Molekulární diagnostika infekční bronchitidy v České republice a na Slovensku Richard J W Currie
Virus infekční bronchitidy
RNA (nukleová kyselina) uvnitř Proteiny (spike proteiny S1 a S2) na vnější straně
Sérotyp x genotyp Viry IB jsou klasifikovány podle struktury spike proteinu S1 Sérotypy IB jsou skupiny virů, které způsobují běžné protilátkové reakce u ptáků Protilátky proti spike proteinům reagují zkříženě
Genotypy jsou viry IB, které mají identický nebo velmi podobný genetický kód spike proteinu V RÁMCI JEDNOHO SÉROTYPU MOHOU BÝT RŮZNÉ GENOTYPY
Jak provést molekulární diagnózu? ….AGGTACCT..
….KLINRHQHF….
1 Sekvenovat nukleovou kys.
2
Jaké jsou změny v porovnání s vakcínou?
3
Ze sekvence nukleové kyseliny určit sekvenci aminokyseliny 4
5
Jaké jsou rozdíly aminokyselin ve srovnání s vakcínou?
Analyzovat, jak rozdíly v aminokyselinách predikují vakcinační strategie
2010-2011 Not Specified 8%
Broiler 48%
Layer 41%
Broiler Breeder 3%
2010-2011 Italy-02 1% H120 8%
4/91 30%
Untypeable 21%
M41 1%
Ark 15%
QX 14% CR88 4%
D274 6%
4/91 je dodnes nejběžnější nález následovaný variantními ARK a QX. terénní viry D274 existují, ale v Evropě jsou poměrně vzácné výsledky, které nelze klasifikovat, jsou zjištěny většinou u vzorků s velmi malým množstvím RNA, u nichž je prezentovaná kvantita pod dolním limitem detekce sekvenční reakce
Jak odlišit vakcínu od terénního viru? Určete sekvenci vakcíny a porovnejte sekvence nukleové kyseliny a aminokyseliny daného vzorku.
Terénní virus 4/91
Terénní virus 4/91– sekvence nukleové kyseliny XXXX SAMPLE SEQUENCE
XXXX SAMPLE SEQUENCE
2010-2011 – 100% NA pozitivní %
45 40 35 30 25 20 15 10
5 0 4/91
Ark
CR88
D274
H120 100%
Italy-02
M41
Ma5
QX
<100%
Většina pozitivních výsledků na 4/91 je homologních s předpokládanou sekvencí z lahvičky s vakcínou Virus 4/91 intenzivně kolonizuje chov a je nejčastěji detekován v případě, že je aplikován více než jeden kmen živé vakcíny proti IB.
2010-2011 – 100% NA pozitivní %
45 40 35 30 25 20 15 10
5 0 4/91
Ark
CR88
D274
H120 100%
Italy-02
M41
Ma5
QX
<100%
Většina pozitivních výsledků na 4/91 je homologních s předpokládanou sekvencí z lahvičky s vakcínou Virus 4/91 intenzivně kolonizuje chov a je nejčastěji detekován v případě, že je aplikován více než jeden kmen živé vakcíny proti IB.
Terénní viry 4/91 (modrá šipka) nadále cirkulují
2010-2011 – 100% NA pozitivní %
45 40 35 30 25 20 15 10
5 0 4/91
Ark
CR88
D274
H120 100%
Italy-02
M41
Ma5
QX
<100%
Většina pozitivních výsledků na ARK je heterologních (bodová mutace ARK 979) se sekvencí hlavní vakcíny. Většina výsledků pochází z chovů vakcinovaných virem ARK. ARK979 v lahvičce s vakcínou není, ale zdá se, že se jedná o konečný bod pro kolonizaci ptáků a může přervávat na farmě „crop to crop“
2010-2011 – 100% NA pozitivní %
45 40 35 30 25 20 15 10
5 0 4/91
Ark
CR88
D274
H120 100%
Italy-02
M41
Ma5
QX
<100%
Výsledky pozitivní na QX pochází (s jedinou výjimkou) z farem bez živé vakcíny QX. Ve vzorcích analyzovaných během posledních 2 let byl zjištěn jediný pozitivní PCR výsledek na terénní virus QX získaný z chovu vakcinovaného virem QX
2010-2011 – 100% NA pozitivní % 45 40
35 30 25 20 15 10 5
0 4/91
Ark
CR88
D274
H120 100%
Italy-02
M41
Ma5
QX
<100%
Pozitivních výsledků na D274 je méně než loni, a to kvůli klesající tendenci pořizovat vzorky z chovů vakcinovaných pouze proti D274. Počet záchytů terénního viru D274 je extrémně nízký.
Jsou některé genetické změny důležitější než jiné? Ano – substituce nukleové kyseliny mohou být „tiché“ (nemající vliv na sekvenci aminokyseliny), anebo vést ke změnám sekvence aminokyseliny
Jsou některé změny sekvence aminokyseliny důležitější nebo jiné? Ano – substituce aminokyselin mohou být „tiché“ (nemající vliv na terciární strukturu proteinů), anebo významně mění terciární strukturu proteinů
Záleží na změně tvaru proteinu S1 ………….. Tichá mutace nukleové kys.
Mutace nukleové kyseliny vede k substituci stejné aminokyseliny -jiný vzhled, stejný tvar
Významná změna aminokyseliny = dramatický odlišný tvar
Hydrofilní a hydrofobní aminokyseliny Ze sekvencí aminokyselin lze dedukovat, jak se změnil tvar proteinu po různých substitucích aminokyselin. Hydrofobní aminokyseliny častěji směřují dovnitř proteinu. Hydrofilní aminokyseliny směřují častěji k vodnímu vnějšímu prostředí.
Substituce dvou aminokyselin může změnit terciární strukturu a tudíž i imunologické vlastnosti terénního viru v porovnání s virem z vakcíny.
Index hydrofobnosti Numerická škála, která vyjadřuje tendenci aminokyselin orientovat se vůči vnitřnímu prostředí (HYDROFOBNÍ) nebo vnějšímu prostředí (HYDROFILNÍ). Změny aminokyselin mohou být Hydrofilní na hydrofobní Hydrofobní na hydrofilní Hydrofilní na více nebo méně hydrofilní Hydrofobní na více nebo méně hydrofobní Sledováním indexu hydrofobnosti lze vyvodit relativní potenciál pohybu aminokyseliny
Hydrofobní – Hydrofilní
Hydrofobní –> více hydrofobní
Rozdíly v indexu hydrofobnosti Z výpočtu absolutního rozdílu mezi hodnotami indexu hydrofobnosti můžeme určit kvantitativní tendenci, zda substituce aminokyseliny povede k jejímu posunu. Čím větší absolutní rozdíl, tím větší posun. Větší posun může vést k významnější strukturální změně proteinu S1. Větší změna může vést k tomu, že se terénní virus etabluje v prostředí a unikne prostředkům imunitní ochrany hostitele.
Tato data lze vizualizovat tak, že vypočítáme absolutní rozdíl indexu hydrofobnosti mezi jednotlivými změnami aminokyselin, seskupíme pozorování do kategorií a do grafu zaneseme procento celkových změn aminokyselin, které se vyskytují v jednotlivých kategoriích.
Rozdíl indexu hydrofobnosti v případě viru 4/91 Hydrophobicity Difference - 13 March 2012 % 40 35 30 25 20
15 10 5 0
Závěr Tyto údaje odpovídají velkému počtu virů s relativně nízkými rozdíly hydrofobnosti vzhledem k viru 4/91 z vakcíny. Výsledná podobnost terciárních struktur S1 naznačuje, že ochranu poskytuje samotná vakcinace 4/91. Existuje také velký počet terénních virů, jejichž stupeň hydrofobnosti se v porovnání s vakcínou významně liší. Tyto viry by mohly být kandidáty rozšíření vakcinační ochrany, a to v souladu s vakcinačními strategiemi ‘Protectotype’ – v tomto případě se jedná o přidání Ma5 do vakcinačního programu 4/91.
Rozdíl v indexu hydrofobnosti v případě izolátů typu QX Hydrophobicity Difference - 13 March 2012 % 40 35 30 25 20
15 10 5 0
Rozdíl v hydrofobnosti 4/91 - 13 March 2012 %
QX - 13 March 2012 %
40
40
35
35
30
30
25
25
20
20
15
15
10
10
5
5
0
0
Závěr Tyto údaje jsou v souladu s následujícími fakty: Většina terénních virů je jen vzdáleně příbuzná s vakcinačním kmenem QX. Většinová populace terénních virů vykazuje hodnoty relativní hydrofobnosti , které naznačují mimořádný potenciál změny terciární struktury S1 vzhledem k vakcinačnímu kmeni . Stupeň variability je obtížné sladit s vakcinační strategií, pokud se používají monovalentní živé vakcíny bez adjuvans Zatímco se předpokládá, že před blíže spřízněnými terénními kmeny ochrání jedna živá vakcína, početná populace vzdáleněji příbuzných kmenů je kandidátem na vakcinační program typu ‘Protectotype’
Česká republika a Slovensko 2012 Skladba vzorků
Analýza výsledků
Czech Republic - Type 09/08/2012
Czech Republic - Results 09/08/2012
48%
50%
36% 64%
2%
Postive Broiler
Broiler GP
Layer
Negative
Genotypy detekované v České republice a na Slovensku k srpnu 2012 Genotype of Results - Czech Republic - 09/08/2012
QX 10%
Ma5 6%
SU 10%
4/91 39%
H120 19% D274 10%
4/91
CR88
D274
H120
CR88 6%
Ma5
QX
SU
Mezi nejčastěji detekované genotypy IBV v České republice patří 4/91, a dále H120, D274 a typ QX.
Česká republika a Slovensko 2012 – 100% Homologie nukleové kyseliny %
45 40 35 30 25 20 15 10
5 0 4/91
CR88
D274
H120 100%
Ma5
QX
SU
< 100%
Všechny záchyty 4/91 byly terénní viry 4/91, které se vyskytovaly pouze na farmách vakcinovaných virem 4/91 v období nejméně 30 týdnů před odběrem vzorků Možnost zavedení vakcinace typu „in-lay spray“
Všechny výsledky typu QX jsou geneticky heterologní (tj. méně než 100% homologní) vůči sekvenci QX z lahvičky s vakcínou Terénní viry D274 byly zjištěny jen v malých počtech a byly identické s genotypy pozorovanými v dalších zemích EU
Proti terénním virům 4/91 v České republice a na Slovensku je třeba použít obecnou homologní vakcinaci Hydrophobicity Difference - 4/91 Results as at 09/08/2012 %
50
40
30
20
10
0
Proti terénním virům typu QX v České republice je třeba použít obecnou vakcinaci typu „Protectotype“ Hydrophobicity Difference - QX Results as at 09/08/2012 %
50
40
30
20
10
0
O čem vypovídá rozdíl v hydrofobnosti Lze jej využít při předpovědi umístění a složení epitopu Část peptidového řetězce, na který se zaměřují protilátky Predikce Hopp-Woodsovy antigenní determinanty
Určuje, zda změny aminokyselin vedou ke změně epitopů vzhledem k epitopům vakcinačního kmene
BEZE ZMĚNY HOMOLOGNÍ VAKCINACE PRAVDĚPODOBNĚ FUNGUJE
VÝZNAMNÉ ZMĚNY MŮŽE BÝT NUTNÉ POUŽÍT VAKCINAČNÍ STRATEGIE TYPU „PROTECTOTYPE“
Predikce shody epitopů – epitopy jsou znázorněny červeně
Terénní virus QX – Česká republika – kloakální výtěry – nosnice ve věku 64 týdnů: D274/H120 (X3) plus vakcína CR88 – vše v období odchovu Sekvence aminokyseliny Pozice
Sekvence z lahvičky s vakcínou
Index hydrofobnosti
Sample Sequence
Index hydrofobnosti
Změna hydrofobní/hydrofilní
88 92 96 117 120 121 128 131 140 141 143 158
Leucin Alanin Serin Serin Serin Glycin Methionin Arginin Glutamát Lysin Fenylalanin Fenylalanin
3.8 1.8 -0.8 -0.8 -0.8 -0.4 1.9 -4.5 -3.5 -3.9 2.8 2.8
Histidin Threonin Glutamin Threonin Alanin Lysin Glutamin Asparagin Glycin Arginin Serin Valin
-3.2 -0.7 -3.5 -0.7 1.8 -3.9 -3.5 -3.5 -0.4 -4.5 -0.8 4.2
Ano Ano NE NE Ano NE Ano NE NE NE Ano NE
Terénní aplikace údajů Trendy rozvoje terénních virů je možné sledovat průběžným vzorkováním a pořizováním dat Mezi jednotlivými zeměmi se vyskytují rozdíly co se týká terénních virů Geografické dělení Rozdíly podle různých veterinárních praxí
Tyto údaje je možné použít při výběru vakcinačního programu a průběžném hodnocení jeho účinnosti
Následující údaje pochází z Velké Británie z let 20112012
Praxe A
Praxe B Practice D
Praxe C
Praxe D
Praxe A
Practice B
Praxe B
Praxe D
Praxe C
Praxe A Practice A
Praxe D
Praxe B Practice B
Practice D
Praxe C
Shrnutí Molekulární analýza klinických vzorků na přítomnost IB může diagnostikovat terénní kmeny ve vztahu k živým vakcinačním kmenům; prokázat rozdíly v chování dvou hlavních virových genotypů; identifikovat změny aminokyselin, které souvisí s klinickou chorobou ;
indikovat aplikaci vakcinačních programů typu ‘Protectotype’, pokud se aminokyselinové charakteristiky terénních virů výrazně liší od vakcinačních kmenů (což vede ke změně epitopů ve srovnání s vakcinačními kmeny).
