Možnosti diagnostiky chorob u kanců a v inseminačních dávkách MVDr. Petr Václavek, Ph.D. Státní veterinární ústav Jihlava
MEVET / Topigs Norsvin seminář, Michalovice, 10. března 2015
Možnosti diagnostiky chorob u kanců a v inseminačních dávkách
OBSAH: 1) Laboratorní diagnostika u kanců obecně 2) Diagnostické metody chorob prasat/kanců a interpretace výsledků 3) Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků pro lab. diagnostiku 4) Porcinní epidemická diarhoea (PED)
Laboratorní diagnostika u kanců obecně • povinné vyšetřování – SZ – viz Metodika kontroly zdraví – povinné úkony hrazené ze státního rozpočtu brucelóza, KMP, ACH, VCHP • dobrovolné vyšetřování ü monitoring – PRRS apod. ü cílené diagnostické testy ü kontrola semene – bakteriologická/virologická
Laboratorní diagnostika u plemenných kanců obecně • povinné vyšetřování – Metodika kontroly zdraví povinné úkony hrazené ze státního rozpočtu EpB130 BRUCELÓZA – VyLa - sérologické vyšetření (RBT + RVK) Plemenní kanci v hospodářství původu před přijetím do izolační stáje – v souladu s přílohou č. 5 k vyhlášce č. 380/2003 Sb. EpB131 BRUCELÓZA – VyLa - sérologické vyšetření (RBT + RVK) Plemenní kanci ve střediscích pro odběr spermatu 1x ročně v souladu s přílohou č. 5 k vyhlášce č. 380/2003 Sb. EpB132 BRUCELÓZA – VyLa - sérologické vyšetření (RBT + RVK) Plemenní kanci v izolační stáji před přijetím do střediska pro odběr spermatu nejdříve za 15 dnů po zahájení izolace - v souladu s přílohou č. 5 k vyhlášce č. 380/2003 Sb.
Laboratorní diagnostika u plemenných kanců obecně • povinné vyšetřování – Metodika kontroly zdraví povinné úkony hrazené ze státního rozpočtu EpB303 KLASICKÝ MOR PRASAT – VyLa - sérologické vyšetření (ELISA) Plemenní kanci v hospodářství původu před přijetím do střediska pro odběr spermatu – v souladu s přílohou č. 5 k vyhlášce č. 380/2003 Sb. EpB304 KLASICKÝ MOR PRASAT – VyLa - sérologické vyšetření (ELISA) Plemenní kanci ve střediscích pro odběr spermatu 1x ročně - v souladu s přílohou č. 5 k vyhlášce č. 380/2003 Sb. EpB403 AUJESZKYHO CHOROBA – VyLa- sérologické vyšetření (ELISA) Plemenní kanci v hospodářství původu před přijetím do izolační stáje – v souladu s přílohou č. 5 k vyhlášce č. 380/2003 Sb. EpB404 AUJESZKYHO CHOROBA – VyLa- sérologické vyšetření (ELISA) Plemenní kanci ve střediscích pro odběr spermatu 1x ročně - v souladu s přílohou č. 5 k vyhlášce č. 380/2003 Sb. EpB405 AUJESZKYHO CHOROBA – VyLa- sérologické vyšetření (ELISA) Plemenní kanci v izolační stáji před přijetím do střediska pro odběr spermatu nejdříve za 15 dnů od zahájení izolace - v souladu s přílohou č. 5 k vyhlášce č. 380/2003 Sb.
Státní veterinární ústav Jihlava
Komplexní diagnostika chorob prasat ODDĚLENÍ bakteriologie
bakteriologická vyšetření virologická a sérologická vyšetření molekulárně-biologická vyšetření
virologie
histologická a imunohist. vyšetření
patologie
patologicko–anatomická vyšetření
chemie parazitologie krmiva
biochemická, toxikologická a hematologická vyšetření parazitologická vyšetření mikrobiologická, mykologická a chemická vyšetření
Výsledek vyšetření + interpretace, konzultace a návrh řešení.
Diagnostické metody A) Nepřímý průkaz = • sérologický průkaz specifických protilátek MATERIÁL: sérum, plasma, sliny
B) Přímý průkaz = • průkaz patogena /antigenu / nukleové kyseliny MATERIÁL: krev, sliny, sperma, výtěry, trus, sekční materiál, seškraby
7
Diagnostické metody - nepřímý průkaz = sérologický průkaz specifických protilátek MATERIÁL: sérum, plasma, sliny
• ELISA – APP, PRRS, M. hyop, PCV2, H. parasuis, P. multocida, SIV, VGP, KMP, AMP, VCHP, ACH, Salmonella sp., brucelóza, chlam., PED, Lawsonia intracellularis, atd. • hemaglutinačně-inhibiční test (HIT) – PPV • rychlá a pomalá aglutinace (RA) – brucelóza • reakce vazby komplementu (RVK) – brucelóza, chlamydióza • MAT – Leptospira sp. • VNT, NPLA, IPMA – KMP, AMP, ACH, apod.
8
Diagnostické metody - přímý průkaz =
průkaz patogena /antigenu / nukleové kyseliny MATERIÁL: krev, sliny, sperma, výtěry, trus, sekční mat. • (real time) RT PCR – PRRS, SIV, KMP VGP, PRCoV, PED • (real time) PCR – PCV2, AMP, PPV, PMT, HP, APP, M. hyop., B. hyodysenteriae, L. intracellularis, Mycoplasma suis • imunochromatografický test – rotaviry, VGP, PED • imunohistochemie – PCV2 • izolace virologická / bakteriologická
9
Interpretace výsledků
není pouze problém diagnostických metod • limity diagnostické metody - specifita, sensitivita, robustnost, atd. • reprezentativní počet vzorků /frekvence vzorkování • stádium onemocnění - virémie/bakteriémie/ sérokonverze • prevalence onemocnění • klinické symptomy -
při klinice je nejpravděpodobnější záchyt patogena (ale virus může být vylučován i před klinickými příznaky i po odeznění)
• materiál/vzorek transport vzorků
vylučování viru do spermatu apod., správný odběr, uchování a
Interpretace výsledků
není pouze problém diagnostických metod
Příklad - PRRSV aneb co vše ovlivňuje výsledek diagnostiky a jeho následnou interpretaci PCR diagnostika viru PRRS: ü RT PCR and nested PCR (diferenciace EU a AM kmene) ü Real-time RT PCR • • • •
PCR – detekuje NK (nemusí být infekční) k infekci je třeba určité dávky mírná klinika u kanců s infekcí PRRS virus kanci vylučují již 1-2 týdny před sérokonverzí (2.-9. den pravidelně, 10.-23. den variabilně)
• v krvi je virus detekován dříve a ve větší kvantitě než v semeni (rozdíl
cca 2 dny) • striktní používání pouze ELISA testů bez PCR není doporučováno – v momentě potvrzení sérologické pozitivity už může být viru sířen spermatem dále
• dlouhodobé/intermitentní vylučování viru PRRS u kanců • virus perzistuje v tonsilách a m.u. (132-157 dnů) • RNA PRRS virus je citlivý k degradaci – transport vzorků, uchování, …!!
Příklad PRRSV aneb co vše ovlivňuje výsledek diagnostiky a následnou interpretaci ü IDEXX PRRS X3 Ab Test ü ELISA Oral Fluid IDEXX ELISA ü AniGen PRRS Ab ELISA 4.0 (Bionote) ü INGEZIM PRRS 2.0 (Ingenasa) ü imunoperoxidázový test - IPMA (AM/EU kmeny)
•
specifita ELISA testů = téměř 100% , ALE falešně pozitivní výsledky mohou být nutnost konfirmačních testů či nutný opakovaný odběr k potvrzení diagnostiky SVÚ Jihlava - nové ceny ELISA testů (od 1.4.2015): ü IDEXX ELISA = 230,- Kč / 1 vzorek (zvýšeno pravděpodobně pouze dočasně) ü ostatní ELISA = 150,- Kč / 1 vzorek
•
v mezinárodních kruhových testech ověřena kvalita a srovnatelné výsledky
•
testů AniGen a Ingezim
Interpretace výsledků
není pouze problém diagnostických metod
Příklad PRRSV aneb co vše ovlivňuje výsledek diagnostiky a následnou interpretaci ü IDEXX PRRS X3 Ab Test
PRRS ELISA a kvalitativní/kvantitativní výsledek IDEXX PRRS ELISA nám dává jednoduchý kvalitativní výsledek = pozitivní/negativní. Pozitivní kontrola je standardizována a reprezentuje signifikantní hladinu specifických protilátek proti viru PRRS. Relativní hladina protilátek je pak determinována kalkulací tzv. S/P hodnoty. Hodnota S/P (vzorek/pozitivní kontrola) je porovnáním výsledku OD vzorku s výsledkem OD známého standardu.
Hraniční hodnota (cut-off) mezi poz. a neg. je stanovena na S/P = 0,4.
S/P poměr je rekalkulován na „titer-like value“ = ne pravý titr protilátek!
14
PRRS monitoring u plemenných kanců SPRÁVNÝ POČET VZORKŮ / FREKVENCE
Obecná pravidla: • doporučován sérologický monitoring v kombinaci s PCR testy ze stejných vzorků krve • různá schémata pro monitoring PRRS: např. 1 x týdně test spermatu metodou PCR a měsíční sérologické testování séra • četnost vyšetření a počet vzorků? STATISTIKA x EKOMOMIKA • někdy povoleno směsování vzorků na PCR test (3-5 vz.) – odůvodněné v negativních chovech, kde se testuje často • ID by neměly být pouštěny bez negativního výsledku • striktní používání pouze ELISA testů bez PCR není doporučováno – v momentě potvrzení sérologické pozitivity už může být viru sířen spermatem dále
PRRS monitoring u plemenných kanců SPRÁVNÝ POČET VZORKŮ Počet vzorků k potvrzení nákazy – Excel tabulka (včetně vlivu sensitivity použitého testu)
Velikost populace (ks) Požadovaná spolehlivost (95%) Citlivost metody (%) Předpokládaná prevalence (%) Počet vzorků (ks) n
n= α= D= N=
50 95% 100% 5% 32
potřebný počet vzorků požadovaná jistota detekce infekce (většinou 0,95) počet infikovaných zvířat (odhad prevalence) velikost (četnost) populace
SPRÁVNÝ POČET VZORKŮ Počet vzorků pro 95% jistotu detekce infekce (1 nebo více) s testem se 100% senzitivitou Prevalence (%)
Velikost populace
50
40
30
25
20
15
10
5
2
1
0.5 0.1
20
4
6
7
9
10
12
16
19
20
20
20
20
30
4
6
8
9
11
14
19
26
30
30
30
30
40
5
6
8
10
12
15
21
31
40
40
40
40
50
5
6
8
10
12
16
22
35
46
50
50
50
60
5
6
8
10
12
16
23
38
55
60
60
60
70
5
6
8
10
13
17
24
40
62
70
70
70
80
5
6
8
10
13
17
24
42
68
79
80
80
90
5
6
8
10
13
17
25
43
73
87
90
90
100
5
6
9
10
13
17
25
45
78
96
100
100
150
5
6
9
11
13
18
27
49
95
130
148
150
200
5
6
9
11
13
18
27
51
105
155
190
200
500
5
6
9
11
14
19
28
56
129
225
349
500
1000
5
6
9
11
14
19
29
57
138
258
450
950
5000
5
6
9
11
14
19
29
59
147
290
564 2253
10000
5
6
9
11
14
19
29
59
148
294
581 2588
∞
5
6
9
11
14
19
29
59
149
299
596 2995
Správný počet vzorků Používáme malé množství vzorků, abychom získali informace o velkém množství zvířat. Výsledek má zajistit relevantní informaci aplikovatelnou na celou populaci (halu, farmu). • statistika – určuje ideální počet vzorků • praxe – bere v úvahu také ekonomickou stránku Chovatel/majitel tlačí počet vzorků a frekvenci vzorkování dolů. Potom přichází klíčové otázky:
Kolik informací ztrácím? Jaká rizika vznikají snížením počtu vzorků (popř. frekvence) ?
Standardní a alternativní postupy odběru diagnostických vzorků u kanců Matrice: • KREV • VÝTĚRY • SEKČNÍ MATERIÁL • SLINY • SEŠKRABY Z MANDLÍ • SPERMA
SPERMA a jeho specifika jako diagnostického vzorku Možnosti laboratorního vyšetření: • konvenční bakteriologické vyšetření
- ne vždy optimální
výsledky (přerůstání, interpretace, apod.)
• konvenční virologické vyšetření
– ne vždy optimální výsledky z různých důvodů – nízká sensitivita, délka analýzy/izolace, interpretace, kontaminace TK, cytotoxicita na TK
• biologický pokus na prasnicích
– byl používán, citlivější než izolace na TK – nelze systematicky používat z welfare důvodů i z praktického hlediska
• molekulární diagnostika - PCR – vysoká sensitivita, rychlé, vysoká kapacita (poč. vz.), ALE …
SPERMA a jeho specifika jako dg. vzorku na PCR • pozitivní výsledek molekulární diagnostiky (PCR) nemusí znamenat, že sperma obsahuje infekční patogen – detekujeme genom (NK) ne infekční organismus • k infekci je navít třeba jistá infekční dávka – množství virových partikulí
Ø např. test RT-nPCR na PRRSV detekuje 100 TCID50/ins. dávku = 20x méně viru než je třeba na exp. infekci 1 z 5 prasniček (Benfield et al. 2000) Ø ALE byla zaznamenána vysoká korelace (94%) mezi PCR a exp. infekcí, tzn. je vysoká pravděpodobnost, že vzorek s pozitivním výsledkem v PCR obsahuje infekční dávku (Christopher-Hennings et al. 1995)
• sperma je ideální spíše pro pozitivní chov, kde se snažím limitovat šíření viru směrem dolů – u PRRS pozitivního kance totiž nemohu dle séra předpokládat vylučování viru ve spermatu
• směsování vz. spermatu se nedoporučuje (kvůli nižší sensitivitě) • virus PRRS v semeni – intermitentní vylučování, nemusí korelovat s protilátkami a virem v krvi
SPERMA a jeho specifika jako diagnostického vzorku na PCR NATIVNÍ SPERMA • vysoká koncentrace balastní DNA oproti hledanému targetu – řešení – úprava metodiky zpracování vzorku INSEMINAČNÍ DÁVKA • problém naředění = „snížení citlivosti“ testu • potencionální inhibiční vlivy protektiv /ředidel, která by mohla způsobovat inhibici při PCR testu • množství spermatu – optimum 2 ks pejet/kapilár /1 zvíře potřeba min. 200 ul do testu na izolaci NK (+ případná rezerva)
SÉRUM a jeho specifika jako diagnostického vzorku • •
ideální vzorek – virus PRRS vylučován dříve než v krvi a ve větší kvantitě preferovaný vzorek pro negativní stáj (sperma je
ideální spíše pro pozitivní chov, kde se snažím limitovat šíření viru směrem dolů)
• •
možno směsování pro PCR diagnostiku (3-5 vz.) zpracování na PCR (PRRS) rychleji než standard na sérologii – chlazené do 24 hodin do lab. krev
24 h/pokojová t.
sérum 7-14 dní/2-8°C
3 dny/2-8°C déle při -20°
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve Odběr vzorků krve u kanců: • standardní odběr do HEMOS zkumavek – v. jugularis, v. cava anterior • alternativní odběry ü ušní žíly - v. auricularis ü ocasní žíla – v. caudalis mediana, perineal ü tarzální žíla – v. tarsalis (v. saphena lateralis – ne vždy vidět) na /do: ü filtrační papír (TEGO) ü tampon + PBS ü plast. kapilára ü mikrozkumavka KDY? ü na fantomu ü při ejakuaci!
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve „Blood swab metod“: krevní stěr
• komprese ušní žíly • narušení jehlou (20G) • stěr tamponem – tyčinka s polyesterovým tamponem • umístit do zkumavky s PBS (0,5-1 ml) • odběr během ejakulace • „flinch rate“= 10% (ne všichni kanci reagují pozitivně) • naředění (7-20x ředící efekt) = nižší sensitivita testu – směsování vzorků se nedoporučuje
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve „Blood-swab metod“ – shoda s ostatními vzorky
• citlivější než testování spermatu!
Reicks et al. 2006
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve „Blood-swab metod“:
V séru je mnohonásobně vyšší koncentrace viru než ve vzorku krevního stěru = rizika
NAVÍC brát v potaz: • • • •
Reicks et al. 2006
ideální podmínky experimentu krátká doba mezi odběrem a testováním neřeší se uchování a transport vzorku ELISA test na detekci protilátek použitelný jen při výrazném posunu cut – off (Patterson et al. 2007)
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve „Plastiková kapilára s mikrocenrifugační zkumavkou“
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve „Plastiková kapilára s mikrocenrifugační zkumavkou“: SAFE-T-FILL Serum Gel Capillary Collection (RAM Scientific, USA) • • • •
může obsahovat separační gel nebo antikoagulant výsledný vzorek je neředěné sérum cca 300 ul krve – může být málo pro dg zvíře musí být klidné – jinak vznik bublin v kapiláře
• alternativa: Bio- Tubes, Biovet inc, Kanada 600 ul krve Postup:
• narušení žíly jehlou často nestačí • potřeba malého skalpelu • ucho před zákrokem očistit alkoholem (ethanol nebo xylol) • nebo lze kapiláru vsunout do jehly (18G)
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve „Plastiková kapilární kapilární zkumavka “:
Patterson et et al. 2007
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve „Mikrozkumavky “: • • • • •
komprese ušní žíly narušení jehlou (20G) odběr do mikrozkumavky odběr během ejakulace na závěr opět komprese ušní žíly aby nevznikl hematom
Dewey et al. 2006
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve „TEGO™ swine blood collection kit “
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve „TEGO™ swine blood collection kit “ Detekce viru testem PCR – porovnání: sérum x TEGO
Detekce protilátek ELISA testem – porovnání: sérum x TEGO
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve VÝHODY alternativních odběrů z periferních žil: • jednodušší a méně invazivní odběry • bez fixace = méně stresu = welfare • bez rizik spojených s odběrem z v. jugularis – potencionální poranění štítné žlázy, n. vagus, ductus thoracicus • při pravidelném odběru méně nebezpečné pro kance i pro lékaře • odběr do kapiláry a mikrozkumavky srovnatelné se standardním odběrem z v. jugularis
Standardní a alternativní postupy odběrů vzorků krve NEVÝHODY alternativních odběrů z periferních žil: • v některých případech nižší sensitivita – naředění (stěry krve, filtrační papír) • nevhodné na směsování (stěry, papír) • v některých případech vyšší náklady? (TEGO, kapiláry) nutnost další validace postupů – testování v praxi
© Copyright The Norwegian School of Veterinary Science
Porcinní epidemická diarhoea (PED) Epidemický průjem prasat
Alphacoronavirus I. - VGP, PRCV Alphacoronavirus II. - PED Betcoronavirus - SARS Deltacoronavirus – SwDCV – Hong Kong, USA (Swine deltacoronavirus) Aktuální situace:
• • • •
• • • • • •
USA 2013 - genetická variabilita, kmeny s různou patogenitou Německo 2014 – výkrmny a dva chovy prasnic - kmen úzce příbuzný s kmeny INDEL v USA - nízká patogenita Rakousko 2014 – výkrmna s běhouny importovanými z Německa Nizozemsko 2014 Ukrajina 2014 – podobný virulentním kmenům z Číny a USA Slovensko 2015 (detekováno na SVÚ Jihlava) – nízce patogenní (5-6 dní průjem, do 10 dní úmrtnost 20-30% selat + prasnice 3-4 dny nežraly a nedávaly selatům mléko)
Porcinní epidemická diarhoea (PED) DIAGNOSTIKA na SVÚ Jihlava
Průkaz viru/NK • RT PCR nebo Real-time PCR – 1000,- Kč • imunochromatografický test - Anigen Rapid TGE/PED Ag Test – 200,- Kč (resp. 400 Kč s TGE) • ICH - pouze rychlý orientační (spíše stájový) test s nízkou sensitivitou – nutnost odběru vyššího počtu vz. • PCR – o několik řádů vyšší sensitivita i specifita Sérologický screening • ELISA Ab
Děkuji za pozornost!
STÁTNÍ VETERINÁRNÍ ÚSTAV JIHLAVA Oddělení virologie
