Preimplantační genetická diagnostika (PGD) Molekulárně-genetická diagnostika vybraných dědičných chorob
PGD – preimplantační genetická diagnostika • zahrnuje soubor technik, které se používají pro zjištění genetické výbavy embryí • umožňuje najít vady v genetické výbavě embryí brzo po jejich vzniku a ještě předtím, než budou transferována do dělohy • může zjistit nepříznivé genetické odchylky konkrétně pro každé embryo, aniž je přitom poškozeno • může zjistit jak genetické vady, které očekáváme, tak i vady, které vznikají náhodně při vývoji vajíček a spermií • umožňuje porod dítěte párům, které jsou nositeli vady snižující výrazně pravděpodobnost donošení plodu a narození dítěte
1
Obecné indikace k PGD • páry s nosičstvím chromozomální aberace • páry s nosičstvím malých chromozomálních mozaiek • páry s výskytem dědičné choroby vázané na chromozom X • páry s genetickou zátěží v rodině (některé monogenní choroby) • páry s opakovanými reprodukčními ztrátami • páry s opakovaným selháním IVF cyklu • páry po prodělané chemo-/radioterapii • páry vyšší věkové hranice
Proč provádět PGD • 10-15% klinicky ověřených gravidit končí spontánním potratem v I. trimestru • v 85% je příčinou spontánního potratu do konce I.trimestru vrozená chromosomální aberace • 99% všech aneuploidních embryí se potrácí samovolně do konce I.trimestru • preimplantační diagnostikou u párů se špatnou reprodukční prognózou lze zvýšit implantační skóre 2-3x • u párů s balancovanou translokací lze 90% potratovost snížit na 13%
2
Biopsie pólových tělísek 1.pólové tělísko = produkt prvního meiotického dělení → obsahuje 23 bivalentních mateřských chromozómů 2. pólové tělísko = produkt druhého meiotického dělení → obsahuje 23 mateřských chromatid • •
vyjmutí embryo nijak nezatíží vyloučení chorob, jejichž nosičkou je matka posouzení genetické kvality vajíček
•
vyšetření pouze mateřského genetické informace rekombinace probíhající mezi homologními chromozómy (sesterské chromatidy mohou mít heterozygotní genotyp)
Biopsie blastocysty • 5-6 den po oplodnění (~100 buněk) • ke genetickému vyšetření se odebírá asi 10 buněk trofoblastu (není ovlivněn časný vývoj embrya) • možnost vyšetření většího počtu buněk a menší technická náročnost celé procedury biopsie
vyšetření pouze extraembryonální tkáně
3
Biopsie blastomer • odběr blastomery z 6-8 buněčného embrya • fixace blastomery na sklíčko • cytogenetická analýza (FISH) • molekulární analýza (PCR)
Analýza odebraných blastomer • FISH – možno vyšetřit jen omezený počet chromozómů • PCR – konkrétní genové mutace • CGH • mikročipy
4
Real Time PCR • sleduje se zvyšování koncentrace cílové DNA měřením fluorescence a během jednotlivých cyklů PCR jsou naměřené výsledky fluorescence okamžitě zobrazovány na monitoru • pro detekci mutací se využívá hybridizačních sond s přenosem rezonanční fluorescenční energie (FRET – Fluorescence Resonance Energy Transfer), které jsou komplementární k určitému úseku mezi amplifikačními primery; na 3´konec jedné sondy je navázána donorová fluorescenční barva (fluorescein) a na 5´konec druhé sondy akceptorová fluorescenční barva → po procesu FRET, kdy donorové fluorescenční barvivo emituje světlo sloužící jako excitační záření pro akceptorovou fluorescenční barvu, emituje akceptorová fluorescenční barva světlo vlnové délky, které se po průchodu příslušným filtrem změří • pro identifikaci mutací je využívána metoda založená na měření změn teploty tání Tm jednotlivých PCR produktů (předpokladem je, aby mutace byla v místě, kde nasedá jedna z hybridizačních sond) → je-li přítomna v amplifikovaném templátu mutace, chybné párování se projeví snížením teploty Tm a posunem příslušného píku do oblasti nižších teplot
FRET sondy
sondy po nasednutí – emise akceptora v důsledku FRET
sonda s rozdílnou Tm oddělena, FRET přerušen, emise donora
sondy odděleny v důsledku elongace řetězce při PCR, FRET přerušen, emise donora
5
Duálně značené sondy • využití 5´-3´ exonukleázové aktivity Taq DNA polymerázy ke štěpení neprodlužovatelné sondy značené na koncích párem fluoroforů, z nichž jeden je fluoreskující (reporter) a druhý nefluoreskující quencher (zhášeč) • sonda je navržena tak, aby její sekvence byla komplementární k určité cílové sekvenci uvnitř amplifikovaného regionu; pokud je sonda v intaktním stavu, jsou oba fluorofory drženy v prostorové blízkosti a quencher pohlcuje (zháší) fluorescenční záření emitované reporterem; pokud sonda hybridizuje s cílovou sekvencí, je během elongační fáze PCR štěpena prostřednictvím 5´3´ exonukleázové aktivity Taq DNA polymerázy, čímž dochází k prostorovému oddělení fluoroforů a zvýšení fluorescenční aktivity reporteru
Fragmentační analýza • automatický genetický analyzátor pracuje na principu gelové kapilární elektroforézy fluorescenčně značených DNA fragmentů • jednotlivé DNA fragmenty jsou ve velmi tenké kapiláře, naplněné speciálním polymerem na bázi polyakrylamidu, po vložení napětí na okrajové elektrody rozděleny dle jejich velikosti a náboje a postupně detekovány laserovým detektorem • fragmenty DNA jsou pro fragmentační analýzu připraveny PCR reakcí s jedním nebo několika páry primerů, přičemž vždy jeden primer z každého páru je fluorescenčně značený • v průběhu jednoho běhu jsme schopni současně analyzovat několik různých fragmentů, ale za předpokladu, že se navzájem liší svou délkou nebo barvou fluorescenční značky • spolu s každým vzorkem běží interní délkový standard, který umožní přesnou kvantifikaci jednotlivých fragmentů
6
CGH – komparativní genomová hybridizace • vyšetření chromozómové aberace porovnáním intenzit fluorescence dvou rozdílně fluorescenčně značených DNA sond – DNA pacienta a DNA zdravého jedince • detekci kvantitativních změn genomu během jedné hybridizační reakce • umožňuje genomový screening nebalancovaných přestaveb vedoucích ke ztrátě nebo zmnožení genetického materiálu, nedokáže odhalit balancované chromozómové změny (reciproké translokace, inverze)
CGH – komparativní genomová hybridizace • v případě, že testovaná DNA neobsahuje žádné změny, dochází k jednotnému zbarvení všech chromozomů (poměr fluorescence testované i kontrolní DNA 1:1) • pokud testovaný vzorek obsahuje nadbytečný materiál (trizomie, amplifikace) objeví se silnější signál v cílových oblastech hybridizovaných chromozomů • v případě ztráty genetického materiálu (delece) má naopak signál v těchto oblastech nižší intenzitu
7
CGH – komparativní genomová hybridizace
array-CGH • spojení klasické CGH a mikročipů (celogenomový screening nebalancovaných změn s vysokou rozlišovací schopností) • využití krátkých fragmentů DNA uchycených na sklíčku nebo destičce (oligonukleotidy, BAC, YAC, PAC nebo cDNA klony) • rozlišovací schopnost stoupá se zvyšováním počtu co nejkratších fragmentů, aby souvisle pokryly jednotlivé sekvence celého genomu • možnost testovat desítky až tisíce genů v jediném pokusu → menší náročnost na spotřebu zkoumané DNA • označené DNA jsou smíchány v ekvimolárním poměru a hybridizovány na oligonukleotidové fragmenty uchycené na čipu; po hybridizaci následuje odmytí nenavázaných sond a hodnocení pomocí speciálního snímacího zařízení; speciálně navržený software pak automaticky identifikuje každý spot na čipu a stanoví poměr obou fluorochromů
8
array-CGH
Využití PGD u vybraných dědičných chorob
9
Cystická fibróza • • • •
metabolické onemocnění s AR dědičností incidence 1:2 500 živě narozených frekvence přenašečů 1:25 molekulárně genetická příčina = mutace genu kódující protein CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator – transmembránový regulátor vodivosti), který se nachází v lokusu 7q31.2 • gen CFTR obsahuje 27 exonů (26 intronů) a je dlouhý přibližně 230 kb • transkript mRNA má délku 6129 bp a kóduje polypeptid o délce 1480 aminokyselin • CFTR protein funguje jako chloridový kanál regulovaný cAMP (patří do skupiny ATP Binding Cassette - kazetových transmembránových transportních proteinů vázajících ATP)
Cystická fibróza • CFTR protein řídí především tok chloridových iontů přes membránu buňky a současně s tím reguluje asociovanou funkci resorpčního epitelového sodíkového kanálu (EnaC) a interakcí s P-glykoproteinem reguluje funkci i dalšího chloridového kanálu označovaného jako ORCC (outwardly rectified chloride channel) • za normálních okolností CFTR protein udržuje adekvátní koncentraci NaCl v lumen exokrinních žlázek sliznice dýchacích cest a pankreatu, což přispívá ke správné hydrataci mukoidních sekretů • u CF jsou membránové kanály nepropustné pro chloridové ionty → resorpce chloridových i sodíkových iontů z lumen dýchacích cest i žlázek pankreatu je porušena a dochází tak ke zvyšování jejich koncentrace a tím ke snížené hydrataci mukoidního sekretu → chronická obstrukce dýchacích cest a vývodů exokrinních žlázek slinivky břišní • koncentrace NaCl v potu se zvyšuje (nad 60 mmol/l)
10
Klinické projevy CF • Plíce: zahlenění a infekce průdušek znesnadňuje dýchání; sekundární infekce narušují plíce (nejčastější příčina úmrtí) • Játra: ucpání žlučovodů znesnadňuje trávení a narušuje funkci jater • Slinivka břišní: uzavření kanálků → trávicí enzymy nemohou být dopraveny do střev • Tenké střevo: ucpávání střeva hustou stolicí (chirurgické zákroky u novorozenců) • Reprodukční orgány: nefunkčnost kanálků v pohlavním ústrojí; ucpání děložního hrdla hleny
Mutace v CFTR genu • již bylo detekováno přes 1500 mutací (většina z nich je privátních = v rámci jedné rodiny), z toho přes 1200 patogenních mutací • pouze 30 mutací se vyskytuje s četností >0,1% • mnohé mutace jsou populačně specifické a/nebo se nacházejí ve vyšší prevalenci v izolovaných populacích či náboženských skupinách
11
Mutace F508del • způsobena delecí tří párů bazí cytozin - tymin - tymin (CTT) v exonu 10 genu CFTR → absence fenylalaninu v pozici 508 aa řetězce • exon 10 společně s exony 9, 11 a 12 kóduje nukleotid vazebnou doménu NBD1 • mutace v exonech kódujících NBD domény mají vzhledem k nepostradatelné funkci těchto domén při přenosu iontů a vody přes plazmatickou membránu nejfatálnější dopad na fenotyp
CFTR gen
12
Metody používané při detekci mutací, variant a polymorfismů genu CFTR • vyšetření mutace F508del genu CFTR pomocí PCR reakce s fluorescenčně značeným párem primerů • vyšetření mutací/polymorfismů CFTR genu pomocí PCR reakce a analýzy v agarózovém gelu • vyšetření mutací/polymorfismů CFTR genu pomocí PCR reakce, digesce restrikční endonukleázou a analýzy v agarózovém gelu • vyšetření několika mutací genu CFTR pomocí reverzní hybridizace • vyšetření mutací genu CFTR metodou MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) • detekce mutací/SNP genu CFTR pomocí sekvenování • vyšetření mutací genu CFTR pomocí Idaho Technology (High Resolution Melting Curve Analysis, HRMCA)
Detekce mutace F508del pomocí PCR • za pomoci primerů naamplifikován úsek exonu 10, který u 70% CF pacientů obsahuje deleci tripletu CTT • pokud je v exonu 10 delece přítomna, výsledný PCR produkt má délku 95 bp, oproti standardně dlouhému fragmentu, který má délku 98 bp (přítomnost delece se projeví zvýšenou elektroforetickou mobilitou nebo zobrazením píku ve vzdálenosti odpovídající délce mutované alely)
Nested a seminested PCR • pokud máme k dispozici malé množství DNA je možné pro vyhledávání mutací použít též PCR metody, které probíhají ve dvou amplifikačních krocích • metoda nested → během první amplifikace jsou použity tzv. vnější primery a během druhé amplifikace tzv. vnitřní primery • metoda seminested → během první amplifikace jsou použity vnější primery, ale během druhé amplifikace je použit jeden z vnějších primerů z první reakce a jeden primer vnitřní
13
Koamplifikace s intragenními polymorfními markery • při PGD vyšetření jedné blastomery metodou PCR hrozí primárně velké riziko kontaminace exogenní DNA a sekundárně, že dojde k jevu zvanému „alelický drop out“ (ADO), při němž dochází ke ztrátě jedné ze dvou alel, které buňka nese, v průběhu amplifikace • k odhalení možné kontaminace vzorku exogenní DNA a ADO je používána fluorescenční multiplex PCR s polymorfními markery • v multiplex PCR reakci je koamplifikována mutace F508del se dvěma CFTR intragenními polymorfními mikrosatelity IVS8CA a IVS17bTA, které detekují počet alel a počet opakujících se dinukleotidů (CA)n a (TA)n na těchto alelách
Reverzní hybridizace na stripech • detekce 36 mutací spojených s CFTR pro evropskou populaci • analýza wild-type sekvencí určení homo/heterozygozity pro každou testovanou mutaci • možnost Tn typizace (polytymidinové alelické varianty lokalizované v intronu 8 genu CFTR → sekvence, známá jako IVS8polyT, obsahuje 5,7 nebo 9 tyminů, přičemž 5T alela způsobuje redukci hladiny normální CFTR mRNA a zvyšující se podíl CFTR mRNA s netranskribovaným exonem 9, což má za následek poruchu funkce CFTR proteinu)
14
Myotonická dystrofie typu 1 • AD multisystémová porucha s neúplnou, ale vysokou penetrací cca 92% a klinicky velice variabilní expresivitou • nejčastější neuromuskulární onemocnění dospělého věku s celosvětovou frekvencí výskytu 1:8000 • molekulárně genetickou příčinou MD1 je mutace v 3´nepřekládané oblasti genu DMPK (Dystrophia Myotonica – Protein Kinase) v lokusu 19q13.3 • gen DPMK (zvaný též MDY-1) je dlouhý 11 612 bp, obsahuje 15 exonů a je přepisován směrem od telomery k centromeře • produktem genu DMPK je protein o molekulové hmotnosti v rozmezí 70 – 80 kDa, zvaný myotoninová proteinkináza, patřící mezi serin/treoninové proteinkinázy
15
Dynamické mutace genu DMPK • expandované trinukleotidové repetice = TREs (Trinukleotide Repeat Expansions) → u MD1 se jedná o prodloužení úseku nestabilních trinukleotidových sekvencí cytozin tymin - guanin (CTG) v 3´nepřekládané oblasti genu DMPK, a to nad fyziologickou hranici 35 opakování • mírně postižení pacienti mívají počet CTG repeticí v rozmezí od 50 do 150 a pacienti s klasickou formou nemoci od 100 do 1500 • nejtěžší formou MD1 je forma kongenitální, u které se počet expandovaných repetic pohybuje až v řádu tisíců • molekulární diagnostika spočívá v detekci patologické alely a v určení velikosti její expanze
Detekce mutace genu DMPK Princip metody PCR s primery P1 a P2 • s použitím primerů P1a P2 je naamplifikován fragment genu DMPK, obsahující CTG repetitivní sekvenci spolu s 60 bp přiléhající sekvence • pokud však délka repetice přesáhne cca 100 trinukleotidů, alela není nasyntetizována a pacient se zdánlivě jeví homozygotní v počtu (CTG) opakování na obou alelách • k odlišení zdravých homozygotů od heterozygotních nositelů expanze je souběžně použita metoda Triplet – Primed PCR (TP-PCR)
16
Princip metody Triplet – Primed PCR • • • • • • •
detekce expandovaných alel, aniž by docházelo k jejich syntéze, u chorob jejichž příčinou je expanze trinukleotidů a je založena na užití trojice primerů podle toho, kterého řetězce syntézu provádíme jedná se buď o primery P1, P3R, P4-CTG nebo P2, P3R, P4-CAG, přičemž primer P4 se místně nahodile váže přímo na trinukleotidovou repetici primer P1 (případně P2) se váže ke hraniční komplementární sekvenci před 5´ konec CTG repetitivní sekvence amplifikací úseku vymezeného primery P1 a P4-CTG (případně P2 a P4CAG) vzniká „žebříček“ DNA fragmentů lišících se od sebe určitým počtem CTG trinukleotidů tyto fragmenty jsou pak dále amplifikovány prostřednictvím primerů P1 a P3R (P2 a P3R) primer P4-CTG (P4-CAG) je složen ze sekvence (CTG)5 ((CAG)5) komplementární k repetitivní sekvenci a 5´ části, komplementární k primeru P3R, ke které se P3R primer váže vzhledem k tomu, že poměr primeru P3R:P4 je 10:1, dochází již v několika prvních cyklech k vyčerpání P4 primeru, což zamezuje zkracování produktů nasedáním tohoto primeru na repetitivní sekvenci PCR produktů vzniklých v dřívějších cyklech
Triplet –Primer PCR P1
P2
P4
P3
17
Fragilní X • onemocnění s lomivým místem na dlouhém raménku chromozómu X v lokusu Xq27.3 je běžnou příčinou mentální retardace, na druhém místě za Downovým syndromem • vyskytuje se u 1 z 1200 chlapců a 1 z 2500 děvčat • třetina dívek s fragilním chromozómem X je mentálně normálních, třetina má inteligenci hraniční a třetina je mentálně retardovaná (na chromozómu X je řada lokusů s geny, které mají vztah k mentální retardaci) • exprese je variabilní: mentální retardace, poruchy chování připomínající autismus, makroorchidismus (zvětšená varlata), vysoký hlas, úzký obličej, dlouhá dolní čelist, velké ušní boltce, volnost kloubů • mutace genu FMR1 (Fragile X Mental Retardation 1) → expanze trinukleotidu CGG v 5'-UTR útlumu transkripce a následnému chybění produktu FMR1 genu, proteinu FMRP • FRAXA (expanze CGG repetic v 5´oblasti FMR1 genu) a FRAXE (expanze CCG repetic v 5´oblasti FMR2 genu) • o tzv. plné mutaci (full mutation) mluvíme, pokud počet repetic převýší 200, normální počet repetic je 6-50
Diagnostika fragilního X • PCR je vhodná jako první krok při molekulárně genetickém vyšetření FRAXA → diagnostika je založena na předpokladu, že premutované a plně mutované alely se díky expandované CGG repetici nemohou amplifikovat • PCR nám pomáhá vytřídit FRAXA negativní vzorky nesoucí normální alely ještě před Southern blottingem (muži s jedním PCR produktem a ženy se dvěma PCR produkty → dvě různě dlouhé normální alely • zbylé FRAXA suspektní vzorky, kterými jsou muži bez amplifikačního produktu a ženy s pouze jedním amplifikačním produktem, postupují do další analýzy metodou Southern blottingem • Southern blotting je nejčastější diagnostická metoda pro přímé určení expanze (CGG)n repetitivní sekvence; je často kombinovaná s metylační analýzou pomocí restrikčního štěpení s metylsenzitivní restrikční endonukleázou
18
Hemofilie • dědičná krevní onemocnění postihující muže se zvýšenou krvácivostí na základě porušené krevní srážlivosti při nedostatečné tvorbě jednoho z koagulačních faktorů → deficit faktoru VIII – hemofilie A (~ 80 %) - mutace F8 genu na lokusu Xq28 → deficit faktoru IX – hemofilie B (~ 20 %) - mutace F9 genu na lokusu Xq27.1-q27.2 • postižení kloubů, postižení svalů, osteoporóza, krvácení do zažívacího traktu, krvácení do nervového systému, krvácení do urogenitálního traktu, slizniční krvácení v dutině ústní, krvácení do dýchacích cest
19
