Diagnostika mastitid Jak vyplývá z uznávané kategorizace zdravotního stavu mlé né žlázy (viz následující tabulka), základními prost!edky diagnostiky mastitid jsou bakteriologické vyšet!ení a stanovení po tu somatických bun"k ve tvr#ových vzorcích mléka odebraných p!ísn" asepticky bezprost!edn" p!ed dojením (po oddojení a odstran"ní prvních st!ik$ mléka). Kategorizace zdravotního stavu mlé né žlázy Po et somatických bun!k [. 103 . ml-1] < 250 (100) > 250 (100)
Patogen nevykultivován zdravá žláza aseptická mastitida
Klinická mastitida nespecifická International Dairy Federation Bulletin 211, 1987, 24 s; DVG,1994
vykultivován latentní infekce subklinická mastitida infek ní
Metody mikrobiologické diagnostiky Metody mikrobiologické diagnostiky mastitid byly doporu eny Mezinárodní mléka!skou federací již po átkem 80. let 20. století (IDF, 1981). I když základní principy této diagnostiky z$stávají i nadále platné (viz nap!. NMC, 1999), stále více se za ínají uplat%ovat molekulárn" biologické metody, založené na detekci jednotlivých genetických marker$ bakteriálních p$vodc$ mastitid simultánními postupy (nap!. Gillespie a Oliver, 2005). Metody stanovení po tu somatických bun!k mléka Metody stanovení po tu somatických bun"k mléka zahrnují: P!ímé mikroskopické stanovení po tu somatických bun"k mléka (&SN EN ISO 13661, 1998). Tato metoda se nepoužívá k rutinnímu stanovení po tu bun"k, nýbrž jako referen ní metoda. Stanovení po tu somatických bun"k mléka na elektronických po íta ích ástic (&SN EN ISO 1366-2, 1998). Tato metoda je na ústupu a je nahrazována elektronickým stanovením s využitím principu fluorescen ní mikroskopie. Stanovení s využitím principu fluorescen ní mikroskopie, a to jak p!i nanášení vzorku na rotující disk, tak p!i použití princip$ pr$tokové cytometrie. Tyto metody byly rekodifikovány (EN ISO 1366-2, 2006). Fluorescen ního zobrazení somatických bun"k využívají i po íta e bun"k, pracující na principu.analýzy obrazu. Umož%ují stanovení po tu bun"k v terénních podmínkách (nap!. to jsou NucleoCounter SCC-100; Direct Cell Counter). Uvedené p!ístroje a jejich použití nebylo dosud mezinárodn" kodifikováno. Direct Cell Counter (DCC) Je p!enosný, bateriemi napájený p!ístroj. Mlé ný vzorek ur ený k analýze je odebírán do speciální kazety. Zma knutím pístu je do kazety nasát definovaný objem vzorku, p!i emž každá kazeta má kalibra ní kód, který p!ístroj p!i m"!ení rozlišuje. Mléko je protla eno systémem kanálk$ a tak promícháno se speciálním reagens, které obarví jádro každé somatické bu%ky. Takto zpracovaný vzorek je pak vystaven excita nímu sv"tlu. Dochází k emisi fluorescen ních signál$, jejichž obraz je zaznamenáván kamerou. Objem 1
vzorku iní p!ibližn" 60 µl, m"!í se 1 µl obarveného vzorku. P!ístroj detekuje po et bun"k na displeji v rozp"tí bun"k od 10 do 4 000 v 1 µl. P!esnost p!ístroje odpovídá p!esnosti p!ístroj$ Fossomatic (r² = 0,988). Opakovatelnost stanovení vyjád!ená koeficientem variability iní 8 % na hladin" 400 . 103/ ml mléka, 12 % na hladin" 100 . 103/ ml mléka. Analýza trvá 45 sekund. Významnou zm"nu doznal i názor na limitní hodnotu po tu somatických bun"k ve tvr#ových vzorcích mléka, která má rozlišit zdravou a zán"tem stiženou mlé nou žlázu. Zatímco se d!íve uznávala limitní hodnota po tu bun"k 250 .103/ ml (IDF, 1987), v sou asnosti se stále více prosazuje limitní hodnota 100 . 103/ ml mléka (DVG,1994). Nep"ímé metody diagnostiky mastitid Nejrozší!en"jší nep!ímou metodou pro diagnostiku projev$ zán"t$ se stalo koncem 20. století m"!ení elektrické vodivosti mléka. Stanovení elektrické vodivosti mléka (VM) se využívalo pro screening subklinických mastitid. Byla navržena !ada p!ístroj$, které umož%ovaly m"!ení ve stáji. Princip m"!ení vycházel z faktu, že mléko je elektrolyt, nebo# obsahuje disociované ionty jejichž obsah v mléce p!i zán"tlivém procesu vzr$stá. To se zejména týká iont$ Cl- a Na+. Údaje o kritické hodnot" pro diagnostiku mastitid se velmi r$zní. VM se udává absolutní hodnotou (AV) nebo rozdílem nejvyšší a nejnižší hodnoty ve vzorcích mléka tvrtí téhož vemene (RV). Byly odvozeny diagnostické algoritmy využívající kombinaci obou vyjád!ení (MIX). N"kte!í auto!i použili p!i konstrukci diagnostického algoritmu i nejvyšších hodnot AV a RV z opakovaných m"!ení. Tento p!ístup ovšem vyžaduje dopln"ní prostého stanovení VM programovou podporou technologického procesoru. D"je se tak proto, že prosté stanovení VM má velmi nízkou diagnostickou ú innost (pod 60 % shody s referen ními diagnostickými metodami). P!íklad diagnostické ú innosti p!i použití algoritmu s programovou podporou a p!i kritických hodnotách AV 0,57 S . m-1, RV 0,07 S . m-1 pro subklinickou mastitidu a AV 0,66 S . m-1, RV 0,16 S . m-1 pro klinickou mastitidu dokumentuje následující tabulka. Z tabulky je z!ejmé, že leze s programovou podporou dosáhnout vysoké diagnostické ú innosti. Nicmén" je t!eba mít na z!eteli, že VM je ovliv%ována !adou interferujících initel$, zejména plemennou p!íslušností zví!at a sezónními vlivy (Ryšánek et al., 1984). Je rovn"ž vhodné zmínit fakt, že MV indikuje zm"ny v iontovém složení mléka d!íve, než jsou patrné smyslové zm"ny mléka a dokonce d!íve, než je zaznamenán nár$st po tu somatických bun"k v mléce. Diagnostická ú innost m!"ení elektrické vodivosti mléka s programovou podporou (aritmetický pr$m"r 2 maximálních hodnot v 7 denním cyklu) AV RV F - Shoda F + F - Shoda [%] [%] [%] [%] [%] 12,2 86,8 1,0 0,9 94,4 Mastitida (F - falešn" negativní nález ! F + falešn" pozitivní nález) Status
F+ [%] 4,7
F[%] 0,0
MIX Shoda [%] 95,3
F+ [%] 4,7
Ryšánek, D.: Vet.Med. Praha, 35,1990,145-153.
2
Diagnostické p!ístroje pracující s programovou podporou jsou nákladná za!ízení. Proto se tento sofistikovaný p!ístup uplat%uje v sou asné dob" pouze v systémech automatického sb"ru dat v procesu dojení a v návazných systémech procesního !ízení chovatelských inností. V takových systémech je m"!ení VM obvykle kombinováno se snímáním spot!eby jadrného krmiva, s automatickým m"!ením hmotnosti výdojku a s m"!ením pohybové aktivity dojnic krokom"ry. Vzniká tak komplexní diagnostický signál umož%ující automatický screening nemocných dojnic. Posoudit diagnostický význam VM a n"kterých dalších zm"n látkového složení mléka umož%ují následující tabulky. T!snost vztahu po tu somatických bun!k mléka a vybraných znak# látkového složení mléka ( tvr#ové vzorky p!ed dojením) Nezávisle prom!nná Ukazatel n Pr$m"r
Po et somatických bun!k [103/ml]
196
2244,0
Nezávisle prom!nná Ukazatel n Pr$m"r
Závisle prom!nná Ukazatel n Pr$m"r Chloridy [mmol/l] Laktóza [mmol/l] Chlorcukrové íslo Titra ní Kyselost [°SH] Elektrická vodivost [S/m]
196
37,09
196
137,3
0,654
+++
42,84
196
3,1
0,705
+++
49,76
196
6,96
0,484
+++
23,44
196
0,543
0,647
+++
41,84
Závisle prom!nná Ukazatel n Pr$m"r Laktóza [mmol/l]
Vícenásobní regrese r S Determinace [%] 0,659 +++ 43,55
196
137,3
Vícenásobní regrese r S Determinace [%] +++ 72,93 0,854
3,1 0,970 Chlorcukrové 196 íslo 196 37,09 196 6,96 Titra ní 0,739 Kyselost [°SH] 196 0,543 0,931 Elektrická vodivost [S/m] r – regresní koeficient; r(0,001) = 3,39 ; S – Významnost; +++ P < 0,001 Chloridy [mmol/l]
+++
94,50
+++
54,61
+++
86,70
Ryšánek, D., Olejník, P. 1980: Vet. Med Czech., 25 (8): 467-474 Czech
3
Z tabulek je z!ejmé, že elektrická vodivost mléka koreluje t"sn"ji s obsahem chloridových iont$ v mléce než s po tem somatických bun"k. Obdobn" se chová i laktóza v mléce. Nicmén" lze konstatovat, že všechny testované znaky tím, že statisticky významn" korelují s po tem somatických bun"k, mohou být použity jako nep!ímé ukazatele poruchy sekre ní funkce mlé né žlázy, která provází zán"tlivý proces. V !ad" experimentálních prací byly tyto znaky takto použity. K b"žné diagnostice se však nepoužívají. Obdobn" je tomu i u dalších zm"n látkového složení mléka, jek je charakterizují následující graf a tabulky.
Tolle, A., Heeschen, W., Reichmuth, J., Zeidler, H.: Dairy Sci. Abstract 33 (1971) 875-879 Chemické zm!ny mléka v d#sledku mastitid :Složka Normální hladina -1 laktóza [g . l ] 4,85 -1 ' S1-kasein [mg . ml ] 13,3 -1 ' -laktalbumin [mg . ml ] 1,03 - 1,22 -1 ß-laktoglobulin [mg . ml ] 4,0 imunoglobuliny [mg . ml-1] 0,25 - 0,30 serumalbumin [mg . ml-1] 0,24 Hamann, J., Krömker, V., : Livest. Prod. Sci., 48, 1997, 201-208
Koeficient zm!ny 0,93 0,50 0,50 0,74 10,0 2,7
4
Fyzikáln! chemické zm!ny mléka v d#sledku mastitid Složka Normální hladina -1 celkový Ca [µmol . l ] 22,94 2+ -1 celkový Mg [µmol . l ] 8,32 -1 celkový P [µmol . l ] 17,2 -1 citrát [mmol . l ] 11,2 + -1 K [mmol . l ] 44,1 Cl- [mmol . l-1] 22,6 - 39,05 Na+ [mmol . l-1] 24,9 chlorcukrové íslo 2,05 - 3,2 titra ní kyselost [°SH] 6,2 - 8,0 pH 6,65 -1 elektrická vodivost [S . m ] 0,480 bod mrznutí [- °C] 0,57 - 0,53 Hamann, J., Krömker, V., : Livest. Prod. Sci., 48, 1997, 201-208 2+
Koeficient zm!ny 0,43 0,31 0,75 0,72 0,85 1,2 - 2,0 2,0 2,8 0,8 - 0,6 1,15 1,1 - 2,2 <1,0
Z dalších zm"n látkového složení mléka mají diagnostický význam tyto: Stanovení bovinního serumalbuminu (BSA). Vychází z faktu, že p!i zán"tlivém procesu mlé né žlázy se zvyšuje pr$chodnost hemato-alveolární bariéry a z krve do mléka pronikají i vysokomolekulární látky, krom" jiných i sérumalbumin. Principem stanovení v komer ních testech byla prostá radiální difúze v agarovém gelu obsahujícím monospecifické protilátky proti BSA. Vyhodnocení se provád"lo stanovením pr$m"ru precipita ní zóny. Test vznikl na p!elomu sedmdesátých a osmdesátých let minulého století. V sou asnosti se již diagnosticky tém"! nepoužívá. Antitrypsinový test. Neutrofilní granulocyty migrující b"hem zán"tu do mlé né žlázy uvol%ují proteolytické enzymy, které jsou histotoxické a poškozují tkán" mlé né žlázy. Mastitidní sekret však obsahuje i inhibitory proteináz. Aktivita t"chto inhibitor$ je v pozitivní korelaci s po tem somatických bun"k, jakož i s obsahem sérum albuminu v mléce. P!esto, že tyto inhibitory vykazují elektroforetickou hetergenitu, jsou považovány za analog lidského '1 anti-trypsinu. Vzorky mléka se istí koprecipitátem a centrifugací, aby se odstranily interferující komponenty. Supernatanty se p!enesou do jamek mikrotitra ních desti ek. P!idá se trypsin a substrát. Reak ní sm"s se inkubuje a pak spektrofotometricky m"!í absorbance chromogenu uvoln"ného trypsinem. Systém readeru a PC umož%uje provést s programovou podporou korekci turbidity a interpolaci hodnot podle nulových a 100% kontrolních vzork$ a stanovení antitrypsinové aktivity vyšet!ovaných vzork$ mléka. Tento test, vyvinutý v osmdesátých letech minulého století, poskytuje vysokou produktivitu stanovení. Je však proti p!ímému stanovení po tu somatických bun"k mnohanásobn" dražší. Proto nedoznal širšího uplatn"ní krom" experimentálních prací. NAGASE test. Zán"tlivé sekrety mlé né žlázy obsahují enzym N-acetyl-ß-Dglukozaminidázu, pocházející z rozpadlých neutrofilních granulocyt$, z v"tší ásti však z poškozených epiteliálních bun"k. Princip metody stanovení spo ívá v tom, že se vzorky mléka smíchají se substrátem a v kyselém prost!edí inkubují. Dojde k hydrolýze, kterou se ze substrátu uvolní št"p, jenž se stane silnou alkalizací sm"si vysoce fluorescentní. Reakce probíhá v titra ních mikroplotnách. Výsledná fluorescence se m"!í fluorometrem. P!ístroj má 5
vysokou opera ní kapacitu. Princip reakce byl navržen již za átkem šedesátých let minulého století. Popsanou podobu však test získal v osmdesátých letech. V devadesátých letech byl použit v !ad" výzkumných prací. V sériové diagnostice nedoznal v"tšího uplatn"ní, krom" zem" svého p$vodu - Finska a dalších skandinávských zemí. C-reaktivní protein pat!í stejn" tak jako haptoglobulin (Hp) a sérum amyloid A (SAA) k protein$m akutní fáze zán"tu. Bylo prokázáno, že p!i mastitid" skotu se zvyšuje zejména koncentrace Hp a na mlé nou žlázu vázaného SAA (M-SAA3). M"!ením exprese gen$ na mRNA bylo zjišt"no, že oba proteiny jsou produkovány i ve tkáni mlé né žlázy, M-SAA3 více než Hb. V játrech jsou produkovány v opa ném po!adí významnosti. Protein$m akutní fáze se v mlé né žláze skotu v"nuje výzkumná pozornost. K diagnostice mastitid se však zatím jejich stanovení v mléce ani exprese gen$ kódujících jejich produkci b"žn" nepoužívají. Vý et metod použitých v experimentálních pracích by mohl a v budoucnu jist" bude pokra ovat. Nicmén" jejich širší uplatn"ní v rutinní diagnostice mastitid nelze o ekávat. Mikrobiologické vyšet!ení a stanovení po tu somatických bun"k mléka budou jist" i nadále esenciálními metodami v diagnostice mastitid.
6
Vybraná literatura CSN EN ISO13366-3: 1998 Mléko – Stanovení po tu somatických bun"k. &ást 1. Mikroskopická metoda. CSN EN ISO13366-2: 1998 Mléko – Stanovení po tu somatických bun"k. &ást 2. Metoda elektronického po ítání ástic. CSN EN ISO13366-3: 1998 Mléko – Stanovení po tu somatických bun"k. &ást 3. Fluoroopto-elektronická metoda. EN ISO13366-2: 2006. Milk – Enumeration of somatic cells – Part 2: Guidance on the operation of fluoro-opto-electronic counters. Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft (DVG): Leitlinien zur Bekämpfung der Mastitis des Rindes als Bestandsproblem. 3. Aufl., Gießen, 1994. Gillespie B.E, Oliver S.P. 2005: Simultaneous detection of mastitis pathogens, Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, and Streptococcus agalactiae by multiplex realtime polymerase chain reaction. J Dairy Sci. 88(10):3510-3518. Hamann, J., Krömker, V.1997: Potential of specific milk composition variables for cow health management, Livest. Prod. Sci., 48: 201-208 IDF 1981: Laboratory methods for use in mastitis work. International Dairy Federation Bulletin, Document 132. 27 pp. IDF 1987: Bovine mastitis. Definition and guidelines for diagnosis. Bulletin of International Dairy Federation No 211. 1987. 24 pp. NMC 1999: National Mastitis Council. Laboratory Handbook on Bovine Mastitis. National Mastitis Council. Walton Commons West, Madison, USA. 222 pp. Rysanek, D., Olejnik, P.: Diagnostic effectiveness of the measurement of electric conductivity in milk. Vet. Med. Czech., 25 (8), 1980, 467-474 Czech Ryšánek, D., Olejník, P., Sokol, J., Opletal, A., Picka, F., Majbová, J., Krej í, J. 1984:Analysis of factors underlying the electric conductance of cow´s milk – Breed, locality, year season. Vet. Med. Czech., 29 (2): 89-94. Czech Rysanek, D. 1990: Algorithms of evaluation of milk electric-conductivity for mastitis screening. Vet. Med. Czech., 35 (3):145-153 Tolle, A., Heeschen, W., Reichmuth, J., Zeidler, H.: Dairy Sci. Abstract 33 (1971) 875-879 Poslední aktualizace: &erven 2007 Copyright (c) Dušan Ryšánek. All rights reserved.
7
