Molekulární biologie sylabus předmětu
Cytoskelet Soustava (proteinových) vláknitých komponentů, schopná konvertovat energii chemickou v energií kinetickou, s charakterem vnitrobuněčné dynamické kostry (dynamické matrix). Heterogenní stav hustoty v buněčném prostoru. Cytoskeletální soustava: znak všech typů eukaryotních buněk. AK sekvence stavebních proteinů vykazuje malé procento substitucí v závislosti na organizmální typu – evolučně starý princip. Otázka alternativní formy cytoskeletu u prokaryotního buněčného typu. Základní téma cytoskeletální funkce: časoprostorová lokalizace a vnitrobuněčný pohyb. Determinace buněčného tvaru, buněčné polarity, cílené distribuce buněčných komponentů, internalizace vnějších komponentů, zpracování internalizovaného materiálu (endocytóza) Autoorganizace zúčastněných (sub)systémů vláknitých struktur (mikrotubuly, intermediární filamenta, mikrofilamenta) Mikrotubuly. Globulární, stavební proteinová podjednotka (dimer tubulinu). Univerzální stavební princip mikrotubulu. GTPasová aktivita, vazná místa. Hydrofóbní mezimolekulové interakce tubulinu. Variabilita délky mikrotubulů. Autoorganizace tubulinu, tubulinových profilament. Vliv koncentrace volného tubulinu (Ck). Vliv teploty. Lokalizace vlastní polymerce. MTOC: organizační centra (model kvasinkové buňky-lokalizace v jaderné membráně - SPB centrum) γ-Tubulin: minoritní protein (Aspergillus nidulans), relativně nový člen tubulinové rodiny. Možná úloha při iniciaci polymerace mikrotubulů. Možná polymerace do mikrotubulárních struktur. Asociované proteiny mikrotubulů (MAP). Strukturní (stabilizují strukturu mikrotubulu); Mikrotubulární motory (pohyb podél mikrotubulů); Interagující proteiny (MIP- interakce jednotlivých komponentů cytoskeletu. Intermediární filamenta. Střední velikost mezi mikrotubuly a mikrofilamenty. Vzájemná morfologická podobnost v závislosti na organizmálním typu. Individualita stavebních proteinů (desmin, vimentin, kreatin, neurofilamin, nestin, laminy - základ staršího systému členění). Nová kategorizace: založena na sekvenční analýze primární struktury – rozlišení sekvenčních typů (3 skupiny, 6 tříd). Stavba filamenta na bázi dvou polypeptidových řetězců. (Současný model studia – savčí buňka, otázky variability struktury, a dynamiky autoorganizace, intermolekulových interakcí). Úloha v karyoskeletu. Interakce s jadernou membránou. Mikrofilamenta. Stavební bílkovina – nesvalový aktin (isoaktiny ). Nepolymerovaný aktin (Gaktin), polymerovaná forma (F-aktin) Omezená variabilita asociovaných proteinů. Toxiny cytoskeletu: kolchicin-blok autoorganizace mikrotubulů; vinblastin - precipitace mikrotubulů; taxol - nežádoucí stabilizační účinky; herbicidy - destabilizace organizačních center; cytocholasiny - blokace vzniku aktiniových vláken. Mikrotubuly prokaryot: tubulin neprokázán, struktury „rhapidozomů“, interakce s membránou, necitlivost k toxinům eukaryotního cytoskeletu. Omezený růst tubulu. Otevřená otázka primitivního cytoskeletu. Molekulové motory Alternativně: motorové proteiny, mechano–chemické enzymy, v jistých situacíchtraslokátory. Oligomerní proteiny s ATPasovou aktivitou. Variabilní počet podjednotek. Principiálně stejné podjednotkové uspořádání. Motorová doména (ATPasová aktivita),
cylindrická doména, koncový polypeptid-koncová doména. Možná variabilita počtu motorových domén. Úloha vazných míst cylindrické domény. Vazná schopnost koncové domény na komponenty cytoskeletu, biomembrány, buněčné struktury. Zdroj energiehydrolytická aktivita motorové domény.
mikrotubuly
+ asociované proteiny (MAPs) + organizační centra (MTOC) (jaderný plak –centrosom- SPB – S. cerevisiae) Jaderný plak je integrován do jaderné membrány Trvalé zakotvení mikrotubulů v celém intervalu buněč. cyklu
13 lineárních protofilament
(- ) + - polarizace
mikrofilament aa
Aktinový cytoskelet kvasinek
G-aktin → Faktin + - polarizace dva typy asociovaných proteinů
Aktinový cytoskelet obshuje 4 morfologicky a biochemicky odlišné struktury: kortikální tečky (patches), aktinová vlákna, cytokinetický prstenec a čepička. Specifické funkce vs polarizovaný růst a vývoj pupenu
Intermediární filamenta Mporfologická podobnost / velká variabilita proteinů Třídění IF: Skupina A, třída (I,II) keratiny Skupina B, třída (III – VI) desmin, vimentin…. Skupina C, třída (V) laminy
Velká pevnost vs mechanický stres Globulární koncové části interagují s ostatními složkami cytoskeletu
Navigovaný pohyb buněčných proteinů Obecný základ: proteiny rozpustné v cytosolu vznikají na polyzomech volně přítomných v tomto prostředí; proteiny určené do buněčných kompartmentů, membránových struktur a mimobuněčného prostředí procházejí určitou hraniční membránou, a to buď po dokončení syntézy polypeptidového řetězce (post-translační vstup), nebo současně s jeho probíhající syntézou (ko-translační vstup). V obou případech je proteosyntéza zahájena na volném ribozomu. Navigace pohybu proteosyntetického aparátu: Úloha signální DNA sekvence tj. N-koncová extense polypeptidu (15-60 AK): navigace pohybu proteosyntetického aparátu k cytoplazmatické membráně prokaryotické buňky, nebo membráně endoplazmatického retikula eukaryotní buňky. Molekulová interakce signální sekvence. Vazba proteinu SRP, vazebná interakce SRP s membránovou DP bílkovinou – membránové ukotvení aparátu proteosyntézy. Místo budoucí translokace peptidu. Stavba signální sekvence na úrovni peptidu. N,H,C oblast. Význam hydrofóbní oblasti. Odštěpení signální sekvence: Subjednotková stavba peptidasy, její membránová lokalizace. Více-enzymový aparát degradace signální sekvence (model kvasinkové buňky). Úloha calmodulinu ve vazbě fragmentů signální sekvence. Signální sekvence jako informační peptid. Navigace bez účasti signální sekvence. Úloha chaperonu SecB (prokaryotický model): Vazba nascentního polypeptidu k proteinu SecB-blokace vývoje sekundární a terciální struktury bílkoviny. SecB rozpoznává topologii peptidu, nikoliv signální sekvenci. Stabilizace peptidu před membránovou translokací. Úloha SecA proteinu v navigované vazbě polypeptidu v místě membránové translokace. Úloha specifické translokasy- hydrofilní membránový kanál přestupu. Úloha integrálních membránových proteinů SecY, Sec E.
Variabilita AK signální sekvence. Cílená záměna signální sekvence vs místo finálního určení proteinu. Signální sekvence jako membránová kotva. Signální sekvence mimobuněčně uvolňovaných proteinů, které determinují patogenitu mikroorganismů. Použití signální DNA sekvence v cílené konversi proteinu vnitrobuněčného v mimobuněčný. Stavba membránových translokátorových struktur. Úloha endoplazmatického retikula jako první sekreční organely. Následné funkce Golgiho aparátu. Postsyntetická modifikace trnsportovaného proteinu - transport v odvozených membránových mikrokompartmentech (sekretorické váčky). Fúze s cytoplasmatickou membranous, uvolnění exportovaného proteinu do periplazmatického prostoru, přestup přes buněčnou stěnu. Proces exocytózy: Interakce - fúze sekretorického kompartmentu s cytoplasmatickou membranous. Sekvenční úloha asociovaných proteinů. Start membránové fúze. Totální fúze, fúze využívající membránový kanál.
Buněčná smrt Odpověď jednobuněčných organismů na stresující podnět Stresory jednobuněčných organismů (teplotní, osmotický, oxidativní stres, deficience nutrientů, růstových faktorů, biotický stres...). Cytoplasmatický a extracytoplasmatický stres. Strategie buněčné adaptace. Strategie programu buněčného zániku (eliminace defektního organismu). Strategie cytodiferenciace (sporogeneze) Adaptace na bázi indukované syntézy stresových bílkovin (chaperonů, specifických proteas). Oprava změny konformace bílkovin, renaturace / odstranění defektních bílkovin. Programovaná buněčná smrt – apoptóza. Další aktivity stresované buňky. Chaperony: Chaperon HSP70 (bakteriální verse-DnaK) (rodina HSP70). Bakteriální chaperony nižší mol. hmotnosti (GroEL, GroES). Multimerní komplexy chaperonů (obecná úloha ve stabilizaci konformace bílkovin). Specifické sigma factory. Příznaky „pre-letální“: inhibice energeticko - metabolických funkcí; ztráta semi-permeability biol. membrány; změna poměru anabolických a katabolických procesů; degradace buněčných struktur – kompartmentů; akumulace inkluzí; pokles schopnosti fyziologické adaptace; snížení receptorových funkcí; genom je stále více reprimován; ztráta vzájemné koordinace metabolických drah; akumulace chyb (error catastrophe). Eukaryotní a prokaryotní model buněčné smrti Koncepce apoptózy: primárně mechanismus řízené eliminace některých buněčných subpopulací v procesu embryonálního a postembryonálního vývoje makroorganismu. Program procesu apoptóźy je součástí společného genofondu organismu a je trvale k disposici (eliminace „odcizených“ buněk, nevhodných mutací) Eukaryotní (makroorganizmální) model: Protikladná úloha induktoru apoptózy – produktu genu p53 a jeho represoru – produktu genu bcl-2. Stresová aktivace induktoru apoptózy s následnou stimulací trnskripce genů, jejichž produkty, jednak zpětně blokují represor induktoru apoptózy, jednak indukují vyjádření genů determinujících sekvenci kroků vlastního programu buněčné smrti, tj. kaskády syntéz a aktivací specifických proteas (caspas) a specifické DNA endonukleasy. Vlastní deaktivace produktu bcl-2 destabilizuje
mitochondriální membránu-vstup kyslíku, produkce kyslíkových radikálů, opakované poškození DNA, zesílení apoptické stimulace. Obecný význam poměru hladin bílkovin p53 a bc1-2. Program buněčné smrti prokaryot a jednobuněčných eukaryot. Exisující možnost realizace programu buněčné smrti. Existující prvky eukaryotního modelu. Velký význam intenzity stresového podnětu ve volbě strategie buněčné odpovědi (adaptace / apoptóza). Sporulace jako model spojení zániku jedné s přežitím druhé buněčné (kryptobiotické) formy. Úloha chaperonu HSP70 v regulaci mikrobní apoptózy. Bakteriální smrt urychlená substrátem. Indukovaná ztráta vzájemné koordinace metabolických drah (metabolický rozvrat). “Asymetrická “ aplikace zdroje C v hladovějící populaci. Buněčná volba mezi adaptací a cytodiferenciací. Mezibuněčný přenos genetické informace Mezibuněčný přenos, „pohyb“ genetické informace: a) vertikální (buněčnou reprodukcí)předávání celé genetické informace potomstvu procesem jaderného a následně buněčného dělení; b) horizontální (mezidruhový) předání fragmentu genetické informace vnitro- i mezidruhově procesem transformace, konjugace a transdukce (transfekce). Obecný význam mezibuněčného toku genetické informace. Rizika v kontextu aplikace geneticky modifikovaných organismů. Evoluční smysl: získání zcela nové (dílčí) genetické informace (genu, genového souboru), získaní „paralogu“ daného genu s jinou evoluční historií; získání fylogeneticky vzdáleného „ortologu“, který nahradí homologický gen. Transfer nepříbuzných genů determinující produkty stejné funkce. Společné rysy horizontálních přenosů genetické informace: jednosměrnost (donor → recipient), stav merozygoty, nízká frekvence rekombinace. Transformace Recipientní buňka kontaktována izolovanou buněčnou DNA (virovou DNA- transfekce). Stav kompetence recipientní buňky. Nekovalentní interakce s receptorem dv DNA , vznik jv DNA, Translokace jv DNA přes povrchové struktury recipienta, univerzální model aparátu translokace. Stabilizace translokované DNA (vazba SSB proteinu). Rekombinace. Konjugace. Recipientní buňka kontaktována donorovou. Fyzický, buněčný kontakt zprostředkován „sexspecifickou “ fimbrií. Epizomální genetická determinace celého procesu a zúčastněných struktur – F faktor – epizomální plasmid. Frekvence rekombinací v situaci: F- x F- (0 rekombinace); F+ x F+ (nízky počet rekombinantů); F+ x F- (výrazně vyšší počet rekombinantů), Hfr x F- (nejvyšší počet rekombinantů). Konjugační transfer lineární, ssDNA. Translokace ssDNA přes povrchové struktury recipienta, membránový aparát translokace, produkty genů Tra. Stabilizace translokované ssDNA (vazba SSB proteinu). Chromozomální integrace F faktoru vznik Hfr kmenů. Variabilní poloha chromozomální integrace F-faktoru, orientace konjugačního přenosu ss DNA. Rekombinace. Konjugační princip chromozomálního mapování. Podmínky konjugace. Poměr celkového počtu buněk donora : k populaci recipienta. Přerušení konjugace. Konjugace v suspenzních a upoutaných buněčných populacích. Transdukce Přenos genetické informace zprostředkovaný fágovou DNA (infekcí bakteriofágem). Význam stavu lysogenie, integrace virové DNA do chromozomu hostitele, přenos chromozomálního
fragmentu v rámci dalšího lytického cyklu. Nespecifická transdukce (transfer libovolného segmentu chromozomu), specifická transdukce (transfer jen určitého segmentu) Rekombinace donorové a recipientní DNA V kontextu mechanizmů mezibuněčného přenosu genetické informace. Těsný kontakt homologických oblastí rekombinujících se molekul. Rekombinace mezi paralelními řetězci tj. řetězci stejné polarity. Zlom v paralelních řetězcích vlivem endonukleasového štěpení. prostoupení řetězců a nové spojení. Holidayův spoj. Pohyb tohoto spoje. Úloha Rec A proteinu (katalytická asistence párování homologních řetězců a následné výměny řetězců). Frekvence a genetická identifikace rekombinantů.
Restrikčně-modifikační (r/m) systém bakteriální buňky Určité bakteriální taxony rozlišují účinně DNA vlastní a DNA jiného kmene. „Restrikce“ cizí nukleové kyseliny je buněčná schopnost tuto DNA degradovat, a to nezávisle na tom ,zda jde o DNA chromozomovou, plazmidovou nebo fágovou. Kromě restrikční specifity je r+ kmen vybaven odpovídající modifikační specifitou (m), která chrání vlastní DNA před degradací vlastním restrikčním systémem. Podstatou kmenově specifické modifikace je methylace adeninu nebo cytozinu v určitých cílových sekvencích nuleotidové sekvence rozpoznávacího místa DNA. Endonuklesa a methylasa určitého R-M systému rozpoznává stejnou sekvenci. Restrikční a modifikační aktivita může být nesena jedním (podjednotkovým) enzymovým komplexem. Komplexní význam studia restrikce a modifikace: studium interakcí protein-protein a proteinDNA, otázky genetické determinace fenotypu restrikce. a modifikace DNA, cílená aplikace restrikčních endonukleas. Význam restrikčních endonukleas Typu II pro cílené genové manipulace. Princip nomenklatury komerčně vyráběných enzymů.
Buněčná lokalizace restrikčně – modifikačního systému Je málo pravděpodobné, že restrikční enzym je lokalizován v periplazmatickém prostoru, popř. je uvolňován do prostoru mimobuněčného. Relativně spolehlivá detekce zatím v cytosolu. Prokázána lokolizace pojednotky HsdR v membráně.
Typy restrikčně - modifikačního systému Typ I: determinující geny: hsdR,hsdM,hsdS; proteiny: HsdR, HsdM, HsdS; enzymová aktivita: restrikční endonukleasa, methyltransferasa, ATP hydrolasa; struktura: 3 podjednotky; nutné kofaktory: ATP, Mg2+, S-(5’-Adenosyl)-L-methionin. Typ II: determinující geny: ecoIR ,ecoI; proteiny: Res,Mod; aktivita: restrikční endonukleasa, methyltransferasa; struktura: jednoduchá; nutné kofaktory: Mg2+, S-(5’-Adenosyl)-Lmethionin. TypIII: determinující geny: res, mod; proteiny: Res,Mod; aktivita: restrikční endonukleasa, methyltransferasa, ATP hydrolasa; struktura: 3 podjednotky; nutné kofaktory: Mg2+, S-(5’Adenosyl)-L-methionin. TypIV: determinující geny: mcrB,mcrC; proteiny: McrB1, McrBs McrC; aktivita: restrikční endonukleasa, GTP hydrolasa; struktura: 3 podjednotky; nutné kofaktory: GTP, Mg2+.
Další rozdíly se týkají míst která systém rozpoznává, místa methylace, místa štěpení, počtu produktů nezbytných pro restrikci a methylaci, symetrie rozpoznávaných sekvencí a dalších charakteristik. Funkce R/M systému může být regulována na úrovni syntézy, koncentrace a autoorganizace podjednotek, dále buněčnou lokalizací individuálních komponentů systému a proteolytickou funkcí některých specifických proteas. RNA: (eukaryotní transkript) struktura / modifikace Produkty transkripce: a) heterogenní jaderná RNA (pre-mRNA)- primární transkript transkripčních jednotek strukturních genů, následujícími úpravami konvertovatelný do mRNA; b) prekursorová ribozomová RNA (pre-rRNA) – primární transkript genů deteminujících rRNA, postranskripční úpravou štěpena na funkční ekvivalenty; prekursorová transferová RNA (pre-tRNA) – primární transkript genů tRNA, postranskripční úpravou vznikají individuální druhy tRNA.; c) 5S-RNA – transkript specifických genů; d) tzv. malé RNA – transkripty genů determinujících 80 – 300 nukleotidové RNA lokalizované v jaderném kompartmentu (snRNA), jadérku (snoRNA) a cytosolu (scRNA). (Informace týkající se počtu transkripčních jednotek mitochondriového a chloroplastového genomu (individuálních typů eukaryotické buňky ) jsou velmi omezené.) Sekundární a terciální struktura vs struktura primární; Potenciální komplementarita dílčích úseků jednoho řetězce → intramolekulární duplex triplex. Konformace sekundární struktury v závislosti na vazbě proteinu Terminologie: „vlásenky“ (hairpins); „vyboulené smyčky“ (bulged loops); „vnitřní smyčky“ (internal pools); „uzly“ (junctions). Proteiny rozeznávají spíše prostorové uspořádání RNA než jednotlivé baze a jejich sekvence. RNP motiv proteinu – vazebná doména; evolučně konzervované sekvence AK. Postsyntetické (postranskripční) úpravy transkriptu: modifikace hnRNA, sestřih hnRNA, úpravy pre-rRNA a pre-tRNA. hnRNA: A) Tvorba komplexu s proteiny(hnRNP – proteiny) a komplexy nukleproteinů snRNA. Vazba proteinů(nukleoproteinů) na intronové úseky hnRNA – tvorba komplexu (spliceozom). Variace těchto komplexů v závislosti na transportu hnRNA z kompartmentu jádra, úloha snRNA v procesu sestřihu. Vazba proteinů vs konformace RNA vs stav přístupnosti RNA k postranskripční úpravě. B) Modifikace 5’ konce tzv. čepičkou m7G (vazba 7-metylguanozinu), 3 strukturní typy podle metylace guanozinu. Význam této modifikace pro vazbu specifikých proteinů, nutných pro iniciaci translace. C) Polyadenylace 3’- konce: vznik poly(A) konce (polyadenylací) – poly(A)sekvence – sekvence individuálních kroků. Polyadenylace: 200 – 250 adenosinových zbytků. Polyadenylační signál;Vazba poly(A)ozomu +poly(A)polymerasa +PABP II { poly(A) binding protein } Sestřih hnRNA: význam sekvence v místě sestřihu určující vazbu snRNA a 5’ a 3’ místo sestřihu (excize intronu). Úloha sn RNA Editace …původně proces řízené inzerce a delece uridinových zbytků v kódujících oblastech RNA, nyní všechny ko- nebo postranskripční úpravy kódujících oblastí RNA, (konverze bazí, editozom, gRNA) Transport (translokace) mRNA z jaderného kompartmentu místo maturace mRNA → místo určení mRNA, mRNA je exportována jako ribonukleotidová partikule „Capping“ a vazba mediátoru exportu, účast poly(A)řetězce Stabilita (stabilizace) mRNA Typ a funkce genového produktu určuje stabilitu příslušné mRNA, zkrácení poly(A) řetězce po vstupu mRNA do cytosolu, regulace genového vyjádření na bázi různě rychlé degradace mRNA ,
Metylace bazíEnzymatická konverze adeninových zbytků v inosiny….. Posttranskripční utlumování / umlčování genové exprese – RNA interference Štěpení dlouhé dsRNA (shRNA,miRNA) na krátké úseky, které rozpoznávají homologní mRNA a indukují utlumení její exprese, a to prostřednictvím: a) siRNA (degradací cílových mRNA) b) miRNA (inhibicí procesu translace) Individualita v organismální závislosti. Vysoce konservovaný a evolučně starý mechanismus
Mezibuněčná signalizace Transdukce chemického signálu Model konverze určité formy informace v informaci jinou-následnou. V kontextu buněčné biologie – biologie jednobuněčných organismů - daná problematika řeší (na molekulové úrovní) recepci a zpracování vnějších chemických (fyzikálně chemických, mechano fyziologických ) signálů v souvislosti s analýzou buněčné odpovědi. Receptory a ligandy Dostupnost struktur buněčného povrchu mimobuněčnému prostředí – ligandu - rozpustné malé nebo velké „signální“ molekule. Obecná lokalizace molekuly receptoru v prostoru cytoplazmatická membrána - periplazmatický prostor – buněčná stěna. Cílená příprava receptorových proteinů jako heterologních bílkovin. Význam poznání vztahu struktury a funkce receptorové molekuly. Aktivace receptoru. Pravidelná a perzistentní aktivace. Distribuce a četnost receptorů. Ne-kovalentní povaha vazebné interakce ligandu. Koncepce prvního a druhého posla Úloha ligandu jako prvního posla. Pleiotropie funkcí ligandu. Koncentrace ligandu z hlediska indukce (stimulace) buněčné odpovědi. Koncentrace ligandu vs objem (specifický povrch) terčové buňky. Sub-typy receptorů. Konformační změny receptorů vs stav vysoké a nízké afinity k ligandu. Studium receptorové funkce s použítím izolované membrány a intaktní buňky. Časná a pozdní buněčná odpověď. Problematika analýzy buněčné odpovědi. Koncepce zesílení signálu jako aktivace – vznik – specifická úloha druhého posla. Úloha vnitrobuněčných terčových struktur. Membránový přenos signálu Recepce-transdukce-buněčná odpověď Receptory spojené s G-proteinem. Modelová úloha G-proteinů. Charakteristika G-proteinů. Subjednotková stavba / monomerní G-protein. Receptory spojené s iontovými kanály. Tyrosinproteinkinasové receptory. Intracelulární receptory extracelulárních signálů. Úloha kaskády konformačních změn membránových proteinů. (Amplifikace signálu) Vzniku a funkce c-AMP jako druhého posla. c-AMP závislé protein kinasy. Spojení receptor – transkripční faktor – regulace genového vyjádření. Orientace přenášeného signálu Receptorová interakce s buněčným metabolizmem. Receptorová interakce s genovým vyjádřením. Receptorová interakce s cytoskeletem. Receptorová interakce s buněčnou adherenci.
Bakteriální toxiny První poznaná podstata bakteriální patogenity; interakce prokaryotní → eukaryotní buňka (cellular microbiology) terminologie:
terčové místo působení: buněčný povrch / vnitřní prostor buňky subjednotková stavba:
A/B
(subjednotka toxinu a vazebné aktivity)
Pathogenní taxon daného rodu (např. Escherichia ) je charakterizovatelný: „pathotypem“; „virotypem“; faktory virulence (produkty): adheziny fimbrií, vlastními toxiny strukturami buněčného povrchu (pouzdro, lipopolysacharidová složka) serotypem (O, H, F antigen)…..
Klasifikace: Kategorie Extracelulární toxin působící na buněčném povrchu
Terčové místo Biologická membrána
Toxin Streptolyzin O Alfa-toxin
Aktivita permeabilizace membrány
Důsledky
Reference
bunčná smrt
Bakteriální toxické exoproteiny Bakteriociny Mimobuněčně produkované peptidy s výraznou antimikrobní aktivitou. Tři skupiny, rozlišení podle molekulové hmotnosti: 1. (5 kDA) – lantibiotika na bázi lantioninu a derivátů lantioninu: typ A- interakce s membránou; typ B- inhibice enzymového aparátu.
2. (10 kDa) – teplotně stabilní peptidy neobsahující lantioniny: typ IIA,IIB,IIC a IID (rozlišení podle terčového bakteriálního rodu, AK sekvence, subjednotkové stavby, závisloslosti svého působení; (včetně dosud nezařazených bakteriocinů). 3. (30 kDa) - teplotně nestabilní proteiny. Relativně široké spektrum terčových struktur i mechanizmů účinku (modulace enzymové aktivity, interference s procesem sporogeneze, buněčným transportem). Účinek může být determinován přítomností povrchových receptorů. Struktura bakteriocinů: 12 – 15 aminokyselinových zbytků, možná tvorba alfa-helikální struktury a cyklických struktur. Intramolekulární vazby. Molekula s rigidní i pohyblivou částí.Model stuktury nisinu, možnosti interakce nisinu s membránou, amfifilní charakter molekuly, vlivem prosředí podmíněný alfa-helix. Vztah struktury a cílové specifity účinku. Indukovaná tvorba membránového póru - nepřímá inhibice membránové protonmotivní síly. Vliv na specifický tok iontů. Nevznikají nespecifické membránové kanály. Mechanismus působení: Kationtový charakter bakteriocinu determinuje interakci s aniontovými fosfolipidy membrány (možná vazebná úloha dalších strukurních prvků). V situaci podjednotkové stavby je aktivita molekuly vázána na funkci všech subjednotek. Modelové interakce s membránou lipozomů. Receptorová úloha buněčné stěny. Funkce teichové a lipoteichové kyseliny v primárním kontaktu bakteriocin / bakteriální buňka. Individuální požadavek bakteriocinů na receptorovou strukturu. Koliciny Bakteriociny produkované specificky kolicinogením kmenem Escherichia coli (popř. druhy čeledi Enterobacteriaceae). Bakteriostaticky / bakteriocidně působicí proteiny (mimobuněčné uvolňované). Indiducibilní, postranslačně neupravované. Variabilní výskyt kolicinogenie (viz mezibuněčné interakce smíšených společenstev), asi třicet typů kolicinů. Producent rezistentní. Plasmidová genetická determinace (mezidrhová podobnost kolicinového operonu) Paralelní determinace rezistence ( gen struktury vlastního kolicinu, imunitního proteinu a tzv.lytického lipoproteinu). Regulace syntézy prostřednictvím SOSsystému. Semispecifické mimobuněčné uvolňování s účastí lytického procesu. Mechanismus účinku: Interakce s receptorem, translokace přes povrchové struktury a interakce s terčovou strukturou. Tomuto programu odpovídá receptorová, translokační a letální doména molekuly kolicinu. Receptor: receptor s vazebnou disposicí pro B12, Fe3+ a bakteriofág. Porinová složka s funkcí receptoru kolicinu. Translokace s účastí proteinů Tol a Ton. Periplasmatická lokalizace. Účinek kolicinů: iontové kanály, depolarizace membrány, nukleasová aktivita, degradace nebo inhibice syntézy stěnového peptidoglykanu. Mimobuněčné polymerní substance Mimobuněčná produkce polysacharidů – jedna z obecných vlastností mikroorganismů prokaryotního i eukaryotního typu, která formuje buněčné mikroprostředí a zprostředkovává mezibuněčný kontakt. Doprovodné složky, širší význam zkratky EPS. Přítomnost nepolymerních složek, modulujících aktuální strukturu a fyzikálně-chemické vlastnosti EPS. Spontánní uvolňování stěnových lipopolysacharidů. Biotická a abiotická degradace mikrobních polysacharidů, chemická modifikace (periplazmatický prostor, mimobuněčný prostor). Makromolekuly: polykationty / polyanionty. Model EPS na bázi uronových kyselin. Převládající polysacharidový typ + doprovodné polysacharidy. Obecná originalita kompozice a makromolekulové konstrukce mimobuněčné polysachridové hmoty. Význam acetylace (význam chemické modifikace obecně) z hlediska finálních vlastností / struktury polysacharidového komplexu. Buněčný fyzický kontakt jako induktor syntézy polysacharidové matrix (model Psudomonas aeruginosa). Význam viskozity vnější polysacharidové matrix.
Fyziologická úloha mimobuněčných polysacharidů. Polysacharidový komplex – aditivn vrstva modulující funkce buněčného povrchu. Přítomnost vody a specifického enzymového systému. Termín glykokalyx v kontextu uvedeného. Bakteriální alginát: Experimentální model studia základních otázek tohoto tématu. Problematická generalizace poznatků. Model Pseudomonas aeruginosa. Specifická úloha v procesu kolonizace plicní tkáně. Vztah k obecné problematice kapsulárních polysacharidů. Základní funkce: úloha v morfogenezi a fyziologii pevných buněčných konsorcií. Mimobunčný polysacharid jako znak buněčné identifikace. Retence vody. Selektivní a specifická sorpce malých a velkých molekul, sorpce iontů Enzymová aktivita vnějšího mimobuněčného prostředí. Protekce buňky na bázi vnější difusní bariéry. Stabilizace agregovaných populací více taxonů / buněčných typů. Koexistence aerobních a anaerobních taxonů. Úloha v mezibuněčném přenosu genetické informace. Úloha v přenosu a modifikacimezibuněčných chemických signálů. Časoprostorová akumulace nutrientů, metabolitů a signálních molekul. Obecný vliv podmínek prostředí na produkci mimobuněčných polysacharidů. Produkce mimobuěčných polysacharidů jako adaptivní strategie. Mimobuněčné polysacharidy ovlivňující makroprostředí (model přirozených sedimentů)
Bakteriální viry Virová částice (virion, rozměr: nm) je nukleoproteinová struktura schopná jednak infikovat buňku hostitele (v daném případě buňku bakteriální), jednak se v jejím vnitrobuněčném prostoru reprodukovat. Tyto infekční částice postrádají vlastní metabolizmus, jsou různého tvarového typu a jsou v podstatě chráněným uložením jedné (popř. více) molekul DNA / RNA (přítomnost proteinových obalových struktur: individuální uspořádání nukleokapsid. Molekula nukleové kyseliny je v podstatě virovým genoforem (replikonem), který zároveň představuje celý virový genom, determinující proteinovou složku viru. Syntéza těchto proteinů je zcela závislá na proteosyntetickém aparátu hostitele. Společným rysem je přesnost reprodukce virové částice i její auotoorganizační princip. Specifita virová infekce je převážně vázána na přítomnost povrchového receptoru, specifického pro příslušný taxon viru. Bakteriální viry (bakteriofágy, fagy) infikují výhradně buňky prokarotní. Další kategorie (viry eukaryální) jsou definovány rovněž hostitelm: viry rostlinné, živočišné, mykofágy, viry entomopathogenní atd.). Základním kriteriem obecné virové taxonomie je typ nukleové kyseliny podle následující kategorizace: dv DNA, jvDNA, dv, segmentovanou RNA, jv, pozitivní RNA Obecný model infekce bakteriální buňky DNA-virionem: po vazebné interakci virion / receptor vstupuje do vnitrobuněčného prostoturu pouze nukleová kyselina, kapsidová část viru zůstává v mimobuněčném prostoru. Volná nukleová kyselina se replikuje. Negativní řetězec DNA je matricí syntézy mRNA. V případě infekce RNA- virionem je překládán replikací vzniklý pozitivní řetězec. Výsledkem virové infekce je zahájení lytického cyklu a následná lyze uvolňující v tomto cyklu vzniklé virové částice. Infekce tzv. mírným fágem se může vyvíjet stejným způspbem, nebo dočasně končí integrací DNA do chromozomu, čímž vzniká stav lyzogenie, virová nukleová kyselina je ve stavu tzv. proviru (profága), a je replikována v rámci replikace bakteriálního chromozomu. Integrace fágového genomu do genomu hostitele je katalyzována integrasou, a je (z hlediska mechanizmu) crossing-overem (viz rekombinace). Vlastní soubor událostí tohoto procesu je buněčnou lyzogenizací. Stav lyzogenie je stavem vratným, zpětné uvolnění virové nukleové kyseliny (profága) je indukovatelné (fyzikálně – chemickými prostředky, stavem určitých deficiencí, antibiotiky atd.). Altrnativou jsou spontánní indukce. Excize profága je katalyzována excisionasou.
Stav imunity lyzogenního kmene: stavem lysogenie (stavem profaga) je determinována syntéza tzv. imunitního represoru, který blokuje vyjádření genů daného fága deteminujících syntézu virových proteinů. Tento stav blokuje infekci lyzogenního kmene homologním fágem Integrace fágového genomu do genomu hostitele je katalyzována integrasou. Imunitní represor: dimer dvou podjednotek – identických polypeptidických řetězců s globulárním N- a C- koncem, vazebná interakce represoru s nukleotidovou sekvencí vodíkovými vazbami. Replikace fágové DNA (model bakteriofág λ): Ve vnitrobuněčném prostoru hostitele přechází lineární dv DNA do formy uzavřené molekuly, výzam kohezních konců, DNA-ligasa. V této formě se replikuje dle modelu valivé (otáčivé) kružnice za vzniku konkatemerů. Replikující se DNA je transkribována (syntéza strukturních proteinů virionu). Výsledný konkatemer je štěpen paralelně s procesem morfogeneze nových virionů)
Genom bakteriofága λ
(Dimmock, N.J. et al.: Introduction to modern virology Blackwell Science, 2001)
Model tohoto genomu (částečně viz ilustrace) rozlišuje geny determinující regulační proteiny, které řídí lytický cyklus a vstup do stavu lyzogenie, geny O, P determinují proteiny replikačního aparátu, geny S, R determinují proteiny působící v procesu buněčné lyze, dále genom obsahuje geny strukturních proteinů hlavové časti virionu a geny strukturních proteinu bičíkové části virionu. (Šipky ukazují směr transkripce; att sekvence-koncové sekvence lineární formy genomu, připojovací místo integrace fága; PL , PR – levý a pravý promotor;) Dále je lokalizován levý a pravý operátor, PRE promotor genu cI imunitního represoru, gen cII determinující aktivační protein promotoru PRE; gen cIII determinující protein, který stabilizuje produkt genu cII; gen N, Q antiterminátoru; gen cro determinující protein, který blokuje vazbu imunitního represoru do oblasti pravého operátoru; gen int determinující integrasu; gen xis determinující excisionasu. Sekvence genového vyjádření: Od promotorů PL a PR začíná transkripce genů rané fáze exprese (geny N a cro), která se zastavuje na na terminátorech tR1 a tL1. Vzniklý protein N umožňuje transkripci genů pozdější rané fáze, k jejichž expresi dochází při vstupo do lyzogenního stavu (případně rekombinaci). Při vstupu do lytického cyklu aktivuje protein Q přepis genů podního vyjádření. V lyzogenním stavu se přepisují geny cII a cIII, jejichž
produkty aktivují přepis genu cI, který determinuje imunitní represor kontaktující pravý a levý operátor. Tímto krokem je zastaven přepis genů pozdní fáze exprese a genů pozdější rané fáze. Antiterminátor umožňuje pokračování transkripce přes terminátory. Antiterminace umožňuje transkripci genů pozdější rané fáze exprese.
Viroidy Fytopatogenita; jednořetězcová, kovalentně uzavřená molekula RNA (300- 400 nukleotidů)intramolekulové párovaní bazí (sekundární struktura); > 25 variant nukleotidové sekvence; nekódující - vysoký obsah GC; interference s produkty transkripce (hnRNA) – chybná eliminace intronů; další aktivita :ribozym (štěpení RNA); nepřítomnost proteinu; replikace: RNA dependentní RNA polymerasa (rostlinná buňka); taxonomie: Avsunviroidae, Pospiviroidae
Priony Téma prionů je primárně spojováno s degenerativním onemocněním mozku-spongiformní encefalopatií – Creutzfeldt-Jacobovy nemoci a dalších variant, včetně tzv. bovinní spongiformní encefalopatie („nemoc šílených krav“). Vývoj názorů na etio- patogenesu onemocnění až k poznání geneticky podmíněné prionové choroby, proteinové infekční částice a prionové složky jednobuněčných eukaryot-kvasinek. Savčí prion Určující model tohoto prionu postuluje existenci prionového proteinu, který se vyskyuje ve dvou izoformách: PrPc –(neurony, gliové buňky, mozková tkáň) – determinován genem Prnp jako běžný protein struktur buněčného povrchu s možnou funkcí receptoru, vazného proteinu popř. dalí buněčnou funkcí. Změnou jeho konformace vniká druhá izoforma PrP-proteinu – PrPSc. Primární struktura obou izoforem je identická, PrPScizoforma se reprodukuje, liší se sekundární a terciární strukturou a vysokou rezistencí k proteolytické degradaci a dalším inaktivacím. Konverze PrPc izoformy do PrPSc je indukována kontaktem. Tato konverze je rovněž možná mutací genu Prnp. Patologický cytologický obraz: vakuolizace neuronů, deposit amyloidů a další. Mutace genu Prnp determinující patogenitu se dědí jako dominantní znak a přenášejí se „mendelisticky“. PrPc protein vzniká a je postranslačně modifikován jako membránový protein s navigovaným transportem (drsné endoplazmatické retikulum – membrána). Jeho lokalizace je stálým pohybem (možná úloha Cu2+ iontů) mezi plazmatickou membránou a endozomem (invaginací membrány). V této lokalizaci dochází také ke konverzi uvedených izoforem. Kvasinkový prion Prionová složka kvasinkové buňky není cytotoxická. Představuje model dědičné změny fenotypu při zachování nezměněného genotypu (ne-mendelisticky přenášený znak). Model prionu URE3. Prion zasahuje první krok biosyntézy uracilu (vznik karbamylasparagové kyseliny) Tento intermediát není využíván v přítomnosti glutaminu. Nález opačné situace a důkaz, že tento znak se přenáší cytodukcí jako cytoplazmaticky přenosný element a další přístupy spojily daný fenotypový znak s existencí prionu (prion URE3). Stimulace tvorby prionu proteinem Ure2p a tvorba amyloidů. Prionový fenotyp PSI: model spojující
autoagregaci amyloidních vláken a inaktivaci funkce kvasinkového prionového proteinu Sup 35p. Eliminace kvasinkových prionů Fenotyp PSI a URE3 (Saccharomyces cerevisiae) může být ztracen eliminací prionové složky dlouhodobou kultivací v přítomnosti guanidinhydrochloridu a dále inaktivací chaperonu Hsp104. Tato skutečnost otevírá problematiku vztahu proteinu Hsp104, který má, mimo jiné, schopnost disociovat proteiny z proteinových agregátů, k proteinu PSI. Model vegetativní (heterokaryontové) neslučitelnosti (splývání hyf) v populaci vláknité houby (Podospora anserina) determinované prionem Het-s.
Poškození a opravy dv DNA Nenahraditelnost, tedy nutná opravitelnost DNA je evoluční motivací vývoje buněčných mechanizmů, které mohou úplně nebo do určitého stupně opravit poškození, která vznikla: a) náhodně (chybou v procesu replikace nebo rekombinace), b) indukovaně, tj. především vlivem vnějších faktorů ( UV, X záření, alkylační činidla a další chemická agens, Mn2+ ionty, deaminační procesy atd.). Důsledkem jsou poškození / chyby těchto typů: jednořetězcové nebo dvouřetězcové zlomy, vznik anomálních struktur v rámci struktury DNA, vznik mezer a přímo nebo následně vznikající chybná párování. Principy a mechanizmy úplných a částečných oprav Fotoreaktivace: oprava eliminující UV indukované thyminové dimery. V přímé fotoreaktivaci je zapojena světlem (340-400nm) aktivovatelná fotolyasa. Specifické působení bez vzniku sekundárně indukovaných chyb. Opravný mechanizmus - štěpení dimeru (cyklobutanového kruhu) je společný prokaryotickému i eukaryotickému buněčnému typu. Alternativní mechanizmus bez účasti enzymu je světlem indukovaná monomerizace thyminového dimeru. Adaptace na alkylační poškození DNA: postupná, adaptivní indukce O6-methylguanin-DNAmethyltransferasy fugující v opravě chybných párů, které obsahují O6-alkylguanin nebo O4alkylthymin. Význam ada-regulonu. Excisní opravy poškozených bází: chemicky modifikované báze jsou rozeznány a vyštěpeny DNA-glykosylasami (monomerní proteiny prokaryot a eukaryot působící bez kofaktorů). Jejich působením vzniká tzv. apurinové nebo apyrimidinové (AP)místo, které je následně rozpoznáno a štěpeno AP-endonukleasami, upraveno DNA-deoxyribofosfodiesterasou, a dále doplněno DNA-polymerasou a uzavřeno DNA-ligasou. Excisní opravy poškozených nukleotidů: pyrimidinový dimer je vyštěpen jako komponent oligonukleotidu. Funkce specifické endonukleasy- uvolnění oligonukleotidového fragmentu. Funkce DNA-polymerasy v opravné syntéze a závěrečná funkce DNA-ligasy. Korekturní funkce DNA-polymerasy III: rozeznání chybného páru a excise chybně zařazeného nukleotidu. Opravy řízené metylací: následné opravy lokalizovaných deformací DNA, vzniklých jako důsledek „přehlédnutého“ chybného párování bází. Klíčovým prvkem těchto oprav je rozlišení řetězce s chybnou a správnou bází. Identifikace methylovaného adeninu ve správném řetězci a rozpoznání a degradace řetězce, ve kterém tento znak chybí (nově syntetizovaný řetězec s chybou). Následují další nutné kroky rekonstrukce DNA.
Opravy kategorie SOS Komplexní buněčná odpověď na poškození DNA, podmíněná indukovanou syntézou produktů tzv. SOS genů, jejíž indukce je zprostředkována interakcí produktů genu LexA a RecA. (model Escherichia coli). Vnitrobuněčným signálem je poškození DNA a následná interakce DNA s RecA- proteinem, který je aktivován (aktivní proteasa). Interakce LexA-proteinu s aktivní formou RecA proteinu způsobí jeho štěpení, čímž je inaktivován jakor represor SOS-genů, k jejichž expresi následně dochází.
Regulace genového vyjádření Bakteriální genom Regulace hladiny a funkce genového produktu - regulace na úrovni jeho syntézy a aktivity. Úroveň procesů: transkripce, postranskripčních úprav,translace a posttranslačních úprav. Vyjádření (exprese) bakteriálního genomu nejčastěji regulováno na úrovni transkripce. Komplementarita regulačního mechanizmu požadavku rychlé adaptace na aktuální vliv fyziologických faktorů (požadavek aktuálně nutné enzymové výbavy atd.). Význam zprostředkované úlohy malých (efektorových) molekul (substrátů / produktů) v iniciaci nebo blokaci transkripčního procesu konkrétních genů: úloha regulačních proteinů v této interakci malých molekul. Znaková funkce regulačního proteinu (regulátoru): rozlišení promotoru určitého genu a rozpoznání efektorové molekuly se vztahem k tomuto genu. Pozitivní regulační protein: vazba do regulační oblasti umožňuje transkripci celé (takto regulované) transkripční jednotky; Vazba negativního regulačního proteinu blokuje transkripci. (pozitivní / negativní regulace). Alosterický efektor: malá molekula indukující změnu konformace regulačního proteinu. Indukce a represe procesu transkripce (syntézy genového produktu). Represor – negativní regulační protein determinovaný regulačním genem.. Operon - typ transkripční jednotky; operátor – oblast vazby represoru - funkční složka operonu. Vazba represoru a vazba induktoru (korepresoru) k represoru je nekovalentní interakcí. Vazba induktoru indukuje konformační změnu represoru, která znemožňuje jeho vazbu k operátoru. Vazba korepresoru má opačný efekt. Uvedené interakce rychle vznikají a zanikají. Negativní regulace operonu je podstatou indukce a represe syntézy enzymů (operonový model). Induktor je pozitivní regulátor, indukující transkripci operonu. Korepresor je metabolit působící jako pozitivní alosterický efektor – zároveň je také označitelný jako negativní regulátor. Vzájemná poloha operátoru a promotoru (mohou se částečně překrývat) určuje mechanismus blokace procesu transkripce – tj. blokaci vazby nebo blokaci pohybu RNA polymerasy. A) Lac operon jako základ operonového modelu a příklad pozitivně i negativně regulovatelného operonu. Transkripční jednotka s geny determinujícími β-galaktosidasu, βgalaktozidpermeasu a galaktozidacetyltransferaasu. Indukce v přítomnosti laktózy a tzv. zdarma působících induktorů. Základní charakteristika represoru lac operonu. Subjednotková stavba operátoru, molekulová podstata vazebné interakce reprsorového tetrameru k operátoru. B) Model pozitivní regulace operonu - katabolická represe. Interakce cAMP s aktivačním proteinem v kontextu vlivu glukózy na konkrétní transkripční proces. Model potlačení enzymové syntézy katabolity některých substrátů. Funkce cAMP jako pozitivního alosterického efektoru. C) Atenuace: regulace transkripce prostřednictvím přítomného atenuátoru, tj. oblasti ve vedoucí DNA sekvenci s funkcí předčasného transkripčního terminátoru. Mechanismus atenuace tryptofanového operonu spojuje vliv aktuální hladiny tryprofanu na rychlost translace s vývojem dv (m)RNA a vlastní terminací rpobíhající transkripce..
D) Syntéza proteinů indukovaná zvýšením kultivační teploty. (Hsp-proteiny). Význam výměny standardního sigma-faktoru RNA- polymerasy za alternativní s.f. a následné rozeznání promotorů alternativních transkripčních jednotek. E) Regulace vyjádření sporulačního subgenomu. Regulace zajišťující (časově přesnou) sekvenční indukci syntézy relativně velkého počtu genových produktů. F) Trp-opreon; operon katabolismu arabinosy.
