PANNON EGYETEM GEORGIKON MEZŐGAZDASÁGTUDOMÁNYI KAR ÁLLAT- ÉS AGRÁRKÖRNYEZET-TUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA AZ INTERDISZCIPLINÁRIS DOKTORI ISKOLA JOGUTÓDJA Vezető: Dr. habil. ANDA ANGÉLA az MTA doktora Témavezető: Dr. habil. VÁRNAGY LÁSZLÓ az MTA doktora
Investigation of Incidences and Developement of Spontaneous Tumours Typical of Crl: CD BR Rat Strain in Two Carcinogenecity Studies Performed Under Similar Circumstances A Crl: CD BR patkánytörzsre jellemző spontán tumorok kifejlődésének és incidenciájának vizsgálata két hasonló körülmények között elvégzett kétéves karcinogenitási kísérlet alapján DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI
Készítette: SEBESTYÉN ISTVÁN
KESZTHELY 2008
TARTALOMJEGYZÉK
1. 2.
TUDOMÁNYOS ELŐZMÉNYEK.................................................................... 2 ANYAG ÉS MÓDSZER .................................................................................... 4 2.1 Kutatási cél................................................................................................... 4 2.2 Kísérleti állatok ............................................................................................ 4 2.3 Hygiene és egészségi állapot........................................................................ 4 2.4 Tartási körülmények .................................................................................... 5 2.5 Takarmány és etetés ..................................................................................... 5 2.6 Vízellátás...................................................................................................... 7 2.7 Az állatok jelölése ........................................................................................ 7 2.8 Klinikai megfigyelések ................................................................................ 8 2.9 Testtömeg mérés .......................................................................................... 8 2.10 Tápfogyasztás mérés .................................................................................... 8 2.11 Hematológia ................................................................................................. 8 2.12 Bonctan ........................................................................................................ 9 2.13 Kórszövettan ................................................................................................ 9 2.14 Statisztikai értékelés..................................................................................... 9 3. EREDMÉNYEK............................................................................................... 10 3.1 Klinikai megfigyelések és elhullások ........................................................ 10 3.2 Testtömeg és tápfogyasztás........................................................................ 10 3.3 Hematológiai vizsgálatok eredményei ....................................................... 10 3.4 Bonctani leletek.......................................................................................... 11 3.5 Szervtömeg mérés eredményei .................................................................. 11 3.6 Mikroszkópos vizsgálatok eredményei ...................................................... 12 3.7 Következtetések ......................................................................................... 13 4. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK............................................................ 14 5. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBŐL MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK .......... 15 6. A TÉZISEKHEZ FELHASZNÁLT IRODALOM........................................... 17
1
1. TUDOMÁNYOS ELŐZMÉNYEK Az elmúlt években a kémiai növényvédő szerek váltak a növényvédelem legfontosabb tudatosan alkalmazott formájává. Természetesen ez általánosítás, mivel néhány kultúrában néhány területen az alternatív módszereket is magas szinten alkalmazzák. A növényvédő szerek esetében, amelyek a gyógyszerek mellett a veszélyes anyagok másik legnagyobb területét jelentik, a forgalomba hozatal Európai Uniós szabályozását jelentő „The Plant Protection Products Directive” a „Növényvédő szer Direktíva” (91/414/EEC), az úgynevezett engedélyezési direktíva 1991. augusztus 19-én jelent meg, miután a Miniszterek Tanácsa elfogadta 1991. július 15-én (OJ L230, ISSN 0378 6978). A Direktíva 1993. július 26-án lépett törvényerőre és Magyarországon a 2000. évi XXV. Törvény a kémiai biztonságról, valamint a 89/2004. (V. 15.) FVM rendelet, a növényvédő szerek forgalomba hozatalának és felhasználásának engedélyezéséről, valamint a növényvédő szerek csomagolásáról, jelöléséről, tárolásáról és szállításáról” léptette életbe ezen előírásokat. Mielőtt egy növényvédő szer hatóanyag felkerül a 91/414/EEC direktíva 1. mellékletére, a gyártóknak egy komplett adat csomagot (dossziét) kell benyújtaniuk a hatóanyagról, valamint legalább egy készítményről, amely ezt a hatóanyagot tartalmazza (EC, 1992). A direktívában előírt adatkövetelmény alapján a hatóanyaggal el kell végezni patkányokon egy hosszú-távú orális toxicitási vizsgálatot és egy karcinogenitási vizsgálatot. Ezt a két vizsgálatot össze is lehet vonni (Kiss, 1997). A karcinogenitási vizsgálat tárgya a hatóanyag daganatkeltő potenciáljának megállapítása állatokon és a releváns humán kockázat értékelése (OECD, 1981). Bármely gyanú, amely felmerül a laboratóriumi vizsgálatok, toxikológiai állatkísérletek és humán megfigyelések során szükségessé tehetik a karcinogenitási vizsgálat elvégzését. A karcinogenitási vizsgálat szükségessége először a gyógyszerekkel kapcsolatban merült fel, mivel gyakran várható volt a gyógyszer rendszeres alkalmazása a páciens élettartamának jelentős részében. Ezen vizsgálatok tervezését és a vizsgálatban kapott eredmények értelmezésémegelőzi genotoxikus potenciál vizsgálata a legújabb elérhető technológia segítségével, és a szisztémás expozíció értékelése legfrissebb technológiai eredmények alapján. Amíg a kezelésre adott válaszok szabványos referencia pontjai a kísérlet saját kontroll adatai, a történeti kontroll adatok különösen a karcinogenitási vizsgálat eredményeinek értelmezésében nagyon hasznosak lehetnek. Ahol benyújtják a történeti kontroll adatokat, azoknak azonos fajon és törzsön hasonló körülmények közt, ugyanazon években elvégzett vizsgálatokból kell származniuk (FDA, 1996).
2
A daganatok történeti kontrol adatbázisának elérhetősége alapján a következő törzseket alkalmazzák a leggyakrabban. Patkány: Fischer 344, Sprague-Dawley, Wistar. Egér: B6C3F1, ICR Swiss (CD-1), BALB/c. Egy mostanában elvégzett vizsgálatban Britton és munkatársai közölték, hogy a három vizsgált patkány törzs közül (Harlan Hsd:Sprague-Dawley SD, Harlan Wistar Hsd:BrlHan:WIST, Charles River Crl:CD), a Harlan Wistar törzs egyedei élték túl legnagyobb számban a 104 hetes karcinogenitási kísérletet. A magas túlélési arány, a szerzők véleménye szerint, függetlennek tűnt a testtömegek és a tápfogyasztás alakulásától és a spontán patológiai profilban fejeződött ki (Britton et al, 2004). A kalória felvételt napjainkban a biológiai kísérletek fontos nem kontrollált változójának tartják, mert a rágcsálók hosszú távon ad libitum etetve elhíznak, reprodukcióra képtelenekké válnak, a korral összefüggésbe hozható betegségek incidenciája megnő, magasabb lesz a daganatok száma és csökken az élettartam. Az elérhető szakirodalomból kitűnik, hogy az ad libitum etetés nem optimalizálja az állatok egészségét és jólétét, és nem biztosítja a farmakológiai és toxikológiai profil értékeléséhez használható legjobb modellt sem. Optimalizált takarmány alkalmazása, ami a kalória felvétel korlátozását jelenti, javasolható a patkányokon végzett krónikus toxicitási és karcinogenitási vizsgálatokhoz (Keenan, 1998a; Keenan et al, 1998b). Habár a daganatok kockázatának csökkentését célzó takarmányozási ajánlások a zsír bevitel korlátozását hangsúlyozzák, David Kritchevsky a Nutrition Today folyóiratban megjelent cikke állatkísérletekből származó bizonyítékokat dokumentál, hogy az energiaegyensúly akár a korlátozott bevitel, akár a magasabb energiafelhasználás mellett sokkal hatékonyabb a daganat növekedés kontrollálásában (Kritchevsky, 1993). Az élelmiszer zsírtartalma pozitív korrelációt mutat a humán daganatok előfordulásával, különösen az emlő és végbél daganatok esetében. Kimutatták, hogy a magas zsírtartalmú takarmány gyorsította a kémiai anyagok által kiváltott daganatok növekedését patkányokon és egereken. A magas zsírtartalmú takarmány általában magas energiatartalmú is. 1975-ben Berg és Howell javasolta, hogy helyénvaló lenne összefüggésbe hozni a daganatok kockázatát az általános étkezési szokásokkal. Valóban már 1920-ban Frederick L. Hoffman, a Prudential Biztosító Társaság statisztikusa javasolta, hogy hozzák összefüggésbe a daganatok gyakoriságát a túltápláltsággal (Berg, 1975, Howell, 1975, Hoffman, 1927). Az alacsony energiatartalmú takarmány csökkentette a prosztata daganat növekedését állatokban, amint új kutatási eredmények mutatták az Ohiói Állami Egyetem Általános Daganat Központ, Arthur G. James Daganat Kórház és a Richard J. Solove Kutató Intézet munkájában. A daganatok növekedésének lassulása jelentkezett akár a takarmány zsírtartalom, szénhidrát tartalom, vagy a takarmány mennyiség csökkentésével. Az eredmények továbbá sejtetik a mechanizmust, ahogy az alacsonyabb energia tartalmú
3
takarmány csökkenti a tumor növekedést patkányokban és egerekben – késleltette új vérerek képződését a daganatban (Ward, 1999). Energia tartalom csökkentés lassította a prosztata daganat növekedését laboratóriumi állatokban, amint a Journal of the National Cancer Institute folyóiratban olvasható. (Mukherjee et al, 1999). Patkányokban és egerekben a prosztata daganat növekedése lényegesen lassítható az állati takarmány energiatartalmának csökkentésével. Ezek az eredmények az elsők a szerzők szerint, amelyek mutatják az energia bevitel hatását a prosztata daganat növekedésére. 2.
ANYAG ÉS MÓDSZER
2.1 Kutatási cél A kísérleti állatok ad libitum takarmányozása során a túltápláltság következtében kialakuló kontrollálatlan testtömeg az egyik szignifikáns változó, amely befolyásolja az engedélyezési célra végzett hosszú távú és karcinogenitási vizsgálatok eredményét. Vizsgálatunk célja, hogy összehasonlítsuk két hasonló körülmények között, de eltérő beltartalmú takarmány ad libitum etetése mellett végzett karcinogenitási vizsgálat kontroll csoportjában elvégzett megfigyelések eredményeit, a spontán daganatok kifejlődését és gyakoriságát, az eltérő összetételű takarmány hatását ezen paraméterekre 2.2 Kísérleti állatok Crl:CD Br (Sprague-Dawley) patkányokat használtunk mindkét kísérletben. Az állatok származási helye a CHARLES RIVER WIGA GmbH, Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld. A patkány nemzetközileg elfogadott faj a karcinogenitási vizsgálatokban. A Crl:CD Br patkánytörzs széles körben használt erre a célra, ezért történeti kontroll adatok rendelkezésre állnak. A kísérleteket csoportonként 50 hím és 50 nőstény patkányon kezdtük. Az állatok a laboratóriumba érkezéskor 5-6 hetesek voltak. A karantén és akklimatizációs időszak 14 nap volt a beérkezéstől számítva. Mindkét kísérletben az állatok testtömege hasonló tartományba tartozott a megfigyelések megkezdésekor. 2.3 Hygiene és egészségi állapot A kísérleteket SPF hygienés állapotú állatokkal indítottuk (a szállító igazolta). Az állatokat speciális zsilippel elzárt rendszerben tartottuk, elkülönített, EU9 baktériumszűrővel szűrt levegőt biztosító steril légkondicionáló berendezéssel ellátott szobákban. Az állattartó egységben tiszta és fekete folyosó volt anyagi és személyi zsilippel elkülönítve. A ketreceket és az almot igény szerint cseréltük. Az itató palackokat körforgó rendszerben szükség szerint tisztítottuk.
4
Az állatszobák takarítását minden munkanap végén sepréssel, majd megfelelő fertőtlenítős felmosással végeztük. Csak megfelelő egészségi állapotú állatot használtunk a kísérletekben. Az állatok egészségi állapotát a felelős állatorvos igazolta a külső klinikai vizsgálatok, valamint az alapszint vizsgálatok alapján. 2.4 Tartási körülmények Az első kísérletben csoportos tartást alkalmaztunk, a megfigyelés kezdetén 5 állatot tartottunk ketrecenként. A hatodik hónaptól 3 állatot tartottunk ketrecenként, majd egyedi tartást alkalmaztunk az első év végétől. A második kísérletben két állatot tartottunk ketrecenként az egész megfigyelési időszak alatt. Techniplast T III típusú műanyag ketreceket használtunk mindkét kísérletben, melyek alapterülete 18 x 18cm és magassága 36 cm volt. Az alomként használt laboratóriumi faforgács minden szállítmányának ellenőriztük a mikrobiológiai állapotát. Napi 12 óra megvilágítást alkalmaztunk reggel 6 és este 6 óra között. A szoba hőmérsékletét 22 ± 3 °C tartományban tartottuk 50 ± 20 % relatív páratartalom mellett. A légcsere 10-15 teljes csere volt óránként túlnyomás biztosítása mellett. A ketreceket két-hetente rendszeresen áthelyeztük a mellette levő ketrec helyére egy körforgást megvalósítva. A szobák hőmérsékletét és páratartalmát rendszeresen ellenőriztük. 2.5 Takarmány és etetés Az első kísérletben az állatok SSNIFF R/M-Z+H 15 MM AUTOKLAVABLE COMPLET DIET FOR RATS AND MICE BREEDING + MAINTENANCE tápot kaptak. Dolgozatomban ezt „Normál” tápnak neveztem. A második kísérletben az állatokat SSNIFF R/M-H, ERED LOW ENERGY COMPLETE DIET FOR RATS AND MICE táppal etettük. Dolgozatomban ezt „Alacsony energiatartalmú” tápnak neveztem. Mindkét tápot a Ssniff Spezialdiäten GmbH (D-59494 Soest, Németország) gyártotta. A tápokat ad libitum etettük. A kísérlet végén boncolás előtt az állatok egy éjszakán át éheztek. A tápok beltartalmának ellenőrzését és az analitikai vizsgálatokat egyaránt elvégeztük. A tápokat analizáltuk ezen felül még a lehetséges szennyezések (aflatoxin, növényvédő szer maradék, nehézfémek) kimutatására is. Minden gyártmányból mikrobiológiai mintákat is vettünk. A tápok minőségi vizsgálatát Magyar Mezőgazdasági Minősítő Intézet (Budapest Remény u. 42.) végezte. A két értékelt vizsgálatban a tápok összetétele volt a legfontosabb különbség. A Normál és az Alacsony energiatartalmú tápok névleges beltartalmát az 1. Táblázat tartalmazza.
5
1. Táblázat A takarmányok névleges beltartalma
Beltartalom
Normál táp MértékÉrték egység 19.00 % 3.50 % 4.90 % 6.00 %
Nyers fehérje Nyers zsír Nyers rost Nyers hamu AMINOSAVAK Lizin 1.10 % Metionin 0.60 % Cisztein 0.25 % Glicin 0.90 % Leucin 1.50 % Izoleucin 0.90 % Arginin 1.20 % Fenilalanin 0.90 % Triptofán 0.25 % Hisztidin 0.45 % Alanin 0.70 % Tirozin 0.60 % Aszparagin 1.40 % Glutamin 2.20 % Valine 0.90 % Treonin - NYOMELEMEK Mangán 75.0 mg/kg Réz 12.0 mg/kg Cink 70.0 mg/kg Jód 1.5 mg/kg Vas 220.0 mg/kg Kalcium 1.00 % Nátrium 0.20 % Magnézium 0.20 % Foszfor 0.80 % Kálium - Szelén - Kobalt - -
Alacsony energiatartalmú táp MértékÉrték egység 17.50 % 3.00 % 11.00 % 5.70 % 0.90 0.30 0.30 0.90 1.20 0.60 1.10 0.80 0.25 0.50 0.60 1.60 3.60 0.90 0.70 90.0 12.0 75.0 2.0 220.0 1.00 0.25 0.20 0.70 1.00 0.2 2.0
6
% % % % % % % % % % % % % % % mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg % % % % % mg/kg mg/kg
1. Táblázat. A takarmányok névleges beltartalma (folytatás) Normál táp MértékÉrték egység VITAMINOK (per kg) A 27000 IU D3 1920 IU E 180 mg/kg C 500 mg/kg B1 24 mg/kg B2 45 mg/kg B6 25 mg/kg B12 90 μg/kg Biotin 400 μg/kg Pantoténsav 60 μg/kg Kolin 2400 mg/kg Folsav 6 mg/kg Nicotinsav 90 mg/kg K3 4 mg/kg Inositol 60 mg/kg ME (per kg) 12.3 MJ Beltartalom
Alacsony energiatartalmú táp MértékÉrték egység 15000 IU 1000 IU 100 mg/kg 10 20 12 80 400 30 1600 4 60 5 50 9.5
mg/kg mg/kg mg/kg μg/kg μg/kg μg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg MJ
Megjegyzés: - = Adat nem áll rendelkezésre
2.6 Vízellátás Az állatok emberi fogyasztásra alkalmas szűrt csapvizet kaptak ad libitum 500 ml-es palackokból (a vizet baktériumszűrővel szűrtük). A víz minőségi vizsgálatát háromhavonta a Fővárosi Vízművek (Budapest, Váci út 23-27.) végezte. A felhasznált takarmány és víz nem tartalmazott semmilyen szennyeződést olyan koncentrációban, ami befolyásolta volna a kísérlet kimenetelét. 2.7 Az állatok jelölése Az állatok egyede jelölését fülbe helyezett krotáliával illetve farokra tetovált számokkal oldottuk meg. A ketreceket azonosító kártyákkal jelöltük, melyek tartalmazták a témaszámot, nemet, csoport jelölést, ketrec számot és az állatok egyedi azonosító számát.
7
2.8 Klinikai megfigyelések Részletes klinikai vizsgálatot végeztünk egyszer a kísérlet megkezdése előtt, majd hetente egyszer a megfigyelési időszakban minden állatnál. Az egyedi megfigyelések magukban foglalták a megjelenés, kondíció, viselkedés, szomatomotoros aktivitás, kiválasztás, légzés, testnyílások és a szemek megfigyelését. Minden állatot naponta megfigyeltünk a toxikus tünetek megjelenésének, vagy progressziójának észlelésére vagy a kannibalizmus elkerülésére. Különös figyelmet fordítottunk a tumorok kifejlődésére: minden látható vagy tapintható daganat megjelenésének idejét, helyét, nagyságát és kifejlődésének ütemét feljegyeztük. Palpációt az első hat hónapban havonta majd a 7 és 12 hónapok között kéthetente, ezt követően pedig hetente végeztünk. Az elhullásokat naponta kétszer ellenőriztük. Az elhullás napját feljegyezzük. A moribund állatokat elkülönítettük vagy felboncoltuk. Ezen állatoknál a végső boncolással megegyező módon jártunk el. 2.9 Testtömeg mérés Az állatok testtömegét a vizsgálat első 12 hetében hetente egyszer, majd négyhetente mértük 1 g-os pontossággal. 2.10 Tápfogyasztás mérés Az állatok tápfogyasztását ketrecenként határoztuk meg az el nem fogyasztott táp visszamérésével az első13 héten hetente, majd kéthetente egyszer. A mérést 1.0 g-os pontossággal végeztük. 2.11 Hematológia Az első kísérletben a12. és 18. hónapban, majd a kísérlet végén vérmintát gyűjtöttünk minden állatból, nyelvgyökből. A nyelvet injekciós tűvel megszúrtuk és heparinos kapillárissal vért vettünk. A kapilláris tartalmából vérkenetet készítettünk, melyet Pappenheim módszerrel festettünk meg. Ezekben a vérvételi időpontokban csak kvalitatív vérkép analízist végeztünk. A második vizsgálatban, amikor az állatokat alacsony energiatartalmú táppal etettük vért vettünk a kísérlet kezdete (alapszint) előtt 10 hím és 10 nőstény állatból szívpunkcióval, majd 12. és 18. hónapban kapillárissal vért gyűjtöttünk a fenti módszer szerint minden túlélő kísérleti állatból. A 24. hónapban, a kísérlet végén minden túlélő állatból vért vettünk szívpunkcióval részletes vérvizsgálatra. Alapszint vételkor és a kísérlet végén a következő paramétereket vizsgáltuk K-4500 Sysmex automatával: − Vörösvérsejt szám - automatikus sejtszámláló − Fehérvérsejt szám - automatikus sejtszámláló − Hemoglobin koncentráció – fotométeres mérés 546 nm-en − Hematokrit - számított érték − Átlagos korpuszkuláris (eritrocita) térfogat – származtatott érték
8
− − − −
Eritrociták átlagos hemoglobin tartalma – számított érték Átlagos korpuszkuláris hemoglobin koncentráció - számított érték Trombocita szám - automatikus sejtszámláló Kvalitatív vérkép – Pappenheim szerint megfestett vérkenet analízis mikroszkóp alatt.
2.12 Bonctan Kórboncolás előtti napon az állatokat megközelítőleg 16-18 órán át éheztettük. A kórboncolás napján az állatokat Nembutál injekcióval túlaltattuk. A részletes kórboncolás minden állat esetében - beleértve a halva találtat is - egy szakképzet patológus irányítása alatt történt. A vizsgálatot a külső megfigyelésekkel kezdtük majd a mell-és hasüreg valamint a koponya felnyitását követően megvizsgáltuk a szervek és szövetek megjelenését. A makroszkopikus elváltozásokat részletesen (elhelyezkedés, szín, méret, forma) boncolási jegyzőkönyvben rögzítettük. A kiválasztott szervek tömegét 0.01 g-os pontossággal megmértük. A testtömegre vonatkoztatott relatív szervtömegeket kiszámítottuk. 2.13 Kórszövettan A boncolás során a kísérleti állatok minden szervét és szövetét tartósítottuk szövettani vizsgálat céljából 10 %-os pufferelt formalin oldatban, a túlélő, moribund és elhullott állatokból azonos módon. Szövettani feldolgozást és vizsgálatot végzünk minden tartósított szervből és szövetmintából. Minden látható elváltozást és tumort minden csoport esetében megvizsgáltunk, és a megfigyeléseket jegyzőkönyvben rögzítettük. A mintákat paraffinba ágyaztuk, megközelítőleg 5 mikron vastag metszeteket készítettünk melyeket lemezre húzás után haematoxilin-eosin festéssel festettünk meg. A csontokat előzőleg 10%-os hangyasav oldatban dekalcináltuk.
2.14 Statisztikai értékelés A kísérletek során a klinikai tüneteket, a testtömeg és tápfogyasztás adatokat, bonctani és szövettani megfigyeléseket, szervtömeg és hematológiai adatokat, a kvalitatív vérképet is beleértve, egyedi adatlapokon gyűjtöttük. Az adatgyűjtés megfelelt a GLP irányelveinek, és a laboratórium minőségbiztosítása ellenőrizte. A két kísérlet testtömeg és tápfogyasztás adatait, a klinikai patológiai paramétereket és a szervtömeg változásait az SPSSPC+ szoftver csomaggal értékeltük.
9
A csoportok adatainak homogenitását és varianciáját az F-teszt segítségével állapítottuk meg. A teszt eredményétől függően Poled vagy Separated variancia becslést végzünk a két-mintás T-teszt segítségével. Nem normál eloszlás esetén a csoportok közti összehasonlítást Mann-Whitney Uteszttel végeztük. A túlélési analízist az SPSSPC+ statisztikai szoftvercsomaggal KaplanMeier módszer (beleértve mind a LogRank, Breslow és Tarone Ware módszereket) és a Cox's regresszió analízis módszer segítségével végeztük el. 3.
EREDMÉNYEK
3.1 Klinikai megfigyelések és elhullások A vizsgálatban kapott eredmények alapján az alacsony energiatartalmú takarmánnyal etetett hím és nőstény állatok napokban kifejezett túlélése hosszabb volt, mint a normál takarmánnyal etetett csoportoké. Az alacsony energiatartalmú tápot fogyasztó hímek 66%-a élt a kísérlet végén, míg a normál takarmányon tartott hímek 56%-a élt a 24. hónapban. A nőstény állatoknál, annak ellenére, hogy több állat hullott el az alacsony energiatartalmú tápot fogyasztó csoportban, a napokban kifejezett átlag túlélés mégis hosszabb volt, mint a normál tápot fogyasztó csoportban. Ez a tény azt jelzi, hogy az elhullások lényegesen később kezdődtek el. A megfigyelt klinikai tünetek az állatok öregedésével, illetve a daganatok fejlődésével voltak összefüggésbe hozhatók. A klinikai tünetek összes száma kissé alacsonyabb volt az alacsony energiatartalmú tápot fogyasztó csoportokban, mint a normál táp etetés esetén. Az alacsony energiatartalmú takarmányozás mellett az állatok általános egészségi állapota jobbnak bizonyult. 3.2 Testtömeg és tápfogyasztás A normál takarmányt fogyasztó csoportok átlagos testtömege szignifikánsan magasabb volt, mint az alacsony energiatartalmú csoportoké a megfigyelési időszak legnagyobb részében. A tápfogyasztás ebben a periódusban az alacsony energiatartalmú tápot fogyasztó csoportokban volt magasabb. Ez alól kivételt képezett a nőstény állatoknál a 28. és 48. hét közötti időszak, amikor az említett tendencia megfordult. 3.3 Hematológiai vizsgálatok eredményei Az rendelkezésre álló hematológiai vizsgálati eredmények alapján az eltérő beltartalmú táp etetése nem befolyásolta szignifikánsan a hematológiai paraméterek alakulását. Megfigyelhető volt a szegmentált sejtek arányának folyamatos növekedése az állatok öregedésével, míg ugyanilyen arányban csökkent a limfociták száma. Ez a kvalitatív vérkép öregedésnek megfelelő fiziológiás változása.
10
3.4 Bonctani leletek Makroszkópos vizsgálattal daganatos eredetű elváltozások a kísérleti állatok számos szervében megfigyelhetők voltak mindkét csoportban a boncolások során. Hímekben és nőstényekben a leggyakoribb elváltozás a hipofízis daganat volt mindkét csoportban, és a történeti kontrol adatok igazolták, hogy ez a daganat fajta jellemző erre a patkány törzsre. Bőr alatti daganatok szintén előfordultak mindkét csoportban, de alacsonyabb gyakorisággal, mint a hipofízis daganat. Daganatok voltak megfigyelhetők még a csecsemőmirigyben, gerincoszlopban, csepleszen, vesékben, herékbe, prosztatába, hasi nyirokcsomókban, májban és az emlőmirigyekben a különböző takarmánnyal etetett csoportokban. Daganatszerű elváltozások a hím állatokban (nagyobbodások, gócok) a pajzsmirigyekben, nyálmirigyben, tüdőben, mellékvesékben, vesékben, lépben és a különböző nyirokcsomókban voltak megfigyelhetők. A nőstény állatoknál daganatszerű elváltozások jelentkeztek az agyalapi mirigyben, agyban, tüdőben, májban, mellékvesékben, vesékben, nemi szervekben, bőrben és az emlőmirigyekben. Ezen elváltozások szórványosan, alacsony gyakorisággal mindkét csoportban jelentkeztek. Elhullást vagy moribund állapotot okozó daganatok nagyon alacsony gyakorisággal fordultak elő. A patológusok a shockot jelölték meg az elhullás okának a leggyakrabban, különösen a hím állatok esetében. Makroszkópos vizsgálattal számos nem-neoplasztikus elváltozás is megfigyelhető volt a kísérleti állatok különböző szerveiben, a különböző beltartalmú tápot fogyasztó csoportokban mindkét nem esetében egyaránt. Hímekben sötétvörös, vérbő tüdő, tüdő ödéma, szívtágulat, vérbő máj, halvány színű vesék, nemi szervek atrófiája, megnagyobbodott here, és savós folyadékkal telt mellüreg volt megfigyelhető. A nőstény kísérleti állatokban halvány színű máj, megnagyobbodott lép és mellékvesék voltak megfigyelhetők. A vérbő tüdő és tüdő ödéma ritkábban fordult elő, mint a hím állatokban. A legtöbb nem-neoplasztikus elváltozás a túlaltatással és az agóniával volt összefüggésbe hozható, illetve egy részük az öregedéssel volt kapcsolatos, vagy toxikológiailag jelentéktelen eltérések (elszíneződés, ciszta, tályog) voltak. 3.5 Szervtömeg mérés eredményei A rendelkezésre álló szervtömeg adatok azt mutatták, hogy az alacsony energiatartalmú tápot fogyasztó hím és nőstény állatok esetében az abszolút és relatív májtömegek magasabbak voltak, mint a normál tápot fogyasztó állatok esetében. Ez az eltérés a hím állatoknál kifejezettebb volt.
11
3.6 Mikroszkópos vizsgálatok eredményei Az értékelt kísérletekben, a történeti kontroll adatokkal összhangban az agyalapi mirigy adenóma volt a leggyakoribb daganat mindkét csoportban és mindkét nem esetében. Az állatok elhullását okozó malignus daganatok a következők voltak: sarcoma polymorphocellulare, fibrosarcoma, lymphoma malignum, adenocarcinoma és hepatocellularis carcinoma, melyek hímekben és nőstényekben egyaránt ritkán fordultak elő. Nem-differenciálódott sarcoma az emlőmirigyekben, szívben, vaginában, nem-differenciálódott carcinoma a bőrben, vaginában vagy a hasüregben, myxosarcoma a bőrben, méhben vagy a hasüregben volt megfigyelhető. Szórványosan follicularis carcinoma a pajzsmirigyben, plexus carcinoma és astrocytoma az agyban, osteosarcoma a csontban, illetve carcinoma planocelluléare a szemben került megfigyelésre. A leggyakoribb benignus daganat ebben a vizsgálatban az emlőmirigy adenóma volt a nőstény állatokban. Ennek a daganatnak a gyakorisága magasabb volt az alacsony energiatartalmú tápot fogyasztó csoportokban, mint a normál tápot fogyasztó csoportokban. Más típusú benignus daganatok, mint fibroma az emlőmirigyekben, bőrben, mell- és hasüregben, myxoma, fibro-adenóma, papilloma a bőrben, adenóma a vesében, mellékvesében, csecsemőmirigyben, mellékpajzsmirigyben, nyálmirigyben, hasnyálmirigyben, méhben, lipoma a gyomorfalban, thymoma a csecsemőmirigyben, pheochromocytoma a mellékvesében, myxoma, fibro-papilloma, leiomyoma a méhben, haemangioma lépben és különböző nyirokcsomókban általánosan alacsony gyakorisággal és azonos incidenciával fordultak elő mindkét csoportban. A nem-neoplasztikus hiperplasztikus elváltozások, mint a hiperpláziás csomók és epevezeték hiperplázia a májban, C-sejtes hiperplázia a pajzsmirigyben, sziget-sejt hiperplázia a hasnyálmirigyben szintén alacsony gyakorisággal előfordultak mindkét nemben. Híméknél megfigyelhető volt cisztás hiperplázia az ondóhólyagban. Hiperplasztikus csomók a májban ritkán, de mindkét nemben és mindkét csoportban előfordultak. Az epevezeték hiperplázia közönséges, öregedéssel kapcsolatba hozható elváltozás a kontroll patkányokban, ami gyakran társul perilobuláris fibrózissal. A C-sejtes hiperplázia a pajzsmirigyben és a cisztás hiperplázia az ondóhólyagban, illetve a sziget-sejt hiperplázia a hasnyálmirigyben csak szórványosan detektálható ritka elváltozás. A szövettani vizsgálatokban kapott daganat gyakorisági eredményeket figyelembe véve a tumorok összes száma kissé magasabb volt az alacsony energiatartalmú takarmányt fogyasztó hím és nőstény állatok esetében, mint a normál takarmánnyal etetett csoportokban. Ez talán az alacsony energiatartalmú táppal etetett csoportokban az elhullások későbbi jelentkezésével és a hosszabb túléléssel magyarázható.
12
3.7 Következtetések A kísérleti eredmények összefoglalásaként megállapíthatjuk, hogy az alacsony energiatartalmú takarmány etetésének előnye a kísérleti állatokkal a hosszú-távú és karcinogenitási vizsgálatokban a jobb túlélési eredményekben, különösen a hím állatoknál, valamint a kísérleti állatok jobb általános egészségi állapotában jelentkezik. Az alacsony energiatartalmú takarmánnyal etetett csoportok testtömeg gyarapodása kiegyensúlyozott volt a magasabb tápfogyasztás ellenére. A magasabb tápfogyasztás azonban segítheti magasabb dózisszintek elérését az etetéses kísérletekben. Az alacsony energiatartalmú táp etetése nem befolyásolta a mért hematológiai paraméterek alakulását, de a májtömegek magasabbak voltak, mint a normál táppal etetett csoportokban. A megfigyelt tumorok összes száma kissé magasabb volt az alacsony energiatartalmú tápot fogyasztó hím és nőstény kísérleti állatokban, mint a normál táppal etetett csoportokban. A vizsgált közepes szintű étrendi korlátozás alkalmazása a kutatók számára jobban kontrollált állatkísérleti modellt biztosít, amelyben a háttér betegségek vagy daganatok alacsonyabb gyakorisággal, vagy legalább időben később jelennek meg. A közepes szintű étrendi korlátozás nem mutatott káros hatásokat a fiziológiás folyamatokra, metabolizmusra, a klinikai patológiai paraméterekre vagy a bonctani elváltozásokra, azonban nagy előnye, hogy lassította az állatok öregedésével összefüggő betegségek kifejlődését. Ez a laboratórium működtetése szempontjából egyszerű eljárás szignifikánsan növeli a túlélést, a kezelésre alkalmas időtartamot a kísérlet során, valamint javítja a toxikológiai kísérletek statisztikai érzékenységét, és elősegíti a tényleges, kezeléssel összefüggésbe hozható hatások detektálását a kétéves kísérleti periódus alatt.
13
4.
ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK
1. A hosszú távú és karcinogenitási vizsgálatokban a kísérleti állatok alacsony energiatartalmú táppal való etetésének előnyeit különösen a hím állatoknál észlelt jobb túlélési arány bizonyítja. Ez a paraméter a karcinogenitási vizsgálatok egyik legfontosabb elfogadási kritériuma. 2. Az alacsony energiatartalmú táppal etetett csoportoknál megfigyelt magasabb tápfogyasztás segítheti az etetéses vizsgálatok során a magasabb dózisok elérését. Alacsony toxicitású anyagok esetében a megfelelő dózisszintek elérése gyakran problematikus. 3. Az alacsony energiatartalmú táppal történő etetés nem befolyásolta a mért hematológiai paramétereket, de a májtömegek magasabbak voltak, mint a normál táppal etetett csoportokban. 4. A tumorok összesített száma az alacsony energiatartalmú táppal etetett hím és nőstény állatoknál magasabb volt, mint a normál táppal etetett csoportokban. Ez növeli az SD patkányon végzett kísérletekben a statisztikai módszerek érzékenységét és segíti a valódi kezeléssel összefüggő hatások felismerését a kétéves vizsgálatokban.
14
5.
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBŐL MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK
I. Sebestyén, E. Béres, I. Pasics-Szakonyi, B. Oláh, Results of the General Toxicity and Genotoxicity Studies of a New Insecticide Synergist International Congress of Toxicologists (ICT), Paris, 1998 G. Hirka, E. Béres, I. Sebestyén Toxicological Examinations of a New Acaricide. Dose Selection for a Carcinogenicity Study International Congress of Toxicologists (ICT), Paris, 1998 I. Pasics-Szakonyi, I. Sebestyén, E. Béres, B. Oláh, J. Stáhl, Results of the General Toxicity and Genetic Studies of an Insecticide Intermediate International Congress of Toxicologists (ICT), Paris, 1998 I. Sebestyén, E. Béres, I. Pasics-Szakonyi, B. Oláh, László Pap Results of the General Toxicity and Genotoxicity Studies of a New Insecticide Synergist TOX’ 98, 1998, Hungary I.Sebestyén, E. Béres, G. Hirka, I. Pasics, Z. Balogh Results of the 2-Year Carcinogenicity Study of a New Acaricide in CRL: CD BR Rats EUROTOX' 2001, Istambul, Turkey I.Sebestyén Historical Review of Acute Oral Toxicity Studies in Respect of the Number of Animals Used in the Studies. TOX'2003 Conference, Zalakaros, Hungary Sebestyén István A növényvédelem fontossága a mezőgazdasági munkák során figyelemmel az emberi egészség védelmére, III. ORSZÁGOS MEZŐGAZDASÁGI MUNKAVÉDELMI FÓRUM, Balatonfüred. 2004. Sebestyén István Toxikológiai ismeretek, kockázatbecslés, elsősegélynyújtás Növényvédő szakmérnök továbbképzés, Békéscsaba, 2005.
15
Sebestyén István Besorolás és cimkézés munkacsoport, növényvédő szer felülvizsgálat, forgalmi kategóriákMAVESZ konferencia, Budapest, 2005. I. Sebestyén Toxicological Data Base and the Risk Assessment, First Aid Növényvédő Szakmérnök Fórum, Miskolc, 2006 Lehotzky Kornélia, Strohmayer Ágnes és Sebestyén István Toxikológiai szempontok és feltételrendszer a peszticidkészítmények forgalmi kategóriába sorolására, az ember egészségének védelme Növényvédelem. 42 (1), AGROINFORM Kiadó, Budapest, 2006. ISSN 01330829 Alan R Boobis, Bernadette C Ossendorp, Ursula Banasiak, Paul Y Hamey, Istvan Sebestyen and Angelo Moretto Cumulative Risk Assessment of Pesticide Residues in Food Toxicology Letters, Elsevier, 2008, Manuscript No.: TOXLET-D-08-00315R1 (accepted for publication) István Sebestyén, László Várnagy, Péter Budai Observations and Tumour Incidence of Control Crl:Cd Br Rats in a 2-Year Carcinogenicity Study by Normal Caloric Intake Georgikon for Agriculture (accepted for publication)
16
6.
A TÉZISEKHEZ FELHASZNÁLT IRODALOM
Berg, J.W., 1975. Can nutrition explain the pattern of international epidemiology of hormone-dependent cancer? Cancer Res;35:3345-3350. Britton, L.D., Downes, N., Mullins, P., Mitchell, D., 2004. The most appropriate strain for rat carcinogenicity bioassay [abstract]. Toxicol Sci.78:560. EC, 1992. Plant Protection Products Directive (91/414/EEC), OJ L230, ISSN 0378 6978. FDA, 1996. ICH Harmonised Tripartite Guideline S1A, Guideline on the Need for Carcinogenicity Studies of Pharmaceuticals. Howell, M.A., 1975. Diet as an etiological factor in the development of cancers of the colon and rectum. J Chronic Dis;28:67-80. Hoffman, F.L., 1927. Cancer increase and overnutrition. Newark, NJ: Prudential Insurance Co. Keenan, K. P., Laroque, P., Dixit, R., 1998. Need for dietary control by coloric restriction in rodent toxicology and carcinogenicity studies. Journal of Toxicology and Environmental Health, 1, 135-148. Keenan, K. P., 1998. Effects of diet and overfeeding on body weight and survival in the rodent bioassay. International Journal of Toxicology, 17, 101117. Kiss I., 1997. Toxikológia. Veszprémi Egyetemi Kiadó, Veszprém. Kritchevsky, D., 1993. Caloric restriction tumorigenesis. Nutrition Today, 28(1), p. 25-27
and
experimental
Mukherjee, P. and Clinton, S., 1999. Cutting Calories Reduces Prostate Cancer Growth in Laboratory Animals, Journal of the National Cancer Institute, Oxford University Press. OECD, 1981. Guidelines for Testing of Chemicals No. 452, Carcinogenicity Study. Ward, D. E., 1999. The Ohio State University, 1999. Research News, Internet Search Result. 2000. évi XXV. Törvény a kémiai biztonságról. 89/2004. (V. 15.) FVM rendelet, a növényvédő szerek forgalomba hozatalának és felhasználásának engedélyezéséről, valamint a növényvédő szerek csomagolásáról, jelöléséről, tárolásáról és szállításáról.
17
