Minimal Residual Disease (MRD) onderzoek bij hematologische maligniteiten
MRD
Principe, doel en eigenschappen
Technieken voor MRD analyse
Klinische toepassingen
Minimal Residual Disease
Bij diagnose: 1012 maligne cellen
Criteria voor complete remissie: – Klinisch: herstel normale hematopoiese – Morfologisch (gevoeligheid 1-5/100)
Nog aanwezigheid van ≤1010 maligne cellen Gevoelige technieken nodig om subklinische/submorfologische ziekte (‘minimal residual disease’ of minimale ziekterest) op te sporen
MRD onderzoek 1012
10-2
Complete Remissie
Morfologische detectielimiet
1010
108
10-4 Immunofenotypische/ moleculaire detectielimiet 10-6
106
Einde inductie
Doel MRD onderzoek
Betere beoordeling vroegtijdige respons op therapie met eventueel intensificatie vs reductie therapie – Vb ALL kinderen (volwassenen)
Continue monitoring tijdens remissie voor vroegtijdig opsporen van relaps met mogelijk therapeutisch ingrijpen – Vb AML M3
Andere: – pre- en post allogene transplantatie – opsporen MRD in aferese materiaal voor autologe stamceltransplantatie – Evaluatie nieuwe therapieën
Eigenschappen MRD technieken Gevoeligheid minstens 10-3 (bij voorkeur 10-4 tot 10-6) Specificiteit Stabiele leukemie-specifieke merkers Reproduceerbaarheid en standaardisatie Kwantitatieve techniek
Technieken voor opsporen MRD
Immunofenotypering mbv multiparameter flowcytometrie – leukemie-specifiek immunofenotype (LAP: leukemia associated phenotype), vnl bij acute leukemieën
Moleculaire technieken: PCR – immunoglobuline/TCR genherschikking vnl bij lymfatische maligniteiten – specifieke chromosoomafwijking (vnl translocaties)
Multiparameter flowcytometrie
Alg principe: simultaan meten van 5 of 6 parameters op elke cel (na aanstralen met laserlicht): – Voorwaartse en zijwaartse lichtverstrooiing (grootte en interne structuur) – 3 of 4 membranaire of intracellulaire antigenen na aankleuren met fluorescent gemerkte (monoclonale) antistoffen Karakterisatie van hematopoietische cellen: cellijn (myeloid, lymfoid B/T) en differentiatiestadium
Multiparameter Flowcytometrie
Leukemie-specifiek immunofenotype obv aberrante of ongewone antigenexpressie: – Cross-lineage antigenexpressie
(expressie van een antigen dat specifiek is voor een andere differentiatielijn) Vb CD13/CD33+ precursor B-ALL Vb CD19+ AML, CD2+ AML
– Asynchrone antigenexpressie
(co-expressie antigenen die normaal niet gelijktijdig op één cel tot expressie komen) Vb AML CD34+/CD15+ Vb precursor B-ALL CD34+/CD20+
Multiparameter Flowcytometrie
Leukemie-specifiek immunofenotype obv aberrante of ongewone antigenexpressie: – Over/onderexpressie of afwezigheid van antigen Vb overexpressie van CD10 bij B-ALL (B-ALL CD10++) Vb afwezigheid van CD33 bij AML (AML CD33-)
– Ectopische antigenexpressie (voorkomen van onrijpe cellen buiten de plaatsen waar zij zich normaal bevinden of expressie van een antigen dat normaal niet tot expressie komt op hematopoietische cellen) Vb TdT+ T-cellen in PB (CD5+/TdT+) Vb NG2 bij ALL, AML
Multiparameter flowcytometrie CD10/CD20/CD19
TdT/CD10/CD19
Multiparameter flowcytometrie: precursor B-ALL Immunofenotypische profielen van normale BM subpopulaties als referentiekader Definiëren van zgn ‘empty spaces’ waarbinnen aberrante fenotypes kunnen voorkomen (BIOMED-I concerted action report, Leukemia 2001)
Multiparameter flowcytometrie Gevoeligheid: 10-3 – 10-4 Voordelen: snel en kwantitatief Nadelen:
– Heterogene populatie (vnl AML) – Verandering van Immnunofenotype bij relaps (vnl AML) -> Follow-up van tenminste 2 antigencombinaties -> in combinatie met moleculaire technieken
Principe PCR
DNA doelwitsequentie Begrensd door primers Exponentiële toename Taq polymerase
RNA na RT stap (RT-PCR)
Kwantificatie:
– seriële dilutie of coamplificatie van een interne of externe standaard – Real-time kwantitatieve PCR
Real-Time kwantitatieve PCR: TaqMan principe
Real-Time kwantitatieve PCR
Ct: Cycle Threshhold: PCR cyclus waarbij het fluorescent signaal een bepaalde drempel overschrijdt en detecteerbaar wordt
Immunoglobuline/T-celreceptor genherschikkingen
PCR Ig/TCR genherschikkingen
PCR Ig/TCR genherschikkingen Gevoeligheid: 10-4 – 10-5 Voordelen: stabiliteit van DNA Nadelen:
– tijds- en arbeidsintensief – Verlies van herschikkingen (clonale evolutie en/of subclonen) -> Follow-up van tenminste 2 targets
PCR van fusiegenen(DNA) RT-PCR van fusiegen transcripten (RNA)
(RT-)PCR fusiegen (transcript)
Gevoeligheid: 10-4 – 10-6
Voordelen: – – –
Stabiele target (bijna) geen achtergrond van normale cellen Vrij eenvoudig en snel
Nadelen: – – – –
Instabiliteit van RNA Variabele genexpressie (patiënt en tijd) Contaminatie Beperkt toepasbaar
Klinische toepassingen van MRD analyse
MRD technieken bij acute leukemieën Flowcytometrie
PCR Ig/TCR herschikkingen
(RT-)PCR fusiegen (transcript)
60-95%
>95%
30-35%
>95%
>95%
10-20%
75-85%
<10%
25-30%
80-90%
>90%
35-40%
>95%
>95%
10-20%
75-85%
<10%
25-30%
Kinderen Precursor B-ALL T-ALL AML
Volwassenen Precursor B-ALL T-ALL AML
MRD bij ALL kinderen
Prognostisch belang van MRD onderzoek tijdens de eerste maanden van therapie:
verdwijningsnelheid van leukemiecellen gedurende de vroege behandelingsfase als onafhankelijke prognostische merker
MRD bij ALL kinderen
Cumulatief risico op relaps na 3 jaar (na diagnose), op basis van het MRD niveau op het einde van de inductie therapie Laag (≤10-4)
Intermediair (>10-4 <10-2)
Hoog (≥10-2)
Cavé et al
5%
24%
56%
Van Dongen et al
9%
32%
67%
Coustan-Smith et al
9%
17%
78%
MRD bij ALL kinderen: pretransplant
Prognostische waarde van MRD analyse vóór allogene stamceltransplantatie
MRD bij ALL volwassenen
Vergelijkbare voorspellende waarde van MRD onderzoek bij ALL volwassenen (wel verschil in therapie respons) MRD analyse om vroegtijdig effect van therapie te evalueren en identificatie van laagrisico en hoogrisico patiënten (reductie versus intensivering van therapie)
MRD bij AML Prognostische waarde van MRD meting voor evaluatie therapierespons Meestal mbv flowcytometrie Gebrek aan standaardisatie Problemen van heterogene populatie leukemische cellen, en immunofenotypische shifts bij relaps
MRD bij APL: monitoring tijdens remissie
AML M3, t(15;17) PML/RARα MRD informatie tijdens remissie laat een vroege therapeutische interventie toe: – Moleculaire relaps 1 tot 14 maand (mediaan 3 maand) vóór hematologische relaps – Betere prognose bij start therapie op tijdstip van moleculaire relaps
(GIMEMA studie)
MRD bij APL
MRD bij CML
t(9;22) BCR/ABL RT PCR
Evaluatie Imatinib therapie:
– MCR: ‘major cytogenetic response’ (≤35% Phi+ metafasen in BM) – CCR: ‘complete cytogenetic response’ (geen Ph+ metafasen in BM) – Major molecular response (MMR): 3 log reductie van BCR/ABL fusie transcript, of BCR-ABL/ABL <0.05-0.1% – Identificatie van mogelijke Imatinib resistentie: 2voudige stijging van BCR/ABL fusie transcript
MRD bij CML
Imatinib vs IFN+AraC als eerstelijnstherapie:
Hogere kans op MMR na 2 jaar indien 2 log reductie na 3m/6m
Branford, Leukemia 2003
MRD bij CML: post allogene transplantatie
BCR-ABL/ABL 3 tot 5 maand na SCT – – –
High-level: ≥0.02% Low-level: <0.02% Negative: afwezig
MRD bij CML
Monitoring BCR/ABL transcripts na allogene transplantatie: – Aanwezigheid van BCR/ABL transcripts na transplantatie - Prognostische waarde van MRD level eerste maanden posttransplantatie - Moleculaire relaps voorafgaand aan cytogenetische en hematologische relaps - Therapeutische interventie bij moleculaire relaps (DLI) met mogelijk langdurige moleculaire remissie
MRD bij CML
MRD bij CLL/NHL/MM
Monitoring therapie bij complete remissie MRD monitoring tijdens remissie om relaps te voorspellen Prognostische waarde pre- en posttransplantatie Evaluatie tumorcontaminatie van aferese materiaal bij autologe SCT Is uitroeiing van MRD noodzakelijk voor duurzame remissie? (kwantitative analyse!) Therapeutische implicatie?
BM versus PB?? B-ALL: BM>PB T-ALL: BM=PB AML: BM>PB CML: BM=PB MM: BM NHL: MRD in BM en Pb als surrogaat voor ziekteactiviteit in klier (of andere site)
Besluit
Verschillende technieken, toepasbaarheid afhankelijk van ziekte, indien mogelijk complementair – Belang van kwantitatieve technieken (real-time PCR) – Belang van standaardisatie van de technieken
Diverse toepassingsgebieden (vroegtijdige therapie respons, vroegtijdig opsporen relaps, hoge dosis/transplant, evaluatie nieuwe therapieën) Nog eerder beperkte klinische implicaties – Kan MRD onderzoek leiden tot (bij)sturen van de therapie? – Heeft het (bij)sturen van de therapie een betere overleving tot gevolg?
