Integrale diagnostiek van hematologische maligniteiten in bloed en beenmerg
Wat de afdeling Hematologie VU medisch centrum u, in nauwe samenwerking met de afdelingen Klinische Genetica en Pathologie, te bieden heeft.
Ons hematologielaboratorium biedt u een breed spectrum van onderzoeken aan, bestaande uit zowel morfologische beoordelingen, immuunfenotyperingen en moleculair biologische analyses. Daarnaast wordt cytogenetisch onderzoek door de afdeling Klinische Genetica in het VU medisch centrum verricht. De afdeling Pathologie doet het clonaliteitsonderzoek m.b.v. genherschikkingen. Klinisch farmacologische en eiwitbepalingen worden door de Afdeling Klinische Farmacologie en Apotheek, respectievelijk de Afdeling Klinische Chemie verricht. Belangrijk voordeel van dit veelomvattende pakket aan bepalingen is dat wij alle bepalingen vanuit één inzendpunt coördineren en U vervolgens één complete en geïntegreerde diagnose leveren met desgewenst een behandeladvies. De volgende diagnostische tests zijn beschikbaar.
Algemeen • Morfologische beoordeling: deze wordt verricht op May Grünwald Giemsa gekleurde uitstrijkjes van perifeer bloed en beenmerg waarbij, indien nodig, speciële kleuringen worden uitgevoerd (ijzer, niet-specifieke esterase, Sudan black). Materiaal: 6 ongekleurde beenmerguitstrijkjes en 4 ongekleurde perifere bloeduitstrijkjes Responstijd*: 1 week • Immuunfenotypering: met behulp van goed gedefinieerde antistofpanels wordt de maligne celpopulatie in kaart gebracht. Bij acute myeloide leukemie worden ook leukemiegeassocieerde antigenen bepaald voor latere detectie van minimale restziekte (MRD). Materiaal: 2-5 ml heparine beenmerg; 6 ml heparinebloed Responstijd*: 1 week • M oleculair-biologische analyse: deze is meestal gebaseerd op een PCR amplificatie methode en wordt gebruikt om op DNA of RNA niveau te 2 2
screenen op ziektespecifieke afwijkingen, die van belang zijn voor diagnose, prognose en voor het vaststellen van de optimale behandeling. Materiaal: 2-5 ml heparine beenmerg of 24 ml heparinebloed Responstijd*: 2 weken • C ytogenetica: onderzoek naar numerieke en structurele chromosomale afwijkingen alsmede analyse van specifiek afwijkende chromosomen met behulp van FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) Materiaal: 2-5 ml heparine beenmerg of 6 ml heparinebloed Responstijd*: 2 weken
voor alle uitslagen geldt dat u (= aanvragende arts, die op het aanvraagformulier is vermeld) z.s.m. – zo nodig en zo mogelijk binnen enkele uren - telefonisch op de hoogte wordt gesteld indien er aan de uitslag directe therapeutische consequenties zijn verbonden. *
Chronische myeloide leukemie 1. Standaard morfologische beoordeling van beenmerg- en bloeduitstrijkjes 2. Standaard cytogenetisch onderzoek: translocatie (9;22), additionele cytogenetische afwijkingen en eventueel FISH (BCR-ABL) 3. Moleculaire technieken gebaseerd op PCR amplificatie: • detectie van translocatie (9;22)/BCR-ABL1 • kwantitatieve bepaling BCR-ABL1 • mutatie-analyse ABL-kinase 4. Klinisch farmacologische bepalingen • Plasmaconcentraties van b.v. imatinib, nilotinib en dasatinib (Klinische Farmacologie en Apotheek) Betekenis: De diagnose CML kan slechts gesteld worden wanneer er een t(9;22) dan wel een BCR-ABL1 fusietranscript wordt aangetoond. Voor het vaststellen van de respons op tyrosinekinaseremmers of het vervolgen van het effect van een allogene stamceltransplantatie dient volgens een strikt schema met behulp 3
van een kwantitatieve PCR de hoeveelheid BCR-ABL1 transcript te worden bepaald. Indien er volgens de ELN (European Leukemia Network) criteria sprake is van een inadequate respons, dient allereerst een bloedspiegel van de op dat moment gebruikte tyrosinekinase remmer bepaald te worden teneinde compliance problemen en farmacokinetische variabelen te onderkennen. Wanneer deze spiegel adequaat is, moet tevens mutatie-analyse van het ABL-kinase gedeelte van het BCR-ABL1 worden verricht. Het vinden van mutaties, zoals bijvoorbeeld een T315I, bepaalt in belangrijke mate verdere behandelopties.
Chronische lymfatische leukemie 1. S tandaard morfologische beoordeling van beenmerg- en bloeduitstrijkjes 2. F ISH: landelijk is besloten, in het kader van de lopende CLL trials (HOVON 68 en 88), dat alleen interfase FISH wordt uitgevoerd voor deletie 11q, trisomie 12, deletie 13q, monosomie 13 en deletie 17p 3. Moleculaire technieken gebaseerd op PCR amplificatie ter identificatie van: • somatische hypermutatiestatus zware ketens immuunglobulinegenen • clonale T-celreceptor gamma-keten (TCRG) genherschikking (Moleculaire Pathologie) • clonale immunoglobuline zware keten (IGH) genherschikking (Moleculaire Pathologie) 4. Immuunfenotypering Betekenis: Chronische lymfatische leukemie is een heterogene aandoening met duidelijke morfologische en immuunfenotypische kenmerken. Verschillende factoren blijken van prognostische waarde te zijn. Bij patiënten waarbij sprake is van deleties van chromosoom 13 heeft de ziekte veelal een relatief gunstig beloop, terwijl trisomie 12 en deleties van chromosoom 11 en met name ook van 17p prognostisch minder gunstig zijn. Dat geldt ook voor een ongemuteerde status van de hypervariabele gedeelten van de zware ketens van de immuunglobulinegenen.
4
Immuunfenotypering is vooral essentieel in gevallen met atypische morfologie en voor het aantonen van de zeldzame chronische lymfatische leukemievormen zoals hairy-cell leukemie, natural killer cel of T-cel leukemieën en miltlymfomen. Clonaliteitsanalyse, via moleculaire of immunologische technieken, kunnen uitgevoerd worden vooral bij patiënten waarbij getwijfeld wordt of het een reactieve dan wel maligne proliferatie betreft.
Myeloproliferatieve neoplasmata (Polycythemia Vera, essentiële thrombocytose, primaire myelofibrose) 1. S tandaard morfologische beoordeling van beenmerg- en bloeduitstrijkjes 2. Moleculaire technieken gebaseerd op PCR amplificatie: • JAK2 exon 14 (V617F) mutatie • JAK2 exon 12 mutaties Betekenis: Bij Polycythemia Vera kan een JAK2 exon 14 mutatie in meer dan 90% van de patiënten worden aangetoond. Bij essentiële thrombocytose en primaire myelofibrose is dit in 30-50% van de patiënten het geval. Hiermee helpt deze test myeloproliferatieve aandoeningen te differentiëren van reactieve processen. In zeldzame gevallen kan er sprake zijn van JAK2 exon 12 mutaties. Bij een aangetoonde JAK2 mutatie is nog niet gedifferentieerd tussen PV, ET of MF. NB: Morfologische beoordeling van het beenmergbiopt, met name geënt op het vaststellen van fibrose
Non-Hodgkin lymfomen Immuunfenotypering van bloed alleen bij leukemisch proces Betekenis: Immuunfenotypering van het perifere bloed of beenmerg speelt een belang5
rijke rol bij het differentiëren tussen chronische lymfatische leukemieën en leukemische non-Hodgkin lymfomen. NB: Stageringsonderzoek op het beenmergbiopt dient te geschieden m.b.v. immuunhistochemie, niet met immuunfenotypering.
Multipel myeloom (MM) en MGUS 1. Standaard morfologische beoordeling van beenmerg- en bloeduitstrijkjes 2. Interfase FISH analyse op de gezuiverde plasmacelfractie – ook in het kader van de HOVON 86 trial - voor: 1p/1q, chromosoom 5, 9 en 15, 13q14.3, 17p13.1 (p53-gen) en IgH; indien afwijkend dan ook FISH voor t(4;14), t(11;14) en t(14;16). Dit is conform een landelijke afspraak. 3. Vrije lichte ketens (FLC) in serum m.b.v. Freelite assay (Klinisch Chemisch Laboratorium) Betekenis: Bij MM komen diverse cytogenetische afwijkingen voor die een sterke associatie hebben met de prognose. De bovengenoemde, met FISH te detecteren afwijkingen, zijn geassocieerd met een slechte prognose. In ongeveer 3% van de gevallen van multipel myeloom is er bij standaard laboratoriumonderzoek met immuunfixatie geen M-proteine aantoonbaar. In meer dan de helft van deze gevallen blijkt er dan toch sprake van productie van clonale FLCs, welke met behulp van de Freelite assay gedetecteerd kunnen worden. Daarmee kan dan vervolgens de respons op therapie vervolgd worden. Indien de FLC in serum negatief is vervalt bovendien de noodzaak om bij een eerste diagnosestelling 24-uurs urine te onderzoeken op aantoonbare clonale FLCs. Indien clonale vrije lichte ketens wel aantoonbaar zijn in serum dient de therapierespons juist wel op basis van gelelectroforese en immunofixatieonderzoek van de 24-uurs urine te geschieden en niet op basis van de FLCs in het serum. Bij verdenking op amyloidose kan niet volstaan worden met onderzoek van serum en moet altijd 24 uurs urine worden onderzocht.
6
Acute lymfatische leukemie 1. Standaard morfologische beoordeling van beenmerg- en bloeduitstrijkjes 2. S tandaard cytogenetisch onderzoek en eventueel FISH (BCR-ABL1 en 11q23 afwijkingen) 3. Moleculaire technieken (gebaseerd op PCR amplificatie): detectie van • 11q23 (MLL) translocaties (4 meest voorkomende translocaties) • t(9;22)/BCR-ABL1 4. Immuunfenotypering • Met behulp van verschillende antistofpanels kan gedifferentieerd worden tussen myeloide-, lymfatische-, bifenotypische- of biclonale leukemie. Betekenis: Het Multilineage Leukemia (MLL) gen, gelegen in band 23 van de lange arm van chromosoom 11, kan betrokken zijn bij translocaties met diverse partnergenen en komt voor bij 5-7% van de gevallen van ALL. Dit heeft een ongunstige prognostische betekenis. Dat geldt ook voor een t(9;22)/BCR-ABL1 translocatie, die bij volwassenen met ALL in 20-30% van de gevallen wordt aangetroffen.
Acute myeloide leukemie en het myelodysplastisch syndroom 1. Standaard morfologische beoordeling van beenmerg- en bloeduitstrijkjes 2. S tandaard cytogenetisch onderzoek en eventueel FISH (chromosoom 5 en 7 deleties, trisomieën) in geval standaard cytogenetisch onderzoek niet mogelijk blijkt. Bij MDS en geen delingen wordt naast FISH del(5q), del(7q), monosomie 5, monosomie 7 en trisomie 8 ook FISH voor Y (bij mannen), del(20q) en del(17p) (p53-gen) onderzocht. 3. Moleculaire technieken gebaseerd op PCR amplificatie en/of sequentieanalyse: detectie van • t(8;21)/AML1-ETO • t(15;17)/PML-RARalfa • inversie 16/t(16;16)(CBFbeta/MYH11) 7
• • • • •
11q23 (MLL) translocaties (4 meest voorkomende translocaties) EVI-1 overexpressie NPM1 mutaties C-EBPalfa mutaties FLT3-ITD
4. Immuunfenotypering: • Met behulp van verschillende antistofpanels kan gedifferentieerd worden tussen myeloïde-, lymfatische-, bifenotypische- en biclonale leukemieën. Betekenis: Bij AML komen diverse moleculaire en cytogenetische afwijkingen voor die een sterke associatie hebben met de prognose. Prognostisch gunstige afwijkingen zijn t(15;17), t(8;21), inv(16) t(16;16), C-EBPalfa en NPM1 mutaties, terwijl patiënten met de overige hierboven genoemde afwijkingen juist een ongunstige prognose hebben. In het algemeen zal in het laatste geval bij daarvoor geschikte patiënten een indicatie voor een allogene stamceltransplantatie bestaan. Hoewel de speciële kleuringen (ijzer en Sudan-Black) naast de May-GrunwaldGiemsa kleuring van grote waarde zijn bij o.a. het onderscheid tussen acute myeloide en acute lymfatische leukemie, is voor een complete diagnostiek immuunfenotypering essentieel. Dit geldt met name voor die gevallen waarbij het resultaat van de conventionele kleuringen onduidelijk is. Ook leukemieën met een ambigue karakter (WHO 2008) kunnen alleen op deze wijze gediagnosticeerd worden.
Stamceltransplantatieonderzoek 1. C himerisme bepaling: Short Tandem Repeat (STR)analyse gebaseerd op PCR amplificatie Betekenis: Na een allogene hemopoietische stamceltransplantatie wordt de 8
hematopoiese van de patiënt vervangen door die van de donor. Met behulp van STR analyse kan vastgesteld worden of er nog resterende cellen van de patiënt aanwezig zijn. Gestreefd dient te worden naar >95% donorchimerisme. Wanneer dit niet bereikt wordt, kan overwogen worden eventuele immuunsuppressieve medicatie te staken, dan wel donorlymfocyteninfusies te geven.
Aplastische anemie 1. Standaard morfologische beoordeling van beenmerg- en bloeduitstrijkjes 2. Immuunfenotypering voor paroxysmale nachtelijke hemoglobinurie (PNH) en uitsluiten van overige hematologische clonale ziekten 3. Standaard cytogenetisch onderzoek en eventueel FISH (zoals bij MDS) Betekenis: In geval van een pancytopenie met een hypocellulair beenmerg bestaat de differentiaal diagnose uit aplastische anemie, een PNH of een hypoplastische MDS. Voor de diagnostiek van een PNH wordt tegenwoordig bij voorkeur immuunfenotypering gebruikt. Het vaststellen van de aanwezigheid van een PNH kloon bij een aplastische anemie of hypoplastische MDS is van waarde voor het voorspellen van de respons op immuunsuppressieve therapie. Cytogenetisch onderzoek kan richting geven aan de diagnostiek omdat bij een aplastische anemie de uitkomst van het chromosomenonderzoek normaal dient te zijn, terwijl het bij ruwweg de helft van de gevallen van het myelodysplastisch syndroom afwijkingen vertoont. NB: Standaardbeoordeling van een beenmergbiopt om de mate van aplasie te beoordelen is noodzakelijk.
Pancytopenie e.c.i. In geval van persisterende pancytopenie zonder aanwijsbare oorzaak zal door integratie van relevante bovengenoemde technieken getracht worden tot een diagnose te komen. 9
Algemene informatie Adres: VU medisch centrum, Afdeling Hematologie, 2D 142 De Boelelaan 1117, 1081 HV Amsterdam Contactpersonen: Ing. A. Loonen, hoofdanaliste hematologie (020) 444 4444, tracer 7611 Prof.dr. G.J. Ossenkoppele, hematoloog (020) 444 4444, tracer 6212 Formulieren: Het aanvraagformulier en het formulier informed consent kunt u downloaden van onze website www.hematologie.nl
Opmerkingen 1. Het aanvraagformulier met informatie over hoeveelheden en type afnamebuizen vindt u op onze website www.hematologie.nl Het materiaal kan van maandag t/m donderdag adequaat worden verwerkt. Indien het materiaal pas op vrijdag op het laboratorium arriveert is vooraf overleg noodzakelijk. 2. A .u.b. zending aanmelden bij:
[email protected] 3. A.u.b. de SPOED sticker gebruiken op de inzending. 4. Indien u zelf al onderzoek (b.v. immuunfenotypering) hebt verricht, vragen wij u de uitslag met de aanvraag mee te sturen. 5. Wij stellen het op prijs om restmateriaal op te slaan voor eventuele onderzoeksvraagstellingen. Indien u deze intentie wilt steunen vragen wij u een door de patiënt ondertekend informed consent formulier met de aanvraag mee te sturen. U kunt dit downloaden van onze website www.hematologie.nl
Versie mei 2011
10
