Základy imunologických metod:
Precipitační a aglutinační reakce
Ústav imunologie 2.LF UK a FN Motol
Metody, ve kterých se používají protilátky Neznačený antigen/protilátka • Precipitace • Aglutinace Značený antigen/protilátka • Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) • Radioimmunoassay (RIA) • Western blotting • Immunofluorescence • Průtoková cytometrie
Citlivost imunochemických metod precipitace - 30 mg/ml
aglutinace - 1 mg/ml
nefelometrie – 0,1 mg/ml
radioimunoassay, ELISA - 1 pg/ml
Imunoprecipitační křivka
Charakteristická křivka vyjadřující závislost tvorby imunoprecipitátu na množství antigenu, přidávaného ke konstantnímu množství protilátky
Oblast nadbytku protilátky • se zvyšujícím se množstvím antigenu vzrůstá precipitát. Na všechna vazebná místa antigenu jsou navázány protilátky. Výsledkem je vznik malých rozpustných komplexů antigenu a protilátky, které se vzájemně nepropojují. V supernatantu neprokazujeme žádný antigen. • V oblasti nadbytku protilátky je množství komplexu antigen-protilátka úměrné koncentraci přítomného antigenu. Tyto reakční poměry se využívají u imunoturbidimetrie a imunonefelometrie a nekompetitivních imunoanalýz.
Oblast ekvivalence • dochází k vzájemnému propojování molekul antigenu a protilátky a tím vznikají velké nerozpustné imunokomplexy s mřížkovitou strukturou, které agregují a vytvářejí imunoprecipitát. V supernatantu neprokazujeme volný antigen ani volnou protilátku • Dosažení ekvivalence se používá u imunodifúzních metod.
Oblast nadbytku antigenu • množství precipitátu klesá v důsledku vysoké koncentrace antigenu. Velké vzájemně propojené imunokomplexy se rozpadají. Všechna vazebná místa protilátek jsou vysycena antigenem a některé molekuly antigenu zůstávají bez navázané protilátky. Vznikají malé rozpustné imunokomplexy. V supernatantu nejsou přítomny volné protilátky, ale vzestupné množství volného antigenu. • Podmínka nadbytku antigenu musí být splněna u kompetitivních imunoanalýz.
Precipitační reakce Imunoprecipitační křivka je základem pro různé imunochemické metody, které mohou být prováděny v gelu nebo v roztoku Flokulační : postupné ředění jedné z reagujících složek ve zkumavce Řada metod založených na měření stupně zákalu – turbidity Turbidimetrie - optická metoda založená na měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích Nefelometrie měří rozptýlené (tzv. Tyndallovo) světlo , které vychází z roztoku všemi směry a měří se pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření.
Precipitační reakce v gelu Imunodifuzní (ID) : ředění se dosahuje difuzí do prostředí gelu Jedna z nejstarších imunologických metod, dnes ji nahrazuje nefelometrie Velká pracnost, nízký rozsah měření a časová náročnost (až 48 h)
Imunoprecipitační metody v gelu: •Radiální imunodifuze •Dvojitá difuze •Imunoelektroforéza
Radiální imunodifuze Protilátka je rozpuštěná v gelu; Ag je přidán do jamek Měření koncentrace různých sérových proteinů, např. hladiny imunoglobulinů
Dvojitá difuze Ab a Ag difundují proti sobě • • • •
Stanovení homogenity systému antigen-protilátka Diagnostika specifických autoimunitních onemocnění Používáno následně po purifikaci směsi antigenů Hledání reakcí mezi serologicky příbuznými antigeny
Identické
Neidentické
Částečně identické
Dvojitá imunodifuze Ouchterlony
Örjan Ouchterlony Vyvinul techniku dvojité imunodifuze v roce 1948
Dvojitá difuze (Ouchterlony)
Dvojitá difuze
Dvojitá difuze
Dvojitá difuze
Imunoelektroforéza Kombinace separace antigenů elektroforézou s identifikací pomocí dvojité difuze detekce přítomnosti nebo absence proteinu v séru
Imunofixační elektroforéza (IFE) • Stále používaná metoda pro stanovení monoklonální gamapatie a typu Ig řetězců • Monoklonální gamapatie je onemocnění, při kterém jeden klon plazmatických buněk produkuje vyšší hladiny protilátky – tato protilátka má těžký řetězec jednoho typu a jeden idiotyp (nazývá se paraprotein nebo M-protein) • Po elektroforetické separaci proteinů vyšetřovaného séra se na gel nanesou protilátky anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti kappa a anti lambda
Imunofixační elektroforéza (IFE)
Raketková imunoelektroforéza Antigen je podroben elektroforéze v gelu obsahujícím protilátku Vzdálenost od startovací jamky k vrcholu raketky odpovídá koncentraci antigenu
Aglutinační reakce Ab + částicový Ag
Aglutinace (shlukování)
Nenáročná, rychlá a levná metoda, ale: Aglutinují pouze protilátky třídy IgG a IgM Nevýhodou je nízká citlivost (0,2 – 2 µg/ml) Částice s navázanou protilátkou mají tendenci se při skladování shlukovat
• Přímá aglutinace • Pasivní aglutinace • Inhibice aglutinace
Přímá aglutinace • •
Ag je přirozenou složkou částice Např. testování pacientova séra na přítomnost protilátek proti určité bakterii: –
Pacientovo sérum je sériově ředěno do zkumavek s danou bakterií. Poslední zkumavka s viditelnou aglutinací určuje titr protilátky v séru
Přímá aglutinace • Stanovení protilátek proti erytrocytům • Erytrocyty: negativně nabité (zeta potenciál), může být ovlivněna agluginační reakce (zejména IgG protilátky) • Řešení: Coombsův test - použití anti imunoglobulinového séra
Příklad: detekce anti-Rh protilátek v krvi Rh- matek
Coombsův Test • Přímý: přidá se protilátka proti lidskému imunoglobulinu (Coombsovo činidlo) k červeným krvinkám. Aglutinace se objeví, pokud jsou erytrocyty pokryty protilátkami • Nepřímý: inkubuje se testované sérum s erytrocyty zdravého dárce. Po promytí se přidá Coombsovo činidlo • stanovení Rh protilátek • diagnostika získané hemolytické anémie - průkaz volných antierytrocytárních protilátek v plazmě (séru)
Přímý a nepřímý Coombsův test
Měření vázané protilátky
Měření sérové protilátky
Pasivní aglutinace • Aglutinace mezi protilátkou a solubilním antigenem vázaným na nesolubilní částici (latexová částice) • Mnohonásobné zvýšení citlivosti oproti precipitační reakci • Diagnostika autoprotilátek u autoimunitních onemocnění – Diagnostika autoimunitní thyroitidy: Thyroglobulin je připojen k latexové částici a je použit k detekci anti-thyroidních protilátek v séru pacienta - Diagnostika revmatoidní artritidy
Inhibice aglutinace • velmi citlivá metoda, umožňující detekci malých množství antigenu. Ag je navázán např. na latexové partikule a v testu je přítomná protilátka proti tomuto Ag, která aglutinuje. • Přítomnost totožného Ag ve zkoumaném vzorku inhibuje aglutinaci, protože tento Ag obsadí vazebná místa Ab. • Průkaz užívání drog (kokain, heroin). • Některé viry spontánně hemaglutinují a proto inhibice hemaglutinace sérovými protilátkami může být využita k diagnostice (zarděnky, chřipka).
Inhibice aglutinace • Kompetice se solubilním Ag Prior to Test +
Test +
+
Patient’s sample
Inhibice aglutinace V řadě A jsou pozitivní jamky 1-8
Průkaz HCG v moči
Hemaglutinace
