniciační faktor nezbytný pro IRES přepis Ø  i pro IRES systém platí nezbytnost rozvinutí 5ÚTR struktury Ø 

IRES = obdoba iniciace prokaryont

Eukaryonta- přímá vazba 40S + cis sequence mRNA

hypotéza ribosomálního filtru „ribosomal tethering and clustering“

(cis regulační sekvence v mRNA) IRES (internal ribosomal entry side) = místo vysoké afinity pro vazbu iniciačního komplexu)

funkce: vnitřní regulační signál

Hypotéza ribosomálního filtru

Iniciace: scanování x fitr ??? jak by filtr mohl fungovat?

A: 40S se váže na vazebná místa na mRNA (šedé zony)

Ø 

B: pevná vazba mezi 40S a mRNA zpomalí nebo až blokuje posun k AUG = regulace translace

Ø 

C: slabší vazba 40S podjednotky, flexibilita, možnost navazovat další podjednotky D: v případě C, více možností – 1=pohyb k čepičce 2=reorientace na mRNA – scanování 3=vazba na další vazebné místo 4=pohyb k AUG pomocí ternárního komplexu

Ø 

Ø  Ø 

silné interakce mezi 40S a mRNA = stop translaci slabé interakce pohyb 40S: - k čepičce - nebo přímo k AUG pomocí ternárního komplexu hypotéza dovoluje jedné sekvenci působit jako umlčovatel i jako zesilovač „podle stavu v buňce“ účinnost translace se může měnit podle vzdálenosti mezi lokalizací ribosomu a iniciačním kodonem co zůstává nepotvrzeno podíl na ribosomy navázaných proteinů na iniciaci translace dopad konfiguračních změn ribosomů na základě proměnlivosti zastoupení jednotlivých r-proteinů

24

Iniciace: scanování x IRES ???

Ribosomální filtr Významná role ve virové patogenezi lidských buněk (roztroušená sklerosa) IRES elementy u napadených buněk mohou umožnit aktivaci několika kodonů a to jak pro polyprotein, tak pro L proteiny (virové typy)

Zelená = IRES Bledě modrá = 40S eIF2 = červená eIF3 = tmavo modrá tRNA = černá ITAF = bílkovina modulující IRES ve prospěch využívání všech AUG pro různé typy bílkovin

Iniciace: hypotéza ribosomálního filtru nová hypotéza vysvětluje existenci trvale na polysomy navázaných mRNA Ø  podporou hypotézy je prokázaná heterogenitou ribosomů a složení 5ÚTR mRNA Ø  vysvětlí zesílení i umlčení přepisu Ø  podporou je i důkaz IRES sekvence u řady mRNA lokalizovaných v buňce excentricky (vedou k morfogenesi) pokud by hypotéza byla prokázána Ø  mělo by smysl vnášet ribosomy do nepříbuzných organismů nebo z jednoho vývojového stádia do druhého

ribosomy = nový nástroj regulace translace

co mluví ve prospěch IRES Ø  interakce = párování basí mezi komplementárními segmenty mRNA a rRNA a vazbou mezi mRNA a ribosomálními proteiny Ø  interakce na základě kompeticí různých mRNA segmentů o vazbu na rRNA Ø  filter“ může také modulovat změny nebo maskovat určitá vazebná místa na ribosomech Ø  tyto interakce ovlivněny strukturální proměnlivostí ribosomů a mohou být využívány systémem IRES

buňka může využívat obou systému iniciace a upřednostňovat jednu z nich podle situace v buňce, nebo v celém organismu

2. translace- initiace – altivní role ribosomů ribosom = regulační struktura = selection + preferenční syntheza specifikých mRNA Ø  interakce mRNA – rRNA = kompetitivní charakter Ø  „filter“ může: modulovat změny, maskovat vazebná místa ribosomu změny vazebných míst: -hererogenita složení ribosomů - interakce s bílkovinami vázanými na ribosomy - interakce s microRNA (21-24 nukleotidů) - fosforylace ribosomálních bílkovin

25

Iniciace: scanování x IRES ??? heterogenita ribosomů podmíněna geneticky: heterogenita r-proteinů: Ø  kvalitativními změnami v 6 proteinech Ø  kvantitativnimi změnami ve 29 proteinech Ø  metylací ve 14 a fosforylací u 2 proteinů heterogenita rRNA:

Děkuji za pozornost

Ø  rRNA kodovany mnohočetnými rodinami Ø  substituce a delece mezi jednotlivými rRNA geny časté v lidských buńkách nalezeno 35 variant 28S rRNA variabilita častá i u 5S rRNA: u ježovky oocyty - se 6 rozdílnými nukleotidy somatické buňky - se 120 royzdílnými nukleotidy

Přijďte zase příště na kus řeči o translaci

26

REGULACE TRANSLACE TRANSLAČNÍ APARÁT. 1. Translační aparát. 1. Translační aparát translační faktory

Recommend Documents