Sliny prasat jako vhodný diagnostický materiál MVDr. Petr Václavek, Ph.D. Státní veterinární ústav Jihlava
Chov prasat 2016, SCHP, Tři věžičky, 3. listopadu 2015
Sliny prasat jako vhodný diagnostický materiál OBSAH: 1) Úvod – co to jsou sliny resp. „orální tekutiny“ 2) Diagnostické metody a interpretace lab. výsledků 3) Postup při odběrů vzorků 4) Trouble-shooting - doporučení 5) Jak zacházet se vzorkem slin 6) Strategie vzorkování (počet vz.) 7) Závěrečné shrnutí
Úvod – Co jsou to „orální tekutiny“ = OT? „ORAL FLUIDS = OF“ OT = sliny + sérový transudát (slizniční transudát + cervikální gingivální tekutina) OT obsahuje sérové či lokální patogeny a protilátky (IgM, IgA, IgG): Ø lokální – Ab ze slinných žláz (B buňky) a lymfoidní tkáně (B buňky MALT/DALT); patogeny z tonsil (např. virus KMP) Ø sérové – slizničního transudát – protilátky i patogeny ze séra/krve + buněčný detritus, zbytky potravy, enzymy, antibakteriální látky, léky…apod.
Historie Sliny – humánní diagnostické testy: • přítomnost protilátek poprvé prokázána již v roce 1909 (Maltská horečka – B. melitensis)
• nyní jsou široce využívány testy ze slin např.: spalničky, HIV, Epstein-Barr virus, hepatitida (A, B, C), příušnice, zarděnky, M. tuberculosis , SARS, parvovirus, herpesvirus a další
• vývoj rychlých testů (20 min.)
Slinné biomarkery a možnosti jejich využití Biomarkery sliny/OT
možnosti jejich využití
DNA
standardní genotypizace bakteriální infekce diagnostika karcinomů hlavy a krku forenzní hledisko
RNA
virová/bakteriální identifikace karcinomy hlavy a krku
proteiny
diagnostika periodontitis diagnostika karcinomů hlavy a krku detekce zubního kazu
muciny/glykoproteiny
diagnostika karcinomů hlavy a krku detekce zubního kazu
imunoglobuliny
diagnostika virů (HIV, hepatitis B a C)
metabolity
diagnostika periodontitis
drogy a jejich metabolity
monitoring drog detekce drogy v těle
viry, bakterie
Epstein-Barr virus - reaktivace (mononukleóza), HIV, Hepatitida A, B, C, atd.
buněčný materiál
diagnostika karcinomů hlavy a krku
Sliny jako diagnostický vzorek ve veterinární medicíně: historie donedávna velmi málo využívané např. na: •
detekci Escherichia coli O157:H7 a Salmonella sp. ve výkrmu skotu
•
diagnostika viru kočičí leukémie
•
v souvislosti s možným přenosem – např. virus vztekliny
•
u prasat – virus ACH, virus vezikulární stomatitidy, virus SLAK apod.
•
výskyt specifických protilátek ve slinách prasat prokázán: u APP (1993), Streptococcus sk. E (1973) a podjednotka B choleratoxinu (2004).
Současnost Výzkum diagnostiky ze slin pro veterinární praxi (2007-2015): •
•
Veterinary Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary Diagnostic and Production Animal Medicine, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, Ames, IA Jeff Zimmerman, John Prickett a další
EUROPEAN LAB NETWORK FOR ORAL FLUID DIAGNOSIS IN PIGS (2012 – 2015) Evropská laboratorní síť pro diagnostiku z orálních tekutin u prasat
Možnosti a limity testování ze slin u prasat Detekce specifických protilátek: PRRSV, SIV, PCV2, Actinobacillus pleuropneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae, PED Detekce patogenů (genom, NK): PRRSV, SIV, PCV2, virus KMP, Mycoplasma hyopneumoniae, virus PED, virus SLAK, BVDV, virus Aujeszkyho choroby, virus vezikulární stomatitidy, Erysipelothrix rhusiopathiae, apod.
ALE NE VŽDY IDEÁLNÍ, např.:
Mycoplasma hyopneumoniae – interpretace PCR?- falešně negativní?
(spíše hluboké výtěry z průdušnice a laváže, výťěry z bronchů, změněná plicní tkáň, sérologie –párové vzorky)
Actinobacillus pleuropneumoniae – PCR pozitivní jen 1-7 den po
infekci (Costa G., et al. 2012)
Další probíhající výzkum využití slin v diagnostice: např. M. hyorhinis, Lawsonia intracellularis, virus AMP, Salmonella spp., virus PED, Haemophilus parasuis, APP apod. ale také ATB (byly podány ATB?, dostatečné množství?, odbourávání ATB? apod.) a detekce proteinů akutní fáze, kortizol, progesteron apod.
Současné praktické využití slin jako diagnostického vzorku PATOGEN
DETEKCE PROTILÁTEK ELISA
DETEKCE VIRU (NK) PCR
porcinní reprodukční a respiratorní syndrom (PRRS)
ANO
ANO
virus chřipky (SIV)
ANO
ANO
porcinní cirkovirus 2 (PCV2)
ANO
ANO
Mycoplasma hyopneumoniae
NE
ANO
epidemický průjem prasat (PED)
ANO
ANO
Actinobacillus pleuropneumoniae
ANO (?)
NE
Dostupné diagnostické testy Patogen
Diagnostický test
PRRSV
RT PCR and nested PCR (diferenciace EU a AM kmene) q Real-time RT PCR ELISA Oral Fluid IDEXX
PCV2
q PCR ELISA IgM, IgG
všechny tyto testy na „sliny“ již akreditovány a k dispozici v laboratoři SVÚ JIHLAVA
Semikvantitativní ELISA (Synbiotics – Merial/LDA22) SIV
RT PCR blokovací ELISA IDEXX
M. hyop.
PCR
PED
PCR (+ ELISA?)
Mezilaboratorní porovnání testů ze slin: mezinárodní kruhové testy Účast SVÚ Jihlava v rámci EUROPEAN LAB NETWORK FOR ORAL FLUID DIAGNOSIS IN PIGS Test I. (2013) - panel vzorků na porovnání testů: • anti-PCV2 protilátky ve slinách - ELISA • anti-PRRSV protilátky ve slinách - IDEXX OF ELISA • virus PRRSV ze slin – Real-time RT PCR • virus chřipky (SIV) ze slin – RT PCR Test II. (2014) - panel vzorků na porovnání schopnosti detekce viru PRRS metodou RT PCR ve vzorcích slin – různé kmeny viru, různá ředění, jedna metoda společná + jedna vlastní, různé extrakce apod.
Průkaz protilátek proti viru PRRS
IDEXX PRRS OF Ab Test
• • • =
optimalizované ředění vzorku (1:2) změna v inkubaci vzorků (2 hodiny) změna konjugátu výsledná sensitivita 100% a specifita 98,7 % Kittawornrat et al. 2010, 2011, 2012
Protilátková odpověď proti viru PRRS (kmeny typu I a II) v séru a ve slinách
= malé rozdíly mezi časem, kdy lze detekovat protilátky v séru a ve slinách
PRRS,PCR testy a sliny • využívány běžné laboratorní PCR testy • stejný postup jako v případě séra a tkání (pouze jiná matrice) Graf: Výsledky testu qRT-PCR na PRRSV v séru a ve slinách (+ objem získaných slin): 1a. Ingelvac PRRS MLV 2b. terénní virus TYP 1 (US) 3c. terénní virus TYP 2 (EU) 0-13 den více viru v krvi, ALE 14-21 více viru v OF !
PRRSV ve slinách/séru – qRT-PCR
SLINY vs. SÉRUM = identická doba detekované virémie = 4-5 týdnů
PCV2Ab semikvantitativní ELISA (Synbiotics – Merial/LDA22)
• • • • • •
SERELISA® PCV2 Ab Mono Blocking ELISA (Synbiotics) test je modifikován - přizpůsoben na detekci Ab proti PCV2 ze slin spolupráce Merial + LDA22 (Ploufragan - Saint Brieuc, France) částečně kvantitativní výsledek (titry protilátek) jiné ředění vzorku slin než u séra problematická je interpretace titrů, neboť se jedná o „směsný vzorek“
PCV-2 ve slinách - qReal-time PCR: INTERPRETACE VÝSLEDKŮ pouze průkaz viru zde nestačí, pro interpretaci je nezbytné znát kvantitu viru !!! kvantitativní výsledek: sérum (jednotlivé vz.) VS. sliny (= směsné vz.) • •
kvantita viru vyjádřena v počtu kopií DNA viru na gram/ml vzorku (PCV-2 DNA log10) – např. Harding et al. 2008 experimentálně stanoveny cut-off koncentrace k rozlišení zdravých x nemocných prasat (PMWS): Ø cut-off pro vzorek tkáně = 7-8/gram Ø cut-off pro vzorek séra = 4-5/ml Ø cut-off pro sliny = ??? (interpretace výsledku)
Interpretace laboratorních výsledků • PCR = co se děje právě nyní = šíří prasata virus? PCRpozitivní výsledek indikuje rannou fázi infekce a aktivní cirkulaci patogena v populaci. • ELISA Ab – imunita stáda, pohled zpět = byl tam virus? Upozornění: aby jste se vyhnuli falešně negativním výsledkům, ELISA testy a PCR testy určené k detekci ze séra musí být validované na vzorky slin. Před zasláním vzorků doporučujeme dotazovat laboratoř.
• jestliže není validace testu = opatrně interpretovat výsledky
Postup při odběrů vzorků Materiál potřebný k odběru slin u prasat
Prickett JR et al. 2008
Postup při odběrů vzorků 1) upevnění provazu 2) 20-30 min. nechat prasata žvýkat provaz 3) sběr slin z provazu 4) slití slin do zkumavky a uskladnění
© IDEXX Laboratories, Inc.
Postup při odběrů vzorků
1) Upevnění provazu • • • •
© Dr. Keith Erlandson
na místo kam mohou všechna prasata, v čistější části kotce, ne přímo u zdroje vody a u krmiva délka: do výšky kohoutku prasat přítomných v kotci Ø 1.3 cm provaz - předvýkrm; Ø 1.6 cm provaz - výkrm 1 provaz/10-25 prasat (kotec)
Postup při odběrů vzorků
© MVDr. Jiří Malášek
Postup při odběrů vzorků
2) prasata žvýkají provaz • 20-30 minut je dostatečný čas (70-80% prasat/kotec o 25ks)
Žvýkala provaz všechna prasata? = reprezentativní vzorek pro všechna prasata v kotci
Seddon et al. 2012
V praxi se potvrzuje, že u prasat zvyklých na provaz je 20-30 min. dostatečný čas na to, aby se na něm vystřídalo 70 – 90 % zvířat z kotce (25 kusů/kotec), což je již dostatečně reprezentativní vzorek pro celou skupinu.
Postup při odběrů vzorků
© Dr. Keith Erlandson
3) sběr slin z provazu • mokrý konec provazu do igelitového sáčku • vymačkejte/vyždímejte provaz a sliny shromážděte v jednom rohu sáčku
Postup při odběrů vzorků
© Dr. Keith Erlandson
4) slití slin do zkumavky a uskladnění • ustřihněte roh sáčku a slijte sliny do zkumavky (nejlépe 50-mL plastová centrifugační zkumavka) • 4 ml vzorku je ideální pro následné testování (min. 2,5 ml) • uchování – lednička nebo mrazák – zachovat chladící řetězec! • rychlé odeslání do laboratoře (4°C)
Trouble-shooting: doporučení •
nesměsujte vzorky slin – již jsou „směsný vzorek“
•
provaz – bavlna /bez latexu/ bez chemie
•
trénování prasat (“trénovací provaz“) ü ü ü
•
„ochuťte“ provaz roztokem cukru (popř. džus, pivo) nenechávat provaz přes noc nepoužívejte provaz určený k tréningu zároveň k odběru
na porodně vzorkujte starší prasata (20-25. den stáří -
jsou agresivnější a provaz je více přitahuje než mladší selata)
•
ochucení provazu pomáhá u mladých nebo nemocných selat
•
prasata jsou více aktivní ráno
•
nečistý vzorek = provaz moc dlouhý
•
nevyndávat provaz z kotce předčasně
•
odstraňte pokaždé všechny provazy
•
použitý provaz nikdy nepoužívat znova
Jak zacházet se vzorkem slin (uskladnění + transport)
Veterinární lékař: • vzorky, které budou odeslány v den odběru, zachladit a zaslat na ledu (2-8°C /max. 24 hodin) • NEBO okamžitě zamrazit • dodržovat chladící řetězec k ochraně vzorku • před odesláním vzorky dobře zabalit (zabránit vytékání slin) – nejlépe do igelitového sáčku a do chladícího boxu Laboratoř: • výrazně znečištěné vzorky slin centrifugovat 10 minut (1000g při 4°C) a pak přepipetovat do čisté zkumavky – testován je supernatant
Strategie vzorkování Sliny = směsný vzorek = diagnóza na úrovni stáda cenově výhodný program surveillance POČET VZORKŮ (počet provazů) and FREKVENCE vzorkování záleží na: • počtu zvířat (na farmě, v kotci) • prevalenci • specifitě a sensitivitě diagnostického testu • důvodu testování (diagnostika onemocnění, monitoring) Příklad – rutinní surveillance se 30 vzorky séra /měsíc NEBO místo toho vzorkovat sliny např. 6 kotců (provazů)/ 1000 ks odstavčat každé dva týdny?
SPRÁVNÝ POČET VZORKŮ - SÉRUM Počet vzorků pro 95% jistotu detekce infekce (1 nebo více) s testem se 100% senzitivitou Prevalence (%)
Velikost populace
50
40
30
25
20
15
10
5
2
1
0.5 0.1
20
4
6
7
9
10
12
16
19
20
20
20
20
30
4
6
8
9
11
14
19
26
30
30
30
30
40
5
6
8
10
12
15
21
31
40
40
40
40
50
5
6
8
10
12
16
22
35
46
50
50
50
60
5
6
8
10
12
16
23
38
55
60
60
60
70
5
6
8
10
13
17
24
40
62
70
70
70
80
5
6
8
10
13
17
24
42
68
79
80
80
90
5
6
8
10
13
17
25
43
73
87
90
90
100
5
6
9
10
13
17
25
45
78
96
100
100
150
5
6
9
11
13
18
27
49
95
130
148
150
200
5
6
9
11
13
18
27
51
105
155
190
200
500
5
6
9
11
14
19
28
56
129
225
349
500
1000
5
6
9
11
14
19
29
57
138
258
450
950
5000
5
6
9
11
14
19
29
59
147
290
564 2253
10000
5
6
9
11
14
19
29
59
148
294
581 2588
∞
5
6
9
11
14
19
29
59
149
299
596 2995
Správný počet vzorků slin? Příklad: detekce viru PRRS metodou RT-PCR Kolik mám odebrat vz. slin abych potvrdil virus v chovu?? Požadované proměnné: • velikost (četnost) populace (hala/farma) – 1000 zvířat • prevalence (procento infikovaných zvířat) - 10% - 70% • požadovaná jistota detekce infekce (konfidence) – 95% • diagnostická sensitivita testu – např. 87,5% Tab. Kolik bych měl testovat kotců (počet provazů) abych detekoval PRRSV ve vzorcích slin. prevalence PRRSV (sérum)
jistota detekce 95%
10%
19 vzorků
20%
6 vzorků
30%
3 vzorky
40%
1 vzorek
50%
1 vzorek
60%
1 vzorek
70%
1 vzorek Robben et al. 2014
Správný počet vzorků slin? Příklad: detekce protilátek proti viru PRRS metodou ELISA IDEXX OF Kolik mám odebrat vz. slin abych potvrdil výskyt PRRS v chovu?? prevalence PRRSV ELISA (sérum) (% + v kotci)
Prasat (+/celkem)
Pravděpodobnost detekce ze slin
4%
1/25
12%
Počet vzorků séra k dosažení pravděpodobnosti jako ze slin
95% pravděpodobnost detekce
15%
4 vz.
24 vz.
3/ 25
45%
5 vz.
16 vz.
20%
5 /25
75%
7 vz.
12 vz.
36%
9 /25
95%
8 vz.
8 vz. Olsen et al. 2013
IDEXX Laboratories, Inc. – uvádí že při 20% prevalenci v kotci jsou protilátky detekovány testem ELISA PRRS IDEXX OF Ab Test s 96% jistotou. Při prevalenci 20-30% v kotci je stejná pravděpodobnost detekce z jednoho vzorku slin jako při testování jednotlivých vz. krve (8 vz. krve).
Pravděpodobnost detekce (%)
Pravděpodobnost detekce z jednoho odebraného séra či z jednoho vzorku slin (ELISA nebo RT-PCR)
jeden vzorek slin jeden vzorek séra
Prevalence v kotci (%) Olsen et al. 2013
Strategie vzorkování slin Sliny = směsný vzorek = diagnóza na úrovni stáda cenově výhodný program surveillance
Diagnostika onemocnění (PRRS, PCV2, SIV, PED)
• u nemocných zvířat (horečka, resp. problémy apod.) = akutní infekce = virémie = PCR (např. PRRSV 2-3 (5) týdnů virémie) • po odeznění klinických příznaků = sérokonverze = ELISA - za 2 týdny pro SIV (7-42 dpi), PCV2 IgG (14 to 198 dpi) - od 7-9 dpi IgG pro PRRSV
např. 2-4 provazů (vzorků) / farma (hala)
(v akutní fázi pro PCR, 1-2 týdny po akutní fázi ELISA + PCR)
Pravidelný monitoring / aktivní surveillance (PRRSV, SIV) •
popř. určení/potvrzení nákazového statusu stáda, nebo monitoring s cílem zavedení vakcinace prasnic
např. 4-6 provazů (vzorků) / 2-4 týdny / farma (1000 ks) Pricket et al. 2007, Pricket et al. 2008, Olsen elt al. 2013, Robben et al. 2014 atd.
Kalkulace nákladů monitoringu PRRS (OT x sérum)
X Příklad: rutinní surveillance se 30 vzorky séra/měsíc NEBO vzorkovat sliny např. 6 kotců (provazů) / 1000 ks prasat každé dva týdny. Ceny: • ELISA ze séra = 150,- Kč / 1 vz. 30 vzorků séra = 4500,- Kč / 1 měsíc • ELISA ze slin = 260,- Kč / 1 vz. 6 vzorků slin = 1560,- Kč (1x za 2 týdny) = 3120,- Kč / 1 měsíc NEBO jinak: 4500,- Kč = 17 x testování slin (20 zvířat/provaz), tzn. 17 kotců = 340 zvířat
ANEB „za méně peněz více muziky“ ??? Využití slin = možnost zavedení rozsáhlejšího monitoringu, častější testování, s vyšší sensitivitou na úrovni farmy, což poskytne přesnější mapování epizootologické situace.
Závěrečné shrnutí Nahradí vzorky slin vzorky séra např. v surveillance PRRSV? • je to výborná nová pomůcka pro veterinární lékaře, chovatele, zootechniky i epidemiology • ALE vzorky slin jsou reprezentativní pro populaci a nemůžou nikdy zcela nahradit individuální vzorky např. - při snaze o izolaci mikroorganismů - u kvantitativního vyhodnocování výsledků (např. PCV2)
Závěrečné shrnutí 1 – negativa • manipulace se vzorky a způsob odeslání vzorků slin ovlivňuje kvalitu výsledků • ne vždy zcela vhodné pro sající selata a pro prasnice • nižší koncentrace živého viru oproti séru - problémy (někdy) s izolací a sekvenací • • • •
specifické laboratorní testy – přizpůsobení a validace testu sensitivita =? (např. PCR na SIV - sliny vs. nosní výtěry? ) dubiózní výsledek ze slin je nutné konfirmovat odběrem sér pravděpodobně není vhodné pro některé rutinně testované patogeny – APP, M. hyopneumoniae = zdvojené vzorkování (krev + sliny) v některých případech?
Závěrečné shrnutí 2 - pozitiva • cenově výhodný monitoring populace popř. surveillance program • neinvazivní sběr vzorku: welfare (bez stresu) • jednoduchý odběr vzorků • zjednodušené vzorkování by mohlo umožnit častější testování za stejné náklady a poskytnout tak přesnější epidemiologickou situaci – vyšší sensitivita na úrovni farmy • vzorky slin = více reprezentují populaci ve srovnání s tradičními individuálními 30 vzorky séra/měs. • umožňuje rozsáhlý monitoring (PRRSV, PCV2, SIV) • široký potenciál – monitoring dalších patogenů?
Informace PREZENTACE www.svujihlava.cz www.mevet.cz VIDEO - http://www.cfsph.iastate.edu/video.php?link=oral-fluid-collection-in-pigs PUBLIKACE, např.: Jirásek T., Václavek P. Sliny prasat jako vhodný diagnostický materiál – praktické zkušenosti. Veterinářství 2014; 64: • • • • •
Prickett, J. R. et al. Oral– fluid samples for surveillance of commercial growing pigs for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and circovirus type 2 infections. J Swine Health Prod 2008; 16:86-91. Seddon, M. Y., et al. Optimising oral fluid collection from groups of pigs: Effect of housing system and provision of ropes. Vet Journal 2012; 193:180-184. Kittawornrat, A., et al. Detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) antibodies in oral fluid specimens using a commercial PRRSV serum antibody enzyme-linked immunosorbent assay. J Vet Diagn Invest. 2012; 24(2):262-269. Prickett, J., et al. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in porcine oral fluid samples: A longitudinal study under experimental conditions. J Vet Diagn Invest 2008; 20:156-163 Kittawornrat, A., et al. Ring test evaluation of the repeatability and reproducibility of a Porcine reproductive and respiratory syndrome virus oral fluid antibody enzyme-linked immunosorbent assay. J Vet Diagn Invest 2012;24(6):1057-63.
Děkuji za pozornost!
STÁTNÍ VETERINÁRNÍ ÚSTAV JIHLAVA Oddělení virologie
