Molekulární diagnostika
Odry 11. 11. 2010
Michal Pohludka, Ph.D.
Buň ňka – základní jednotka živé hmoty • Všechny v současnosti známé buňky se vyvinuly ze společného předka, tedy buňky, která žila asi před 3,5-3,8 miliardami lety Dva základní typy buněk: Prokaryotní buňka Eukaryotní buňka (Viry) www.google.com
ALBERTS, Bruce, et al Essential Cell Biology (2004) Alberts B, Johnson A, Lewis J. et al. Molecular Biology of the Cell (2002)
Prokaryotní buň ňka
Neobsahuje jádro Menší rozměry Menší ribozomy Absence mitochondrií a jiných kompartmentů
Jiný koncept genové exprese vč. lokalizací a regulací Jinak uspořádaný metabolismus
Thanbichler M, Wang S, Shapiro L: J Cell Biochem (2005) Shih YL, Rothfield L: Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2006) Fuerst J: Annu Rev Microbiol (2005)
Listeria monocytogenes Dennis Kunkel Microskopy. Inc.
Eukaryotní buň ňka
Jádro Kompartmenty Mitochondrie GA Cytoplazmatické retikulum Lysozom Živočišná a rostlinná buňka Tvorba mnohobuněčných organismů Schopnost diferenciace
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Animal_cell_structure_en.svg
Dogma molekulární biologie transkripce DNA
translace Protein
RNA
Relugace trankripce Replikace Transport do cyto. Ret. Modifikace DNA Strukturální uspořádání Modifikace RNA …… Vazebné proteiny …..
Relugace translace Transport do GA …..…
Posttranslační mod. Transport do cílového místa Regulace Degradace proteinů Tvorba komplexů …..…
Dogma molekulární biologie transkripce DNA
translace Protein
RNA
Relugace trankripce Replikace Transport do cyto. Ret. Modifikace DNA Strukturální uspořádání Modifikace RNA …… Vazebné proteiny …..
Relugace translace Transport do GA …..…
Posttranslační mod. Transport do cílového místa Regulace Degradace proteinů Tvorba komplexů …..…
ROSTE Variabilita, Slož žitost a Komplexnost
Stejná DNA výbava – rozdílný expresní profil a proteom
Infekč ční onemocně ění
Virové Prokaryotické
Eukaryotické
Virové a bakteriální infekce – dle orgánů ů, které napadají
Molekulární diagnostika
Virové Prokaryotické
Eukaryotické
1. Rozpoznání infekč čního agens
2. Rozpoznání odpově ědi org.
Molekulární diagnostika Detekce imunitní odpovědi ELISA Chemiluminiscence xMAP technology ………
1. Rozpoznání infekčního agens
2. Rozpoznání odpově ědi org.
Molekulární diagnostika Detekce imunitní odpovědi xMAP technology Mikrobiologie PCR Diagnostika ……
1. Rozpoznání infekč čního agens
2. Rozpoznání odpovědi org.
Molekulární diagnostika Detekce imunitní odpovědi xMAP technology Mikrobiologie PCR Diagnostika ……
1. Rozpoznání infekč čního agens
2. Rozpoznání odpovědi org.
PCR Diagnostika Proč č je metoda PCR vhodným nástrojem pro diagnostiku? Stanovení DNA (zásadní pozitivum) Universální metoda detekující viry, bakterie i eukaryoty Citlivost (jedna kopie ve vzorku) Minimum biologického materiálů ů Rozšíř řená metoda hojně ě použ žívaná na téměř ěř kaž ždém výzkumném
pracovišti v oblasti molekulární biologie, genetiky, … Prostorově ě malá technologie
PCR Diagnostika Proč č je metoda PCR vhodným nástrojem pro diagnostiku? Stanovení DNA (zásadní pozitivum) Universální metoda detekující viry, bakterie i eukaryoty Citlivost (jedna kopie ve vzorku) Minimum biologického materiálů Rozšířená metoda hojně používaná na téměř každém výzkumném pracovišti v
oblasti molekulární biologie, genetiky, … Prostorově malá technologie
Struktura DNA
Definovaná stabilní struktura
Komplemetarita bazí A-T, C-G
Minimální náchylnost na degradaci a kontaminaci
Snadná izolace
Polymerase Chain Reaction (PCR) … molekulárně ě-biologická metoda pro namnož žení specifického úseku DNA …
Směs DNA (celý genom vč. extracellularních DNA sekvencí) Detekce od 1 kopie ve vzorku Amplifikace specifického úseku DNA Přístrojová či gelová detekce (real time PCR resp konvenční PCR)
PCR cyklus
72°C
95°C
60°C
http://www.youtube.com/watch?v=v4L7rvmBXbY
Konvenč ční PCR
Konvenční PCR – měření pouze výsledného produktu Není možnost měřit multiplexovou analýzu Nutnost gelové elfo a vizualizace
Real Time PCR
Detekce fluorescenčních barviček Měření signálu po každém cyklu Možnost kvantifikace Možnost multiplexové analýzy
Kvantifikace pomocí real time PCR resp. Dynamický rozsah Dynamický rozsah 10 řádů
Citlivá metoda Přesná metoda Možnost stanovit stádium onemocnění Záloha dat (CFR modul) Rychlost
Detekč ční limity konvenč ční PCR a Real time PCR
PCR Diagnostika Nový produkt od podzimu 2010
Konvenč ční PCR př řístroje
První PCR cycler byl uveden na trh v roce 1988 Nejprodávanější PCR cyclery na světě i v ČR V současné době 8 generace PCR cycleru
PTC-100
MJ Mini
MyCycler
C1000
S1000
Dyad + Disciple
Tetrad 2
Real-Time PCR př řístroje
První real-time PCR cycler byl uveden na trh v roce 1999 Přední postavení na celosvětovém trhu i v ČR Inovativní přístup První „upgradeable“ real-time PCR přístroj První přístroj schopný multiplexové analýzy (4 analyty) První systém s možností gradientu
PCR Diagnostika
&
PCR Testy Mycobacterium tuberculosis
Mycoplasma pneumoniae
Borrelia burgdorferi
Herpes Simplex virus
Chlamydia trachomatis
Varicella-Zoster virus
Neisseria gonorrhoeae
Cytomegalovirus
Chlamydia pneumoniae
Epstein-Barr virus
Legionella pneumophila
Mycoplasma pneumoniae
Hepatitis B virus (ve fázi vývoje a certifikací) Hepatitis C virus (ve fázi vývoje a certifikací)
CE IVD soupravy jsou vyvíjeny a produkovány společností GeneProof
Testy byly validovány na Real-Time PCR př řístroje
Řešení PCR diagnostiky
Objem vzorku - 48, 96 a 384 jamkové formát (stripy) Jednoduchá konstrukce kitu – Master mix a vzorek Všechny kity mají stejnou PCR metodu Spojení Bio-Rad přístrojů a GeneProof kitu zajišťuje vysokou citlivost
Proč č právě ě Bio-Rad a GeneProof Bio-Rad př řístroje: vysoká kvalita PCR přístrojů dlouholetá zkušenost a etablovanost v oblasti PCR na českém i světovém trhu přímé zastoupení, kompletní servis a podpora GeneProof kity: Česká společnost - vývoj, produkce a distribuce v ČR Aplikační podpora
Metodický protokol
Dě ěkuji za pozornost Michal Pohludka
[email protected] +420 602 659 211
