Sliny prasat jako vhodný diagnostický materiál MVDr. Petr Václavek, Ph.D. Státní veterinární ústav Jihlava
Chov prasat 2016, SCHP, Tři věžičky, 3. listopadu 2015
Možnosti virologické a sérologické diagnostiky ze slin prasat 1)
Úvod – co to jsou sliny resp. „orální tekutiny“
2)
Možnosti a limity testování ze slin
3)
Diagnostické metody a interpretace lab. výsledků
4)
Postup při odběrů vzorků a strategie vzorkování
5)
Trouble-shooting - doporučení
6)
Jak zacházet se vzorkem slin
7)
Strategie vzorkování / počet vzorků
8)
Závěrečné shrnutí
Úvod – Co jsou to „orální tekutiny“ ? „ORAL FLUIDS = OF“ OT = sliny + slizniční transudát + cervikální gingivální tekutina + sérové či lokální patogeny a protilátky (IgM, IgA, IgG) : • lokální – Ab ze slinných žláz (B buňky) a lymfoidní tkáně (B buňky MALT/DALT); patogeny z tonsil (např. virus KMP) • sérové – slizničního transudát – protilátky i patogeny + buněčný detritus, zbytky potravy, enzymy, antibakteriální látky, léky …apod.
Historie Sliny – humánní diagnostické testy: • přítomnost protilátek poprvé prokázána již v roce 1909 (Maltská horečka – B. melitensis)
• nyní jsou široce využívány testy ze slin např.: spalničky, HIV, Epstein-Barr virus, hepatitida (A, B, C), příušnice, zarděnky, M. tuberculosis , SARS, parvovirus, herpesvirus a další
• vývoj rychlých testů (20 min.)
Slinné biomarkery a možnosti jejich využití Biomarkery sliny/OT
možnosti jejich využití
DNA
standardní genotypizace bakteriální infekce diagnostika karcinomů hlavy a krku forenzní hledisko
RNA
virová/bakteriální identifikace karcinomy hlavy a krku
proteiny
diagnostika periodontitis diagnostika karcinomů hlavy a krku detekce zubního kazu
muciny/glykoproteiny
diagnostika karcinomů hlavy a krku detekce zubního kazu
imunoglobuliny
diagnostika virů (HIV, hepatitis B a C)
metabolity
diagnostika periodontitis
drogy a jejich metabolity
monitoring drog detekce drogy v těle
viry, bakterie
Epstein-Barr virus - reaktivace (mononukleóza), HIV, Hepatitida A, B, C, atd.
buněčný materiál
diagnostika karcinomů hlavy a krku
Sliny jako diagnostický vzorek ve veterinární medicíně: historie donedávna velmi málo využívané např. na: •
detekci Escherichia coli O157:H7 a Salmonella sp. ve výkrmu skotu
•
diagnostika viru kočičí leukémie
•
v souvislosti s možným přenosem – např. virus vztekliny
•
u prasat – virus ACH, virus vezikulární stomatitidy, virus SLAK apod.
•
výskyt specifických protilátek ve slinách prasat prokázán: u APP (1993), Streptococcus sk. E (1973) a podjednotka B choleratoxinu (2004).
Současnost Výzkum diagnostiky ze slin pro veterinární praxi (2007-2015): •
•
Veterinary Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary Diagnostic and Production Animal Medicine, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, Ames, IA Jeff Zimmerman, John Prickett a další
EUROPEAN LAB NETWORK FOR ORAL FLUID DIAGNOSIS IN PIGS (2012 – 2015)
Možnosti a limity testování ze slin u prasat Detekce specifických protilátek: PCV2, PRRSV, SIV, Actinobacillus pleuropneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae Detekce patogenů (genom, NK): PCV-2, PRRSV, SIV, virus KMP, Mycoplasma hyopneumoniae, virus SLAK, BVDV, virus Aujeszkyho choroby, virus vezikulární stomatitidy, Erysipelothrix rhusiopathiae, apod.
ALE NE VŽDY IDEÁLNÍ, např.:
Mycoplasma hyopneumoniae – interpretace PCR?- falešně negativní?
(spíše hluboké výtěry z průdušnice a laváže, výťěry z bronchů, změněná plicní tkáň, sérologie –párové vzorky)
Actinobacillus pleuropneumoniae – PCR pozitivní jen 1-7 den po
infekci (Costa G., et al. 2012)
Další probíhající výzkum využití slin v diagnostice: např. M. hyorhinis, Lawsonia intracellularis, virus AMP, Salmonella spp., virus PED, Haemophilus parasuis, apod. ale také ATB (byly podány ATB?, dostatečné množství?, odbourávání ATB? apod.) a detekce proteinů akutní fáze apod.
Současné praktické využití slin jako diagnostického vzorku PATOGEN
DETEKCE PROTILÁTEK ELISA
DETEKCE VIRU (NK) PCR
porcinní reprodukční a respiratorní syndrom (PRRS)
ANO
ANO
virus chřipky (SIV)
ANO
ANO
porcinní cirkovirus 2 (PCV2)
ANO
ANO
Mycoplasma hyopneumoniae
ANO
NE
Dostupné diagnostické testy Patogen
Diagnostický test
PRRSV
RT PCR and nested PCR (diferenciace EU a AM kmene) q Real-time RT PCR ELISA Oral Fluid IDEXX
PCV2
q PCR ELISA IgM, IgG
všechny tyto testy na „sliny“ již akreditovány a k dispozici v laboratoři SVÚ JIHLAVA
Semikvantitativní ELISA (Synbiotics – Merial/LDA22) SIV
RT PCR blokovací ELISA IDEXX
M. hyop.
PCR
Mezilaboratorní porovnání testů ze slin – mezinárodní kruhové testy Účast SVÚ Jihlava v rámci EUROPEAN LAB NETWORK FOR ORAL FLUID DIAGNOSIS IN PIGS Test I. (2013) - panel vzorků na porovnání testů: • anti-PCV2 protilátky ve slinách - ELISA • anti-PRRSV protilátky ve slinách - IDEXX OF ELISA • virus PRRSV ze slin – Real time RT PCR • virus chřipky (SIV) ze slin – RT PCR Test II. (2014) - panel vzorků na porovnání schopnosti detekce viru PRRS metodou RT PCR ve vzorcích slin – různé kmeny viru, různá ředění, jedna metoda společná + jedna vlastní, různé extrakce apod.
IDEXX PRRS OF Ab Test
• • • =
optimalizované ředění vzorku (1:2) změna v inkubaci vzorků (2 hodiny) změna konjugátu výsledná sensitivita 100% a specifita 98,7 %
Protilátková odpověď proti viru PRRS (kmeny typu I a II) v séru a ve slinách
= malé rozdíly mezi časem, kdy lze detekovat protilátky v séru a ve slinách
PCR testy a sliny • využívány běžné laboratorní PCR testy • stejný postup jako v případě séra a tkání (pouze jiná matrice) Graf: Výsledky testu qRT-PCR na PRRSV v séru a ve slinách (+ objem získaných slin): 1a. Ingelvac PRRS MLV 2b. terénní virus TYP 1 (US) 3c. terénní virus TYP 2 (EU)
PRRSV ve slinách – qRT-PCR
PCV-2 ve slinách - qReal-time PCR: INTERPRETACE VÝSLEDKŮ pouze průkaz viru zde nestačí, pro interpretaci je nezbytné znát kvantitu viru !!! kvantitativní výsledek ze séra (jednotlivé vzorky) vs. kvantitativní výsledek ze slin (= směsný vzorek) • kvantita viru vyjádřena v počtu kopií DNA viru na gram/ml vzorku (PCV-2 DNA log10) – např. Harding et al. 2008 • experimentálně stanoveny cut-off koncentrace k rozlišení zdravých x nemocných prasat (PMWS): Ø cut-off pro vzorek tkáně = 7-8/gram Ø cut-off pro vzorek séra = 4-5/ml Ø cut-off pro sliny = ??? (interpretace výsledku)
Interpretace laboratorních výsledků • PCR = co se děje právě nyní = šíří prasata virus? PCRpozitivní výsledek reflektuje aktivní cirkulaci patogena v populaci. • ELISA Ab – pohled zpět = byl tam dříve virus? Upozornění: aby jste se vyhnuli falešně negativním výsledkům, ELISA testy a PCR testy určené k detekci ze séra musí být validované na vzorky slin. Před zasláním vzorků dotazovat laboratoř.
• jestliže není validace = opatrně interpretovat výsledky
Postup při odběrů vzorků Materiál potřebný k odběru slin u prasat
Prickett JR et al. 2008
Postup při odběrů vzorků 1) upevnění provazu 2) 20-30 min. nechat prasata žvýkat provaz 3) sběr slin z provazu 4) slití slin do zkumavky a uskladnění
Postup při odběrů vzorků
1) Upevnění provazu • • • •
na místo kam mohou všechna prasata, v čistější části kotce, ne přímo u zdroje vody a u krmiva délka: do výšky kohoutku prasat přítomných v kotci Ø 1.3 cm provaz - předvýkrm; Ø 1.6 cm provaz - výkrm 1 provaz/10-25 prasat (kotec)
Postup při odběrů vzorků
2) prasata žvýkají provaz • 20-30 minut je dostatečný čas (70-80% prasat/kotec o 25ks)
Postup při odběrů vzorků
Žvýkala provaz všechna prasata? = reprezentativní vzorek pro všechna prasata v kotci
Seddon et al. 2012
V praxi se potvrzuje, že u prasat zvyklých na provaz je 20-30 min. dostatečný čas na to, aby se na něm vystřídalo 70 – 90 % zvířat z kotce (25 kusů/kotec), což je již dostatečně reprezentativní vzorek pro celou skupinu.
Postup při odběrů vzorků
3) sběr slin z provazu • mokrý konec provazu do igelitového sáčku • vymačkejte/vyždímejte provaz a sliny shromážděte v jednom rohu sáčku
Postup při odběrů vzorků
4) slití slin do zkumavky a uskladnění • ustřihněte roh sáčku a slijte sliny do zkumavky (nejlépe 50-mL plastová centrifugační zkumavka) • 4 ml vzorku je ideální pro následné testování (min. 2,5 ml) • uchování – lednička nebo mrazák – zachovat chladící řetězec! • rychlé odeslání do laboratoře (4°C)
Trouble-shooting: doporučení •
nesměsujte vzorky slin – již jsou „směsný vzorek“
•
provaz – bavlna /bez latexu/ bez chemie
•
trénování prasat (“trénovací provaz“) ü ü ü
•
„ochuťte“ provaz roztokem cukru (popř. džus, pivo) nenechávat provaz přes noc nepoužívejte provaz určený k tréningu zároveň k odběru
na porodně vzorkujte starší prasata (20-25. den stáří -
jsou agresivnější a provaz je více přitahuje než mladší selata)
•
ochucení provazu pomáhá u mladých nebo nemocných selat
•
prasata jsou více aktivní ráno
•
nečistý vzorek = provaz moc dlouhý
•
nevyndávat provaz z kotce předčasně
•
odstraňte pokaždé všechny provazy
•
použitý provaz nikdy nepoužívat znova
Jak zacházet se vzorkem slin Veterinární lékař: • vzorky, které budou odeslány v den odběru, zachladit a zaslat na ledu (4°C) • NEBO okamžitě zamrazit • dodržovat chladící řetězec k ochraně vzorku • před odesláním vzorky dobře zabalit (zabránit vytékání slin) – nejlépe do igelitového sáčku a do chladícího boxu Laboratoř: • čiré vzorky slin není potřeba dále zpracovávat • výrazně znečištěné vzorky slin centrifugovat 10 minut (1000g při 4°C) a pak přepipetovat do čisté zkumavky – testován je supernatant
Strategie vzorkování Sliny = směsný vzorek = diagnóza na úrovni stáda cenově výhodný program surveillance POČET VZORKŮ (počet provazů) and FREKVENCE vzorkování záleží na: • počtu zvířat (na farmě, v kotci) • prevalenci • specifitě a sensitivitě diagnostického testu • důvodu testování (diagnostika onemocnění, monitoring) Příklad – rutinní surveillance se 30 vzorky séra /měsíc NEBO místo toho vzorkovat sliny např. 6 kotců (provazů)/ 1000 ks odstavčat každé dva týdny?
Strategie vzorkování Sliny = směsný vzorek = diagnóza na úrovni stáda cenově výhodný program surveillance
Diagnostika onemocnění (PRRS, PCV2, SIV)
• u nemocných zvířat = akutní infekce = virémie = PCR (např. PRRSV 2-3 (5) týdnů virémie) • po odeznění klinických příznaků = sérokonverze = ELISA - za 2 týdny pro SIV (7-42 dpi), PCV2 (14 to 198 dpi) - za 4 týdny PRRSV (resp. 7 dpi)
např. 2-5 provazů (vzorků) / farma Monitoring
• určení nákazového statusu stáda (PRRSV, SIV) • nebo např. monitoring s cílem zavedení vakcinace prasnic
např. 6 provazů (vzorků) / 2 týdny / farma
Kalkulace nákladů monitoringu PRRS a srovnání s diagnostikou ze séra Příklad – rutinní surveillance se 30 vzorky séra /měsíc NEBO vzorkovat sliny např. 6 kotců (provazů) / 1000 ks odstavčat každé dva týdny. Ceny: • ELISA ze séra = 150,- Kč / 1 vz. 30 vzorků séra = 4500,- Kč / 1 měsíc • ELISA ze slin = 260,- Kč / 1 vz. 6 vzorků slin = 1560,- Kč (1x za 2 týdny) = 3120,- / 1 měsíc NEBO jinak: 4500,- Kč = 17 x testování slin (20 zvířat/provaz), tzn. monitoruji 17 kotců = 340 zvířat
ANEB „za méně peněz více muziky“ ??? Využití slin = možnost zavedení rozsáhlejšího monitoringu, častější testování, s vyšší sensitivitou na úrovni farmy, což poskytne přesnější mapování epizootologické situace.
SPRÁVNÝ POČET VZORKŮ Počet vzorků pro 95% jistotu detekce infekce (1 nebo více) s testem se 100% senzitivitou Prevalence (%)
Velikost populace
50
40
30
25
20
15
10
5
2
1
0.5 0.1
20
4
6
7
9
10
12
16
19
20
20
20
20
30
4
6
8
9
11
14
19
26
30
30
30
30
40
5
6
8
10
12
15
21
31
40
40
40
40
50
5
6
8
10
12
16
22
35
46
50
50
50
60
5
6
8
10
12
16
23
38
55
60
60
60
70
5
6
8
10
13
17
24
40
62
70
70
70
80
5
6
8
10
13
17
24
42
68
79
80
80
90
5
6
8
10
13
17
25
43
73
87
90
90
100
5
6
9
10
13
17
25
45
78
96
100
100
150
5
6
9
11
13
18
27
49
95
130
148
150
200
5
6
9
11
13
18
27
51
105
155
190
200
500
5
6
9
11
14
19
28
56
129
225
349
500
1000
5
6
9
11
14
19
29
57
138
258
450
950
5000
5
6
9
11
14
19
29
59
147
290
564 2253
10000
5
6
9
11
14
19
29
59
148
294
581 2588
∞
5
6
9
11
14
19
29
59
149
299
596 2995
Správný počet vzorků? Příklad: detekce viru PRRS metodou RT-PCR Kolik mám odebrat vz. slin abych potvrdil virus v chovu?? Požadované proměnné: • velikost (četnost) populace (hala/farma) – 1000 zvířat • prevalence (procento infikovaných zvířat) - 10% - 70% • požadovaná jistota detekce infekce (konfidence) – 95% • diagnostická sensitivita testu – např. 87,5% Tab. Kolik bych měl testovat kotců (počet provazů) abych detekoval PRRSV ve vzorcích slin. prevalence PRRSV (sérum)
jistota detekce 95%
10%
19 vzorků
20%
6 vzorků
30%
3 vzorky
40%
1 vzorek
50%
1 vzorek
60%
1 vzorek
70%
1 vzorek Robben et al. 2014
Závěrečné shrnutí Nahradí vzorky slin vzorky séra např. v surveillance PRRSV? • je to výborná nová pomůcka pro veterinární lékaře, chovatele, zootechniky i epidemiology • ALE vzorky slin jsou reprezentativní pro populaci a nemůžou nikdy zcela nahradit individuální vzorky např. - při snaze o izolaci mikroorganismů - u kvantitativního vyhodnocování výsledků (např. PCV2)
Závěrečné shrnutí 1 – negativa • manipulace se vzorky a způsob odeslání vzorků slin ovlivňuje kvalitu výsledků • ne vždy zcela vhodné pro sající selata a pro prasnice • nižší koncentrace viru oproti séru - problémy (někdy) s izolací a sekvenací • specifické laboratorní testy – přizpůsobení a validace testu • sensitivita =? (např. PCR na SIV - sliny vs. nosní výtěry? ) • pravděpodobně není vhodné pro některé rutinně testované patogeny – APP, M. hyopneumoniae = zdvojené vzorkování (krev + sliny) v některých případech?
Závěrečné shrnutí 2 - pozitiva • cenově výhodný monitoring populace popř. surveillance program • neinvazivní sběr vzorku: welfare (bez stresu) • jednoduchý odběr vzorků • zjednodušené vzorkování by mohlo umožnit častější testování za stejné náklady a poskytnout tak přesnější epidemiologickou situaci – vyšší sensitivita na úrovni farmy • vzorky slin = více reprezentují populaci ve srovnání s tradičními individuálními 30 vzorky séra/měs. • umožňuje rozsáhlý monitoring (PRRSV, PCV2, SIV) • široký potenciál – monitoring dalších patogenů?
Informace www.svujihlava.cz www.mevet.cz Jirásek T., Václavek P. Sliny prasat jako vhodný diagnostický materiál – praktické zkušenosti. Veterinářství 2014; 64: VIDEO - http://www.cfsph.iastate.edu/video.php?link=oral-fluid-collection-in-pigs PUBLIKACE, např.: • • •
• •
Prickett, J. R. et al. Oral– fluid samples for surveillance of commercial growing pigs for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and circovirus type 2 infections. J Swine Health Prod 2008;16:86-91. Seddon, M. Y., et al. Optimising oral fluid collection from groups of pigs: Effect of housing system and provision of ropes. Vet Journal 2012;193:180-184. Kittawornrat, A., et al. Detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) antibodies in oral fluid specimens using a commercial PRRSV serum antibody enzyme-linked immunosorbent assay. J Vet Diagn Invest. 2012;24(2):262269. Prickett, J., et al. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in porcine oral fluid samples: A longitudinal study under experimental conditions. J Vet Diagn Invest 2008;20:156-163 Kittawornrat, A., et al. Ring test evaluation of the repeatability and reproducibility of a Porcine reproductive and respiratory syndrome virus oral fluid antibody enzymelinked immunosorbent assay. J Vet Diagn Invest 2012;24(6):1057-63.
Děkuji za pozornost!
STÁTNÍ VETERINÁRNÍ ÚSTAV JIHLAVA Oddělení virologie
