Diagnostika a hodnocení chorob rostlin, se zaměřením na obilniny

Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha 6 - Ruzyně

Diagnostika a hodnocení chorob rostlin, se zaměřením na obilniny

Odborný seminář 9. 11. 2006.

Výzkumný ústav rostlinné výroby, 2006 161 06 Praha 6 – Ruzyně, Drnovská 507 Odborný garant: Ing. Lubomír Věchet, CSc. ISBN: 80-86555-92-5

2

Obsah Lubomír Věchet: Diagnostika a měření chorob rostlin. Leona Leišová: Hodnocení a diagnostika chorob obilnin způsobených houbovými patogeny s využitím molekulárně-biologických metod. Lubomír Věchet: Určení a hodnocení padlí travního (Blumeria graminis f. sp. tritici; anamorph Erysiphe graminis) na pšenici. Alena Hanzalová, Jana Šárová: Původci listových skvrnitostí v ČR Jana Chrpová, Václav Šíp, Eliška Sychrová, Eva Matějová: Klasové fuzariózy u pšenice. Eliška Sychrová: Choroby pat stébel. Evženie Prokinová: Diagnostika listových skvrnitostí ječmene. Lubomír Věchet: Diagnostika a hodnocení braničnatky pšeničné (Mycosphaerella graminicola). Michaela Kochanová, Evženie Prokinová: Diagnostika snětí rodu Tilletia na pšenici. Jozef Gubiš, Martina Hudcovicová: Využitie PCR metód v detekcii Rhynchosporium secalis na jačmeni siatom. Blanka Kokošková: Význam a diagnostika bakterií Pseudomonas syringae a patovarů vyskytujících se na obilninách. Josef Hýsek, Milan Vach: Diagnostika a hodnocení fytopatogenních hub rodu Fusarium (Posuny v houbovém spektru po aplikaci biopreparátů při pěstování jarního ječmene. Markéta Hejná, Miroslav Kolařík, Jaroslava Marková: Molekulárně-genetická analýza aecií na rodu Ranunculus.

4 7 14 19 23 26 31 35 40 44 47 53 56

3

Diagnostika a měření chorob rostlin Lubomír Věchet Výzkumný ústav rostlinné výroby, Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně E-mail: [email protected] Udává se, že je celosvětově známo asi 80 000 chorob rostlin. Abychom si dovedli udělat představu o závažnosti napadení rostlin chorobou, je třeba nejprve chorobu správně určit. Choroba je zhoršení normálního stavu živé rostliny, které narušuje nebo pozměňuje životní funkce. Rostlina stává ochořelou, když je nepřetržitě postižena nějakým příčinným agens, které končí v abnormálních fyziologických procesech, jež narušují normální strukturu, růst, funkci a jiné aktivity, například změní ekonomické hodnoty produktu. Jde prostě o řadu událostí spouštěných patogenem, které vedou k destrukci tkání nebo právě k ovládnutí rostliny patogenem. Důsledkem může být abnormální růst nebo disfunkce rostliny způsobená živými organizmy nebo neživými faktory. Choroba se většinou projevuje v místě infekce rostliny patogenem. U nadzemních částí to mohou být chlorotické skvrny, později s ložiskem infekce. Při pohledu pouhým okem je vidět řada příznaků choroby v podobě například mycelia na povrchu rostliny nebo je mycelium skryto uvnitř hostitele a jsou vidět jen ložiska výtrusů, jindy to jsou skvrny charakteristicky tvarované a zbarvené. Někdy může být rostlina napadena více patogeny a často není jednoduché určit, který patogen je primární. U chorob kořenů to mohou být nápadné barevné změny (např. černání). Zdrojem infekce může být také vyseté zrno a k projevu choroby dochází na listech nebo klasech. Běžně se vyskytující choroby mohou být rozděleny na listové a klasové a půdou přenosné choroby. Některé choroby je relativně snadné diagnostikovat, protože symptomy jsou charakteristické a zřejmé. Ostatní choroby může být obtížné diagnostikovat bez mikroskopických nebo laboratorních analýz. Diagnóza je tedy první krok směrem k dosažení efektivní kontroly. Správné určení choroby je možné podle charakteristických příznaků napadení. Obecně lze říci, že do metod určení choroby patří polní diagnostika, laboratorní testy (jako kultury původce choroby), sérologické testy (ELISA), molekulární testy (PCR), indexace biologickými indikátory. Příznaky ochoření podzemních a nadzemních částí rostliny mohou být však značně odlišné. Pokud příznaky nejsou jednoznačné a nestačí vizuální posouzení, musíme provést podrobnější hodnocení pod mikroskopem. Jindy je třeba patogena izolovat z ložiska infekce a provést určení pomocí různých identifikačních metod jako jsou metody biochemické, imunochemické, molekulárně biologické nebo testy patogenity. Tyto metody je nezbytné použít také ve sporných případech. Kromě hlavních příznaků ochoření se v některých případech mohou objevit druhotné, někdy velice nápadné změny v habitu rostliny (např. lom stébla, bělení klasů, malá výška rostliny, bohaté odnožování ap.). V řízení ochrany rostlin je kromě přesné identifikace choroby důležité, kromě jiného, určit počátek objevení choroby v porostu rostliny. Jednou z metod, jak poměrně přesně určit nástup choroby v porostu plodiny je metoda sumace průměrných efektivních denních teplot. Tato metoda byla úspěšně použita při stanovení počátku výskytu padlí travního na ječmeni ( Věchet a Kocourek, 1988). Diagnostika a měření intenzity choroby hrají klíčovou úlohu ve fytopatologii. Bez kvantifikace choroby by nebyla možná žádná studie epidemiologie, odhad ztrát na výnosu plodiny, žádný průzkum výskytu choroby. Intenzita choroby může být vyjádřena (Kranz & Rotem, 1988) buď jako výskyt (frekvence) nebo jako závažnost. Výskyt je procento ochořelých rostlin nebo částí rostliny ve vzorku nebo populaci, bez ohledu na samotnou závažnost. Závažnost choroby je procento příslušné tkáně nebo orgánu hostitele pokrytého symptomy (nebo skvrnami) choroby.

4

Závažnost vyplývá z počtu a velikosti skvrn. Výběr mezi hodnocením choroby podle závažnosti nebo výskytu (frekvence) záleží převážně na typu choroby a na účelu hodnocení. Závažnost choroby se zdá být více vhodná pro rzi, padlí travní, plísně, listové skvrnitosti apod. Hodnocení chorob podle výskytu je vhodné pro většinu chorob v časných stádiích jejich epidemií. Vizuální odhad napadení rostliny chorobou je důležitý pro studium epidemiologie choroby, rezistence rostlin k chorobě, účinku fungicidů a odhadu ztráty na výnosu plodiny. Například vizuální odhad procenta ochořelé listové plochy je ovlivněn strukturou rostliny, velikostí a typem skvrn. Tento odhad můžeme provádět na poli a to buď přímo na rostlinách nebo částech rostlin, případně na odtržených rostlinách. Jiným způsobem je použití klíčů (obrázkový odhadovací klíč), standardních diagramů (mohou být použity i pro měření intenzity choroby) nebo stupnice měření intenzity choroby. Kromě těchto odhadovacích klíčů byly vytvořeny i fotografické klíče (Flath, Andersch, 1996; Obr. 1). Při hodnocení listových chorob se používají a používaly různé stupnice s větším nebo menším počtem hodnotících kategorií. V současné době se nejvíce používá 9-ti bodová stupnice. Každý hodnotitel je při hodnocení napadení rostliny chorobou zatížen vlastní, subjektivní chybou. Důsledkem toho je, že například dva hodnotitelé odhadnou stejné napadení různě. U napadení rostlin biotrofními patogeny (např. padlí travní, rzi) hodnotíme procento pokrytí listové plochy příznaky napadení. U napadení rostlin nekrotrofními patogeny (například braničnatka pšeničná) hodnotíme procento nekrotických skvrn, s charakteristickými příznaky na listu. Můžeme hodnotit napadení jednoho listu na rostlině (např. praporcového) nebo všech listů a z toho vypočítat napadení celé rostliny. Při vyjádření napadení celé rostliny, kdy vycházíme z napadení všech listů na rostlině, může dojít k rozkolísání hodnot v několika po sobě jdoucích hodnoceních. Důsledkem, kromě subjektivní chyby, je skutečnost, že počet listů na rostlině se v růstových fázích mění. Může se totiž stát, že v následném hodnocení uděláme nižší odhad, než v předchozím hodnocení. Přesnější je potom použití tzv. kumulativního procenta napadení (CPLAD), kdy v jednotlivých termínech hodnocení se načítají pouze vyšší hodnoty. Často potřebujeme měřit rychlost vývoje choroby. Zvláště při aplikaci fungicidů je třeba znát jak jejich použití ovlivnilo snížení rychlosti epidemie, třeba v porovnání s neošetřeným porostem. Existují tři způsoby výpočtu rychlosti epidemie (Kranz & Rotem, 1988): (1) dvoubodová metoda, (2) lineární regrese transformovaných hodnot intenzity choroby a (3) nelineární hodnoty odpovídající intenzitě choroby. Podívejme se na ten nejjednodušší způsob, to je dvoubodovou metodu výpočtu rychlosti. V křivce průběhu choroby jsou vybrány dvě hodnoty, které jsou v našem zájmu a z těch vypočítáme rychlost epidemie. Jestliže má křivka choroby logistický průběh (logistická rovnice je nejjednodušší model růstu, která počítá rychlost růstu vůči nule v nějakém časovém bodě) je rychlost vypočítána takto: r= [logit(y2)logit(y1)]/dt, kde logit (y) je loge (y/(1-y)) a dt je časový interval mezi vybranými body. Jestliže křivka průběhu choroby má asymetrický, sigmoidální charakter (podoba C), pak se používá Gompertzova transformace. Výpočet je podobný: k=[gompit(Y2) – gompit (y1)]/dt, kde gompit(y) je –log)-log(y)). Nejčastěji používaným způsobem výpočtu v korelaci intenzity choroby k odhadu ztráty na výnosu je AUDCP- plocha pod křivkou rozvoje choroby. Ta byla prvně použita Vanderplankem v roce 1963. Je obvykle počítána trapezoidální transformací AUDPC= Σ(yi+yi+1)/2xdti, kde dti je časový interval mezi každými dvěma pozorováními yia yi+1 Z hlediska ochranného zásahu proti chorobě je třeba napadení hodnotit již v ranných fázích vývoje choroby. Byla také snaha vyvinout metody, které by tomuto mohly být nápomocny. Jedním příkladem může být metoda sumace efektivních teplot, kterou jsme v roce 1990 vyvinuli pro počátek hodnocení padlí travního na jarním ječmeni. Správné určení choroby na rostlině a jeho přesné měření je předpokladem dobré vypovídací schopnosti našich výsledků.

5

LITERATURA FLATH K., ANDERSCH A. (1996): Assessment of partial resistence to powdery mildew in German winter wheat varieties by a laboratory methhod. Proceedings of th 9th European and Mediterranean Cereeal & Powdery Mildews Conference 2-6 September 1996, Lunteren, The Netherlands. 226. KRANZ J., ROTEM J. (1988): Experimental techniques in plant disease epidemiology. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo: 1-299. VĚCHET L., KOCOUREK F. (1988): Model řízení ochrany ječmene jarního proti padlí travnímu. Ochrana rostlin 24, (3): 183-190.

Tento výzkum byl podporován výzkumným záměrem MZE ČR č. 0002700602.

6

Hodnocení a diagnostika chorob obilnin způsobených houbovými patogeny s využitím molekulárně-biologických metod Leona Leišová Výzkumný ústav rostlinné výroby, Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně E-mail: [email protected] Nejčastějšími chorobami obilovin jsou choroby způsobené houbovými patogeny. Způsobují značné ekonomické ztráty, a proto se jejich studiu věnuje stále větší pozornost. Houby (Fungi) jsou eukaryotické, stélkaté organismy, jejichž heterotrofie je odkazuje k saprofytickému, parazitickému nebo symbiotickému způsobu výživy. Genom vláknitých hub o velikosti 20 až 50 Mb je rozdělen na jaderný, mitochondriální a plasmidový. Obsahuje málo repetitivní DNA s výjimkou genů pro rRNA, tRNA a úseků podobných retrotransposonům. Jaderný genom je uspořádán v chromosomech podobně jako u ostatních eukaryot. Mitochondriová DNA je většinou kružnicová a je značně velikostně i sekvenčně variabilní. Plasmidy u vláknitých hub se primárně vyskytují v mitochondriích. Kompletní sekvence genomu není dosud známa u žádného druhu houby parazitující na rostlinách. Nejprostudovanější částí genomu jsou tzv. ITS a IGS oblasti, které se často využívají pro taxonomické studie (Mugnier, 1995) a k přípravě diagnostických markerů (Bates et al., 2001). ITS (Internal Transcribed Spacers) jsou mezerníky, které oddělují geny kódující ribosomální rRNA: ITS1 se nachází mezi geny pro 18S rRNA a 5,8S rRNA a ITS2 mezi geny pro 5,8S rRNA a 26S rRNA. Mezi jednotlivými opakujícími se jednotkami jsou opět mezerníky, tzv. IGS (Intergenic Spacers). Kódující oblasti jsou značně konzervativní, naopak oblast mezerníků ITS a IGS vykazují vysokou míru variability. Klasická metodika detekce houbových patogenů zahrnuje pěstování na umělých živných médiích (Arabi and Jawhar, 2003), imunologické testy (ELISA) a patologické testy na diferenciačních odrůdách hostitele (Afanasenko et al., 1995). Tyto metody selhávají tam, kde se jedná o vysoce variabilní populaci patogena a tam, kde existují druhy či formy geneticky si velmi blízké. To je např. případ houby Pyrenophora teres, jejíž populace vykazují vysokou míru variability, a která se vyskytuje ve dvou formách: Pyrenophora teres f. sp. teres a Pyrenophora teres f. sp. maculata (Smedegård-Petersen, 1971). Obě formy produkují podobné kultury na umělých živných půdách, mají takřka identickou morfologii; liší se pouze typem symptomu na listech hostitele. Vzhledem k tomu, že se rezistence k oběma formám dědí nezávisle (Ho et al., 1996) je důležité, aby byl patogen korektně identifikován. Taktéž následný výzkum chování patogena musí být založen na správné identifikaci druhu a formy. Nové možnosti detekce patogenů se otevřely s objevením polymerázové řetězové reakce. První metodou použitou k detekci a vzájemnému rozlišení druhů Pyrenophora teres f. sp. teres, Pyrenophora teres f. sp. maculata a Pyrenophora graminea byla RAPD (Reeves and Ball, 1991). Autoři použili 4 primery, z nichž pomocí jednoho dokázali rozlišit všech osm studovaných izolátů. Tento počet je však pro přípravu markeru nedostatečný. Peltonen et al. (1996) dokázali pomocí metody RAPD rozlišit 50 izolátů Pyrenophora teres a Pyrenophora graminea. Dvě formy Pyrenopora teres: Pyrenophora teres f. sp. teres a Pyrenophora teres f. sp. maculata však rozlišit nedokázali. Taylor et al. (2001) použili 60 RAPD primerů k vyhledání diagnostického druhově specifického markeru. Ten převedli na tzv. SCAR (Sequence-Characterised Amplified Region) marker, pomocí něhož lze specificky detekovat Pyrenophora graminea v zrnu ječmene (Hordeum vulgare). Tento postup: převod RAPD markeru na specifický SCAR marker je hojně využíván, pro detekci Pyrenophora teres jej použili Williams et al. (2001). Vytvořili diagnostický set molekulárních SCAR markerů vyvinutých pomocí metody RAPD, specificky detekujících obě formy Pyrenophora teres.

7

V posledních několika letech se objevuje snaha vyvinout metodiku pro kvantitativní stanovení obsahu houbového patogena v pletivech hostitele. Metody kvantifikace lze rozdělit na přímé a nepřímé. Mezi nepřímé metody patří ty, které nestanovují vlastní obsah patogena, ale posuzují jej z míry jeho vedlejších projevů: velikosti lézí, množství vyprodukovaných mykotoxinů či dalších sekundárních metabolitů, míry vlivu na výnos, apod. Nepřímými metodami jsou např.: vizuální hodnocení míry napadení, počítání hmotnosti tisíce zrn (HTZ) či stanovení obsahu příslušných mykotoxinů a dalších sekundárních metabolitů pomocí metod ELISA a HPLC. Pro správnou interpretaci výsledků je nutné, aby stanovené hodnoty korelovaly se skutečnou mírou napadení rostliny patogenem. Přímé metody kvantifikace stanovují přímo obsah patogena v pletivech hostitele. Kromě metody ELISA se dnes využívá řady metod molekulární biologie založených výhradně na polymerázové řetězové reakci (PCR) (Böhm et al., 1999; Bates et al., 2001; Fraaije et al., 2002; Schena et al., 2004). Doohan et al. (1999) použili techniku kompetitivní PCR s druhově specifickými primery ke kvantitativní detekci přítomnosti patogenů rodu Fusarium v pletivech pšenice (Triticum aestivum). Jako kompetitoru použili DNA o známé koncentraci izolovanou z mycelia patogena napěstovaného in vitro. Touž technikou stanovili Mahuku et al. (1995) obsah patogena Leptosphaeria maculans v pletivech řepky. Výhodou metody je její jednoduchost, nenáročnost na vybavení a nízká cena analýz, nevýhodou malá přesnost daná velikostí chyby při odečtu intenzit záření barviva ethidiumbromidu interkalovaného do PCR produktů po elektroforetické separaci v agarózovém gelu. Simpson et al. (2001) studovali závislost obsahu patogena a jím produkovaných toxinů v zrnu na množství použitých fungicidů mj. pomocí kvantitativní SYBRGreen real-time PCR. Tuto metodu popsal Hopwood et al. (1997) a je založená na sledování PCR reakce se specifickými primery v reálném čase. V každém cyklu reakce je detekován vzrůst fluorescence interkalačního barviva SYBRGreen při λ = 530 nm, který odpovídá rostoucímu počtu kopií amplikonu. Metoda je přesnější než kompetitivní PCR, neboť hodnoty fluorescence jsou odečítány CCD kamerou, nevýhodou je nutnost post amplifikačních kontrol přítomnosti nespecifických PCR produktů pomocí elektroforetické separace nebo analýzy disociačních křivek. Tato metoda byla použita např. ke stanovaní obsahu padlí travního (Erysiphe graminis) v listových pletivech pšenice (Triticum aestivum) (Fraaije et al., 2002) či patogena Pyrenophora graminea v zrnu ječmene (Hordeum vulgare) (Bates et al., 2001). Další metodou kvantifikace patogenů je opět real-time PCR se specifickými primery, kde jsou PCR produkty detekovány pomocí různých typů sond. Nejčastěji se využívají tzv. TaqMan sondy, což jsou oligonukleotidy, které se specificky hybridizují od oblasti mezi primery a tím zvyšují specifičnost reakce. Na 5´ konci jsou značeny fluorescenční značkou (FAM, VIC, apod.) a na 3´ konci je kovalentně navázán zhášeč fluorescence, kterým může být buď fluorescenční značka TAMRA nebo nefluorescenční kovalentně navázaný MGB (Minor Groove Binder) zhášeč. 5´3´ exonukleázová aktivita Taq polymerázy v elongačních fázích PCR způsobuje degradaci sondy a tím dochází ke vzrůstu intenzity fluorescence, která je v každém cyklu PCR reakce detekována pomocí CCD kamery. Porovnáním odečtených hodnot Ct (Cycle treshold) s kalibrací lze stanovit kvantitativní zastoupení PCR produktu v reakční směsi. Böhm et al. (1999) použili tuto metodu ke stanovení rozsahu napadení pletiv hostitele patogeny rodu Glomus a Phytophtora. Bates and Taylor (2001) vyvinuli nový typ sondy pro real-time PCR, který využívá Scorpion Amplified Refractory Mutation System (ARMS) technologie. Jedná se vlastně o forward primer prodloužený přes interní zhášeč a nástavce tvořící vlásenku o sondu a fluorescenční značku FAM. Během reakce se uvolňuje vlásenka, sonda se „rozbalí“ a hybridizuje se na nově se tvořící vlákno DNA. Dochází tak k oddálení fluoroforu od zhášeče. Uvolněné kvantum záření je detekováno CCD kamerou. Sonda byla vytvořena na základě

8

sekvence ITS oblasti hub Pyrenophora teres a Pyrenophora graminea, kde se v pozici 42 vyskytuje druhově specifická bodová mutace (SNP) (Stevens et al., 1998). Deoxythimidin-5´fosfát (T), specifický pro druh Pyrenophora teres, je umístěn na 3´ konci forward primeru a tím je zaručena vysoká specifičnost reakce (Bates and Taylor, 2001). Výhodou metod real-time PCR s použitím sond je, že je možné provádět multiplexové analýzy, kdy jsou v reakci použity dvě sondy s různými fuorescenčními značkami (např. FAM a VIC). Je pak možno kvantifikovat zároveň obsah patogena i hostitelské DNA (Winton et al., 2002). Jako standardy se používají často DNA extrahované z nenapadené rostliny a čistého mycelia pěstovaného in vitro. Pro přesnější kvantifikaci se používají standardy, kdy je cílový fragment DNA klonován do plasmidu a amplifikován spolu se vzorky (Block and Schwarz, 2003; Reischer et al., 2004). MATERIÁL A METODY K vývoji diagnostických markerů bylo použito 80 izolátů hub Pyrenophora teres f. sp. teres, Pyrenophora teres f. sp. maculata, Pyrenophora graminea a Cochliobolus sativus. Primery a Taq Man sondy byly navrženy pomocí programu Primer Expres (Applied Biosystems) na základě publikovaných sekvencí (Leišová et al. 2005; Leišová et al. 2006). Inokulace u každého z patogenů byla provedena podle na pracovišti VÚRV zavedených protokolů. V případě listových pletiv napadených P. teres byl materiál zamražen a DNA byla izolována pomocí detergentu CTAB (Leišová et al. 2004). Koncentrace DNA byla zjištěna spektrofotometricky; vzorky byly naředěny na koncentraci 50ng DNA/μl. Jako výchozí pro získání diagnostických markerů byla zvolena metoda AFLP (Vos el al. 1995). Základem metody je aplikace restrikčních endonukleáz EcoRI a MseI na genomovou DNA patogena a provedení výběru restrikčních fragmentů tzv. selektivní amplifikací. Analýzou výsledků amplifikace metodou kapilární elektroforézy byly vytříděny fragmenty specifické vždy pro jeden druh rodu Pyrenophora. Fragmenty reprezentované nejvýraznějšími signály byly klonovány do pPCR-Script Amp SK+ phagemidu (Stratagene) a sekvencovány. Na základě získaných sekvencí byly navrženy specifické primery a Taq Man sondy pro realtime PCR. Konvenční PCR reakce byly prováděny v cykleru Flexigene (Techne). Reakční směs o objemu 15μl obsahovala 0,33μM primerů, 0,25mM dNTP, 1x pufr, 2,0mM MgCl2, 1U Tth polymerázy (BioTools) a 100 ng templátové DNA. Reakční cyklus byl následující: 95°C 5min., 35 cyklů: 95°C, 30 sec., 50/60°C, 30 sec., 72°C, 40 sec. a na závěr 72°C, 5 min. Produkty reakce byly separovány elektroforeticky v 2,5% agarózovém gelu, vizualizovány ethidiumbromidem a detekovány pod UV lampou. Taq Man real-time PCR reakce byly prováděny v cykleru ABI PRISM 7700 podle protokolu PN 402823 (Applied Biosystems). PCR reakce byly prováděny jak v multiplexovém tak i v uniplexovém uspořádání. Taq Man MGB sondy pro detekci houbového patogena byly značeny fluorescenční barvou FAM a sondy detekující DNA rostliny fluorescenční barvou VIC. Pro kvantifikaci DNA rostlinného hostitele byly zvolen jednokopiový gen RacB. Primery a Taq Man MGB sondy byly navrženy pomocí programu Primer Expres na základě publikované sekvence (Schultheiss et al. 2002). Reakční směs o objemu 25 μl obsahovala 1 x PCR pufru, 4mM MgCl2, 0,1mM (každého) dATP, dGTP, dCTP, 0,2mM dUTP, 2,5U Gold Taq polymerázy, 0,3μM směsi primerů, 0,3μM Taq Man MGB sond značených fluorescenčními značkami fam a vic a 250ng templátové DNA. Reakce byly prováděny v optických PCR destičkách s optickými víčky v přístroji ABI PRISM 7700. Reakce obsahuje následující kroky: 2min. při 50°C, 10 min. při 95°C a 40 cyklů: 15 sec. při 95°C, 1 min. při 60°C. Ke sběru a analýze dat byl použit program

9

ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Na základě nadefinovaných hodnot koncentrací DNA a zjištěných hodnot Ct reakcí s DNA ředicí řady směsi standardů byla vytvořena kalibrační křivka. Z rovnice kalibrační křivky byl vytvořen vzorec pro výpočet počátečního obsahu DNA z naměřených hodnot CT reakcí se vzorky. VÝSLEDKY A DISKUSE Korektní identifikace patogenů je důležitá pro kontrolu choroby, šlechtění na rezistenci a epidemiologické studie. Zvláště v případě houby Pyrenophora teres, kde křížení jejích dvou forem poskytuje genotypy projevující se intermediárními symptomy, které mohou být zaměnitelné s jinými patogeny, je nutná přesná diagnostika. V této práci se AFLP ukázala jako citlivá metoda, která dokázala rozlišit obě formy Pyrenophora teres. Podobně Williams et al. (2001) dospěli k názoru, že pomocí AFLP lze obě formy Pyrenophora teres rozlišit a určit spolehlivěji, než na základě symptomů. Přímé použití metody AFLP pro detekci a rozlišení patogenů je příliš zdlouhavé a finančně nákladné, proto byly některé z diagnostických markerů převedeny na tzv. STS (Sequence Tagged Site) markery. Optimalizovaná metodika byla použita k detekci obou forem Pyrenophora teres přímo v pletivech hostitele (Obr. 1). Obr 1 Výsledky amplifikace vzorků DNA z napadených listových pletiv s markerem PTM494d (velikostní standard 100bp, 1-70 vzorky, 71 pozitivní kontrola, 72 negativní kontrola).

AFLP byla použita rovněž pro navržení primerů a TaqMan sond pro kvantitativní detekci Pyrenophora teres metodou real-time PCR. Metoda TaqMan real-time PCR byla zvolena zejména pro svou vysokou specifičnost, citlivost a přesnost. Existuje několik technik pro kvantifikaci fytopatogenních hub založených na konvenční PCR. Jsou však pracné a méně přesné, zejména proto, že během pozdějších cyklů klesá účinnost PCR reakce (Ginzinger, 2002). Ve stanovení pomocí real-time PCR je počet amplikonů detekován v časných cyklech, kdy je účinnost reakce stále konstantní (Schena et al., 2004). Počet cyklů PCR nutných k vygenerování fluorescenčního signálu, který statisticky významně převyšuje úroveň pozadí (Ct, Cycle treshold) je nepřímo úměrný logaritmu počátečního množství cílových sekvencí DNA. Otázka účinnosti reakce je v literatuře často diskutována (Block and Schwarz, 2003; Schena et al., 2004). V této práci byly účinnosti reakce počítány podle práce Blockové a Schwarze (2003). Ve všech stanoveních byly vysoké, s průměrnou hodnotou 95% a průměrnou standardní odchylkou mezi stanoveními 3,3%. Přesnost stanovení rovněž ovlivňuje volba standardů. Plasmidové standardy obsahující cílovou sekvenci DNA patogena či hostitele a mohou být amplifikovány zároveň se vzorky. Do reakce vstupují kopie plasmidů místo koncentrace DNA vzorku houby a rostliny zvolené

10

za standard. Tím dochází ke zpřesnění vstupní informace o počtu cílových kopií a následné kalibrační křivky. Směs plasmidových stadardů v poměru 1:1000 simulovala velmi zhruba poměr obsahu DNA patogena a hostitele v napadeném pletivu. Ředicí řada se sestávala z osmi vzorků směsi plasmidových standardů každý v poměru 1:1000 s koncentracemi od 10 do 108 počtu kopií plasmidu s DNA patogena a od 103 do 1011 počtu kopií plasmidů s DNA hostitele. Detekčním limitem TaqMan real-time PCR ve všech stanoveních bylo 5 kopií cílové DNA sekvence v reakci, podobně jako v práci Reischera et al. (2004). Optimalizovaná metodika poskytuje spolehlivá data v rozsahu šesti řádů vstupního počtu kopií cílové DNA sekvence. Pokud jsou v reakci dvě sondy značené různými fluorofory, je možno kvantifikovat simultánně DNA hostitele i patogena (Winton et al., 2002). V tomto případě detekce hostitelské DNA slouží jako interní pozitivní kontrola k odstínění odlišností daných extrakcí DNA a účinností reakce. Rovněž lze pak vyjádřit množství patogena jako míru napadení hostitele, což je z hlediska fytopatologické praxe výmluvnější. Kvantifikace a odhad míry napadení hostitele patogenem je nejatraktivnější aplikací realtime PCR přímo využitelnou v zemědělské praxi. Aplikací TaqMan technologie na vzorky odrůd ječmene pěstovaných v Kroměříži v letech 2003 a 2004 se ukázalo, že v těchto letech byl dominantní výskyt formy Pyrenophora teres f. sp. teres (Obr. 2) Obr. 2 Výskyt obou forem P. teres v roce 2003 (obr. vlevo) a 2004 (obr. vpravo) u 18 odrůd ječmene pěstovaných na lokalitě Kroměříž. 10

12,0000

9 PTM/PT

PTM/PT 10,0000

PTT/PT

PTT/PT

7 cn(PTM,PTT)/cn(PT)

cn(PTT,PTM)/cn(PT)

8

6 5 4 3 2

8,0000

6,0000

4,0000

2,0000

1 0

odrůdy ječmene

P Ph r est ila ige de lp h Ol ie br a No m rd M us ar M id o ad l on n M a ad eir a Kr on Je a rse y Fo ru At m rib An ut na b Ak el ce n Pr t im Or u s th eg a La dí k He ri Sa s lo on Sa be l CI 73 9

Pr Ph esti ila ge de lp hi O e lb ra m No rd u M s ar i M d ol ad on n M a ad ei ra Kr on a Je rse y Fo ru m At rib A ut nn ab el Ak ce nt Pr im O us r th eg a La dí k He ris Sa lo on Sa be l

0,0000

odrůdy ječmene

U několika odrůd ječmene byla sledována rychlost růstu a pronikání dvou izolátů Pyrenophora teres f. sp. teres a Pyrenophora teres f. sp. maculata v závislosti na genotypu hostitele (Obr 3). Obr 3 Detekce přítomnosti P. teres v listových pletivech ječmene v závislosti na době odběru vzorků. 1200000,00

Forum Akcent Scarlett

Počet kopií P. teres ve vzorku

1000000,00

Beate CI 739

800000,00 600000,00 400000,00 200000,00 0,00 6 dpi

13 dpi

21 dpi

Dny po infekci

11

Tato metoda může být využita rovněž ke studiu pronikání patogena do pletiv hostitelské rostliny za různých podmínek růstu, po aplikaci fungicidů apod. Např. nízký obsah DNA patogena v rezistentní rostlině by mohl být důsledkem účinné obrany rostliny a zastavení růstu houby. Přítomnost vysokého obsahu patogena v pletivech rezistentního hostitele svědčí spíše o toleranci než o opravdové rezistenci. V této práci byla nalezena statisticky významná korelace mezi hodnotami Ct a velikostmi symptomů na listech (R2= 0,52) pouze v počátečních stádiích infekce. V pozdějších stádiích velikost symptomů neodpovídá obsahu patogena, rozsah nekrotických pletiv bývá větší než skutečný obsah patogena. Tato skutečnost odpovídá i faktu, že Pyrenophora teres produkuje toxiny, které usmrcují buňky v okolí penetrujících hyf (Keon and Hargreaves, 1983). LITERATURA AFANASENKO O.S., HARTLEB H., GUSEVA N.N., MINARIKOVA V., JANOSHEVA M. (1995): A set of differentials to characterize populations of Pyrenophora teres Drechs. for international use. Journal of Phytopathology 143: 501-507. ARABI M.I.E., JAWHAR M. (2003): In vitro quantification of barley reaction to leaf stripe. Plant Breeding 122: 444-446. BATES J.A., TAYLOR E.J.A., KENYON D.M., THOMAS J.E. (2001): The application of real-time PCR to the identification, detection and quantification of Pyrenophora species in barley seed. Molecular Plant Pathology 2: 49-57. BATES J.A., TAYLOR E.J.A. (2001): Scorpion ARMS primers for SNP real-time PCR detection and quantification of Pyrenophora teres. Molecular Plant Pathology 2: 275-280. BLOCK A., SCHWARZ G. (2003): Validation of different genomic and cloned DNA calibration standards for construct-specific quantification of LibertyLink in rapeseed by real-time PCR. European Food Research and Technology 216: 421-427. BÖHM J., HAHN A., SCHUBERT R., BAHNWEG G., ADLER N., NECHWATAL J., OEHLMANN R., OSWALD W. (1999): Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. J. Phytopathol. 147: 409-416. DOOHAN F.M., PARRY D.W., NICHOLSON P. (1999): Fusarium ear blight of wheat : the use of quantitative PCR and visual disease assessment in studies of disease control. Plant Pathol., 48: 209-217. FRAAIJE B.A., BUTTERS J.A., COELHO J.M., JONES D.R., HOLLOMON D.W. (2002): Following the dynamics of strobilurin resistance in Blumeria graminis f.sp. tritici using quantitative allel-specific real-time PCR measurements with the fluorescent dye SYBR Green I. Plant Pathol., 51: 45-54. HO K.M., TEKAUZ A., CHOO T.M., MARTIN R.A. (1996): Genetic studies on net blotch resistance in a barley cross. Canadian Journal of Plant Science 76: 715-719. HOPWOOD A., OLDROYD N., FELLOWS S., WARD R., OWEN S.A., SULLIVAN K. (1997): Rapid quantification of DNA samples extracted from buccal scrapes prior to DNA profiling. Biotechniques, 23: 18-20. KEON J.P.R., HARGREAVES J.A. (1983): A cytological study of the net blotch disease of barley caused by Pyrenophora teres. Physiological Plant Pathology 22: 321-329.

12

LEIŠOVÁ L., KUČERA L., MINAŘÍKOVÁ V., OVESNÁ J. (2005): AFLP-based PCR markers that differentiate spot and net forms of Pyrenophora teres. Plant Pathology 54: 66-73. LEISOVA L., MINARIKOVA V., KUCERA L., OVESNA J. (2006): The quantification of Pyrenophorat teres in infected barley leaves using real-time PCR. Journal of Microbiological Methods (in press). MAHUKU G.S., GOODWIN P.H., HALL R. (1995): A competitive polymerase chain reaction to quantify DNA of Leptosphaeria maculans during blackleg development in oilseed rape. MPMI, 8, 5: 761-767. MUGNIER J. (1995): Les taches brunes des orges – Une nouvelle approche du diagnostic de l´Helminthosporiose : la PCR. Phytoma 469: 17-20. PELTONEN S., JALLI M., KAMMIOVIRTA K., KARJALAINEN R. (1996): Genetic variation in Drechslera teres populations as indicated by RAPD markers. Annual of Applied Biology 128: 465-477. REISCHER G.G., LEMMENS M., FARNLEITNER A., ADLER A., MACH R.L. (2004): Quantification of Fusarium graminearum in infected wheat by species specific real-time PCR applying a TaqMan probe. Journal of Microbiological Methods 59: 141-146. REEVES J.C., BALL S.F.L. (1991): Research note: Preliminary results on the identification of Pyrenophora species using DNA polymorphisms amplified from arbitrary primers. Plant Varieties and Seeds 4: 185-189. SCHENA L., NIGRO F., IPPOLITO A., GALLITELLI D. (2004): Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi. European Journal of Plant Pathology 110: 893-908. SIMPSON D.R., WESTON G.E., TURNER J.A., JENNINGS P., NICHOLSON P. (2001): Differential control of head blight pathogens of wheat by fungicides and consequences for mycotoxin contamination of grain. Europ. J. Plant Pathol., 107: 421-431. SMEDEGÅRD-PETERSEN V. (1971): Pyrenophora teres f. maculata f. nov. and Pyrenophora teres f. teres on barley in Denmark. In: Yearbook of the Royal Veterinary and Agricultural University, Copenhagen, 124-144. TAYLOR E.J.A., STEVENS E.A., BATES J.A., MORREALE G., LEE D., KENYON D.M., THOMAS J.E. (2001): Rapid-cycle PCR detection of Pyrenophora graminea from barley seed. Plant Pathology 50: 347-355. VOS P., HOGERS R., BLEEKER M., REIJANS M., VAN DE LEE T., HORNES M., FRIJTERS A., POT J., PELEMAN J., KUIPER M., ZABEAU M. (1995): AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23: 4407-4414. WILLIAMS K.J., SMYL C., LICHON A., WONG K.Y., WALLWORK H. (2001): Development and use of an assay based on the polymerase chain reaction that differentiates the pathogens causing spot form and net form of net blotch of barley. Australasian Plant Pathology 30: 37-44. WINTON L.M., STONE J.K., WATRUD L.S., HANSEN E.M. (2002): Simultaneous one-tube quantification of host and pathogen DNA with real-time polymerase chain reaction. Phytopathology 92: 112-116. PODĚKOVÁNÍ Tato práce byla financována Národní agenturou pro zemědělský výzkum, projekt č. QC1361 a Grantovou agenturou ČR projekt č. 521/06/1544. 13

Určení a hodnocení padlí travního (Blumeria graminis f. sp. tritici; anamorph Erysiphe graminis) na pšenici. Lubomír Věchet Výzkumný Ústav Rostlinné výroby, Drnovská 507, 161 06 Praha 6 - Ruzyně E-mail: [email protected] Padlí travní je řazeno do podtřídy Ascohymenomycetes, řádu Erysiphales. Padlí jsou závazní patogeni cévnatých rostlin. Jsou známy svou specializací na určité rody nebo druhy hostitelů a jsou u nich známy speciální formy (Urban & Kalina, 1977) . Určení padlí travního je možné podle typických příznaků na listu (Obr. 1.2.) nebo i klasu (Obr. 4) pšenice. Padlí travní tvoří kupky bílého až šedého, vatovitého mycelia, příznaky ve formě kupek na listech nebo klasu pšenice. To je nepohlavní stádium patogena. Kupky jsou tvořeny povrchovým myceliem. Na něm se vytváří konidiofory (nosiče konidií). Z nich vyrůstají krátká vlákna (Obr. 3), která se začnou od konce přehrádkovat (bazální část vlákna má schopnost částečně dorůstat). Obr. 1. Pšenice ozimá Ulka (Věchet, 2006).

Obr. 2. Akteur x Caphorn,2006 (Věchet, 2006).

14

Obr. 3. Padlí travní na pšenici ozimé Kanzler, listový segment (Věchet, 2004).

Obr. 4. Padlí travní v klasu. Pšenice ozimá Kanzler (Věchet, 2005).

15

Vzniká tak řetízek soudečkovitých konidií, přičemž nejstarší je umístěna nejdále od báze vlákna. Koncem vegetace nebo při zvýšených teplotách i dříve, dochází k pohlavnímu rozmnožování padlí. V myceliu se tvoří černé plodničky, kleistotecia (Obr. 5). Uvnitř jsou vějířovitě umístěná vřecka, přirostlá k bázi. U padlí travního je v kleistoteciu více vřecek. Je to přezimující stádium této houby. Pod mikroskopem můžeme pozorovat vývojová stádia této houby. Vývoj je určen teplotou prostředí a odolností rostliny. Charakteristická stádia vývoje jsou klíčení konidie (kolem čtvrté hodiny po dosednutí konidie na list (Obr. 6), tvorba apresoria (přísavky, terčovitě rozšířená část hyfy přitisknutá na buňku; z ní zpravidla vyrůstá infekční hyfa pronikající do buňky) (14-18 hod.). Sledování tvorby haustoria, orgán vyrůstající z hyfy a pronikající do buňky jako kyjovitý nebo jinak tvarovaný výběžek určený k absorpci živin (kolem 24. hod.). Jeho pozorování je však náročnější na techniku mikroskopování. Asi po 46 hod. od infekce se začne vytvářet sekundární hyfa, která se asi za 4-6 hod. větví a mění se v prodlouženou Obr. 5. Kleistotecia padlí travního na pšenici ozimé; odrůda Ludwig (Věchet, 2005).

sekundární hyfu. Kolem 72 hod. se počínají tvořit konidiofory a diferencované konidie jsou vytvořeny asi ve 156-160 hod. po inokulaci. Tyto časové údaje jsou pouze orientační, neboť odpovídají specifickým podmínkám sledovaní (listové segmenty a řízené podmínky). K odhadování nebo určení stupně napadení, to je pokryvnosti listu kupkami padlí travního se užívá řada stupnic, jednak s numerickým vyjádřením nebo s grafickým vyjádřením. V poslední době se používají spíše podrobnější stupnice. Příkladem může být devítibodová stupnice (Obr. 7) Saari & Prescott (1975), kde stupeň 9 znamená pokrytí listu 0 a stupeň 1 pokrytí listu 75% a více.

16

Obr. 6. Infekční struktury padlí travního na pšenici (Blumeria graminis f.sp. tritici). Klíčí konidie (4. hod. po inokulaci), apresorium s infekčním klíčkem (18. hod. po inokulaci), konidie s apresoriem a počátkem sekundární prodloužené hyfy (46. hod po inokulaci) (Věchet, 2004).

Obr. 7. Stupnice k odhadování stupně napadení porostu ječmene padlím travním (Saari & Prescott 1975).

17

Na závěr je možné říci, že příznaky padlí travního jsou tak typické, že určení choroby nedělá obvykle potíže. LITERATURA SAARI E.E., PRESCOTT J.M. /1975): A scale for appraising the foliar intensity of winter wheat diseases. Plant Disease Reporter, 595: 377-380. URBAN Z., KALINA T. (1977): Sinice, řasy, houby. Systém a vývoj. Katedra botaniky přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy Praha. 1-253.

Tento výzkum byl podporován výzkumným záměrem MZE ČR č. 0002700602.

18

Původci listových skvrnitostí v ČR Alena Hanzalová, Jana Šárová Výzkumný ústav rostlinné výroby, Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně E-mail: [email protected] Mezi nejvýznamnější původce listových skvrnitostí pšenice patří Phaeosphaeria nodorum (anam. Stagonospora nodorum), Mycosphaerella graminicola (anam. Septoria tritici) a Pyrenophora tritici-repentis (anam. Drechslera tritici-repentis). Dříve v našich podmínkách převažovala Phaeosphaeria nodorum, v posledních několika letech se však vyskytuje hojně i P. tritici-repentis a M. graminicola. V rámci pětiletého monitoringu byly každoročně získány vzorky listových skvrnitostí z různých okresů v ČR. V letech 2000, 2003 a 2004, 2005 převládala ve vzorcích P. triticirepentis, která je původcem hnědé skvrnitosti pšenice zvané „tan spot“. V roce 2001 a 2002 se nejhojněji vyskytovala ve vzorcích M. graminicola. P. nodorum byla ve sledovaném období též izolována poměrně často. Výskyt zjištěných původců listovách skvrnitostí Didymella exitialis, Cochliobolus sativus a Ascochyta sp. byl do 10%, pouze v roce 2001 byla D. exitialis zaznamenána poměrně hojně, ale většina autorů ji považuje za sekundárního patogena. C. sativus preferuje spíše teplé a vlhké klima, v ČR se vyskytoval ojediněle. Frekvence jednotlivých patogenů byla ovlivněna průběhem počasí v jednotlivých letech a na jednotlivých lokalitách a také obdobím sběru vzorků. V jarním období většinou v porostech převládala M. graminicola, teprve později se v případě příznivých klimatických podmínek rozvinula infekce P. tritici-repentis a P. nodorum. Obecně lze však říci, že tyto tři patogenní druhy převládají i v jiných evropských státech (Bankina 2001, Csösz 2001). Pyrenophora tritici-repentis byla zjištěna v ČR v roce 1967 (Benada a kol. 1967), další zmíňka o výskytu tohoto patogena je však až z roku 1997 (Vícha 1998). Od té doby byl výskyt P. tritici-repentis pozorován v ČR každoročně (Šárová a kol. 2003a). Její význam v ČR i v celé Evropě roste je jí věnována v tomto příspěvku větší pozornost. Pyrenophora tritici-repentis má široký okruh hostitelů a byla vedle pšenice izolována i z mnoha druhů trav v různých zemích světa. Na listech náchylných odrůd pšenice způsobuje drobné skvrny světlehnědé barvy, později se léze prodlužují a vytváří se chlorotický okraj s typickým typický tmavým středem. Na rezistentních nebo částečně rezistentních odrůdách pšenice tvoří patogen podstatně menší tmavě hnědé léze, chlorózy a nekrózy mohou zcela chybět. V současné době je popsáno 8 ras tohoto patogena, které jsou determinovány na základě virulence/avirulence k testovacímu sortimentu odrůd (Strelkov a Lamari 2003). V ČR je dominantní rasa 1. Jednotlivé rasy jsou schopny produkovat hostitelsky specifické toxiny, zatím byly identifikovány čtyři - Ptr ToxA, B, C, D. Rasové spektrum bylo více studováno především v Severní Americe, kde stejně jako u nás převažuje rasa 1. Vzrůstající tendence výskytu se začíná projevovat u rasy 2. Nejvhodnější metodou ochrany proti listové skvrnitosti je šlechtění na rezistenci. Rezistence odrůd ozimé a jarní pšenice vůči P. tritici-repentis má kvantitativní nebo kvalitativní charakter. Ve skleníkových podmínkách ukazují reakce sledovaných odrůd ke směsi ras (Tab.1) velký počet odrůd s mírně náchylnou až mírně rezistentní reakcí. Odrůdy Clarus, Rheia, Cubus, Šárka, Vlasta a Dromos měly rezistentní reakci. Většina odrůd pšenice nese střední rezistenci vůči patogenu, vysoká úroveň rezistence je spíše ojedinělá. Neexistuje však žádná odrůda, která by byla zcela bez příznaků onemocnění, tedy bez symptomů.

19

V polních podmínkách se jeví jako rezistentní odrůdy ozimé pšenice registrované v ČR odrůdy Vlasta, Rialto, Athlet, Trane, Siria, Vega, Alana a Samara. Naopak odrůdy Ina, Bruta, Samanta, Mona a Boka vykazovaly poměrně vysokou náchylnost vůči P. tritici-repentis (Šárová a kol. 2003b). Tab.1: Reakce odrůd zimní pšenice k Pyrenophora tritici-repentis ve skleníkových podmínkách. Odrůda/linie Clarus Rheia Cubus SHMK WW 14-92 Šárka Vlasta Dromos (SWS 799.14953) Buteo (LP 396.3.98) Alana Grandios Alibaba CEBECO 0104 LP 737.1.98 Simila (SG-S 1875-01) Globus Semper 5076112 CEBECO 0207 Mladka SG-RU 370 Darwin Ebi Ilias SG-U 7125 Sulamit

Reakce k PTR R R R R R R R MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS

Odrůda/linie Etela (HE 6130) Ludwig Apache Rapsodia Banquet Floret (PBIS 01/1035) Complet Drifter Meritto Akteur Bill PBIS 01/1034 Batis Nela Samanta Versailles CEBECO 0306 Caphorn Corsaire Karolinum Heroldo (PBIS 00/91) Hedvika Biscay Svitava Barroko (PBIS 00/140)

Reakce k PTR MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS MR-MS S S S S S S S S

R – rezistentní reakce, MR-MS – mírně náchylná až mírně rezistentní reakce, S – náchylná reakce

20

Stupnice pro hodnocení reakce odrůd ozimé pšenice k PTR ve skleníkových podmínkách

1. malé, tmavě hnědé až černé skvrny bez okolní chlorózy a světle hnědé nekrózy rezistentní (R) 2. malé tmavě hnědé až černé skvrny s velmi malými chlorózami a nekrózami mírně rezistentní (R) 3. malé tmavě hnědé až černé skvrny úplně obklopené výrazným chlorotickým nebo nekrotickým kruhem, léze vesměs nesplývají mírně rezistentní až mírně náchylný (S) 4. malé tmavě hnědé až černé skvrny úplně obklopené chlorotickou nebo nekrotickou zónou, některé léze splývají mírně náchylný (S) 5. tmavě hnědé až černé středy mohou nebo nemusí být rozpoznatelné, většina lézí se skládá ze splynutých chlorotických nebo nekrotických zón náchylný (S)

21

Procenta napadení při hodnocení v polních podmínkách

LITERATURA BANKINA B. (2001): Some aspects of wheat leaf diseases epidemiology in Latvia, 19982000. In: Book of Abstracts, Conference Healthy Cereals in Kroměříž, p. 53. BENADA J., ŠEDIVÝ J., ŠPAČEK J. (1967): Atlas chorob a škůdců obilnin. 218 p., Praha. CSÖSZ M. (2001): Incidence of saprophytic and necrotrophic pathogens on wheat in Hungary in 2000. In: Book of Abstracts, Conference Healthy Cereals in Kroměříž, p. 46. STRELKOV S. E., LAMARI L. (2003): Host-parasite interactions in tan spot [Pyrenophora tritici-repentis] of wheat. Can. J. Plant Pathol. 25: 339-349. ŠÁROVÁ J., HANZALOVÁ A., BARTOŠ P. (2003a): Incidence of wheat leaf spot pathogens in the Czech Republic. Cereal Research Communications 31: 145-151. ŠÁROVÁ J., ŠÍP V., HANZALOVÁ A. (2003b): Response of winter wheat cultivars to artificial infection with Pyrenophora tritici-repentis in field conditions. Plant Protection Science 38(2): 575-579. VÍCHA Z. (1998): Listová skvrnitost pšenice – Helminthosporium tritici vulgaris Nisikado. Agro 5: 10. Práce vznikla za podpory projektů MZE NAZV 1G 58083 a výzkumného záměru MZE 0002700602.

22

Klasové fuzariózy u pšenice Jana Chrpová, Václav Šíp, Eliška Sychrová, Eva Matějová Výzkumný ústav rostlinné výroby, Drnovská 507, 161 06 Praha 6 - Ruzyně E-mail: [email protected] Klasové fuzariózy, které jsou ve sledovaných podmínkách působeny převážně druhy Fusarium graminearum (Schwabe) a Fusarium culmorum (W.G. Smith) Sacc., patří k nejškodlivějším chorobám ovlivňujícím výnos a jakost zrna. Závažnou skutečností je též produkce sekundárních metabolitů – mykotoxinů. Obsah mykotoxinů je nově sledovaným parametrem pro nákup produkce obilovin. Limity maximálního obsahu fuzariových toxinů v obilovinách podle nařízení komise (ES) č.466/2001 (včetně novely nařízení č.856/2005) jsou následující: deoxynivalenol (DON) – 1,25 mg/kg; zearalenon (ZEA) – 0,1 mg /kg pro nezpracované obiloviny kromě pšenice tvrdé, ovsa a kukuřice s účinností od 1.7.2006. Tyto limity byly uplatňovány již od počátku intervenčního nákupu, tj. od 1.11.2005. Mykotoxiny bezprostředně ohrožují hygienickou kvalitu zrna. Uplatnění kontaminovaného zrna pro výrobu potravin nebo krmiv se jeví jako velmi problematické. Výskyt fuzarióz na území České republiky je sledován v rámci studie prováděné ve spolupráci se Státní rostlinolékařskou správou. V současné době jsou k dispozici výsledky získané sběrem klasů podezřelých z napadení fuzariózou klasu, který probíhal ve třech ročnících (2003-2005) Analýza obsahu DON u získaných vzorků (celkový počet 916) byla provedena metodou ELISA s využitím RIDASCREENRFAST DON kits (R-Biopharm GmbH, Darmstadt, Germany). Přesná determinace druhů rodu Fusarium v klasech je možná (jen) mikroskopicky (a někdy i s následnou kultivací). Mykologické analýzy odhalily převažující výskyt F. graminearum, dále F. avenaceum, F. culmorum, a F. poae. Byla zjištěna statisticky významná korelace (r=0,65) mezi hodnocením symptomů v odebraných klasech a zjištěným obsahem DON. V současné době probíhají analýzy divergence zjištěných patogenů na molekulární úrovni, zkoušky patogenity a hodnocení získaných izolátů v polních podmínkách. Na základě vyhodnocení získaných údajů s ohledem na ročník, oblast, odrůdu, předplodinu a zpracování půdy bylo zjištěno, že k variabilitě obsahu DON v zrnu přispívá z 49 % ročník a lokalita, pak následuje odrůda (34 %) a způsob pěstování (zpracování půdy, předplodina -17 %). Byly detekovány oblasti s vysokým rizikem kontaminace zrna mykotoxiny (jižní a východní Morava). Významně vyšší obsah DON byl zjištěn u vzorků z porostů pěstovaných po kukuřici (průměrný obsah DON 6,54 mg/kg; celkový obsah DON 2,55 mg/kg) a po aplikaci minimalizačního zpracování půdy (3,54 mg/kg). Nejvyšší obsah DON (10,84 mg/kg) byl zjištěn po kukuřici, kdy byla zároveň použita minimalizace. Bylo potvrzeno, že cílená aplikace fungicidů ve vhodnou dobu a v doporučné dávce snižuje obsah DON v průměru o 50 %, avšak při nedodržení termínu a dávky je fungicidní ochrana neúčinná. V rámci četněji zastoupených odrůd (>15) Nela, Alana, Šárka a Ebi vykazovaly průměrný obsah DON nižší než 1,25 mg/kg (limitní hodnota), zatímco u odrůd Drifter, Complet, Alibaba a Clarus byl zjištěn průměrný obsah DON vyšší než 4,5 mg/kg. Boj proti této závažné chorobě je založen na agrotechnických opatřeních, fungicidní ochraně, pěstování odrůd s vyšší odolností ke klasové fuzarióze a k akumulaci mykotoxinů, pozornost se věnuje i možnostem biologické ochrany. Ochranná opatření by měla vycházet z podmínek příslušného ročníku, při rozhodování o aplikaci fungicidu je třeba brát v úvahu předplodinu, způsob zpracování půdy i to, zda v dané oblasti již byly problémy s nadlimitním obsahem mykotoxinů. V problematických oblastech je vhodné volit odrůdu s vyšší odolností. Fungicidy na bázi tebuconazole a metconazole potlačují projevy fuzariózy klasu a tvorbu mykotoxinů, nejsou však účinné za všech okolností. Nyní jsou k dispozici i fungicidy na bázi prothioconazole s vyšší účinností, přesto je zřejmé, že ke snížení rizik je třeba použít komplex

23

opatření. V pokusech prováděných ve VÚRV byla po fungicidním ošetření u rezistentních odrůd dosažena 89 % redukce obsahu DON a 96 % redukce obsahu patogena. K omezení ztrát v rizikových oblastech a po rizikových předplodinách (především kukuřice) by nepochybně měla přispět volba odrůd s vyšším stupněm rezistence, dle možností v kombinaci s fungicidní ochranou. Tvorba odrůd s vyšší odolností k fuzarióze klasu je jedním ze šlechtitelských cílů. V českém šlechtění pšenice je věnována pozornost jak využití adaptovaných zdrojů s mírnou rezistencí, tak i využití vzdálených zdrojů s vysokou rezistencí (Sumai 3, Nobeoka Bozu,). V současné době je možné využít nově odvozené QTL markéry, které byly detekovány na různých chromozomech (velký efekt na redukci obsahu DON byl zaznamenán na 3B a 5A). Důležitou roli ve šlechtitelském procesu hraje testování rezistence k této chorobě. Hodnocení rezistence probíhá na šlechtitelských pracovištích většinou od generace F4-F6. Pokročilé šlechtitelské materiály jsou spolu se zdroji rezistence, vybranými registrovanými odrůdami a kontrolními odrůdami hodnoceny ve spolupráci VÚRV se šlechtitelskými pracovišti v kruhových testech, které v současné době probíhají na 9 stanovištích. Je sledována reakce na umělou infekci prováděnou postřikem inokula do klasů v době květu u odrůd pšenice, novošlechtění a u zdrojů rezistence. V současné době je při testech využíváno F. culmorum, izolát B. V budoucnu bude nepochybně třeba zohlednit ve šlechtění na rezistenci převládající výskyt druhu Fusarium graminearum na našem území a na základě provedených analýz vybrat vhodný izolát tohoto druhu. Pro podporu rozvoje infekce je používána mikrozávlaha. K objevení prvních symptomů, kterými jsou drobné nevýrazné skvrnky na plevách nebo bělení květních obalů až celých klásků u pšenic, obvykle dochází 7-10 dní po infekci. Symptomy a jejich rozvoj jsou zaznamenávány 14., 21. a 28. den po infekci. Při hodnocení je používána 9 bodová stupnice, kterou využívá ÚKZÚZ. Při hodnocení odolnosti je kromě hodnocení rozvoje choroby v klase za důležitý znak považováno i % fuzariózou poškozených zrn. Tento znak vysoce významně koreluje s obsahem DON. Pro stanovení rezistence odrůd je nezbytné opakované hodnocení rezistence i testování na více lokalitách. Získané výsledky dokumentují závažnost sledované choroby i nutnost věnovat se dále problematice klasových fuzarióz. Jako účinný se jeví komplexní přístup ke ochranným opatřením proti této chorobě. Povzbuzující je zjištěná vyšší úroveň rezistence především u některých registrovaných odrůd a novošlechtění procházejících registračním řízením (Obr. 1). Rozšíření odrůd s vyšší rezistencí k fuzarióze klasu by spolu s dalšími opatřeními mělo přispět ke snížení rizika kontaminace mykotoxiny.

24

Obr. 1. Projev infekce houbou F.culmorum u mírně rezistentní nově registrované odrůdy ozimé pšenice Simila (vlevo) v porovnání s náchylnou kontrolou (vpravo).

Výsledky byly získány v rámci řešení projektu NAZV QG50076 (Analýza původců klasových fuzarióz na pšenici na území ČR, vymezení vlivu napadení na hygienickou kvalitu zrna a zajištění účinnější ochrany porostů).

25

Choroby pat stébel Eliška Sychrová Výzkumný ústav rostlinné výroby, Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně E-mail: [email protected] V posledních desetiletích se na území České republiky nevyskytla epidemie těchto chorob. Výskyty jsou jen lokální, často jsou i přehlédnuty a poškození porostů obilnin je připsáno jiným příčinám. Přesto zůstávají choroby pat stébel skupinou chorob, kterým je nutno i nadále věnovat pozornost při posuzování vývoje zdravotního stavu porostů. Postihují především porosty ozimých obilnin, nejvíce ozimé pšenice, mohou se vyskytnout a škodit i v porostech ozimého ječmene, žita i triticale. Komplex chorob pat stébel v sobě zahrnuje dvě hlavní skupiny ochoření. Jednak je to napadení kořenů, kde významným původcem černání a hnití kořenů je houba Gaeumannomyces graminis, dále hnědnutí a hnití kořenů po napadení houbou kořenomorkou (Rhizoctonia spp.) a obecná hniloba, kdy napadené kořeny jsou hnědé, černé, někdy i žluté a v různých odstínech růžové až červené. Původcem obecné hniloby kořenů jsou většinou houby rodu Fusarium, ale na některých pozemcích jsou původcem další rody hub, např. Cochliobolus sativus, Periconia spp., Colletotrichum spp. a další. Druhou skupinu chorob představuje napadení bází stébel obilnin. Přes listové pochvy až na stéblo prorůstají původci stéblolamu, v našich podmínkách hlavně houby Pseudocercosporella herpotrichoides, P. acuformis (teleomorfa Tapesia spp.) a Rhizoctonia spp. Jako původce skvrn na spodních internodiích se často mohou vyskytnout i zástupci rodu Fusarium, někdy také Cochliobolus sativus (anamorfa Bipolaris sorokiniana). Při silnějším napadení rostliny přerůstá z kořenů na spodní internodia Gaeumannomyces graminis. Způsob, jakým provádíme diagnózu, určení původce ochoření, je závislé na období, kdy provádíme sledování chorob v porostech. Většinu z nich lze za vhodných podmínek ve stopách zjistit u porostů už koncem podzimního období. Z praktického hlediska je vhodné odsledovat skutečný výskyt těchto chorob na jaře na konci odnožování. Tehdy po stanovení stupně napadení a alespoň přibližným určením původce lze rozhodnout o vhodnosti ošetření porostů obilniny fungicidem. Platí to o patogenech napadajících báze stébel. Při napadení kořenů hnilobami jen posoudíme perspektivu dalšího vývoje porostu, chemická ochrana není účinná. Pro posouzení výskytu chorob pat stébel obilnin a hodnocení jejich vlivu na výnos a kvalitu zrna jsou vhodné ještě další termíny. Jsou to především odběry a hodnocení vzorků obilnin v době mléčné zralosti. Tehdy je napadení chorobami na rostlinách dobře patrné a poměrně dobře se dají vizuálně determinovat i původci ochoření. Konečné hodnocení výskytu chorob lze dělat u porostů v plné zralosti.Tehdy se posoudí skutečný výskyt chorob pat stébel a zdravotní stav kořenů, determinace původců je někdy ztížena přerůstáním druhotné mykoflóry. Na konci podzimu, za velmi vhodných povětrnostních podmínek (dostatečné dešťové srážky, relativně vysoké teploty) v porostech časněji setých citlivých pšenic po kritických předplodinách, lze v porostech zjistit první příznaky jak napadení stéblolamem, tak částečné poškození kořenů hnilobami. U kořenů se jedná především o barevné změny – úseky kořenů zhnědlé či zčernalé nebo i jiné barvy. Na nadzemních částech to jsou skvrny na listových pochvách, většinou oválné ,světle hnědé. Jak se zvětšují, střed je světlejší, okraje zůstávají hnědé, různě široké. U větších skvrn se pletivo ve středu často rozpadá. Patogeni prorůstají pletivem listů na další listové pochvy. Chemická ochrana postřikem porostů fungicidy proti

26

chorobám pat stébel na podzim není vhodná především z ekonomického hlediska. Kromě toho o šíření patogenů v porostech a intenzitě poškození rostlin rozhoduje do značné míry průběh povětrnostních podmínek během zimního a jarního období. Mírné zimy s obdobími nad bodem mrazu s dostatečnou vzdušnou vlhkostí umožňují jak růst patogenů v rostlinách, tak jejich šíření na další rostliny. Důležité je proto zjištění skutečného výskytu chorob nadzemních částí rostlin na jaře na konci odnožování. U vytipovaných porostů je vhodné provést odběr vzorků rostlin i s kořeny. Odběr má být náhodný, nejlépe na více místech v porostu, odebráním menšího počtu rostlin. Po oprání rostlin se hodnotí výskyt skvrn na listových pochvách, počet napadených odnoží a typ skvrn. Pro původce pravého stéblolamu jsou typické oválné žlutohnědé skvrny, často ve středu s drobnými černými sklerociálními útvary. Patogen prorůstá dalšími vrstvami listů na budoucí stéblo,většinou tvoří mezi vrstvami listů černě sazovitá myceliální sklerocia. Další původce stéblolamu – houba kořenomorka působí podobné skvrny, hnědý lem oválných skvrn je však širší a nápadnější, střed skvrny bývá světlejší, často se rozpadá, pokud je přítomno mycelium, pak je bělavé, sklerociální útvary světle- až červenohnědé. Prorůstá listovými pochvami pomaleji. Pokud jsou původcem skvrn další rody hub, např. Fusarium spp. bývá listová pochva napadena v podélných pruzích, postupně splývajících, při silnějším napadení je listová pochva zcela zhnědlá. Prorůstání patogena do vnitřních vrstev je slabší. Pro rozhodnutí o ochraně fungicidy na jaře bývá rozhodující procento napadení odnoží. U ozimých pšenic za kritické bývá uváděno 20 – 25 %, u ozimých ječmenů 50 – 70 %, u žita a triticale se v ČR ochrana fungicidy proti chorobám pat stébel většinou nepoužívá. Pro ozimé ječmeny je vyšší procento napadení pro doporučení chemické ochrany z toho důvodu, že u ozimých ječmenů patogen prorůstá stěnami stébla pomaleji a silnější stěna stébla většinou není mechanicky poškozena. U odebraných vzorků je nutné vyhodnotit i zdravotní stav kořenů pro posouzení perspektivy dalšího vývoje zdravotního stavu porostu. Zhodnocení výskytu chorob pat stébel v době mléčné zralosti dává dobrou představu o vlivu těchto chorob na budoucí sklizeň zrna. Je vhodné odebrat malé vzorky rostlin i s kořeny 5-10 cm dlouhými na více místech sledovaného porostu. Kořeny je vhodné oprat. V našich pokusech jsme používali pro hodnocení napadení skvrnami typu stéblolamu šestibodovou stupnici a pro hodnocení zdravotního stavu kořenů devítibodovou stupnici. Tab.1. Stupnice pro posouzení napadení stébel obilnin skvrnami typu stéblolamu. Stupeň 0 - stéblo čisté, bez napadení 1 - 1 až 2 menší oválné skvrny na stéble 2 - 2 i více skvrn, někdy splývají, není zasažen celý obvod stébla. 3 - skvrna zasahuje celý obvod stébla, pletivo pevné, nehroutí se 4 - zasažen celý obvod stébla, pletivo mechanicky narušené, propadá se 5 - zasažen celý obvod stébla, pletivo zhroucené, stéblo se láme Konečné hodnocení výskytu chorob pat stébel v porostech lze provádět v době plné zralosti porostů. Tehdy se zjistí skutečný konečný výskyt ochoření, dopad na kvalitu zrna a podíl patogenů na ochoření. Nevýhodou je, že na dozrálých rostlinách nejsou příznaky ochoření někdy už dobře patrné, suché pletivo, zdravé i ochořelé za vlhka porůstá druhotnou mykoflórou, zejména černěmi. V naší práci při sledování chorob pat stébel v minulých létech jsme používali výhradně klasické metody, tj. vizuální posouzení napadených rostlin. Determinace byla doplňována mikroskopickým vyšetřením, použitím vlhkých komůrek pro růst původců, další kultivace původců běžnou laboratorní mykologickou technikou.

27

Značné možnosti pro posuzování výskytu jednotlivých původců chorob v porostech dávají nové imunochemické, imunobiologické a molekulárně biologické metody (např. použití metody ELISA nebo PCR – Polymerase chain reaction). Jsou výborné pro přesnou determinaci původce ochoření, pro rozlišení druhů, případně i kmenů (izolátů) původce, ale z hlediska zemědělské praxe to jsou dosud metody pracovně i finančně značně nákladné. Je i omezená možnost posoudit rychle velké množství vzorků, kdy jde spíše o rozhodnutí, zda použít chemickou ochranu, než o zcela přesnou determinaci původce ochoření. Tab.2. Stupnice hodnocení napadení kořenů černáním a hnilobami. Stupeň 1 - kořeny čisté, bez napadení 2 - 1- 3 % kořenů barevné změny, hniloby 3 - 4 - 20 % - „ 5 - 21 - 50 % - „ 6 - 51 - 75 % - „ 7 - 76 - 95 % - „ 8 - 95 - 100 % kořeny barevně změněny, hniloba 9 - 95 - 100 % kořeny hnilobou zcela rozloženy, většinou zůstaly v zemi ZÁVĚR: Choroby pat stébel se u nás v porostech obilnin objevují pravidelně. Rozsah výskytu a intenzita napadení rostlin a tím i následné poškození na výnosech závisejí na více faktorech. Rozhodující bývá vliv ročníku – souhrn povětrnostních podmínek. Z více důvodů nedochází k tak silným výskytům a ztrátám na výnosech, jak se to stávalo v minulosti. Přesto jejich výskytu v porostech a determinaci původců ochoření ve sledovaném porostu je potřeba věnovat pozornost a v případu hrozícího silnějšího výskytu a následným ztrátám rozhodnout o ochranných opatřeních.

28

Obr. 1. Spodní internodium pšenice se skvrnou pravého stéblolamu. Původce Tapesia sp.

29

Obr. 2. Skvrny na stéble pšenice. Původce Rhizoctonia sp.

Tento výzkum byl podporován výzkumným záměrem MZE ČR č. 0002700603.

30

Diagnostika listových skvrnitostí ječmene Evženie Prokinová Katedra Ochrany rostlin, Česká zemědělská univerzita, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 Suchdol E-mail: [email protected] Jarní ječmen patří k základním plodinám našeho zemědělství. Pokud se pěstiteli podaří dosáhnout požadované kvality sklizně, nebývá obvykle problém s odbytem. V posledních letech se rozšiřují i plochy ozimého ječmene. Proto je potřeba věnovat se dostatečně i zdravotnímu stavu plodiny. Jak již bylo řečeno, především u jarního ječmene je dominantní pro efektivitu pěstování dosažená kvalita zrna. Ta je bezprostředně ovlivňována funkčností asimilační plochy. Jakékoli snížení této funkce má negativní dopad jak na kvantitu, tak na kvalitu sklizně. Proto patří listové skvrnitosti u ječmene k hlavním zdravotním problémům. V našich podmínkách převládají skvrnitosti houbového původu a abionózy. Mnohdy se ale nedaří etiologii choroby správně určit a to může vést k druhotné ztrátě – prostředky vynaložené na ochranu nemají odpovídající návratnost. Příčina chyb je mimo jiné v tom, že u ječmene jsou příznaky chorob ze všech u nás pěstovaných obilnin nejsnadněji zaměnitelné a ani specialista, který ovládá symptomatickou diagnózu, si nemusí být pouze na základě symptomů jistý, že správně určil primární příčinu skvrn. K nejrozšířenějším onemocněním ječmene u nás patří hnědá skvrnitost způsobovaná houbou Pyrenophora teres. Právě na tomto onemocnění je možné dokladovat, jak snadná je možnost záměny. V případě projevu tzv. „net“ typu, který způsobuje P. teres f. teres, se zdá, že je vše jasné. Ze zkušenosti vím, že i zde dochází k záměně – při intenzivnějším rozvoji onemocnění může být příznak podobný příznaku pruhovitosti ječmene (Pyrenophora graminea). A to vůbec neuvažujeme o možnosti výskytu bakteriálního onemocnění (Xanthomonas campestris pv. translucens), které se ve stadiu zasychání skvrn projevuje také podélnými, splývavými zaschlými pruhy. S podélnými pruhy zaschlého pletiva se setkáváme i v případě jedné virózy – Barley stripe mosaic virus. Mimo to je stále častější jiný projev hnědé skvrnitosti, tzv. „spot“ typ, vyvolávaný P. teres f. maculata. Ten je zase možno zaměnit se skvrnitostí vyvolanou houbami rodu Septoria a v našich podmínkách častěji se skvrnitostí vyvolanou Cochliobolus sativus. Právě tato houba doprovází ječmen u nás nejčastěji. Nelze jednoznačně vyloučit ani možnost záměny s projevem polní rezistence vůči padlí a skvrnitostí fyziologického původu. Při polní diagnostice bývají zaměňovány i příznaky vyvolané Rhynchosporium secalis za skvrny způsobené Ascochyta hordei. Na základě pouhé symptomatiky je možné se dopustit chyby i při určování nespecifických zasychajících skvrn v době mezi odnožováním a sloupkováním – příčinou může být poškození mrazem, nadměrným slunečním zářením – obvykle v kombinaci s poškozením ozónem, poškození herbicidem. Konkrétně u ječmene je nutno počítat s obrovskou variabilitou příznaků danou odrůdovou reakcí. I nadále zůstává symptomatická diagnostika pro polní podmínky základní, výchozí, zcela nepostradatelná. U listových skvrnitostí ječmene však klade na znalosti a schopnosti příslušného pracovníka ještě vyšší nároky než u jiných rozšířených plodin a pro úplnou jistotu správnosti určení ve většině případů nestačí. Další nejdostupnější metodou – a to i v provozních podmínkách – je přímá mikroskopická metoda, která často umožňuje určit houbového patogena na úrovni rodu, popř. alespoň houbový původ skvrnitosti vyloučit. V případě houbové choroby je jistější izolace patogena z rostlinných pletiv – většinou postačí tzv. vlhká komůrka, lépe v kombinaci s potřebným režimem UV záření, maličko náročnější, ale přesnější je izolace na umělé živné půdě a následná mikroskopická determinace. Tato metoda ale není vhodná pro provoz z časových důvodů. Dalším negativem je fakt, že můžeme izolovat druhotného patogena a nepodaří se

s určitostí determinovat primárního původce daného stavu. Použitelná i pro pěstitele je v současné době metoda izolace a následné mikroskopické determinace jen v některých podnicích, tam, kde dotyčný pěstitel projeví zájem a hledá aktivně informace okamžitě při zjištění primárních příznaků na prvních rostlinách v porostu. Bohužel praxe většinou reaguje až při nápadném projevu onemocnění a pak je potřeba o případném zásahu rozhodnout v řádu několika hodin. Nutno konstatovat, že při determinaci do druhu i u mikroskopické diagnózy hraje - sice méně než v případě symptomatiky, ale přece – roli posuzující subjekt a kvalita používaného mikroskopu. Ideální možností, která slučuje objektivitu, přesnost a rychlost jsou náročnější laboratorní metody. K dnešku existují pro některé hospodářsky významné původce chorob kulturních rostlin komerčně vyráběné a v prodejní síti běžně dostupné kity nejen pro ELISA test, ale už i pro PCR a její modifikace. Jde ale hlavně o rody Rhizoctonia, Fusarium, Septoria, Phytophthora, viry, bakterie. Z hlediska technického by právě v případě ječmene, kde je symptomatická a do značné míry i mikroskopická diagnostika z různých příčin „riziková“, byly metody ELISA a PCR pro využití pro praxi optimální. Zatím ale, pokud je mi známo, pro původce listových houbových chorob ječmene takové možnosti nejsou, i když výzkum jde velmi rychle kupředu. Pracovníci VÚRV např. vyvinuli metodu PCR, kterou lze determinovat P. teres f. teres a P. teres f. maculata, ale zatím jde stále o fázi výzkumu. Mimo to bychom, minimálně v ČR, narazili i na organizační zabezpečení příslušného servisu pro praxi. Dalším diskutabilním bodem je současný výskyt více patogenů – moderní metody umožňují rychle, objektivně determinovat konkrétní organismus, ale ta samá metoda neříká nic o případné přítomnosti dalších původců onemocnění. Na druhou stranu je nutno přiznat, že z hlediska praxe a s ohledem na současně dominantně používanou fungicidní ochranu proti houbovým chorobám stačí potvrdit, že jde opravdu o chorobu vyvolanou fytopatogenní houbou. Jenže i to je někdy jen za pomoci symptomatické metody v případě listových skvrnitostí ječmene obtížné. Determinace abionóz představuje samostatnou kapitolu. Tato se obvykle bez laboratorního rozboru neobejde. Vyšetření obsahu jednotlivých živinných prvků v rostlině i v půdě je standardní a příslušným laboratořím nečiní potíže. Při podezření na výživové nedostatky tak pěstiteli nevzniká neřešitelný problém. Mnohem horší je situace při podezření na poškození herbicidy, resp. rezidui herbicidů. Přímé poškození herbicidy nebývá „neurčitelné“ – při podezření pěstitel ví, jaké přípravky použil, v jaké dávce, kombinaci atd. a z toho obvykle lze dovodit, zda jde právě o toto poškození. V případě reziduí nastává situace diagnosticky téměř neřešitelná, protože a) řada účinných látek je v době projevu příznaku již rozložená a tudíž nedetekovatelná, b) účinná látka může být přítomna pouze v minimálním, nedetekovatelném množství, c) v ČR existuje (podle mých informací) pouze jedno pracoviště schopné detekovat a determinovat větší část účinných pesticidních látek a to je VŠCHT. Toto pracoviště nemá potřebné rozbory v náplni práce, na servisní rozbory nemá ani kapacitu, nehledě na cenovou nedostupnost. Mimo to se téměř nic neví o účincích látek, na které se pesticidy v půdě přeměňují. V tomto případě pak připadá v úvahu jen vylučovací metoda, kdy se po vyloučení patogenní, výživové či klimatické příčiny domníváme, že jde o poškození rezidui herbicidů. V tabulce jsou uvedeny nejčastější choroby ječmene u nás a možnosti záměny příznaků. Podtržení označuje příčiny, se kterými je pravděpodobné se setkat v ČR. patogen Pyrenophora graminea

symptom Již ve fázi 3-4 listů podélné světle zelené, žloutnoucí pruhy na listech, postupně se šíří i na další listy napadené pletivo

detekce Lze přímá mikroskopická metoda, popř. po inkubaci ve vlhké komůrce. Spolehlivější je kultivace na sterilních listech

2

Pyrenophora teres

Cochliobolus sativus

Rhynchosporium secalis

zasychá, listy se mohou až třepit. Napadené rostliny jsou menší než zdravé. Ve stadiu primárních příznaků je možno zaměnit za: 1) nedostatek N, méně často za deficit Fe, S nebo Mg (chlorózy) 2) poškození herbicidy (propanil) U nás nepravděpodobné (ú.l. v přípravku Sencor, není registrován) do obilovin 3) virózu (Barley mosaic virus, Barley yellow mosaic virus, Barley yellow dwarf virus 4) Cephalosporium gramineum Žluté nepravidelné skvrny, které rychle hnědnou. Mají typickou síťovitou strukturu; nebo eliptické skvrny s tmavým hnědým středem a difúzním chlorotickým až žlutým haló. Při silné infekci mohou skvrny v pokročilejším stadiu choroby splývat do podélných pruhů. Možnost záměny primárních příznaků s Cochliobolus sativus, Septoria spp. V pokročilém stadiu při intenzívním projevu příznaků možnost záměny s P. graminea Okrouhlé až oválné, sytě hnědé - čokoládově hnědé skvrny s ostrým okrajem U některých odrůd možnost záměny s projevy polní rezistence vůči padlí

Oválné až okrouhlé, nejprve šedozelené, vodnaté skvrny. Rychle zasychají, jsou nepravidelného tvaru, světlé s ostrým hnědým nebo hnědě fialovým okrajem. Ve stadiu primárních příznaků možno zaměnit s příznaky napadení Pseudomonas

ječmene umístěných na vodním agaru, při režimu světlo/tma 12/12 hodin. Určení do druhu podle růstu konidioforů a velikosti spór. Na úrovni výzkumu PCR

viz P. graminea

Přímá mikroskopická metoda, popř. po inkubaci napadeného pletiva ve vlhké komůrce. Roste a imperfektní stadium (Bipolaris sorokiniana) sporuluje na všech běžných univerzálních půdách, lépe na organických (např. PDA) Na úrovni výzkumu PCR Přímá mikroskopická metoda jen v pokročilé fázi onemocnění Kultivace na univerzálních půdách (např. PDA)

3

syringae (potvrzené informace o četnějším výskytu na ječmeni v ČR nemám, v zahraniční literatuře uváděna jako běžně celosvětově rozšířená). U některých odrůd možno zaměnit s Ascochyta sp. Nelze vyloučit záměnu s poškozením herbicidem Ramularia collo-cygni Drobné, hnědé skvrnky na horních listech – nejčastěji na praporcovém listu, mohou pokrývat až 90 % listové plochy Lze zaměnit za poškození B (nadbytek), s fyziologickou skvrnitostí

Projevy polní rezistence vůči Blumeria graminis

Žloutnutí listů, zasychání od špiček

Symptomatika a přímá mikroskopická metoda jsou nespolehlivé. Úspěšnější je přímá mikroskopická metoda po inkubaci ve vlhké komůrce Kultivace na anorganických půdách (Cz-D, Raulin Thom) Je vypracována metoda PCR pro detekci patogena v napadených listech ječmene Silně variabilní světle až sytě Obvykle stačí přímá hnědé skvrny, souvislé i složené mikroskopická metoda z mnoha teček, obvykle ne na praporcovém listu. Variabilita dána dominantně odrůdou, méně ovlivněna podmínkami vnějšího prostředí. Možnost záměny s fyziologickou skvrnitostí, méně často s projevy napadení Cochliobolus sativus Poškození CL, F, ozonem, Jednoznačně jen laboratorně výživové nedostatky (N, P, Mg, Mn) Virózy Poškození herbicidy

4

Diagnostika a hodnocení braničnatky pšeničné (Mycosphaerella graminicola). Lubomír Věchet Výzkumný ústav rostlinné výroby, Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně E-mail: [email protected] Braničnatka pšeničná (listová skvrnitost pšenice), původce Mycosphaerella graminicola (Fuckel) J. Schrőt. in John – sexuální stádium (asexuální stádium Septoria tritici Roberge in Desmaz) zahrnuje jeden z nejrozsáhlejších rodů askomycet. Do tohoto rodu jsou řazeny fytopatogenní houby, které se vyskytují ne neobyčejně širokém sortimentu hostitelů (Rous, 2003). Taxonomicky je houba řazena do skupiny Sphaeropsidales, jež jsou charakterizovány tvorbou kulovitých nebo méně pravidelně utvářených plodniček (pyknid). Tato skupina je řazena mezi houby nedokonale známé (Fungi imperfecti). Braničnatka pšeničná je jednou z nejvážnějších chorob ve všech oblastech pěstování pšenice, zejména v místech s relativně vysokými srážkami, středními teplotami a působí vážné ztráty na výnosu zrna (King et al., 1983; Goodwin & Cavaletto, 1999; Zhang et al., 2001). Za posledních 20 let se důležitost této choroby v Evropě zvýšila. Uvádí se, že braničnatka pšeničná způsobuje ztráty u evropských pěstitelů pšenice zhruba 0,4 miliardy Euro (Syngenta, 2001). První symptomy na náchylné pšenici se projevují na listech jako nepravidelné, obdélníkové chlorotické skvrny, které se obvykle objevují do šesti dnů po penetraci pyknospory. Příznaky ochoření na listech pšenice se objevují na podzim, kde vytvářejí oválné, ve středu světlejší skvrny, které se vyvíjejí do nepravidelných nekrotických lézí (Obr. 1). Nekrotické skvrny jsou nejprve vpadlé a šedozelené. Skvrny často splývají, listy žloutnou a odumírají. Ve skvrnách se hustě tvoří tmavohnědé až černé pyknidy, po relativně dlouhé latentní periodě více než tří týdnů (Shaw, 1990). Ty jsou zapuštěny v epidermální a mezofylové tkáni na obou stranách listu s otvorem na vrcholu. Pyknidy jsou výlučně tvořeny uvnitř substomatálních dutin a proto se objevují v řadách paralelně vaskulárních žil listu (Palmer & Skinner, 2002). Pyknidy vytvářejí cirry ( (Obr. 2) v různých formách (nitkovité, kapkovité, Obr. 3) a v nich asexuální pyknospory (Obr. 4). Ty jsou rozptylovány dešťovými stříkanci na krátké vzdálenosti. Pyknospory se tvoří ve dvou formách: makropyknospory (3598 x 1-3 μm) se 3-5 septy nebo mikropyknospory (8-10,5 x 0,8-1 μm) bez sept (Eyal et al, 1987). Cirrus (tenký ohebný úponek) je gel vytvářený proteinovými a sacharidovými sloučeninami. Primární úlohou sloučenin cirrus jsou ochrana pyknospor od vysychání a prevence předčasnému klíčení. Cirrus ochraňuje pyknospory tak, že zůstává životaschopný, přinejmenším 28 dnů (Fournet, 1969). Braničnatka plevová Phaeosphaeria nodorum – sexuální stádium (asexuální stádium Septoria nodorum = Stangospora nodorum) je nejvíce zřetelná na pluchách, ale také se vyskytuje na listech a listových pochvách. Infekce listů začíná jako velmi tmavě hnědé fleky nebo skvrny, někdy se žlutým lemem. Tyto malé nepravidelné skvrny se rozšiřují do oválně světle hnědých skvrn s tmavě hnědým středem. Na klasech pšenice skvrny začínají buď jako našedlé nebo nahnědlé skvrny na plevách, obvykle v horní třetině plevy. Jak se skvrny zvětšují, stávají se tmavě hnědé a střed přechází do barvy šedobílé, kdy se uvnitř nich vyvíjejí drobné hnědé pyknidy. Tyto pyknidy lze bez použití lupy jen obtížně pozorovat. Po delším období 5-12 týdnů se objevují pseudothecia se sexuálními askosporami (Eriksen, 2000; Hunter et al., 1999). Askospory (Obr. 5) jsou rozptylovány větrem na dlouhé vzdálenosti. Mají dvě buňky a jsou nerovnoměrné ve velikosti. Morfologický vzhled asexuálních pyknid a sexuálních askospor je zcela podobný (Eyal et al., 1987). Askospory se vyskytují během sezóny pěstování plodiny (Hunter at al., 1999) a pravděpodobně způsobují primární infekce pšenice na podzim, když jsou větrem zaváty z vedlejšího strniště (Zhang et

5

al., 2001). Pyknospory (Obr. 4) jsou rozptylovány na krátké vzdálenosti dešťovými kapkami, zatímco askospory jsou rozptylovány větrem na dlouhé vzdálenosti. Obr. 1. Variabilita symptomů braničnatky pšeničné (M. graminicola) na odrůdách pšenice ozimé. (Věchet, 2005).

Ludwig

Meritto

Ludwig

Rapsodia

Vlasta

Rapsodia

6

Obr. 2. Pyknidy M. graminicola ve skvrně braničnatky pšeničné s cirry (Věchet, 2005).

Obr. 3. Typy cirrů: nitkovité - Galaxie, kapkovité – Oasis. (Věchet, 2006).

7

Obr. 4, Pyknospory M. graminicola, Hereward. (Věchet, 2004).

Obr. 5. Askospory (zvětšeno 650 x) M. graminicola. Vzorek obarven laktofenolovou bavlníkovou modří (Blaire-Louise Palmer & Wendy Skinner, 2002).

Hodnocení závažnosti choroby spočívá v odhadu procenta pokrytí listové plochy typickými příznaky choroby. Jsou to skvrny různé velikosti a tvaru s typickými pyknidami. Většinou se používá devítibodová stupnice. Příkladem může být stupnice skvrnitosti Septoria tritici podle Zhanga et al. (1999): 1. Žádné viditelné symtomy nejsou pozorovány a listy zůstávají zelené a zdravé.

8

2. Několik chlorotických skvrn je přítomno a infekčním místem je světle hnědě zbarvená skvrna. 3. Rozsáhlé chlorotické skvrny jsou přítomny. Skvrny mají občas nekrózy v místech infekce. 4. Rozsáhlé chlorotické skvrny se spojují navzájem a jednotlivé skvrny jsou identifikovány na jednotlivých infekčních místech. Obě, nekrózy a chlorózy existují na listu. 5. Skvrny jsou plně spojeny a více než polovina listu je vysušena nekrózami. 6. Celý list je seschlý a vodou promočené skvrny pokrývají celý list. 7. V infekčních místech je vidět několik pyknid a méně než 30% listu je zaplněno skvrnami pokrytými pyknidami. List zůstává suchý a zelený. 8. Pyknidy pokrývají 50 až 70% povrchu listu a infikovaná místa jsou suchá, ještě stále zelená. 9. Celý list je pokryt pyknidiálními skvrnami, je suchý a ještě stále zelený. Polní diagnózy mohou být zpřesněny s použitím rychlých imunologických testů a molekulárně genetických metod. LITERATURA ERIKSEN L. (2000): The inflience of sexual reproduction on the structure populations of Mycosphaerella graminicola in reaction to durability of resistance. Ph.D.Thesis. EYAL Z. , LEVY E. (1987): Variation in pathogenicity patterns of Mycosphaerella graminicola within Tritium spp. In Izrael. Euphytica 36: 237-250. FOURNET J. (1969): Properiétés et role du cirrhe du Septoria nodorum Berk. Ann. Phytopathol. 1:87-94. GOODWIN S.B., CAVALETTO J.R., WAALWIJK C., KEMA G.H.J. (2001): A DNA fingerprinting probe from Mycosphaerella graminicola identifies an active transposable element. Phytopathology 91, 1181-1188. HUNTER T., COKER R.R., ROYAL D.J. (1999): The telomorph stage, Mycosphaerella graminicola, in epidemics of septoria tritici blotch on winter wheat in the UK. Plant Pathol. 48: 51–57. KING., JENKYNS, MORGAN (1983): The estimation of yield losses in wheat from severity of infection by Septoria species. Plant Pathology 32: 239-249. PALMER C-L., SKINNER W. (2002): Mycosphaerella graminicola : latent infection, crop devastation and genomics. Molecular Plant Pathology 3 ( 2 ): 63–70. SHAW M.W. (1990): Effects of temperature, leaf wetness and cultivar on the latent period of Mycosphaerella graminicola on winter wheat. Plant pathol. 39: 255-268. ZHANG X., HALEY S.D., JIN Y. (1999): Diallel analysis of septoria tritici blotch resistance in winter wheat. p. 56–58. In M. van Ginkel et al. (ed.) Septoria and Stagonospora diseases of cereals: A compilation of global research. CIMMYT, Mexico D.F. ZHANG X.; HALEY S.D.; JIN Y. (2001): Inheritance of Septoria tritici blotch resistance in winter wheat. Crop Science, , 41, 2: 323-326.

Tento výzkum byl podporován výzkumným záměrem MZE ČR č. 602700602.

9

Diagnostika snětí rodu Tilletia na pšenici Michaela Kochanová, Evženie Prokinová, Katedra Ochrany rostlin,Česká zemědělská univerzita, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6-Suchdol E-mail:[email protected] Na území České republiky se každoročně vyskytují mazlavá sněť pšeničná a zakrslá sněť pšeničná. Jedná se o velmi závažné choroby pšenice i ostatních obilnin, jejichž původci jsou fytopatogenní stopkovýtrusé houby Tilletia caries (DC.) Tul., syn. T. tritici (Bjerk.) Wint. a Tilletia controversa Kühn. Tyto organizmy mohou způsobit obrovské ztráty na výnosu, ale především znehodnocení veškeré sklizně a znemožnění obchodovatelnosti se zrnem pšenice pro povrchovou kontaminaci teliosporami snětí. Takovéto zrno není použitelné pro potravinářské, ani krmivářské účely. Na pěstebním pozemku se spory Tilletia mohou vyskytnout prostřednictvím osiva a mohou být přítomné v půdě z minulých let pěstování pšenice. T. caries je přenosná obilkou a životnost spor v půdě může dosahovat až tří let, T. controversa je přenosná i půdou a v té přežívá až deset let, tím je z hlediska ochrany mnohem nebezpečnější. Během této doby mohou životaschopné spory s variabilní mezidruhovou i vnitrodruhovou dormancí za podmínek odpovídajících jejich požadavkům pro klíčení infikovat rostlinu a to již od jejích nejranějších růstových fází. Onemocnění snětí je až do výskytu jediného jistého symptomu – hálek v klasu místo zrn – latentní. Veškeré příznaky pozorovatelné během růstu mladé rostliny, jako jsou světlé skvrny na listech, zvýšená tvorba odnoží nebo inhibice růstu rostliny, mohou mít řadu jiných příčin a lze je tedy označit za nespolehlivé. Diagnostika na základě symptomů je proveditelná i v polních podmínkách. Sněť se ale může vyskytovat v podobě pouze několika napadených klasů na rozlehlém pěstebním pozemku, čehož si pěstitel nemusí všimnout. Při sklizni se snětivé hálky vyplněné řádově až miliony spor, poškodí a spory kontaminují okolní klasy, sklízené zrno i sklízecí a následně čisticí techniku. Spory jsou pozorovatelné světelným mikroskopem a užití světelného mikroskopu k pozorování vnější polygonální retikulace teliospor je také jednou z mála metod, jak jednotlivé druhy odlišit. Teliospory T. caries jsou kulovité, příležitostně oválné o rozměrech 14–23,5 µm, výjimečně mohou dosahovat velikosti až 25 µm. Vnější polygonální síťovitá struktura dosahuje hloubky 0,5–1,5 µm. Teliospory T. controversa jsou téměř kulovité až kulaté, o rozměrech 19–24 µm, výjimečně 16,8–32 µm. Vnější polygonální síťovitá struktura dosahuje hloubky 1,5–3 µm. Druhy lze také determinovat pozorováním degradace lamel teliospor T. caries v imersním oleji, autofluorescence teliospor T. controversa nebo pomocí testu klíčivosti na vodním agaru v Petriho miskách. Vyklíčená spora napadá rostlinu pravděpodobně od jejího klíčení až do konce odnožování a to při bázi rostliny. Mycelium Tilletia je zjistitelné přímo v hostiteli barvením rostlinného pletiva a jeho pozorováním světelným mikroskopem. Touto metodou se zabývali v 50. a 60. letech minulého století laboratoře v Německu a ve Velké Británii. Autoři publikací takto detekovali hyfy v rostlině od šestého dne po jejím vzejití nad povrch půdy. V pletivu podezřelém na přítomnost mycelia lze po prosvětlení vařením v KOH a obarvením 1 % roztokem trypanové modři mycelium snadno pozorovat. Je to nejjednodušší způsob detekce houby v rostlině, nejméně náročný na laboratorní vybavení. K provedení postačí světelný mikroskop s dvěstěpadesátinásobným zvětšením. Spolehlivé stanovení ale vyžaduje jistou zkušenost s preparací infikovaného pletiva, zručnost laboranta i znalosti v morfologii Tilletia spp. pro rozpoznání v pletivu. O poznání náročnější na technické vybavení laboratoře jsou metody molekulární diagnostiky. Závislost na nákladných přístrojích i nezanedbatelná výše finanční náročnosti zpracování jednoho vzorku patří mezi několik nevýhod těchto přesných a relativně rychlých

10

metod. Výhodou je snadná proveditelnost postupu zaškoleným laborantem, který není omezen svými znalostmi o studovaném organizmu. Na Katedře ochrany rostlin ČZU v Praze byla vyvinuta molekulárně biologická metoda, která si získala své uživatele i v zahraničí a momentálně se používá pro analýzu rostlinného materiálu např. ve Vídni. Jedná se o polymerázovou řetězovou reakci (PCR), metodu, která umožňuje po exponenciálním namnožení specifického úseku deoxyribonukleové kyseliny (DNA) přítomného v genomu Tilletia spp. detekovat mycelium v hostitelské rostlině na úrovni rodu cílového patogena. Nejvhodnější částí testované rostliny je její báze, u odrostlejších rostlin vzrostný vrchol, tedy místo s nejvyšší koncentrací mycelia. Postup začíná chemickou izolací DNA rostliny podezřelé na přítomnost sněti. Získaná DNA se použije v reakci probíhající ve speciálním termostatu – termocykléru. Ten mění teploty řádově o desítky stupňů Celsia na jejich konkrétní hodnoty v krátkých, až několikasekundových, intervalech. Použitím chemikálií komerčně dostupných a charakteristických pro stanovovaný organizmus se takto namnoží požadovaný úsek DNA patogena na detekovatelnou koncentraci. Výsledky reakce se pozorují na agarózovém gelu osvětleném ultrafialovým světlem nutné vlnové délky. Informace o přítomnosti nebo absenci sněti je jednoznačná a závisí jen na pečlivém provedení metody a sterilních podmínkách laboratorního prostředí. Toto molekulárně biologické stanovení nevypovídá o množství patogena v rostlině. Předpokládáme, že to může být různé v závislosti na podmínkách prostředí, virulenci patogena s ohledem na zmíněnou variabilitu a v neposlední řadě na odrůdě hostitelské rostliny. Zejména na území Severní Ameriky se věnuje velká pozornost šlechtění odolné odrůdy, jejíž použití se řadí mezi základní opatření proti snětím. Snaha šlechtitelů je kontinuální, vzhledem ke skutečnosti, že pro patogena je překonání rezistence hostitele často rychlejší proces, než pro šlechtitele „tvorba“ odolného materiálu. Při šlechtění je nutná zdlouhavá kultivace porostu a až do plné zralosti rostliny není jasné, který materiál je vhodný pro další zacházení. Pracovníci Katedry ochrany rostlin se tedy začali zabývat možností, jak případné šlechtění urychlit a jak pro tyto účely použít výhody, které poskytuje molekulární diagnostika. Řešení nabízí kvantitativní PCR. Ta umožňuje stanovení množství mycelia v rostlině sledováním záření označené sondy degradující při exponenciálním nárůstu počtu kopií cílové sekvence DNA detekovaného organizmu. Při tomto stanovení je nutné mít v reakci se vzorky k dispozici standardy se známým množstvím stanovené DNA a k těm graficky znázorněné výsledky z kvantifikace přirovnat. Standardy jsou v případě Tilletia plazmidy se zabudovaným krátkým úsekem ribozomální DNA mycelia získaného kultivací in vitro. Všechny vzorky včetně standardů je nutné vyhotovovat v tripletech, aby se eliminovala případná chyba reakce. Také proto je stanovení tak nákladnou záležitostí a v České republice zřejmě nebude možné jej využívat pro komerční účely. V zahraničí tato možnost kvantifikace vzbuzuje zájem vědců v oboru a můžeme předpokládat, že i u nás, třebaže jen na vybraných pracovištích, by mohla být pro potřeby šlechtění v budoucnu použita. Sněti jsou momentálně velkým problémem a nebezpečí vzniku infekce konkrétně snětí zakrslou bude vzhledem k zásobě spor v půdě na většině pěstebních ploch naší republiky trvat i v dalších letech, minimálně následujících deset let. Toto časové období bude takto krátké v ideálním případě, tedy pokud se množství spor nebude zvyšovat dalším „vypěstováním“ sněti přes náchylné odrůdy pšenice za příznivého počasí, tedy při dlouhodobé sněhové pokrývce zamezující promrznutí půdy a poskytující sporám pod sněhem stabilně nízkou teplotu pro vyklíčení. Včasná a přesná diagnostika původců snětí, nejlépe v podobě zjištění množství spor již v půdě a možnosti jeho sledování, by byla prvním krokem k omezení tohoto významného onemocnění. Samozřejmě za předpokladu, že na diagnostiku budou navazovat další ochranná opatření, mezi které se řadí moření osiva a to i uznaného, použití širšího osevního postupu, zamezení kontaminace pěstebních pozemků či zrna sklízecí technikou a pěstování odolných odrůd.

11

Obr. 1. Snětivý klas.

12

Obr. 2. Při pozorování vnější polygonální retikulace teliospor světelným mikroskopem je možné rozlišit druhy (vpravo T. controversa, vlevo T. caries).

13

Využitie PCR metód v detekcii Rhynchosporium secalis na jačmeni siatom Jozef Gubiš, Martina Hudcovicová SCPV - Výskumný ústav rastlinnej výroby, Bratislavská cesta 122, 921 68 Piešťany, Slovenská republika, E-mail:[email protected], [email protected] Jačmeň siaty ako aj ostatné plodiny je počas svojho vývinu a rastu v prirodzených podmienkach prostredia ovplyvňovaný množstvom faktorov, či už pôdno-klimatickými podmienkami alebo výskytom patogénnych mikroorganizmov. Z patogénov majú značný negatívny význam niektoré listové škvrnitosti jačmeňa, medzi ktoré patrí aj rynchopóriová škvrnitosť jačmeňa. Pôvodcom rynchospóriovej škvrnitosti je Rhynchosporium secalis (Oudem.) J.J. Davis, ktorý je rozšírený takmer vo všetkých pestovateľských oblastiach jačmeňa na svete, kde spôsobuje značné škody na úrode. Zdrojom infekcie R. secalis je hlavne prezimujúce mycélium v listoch, pôde a na pozberových zvyškoch a tiež i niektoré burinné druhy tráv. Patogén je taktiež prenosný i mycéliom v semene. Pôvodca rynchospóriovej škvrnitosti jačmeňa vytvára na infikovaných častiach nápadné, 1-2 cm veľké škvrny, spočiatku priesvitné, oválne alebo nepravidelného tvaru. Škvrny sa sfarbujú cez modrozelenú do slamovo žltej farby, s dobre viditeľnými koncentrickými pruhmi hnedo sfarbeného pletiva s nápadným hnedým až čiernohnedým lemovaným okrajom. Časom sa toto pletivo v mieste škvŕn môže trhať a vypadávať. Základnou preventívnou metódou pre kontrolovanie kontaminácií patogénnymi mikroorganizmami je už dopestovanie a výsev zdravého neinfikovaného osiva. V tomto zmysle je potrebná už počas pestovania plodín rýchla a spoľahlivá detekcia primárnych kontaminácií patogénnych mikroorganizmov, ktorá umožní presný, včasný a efektívny ochranný zásah a tak zabráni expanzii patogéna v rastline a jej orgánoch, vrátane semena. Z klasických fytopatologických testov sa v súčasných metódach overovania zdravotného stavu semien pozorujú morfologické charakteristiky patogéna po týždňovej inkubácii semien na agare. Avšak tieto techniky sú náročné na čas a prácu a identita húb môže byť niekedy potvrdená až po dlhšom čase. Preto bolo potrebné pre správnu a rýchlu identifikáciu patogénov vyvinúť novú metódu. Z tohto dôvodu sa na detekciu patogénov okrem klasických fytopatologických testov začali využívať aj PCR (polymerázová reťazová reakcia) techniky. PCR metódy sú oproti klasickým testom vysoko citlivé a špecifické, rýchle a interpretácia výsledkov je jednoznačná. Avšak ich nevýhodou je, že vyžadujú izoláciu DNA. PCR metódy sa už niekoľko rokov vo viacerých výskumných pracoviskách používajú ako hlavný nástroj pre diagnostiku a štúdium fytopatogénnych húb, pričom prispievajú k uľahčeniu riešenia niektorých problémov pripisovaných detekcii, kontrole a obmedzeniu rastlinných patogénov. Pri jačmeni sa techniky PCR využili pri kvalitatívnej detekcii viacerých patogénov: Pyrenophora graminea, Pyrenophora teres, Rhynchosporium secalis a Ustilago hordei. Zavedením novej techniky RT-PCR (real-time PCR) sa zlepšili a zjednodušili metódy kvantifikácie DNA patogénov. RT-PCR je metóda kvantitatívna, na rozdiel od klasickej PCR, kde sa na kvantifikáciu DNA patogéna musia použiť ďalšie techniky. Špecifickosť reakcie pri RT-PCR je veľmi vysoká a oproti klasickej PCR stačí na získanie výsledkov kratší čas (20 min. – 2 hod.) v závislosti od použitého prístroja. Senzitivita reakcie je veľmi vysoká vďaka kombinácii amplifikácie DNA v PCR a systému detekcie. Kvantifikácia DNA patogéna môže byť najčastejšie uskutočnená 2 spôsobmi, a to pomocou SYBR Green I systému alebo pomocou TaqMan TM sondy. Systémom SYBR Green I boli diagnostikované patogény Pyrenophora graminea a Pyrenophora teres. Sonda TaqMan TM sa vyznačuje vyššou špecifickosťou vďaka dvom špecifickým cieľovým sekvenciám – pre primer a pre sondu.

14

Na Slovensku sa molekulárnej diagnostike patogénov obilnín zatiaľ nevenuje dostatočná pozornosť a ani nepoznáme slovenské pracovisko, ktoré by sa kvantitatívnou detekciou najvýznamnejších hubových patogénov obilnín zaoberalo. Cieľom našej práce bolo zavedenie novej techniky RT-PCR do výskumnej činnosti VÚRV Piešťany. Keďže pri RT-PCR metóde sa používajú špecifické primery o veľkosti v rozmedzí 50-150 bp, boli v prvom rade zabezpečené nové primery s požadovanou veľkosťou amplifikovaného produktu. Pre R. secalis bol navrhnutý pár primerov RS17F a RS17R pomocou on-line programu Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) s veľkosťou produktu 67 bp. Pár špecifických primerov bol odvodený z ITS oblasti rDNA R. secalis secalis (nukleotidová sekvencia patogéna pochádzala z NCBI Genbank databázy, AY140668). Špecifickosť primera RS17F a RS17R pre daný patogén bola overená použitím DNA rôznych patogénov (R. secalis, P. teres f. teres, P. teres f. maculata, P. graminea, Drechslera tritici-repentis, S. nodorum, S. tritici, Fusarium culmorum, F. graminearum, F. poe a F. avenaceum) v PCR reakcii. Kedže primery vykazovali čiastočne krížovú reakciu s inými patogénmi (P. teres, Drechslera tritici-repentis, F. culmorum and F. poe), výsledné produkty z RT-PCR boli overované v agarózovom géle. Kvantifikácia patogénov prebiehala na prístroji ABI PRISM® 7000 od firmy Applied Biosystems pomocou „SYBR® Green“ farbičky (SYBR® Green I Maters Mix). Pred samotnou analýzou neznámych vzoriek boli najskôr testované rôzne koncentrácie primerov. Pri optimalizácii koncentrácie primerov použitých v RT-PCR boli skúšané 3 rôzne koncentrácie a to 50, 500 a 1000 nM primeru na reakciu. Tieto koncentrácie primerov boli skúšané pri kalibračnej krivke, kde boli použité rôzne koncentrácie vstupnej DNA patogéna (2,5; 25; 250; 2500 a 25000 pg/µl). Najlepšou koncentráciou primeru pre kvantifikáciu sa pre R. secalis ukázala koncentrácia 500 nM primeru na reakciu. Pri testovaní koncentrácie primeru bol dosiahnutý vysoký determinačný koeficient (R2= 0,98), čo potvrdilo správnosť výsledkov. Správnosť výsledkov bola overená aj pomocou disociačnej krivky, ktorá ukázala, že počas amplifikácie nedochádzalo k tvorbe nešpecifických fragmentov (dimérov primera). Amplifikácia rôzneho množstva vstupnej patogénnej DNA bola skontrolovaná aj v agarózovom géle. V tabuľke 1 sú prezentované prvotné výsledky kvantifikácie R. secalis v semenných vzorkách jačmeňa. Dvadsaťtri kontaminovaných vzoriek jačmeňa R. secalis z prirodzených podmienok prostredia bolo analyzovaných pre overovanie primerov. Všetky testované vzorky vykazovali signál v RT-PCR analýze. ABI PRISM 7000 SDS systém kvantifikoval špecifický fluorescenčný signál R. secalis vo vzorkách z prirodzených podmienok, ktorý bol v rozmedzí 2,48 až 419,1 pg DNA R. secalis na 100 ng celkovej DNA. Koeficient determinácie pre túto analýzu bol R2= 0,96. Pravdivosť amplikónov R. secalis bola overená pomocou analýzy krivky topenia (melting curve) (Tm = 77°C). Správnosť kvantitatívnej analýzy bola kontrolovaná použitím 4 umelo infikovaných vzoriek semien s 1, 2, 5 a 20 % úrovňou infekcie R. secalis. Úroveň kontaminácie umelo infikovaných vzoriek sa zvyšovala so zvyšovaním úrovne infekcie (tabuľka 1), pričom korelačný koeficient pri tejto analýze bol 0,98. Na iných pracoviskách bola kvantifikácia R. secalis uskutočnená aj v listových vzorkách pri použití primerov odvodených od génu pre cytochróm b z R. secalis a FAM označenou TagMan probou. Okrem RT-PCR technológie na kvantitatívnu detekciu R. secalis v semenách je možné využiť aj kompetetívnu PCR. Nami použitá technológia SYBR Green I sa uplatnila aj pri detekcii iných druhov patogénov, ako napr. P. teres, P. graminea, Tilletia caries, Fusarium spp., Blumeria graminis f. sp. tritici, Cladosporium spp., Ramularia spp. a Microsphaera alphitoides, Septoria spp. a Phytophtora infestans. Ďalšou možnou technológiou na RT-PCR je technológia Scorpion, ktorá bola použitá na kvantifikovanie Pyrenophora teres v semenách jačmeňa.

15

RT-PCR sa v súčasnosti využíva nielen na detekciu mnohých ďalších fytopatogénov, ale aj iných húb, baktérií, vírusov a viroidov. Okrem toho sa môže využiť na detekciu transgénov, resp. stanovenie počtu ich kópií v transgénnom organizme, na detekciu nežiadúcich prímesí v potravinách a na kvantifikáciu rôznych špecifických transkriptov. VÚRV Piešťany začal riešiť problematiku molekulárnej diagnostiky fytopatogénov, resp. molekulárnej fytopatológie na princípe analýzy DNA v roku 2002. Z rastlinných patogénov sa pozornosť najskôr venovala P. teres a Stagonospora nodorum. Od roku 2003 sa do výskumnej činnosti sa postupne zavádzali metódy molekulárnej diagnostiky pri viacerých patogénoch pšenice letnej (Septoria tritici, Drechslera tritici-repentis, Fusarium culmorum, F. graminearum, F. poe a F. avenaceum) a jačmeňa siateho (R. secalis, P. teres f. teres, P. teres f. maculata, P. graminea a Cochliobolus sativus). Keďže množstvo patogénov je prenosných aj semenom, aplikovaním molekulárnej diagnostiky patogénov obilnín v pestovateľskej praxi by zabezpečilo najmä zlepšenie zdravotného stavu porastu, čo sa následne prejaví nielen na úrode, ale aj kvalite dopestovaného zrna. Priamejšie hospodárske prínosy použitím molekulárnych metód sa prejavia aj v zníženej, resp. riadenej spotrebe agrochemikálií a v zníženej kontaminácii rastlinných produktov ich rezíduami. Tab. 1 Množstvo DNA R. secalis v pg na 100 ng celkovej DNA v prirodzene infikovaných semenách jačmeňa z 2 lokalít a umelo infikované semená genotypu SK-13991 genotyp úroveň R. secalis pg/100ng Garant 19,424 Akcent 8,224 Ebson 8,608 Progres 27,808 Expres 5,104 Annabell 3,76 Cyril 15,696 Jubilant 419,088 Pasadena 792 Bolina 6,24 Lenka 6,64 K29192 Diamant 12,768 Lenka 15,6 Viktor 18,56 Norbert 5,2 CI 5791 3,376 CI 4922 1,776 Terno 2,48 úroveň infekcie úroveň R. secalis pg/100ng 1% 3750,4 2% 5625,6 5% 6195,2 20% 8606,4 * umelo infikované semená genotypu SK-13991 u.i. SK13991 *

Spišká Belá

Malý Šariš

lokalita

Práca vznikla na základe riešenia Výskumnej úlohy VaV 2003 SP 27/028 0E 02/028 0E 02 MP SR.

16

Význam a diagnostika bakterie Pseudomonas syringae a patovarů vyskytujících se na obilninách Blanka Kokošková Výzkumný ústav rostlinné výroby, Drnovská 507, 161 06 Praha 6 - Ruzyně E-mail: [email protected]

HOSPODÁŘSKÝ VÝZNAM BAKTERIE PEUDOMONAS SYRINGAE Bakteriální choroby obilnin nepatří v České republice k příliš významným chorobám. Ve střední Evropě se s bakteriózami na obilninách setkáváme spíše ojediněle. Jejich výskyt nelze vyloučit v případě vlhkého a deštivého počasí zvláště v raných fázích vývoje rostlin. Na území našeho státu se mohou objevit nejčastěji u kukuřice, dále pak u ječmene, ovsa a pšenice. Není zapotřebí uplatňovat proti nim žádná zvláštní ochranná opatření. Běžná ochrana zahrnuje kontrolu zdravotního stavu porostů, používání zdravého osiva a rezistentních odrůd. Dosud nebylo zapotřebí provést plošné chemické ošetření baktericidy, neboť rozsah napadení porostů takový zásah nevyžadoval. Z bakteriálních patogenů rodu Pseudomonas škodlivých na obilninách má největší význam bakterie Pseudomonas syringae. Je to druh, v rámci kterého je známo více než 45 různých patovarů. Nejznámější z nich je bakterie P. s. pv. syringae, která je polyfágní, tj. škodí na mnoha hostitelských rostlinách. Většina ostatních patovarů se vyznačuje úzkou hostitelskou specializací, resp. hostitelským okruhem tvořeným několika úzce příbuznými druhy rostlin v rámci jedné nebo několika málo čeledí. K nim patří např. pv. striafaciens, coronafaciens, atrofaciens, které se vyskytují na obilninách, pv. glycinea, phaseolicola, pisi na luskovinách, pv. tabaci na tabáku, pv. tomato na rajčeti, pv. morsprunorum na peckovinách aj. Bakterie P. s. pv. syringae se vyskytuje po celém světě hojně v epifytní mikroflóře mnoha druhů rostlin a je příležitostným patogenem, který na rostlinách způsobuje různé typy příznaků, nejčastěji listové nekrózy. Skvrnitost listů může přecházet až ve spálu, je-li průběh infekce velmi rychlý. Spálové příznaky najdeme někdy na rostlinách pšenice, kukuřice, fazolu, hrachu, jetele a rajčete. Bakterie P. s. pv. syringae významně škodí na ovocných stromech, zvl. dřevinách rodu Prunus, kde kromě listových a korových nekróz způsobuje také černání pupenů a spálu květů. Silná infekce má za následek odumírání výhonů. Škodlivost patogena se zvyšuje v jarních a podzimních měsících, kdy teploty kolísají kolem 0 oC. Poslední jmenované onemocnění je charakteristické obdobnými příznaky jako spála růžovitých, jehož původcem je bakterie Erwinia amylovora, proto k přesnému určení patogena nestačí vizuální posouzení příznaků, ale je nezbytný bakteriologický rozbor. Mnohdy bakterie P. s. pv. syringae nebývá jedinou příčinou onemocnění rostlin, ale způsobuje je spolu s jinými patogenními mikroorganismy nebo je až sekundárním patogenem. Na ječmeni vyvolává bakterie P. s. pv. syringae černání obilek. Po napadení v raných fázích vývoje se obilky ječmene, scvrkávají, černají a neklíčí. Choroba má ekonomický význam především u sladovnického ječmene. Přítomnost metabolických látek v infikovaných zrnech působí nepříznivě na poměr proteinů ovlivňujících kvalitu piva. Při silné infekci obilek patogenem je zpracování partií pro sladovnické účely vyloučeno. V porostu ovsa se může vyskytovat bakteriální gloriolová skvrnitost, kterou způsobuje bakterie P. s. pv. coronafaciens. I když se vyskytuje především na ovsu, můžeme ji najít i na kukuřici, výjimečně také na žitu, ječmeni, pšenici a některých travách. Choroba je sice rozšířená téměř ve všech pěstitelských oblastech ovsa, ale nezpůsobuje hospodářsky významné ztráty na výnosech. Charakteristickými příznaky jsou drobné vodnaté skvrny s chlorotickým prstencem po obvodu (tzv. halo), které můžeme najít na všech nadzemních orgánech, nejčastěji však na listech. Při silném napadení rostlin patogenem skvrny splývají,

17

listy žloutnou a usychají a mnohdy se zkrucují. Infikovaná zrna se zpravidla vyznačují sníženou klíčivostí. Příznaky choroby lze zaměnit s bakteriózami způsobenými jinými patovary druhu P. syringae. Někdy se vyskytne na obilninách bakteriální hnědnutí báze plev, jehož původcem je bakterie P. s. pv. atrofaciens. Patogen napadá většinou pšenici a ječmen. Infikovány bývají báze plev a stébla hostitelských rostlin, což se projevuje zhnědnutím míst postižených bakteriální infekcí. Napadení se na rostlinách šíří hlavně v deštivém počasí v období od počátku metání do konce voskové zralosti. Škodlivost choroby nebývá významná. K dalším bakteriózám na obilninách patří bakteriální pruhovitost, kterou způsobuje bakterie P. s. pv. striafaciens. Patogen škodí na ovsu a na ječmeni. Příznaky napadení se projevují jako podélné žlutohnědé skvrny objevující se na listové čepeli, které později nekrotizují a při silnějším napadení splývají v podélné pruhy. KRYSTALIZAČNÍ AKTIVITA Krystalizační aktivita je vlastnost některých částic iniciovat tvorbu krystalizačních jader umožňujících vznik ledu v podmínkách teplot blízko pod bodem mrazu. Voda se může nacházet v tekutém stavu i při teplotách pod bodem tuhnutí. Změna skupenství nastane ve chvíli, kdy se ledový zárodek neboli krystalizační jádro stane stabilním a volně roste. Tento děj se nazývá krystalizace nebo také nukleace. K homogenní krystalizaci dochází, jestliže při teplotách okolo – 40 oC se molekuly vody začnou spontánně seskupovat do mřížky. Heterogenní krystalizace nastává, jestliže voda s teplotou okolo 0 oC mrzne až po přidání ledu nebo pomocí cizorodých částic, kterými mohou být i některé bakterie. KRYSTALIZAČNĚ AKTIVNÍ ( INA+) BAKTERIE V polovině minulého století se vědci začali zabývat příčinou relativně rychlého vytváření ledových částic v mracích a objevili existenci krystalizačních jader. Zjistilo se, že jedním ze zdrojů nukleace jsou i bakterie, které byly později identifikovány jako bakterie P. syringae. Od té doby bylo identifikováno několik dalších druhů INA+ bakterií jako P. fluorescens, P. viridiflava, Pantoea agglomerans a Xanthomonas campestris. INA+ bakterie se nazývají ty, které se podílejí na nukleaci ledu těsně pod bodem mrazu (tj. do –5 oC). Nukleačně aktivní jsou i jiné organismy, např. houby z rodu Fusarium. Nejrozšířenější INA+ bakterií na světě byla shledána P. s. pv. syrinage. Četnost krystalizačně aktivních kmenů této bakterie je různá na různých hostitelských rostlinách, navíc se v průběhu roku dynamicky mění. Na mandloni, hrušni, ovsu a fazolu byly zjištěny četnější populace k INA+ kmenů bakterií P. s. pv. syringae než např. na bramborách či citrusech. VÝZNAM INA+ BAKTERÍ V ZEMĚDĚLSTVÍ INA+ bakterie mají v přírodě velký význam. Škody způsobované na nadzemních částech rostlin mrazy během vegetace souvisí s četností INA+ bakterií, které jsou přítomny na povrchu rostlinných orgánů. Mrazové poškození jako důsledek výskytu INA+ bakterií bylo poprvé popsáno na rostlinách kukuřice. Zjistilo se, že rostliny inokulované kmeny bakterie P. s. pv. syringae vykazovaly známky mrazového poškození při vyšších teplotách než rostliny bez inokulátu. Lze předpokládat spoluúčast INA+ bakterií na mrazových škodách u odrůd mnoha druhů rostlin náchylných vůči mrazovému poškození při poklesu teplot do –5 až –7 oC, k čemuž dochází často v jarních nebo podzimních měsících. Pokusy na ovsu, kdy na listy rostlin byly inokulovány jak INA+ bakterie, tak kmeny mutované, bez krystalizační aktivity (INA- ) prokázaly, že INA+ bakterie lépe prosperovaly

18

na rostlinách poškozených mrazem, neboť z poškozených buněk mohly lépe využívat živiny než INA- bakterie. INA+ bakterie byly kompetičně schopnější než INA- bakterie. CHARAKTERISTIKA DRUHU P. SYRINGAE Bakterie P. syringae patří do rodu Pseudomonas. Bakteriální buňky mají tvar rovných tyčinek, jsou gramnegativní, aerobní a nesporulující, mohou mít jeden nebo více polárních bičíků. Pseudomonády lze rozdělit na fluorescentní a nefluorescentní, podle toho, zda tvoří na živných půdách chudých na železo pigment fluorescein. Zároveň je pro fluorescentní druhy charakteristické, že na rozdíl od nefluorescentních, jako zdroj uhlíku neakumulují poly-βhydroxybutyrát. Bakterie P. syringae patří k pseudomonádám fluorescentním. DIAGNOSTIKA BAKTERIÍ P. SYRINGAE Diagnostika bakteriálních patogenů obilnin se v obecném principu provádí stejně jako u všech fytopatogenních bakterií. Základem bakteriologického rozboru je podrobné vizuální posouzení příznaků poškození rostlin, případná izolace bakterií přítomných v rostlinných pletivech na živná diferenciační a semiselektivní média a jejich kultivace v čisté kultuře. Při detekci se provádí určení bakterie přímo z rostlinného pletiva bez předchozí izolace. Pro izolaci a kultivaci bakterie P. syringae se používají nejčastěji živná média chudá na železité soli, jako např. médium King B, na nichž bakterie tohoto druhu fluoreskují a tím se odlišují od jiných fytopatogenních i saprofytických bakterií. Kultivace izolátů probíhá v termostatu při teplotě kolem 22 oC. Po izolaci následuje testování izolovaných kmenů bakterií včetně identifikace pomocí fyziologických, chemických, biochemických, imunochemických, molekulárně biologických a biologických testů. Pro každý rod, případně druh byla vypracována strategie identifikace a doporučen soubor vhodných diferenciačních testů, které umožní rychlým a jednoduchým postupem studovaný izolát určit. CHEMICKÉ TESTY Gramovo barvení, KOH test, test oxidázy Z chemických testů se používá pro identifikaci bakterií Gramovo barvení, jehož podstata spočívá v barevném rozlišení grampozitivních (barvitelných) a gramnegativních (nebarvitelných) bakterií. U grampozitivních bakterií se v buněčné stěně zachovává obarvení krystalovou violetí (výsledná barva je modrofialová) a u gramnegativních nikoliv, barva je růžovofialová. P. syringae je gramnegativní bakterie. Jako náhradu nebo doplněk Gramova barvení lze použít test rozpustnosti buněčné stěny, nebo-li KOH test, kdy zjišťujeme, zda je buněčná stěna bakterií lyzovatelná v 3 % roztoku hydroxidu draselného. Jestliže se bakterie lepí na kličku a vytváří provazec slizu, hodnotíme výsledek testu jako pozitivní. V takovém případě se jedná o bakterii gramnegativní a naopak. Bakterie P. syringae je v KOH testu pozitivní. Testem oxidázy se prokazuje schopnost tvorby enzymu diaminoxidázy. Test spočívá v tom, že u bakterií, které obsahují enzym diaminoxidázu dojde v přítomnosti vody a kyslíku k odštěpení aminoskupiny z diamínů za vzniku peroxidu vodíku, což se projeví fialovým zabarvením reakce. Takto se rozlišují v rámci rodu Pseudomonas fytopatogenní druhy, které jsou v testu negativní od druhů nefytopatogenních, které jsou v testu pozitivní. P. syringae je oxidáza negativní bakterie. BIOCHEMICKÉ METODY Biolog Bacteria Mikrobiální identifikační metoda Biolog MicroPlate SystemT M je založena na rozdílném využívání uhlíkatých a dusíkatých látek, umístěných v Biolog destičce jednotlivými

19

taxonomickými skupinami bakterií. Existují dva typy destiček, jedna pro grampozitivní a druhá pro gramnegativní bakterie, které se liší jednotlivými zdroji uhlíku a dusíku. Využívání určité látky testovaným kmenem se projeví zvýšenou respirací, která představuje barevnou reakci vzniklou redukcí tetrazoliové violeti na fialový formazan. Výsledný vzorec reakcí se nazývá bakteriální „metabolický otisk“. Ten je porovnán se vzorovým kmenem v odpovídající databázi pro příslušný druh bakterie. Podobnost vzorců je vyjádřena indexem podobnosti pohybujícím se v intervalu od 0 do 1. Hodnocení se provádí na automatickém přístroji MicroStationT M nebo vizuelně. Po inokulaci Biolog destičky testovaným kmenem bakterie se destička inkubuje v termostatu při odpovídající teplotě a po 24 hodinách se hodnotí. Bakterie P. syringae lze touto metodou spolehlivě identifikovat na úroveň druhu, ale na úroveň patovaru pouze s variabilní spolehlivostí. Je to způsobeno především tím, že metabolické vzorce jednotlivých patovarů jsou příliš podobné, aby je tento test byl schopen jednoznačně určit. SÉROLOGICKÉ A IMUNOCHEMICKÉ METODY Sklíčková aglutinace, ELISA, IF a modifikace Sérologické metody jsou založeny na reakci specifických protilátek s antigenem. Těmito protilátkami jsou nejčastěji imunoglobuliny, které se tvoří v krevním séru obratlovců jako reakce na přítomnost antigenu. Pokud se antigen setká s homologní protilátkou, reakce je pozitivní a projeví se aglutinací antigenu s protilátkou (sklíčková aglutinace) nebo změnou zabarvení reakce (ELISA, IF). Pro test sklíčkové aglutinace se používají polyklonální antiséra o známé citlivosti a specifičnosti. Podstatou imunochemické metody ELISA (imunoadsorpční enzymová reakce) je vizualizace reakce antigenu detekované bakterie s homologní protilátkou, která využívá enzymy (alkalickou fosfatázu aj.) chemicky vázané s imunoglobuliny získanými z antiséra. ELISA destičky se naplní antigenem (bakterie nebo rostlinný homogenát), k němuž se přidá protilátka značená enzymem. Po odstranění přebytku protilátky se přidá substrát enzymu, kterým je p-nitrofenylfosfát. Ten je v případě pozitivní reakce hydrolyzován enzymem na pnitrofenol za vzniku barevné změny reakce. Hodnocení se provádí vizuelně nebo fotometricky na ELISA readeru. U imunofluorescence se k vizualizaci reakce antigenu detekované bakterie s homologní protilátkou využívají barviva, jako např. FITC (fluorescein izothiokyanát). U přímé imunofluorescence se barvivo konjuguje s homologní protilátkou, u nepřímé imunofluorescence s tzv. konjugátem, což je druhá protilátka vázaná na první protilátku. Specifiká reakce antigenu detekované bakterie s protilátkou se projeví žlutozelenou fluorescencí v ultrafialovém světle. Pod mikroskopem je možné posoudit kromě intenzity fluorescence i tvar a velikost bakteriálních buněk. Tato metoda, zvl. nepřímá imunofluorescence, je z důvodu vysoké citlivosti vhodná pro detekci bakterií přítomných v rostlinách ve velmi nízkých koncentracích. Spolehlivost imunochemických testů souvisí s kvalitou použitých protilátek. Monoklonální protilátky jsou vesměs citlivější a specifičtější než polyklonální protilátky. Pro determinaci a detekci patovarů bakterie P. syringae jsou na trhu k dispozici komerční protilátky (Neogen Europe, UK). MOLEKULÁRNÍ METODY Hhybridizace NK, PCR a modifikace, RAPD, RFLP aj. Podstatou hybridizace je spojování komplementárních jednořetězcových úseků DNA. K jejich detekci se používá molekulární tzv. nukleotidová sonda o známé sekvenci. Je to definovaný oligonukleotid nebo polynukleotid připravený z DNA příslušného kmene bakterie. Dot blot (tečková) hybridizace je schopna detekovat homologní sekvence DNA v bakteriích

20

bez purifikace DNA testované bakterie. Determinační test se provádí tak, že suspenze testovaných bakterií se nanese na nitrocelulózovou membránu a poté se inkubuje se značenou sondou. Po odstranění přebytečného množství sondy se výsledek hybridizace hodnotí autoradiograficky nebo kolorimetricky, pokud značení sondy není radioaktivní, ale enzymatické. Podstatou metody PCR (polymerázová řetězová reakce) je amplifikace (zmnožení) specifických sekvencí (úseků) DNA, charakteristických pro danou bakterii, kterou detekujeme. Test je zahájen teplotní denaturací DNA detekované bakterie, poté následuje hybridizace neboli připojení primerů (vzorových nukleotidů charakteristických pro danou bakterii) a nakonec syntéza dvouřetězcové DNA enzymem, kterým bývá teplotně stabilní DNA-polymeráza. To probíhá v prostředí, kde jsou přítomny čtyři deoxynukleotidotrifosfáty. Metoda PCR, která je nejpoužívanější z molekulárních metod, využívá specifické primery, jejichž specifičnost vůči testované bakterii, je mírou spolehlivosti PCR testu. U metody RAPD (analýza náhodně amplifikované polymorfní DNA) jsou profily genomové DNA získány amplifikací PCR pomocí velmi krátkých primerů. Profil amplifikovaných produktů umožňuje rozlišení nejen patovaru, ale i kmenů bakterií. Metoda je velmi rychlá a nevyžaduje předem údaje o genomové DNA a dalších komponentech nezbytných pro test, ale je obtížně reprodukovatelná a tím i optimalizovatelná. RFLP (analýza délkového polymorfismu restrikčních fragmentů) zahrnuje izolaci a purifikaci genomové nebo plazmidové DNA a štěpení DNA pomocí enzymů ve specifických místech na fragmenty různé délky. Rozštěpené fragmenty DNA lze rozdělit agarovou gelovou elektroforézou, neboť se liší různou pohyblivostí v gelu. Lokalizaci fragmentů v gelu je možné vizualizovat barvivem jako je ethidiumbromid. Na elektroforeogramech lze rozeznat spektrum pruhů (RFLP-profil), které odpovídají fragmentům různé délky. To umožní porovnat testované a referenční kmeny bakterií. Analyzuje se zpravidla jen část genomu, protože při analýze celého genomu by fragmentů bylo příliš mnoho a vyhodnocení denzitometrem by bylo velmi obtížné. Proto se používají jen sondy, které umožňují zviditelnit ty fragmenty, které se sondou hybridizují. Nejznámější je tzv. Southernova hybridizace, kdy se denaturovaná DNA přenáší z gelu na membránový filtr, na kterém hybridizuje s komplementární sekvencí NK. Metoda RFLP sice umožňuje rozlišení bakterií nejen na úroveň druhu, patovaru, či kmenů, ale je relativně složitá, finančně nákladná, pracná a časově náročná. Molekulární metody patří k nejcitlivějším metodám, které umožňují detekci bakterií v rostlinných pletivech ve velmi nízkých koncentracích. Metodou PCR je možné detekovat patovary bakterie P. syringae pomocí specifických primerů. BIOLOGICKÉ TESTY (TESTY PATOGENITY) HR test na rostlinách tabáku, test patogenity na hostitelských rostlinách Test hypersenzitivity (HR) umožňuje rozlišení fytopatogenních hostitelsky specializovaných bakterií (P. syringae pv. tabaci), vyvolávajících příznaky onemocnění, od hostitelsky nespecializovaných bakterií (fytopatogenní druhy Pseudomonas a Erwinia), které vyvolávají hypersenzitivní reakci. Saprofytické bakterie nezpůsobují žádné příznaky. Hypersenzitivní reakce je charakteristická tím, že do 24 hodin po aplikaci bakteriální suspenze do listů tabáku se objeví ohraničená nekróza, zatímco při normální infekci dochází v průběhu několika dnů k postupné neohraničené nekrotizaci rostlinných pletiv. HR test je nejběžnější z testů používaných k rozlišení fytopatogenních a saprofytických pseudomonád. Bakterie P. s. pv. syringae a další patovary rostlinná pletiva tabáku nekrotizují, zatímco nefytopatogenní pseudomonády nezpůsobují na rostlinách tabáku žádné příznaky. Testy patogenity na hostitelských nebo indikátorových rostlinách napodobují přirozenou infekci. Používají se pro potvrzení určené bakterie, prověření patogenity a stanovení virulence

21

kmenů. Umělé infekce rostlin jsou důležité i při stanovení hladiny rezistence druhů a odrůd rostlin a při testování účinnosti přípravků na ochranu rostlin. Úspěšnou infekci docílíme použitím mladých vitálních rostlin vysoce náchylné odrůdy, patogenními a virulentními bakteriemi a zabezpečením vhodných vnějších podmínek prostředí (optimální teplota, vysoká relativní vzdušná vlhkost) umožňujících rozvoj choroby a projev příznaků napadení. Optimální koncentrace bakteriální suspenze pro inokulaci bývá zravidla 106-8 cfu/ml (bakteriálních buněk v ml). Fytopatogenní pseudomonády způsobující listové nekrózy, mezi něž patří P. syringae, často pronikají do rostlin průduchy a stejně jako další fytopatogenní bakterie také po poranění rostlin. Listové skvrnitosti a spály je možné vyvolat aplikováním bakterií formou postřiků na zdravé nebo poraněné listy, vakuovou infiltrací či injikací rostlinných pletiv. Pro infekce P. s. pv. syringae a dalších patovarů se u obilnin nejčastěji používají postřiky nebo vakuová infiltrace na listy rostlin předem poraněné, např. zdrsnělé karborundem. Listové čepele jsou u obilnin pokryty voskovými substancemi kutikuly, které je chrání před proniknutím bakterií do rostlinných pletiv, proto je pro úspěšnou infekci důležité, aby byly listy před inokulací bakteriemi předem poraněny. K důkazu bakterie P. s. pv. syringae je také možné použít mladé nezralé plody peckovin, např. třešně nebo višně. Plody inokulované injikací bakteriální suspenze se umisťují do prostředí vysoké relativní vzdušné vlhkosti. Příznaky napadení se projeví tvorbou zelených vodnatých nebo hnědočerných skvrn, které se tvoří kolem místa vpichu do týdne po inokulaci. KRYSTALIZAČNÍ AKTIVITA Krystalizační aktivita testovaných bakterií se zjišťuje diferenční termickou analýzou, která měří začátek tvorby ledových krystalů suspenze obsahující bakteriální buňky. Metoda využívá rozdílu teplot termočlánků srovnávacího a zkoumaného vzorku, které vzniká uvolněním latentního tepla ze vzorku při přeměně z kapalného do tuhého skupenství. Měření probíhá v termobaterii s termočlánky, na něž jsou aplikovány kapky testované bakterie o určité koncentraci. Termobaterie se postupně zchlazuje v kryostatu o 1 °C za jednu minutu do doby, než zmrznou všechny kapky. Průběh krystalizace je zaznamenán počítačem. V naší laboratoři je krystalizačně aktivní sbírkový kmen P. s. pv. syringae CCM 4073 vyvolávající tvorbu ledových krystalů při teplotách –5 až –3 oC používán jako pozitivní kontrola v srovnávacích testech. Mezi izoláty pocházejícími z obilnin, hrachu, peckovin a obilnin jsme našli kmeny krystalizačně aktivních bakterií P. s. pv. pisi a pv. syringae, které nukleovaly v rozmezí teplot –4 až –6 oC. UCHOVÁNÍ BAKTERIÁLNÍCH KULTUR Určené kmeny bakterií se dlouhodobě uchovávají při teplotách hluboko pod bodem mrazu (v tzv. mikrobankách při -60 až –80 oC v hlubokomrazícím boxu), v tekutém dusíku nebo jako lyofilizáty.

Výzkum byl podporován úkolem: 3205305

22

Diagnostika a hodnocení půdních fytopatogenních hub rodu Fusarium. (Posuny v houbovém spektru po aplikaci biopreparátů při pěstování jarního ječmene). Josef Hýsek, Milan Vach Výzkumný ústav rostlinné výroby, Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně E-mail: [email protected] Houby rodu Fusarium jsou významnými podmíněně patogenními houbami, které jsou přenášeny půdou a větrem a za vhodných podmínek působí choroby obilnin. Většina druhů produkuje mykotoxiny trichothecenového typu jako jsou deoxynivalenol (DON), diacetoxyscirpenol (DAS), nivalenol (NIV), T-2 toxin, HT-2 toxin a další, které kontaminují potraviny. Druhy rodu Fusarium mohou též produkovat zearalenon, což je toxická látka podobné chemické struktury jako jsou steroidní hormony. Druhy rodu Fusarium přežívají v půdě zvláště na rostlinných zbytcích a to jednak na zbytcích různých plevelů, ale i na zbytcích obilnin. Zajímavým druhem rodu Fusarium je Fusarium oxysporum, které vytváří velkou škálu specifických forem (formae specialis) patogenních pro specifické rody (druhy) rostlin neboli různé patotypy. Některé patotypy vytvářejí typické rasy, které jsou patogenní pouze pro určité kultivary (odrůdy), podle nichž mohou být diferencovány. Tato specializace jednotlivého druhu je v naprostém kontrastu k ostatním druhům rodu Fusarium, u kterých nebyly specifické formy a rasy vůbec popsány. Fusarium oxysporum je nejčastějším druhem rodu Fusarium izolovaným v našich zemědělských půdách. Je v půdě na začátku pokusů s biopreparáty a jeho počet v půdě se vlivem biopreparátů snižuje, ne však v takové míře jako počet ostatních patogenních fuzárií (Fusarium culmorum, F. graminearum, F. avenaceum). Počet patogenních fuzárií klesá vlivem biopreparátů asi o polovinu jejich celkového počtu. Proto je napadení kořenů jarního ječmene nižší a výnos se zvýší. V naší práci jsme chtěli poukázat zvláště na tuto skutečnost, která je svým způsobem nová. K uvedenému jevu došlo na všech pokusných plochách ošetřených biopreparáty. Z našich pokusů vyplývá, že antagonistické mikroorganismy (Trichoderma harzianum, Bacillus subtilis) nepotlačují růst uvedené houby v takové míře jako růst patogenních fuzárií. Význam mikroskopické houby Fusarium oxysporum byl vyzdvižen na evropském semináři o rodu Fusarium konaném ve dnech 19. - 22. září 2006 v holandském Wageningen. Byly tam zhodnoceny nové metody identifikace houby v xylemu rajčat (Houterman et al., 2006), genetické vztahy mezi patogenními a nepatogenními populacemi F. oxysporum (Edel-Hermann, 2006) a další. Formae specialis jsou stanovovány dosud podle zjištěného hostitele. Neexistuje dosud molekulární metoda na identifikaci speciální formy houby Fusarium oxysporum v nepřítomnosti hostitele, v úvahu by přicházelo např. porovnání DNA hostitele a DNA patogenní houby (Mee-Soh et al., 2006), zda jsou některá specifická společná řazení bazí nebo zda je možná komplementární tvorba proteinů. To však dosud nebylo ve světě rozpracováno a je to pouze možné řešení. Obecně lze říci, že se komunity mikromycet mění např. v průběhu dekompozice listového opadu (Osono, 2006) a tedy i během půdního procesu. MATERIÁL A METODY Použili jsme biopreparáty Ibefungin (založený na bázi bakterie Bacillus subtilis) a Supresivit (založený na bázi houby Trichoderma harzianum). Jarní ječmen byl přihnojován síranem amonným a biopreparáty byly aplikovány na povrch osiva jarního ječmene, jednak jako mořidlo. V kontrole nebyl pozemek hnojen ani ošetřován. Z půd jednotlivých variant jsme připravili půdní výluhy (1g půdy v 1 litru sterilní destilované vody). 1 ml suspenze jsme odpipetovali na dno sterilních Petriho misek, které jsme přelili chladnoucím agarem (sladinkovým nebo bramborovým). Petriho misky jsme inkubovali při 20 0C po dobu 10 dnů.

23

Po 10 dnech jsme provedli kvalitativní a kvantitativní mikroskopické určení kolonií hub. Určování hub bylo prováděno klasickou morfologickou mikroskopickou diagnostikou (měření velikosti konidií, konidioforů, chlamydospor atd.). ´ VÝSLEDKY A DISKUSE V kontrolní variantě bez hnojení síranem amonným docházelo po zasetí k vzestupu patogenních hub rodu Fusarium (F. culmorum, F. graminearum, F. avenaceum, F.sambucinum, F. poae, F. tricinctum) a nepatogenního velmi pleomorfního druhu F. oxysporum. Kmen houby F. oxysporum, jediný ze skupiny rodu Fusarium, vlivem biopreparátů Supresivit (účinná houba Trichoderma harzianum) a Ibefungin (účinná bakterie Bacillus subtilis), kolísal v zastoupení v půdě (Tab. 1). Tab.1. Procento výskytu mikroskopických hub ve sledovaných vzorcích během vegetační doby obilnin po ošetření biopreparáty. ošetření Ibefunginem před setím 1 měsíc po setí 2 měsíce po setí konec vegetace Fusarium oxysporum 20 25 25 40 Fusarium culmorum 3 10 10 10 Fusarium graminearum 3 10 15 10 Fusarium sambucinum 3 10 15 10 Fusarium avenaceum 3 10 10 10 Fusarium tricinctum 3 10 10 10 Fusarium poae 3 10 10 10 Aspergillus spp. 3 3 3 10 Paecilomyces spp. 10 8 8 10 Acremonium spp. 20 8 8 10 Humicola spp.to 5 5 5 5 Penicillium spp. 20 15 15 50 Verticillium sp. 5 5 5 5 ošetření Supresivitem před setím 1 měsíc po setí 2 měsíce po setí konec vegetace Fusarium oxysporum 20 25 25 40 Fusarium culmorum 3 15 10 10 Fusarium graminearum 3 15 10 10 Fusarium sambucinum 3 10 10 10 Fusarium avenaceum 3 15 10 10 Fusarium tricinctum 3 15 10 10 Fusarium poae 3 15 10 10 Aspergillus spp. 3 3 3 10 Paecilomyces spp. 10 8 8 10 Acremonium spp. 20 8 8 10 Humicola spp.to 5 5 5 5 Penicillium spp. 20 15 15 50 Verticillium sp. 5 5 5 5 kontrola před setím 1 měsíc po setí 2 měsíce po setí konec vegetace Fusarium oxysporum 20 25 25 20 Fusarium culmorum 3 25 25 25 Fusarium graminearum 3 25 30 25 Fusarium sambucinum 3 15 20 20 Fusarium avenaceum 3 20 25 20 Fusarium tricinctum 4 20 25 20 Fusarium poae 3 15 20 20

24

Aspergillus spp. Paecilomyces spp. Acremonium spp. Humicola spp.to Penicillium spp. Verticillium sp.

3 10 10 5 20 5

3 10 10 5 20 5

3 10 10 5 20 5

10 10 10 5 20 5

Z uvedeného výčtu jednotlivých mikroskopických hub je patrné, že jediný druh rodu Fusarium, který není ovlivněn biopreparáty je druh F. oxysporum. Ostatní druhy rodu Fusarium jsou ovlivněny téměř stejně, jsou potlačeny vlivem biopreparátů Supresivit a Ibefungin. Z literatury je patrné, že uvedený druh má velký význam při patogenezi různých rostlin. V půdě se však chová oproti dalším patogenním houbám anomálně, neboť na něho dosud používané biopreparáty (Ibefungin, Supresivit) nepůsobí v takové míře. LITERATURA EDELl-HERMANN V., GAUTHERON N., ALABOUVETTE C., KLEIN K., STEINBERG Ch. (2006): Genetic relationships among nonpathogenic populations of Fusarium oxysporum. Book of Abstracts. European Fusarium Seminar, 19 - 22 September 2006, Wageningen, the Netherlands, p.47. HOUTERMAN P.M., SPEIJER D., DEKKER H.L., VAN DER DOES, MEIIJER M., CORNELISSEN B.J.C., REP M (2006).: A proteomic approach to identify proteins secreted by Fusarium oxysporum in xylem sap of tomato. Book of Abstracts. European Fusarium Seminar, 19 - 22 September 2006, Wageningen, the Netherlands, p. 65. MEE-SOH KIM I., STEWART J.E., JAMES R.L., DUMROESE R.K., KOPFENSTEIN N.B. (2006): Molecular chracterization of Fusarium commune and F. oxysporum from conifer nursery. 8th International Mycological Congress, 21 - 25 August 2006, Cairns Convention Centre, Quensland, Australia, Congress Handbook and Abstracts Book 1, p. 60. OSONO T. (2006): Changes in microfungal communities during decomposition of leaf litter. 8th International Mycological Congress, 21 - 25 August 2006, Cairns Convention Centre, Quensland, Australia, Congress Handbook and Abstracts Book 1, p. 350.

Výsledky uvedené v tomto příspěvku jsou součástí řešení výzkumného záměru MZE ČR: 0002700601 a 0002700603 financovaného MZE ČR.

25

Molekulárně-genetická analýza aecií na rodu Ranunculus. Markéta Hejná, Miroslav Kolařík, Jaroslava Marková Katedra botaniky Přírodovědecké fakulty, Univrzita Karlova v Praze, Benátská 2, 128 01 Praha 2 E-mail: [email protected]

Klasifikace rzí (Uredinales) vycházející ze znalostí o fylogenetickém vývoji byla postavena na morfologických znacích všech typů ložisek a spor, na charakteru životního cyklu a na specializaci k hostitelským druhům rostlin. Pro objektivní posouzení příbuzenských vazeb u mnoha skupin rzí (včetně travních) však nemusí být morfologické znaky dostačující. Fyziologická a ekologická variabilita v rámci jednotlivých druhů, mnohdy široce pojatých, je dosud málo prozkoumána. Jednou z málo prostudovaných skupin jsou heteroecické rzi, které mají jarní ložiska na druzích rodu Ranunculus (včetně rodu Ficaria). Takovými jsou Puccinia magnusiana Koern., Puccinia perplexans Plowr., Uromyces dactylidis Otth, Uromyces festucae Sydow, Uromyces poae Rabenh. a Uromyces poaealpinae W. Rytz. Životní cykly jsou sice víceméně objasněny, ale bez infekčních pokusů nelze aecia jednoznačně přiřadit k příslušnému druhu. Nálezy aecií na pryskyřnících proto často zůstávají blíže neurčeny pod názvem Aecidium ranunculacearum DC. Tato studie je zaměřena na molekulární techniky, které se stále více prosazují jako významný zdroj informací a předpokládá se jejich využití při určování druhů i studiu příbuzenských vazeb v této skupině rzí. Použití molekulárních metod umožňuje charakterizovat rozdíly na úrovni druhové i vnitrodruhové (Zambino et Szabó 1993, Smith et al. 2004, aj.) a také studovat fylogenetické vztahy na úrovni mezirodové (Maier et al. 2003). Cílem práce je vytvořit metodu, která na základě srovnání DNA aecií s DNA ze spolehlivě určených telií umožní jednoznačné přiřazení aecií k určitému druhu a objasnění vzájemných příbuzenských vztahů. Ke srovnání dvou genomů (z neznámých aecií a spolehlivě určených telií) lze použít metody multilokusového PCR-fingerpringu, které jsou vhodné, díky rychlosti a nízké ceně pro rutinní použití. Často je využívaná metoda RAPD (random amplified polymorphic DNA). Tato metoda je schopna pracovat s DNA z jednoho jarního ložiska i s příměsí cizorodé DNA (Edwards et al. 1999, Villaréal et al. 2002). Druhou možností je studium jednotlivých genů. U rzí je nejčastěji používaná rDNA oblast kódující ribozomální RNA. Pomocí specifických primerů, které preferují rDNA rzí, lze zpracovat i malé množství kontaminované DNA (Driessen et al. 2004). Získané úseky rDNA (ITS oblast, 28S rDNA) lze charakterizovat sekvenací, či rychleji metodou RFLP (restriction fragment length polymorphism). Tato metoda štěpí získaný PCR fragment pomocí restrikčních endonukleáz v sekvenčně specifické pozici za vzniku různě dlouhých restrikčních fragmentů, tedy tak zvaného RFLP fingerprintu. Pokud má daná rez druhově specifikou rDNA (s minimální vnitrodruhovou variabilitou) pak lze najít vhodný restrikční enzym na její odlišení od druhů ostatních. Správný enzym rozlišující jednotlivé druhy lze najít porovnáním jejich sekvencí. Z toho plyne, že k typování pomocí metody RFLP je třeba nejprve sekvenovat rDNA všech druhů tvořících anamorfu Aecidium ranunculacearum, ale i jedince z více populací od každého z těchto druhů. Pro zjišťování diverzity na úrovni mezidruhové či vnitrodruhové lze tedy použít metodu RAPD (Pei et al. 1997, Kolmer et Liu 2000), RFLP (Kinloch et al. 1998, Driessen et al. 2004) nebo sekvence ITS (Zambino et Szabo 1993, Anikster et al. 2004, Smith et al. 2004), případně

26

IGS oblastí (Moricca et Ragazzi 1998). Často je používána kombinace RAPD metody a porovnávání ITS oblastí (Edwards et al. 1999). IZOLACE DNA U RZÍ Izolovat DNA je možné z materiálu čerstvého, suchého, dokonce i staršího víceletého. Pro izolaci je vhodné vypreparovat z ložisek pouze spory, ale lze použít i celá ložiska, dokonce i části listu s ložiskem. K extrakci DNA ze spor rzí se nejčastěji používá různě modifikovaná metoda CTAB. Je možné také využít komerčně vyráběných izolačních kitů např. Plant DNeasy mini kit (Qiagen Inc., Valencia, California). Cílem práce je zvolit takový postup, který nebude příliš náročný, protože by měl sloužit pro rutinní identifikaci, ale bude bezpečně fungovat pro izolaci DNA z aecií, uredií i telií. Je nutné získat z aecií takovou DNA, aby mohla být následně porovnána s DNA izolovanou z uredií či telií. Základ tvoří několik metod. Z práce Zambino et Szabo (1993) bylo převzato zejména složení extrakčního pufru. Způsob drcení byl převzat z práce Anikster et al. (2004). Nejprve byla vypreparována celá ložiska a jednotlivě vložena do mikrozkumavek se 100μl extrakčního pufru (0,089 M Tris, 0,045 M kyselina boritá, 0,05 μM EDTA, 1% βmerkaptoetanol). Následně bylo přidáno několik 1 mm velkých skleněných kuliček a mikrozkumavky třepány na vortexu ve vodorovné poloze zprvu 5 min., ale po prvních zkušenostech byla tato doba prodloužena na 10 min. Po drcení následuje inkubace. Původně bylo v plánu použít inkubaci podle Zambino et Szabo (1993) tj. 15 min. při 75°C, tento postup byl ale neúspěšný a proto byla postupně zvyšována teplota i doba inkubace. Nakonec se ukázala jako optimální teplota 90-95°C po dobu 20 min. Takto připravenou DNA je možné, bez dalších úprav, použít na PCR amplifikaci. Bez větších změn vydrží zamrazená při –20°C minimálně dva měsíce, poté se její vlastnosti postupně zhoršují. VYUŽUŤÍ RDNA PŘI STUDIU RZÍ rDNA se vyskytuje v genomu repetitivně, několikrát za sebou. Celková délka repetice bývá v rozmezí 8-24 kb. Je snadno dosažitelná pomocí univerzálních primerů (White et al. 1990). Velká podjednotka rDNA (LSU rDNA, 28S rDNA) je poměrně konzervativní úsek, který se často využívá při studiích na vyšší taxonomické úrovni. Nicméně i v této podjednotce se nachází velmi variabilní úseky, ve kterých lze najít odlišnosti mezi jednotlivými velmi příbuznými druhy (Maier et al. 2003). Oblasti ITS a IGS mají větší variabilitu a liší se i mezi sesterskými druhy a často umožňují odlišit i vnitrodruhové taxonomické jednotky, populace, fyziologické rasy atd. (White et al. 1990, Szabo 2006). Pro naše účely byla zvolena oblast ITS, která se nejčastěji používá a je zde tedy možnost srovnání se sekvencemi předešlých autorů. OPTIMALIZACE PCR REAKCE Výhodou PCR je její nenáročnost a to, že funguje i s velmi malým vstupním množstvím DNA (už od 0,1-10 ng na jednu reakci), zatímco produktu reakce získáme množství poměrně velké. PCR obvykle bývá potřeba optimalizovat zvlášť pro každou skupinu organismů. Je nutné zjistit nejvhodnější koncentraci vstupní DNA, vybrat vhodné primery, popřípadě zjistit optimální teplotu jejich nasedání.

27

Pro hledání vhodných primerů a koncentrace templátové DNA byl použit jednotný postup PCR amplifikace. Reakční směs (pro objem 25 μl) byla: 2,5 μl DynaZyme pufr 10x, 2,5 μl 2 mM dNTP’s, 2 μl každý primer (10 pM/μl), 0,5 μl DynaZyme polymerázy, 15 μl H2O, 2-4 μl DNA. Teplotní cyklus reakce byl: počáteční denaturace 3 min. při 95°C, 30 cyklů s denaturací při 95°C po dobu 30s., teplotou nasedání primerů 55°C 30s. a polymerací při 72°C 1 min. Na závěr inkubace 10 min. při 72°C. Všechny PCR reakce byly prováděny v termocykleru Mastercycler Gradient (Eppendorf AG, Cologne Hamburg, Germany). Získaný PCR produkt byl elektroforeticky zviditelněn na 1% agarózovém gelu. Agarózový gel byl připraven rozvařením 0,7 g agarózy v 70 ml 1x TBE (tris-borate-EDTA) pufru, poté byl přidán etidiumbromid. Po ztuhnutí gelu následovalo nanesení vzorků (společně s trochou nanášecího roztoku) do studniček gelu, vloženého do elektroforetické vaničky. Elektroforéza probíhala cca ½ hodiny při napětí 135 V. Na základě informací z literatury a zkušeností v laboratoři byly vybrány čtyři různé kombinace primerů. ITS 4 + 5 (Zambino et Szabo 1993), ITS 1 + 4 a ITS 1 + 4S pro amplifikaci ITS oblastí a primery NL1 + NL4 (Maier et al. 2003) pro amplifikaci LSU rDNA. Tyto kombinace byly následně testovány. Po zviditelnění na elektroforéze (výsledky shrnuty v tabulce č. 1) bylo vidět, že nejvhodnější je kombinace primerů ITS 4 + ITS 5. Dále bylo nutné optimalizovat koncentraci použité DNA. Bylo testováno ředění 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:5000 a 1: 10000. Výsledky pokusů se třemi různými DNA jsou znázorněny na obrázku č. 1. Použitelná je tedy pouze DNA ředěná 1:50 a 1:100, ostatní ředění nepřinesla žádné výsledky. Materiál

DNA z aecií 05/1 100x ředěná

Kontrolní DNA

Primery

DNA z aecií 05/1 500x ředěná

ITS1 + ITS4 ITS4 + ITS5 ITS1 + ITS4S NL1 + NL4

0 2 0 1

0 2 0 1

2 2 2 2

Tabulka 1. Výsledky testování různých kombinací ITS primerů.0 = reakce neproběhla, 1-2 = síla fragmentu (množství získané DNA). Obr. 1. Výsledky testování různých ředění na třech vzorcích DNA. Zleva postupně u všech tří vzorků ředění 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:5000, 1:10000. Za první sérií je navíc nanesena kontrolní DNA.

28

Další optimalizací měla být úprava teploty pro nasedání primerů. Pomocí programu ITS gradient byla na 12 shodných vzorcích vyzkoušena teplota nasedání primerů v rozmezí 5065°C. PCR reakce ale proběhla ve všech vzorcích v podstatě bez rozdílu. SEKVEACE ITS OBLASTÍ Amplifikovaný fragment ITS oblastí byl přečištěn pomocí soupravy WizardTM DNA Clean Up, dle návodu přiloženého k soupravě. DNA byla servisně osekvenovaná firmou Macrogen. Zatím byly získány ITS rDNA sekvence ze čtyř vzorků v délkce 580-620 bp. Dle podobnosti k sekvencím z databáze GenBank se jedná o zatím nesekvenované druhy rzí (94% podobnost sekvencí s Puccinia persistens). Druhové určení tedy bude možné až srovnáním se sekvencemi spolehlivě určených teliových stadií. K sekvenování bylo nezbytné použít oba primery a sekvenovat tedy oba komplementární řetězce. Důvodem je motiv v ITS2, složený z úseku cca deseti cytosinů a deseti thyminů, které patrně tvoří smyčku a výsledky sekvenační reakce se dále stávají nekvalitními. ZÁVĚR Byla nalezena metoda izolace, její efektivnost není vždy stejná a proto se bude souběžně hledat metoda další. Dosavadním výsledkem práce je zjištění, že pro ITS amplifikaci DNA rzí je vhodná kombinace primerů ITS4 + ITS5, které jsou schopny nasedat v širokém rozmezí teplot (5065°C). Koncentrace DNA vstupující do reakce musí být poměrně velká (vhodná jsou ředění 1:50 až 1:100). V blízké budoucnosti se předpokládá také použití primerů specifických pro rzi RUST 1-3. LITERATURA ANIKSTER Y., SZABO L. J., EILAM T., MANIATERSKI J., KOIKE S. T., BUSHNELL W. R. (2004): Morphology, life cycle biology, and DNA sequence analysis of rust fungi on garlic and chives from California. Phytopathology 94: 569-577. DRIESSEN S. A., O’BRIEN P. A., HARDY J. (2004): Diversity of Puccinia boroniae assessed by teliospore morphology and restriction fragment patterns of ribosomal DNA. Australasian Plant Pathology 33: 77-82. EDWARDS J., ADES P. K., PARBERY D. G., HALLORAN G. M., TAYLOR P. N. J. (1999): Morphological and molecular variation between Australasian isolates of Puccinia menthae. Mycol. Res. 103: 1505-1514. KINLOCH B. B., WESTFALL R. D., WHITE E. E., GITZENDANNER M. A., DUPPER G. E., FOORD B. M., HODGSKISS P. D. (1998): Genetics of Cronartium ribicola. IV. Population structure in western North America. Can. J. Bot. 76: 91-98.

29

KOLMER J. A., LIU J. Q. (2000): Virulence and molecular polymorphism in international collections of the wheat leaf rust fungus Puccinia triticina. Phytopathology 90: 427436. MAIER W., BEGEROW D., WEIβ M., OBERWINKLER F. (2003): Phylogeny of the rust fungi: an approach using nuclear large subunit ribosomal DNA sequences. Can. J. Bot. 81: 12-23. MORICCA S., RAGAZZI A. (1998): Use of RFLP and SSCP analysis to differentiate the pine rusts Coronartium flaccidum and Peridermium pini. Mycol. Res. 102: 666-670. PEI M. H., WHELAN M. J., HALFORD N. G., ROYLE D. J. (1997): Distinction between stem- and leaf- infecting forms of Melampsora rust on Salix viminalis using RAPD markers. Mycol. Res. 101: 7-10. SMITH J. A., BLANCHETTE R. A., NEWCOMBE G. (2004): Molecular and morphological characterisation of the willow rust fungus, Melampsora epitea, from arctic and temperate hosts in North America. Mycologia 96: 1330-1338. SZABO L. J. (2006): Deciphering species complex: Puccinia andropogonis and Puccinia coronata, examples of differing modes of speciation. Mycoscience. 47: 130-136. VILLARÈAL L. M. M. A., LANNOU Ch., C. de VALLAVIEILLE- POPE, NEEMA C. (2002): Genetic variability in Puccinia striiformis f. sp. tritici populations sampled on a local scale during natural epidemics. Apl. Environ. Microbiol. 68: 6138-6145. WHITE T. J., BRUNS T., LEE S., TAYLOR J. (1990): Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A guide to methods and Applications. Academic Press, San Diego, CA. p. 315-322. ZAMBINO P. J., SZABO L. J. (1993): Phylogenetic relationships of selected cereal and grass rusts based on rDNA sequence analysis. Mycologia 85: 401-414.

30

Správná diagnostika, hodnocení a pochopení chorob rostlin je možná jedním z předpokladů získání úsměvných produktů

Eva Přibylová 2004

31