Purifikasi Imunoglobulin Yolk Anti Avian Influenza Dari Kuning Telur Ayam Arab Darmawi1, Muhammad Hambal2, Fakhrurrazi1 1 Staf Pengajar Mikrobiologi Pada Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Syiah Kuala, Jl. Hasan Krueng Kale no.8, Darussalam Banda Aceh 2 Staf Pengajar Parasitologi Pada Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Syiah Kuala, Jl. Hasan Krueng Kale no.8, Darussalam Banda Aceh * E-mail:
[email protected] Abstrak Imunoglobulin pada unggas disebut immunoglobulin yolk (IgY), untuk membedakannya dengan IgG mamalia. Tujuan penelitian ini adalah untuk memurnikan IgY dan mengetahui kuantitas protein IgY yang dipurifikasi dari kuning telur ayam arab yang divaksin dan memiliki titer antibodi protektif terhadap Avian Influenza. Sebanyak 20 ekor ayam petelur jenis Breakel Silver digunakan pada riset ini. Semua ayam divaksinasi dengan vaksin komersial Avian Influenza (H5N1). Purifikasi IgY mengikuti metode EggstractTM IgY Purification System. Kuantitas IgY ditentukan dengan metode Bradford (λ = 280 nm). Hasil menunjukkan bahwa konsentrasi protein IgY setelah dipurifikasi adalah 2,56 mg/ml. Kajian ini menunjukkan bahwa kuning telur dari ayam yang divaksinasi dengan vaksin komersial mengandung antibodi anti-Avian influenza. Kata kunci: Avian influenza, antibodi, ayam petelur Abstract The main immunoglobulin fraction of poultry is called IgY, in order to distinguish it from the mammalian IgG. The aim of this research is focus on purification and concentration of purified yolk immunoglobulin of hens obtained from yolk of Breakel Silver chickens vaccinated to obtained purity IgY. As many as 20 breakel silver layer were used in this research. The laying hens were vaccinated using Avian Influenza commercial vaccine (H5N1). IgY was extracted from serum by means of purified using EggstractTM IgY Purification System. The purity of anti-Avian influenza IgY protein was determined by Bradford method (λ = 280 nm). The result showed that IgY concentration after purification was 2,56 mg/ml. This study has shown that the yolk of chickens vaccinated with commercial vaccine contained antibody anti-Avian influenza. Key words: Avian influenza, antibody, laying hens
1
1. Pendahuluan Infeksi virus H5N1 pada host dimulai ketika virus memasuki sel hospes setelah terjadi penempelan (attachment) spikes virion dengan reseptor spesifik yang ada dipermukaan sel hospesnya. Virion akan menyusup ke sitoplasma sel dan akan mengintegrasikan materi genetiknya di dalam inti sel hospesnya, dan dengan menggunakan mesin genetik dari hospesnya, virus dapat bereplikasi membentuk virion-virion baru, dan virion-virion ini dapat menginfeksi kembali sel-sel sekitarnya. Hasil pemeriksaan spesimen klinik yang diambil dari penderita, ternyata Avian Influenza H5N1 dapat bereplikasi di dalam sel nasofaring dan di dalam sel gastrointestinal. Fase penempelan adalah fase yang paling menentukan apakah virus dapat masuk atau tidak ke dalam sel hospesnya untuk melanjutkan replikasi. Virus H5N1 juga dapat dideteksi di dalam darah, cairan cerebrospinal, dan tinja pasien (WHO, 2005). Pada jenis unggas yang sehat, paparan Avian Influenza H5N1 akan menghasilkan antibodi immunoglobulin yolk (IgY) di dalam serum dengan spesifisitas antibodi yang tinggi (Rollier dkk., 2000). IgY lebih berperan sebagai sistemik antibodi daripada sekretori antibodi, meskipun IgY dapat ditemukan dalam saluran pencernaan duodenum, trachea, dan seminal plasma (Carlander, 2002). Molekul imunoglobulin diproduksi oleh sel limfosit B, dimana sel limfosit B mengalami pematangan dalam bursa Fabricius ayam. Sel limfosit B terdiri dari dua bentuk molekul yang berbeda, molekul pertama sebagai reseptor permukaan (untuk mengikat antigen) dan molekul lainnya sebagai antibodi yang disekresikan ke dalam cairan ekstraseluler. Antibodi yang disekresikan dapat berfungsi sebagai media yang mengikat antigen melalui binding site yang spesifik, sekaligus merupakan jembatan yang menghubungkan antigen dengan sel-sel imun atau mengaktifkan komplemen (Roitt dan Delves, 2001). IgY mengemban fungsi yang setara dengan IgG mamalia. IgY berevolusi dan diduga menjadi cikal bakal IgG dan IgE mamalia. Namun, berdasarkan struktur fundamennya ada perbedaan antara IgG mamalia dan IgY unggas. Molekul IgY terdiri dari dua rantai berat dan dua rantai ringan. Rantai berat tidak memiliki engsel dan tersusun atas empat domain variabel yaitu Cv1, Cv2, Cv3, dan Cv4. IgY memiliki berat molekul ~180 kDa yang masing-masing rantai beratnya ~65-68 kDa, koefisien sedimentasi 7,8 S, dan titik isoelektrik 5,7-7,6 (Chio, 2002 dan Davalos-Patoja dkk., 2000). Penelitian ini akan fokus pada penentuan kuantitas protein IgY yang terdapat di dalam kuning telur ayam arab jenis Breakel Silver yang divaksin dengan vaksin komersial Avian Influenza (H5N1). IgY dipurifikasi melalui metode EggstractTM IgY Purification System. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan IgY murni yang terdapat di dalam kuning telur. Diharapkan IgY murni yang diperoleh dari penelitian ini dapat dimanfaatkan untuk kepentingan imunodiagnostik yang dapat mengenal antigen virus Avian Influenza (H5N1) melalui reaksi homolog antigen-antibodi, dan juga diaplikasikan sebagai imunogen yang bersifat merangsang pembentukan antibodi anti-idiotipe pada spesies lainnya selain unggas.
2
2. Metode 2.1 Rancangan Penelitian Sebanyak 20 ekor ayam petelur jenis Breakel Silver yang tidak pernah divaksin dengan vaksin Avian influenza diperoleh dari pedagang ayam komersial. Ayam dipelihara secara individual dalam kandang batere, diberi pakan dan minum secara et libitum. Semua ayam tersebut divaksinasi dengan vaksin komersial Avian Influenza (H5N1). IgY dipurifikasi dari kuning telur. Kuantitas protein IgY diuji melalui uji Bradford. 2.2. Vaksinasi ayam petelur dengan vaksin komersial Avian Influenza (H5N1) Dua puluh ekor ayam petelur jenis Breakel Silver divaksinasi dengan vaksin komersial Avian Influenza (H5N1). Teknik vaksinasi yang digunakan mengikuti metode Li dkk. (2005), yaitu suntikan pertama menggunakan 0,5 ml antigen vaksin komersial Avian Influenza (H5N1) dengan emulsi plus Freund’s Complete Adjuvant (FCA) dan setiap 2 minggu berikutnya diikuti suntikan booster. Booster dilakukan sebanyak 3 kali, setiap kali booster menggunakan suntikan 0,5 ml antigen vaksin komersial Avian Influenza (H5N1) dengan suntikan emulsi Incomplete Freund’s Adjuvant (IFA). 2.3. Purifikasi Imunoglobulin Y (IgY) dari Kuning Telur Purifikasi IgY dilakukan melalui metode EggstractTM IgY Purification System. Sebanyak 80 ml kuning telur dilarutkan ke dalam 240 ml solution A. Larutan distirer selama 5 menit dan disentrifus pada 1500 g dengan temperatur 4 0 C selama 15 menit. Supernatan ditambahkan solution B sebanyak 1/3 volume supernatan. Larutan distirer dan disentrifus pada 1500 g dengan temperatur 4 0C selama 15 menit. Pelet dilarutkan dengan Phosphate Buffered Saline (PBS) menjadi volume awal (80 ml) dan ditambahkan solution B sebanyak 1/3 volume larutan pelet. Larutan distirer dan disentrifus kembali pada 1500 g dengan temperatur 4 0C selama 15 menit. Pelet dilarutkan dengan Phosphate Buffered Saline (PBS) menjadi ¾ volume awal (60 ml) (Haak-Frendscho, 1994). 2.4. Kuantitas Protein IgY Sebanyak 10 mg Bovine Serum Albumin (BSA) dilarutkan dengan 10 ml aquadest dan dibuat 15 tingkatan konsentrasi sebagai standart. Sebanyak 100 l dari masing-masing tingkatan ditempatkan dalam tabung reaksi steril lainnya dan ditambahkan dengan 5 ml larutan Bradford. Sebagai blanko digunakan 3 tabung reaksi steril masing-masing diisi dengan 100 l aquadest dan ditambahkan dengan 5 ml larutan Bradford. Sebanyak 100 l sampel dari masing-masing IgY diisi ke dalam tabung reaksi steril dan masing-masing ditambahkan dengan 5 ml larutan Bradford. Standart, blanko, dan sampel masing-masing dimasukkan ke dalam tabung kuvet untuk dilihat hasil absorbansinya dengan menggunakan Spectrophotometer dengan mengikuti metode Bradford (Balqis dkk., 2008 dan Darmawi dkk., 2008).
3
3. Hasil dan Pembahasan Implikasi dari rangsangan respons imun ayam petelur adalah terbentuknya antibodi spesifik di dalam serum. Pada ayam petelur, antibodi yang terbentuk di dalam serum juga didepositkan ke dalam kuning telur (Darmawi dkk., 2009). Hasil penelitian ini membuktikan bahwa ayam petelur yang divaksin dengan vaksin H5N1 memiliki titer antibodi positif meningkat (hasil tidak ditunjukkan). Hal ini sesuai dengan laporan Soejoedono dkk. (2005) bahwa pemaparan antigen ke dalam tubuh induk ayam akan menghasilkan antibodi spesifik terhadap antigen yang disuntikkan. Ayam petelur yang diimunisasi dengan Streptococcus mutans, Salmonella enterotidis, dan Escherichia coli menunjukkan serum dan ekstraksi kuning telur positif mengandung IgY terhadap bakteri tersebut dua minggu pascavaksinasi. Penelitian kami terdahulu membuktikan pula bahwa ayam petelur yang divaksin dengan antigen ekskretori/sekretori A. galli dapat membentuk antibodi mulai minggu ke-4 pascavaksinasi (Darmawi dkk., 2010). Kuantitas protein IgY yang ditemukan pada purifikasi EggstractTM IgY Purification System adalah 2,56 mg/ml serum (Tabel 1). Untuk mengetahui kuantitas protein antibodi serum terhadap Avian influenza, pada riset ini dilakukan pemerikasaan kandungan protein IgY dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 280 nm. Sampel diambil pada tahap resuspensi menjadi volume awal (80 ml) dan tahap akhir purifikasi ¾ volume awal (60 ml). Kuantitas protein IgY pada tiap-tiap tahap purifikasi disajikan pada berikut ini. Tabel 1. Kuantitas protein yolk pada tiap-tiap tahapan purifikasi IgY Tahap purifikasi ______ Kuantitas protein (mg/ml) Resuspensi menjadi volume awal 2,56 Resuspensi menjadi ¾ volume awal 2,98 _________________________________________________________ Selain metode EggstractTM IgY Purification System, IgY dapat juga dipurifikasi melalui metode Hight Performance Liquid Chromatography (HPLC). Pada metode EggstractTM IgY Purification System, IgY dipurifikasi melalui prosen pelarutan dan pengendapan, dimana larutan A berfungsi untuk melarutkan protein, sedangkan larutan B berfungsi mengendapkan protein sehingga protein antibodi IgY dapat dipisahkan. Pada metode HPLC, protein antibodi IgY dipisahkan melalui tahapan pengendapan dengan amonium sulfat, dialisis, pengendapan dengan polyethylinglycol (PEG), dan akhirnya dilalukan ke dalam kolom FPLC. Darmawi dkk. (2010) membuktikan bahwa ayam petelur yang divaksin dengan antigen ekskretori/sekretori A. galli mampu menghasilkan antibodi IgY seberat 0,875 mg/ml kuning telur yang dipurifikasi melalui metode HPLC. IgY yang dihasilkan melalui metode HPLC menunjukkan hasil yang lebuh murni dibandingkan dengan metode EggstractTM IgY Purification System. Haak-Frendscho (1994) melaporkan bahwa ayam petelur White Leghorn yang diinjeksi pada beberapa lokasi subcutan dengan 20 – 500 μg antigen yang dicampur dengan FCA dan diikuti 2-3 kali booster dapat menghasilkan 90 – 100 mg IgY, 1 -10% (1 -10 mg) diantaranya adalah IgY spesifik. Tizard (1996) menyatakan bahwa pada mamalia IgG yang merupakan komponen utama
4
imunoglobulin serum dengan berat molekul 160.000 Da memiliki kadar dalam serum sekitar 13 mg/ml dan merupakan 75 % dari semua imunoglobulin. IgG dan komplemen bekerja saling membantu sebagai opsonin pada pemusnahan antigen. IgG mempunyai sifat opsonin yang efektif karena sel-sel fagosit, monosit dan makrofag mempunyai reseptor untuk fraksi Fc dari IgG sehingga dapat memperat hubungan antara fagosit dengan sel sasaran. Selanjutnya proses opsonisasi tersebut dibantu oleh reseptor untuk komplemen pada permukaan fagosit. IgG merupakan antibodi predominan pada respon kedua dan membangun sistem pertahanan terhadap bakteri dan virus. Untuk menentukan berat molekul IgY dilakukan dengan uji SDS PAGE. Hasil visualisasi berat molekul IgY melalui SDS-PAGE disajikan pada Gambar 1. kDa
1
2
3
4
225
150 100 75 50
Gambar 1. Visualisasi pita protein IgY melalui uji SDS PAGE Keterangan:
kDa = kilo Dalton, 1 = marker; 2, 3, dan 4 = Sampel hasil purifikasi IgY dari Yolk melalui metode EggstractTM IgY Purification System
SDS PAGE mampu memvisualisasikan karakter IgY berdasarkan berat molekulnya. Mekanisme SDS PAGE diawali oleh memasukkan sampel IgY ke dalam sumur gel (buffer gel pengumpul) yang memeliliki pori yang lebih besar. Gel pengumpul berfungsi untuk mengumpulkan protein IgY yang selanjutnya bermigrasi di bawah pengaruh arus listik. Berat molekul yang paling rendah berada pada lapisan yang paling bawah, sedangkan protein yang memiliki berat molekul yang tinggi berada pada lapisan di atasnya. Migrasi IgY terjadi karena sifat gel poliakrilamid yang memiliki kemampuan sebagai katalisator pada tahap awal polimerase. Semakin tinggi konsentrasi poliakrilamid yang digunakan maka semakin kecil ukuran molekul yang dipisahkan dan mobilitas molekul semakin besar sehingga metode SDS PAGE pada riset ini menggunakan gel poliakrilamid 12% dapat memisahkan IgY yang memiliki berat molekul tinggi (kira-kira 180 kDa) dan mobilitas molekul yang besar (Wilson dan Walker, 2000).
5
Sebagai pertimbangan bahwa produksi antibodi IgY pada bangsa unggas dan reptil unggas dapat dilakukan melalui teknik vaksinasi dengan cara menginjeksikan antigen dan adjuvant secara subkutan, intramuskular, atau secara oral dalam interval waktu tertentu (Carlander, 2002 dan Hammond, 2007). Schade dkk. (1999) merekomendasikan bahwa untuk produksi IgY pada ayam petelur dosis antigen yang akan digunakan adalah 10 – 100 μg dalam emulsi FCA untuk memicu reaksi lokal pada jaringan subkutan atau intramuskular. Frekuensi vaksinasi dilakukan dua sampai tiga kali booster dalam interval waktu 4 – 8 minggu sebelum masa ayam bertelur. Teknik imunisasi pada ayam yang dilakukan Camenisch dkk. (1999) untuk memicu terbentuknya IgY anti human hypoxiainducible factor 1 (anti-HIF-1α) dalam kuning telur ayam adalah dengan menyuntikkan 80 μg antigen fusi protein plasmid bakteri yang mengekspresikan HIF-1α dengan glutathione S-tranferase yang diresuspensi dengan 500 μl PBS dan dicampur dengan 500 μl CFA pada otot dada. Booster dilakukan dua kali dengan cara menyuntikkan 60 μg antigen yang dicampur dengan IFA pada minggu ke-2 dan 4. 4. Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa kuning telur dari ayam arab yang divaksin dengan vaksin komersial (H5N1) mengandung IgY yang ditandai oleh adanya IgY yolk dapat dipurifikasi dengan konsentrasi protein IgY adalah 2,56 mg/ml yolk. Pita protein yang diviasualisasikan adalah molekul IgY utuh 180 kDa dan rantai berat IgY 67 – 70 kDa. Ucapan Terima Kasih Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dewi Asnita yang telah berperan sebagai teknisi yang membantu penelitian ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Kementrian Negara Riset dan Teknologi yang telah membiayai Riset ini melalui Riset Insentif 2009 s.d 2010. Daftar Pustaka Balqis, U., Tiuria, R., Priosoeryanto, B.P., Suhartono, M.T., dan Darmawi, (2008) Purifikasi Protease Dari Ekskretori/Sekretori Yang Dilepaskan Oleh Stadium L3 Ascaridia galli. Proceeding: Seminar Nasional BKS-PTN Wilayah Barat, Banda Aceh, 3 – 4 Juni. Camenisch, G., M. Tini, D. Chilov, I. Kvietikova, V. Srinivas, J. Caro, P. Spielmann, R. H. Wenger, and M. Gassmann (1999) General Applicability of Chicken Egg Yolk Antibodies: the Performance of IgY Immunoglobulins Raised Against the Hypoxia-inducible Factor 1 . J. FASEB. 13: 81-88. Carlander, D., (2002) Avian IgY Antibody: in vitro and in vivo. Dissertation, Acta Universitatis Upsaliensis, Uppsala. Chio, V., (2002) Ducks Antibodies for IVD Applications. IVD Technology. http://www.decifelink.com/ivdt/archive/02/04/003.html. (20-02-2003).
6
Darmawi, Hambal, M., Estuningsih, S.E., Jamin, F., Balqis, U., (2008) Kuantitas Protein Ekskretori/Sekretori dan Tegumen Fasciola gigantica. Prosiding: Seminar Nasional BKS-PTN Wilayah Barat, Banda Aceh, 3 – 4 Juni. Darmawi, Balqis, U., Hambal M., (2009) Deposit Antibodi AntiEkskretori/Sekretori Ascaridia galli di Dalam Yolk Ayam Petelur. Prosiding Seminar Nasional dan Pameran Hasil-Hasil Penelitian (Dalam Rangka Dies Natalis UNRAM ke 47), Mataram, 29-30 September, 304312. Darmawi, Balqis, U., Tiuria, R., Hambal M., dan Samadi, (2010) Purifikasi Imunoglobulin Yolk Pada Ayam Yang Divaksin Terhadap Ekskretori/Sekretori Terhadap Stadium L3 Ascaridia galli, Jurnal Agripet, 10(2), 9–15. Davalos-Patoja, L., Ortego-Vinuesa, J.L., Bastos-Gonzales, D., Hidalgo-Alvarez, R., (2000). Colloidal Stability of IgG and IgY-coated Latex Microspheres, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 20(2): 165-175. Haak-Frendscho M. 1994. Why IgY? Chicken Polyclonal Antibody, an Appealing Alternative. Promega Notes Magazine (46): 11. Li, B., Peng, J., Niu, Z., Yin, X., and Liu, F., (2005) Preparation of Anti-Idiotypic Antibody Against Avian Influenza Virus Subtype H9. Cellular and Molecular Immunology, 2(2): 155 – 157. http://www.cmi.ustc.edu.cn/2/2/155.pdf (26-12-06) Roitt, I.M., and Delves, P.J., (2001) Roitt’s Esential Immunology. Tenth Edition, Blackwell Science Ltd. Osney Mead Oxford OX2 OEL. Rollier, C., Charollois, C., Jamrd, C., Trepo, C., and Cova, L., (2000) Maternally Transferred Antibodies from DNA-Immunized Avians Protect Offspring Against Hepadnavirus Infection. J. of Virol. 74(10): 4908 – 4911. Schade, R., Henklein, P., and Hlinak, A., (1999) The Production of Avian (Egg Yolk) Antibodies: IgY. The Report And Recommendations of ECVAM Workshop 211,2. Reprinted with Minor Amendments from ATLA 24: 925 - 934. Soejoedono, R.D., Wibawan, I.W.T., dan Hayati, Z., (2005) Pemanfaatan Telur Ayam Sebagai Pabrik Biologis: Produksi ”Yolk Immunoglobulin” (IgY) Anti Plaque dan Diare dengan Titik Berat pada Anti Streptococcus mutans, Escherichia coli dan Salmonella enterotidis. Laporan Riset Unggulan Terpadu, Kementrian Negara Riset dan Teknologi Republik Indonesia. Tizard, I.R., (1996) Veterinary Immunology an Introduction. Fifth Edition, WB Sounders Company, a Division of Harcourt Brace and Company. The Curtis Center Independence Square West, Philadelphia, Pennsylvania. Wilson, K. and Walker, J., (2000) Principle and Techniques of Practical Biochemistry, 5th Ed., UK., Cambridge University Press. Word Health Organization. (2005) Avian Influenza. Assessing the Pandemic Threat. http://www.who.int/csr/disease/influenza/H5N1 (26-12-06)
7
