VLIV MASTITID NA JAKOST A ZDRAVOTNÍ NEZÁVADNOST MLÉKA

VLIV MASTITID NA JAKOST A ZDRAVOTNÍ NEZÁVADNOST MLÉKA Mastitidy skotu jsou jednou z hlavních příčin snižování jakosti mléka. Je tomu tak proto, že tato hromadná onemocnění způsobují závažné poruchy funkce mléčné žlázy, které se promítají ve snižování produkční aktivity sekrečního parenchymu, narušují smyslové vlastnosti mléka a vedou k významným změnám jeho složení a jeho fyzikálních vlastností. Tím dochází ke snížení biologické a nutriční hodnoty mléka a snížení jeho technologické zpracovatelnosti. V neposlední řadě jsou tato onemocnění provázena pomnožováním patogenní a podmíněně patogenní mikroflóry, která může ohrozit zdraví člověka přímo nebo prostřednictvím toxických bakteriálních produktů. Nelze ani opomenout ohrožení člověka rezidui antibiotik v mléce, která se široce používají při terapii mastitid. Smyslové změny mléka jsou nejvýrazněji ovlivněny při zjevných, klinických formách onemocnění, zejména při parenchymatózní a indurativní formě mastitid, kdy sekret postižené žlázy ztrácí úplně vzhled mléka a mění se v sérovitý a hnisavý, někdy i výrazně páchnoucí produkt zánětu. Při lehčích formách klinických mastitid, jako jsou akutní a chronické katarální mastitidy, ztrácí mléko svoji typicky bílou barvu a získává nažloutlý odstín, pravděpodobně v důsledku výrazného zvýšení obsahu karotenů v mléčném tuku. Mléko při těchto mastitidách obsahuje zřetelné hnisavé vločky, zejména v prvních střicích výdojku. Smyslové vlastnosti mléka jsou dokonce narušeny i u nezjevných, subklinických forem onemocnění, při kterých je změněna chuť mléka. V důsledku zvýšení obsahu chloridů a sodíku a poklesu obsahu laktózy mléko ztrácí typickou nasládlou chuť a nabývá slanou příchuť. Konečně mléko při subklinické mastitidě získává nahořklou chuť v důsledku enzymaticky indukované proteolýzy, jakož i v důsledku změn zastoupení mastných kyselin v mléčném tuku. Změny složení mléka Základní změnou ve složení mléka v důsledku zánětů mléčné žlázy je nárůst počtu somatických buněk, zejména neutrofilních granulocytů. Metabolické vzplanutí těchto fagocytujících buněk a v konečném důsledku jejich rozpad vedou k uvolnění některých buněčných enzymů. Tyto enzymy se uvolňují i ze sekrečních buněk a z epitelií mlékovodů a mléčných cisteren, z nichž některé se v důsledku zánětu rozpadají. K těmto enzymům náleží: kataláza, laktoperoxidáza, Nacetyl-ß-D-glukozoaminidáza (NAGáza), lysozym, laktat dehydrogenáza (LDH), glutamatoxalacetat-transamináza (GOT). •

Kataláza je oxidoreduktázou, která katalyzuje dekompozici H2O2. na H2O a O2. Kataláza je enzymem obsaženým v rostlinách, bakteriích i živočišných tkáních (játrech a zejména v ledvinách). Obsahují ji i erytrocyty. V mléce je oxidoreduktázová aktivita vázána převážně na membráně tukových kuliček, kde je 12 krát vyšší než v odstředěném mléce. Kataláza je termolabilní látka. Inaktivuje se již teplotou 65 °C při expozici po 16 s. Aktivita katalázy vzrůstá při mastitidách, pravděpodobně působením fosfolipázy na membránu tukových kuliček. Proto byla dříve používána jako diagnostický indikátor mastitid.

•

Laktoperoxidáza je významnou součástí systému laktoperoxidáza-tiokyanát-hydrogen peroxid. Tento systém je významným obranným mechanismem zvláště v laktaci. Inhibuje růst stafylokoků, streptokoků i koliformních bakterií. Laktoperoxidáza - se syntetizuje epiteliálními buňkami mléčné žlázy. Tiokyanát pochází ze zeleného krmení, zvláště z luštěnin. Hydrogen peroxid je produktem některých bakterií, např. streptokoků. Mechanismus účinku spočívá v tom, že laktoperoxidáza v přítomnosti hydrogen peroxidu 1

oxiduje tiokyanát na hypotiokyanát (OSNC), který destruuje vnitřní bakteriální membránu streptokoků. Společně s hypoiodidem (OI) jsou tyto molekuly silnými antimikrobiálními činiteli proti bakteriím, virům i kvasinkám. Koncentrace laktoperoxidázy a thiokyanátu vzrůstá s rozvojem infekce mléčné žlázy. •

Myeloperoxidáza je obsažena v primárních granulích neutrofilů. Katalyzuje obdobnou reakci jako laktoperoxidáza (H2O2. na H2O a O2). Navíc pak spolu s peroxidem vodíku a chloridovými ionty vytváří kyselinu chlornou (HOCl) a monochloraminy, významné nositele baktericidní aktivity neutrofilů. Baktericidní aktivita HOCl je padesátkrát vyšší než vlivem působení H2O2.

•

ß-glukoronidáza je kyselou hydrlázou obsaženou v primárních (azurofilních) granulích neutrofilních granulocytů a v lyzosomech makrofágů Uvolňuje se při exocytóze granulí neutrofilů a při lýze neutrofilů a makrofágů.

•

Laktat dehydrogenáza (LDH) je oxidoreduktáza. Katalysuje přeměnu pyruvátu na laktát v závěrečném kroku glykolýzy za anaerobních podmínek. Tento enzym je obsažen jak v epiteliálních buňkách, tak v neutrofilních granulocytech. V průběhu zánětu mléčné žlázy dochází k uvolňování proteináz (nap. želatinázy), ROS (např. superoxidu. hydrogen peroxidu a hydroxylových radikálů) z rozpadajících se neutrofilních granulocytů. Cytotoxický efekt těchto látek vede k oxidaci proteinů, peroxidaci lipidů a k poškození DNA a tím k inhibici metabolických procesů buněk. Dochází tak k primární nekróze buněk, tedy k cytolýze, při které se LDH uvolňuje.

•

Glutamat-oxalacetat-transamináza (GOT) je buněčný enzym. Jeho aktivita odráží stupeň tkáňového poškození. V sekretu mléčné žlázy se jeho aktivita zvyšuje při mastitidách.

•

N-acetyl-ß-D-glukozoaminidáza (NAGáza je lysosomální enzym, obsažený zejména v neutrofilních gramulocytech a makrofázích. Je indikátorem tkáňového poškození při mastitidách. Jeho specifická funkce v mléčné žláze není známá. Byla prokázána jeho antibakteriální aktivita zejména pro Arcanobacterium pyogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae a Pseudomonas aeroginosa, nikoli však pro Escherichia coli a Enterobacter aerogenes. Během laktace je jeho koncentrace v mléce nízká, stejně tak jako v sekretu začátkem zaprahování. Uprostřed období stání na sucho je jeho aktivita nejvyšší a koinciduje s nejvyšší aktivitou laktoferinu v tomto období. Aktivita tohoto enzymu nepřímo odráží dynamiku výskytu nových infekcí - během zaprahování vysoký výskyt, ve střední fázi zaprahlosti nízký výskyt.

•

Lyzosym je bakteriolytický enzym - muramidáza. Destruuje bakterie lýzou peptidoglykanu buněčné stěny Gram pozitivních bakterií a vnější membrány Gram negativních bakterií. Pochází zejména z lýzovaných neutrofilů.

•

Proteinázy mléka mají dvojí hlavní původ: z krevní plasmy proniká do mléka plasmin, ze somatických buněk pocházejí lysosomálni proteinázy: katepsin D, B, L. Dalším enzymem pocházejícím ze somatických buněk je serin proteináza – elastáza a katepsin G. Některé z těchto enzymů se v mléce vyskytují jako proenzymy, tedy neaktivní prekurzory enzymů. Např. plasmin ve formě plasminogenu, katepsin D ve formě prokatepsin D. Plasminogen je v mléce aktivován urokinázou a specifickým tkáňovým

2

aktivátorem. Zvýšená proteolytická aktivita mléka provázející zánět žlázy způsobuje hydrolýzu kaseinu (CN), čímž se snižuje výtěžnost mléka pro výrobu sýrů a zhoršuje jakost mléčných produktů. Substrátem plasminu je v mléce ß-kasein (ß-CN), který se štěpí na γ1, γ2, γ3 –CN a na proteázové peptony. ß-CN je základem textury sýra. Proto jeho degradací dochází ke zvýšení retence vody a úniku peptidů do syrovátky. Katepsin D degraduje αs1-CN, αs2 -CN případně i κ-CN za vzniku glykomakropeptidů a αlaktalbuminu (α-LA). Elastáza hydrolýzuje αs1-CN a méně efektivně i α-LA a ßlaktglobulin (ß-LG). Důsledky proteolytické aktivity byly prokázány při zvýšení počtu somatických buněk nad 2 .106/ml. Sekret pocházející ze zánětem postižené žlázy však obsahuje i inhibitory proteináz. Nejvýznamnějším je antitrypsin, považovaný za analog humánního α1 antitrypsinu. Jeho aktivita vzrůstá úměrně s počtem somatických buněk v mléce. Proto bývá někdy ve vědeckých studiích používán jako laboratorní indikátor mastitid. •

Lipáza je hydrolytický enzym, který katalyzuje štěpení alfa-esterových vazeb triacylglycerolů. Tento enzym se vyskytuje v mléce v několika formách. Zdá se pravděpodobné, že jejich odlišnost je dána vazbou na různé jiné bílkoviny. Příkladem je vazba lipázy na kaseionové micely. Udává se, že v této formě se vyskytuje až 90 % lipolytické aktivity mléka zdravé mléčné žlázy. V mléce se vyskytuje i lipoproteinová lipáza (LPL), která pochází z krve a v sekreční tkáni mléčné žlázy hraje významnou roli v syntéze lipidů. S mastitidami je spojena lipáza, která vstupuje do mléka se somatickými buňkami. Následná lipolýza mléčného tuku, je potencována mechanickými inzulty působícími na tukové kuličky při transportu mléka v dojicím stroji i při svozu a mlékárenském ošetření mléka. Lipolýza má za následek zvýšení obsahu volných mastných kyselin. Potencuje rovněž žluknutí mléka.

Některé z uvedených enzymů, laktoperoxidáza, N-acetyl-ß-D-glukozoaminidáza (NAGáza), ßglukoronidáza a lysozym, se uplatňují jako přirozené antibakteriální látky. Mezi tyto látky rovněž patří laktoferin, defensiny a komplement. Antibakteriálních vlastností některých z těchto látek se používá při přípravě nutričních doplňků a funkčních potravin. Nicméně, při mlékárenském zpracování mléka působí jako endogenní inhibiční látky v technologických procesech výroby kysaných mléčných produktů. •

Laktoferin je glykoprotein, aktivně vážící ionty železa, které jsou nezbytné pro metabolismus některých bakteriálních patogenů mléčné žlázy. Tvoří se v epiteliálních buňkách i v neutrofilních granulocytech, je obsažen v jejich sekundárních granulích. V přítomnosti bikarbonátu inhibuje bakterie, které jsou metabolicky náročné na ionty železa (Escherichia coli). Inhibiční účinek laktoferinu blokují citrátové ionty, které s laktoferinem soutěží ve vychytávání železa. Laktoferin se uplatňuje zejména v období involuce mléčné žlázy, kdy obsah citrátů klesá k nule. S tím souvisí odolnost mléčných žláz vůči koliinfekcím v období zaprahlosti. Laktoferin má antibakteriální, antivirové, antiplísňové, antikarcinogenní a imunostimulační vlastnosti. Laktoferin zvyšuje baktericidní funkci fagocytů tím, že brání produkci dismutázy, bakteriálního enzymu, který inaktivuje superoxidové radikály fagocytů. Některé bakterie, jako Streptococcus agalactiae, však dokáží utilizovat železo vázané v laktoferinu. V sekretu zdravé mléčné žlázy je koncentrace laktoferinu nízká (0,2 mg/l), vyšší je v kolostru (0,5 až 1 mg/l) a v období 30 dnů po zaprahnutí (50 až 100 mg/l). Koncentrace laktoferinu se zvyšuje i při zánětu mléčné žlázy.

3

•

Defenzíny jsou bazické, kationické proteiny, bohaté na cystein a arginin, produkované neutrofily. Jsou batericidní pro všechny běžné původce mastitid skotu, avšak i pro kulturní mlékařskou laktoflóru..

• Komplement je proteinový termolabilní faktor, přecházející do mléka z krevního séra Uplatňuje se jednak jako nespecifický opsonin, a to svým fragmentem C3b po aktivaci alternativní cestou. Je aktivován i klasickou cestou, a to komplexem korpuskulárního antigenu a specifických protilátek. Působí tedy i jako specifický opsonin, potencující fagocytózu. Svými fragmenty C8 a C9 se spolu se specifickými protilátkami uplatňuje také bakteriolyticky, avšak pouze pro Gram negativní bakterie. Kvantitativní změny dokumentuje následující tabulka. Změny obsahu enzymů v mléce v důsledku mastitid Činitel Normální hladina somatické buňky 20-250 [.103 . ml-1] neutrofilní granulocyty [%] 12 kataláza 0,08 [µmol O2 . min-1 . ml-1] laktoperoxidáza [µg . l-1] 30,0 -1 ß  glukoronidáza [mU . ml ] 0,012 -1 lysozym [µg . l ] 1,0 NAGáza [µmol. ml-1] 0,032 LDH [mU . ml-1] 300-500 -1 GOT [mU . ml ] 4,0 -1 laktoferin [mg . ml ] 0,1-0,2 Hamann a Krömker, 1997; Upraveno.

Koeficient změny >10,0 7,5 23,0 2,0 4,0 >100,0 >2,0 >10,0 7,0 100,0

Při zánětlivém procesu mléčné žlázy vzrůstá obsah i dalších enzymů jejichž původ v mléce není jednoznačně objasněn, nicméně lze předpokládat, že se do mléka dostávají z krve, v důsledku zvýšené propustnosti hemato-alveolární bariéry. Jsou to např. kyselá a alkalická fosfatáza. V mastitidních sekretech klesá obsah xantin oxidázy. Lipidy mléka. Snížení obsahu tuku v mléce v důsledku zánětlivého procesu mléčné žlázy není jednoznačné. Někteří autoři zaznamenali malé snížení (např. z 3,45 % na 3,2 %), jiní rozdíl nezaznamenali. Podstatně závažnější jsou kvalitativní změny. Byl zjištěn vysoce signifikantní nárůst obsahu volných mastných kyselin, až na dvojnásobek. Zvyšuje se jodové číslo. Je to důsledek lipolýzy, neboť aktivita lipáz při zánětlivém procesu vzrůstá. Zvyšuje se podíl nízkomolekulárních mastných kyselin (C8 - C14) a volných mastných kyselin C18 (kyseliny oleové, linolové a linolenové). V triacylglyceridech vzrůstá obsah esterifikovaných mastných kyselin s krátkým řetězcem (C4 - C12). Koncentrace esterifikovaných mastných kyselin s dlouhým řetězcem (C16 - C18) naopak klesá. Při zánětlivých procesech provázených zvýšením počtu somatických buněk nad 2,5 . 106 . ml-1 byl zaznamenám signifikantní nárůst neesterifikovaných mastných kyselin. Konečně byly v mastitidním mléce zjištěny i nižší hladiny fosfolipidů. Fosfolipidy jsou lokalizovány převážně v membráně tukových kuliček. Úbytek membránových fosfolipidů usnadňuje lipázám jejich atakování, což v konečném důsledku potencuje lipolýzu.

4

Proteiny mléka. Rovněž změny v obsahu celkových bílkovin jsou nejednoznačné. V některých případech nebyl zaznamenán rozdíl v jejich obsahu, v jiných dokonce mírný nárůst. V důsledku zánětlivého procesu mléčné žlázy se snižuje obsah nutričně nejvýznamnější bílkoviny mléka, kaseinu. V mléce je kasein obsažen z 95 % v micelární formě. Při mastitidách se obsah micelárního kaseinu snižuje až na 46 %. Snižuje se i obsah dalších bílkovin secernovaných v mléčné žláze - α-laktalbuminu a ß-laktoglobulinu. Naopak obsah sérových proteinů výrazně vzrůstá, bovinní serumalbumin z 0,24 na 0,65 mg . ml-1, celkové imunoglobuliny z 0,3 na 18,3 mg . ml-1. Uvedené poklesy a nárůsty jsou přibližně v rovnováze, proto nebývá zjišťován statisticky významný pokles celkové bílkoviny mléka. Při experimentálně vyvolané mastitidě byl popsán vzestup aktivity proteáz, který vedl k hydrolýze ß-kaseinu a αS1-kaseinu. Hydrolýza byla potencována opakovaným zmražením a rozmražením změněného sekretu. Významnou roli v proteolýze hraje plazmin. V mléce je navázán na kaseinové micely a degraduje αS1, αS2 na γkasein, peptony a pravděpodobně κ-kasein. Prekurzorem plazminu je plazminogen, představující v mléce proteolytický rezervoár. Plazmin způsobuje proteolýzu při sýření v závislosti na technologické teplotě (plazmin má optimální aktivitu při 37 °C a pH 7,5). Tento enzym je termostabilní a je možné, že se účastní při vzniku želatinizace UHT mléka. Mléčný cukr. Pokles obsahu laktózy je jednou z nejvýznamnějších změn složení mléka v důsledku zánětlivého procesu. Zánětlivý proces mléčné žlázy vede k poškození sekrečních buněk a k narušení syntetické aktivity enzymatického systému zahrnujícího enzym galaktosyl transferázu a α-laktalbumin. To je pak příčinou snížené biosyntézy laktózy. Snížený obsah laktózy se projevuje i v dalších změnách mléka, v poklesu sušiny, tukuprosté sušiny, a ve změnách hodnot chlorcukrového čísla. Protože laktóza je osmoticky aktivní, bývá zvýšený obsah sodíku a chloridů uváděn jako kompenzační mechanismus pro udržení osmotické rovnováhy sekretu. Produkce mléka. Zánětlivý proces mléčné žlázy významně snižuje produkci mléka. Klesá obsah sušiny, tukuprosté sušiny, zvyšuje se obsah popela. Ionty mléka. Zánětlivý proces mléčné žlázy způsobuje poškození sekrečního epitelu. Tím je narušeno tzv. těsnicí spojení mezi sekrečními buňkami a dochází ke zvýšení permeability. Protože Na+ a Cl- jsou v extracelulární tekutině v převaze, pronikají do lumina alveol. Aby se udržela osmotická rovnováha, obsah K+ proporcionálně klesá. Rovněž hladiny vápníku, hořčíku a fosforu jsou při zánětlivém procesu sníženy. Chemické změny mléka v důsledku mastitid Složka laktóza [g . l-1] α S1-kasein [mg . ml-1] α -laktalbumin [mg . ml-1] ß-laktoglobulin [mg . ml-1] imunoglobuliny [mg . ml-1] serumalbumin [mg . ml-1] Hamann a Krömker, 1997

Normální hladina 4,85 13,3 1,03 - 1,22 4,0 0,25 - 0,30 0,24

Koeficient změny 0,93 0,50 0,50 0,74 10,0 2,7

Fyzikálně chemické změny mléka. Popsané změny v chemickém složení mléka se odrážejí i ve fyzikálních vlastnostech. Byl zaznamenán vzrůst pH a elektrické konduktivity. Zvyšuje se i viskozita mléka, dochází k depresi bodu mrznutí.

5

Fyzikálně chemické změny mléka v důsledku mastitid Složka Normální hladina celkový Ca2+ [µmol . l-1] 22,94 2+ -1 celkový Mg [µmol . l ] 8,32 -1 celkový P [µmol . l ] 17,2 -1 citrát [mmol . l ] 11,2 + -1 K [mmol . l ] 44,1 -1 Cl [mmol . l ] 22,6 - 39,05 + -1 Na [mmol . l ] 24,9 chlorcukrové číslo 2,05 - 3,2 titrační kyselost [°SH] 6,2 - 8,0 pH 6,65 -1 elektrická vodivost [S . m ] 0,480 bod mrznutí [- °C] 0,57 - 0,53 Hamann a Krömker, 1997

Koeficient změny 0,43 0,31 0,75 0,72 0,85 1,2 - 2,0 2,0 2,8 0,8 - 0,6 1,15 1,1 - 2,2 <1,0

Kvantitativní změny složení mléka i změn fyzikálních vlastnosti shrnuje následující graf.

Tolle, et al.,1971

6

Nutriční hodnota a technologická zpracovatelnost mléka Nutričně významné složky mléka kontaminovaného zánětlivými sekrety jsou, jak vyplývá z uvedených údajů, významně ovlivněny. Nejzávažnější je snižování hlavních živin mléka, laktózy a kaseinu. Nelze opomenout ani závažnost poklesu obsahu významných makroelementů, vápníku a fosforu. Nutričně nejvýznamnější je celkově snížená jakost mléka a mléčných výrobků, která působí jako faktor omezující jejich spotřebu. Tím dochází k podceňování významu mléka a mléčných produktů v racionální výživě. Popsané změny vlastností mléka ovlivňují jejich technologickou zpracovatelnost, a proto i jakost finálních produktů. Konzumní mléko má sníženou úchovnost v důsledku působení termostabilních somatických lipáz a proteáz. Pasterizované mléko s příměsí zánětlivých sekretů má tendenci k rychlému nástupu smyslových vad, zejména vůně a chuti. Se zvyšujícím se podílem mléka od mastitidních krav klesá jeho termostabilita, což narušuje technologii výroby sterilizovaného (UHT) a kondenzovaného mléka. Tyto výrobky mají tendenci k chuťovým vadám a při skladování i k tvorbě sedimentu a k želatinizaci. Senzoricky jsou ovlivněny i sušené mléčné výrobky. Klesá u nich rozpustnost při obnovování. Snížený obsah laktózy, základního substrátu kulturní mlékařské mikroflóry, narušuje zpracování mléka na kysané mléčné produkty. Technologie jejich výroby je nepříznivě ovlivněna i zvýšenou alkalitou zánětlivého sekretu a přítomností endogenních inhibičních látek, např. volných mastných kyselin a imunoglobulinů. Při výrobě másla se prodlužuje doba stloukání. Smetana ze změněného mléka má vyšší číslo kyselosti a máslo z ní má nažluklou chuť, neboť podléhá snadněji oxidaci. Velmi významně je narušena technologie výroby sýrů. Nižší obsah kaseinu a změny v jeho disperzi, jakož i snížený obsah vápníku, hořčíku a fosforu zhoršují syřitelnost. Špatně se odděluje syrovátka. Negativně se při tom uplatňují i zvýšené hladiny imunoglobulinů, volných mastných kyselin a laktoperoxidázy, stejně tak i zvýšená alkalita. Narušeno je zrání sýrů. Nízká aktivita xantinoxidázy snižuje ochranný účinek dusičnanů proti duření sýrů. Tvrdé sýry produkované z mléka kontaminovaného zánětlivými sekrety mají sníženou tuhost, vyšší obsah vody a narušené chuťové vlastnosti. Mikrobiologické vlastnosti mléka Některé kmeny streptokoků a stafylokoků způsobující mastitidy krav mohou být patogenní i pro člověka. Syrové mléko proto může být potenciálním zdrojem nebezpečí, avšak účinné tepelné ošetření mléka, jakým je pasterace, destruuje tyto mikroorganismy. Bylo prokázáno, že Streptococcus agalactiae je zodpovědný za infekce novorozenců, které u nich mohou vést k septikémiím a meningitidám. Uvádí se, že uvedený patogen je příčinou až 25 % perinatálních úmrtí novorozenců (sepse, meningitidy). Tento patogen cirkuluje mezi populací krav a lidí a vyskytuje se i ve vnějším prostředí, např. v odpadních vodách. 7 až 20 % rodiček má porodní cesty kolonizované tímto patogenem. Traduje se, že přenos ze zvířat na člověka je vzácný a málo významný. To lze přičíst mimo jiné i faktu, že prevalence tohoto patogena ve stádech krav výrazně klesla. Druhý nejvýznamnější patogen mléčné žlázy krav, Staphylococcus aureus, přináší rizika poněkud vyšší. Je rovněž významným patogenem lidí, u kterých vyvolává úporné chronické

7

infekce, zvláště horních cest dýchacích. Staphylococcus aureus je příčinou závažných nosokomiálních infekcí na chirurgických odděleních nemocnic. Vyvolává sepse, osteomyelitidy, furunkulózy a další onemocnění, vedoucí až ke smrti postižených lidí. Kromě toho, jeho toxické produkty jsou u lidí významnými alergeny. Navíc řada kmenů tohoto patogena vykazuje polyrezistenci vůči antibiotikům. Uvádí se, že 30 % lidí infikovaných polyrezistentními kmeny tohoto patogena umírá. Polyrezistentní kmeny Staphylococcus aureus byly zachyceny i z infikovaných krav. Staphylococcus aureus je závažný i tím, že některé jeho kmeny produkují termostabilní enterotoxiny, vyvolávající u lidí enterotoxikózy (viz dále). I když enterotoxigenita je vázána převážně na biotypy humánní provenience a nebezpečí pro člověka hrozí až při vysokém pomnožení mikroba (106 . ml-1), nelze ohrožení člověka při konzumu mléka zcela vyloučit. To proto, že některá stáda dojnic jsou promořena dominantně biotypem A Staphylococcus aureus, tedy biotypem s nejvyšším zastoupením enterotoxigenních kmenů. Toto nebezpečí je zvláště aktuální při prodeji mléka ze dvora, kdy se snižuje účinnost fenoménu ředění. Psychrotrofní bakterie Některé patogeny mléčné žlázy skotu příslušejí k závažné skupině mikroorganismů, které označujeme jako psychrotrofní baktérie. Jsou to mikroorganismy, které jsou schopny pomnožovat se při 7 i méně °C, tedy při uchovávání mléka v chladovém režimu. Častějším zdrojem kontaminace syrového mléka psychrotrofními bakteriemi než mléčná žláza, je však vnější prostředí. Psychrotrofní bakterie produkují termostabilní enzymy způsobující proteolýzu a lipolýzu mléka.Tak dochází k závažným změnám ve složení mléka, které se manifestují organoleptickým změnami mléka a mléčných výrobků. Dochází zejména k porušení chuti a vůně, k tvorbě sedimentu. U vysoce tepelně ošetřených mlék vzniká hlenovatění. Proteolytické příslušejí k rodům: Achromobacter Aeromonas Flavobacterium Xantomonas

Pseudomonas Escherichia Proteus Serratia

(Tučně jsou vytištěni původci mastitid.) Hydrolýzují zejména κ-kasein (tím narušují stabilitu kaseinových micel). Hydrolýzou vznikají volné aminokyseliny. U pasterizovaného mléka vzniká sediment.Vyskytuje se i hniloba mléka s produkcí indolu a amoniaku. Lipolytické příslušejí rodům: Aeromonas Acinetobacter Flavobacterium

Pseudomonas

Lipolytické produkující lecitinázu

8

Acinetobacter Alcaligenes Flavobacterium

Citrobacter Enterobacter Klebsiella Pseudomonas

Lecitináza hydrolyzuje ochrannou membránu tukových kuliček. Tím přispívá k urychlení oxidace mléčného tuku, ke žluknutí. Kontaminace psychrotrofní mikroflórou tedy může být příčinou technologických a organoleptických vad finálních mléčných výrobků. Celkový počet mikroorganismů v syrovém mléce Patogenní mikroflóra vylučovaná infikovanými dojnicemi ovlivňuje trvale celkový počet mikroorganismů v syrovém mléce. Uvádí se, že mléčná žláza stižená klinickou mastitidou vylučuje až 108 mikrobů v 1 ml sekretu. U subklinických mastitid 104 až 105 mikrobů v 1 ml. Hlavní patogeny se v syrovém mléce vyskytují často. Uvádí se např., že patogenní streptokoky se vyskytují v 64 %, Staphylococcus aureus ve 28 % až 46 % bazénových vzorků mléka. Jejich celkový počet však obvykle nepřekračuje 104 v ml mléka. Jak již bylo uvedeno, někteří bakteriální původci mastitid se uplatňují i jako původci alimentárních onemocnění člověka. Kontaminace syrového mléka těmito patogeny představuje reálné nebezpečí pro člověka, zvláště konzumují-li syrové mléko a mléčné výrobky, které nebyly vyrobeny z pasterizovaného mléka. Výskyt původců alimentárních onemocnění člověka v syrovém mléce Alimentární onemocnění člověka způsobovaná původci přenosnými ze zvířat na člověka řadíme k zoonózám. Zoonózou jsou onemocnění nebo infekce, které jsou přirozeně přenosné přímo nebo nepřímo mezi zvířaty a lidmi. Sledování zoonóz a jejich původců upravuje vyhláška 356/2004 Sb. Z původců zoonóz lze reálně v syrovém mléce detekovat: Salonella spp., Staphylococcus aureus (enterotoxigenní – ETSA), Escherichia coli (shigatoxigenní – STEC) , Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica. Všechny uvedené patogeny mohou vyvolat mastitidu u dojnic. U většiny z nich se však průkaz opírá pouze o experimentální infekci: Salonella dublin, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni a Yersinia enterocolitica (Oliver a spol., 2005). Přirozená infekce mléčných žláz je pravděpodobně velmi vzácná a nemá praktický význam ani z hlediska onemocnění zvířat, ani jako zdroj onemocnění člověka. Z uvedený bakteriálních druhů jsou velmi závažnými a široce rozšířenými původci mastitid Staphylococcus aureus a Escherichia coli. Přímý průkaz enterotoxigenity kmenů Staphylococcus aureus a shigatoxigenity kmenů Escherichia coli vykultivovaných ze sekretů mastitidních žláz však téměř chybí. Lze proto konstatovat, že infikovaná mléční žláza se uplatňuje jako zdroj bakteriálních původců alimentárních onemocnění člověka velmi málo. Je však třeba brát na zřetel, že řada původců mastitid dojnic se vyskytuje v prostředí (environmentální původci). Tyto zdroje kontaminace syrového mléka jsou pro člověka mnohem rizikovější. Dojnice jsou jako zdroj kontaminace závažné i tím, že někteří původci alimentárních onemocnění člověka kolonizují jejich zažívací trakt (Escherichia coli, Salonella spp., Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni a Yersinia enterocolitica). Fekální kontaminace syrového mléka je tak často příčinou onemocnění konzumenta (viz dále). V syrovém mléce byla výskytu původců alimentárních onemocnění člověka věnována řada studií. Převážně byly tyto studie zaměřeny na prevalenci Campylobacter jejuni, Listeria

9

monocytogenes, a Salmonella spp. Údaje o výskytu shiga-toxigenní Escherichia coli (STEC) neboli enterohemorragické E. coli (EHEC) a enterotoxigenních kmenů Staphylococcus aureus v syrovém mléce jsou dosud pouze ojedinělé. Proto jsme se jimi v r. 2006 zabývali (Ryšánek a Hubáčková, 2006). V 502 bazénových vzorcích syrového mléka bylo identifikováno 109 izolátů E. coli (21,0 %) a 70 izolátů S. aureus (13,9 %). Metodou multiplex PCR nebyly z izolátů E. coli detekovány žádné geny kódující shigatoxiny. Pouze byly zachyceny 2 izoláty s genem kódujícím produkci jednoho z faktorů virulence intiminu (saeA). Z izolátů S. aureus byly metodou multiplex PCR detekovány následující genotypy enterotoxinů v četnosti : a (11 %), g (11 %)i, agi (10 %), bgi (7 %), abgi (3 %) , h (3 %), i (3 %), dj (3 %), al (1 %), ah (1 %). Zhodnocení nebezpečí výskytu toxinogenních kmenů E. coli a S. aureus v mléce Z dosažených výsledků je zřejmé, že nebezpečí pramenící z kontaminace syrového mléka shigatoxigenními E. coli je na území České republiky malé. Toto nebezpečí nelze podceňovat, neboť infekční dávka při alimentárních infekcí způsobovaných shigatoxigenními E. coli (STEC) je velmi malá (1-10 KTJ/ml) (Paton a Paton, 1998). Většina publikovaných výskytů infekcí STEC souvisela s konzumem syrového nebo nedostatečně pasterizovaného mléka nebo smetany. Infekce STEC není sice příliš častá, avšak může probíhat jako velmi vážné onemocnění s trvalými následky nebo úmrtím pacienta. STEC O157 (výskyt 33 %) vedle salmonel (37 %) a kampylobakterů (26 %) byly nejčastějšími původci alimentárních onemocnění farmářů. To dokládá významnost STEC O157 jako patogenních mikroorganismů v mléce a závažnou negativní roli nepasterizovaného mléka při onemocněních člověka . Legislativa v České republice se řídí od 1.1. 2006 nařízeními tzv. hygienického balíčku EU. Je to zejména nařízení, kterým se stanoví zvláštní hygienická pravidla pro potraviny živočišného původu (Regulation 853/ 2005) a nařízení zavádějící mikrobiologická kritéria pro potraviny (Nařízení 2073/2005). Žádné z těchto nařízení neudává povinnost kontrolovat shigatoxiny v mléce nebo jiných komoditách, pouze se kontrolují limitní počty E. coli v másle a smetaně vyrobené ze syrového mléka nebo z mléka, které bylo podrobeno nižšímu tepelnému ošetření než pasteraci (limitní hodnota činí: m = 10; M = 100 KTJ/g, c = 2; n = 5). Alimentární intoxikaci mohou vyvolat kmeny S. aureus produkující klasické SEs (A-E), z nově popsaných SEs to jsou SEG, SEH, SEI. V naší studii 6,6 % bazénových vzorků mléka obsahovalo izoláty S. aureus produkující tyto SEs nebo nesoucí jejich geny. Jiní autoři detekovali SE geny dokonce u 48 % vzorků syrového kravského mléka. V Norsku v bazénových vzorcích kravského mléka byl nejčastěji zachycovaným klasickým toxinem SEC/sec. V České republice byl nejfrekventovanější gen sea. Dále to byl SEB/seb, nejméně častý byl SED/sed. SEC/sec ani see nebyly zachyceny. Nejčastější výskyt sea je v souladu s poznáním, že přes 75 % alimentárních intoxikací je způsobeno právě toxinem SEA. Není pochyb o tom, že syrové mléko je potenciálním zdrojem enterotoxigenních kmenů S. aureus a tedy i potenciálním zdrojem stafylokokových enterotoxinů v konzumním mléce a

10

mléčných produktech. K vyprodukování potřebného množství toxinu je však zapotřebí pomnožení toxinogenního kmene S. aureus v počtu 106 KTJ/g nebo ml (Jičínská a Havlová., 1995). Legislativa EU zavedla nová mikrobiologická kritéria v nařízení 2073/2005. Toto nařízení zahrnuje mezi kritéria bezpečnosti potravin kromě limitních počtů listerií a salmonel i nepřítomnost stafylokokové enterotoxinů v sýrech, které byly vyrobeny ze syrového mléka nebo mléka vystaveného nižšímu tepelnému ošetření než pasterizaci, ve zrajících sýrech a měkkých sýrech (čerstvých sýrech), v sušeném mléce a v sušené syrovátce podle kritérií hygieny výrobního procesu. V uvedených komoditách se požaduje negativní nález stafylokokových enterotoxinů v 25 g vzorku. Vyšetření se však provádí pouze tehdy, je-li počet koagulázopozitivních stafylokoků vyšší než 105 KTJ/g. Přehled mikrobiologických kritérií uvádí následující schéma: Kritéria bezpečnosti potravin

-

listerie v potravinách „ready to eat“ (pod 100 KTJ/g)

-

salmonely v sýrech, másle, smetaně ze syrového mléka, v sušeném mléce a sušené syrovátce, v mražených krémech a vaječných výrobcích, (negativní v 25 g)

-

stafylkokové enterotoxiny v v sýrech, másle, smetaně ze syrového mléka, v sušeném mléce a sušené syrovátce (negativní v 25 g)

Kritéria hygieny výrobního procesu Enterobacteriaceae; E. coli; Koagulázopozitivní stafylokoky; Velkým nebezpečím souvisejícím s SEs je jejich termostabilita. Po tepelném zpracování mléka může být počet bakterií S. aureus nulový, avšak toxin zůstává neporušen a může vyvolat intoxikaci. Nejdůležitějším krokem k prevenci alimentární intoxikace SEs je zchlazení mléka hned po nadojení, kdy je pozastaveno pomnožování S. aureus. Při nízké teplotě (pod 10°C) nejsou toxinogenní kmeny schopny SEs produkovat. Alimentární intoxikace SEs byly nejčastěji zaznamenány při konzumaci syrového mléka a nízkotučného sušeného mléka. Z výše uvedeného vyplývá, že syrové kravské mléko je vysoce rizikovou komoditou z hlediska alimentárních intoxikací. EU vydala nařízení (Regulation 853/2005), kde vymezuje podmínky prodeje syrového mléka k přímé lidské spotřebě. Nařízení umožňuje členským státům buď zakázat, omezit nebo připustit prodej syrového mléka a smetany určených k přímé lidské spotřebě. Tak například ve Skotsku je prodej nepasterizovaného mléka úplně zakázán, v Anglii a Walesu je prodej povolen, avšak od r. 1995 tam existují přísná hygienická kritéria pro syrové mléko určené k prodeji spotřebitelům: Celkový počet mikroorganismů (při 30 °C): 20000/ml; Počet koliformních bakterií <100/ml; patogeny a jejich toxiny nepřítomné v množstvích ovlivňujících zdraví konzumentů. V ČR se syrové mléko vyrobené k přímé lidské spotřebě nepodrobuje žádným přísnějším požadavkům a vztahují se na ně dosud obdobná hygienická kritéria jako na syrové mléko určené k mlékárenskému ošetření a zpracování. Navíc se pouze požaduje, aby při prodeji bylo mléko zřetelně označeno, že má být před spotřebou převařeno (Vyhláška 375/2003 Sb.).

11

Ohrožení lidí rezidui antibiotik v mléce souvisí s ovlivněním jakosti mléka zánětlivými onemocněními mléčných žláz nepřímo. Avšak stávající masově uplatňovaná terapie mastitid antibiotiky, které jsme svědky, staví tento problém do popředí. Je tomu tak proto, že rezidua antibiotik ohrožují lidskou populaci jako významné alergeny. I nízké koncentrace některých antibiotik, např. 3 . 10-6 m.j. penicilinu mohou u alergiků vyvolat dramatické klinické reakce. I když se tvrdí, že alergizují jen parenterálně aplikovaná antibiotika, nelze vyloučit, že cirkulace reziduí antibiotik vede k permanentní alergizaci. Je třeba si uvědomit, že většina antibiotik je vysoce termorezistentních, takže mohou zůstávat v mléce i po účinné pasteraci. Nelze opomenout ani potenciální nebezpečí vzniku bakteriální rezistence vůči antibiotikům. Vznik a šíření rezistence je největší v zemích, kde jsou antibiotika laikům volně dostupná. Je proto absence reziduí antimikrobiálních látek významným jakostním znakem syrového mléka a kritériem způsobilosti syrového mléka pro mlékárenské zpracování k lidské výživě. Vybrané literární prameny Fox, P.F., Kelly, A.L.: Indigenous enzymes in milk: Overview and historical aspects. Internationa Dairy Journal 16 (2006) 500-516. Hamann J., Krömker V., Potential of specific milk composition variables for cow health management, Livest. Prod. Sci. 48 (1997) 201-208 Jičínská, E., Havlová., J.: Patogenní mikroorganismy v mléce a mlékárenských výrobcích. ÚSPI Praha1995: .106 s. Oliver1, S.P. , Jayarao, B.M., Almeida, R A.: Foodborne pathogens, Mastitis, Milk quality and dairy food safety. NMC Annual Meeting Proceedings (2005), 3-27. Ryšánek, D., Hubáčková, M.: Analýza rizik průniku shigatoxigenních Escherichia coli a enterotoxigenních Staphylococcus aureus do konzumního mléka. Studie Vědeckého výboru veterinárního. Brno 2006. 17 s. Shah, N.P.: Psychrotrophs in milk: a review. Milchwissenschaft 49, 1994: 432-437. Tolle, A., Heeschen, W., Reichmuth, J., Zeidler, H.: Dairy Sci. Abstract 33, 197: 875-879.

Poslední aktualizace: Květen 2007 Copyright (c) Dušan Ryšánek. All rights reserved.

12