FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2012 - 2013
Susceptibiliteit voor pediatrische maligniteiten in BRCA1 en BRCA2 families
Eva DUYVER
Promotor: Prof. Dr. B. Poppe
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding
MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE
TOELATING TOT BRUIKLEEN.
VOORWOORD Deze scriptie kwam tot stand dankzij de vlotte samenwerking met professor Bruce Poppe. Ik wil hem bedanken voor de ondersteuning en begeleiding. Graag bedank ik ook het administratief personeel van de dienst K5 voor hun hulp tijdens het stamboomonderzoek. Ten laatste zou ik graag ook mijn ouders, dhr. Kinoo, mevr. Maes en mijn vriend danken voor de hulp en het nalezen van deze scriptie.
INHOUDSTAFEL A. ABSTRACT....................................................................................................................... 1 B. INLEIDING....................................................................................................................... 3 I. DNA-SCHADE EN HERSTEL. ............................................................................................... 3 II. HOMOLOGE RECOMBINATIE. ............................................................................................ 5 III. FA/BRCA PATHWAY. ..................................................................................................... 8 IV. FUNCTIE BRCA1 EN BRCA2 ......................................................................................... 9 a)
BRCA1 ......................................................................................................................... 9
b)
BRCA2 ....................................................................................................................... 10
V. HEREDITAIR BORST- EN OVARIUM CARCINOOM SYNDROOM ........................................... 10 VI. HEREDITAIRE KANKER PREDISPOSITIE SYNDROMEN MET PEDIATRISCHE NEOPLASIEËN. 11 a)
Hereditair retinoblastoom ......................................................................................... 11
b)
Von-Hippel Lindau syndroom. .................................................................................. 11
c)
MEN syndroom. ......................................................................................................... 12
d)
Familiale adenomateuze polypose. ........................................................................... 12
e)
Wilmstumor. ............................................................................................................... 13
f)
Bloom’s syndroom. ..................................................................................................... 13
g)
Li-Fraumeni syndroom, Ataxia Telangiectasia en Fanconi anemie. ........................ 13 o
Li-Fraumeni syndroom. ...................................................................................................................................... 14
o
Ataxia telengiectasia. ......................................................................................................................................... 15
o
TP53 en BRCA1-2........................................................................................................................................ 15
ATM en BRCA1-2 ....................................................................................................................................... 16
Fanconi anemie. ................................................................................................................................................. 17
Fanconi anemie en BRCA2. ......................................................................................................................... 18
Fanconi anemie en BRCA1. ......................................................................................................................... 18
VII. AANLEIDING TOT EN DOEL VAN DIT ONDERZOEK. ........................................................ 20 C. METHODOLOGIE ........................................................................................................ 20 I. LITERATUURONDERZOEK. ............................................................................................... 20 II. STAMBOOMONDERZOEK. ................................................................................................ 21 D. RESULTATEN. .............................................................................................................. 23 I. LITERATUURONDERZOEK ................................................................................................ 23 a)
BRCA en pediatrische tumoren. ................................................................................ 23
b)
BRCA 2 en medulloblastoom. .................................................................................... 25
c)
FANCD1/BRCA2 mutaties en Fanconi anemie. ........................................................ 26
II. STAMBOOMONDERZOEK. ................................................................................................ 28 a)
Algemeen ................................................................................................................... 28
b)
Casussen. ................................................................................................................... 29 o
Familie 1 ............................................................................................................................................................ 29
o
Familie 2 ............................................................................................................................................................ 30
o
Familie 3 ............................................................................................................................................................ 31
o
Familie 4 ............................................................................................................................................................ 32
o
Familie 5 ............................................................................................................................................................ 33
o
Familie 6 ............................................................................................................................................................ 33
o
Familie 7 ............................................................................................................................................................ 34
o
Familie 8 ............................................................................................................................................................ 35
o
Familie 9 ............................................................................................................................................................ 36
o
Familie 10 .......................................................................................................................................................... 37
o
Familie 11 .......................................................................................................................................................... 38
E. DISCUSSIE...................................................................................................................... 41 F. REFERENTIELIJST. ..................................................................................................... 46 G. BIJLAGEN. ..................................................................................................................... 49
A. Abstract Inleiding: In het cellulair genoom ontstaan dagelijks mutaties als gevolg van blootstelling aan genotoxische stoffen. Voor het behoud van de integriteit van het DNA, zijn herstelmechanismen onontbeerlijk. Zonder deze processen persisteren deze genoomfouten en net dit is etiopathogenetisch bij de genese van maligniteiten. DNA-herstel vindt plaats via verschillende cellulaire cascades, waarvan 1 homologe recombinatie betreft, een proces waarbij proteïnes gecodeerd door Breast Cancer susceptibility gene 1 en Breast Cancer susceptibility gene 2 (BRCA1 en -2) belangrijke functies uitoefenen. In deze pathway interageren ze met eiwitten die in gemuteerde versie reeds geassocieerd zijn met het predisponeren tot pediatrische maligniteiten. Bovendien zijn biallelische mutaties in BRCA2 geïdentificeerd als een onderliggende oorzaak van een subtype Fanconi anemie, dat gepaard gaat met pediatrische tumoren. Heterozygote BRCA1/2 mutaties zijn ondertussen bekende oorzaken van het Hereditair Borst- en Ovariumcarcinoom (HBOC) syndroom. Aangezien reeds enkele syndromen gekend zijn die aantonen dat kanker op kinderleeftijd erfelijk kan zijn en wegens de belangrijke rol van BRCA1 en -2 in het behoud van integriteit van het DNA, werd hier onderzocht of heterozygote BRCA mutaties een oorzaak kunnen zijn van kanker op kinderleeftijd.
Methodologie: Enerzijds werd de literatuur doorzocht op studies rond deze link en rond het verband van BRCA met reeds gekende hereditaire kankersyndromen die gepaard gaan met pediatrische maligniteiten. Anderzijds werd een beschrijvende stamboomstudie uitgevoerd bij 159 dossiers van BRCA mutatiedragende families uit het dossierbestand van de dienst Medische genetica van het UZ Gent. Er werd gezocht naar gevallen van pediatrische tumoren bij maximaal 4e graadsverwanten van een bewezen mutatiedragend persoon.
Resultaten: In de literatuur is de link heterozygote BRCA1/2 mutaties en predispositie voor pediatrische tumoren slechts weinig onderzocht. Twee studies over deze topic werden aangetroffen. Homozygote BRCA2 mutaties werden wel reeds uitvoerig gelinkt aan pediatrische tumoren. Het stamboomonderzoek resulteerde 11 gevallen op 159 families. Dit betekent een verhouding van 6,9 pediatrische maligniteiten per 100 BRCA mutatie positieve families. In deze 11 gevallen waren 2 patiënten gekend positief voor een BRCA1 mutatie. Aangetroffen maligniteiten betroffen: leukemie, ALL, Hodgkin lymfoom, osteosarcoom,
1
‘bot/spier tumor’, niertumor, hersentumor en cerebellaire tumor. De geslachtsverdeling was 8 meisjes en 3 jongens.
Conclusie: Het onderzoek naar deze topic is nog zeer beperkt en zou verder moeten uitgebreid worden. Deze studie geeft aanduiding dat de link BRCA1/2 mutaties en predispositie voor pediatrische maligniteiten weldegelijk plausibel is. Het beschrijvende en exploratieve karakter van deze studie laat niet toe deze associatie te kwantificeren, maar vormt met zekerheid aanleiding tot verder onderzoek.
2
B. Inleiding I.
DNA-schade en herstel.
In het cellulair genoom ontstaan dagelijks mutaties als gevolg van blootstelling aan genotoxische stoffen. Endogene mutagene stoffen zijn meestal afkomstig van het normale oxidatieve metabolisme in de cel, veelal zijn het reactieve zuurstofmoleculen. Exogene stoffen die de DNA-structuur aantasten, zijn zeer talrijk en betreffen onder andere ioniserende straling, UV straling en vele chemicaliën. Ook tijdens replicatie kunnen fouten in het DNA ontstaan door bv. foutieve base-incorporatie.(1) Er wordt geschat dat een cel in 1 dag 10 tot 20 000 DNA-laesies moet herstellen. (2) Deze stoffen veroorzaken een breed spectrum aan type DNA-schade zoals enkelstreng breuken, crosslinking van de DNA-helix, modificatie van bases en dubbelstreng DNA-breuken waarbij deze laatste de meest kritische beschadiging vormt, gegeven het feit dat indien niet gecorrigeerd, ze aanleiding kunnen geven tot majeure deleties of translocaties.(1, 3-5) Indien de beschadigde DNA-helix niet wordt hersteld komt de genoomintegriteit in het gedrang en kan de schade aanleiding geven tot genoominstabiliteit en net deze twee zaken zijn kenmerken van de meeste kankers.(3) De ‘somatische mutatie hypothese’ van kanker stelt dat neoplastische transformatie ontstaat door mutaties die de functie van specifieke genen die betrokken zijn bij celreplicatie, in het gedrang brengt, wat de noodzaak van DNA-herstelcascades onderstreept.(6) Dat kan ook afgeleid worden uit de vele genetische aandoeningen, zoals ataxia telengiectasia en Nijmegen breakage syndroom, waarbij proteïnen, betrokken in het DNA-herstel, defectief functioneren en waarbij de patiënten ontwikkelingsdefecten, neurologische abnormaliteiten en een hoog risico op kankerontwikkeling
vertonen.
(3)
DNA-herstel
is
dus
essentieel
voor
normale
celontwikkeling, groei en preventie van apoptose. Cellulair zijn meerdere herstelmechanismen voor handen die het brede gamma aan laesies kunnen restitueren. Afhankelijk van het type schade kunnen volgende processen een rol spelen: nucleotide excisie herstel (NER), base excisie herstel (BER), mismatch herstel (MMR), homologe recombinatie (HR) en niet-homologe end joining (NHEJ). De laatste twee zijn alleen betrokken bij het herstellen van dubbelstreng DNA-breuken.(5) De Fanconi anemie/BRCA pathway is ook betrokken bij DNA-herstel, met name bij herstel van DNAcrosslinking, maar vormt eerder een regulerend proces van HR, translaesie synthese en NER dan een effectieve DNA-herstelcascade.(7)
3
NER is een herstelmechanisme dat het potentieel heeft om een grote variabiliteit aan DNAschade te herstellen. Het verwijdert een strengsectie die een majeure nucleotidelaesie vertoont. Het stuk dat geëxciseerd wordt is meestal een 30-tal nucleotiden lang. Voorwaarde voor deze vorm van herstel is het aanwezig zijn van een intacte streng die als template dient voor het aanvullen van het gecreëerde defect. (2, 6, 8, 9) BER corrigeert beschadigde basen in de DNA-sequentie die ontstaan zijn na deaminatie, oxidatie en alkylatie. Het proces betreft de excisie van de aangetaste nucleotide en de vervanging ervan door een onbeschadigde versie. De cascade is ook betrokken bij het herstel van enkelstreng DNA-breuken.(2, 8) Zowel NER als BER zijn persistent aanwezig in de cel en herstellen de schade vanaf ze gedetecteerd wordt. Anders ligt het bij MMR. Dit proces is enkel actief gedurende specifieke cellulaire stadia en herstelt base mismatches die ontstaan zijn gedurende de replicatie en die het proofreading proces ontglipt zijn.(2) Dubbelstreng DNA-breuken worden door twee andere cascades gerestitueerd, namelijk HR en NHEJ. Verder zijn er nog 2 processen gekend, enkelstreng annealing en alternatieve endjoining, die voornamelijk aangetoond zijn in experimenten en er wordt aangenomen dat deze geen grote rol spelen in vivo.(4) HR is een trage, maar betrouwbare manier van herstel en kan alleen optreden indien er een zusterchromatide aanwezig is. De cascade herstelt bovendien niet alleen dubbelstreng DNAbreuken, het proces is ook betrokken bij het herstel van geblokkeerde replicatievorken, interstreng crosslinks, meiotische dubbelstreng breuken en abortieve topoisomerase II laesies.(10) Hieronder zal HR verder uitgebreid besproken worden, gegeven het feit dat deze cascade proteïnes includeert die in gemuteerde vorm gekend zijn voor het veroorzaken van kanker predispositie syndromen, met onder andere pediatrische maligniteiten. NHEJ is een herstelmechanisme dat na korte processing, de losse einden van de breuk rechtstreeks ligeert wat gepaard kan gaan met kleine inserties, deleties of substituties ter hoogte van de breuk. Het proces kan plaatsvinden gedurende de gehele celcyclus omdat het geen homologe template vereist. Dit laatste vormt het probleem van deze cascade. Door de afwezigheid van de template is er geen basis om de correcte nucleotiden in te bouwen en dus het DNA te herstellen in de originele status. Het is een vorm van herstel dat frequenter gepaard gaat met mutaties.(3, 5, 10)
4
De factoren die de keuze tussen HR en NHEJ bepalen, zijn nog niet volledig bekend. Wat zeker een rol speelt, is de fase van de celcyclus waarin de cel zich bevindt, gezien HR alleen maar in de late S en G2 fase kan optreden. De complexiteit van het beschadigd chromatine en van de geïnduceerde schade zou ook een rol spelen.(1)
II.
Homologe recombinatie.
Homologe recombinatie verloopt complex en vereist een grote diversiteit aan proteïnen. Deze cascade is van belang geweest als stimulans voor de vraagstelling die centraal staat in deze masterproef. Dit door het feit dat in deze pathway er een associatie bestaat van BRCA1 en -2 met proteïnes die in gemuteerde vorm gekend zijn voor het predisponeren tot pediatrische maligniteiten. Zoals eerder vermeld, vereist homologe recombinatie de aanwezigheid van de zusterchromatide en is het optreden van het herstelproces zo gerestricteerd tot de late S fase en de G2 fase. Deze vereiste zorgt voor het hoog betrouwbaarheidsgehalte van het herstel.(1, 4, 10) De cascade start met het identificeren van de dubbelstreng DNA-breuk. Dit gebeurt door sensorproteïnes die ook het DNA-schade signaal amplificeren via transducer proteïnes die als functie hebben de downstream effector moleculen te activeren. Concreet functioneert het MRN-complex als sensor voor de breuk. Dit complex bestaat uit Mre11, Rad50 en Nbs1, elk met hun eigen functie. Mre11 heeft een DNA bindende activiteit en kan zo andere DNAherstelmoleculen rekruteren. De molecule heeft ook een endonuclease en exonuclease activiteit. Rad50 kan de DNA-helix uiteinden gedeeltelijk ontwinden waardoor de mogelijkheid ontstaat voor andere proteïnes om het DNA te binden. Nbs1 maakt het aantrekken van verschillende DNA-herstelproteïnes en van checkpoint controle moleculen mogelijk. Na de sensing van de breuk worden verschillende transducer en effector moleculen geactiveerd. ATM is zowel een transducer molecule als een primaire sensor voor dubbelstreng DNA-breuken. De molecule wordt gerekruteerd naar de plaats van de schade door het MRNcomplex waardoor de autofosforylatie ervan ter hoogte van serine 1981 wordt geïnduceerd. Hierdoor wordt de molecule geactiveerd. Actief ATM fosforyleert dan histon 2AX ter hoogte van serine 139 aan beide zijden van de breuk en vormt zo H2AX.(1) Deze modificatie zorgt ervoor dat het DNA minder compact gewonden zit rond de histonen en zo meer beschikbaar is voor binding met verschillende proteïnes. ATM fosforyleert ook andere substraten van de
5
herstelcascade, onder andere NBS1, BRCA1, FANCD2 en TP53. (11) Sequentiële fosforylatie van ATM en H2AX zorgt voor versterking van het signaal en het aantrekken van een groot aantal DNA-hersteleiwitten en checkpunt controlemoleculen naar de plaats van DNA schade. Voorbeelden hiervan zijn: MDC1, 53BP1, BRCA1, Chk1, Chk2 en TP53. Ook eiwitten die deel uitmaken van de FA pathway worden gerekruteerd. Deze events vinden plaats binnen enkele minuten na het induceren van de dubbelstreng DNA-breuk. Het cruciale event dat hierop volgt is de resectie van de DNA-uiteinden. Dit wordt gemedieerd door de endonuclease activiteit van Mre11 in het MRN-complex. Die actie wordt gereguleerd door de interactie met CtlP-BRCA1 complex. (1, 12)
Door deze 5’-3’ resectie worden 3’
enkelstrengige eindjes geproduceerd, die snel gebonden worden door RPA. Vervolgens wordt het RAD52/BRCA2/RAD51/RAD54 complex naar het enkelstrengig DNA aangetrokken via het BRCA1/PALB2 complex.(1) Deze interactie kan maar plaatsvinden na S988 fosforylatie van BRCA1 gemedieerd door CHK2.(12) Dit complex zorgt voor de vervanging van RPA door RAD51 op het DNA-einde en dit vormt een nucleoproteïne filament die de homologe sequentie van de zusterchromatide opzoekt. Na strenginvasie wordt een D-loop gevormd waar DNA-synthese plaats vindt met de homologe DNA-streng als template. In het verloop van dit proces ontstaat er op een bepaald punt een vierstrengige structuur achter de invaderende 3’ streng, wat gekend staat als een Holliday junctie (HJ). Wanneer het tweede gebroken DNAeind gecapteerd wordt door de 3’ streng, wordt een dubbele HJ gevormd. Eenmaal de breuk overbrugd is, worden de juncties opgelost via DNA-resolvases wat kan resulteren in crossover of niet cross-over chromosoom DNA-producten. Niet ieder HR-proces evolueert via HJ, er bestaat ook een alternatieve manier via synthese dependente streng annealing, wat altijd resulteert in niet cross-over chromosomale producten.(1, 4, 10, 11) Moleculen die specifiek de interesse opwekken in kader van deze studie zijn ATM en TP53, gezien zij, indien gemuteerd, geassocieerd worden met kanker predispositiesyndromen die een fenotype met pediatrische maligniteiten veroorzaken. Het feit dat zij samenwerken met BRCA1 en -2 in een pathway, is een aanleiding geweest tot de interesse voor de vraagstelling in deze studie. Dit zal verder verduidelijkt worden.
6
Figuur 1: Homologe recombinatie.(13)
7
Figuur 2: Homologe recombinatie.(14)
III.
FA/BRCA pathway.
De FA/BRCA-cascade is specifiek gericht op herstel van DNA-interstreng crosslinks (ICL) tijdens replicatie. Gezien de cascade geactiveerd wordt door schade veroorzaakt door UV en ioniserende straling, zou dit proces ook betrokken kunnen zijn bij het herstel van andere laesies. Zoals hierboven beschreven wordt, kan deze schade echter ook hersteld worden door andere cellulaire mechanismen. (15) De FA/BRCA pathway coördineert en integreert verschillende DNA-herstelmechanismen, met name NER, HR en translaesie synthese. (7, 15) Deze cascade werd als interessant beoordeeld voor deze studie gezien patiënten met defecten hierin duidelijk gepredisponeerd zijn tot maligniteiten op kinderleeftijd en bovendien BRCA2 als één van de FA genen geïdentificeerd werd. Verder interageert de pathway ook met BRCA1. Algemeen gesteld worden ICL’s als volgt hersteld. Nadat de replicatievork geblokkeerd wordt door de ICL, wordt een dubbelstreng breuk geïnduceerd waardoor de gecrosslinkte zusterchromatiden ontkoppeld worden. Door een breuk te induceren aan de andere zijde van de crosslink, kan de laesie losgemaakt worden en verder gebypassed worden door een polymerase die in staat is DNA te synthetiseren in beschadigde regio’s. De crosslink heeft nu het aspect van een nucleotide laesie en kan door NER hersteld worden. Hierdoor kan de replicatievork hersteld worden via HR-gemedieerde strenginvasie van de gecorrigeerde chromatide. HR zorgt voor verder herstel van de geïnduceerde dubbelstreng breuk. (7, 15) Moleculair zijn volgende structuren betrokken. Het FA-kerncomplex wordt gevormd door FANCA/B/C/E/F/G/L/M en dit complex activeert de monoubiquitinatie van FANCD2 en 8
FANCI na genotoxische stress in de S fase. Deze geubiquitineerde moleculen interageren dan op hun beurt met downstream proteïnes zoals FANCD1/BRCA2, FANCN/PALB2, FANCJ/BRIP1, FANCP/SLX4, RAD51C en hun geassocieerd eiwit BRCA1. Dit laatste eiwit speelt bovendien een unieke rol in het HR-proces bij ICL-herstel. De molecule promoot de associatie van FANCD2-Ub met chromatine en ook de rekrutering van RAD51 verderop in het herstelproces. Opvallend aan deze laatste proteïnes is dat ze een belangrijke rol spelen in het HR-proces. Dit komt overeen met het feit dat HR in de laatste fase van herstel van de ICL in actie komt.(7, 16) Ook in deze pathway speelt ATM een rol, samen met ATR fosforyleert het FANCD2/FANCI heterodimeer.(16)
Figuur 3: Fanconi anemie pathway.(17)
IV.
Functie BRCA1 en BRCA2
Om de parallel te kunnen trekken tussen moleculen die in gemuteerde vorm reeds gekend zijn voor hun associatie met pediatrische maligniteiten, is het belangrijk te weten welke de algemene functie van BRCA1 en -2 is. a) BRCA1 BRCA1 is essentieel in de homologe recombinatie door het faciliteren van de associatie van RAD51 met de breuk. Bovendien is de proteïne ook betrokken in de resectie van de DNAuiteinden door complexvorming met CtlP. (12) In deze homologe recombinatie is ATM betrokken, waardoor de volgende parallel kan getrokken worden. Gemuteerd ATM veroorzaakt een defectieve HR in de cel en is een gekende factor bij het predisponeren tot
9
pediatrische maligniteiten. Analoog aan dit, zorgt defectief BRCA1 ook voor een slecht verlopen van HR en bestaat de mogelijkheid dat gemuteerd BRCA1 een verhoogd risico op tumoren op kinderleeftijd met zich mee brengt. Die assumptie vormde een basis voor deze studie. BRCA1 is naast z’n rol in HR ook betrokken bij checkpoint activatie in de celcyclus. In het G1/S- checkpunt faciliteert
BRCA1 de fosforylatie van TP53 door ATM. Deze
fosforylatie is nodig om de transcriptie te starten van CDK-inhibitor p21 en zo de replicatie te stoppen, zodat opgetreden DNA-schade hersteld kan worden. (12, 18) In het S-fase checkpoint is de positie van BRCA1 minder duidelijk. Er is geweten dat BRCA1 een rol speelt bij de regulatie van Chk1-kinase activiteit. Bovendien kan gesteld worden dat de ATM gemedieerde fosforylatie van BRCA1 noodzakelijk is om dit checkpunt te kunnen opstarten en dat omgekeerd, het mogelijk is dat BRCA1 nodig is om ATM te activeren via z’n colokalisatie met het MRN-complex. De rol van BRCA1 in het G2/M-checkpunt is analoog aan die in het S-fase checkpunt. Het reguleert de activiteit van Chk1-kinase en de fosforylatie van BRCA1 is nodig om het checkpunt te activeren. (18) Opnieuw blijkt uit deze functies de nauwe betrokkenheid van BRCA1 met TP53 en ATM, 2 moleculen, die indien gemuteerd predisponeren tot maligniteiten op kinderleeftijd. Dit onderstreept de plausibiliteit van de vraagstelling van deze studie. b) BRCA2 De functie van BRCA2 is, in tegenstelling tot BRCA1, gelimiteerd tot HR. De proteïne is een essentiële mediator van de recrutering van RAD51, de belangrijkste effectormolecule in HR, gezien die de strenginvasie initieert.(12) Aangezien BRCA2 en ATM onontbeerlijk zijn voor HR, kan, net zoals bij BRAC1, hier de parallel getrokken worden met ATM.
V.
Hereditair borst- en ovarium carcinoom syndroom
Heterozygote mutaties in BRCA1 en BRCA2 zijn reeds geassocieerd met een verhoogd risico op vroegtijdige ontwikkeling van borst- en ovariumkanker. Daarenboven geven ze een verhoogd risico op borstkanker bij mannen, melanoom, gastro-intestinale tumoren, pancreas-, eileider-, laryngeale en prostaatkanker. BRCA1/2 mutaties veroorzaken 5-7% van alle
10
gevallen van borstkanker en vrouwelijke mutatiedragers hebben een lifetime risico van 50-80% op borstkanker en 30-50% op ovariumkanker.(12, 19)
VI.
Hereditaire kanker predispositie syndromen met pediatrische neoplasieën.
De interesse voor BRCA1/2 mutaties als mogelijke oorzaken van pediatrische neoplasieën volgde niet alleen uit het feit dat moleculen met een gelijkaardige functie en/of functionerend in dezelfde pathways als BRCA1/2, reeds geassocieerd zijn met kanker op kinderleeftijd, de interesse vloeide ook voort uit het feit dat er reeds aangetoond is dat pediatrische maligniteiten erfelijk kunnen zijn. Volgende hereditaire syndromen zijn reeds gekend als predisponerend voor kanker op kinderleeftijd: hereditair retinoblastoom, Li-Fraumeni syndroom, von Hippel-Lindau syndroom, multiple endocriene neoplasie (MEN) syndroom, familiale adenomateuze polypose, Fanconi anemie, familiale Wilmstumor, ataxia telengiectasia en Bloom’s syndroom.(20-22) a) Hereditair retinoblastoom Retinoblastoom is een tumor die ontstaat uit ontwikkelende retinacellen en heeft een geschatte incidentie van 1 op 17000. De tumor ontwikkelt zich typisch vóór de leeftijd van 5 jaar. Bij 40% van de retinoblastoma’s wordt een germinale mutatie van RB1 aangetroffen. Het betreft een autosomaal dominante aandoening. Het RB1 gen is een tumorsuppressorgen, gelegen op chromosoom 13q14, dat op beide allelen geïnactiveerd moet worden vooraleer er zich een retinoblastoom kan ontwikkelen. Van de kinderen die een erfelijke mutatie van het RB1 gen bezitten, ontwikkelt 90% een retinoblastoom. Bovendien hebben ze een hoger risico op het ontwikkelen van een secundaire niet-oculaire tumor, meer bepaald een osteosarcoom. Dit risico verhoogt nog in regio’s die bestraald werden, gezien de verhoogde sensitiviteit van deze patiënten voor ioniserende straling. Naast osteosarcomen worden ook weke-delen sarcomen, melanomen, pineoblastomas, long- en blaastumoren in verhoogde frequentie gezien bij deze patiënten. (20-22) b) Von-Hippel Lindau syndroom. Het von Hippel-Lindau syndroom is een aandoening die gepaard gaat met maligniteiten op kinderleeftijd en heeft een incidentie van 1 op 36000. Het wordt veroorzaakt door een germinale mutatie in VHL en het syndroom erft autosomaal dominant over. Het gen is gelokaliseerd op het chromosoom 3p25. VHL defectieve cellen bevinden zich in een pseudohypoxie, waar
proteïnes
geproduceerd
worden
die typisch
in
hypoxische
omstandigheden worden aangemaakt. Dit leidt tot gehypervasculariseerde tumoren zoals 11
hemangioblastomen van de retina, cerebellum of ruggenmerg. Daarnaast kunnen patiënten ook renaal cel carcinomen, feochromocytomen, nier- en pancreascysten, paragangliomen en papillaire cystadenomen van de epididymis en cystes van het ligamentum latum ontwikkelen. Jonge kinderen lopen het meest risico op retinale laesies. Adolescenten zijn specifiek at risk voor cerebellaire hemangioblastomen en feochromocytomen.(20, 22) c) MEN syndroom. Het MEN syndroom is een autosomaal dominante aandoening die gekenmerkt wordt door een sterk verhoogde susceptibiliteit op endocriene tumoren en een discreter verhoogd risico op niet-endocriene tumoren. Dit syndroom wordt onderverdeeld in MEN1 en MEN2, die respectievelijk veroorzaakt worden door aangeboren mutaties in MEN1(11q13) - en RET(10q11). Het RET gen is een proto-oncogen dat codeert voor een tyrosine kinase receptor proteïne welke betrokken is bij processen van celgroei, differentiatie en apoptose. Het MEN1 genproduct is een tumorsuppressor. MEN1 patiënten hebben een verhoogd risico op het ontwikkelen van hypofysetumoren, parathyroïd adenomen en pancreastumoren. De meeste manifestaties ontstaan tijdens de adolescentie, maar occasioneel treden ze op jonge leeftijd op. Het MEN2 syndroom wordt nog onderverdeeld in MEN2A en MEN2B. MEN2A is geassocieerd met het optreden van medullair thyroïd carcinomen, parathyroïd adenomen en feochromocytoom. Het vormt 90% van de MEN2 patiënten. MEN2B is verbonden met het voorkomen van medullair thyroïd carcinoom, feochromocytoom, ganglioneuromatose en mucosale neurinomen en dit reeds op zeer jonge leeftijd. (20-22) d) Familiale adenomateuze polypose. Familiale adenomateuze polypose is een autosominaal dominant syndroom met een incidentie van 1 op 10 000. De aandoening gaat gepaard met vorming van multipele adenomateuze poliepen in het colon en rectum van de patiënten. Ze ontstaan meestal tijdens de adolescentie en onbehandeld evolueren ze bijna zonder uitzondering naar coloncarcinoom. Bovendien is het risico op het ontwikkelen van hepatoblastoom bij deze patiënten in de leeftijdsperiode van 0-4 jaar tot 800 maal verhoogd. Andere extra-intestinale maligniteiten die bij dit syndroom voorkomen zijn hersentumoren, adrenocorticale tumoren, thyroïdtumoren en pancreas adenocarcinoom. De onderliggende oorzaak is een constitutionele mutatie in het APC gen gelegen op chromosoom 5q21. In normale omstandigheden inhibeert APC de Wnt signalisatie door binding aan β cathenine. Verlies van functie van het APC proteïne leidt tot versterkt Wnt signaal en celproliferatie. Er bestaat ook een kleine groep van FAP patiënten die APC mutatie negatief zijn maar die homozygoot zijn voor een MYH mutatie. (20, 22) 12
e) Wilmstumor. Wilmstumor is een tumor die voorkomt op kinderleeftijd en histologisch gecatalogeerd wordt als nefroblastoom. Bij de hereditaire vorm is de etiologische germinale mutatie gelegen op chromosoom 11p13, met name in het WT1 gen. Er wordt aangenomen dat ook andere genen (o.a. op chromosoom 17q21 en 19q13) een rol spelen, aangezien in minder dan 5% van de Wilmstumoren bij personen met suggestieve evidentie voor genetische predispositie, een aangeboren mutatie werd aangetroffen in het WT1 gen. Susceptibiliteit voor deze tumor wordt voornamelijk gezien binnen enkele andere genetische aandoeningen zoals het BeckwithWiedemann syndroom, Denys-Drash syndroom en het WAGR syndroom. De echte familiale vorm is verantwoordelijk voor slechts 1% van het totaal aantal Wilmstumoren. (20, 22) f) Bloom’s syndroom. Het Bloom’s syndroom is een zeldzame autosomaal recessieve ziekte waarbij patiënten fenotypisch gekarakteriseerd worden door faciale teleangiëctastieën, fotosensitiviteit, groeivertraging en verhoogde susceptibiliteit voor een breed spectrum aan tumoren. De gemiddelde leeftijd bij het ontstaan van een tumor is 24,7 jaar en ongeveer één derde van alle tumoren ontstaan bij kinderen of adolescenten. Acute leukemie en maligne lymfomen zijn op die leeftijden de meest voorkomende vormen van kanker. Het typische cytogenetisch kenmerk van de cellen bij deze patiënten is de verhoogde zusterchromatide uitwisseling in germinaal DNA. Het etiologisch gen is gelegen op chromosoom 15q26.1 en betreft het BLM gen. Deze sequentie codeert voor een eiwit dat tot de RecQ helicase proteïne familie behoort. De functie van deze helicases betreft het dubbelstrengig DNA te ontwinden waardoor ze een belangrijke rol spelen bij DNA-recombinatie, transcriptie, replicatie en bij DNA-herstel. In een studie bij de Ashkenazi joodse populatie, bleek er in de BRCA1/2 mutatiedragende groep ook een verhoogde aanwezigheid van BLM mutaties. (23) Dit ondersteunt het belang van de onderzoeksvraag die hier gesteld wordt. Bij het Bloom’s syndroom is onderliggend het DNAherstel gecompromitteerd, wat er ook wordt aangetroffen bij BRCA1/2 deficiënte cellen. Hierdoor blijkt opnieuw de relevantie van de onderzoeksvraag van deze studie. (20) g) Li-Fraumeni syndroom, ataxia telangiectasia en Fanconi anemie. Het Li-Fraumeni syndroom, ataxia telangectasia en Fanconi anemie zijn 3 aparte hereditaire kankerpredispositiesyndromen die geassocieerd zijn met pediatrische maligniteiten. Bij deze aandoeningen wordt de mogelijke betrokkenheid van BRCA1/2 mutaties in het veroorzaken van pediatrische maligniteiten extra onderstreept. Uit voorgaande tekst werd reeds veelvuldig
13
de link met deze proteïnes aangehaald en dit zal hieronder nog meer uitgebreid aangehaald worden. o Li-Fraumeni syndroom. Germinale mutaties in het TP53 gen zijn de onderliggende oorzaak van het Li-Fraumeni syndroom. Het product afkomstig van het TP53, is een tetramere transcriptiefactor die in een proces functioneert die de celgroei inhibeert wanneer er cel stress optreedt. Deze stress wordt veroorzaakt door agentia die DNA-schade uitlokken, zoals hypoxie, oncogene stoffen, radiatie,… Hierdoor wordt TP53 post-translationeel gestabiliseerd, zodat het zijn effectoren kan activeren en zo celcyclus arrest, cellulaire veroudering of apoptose kan veroorzaken. Zoals reeds aangehaald speelt TP53 ook een rol bij DNA-herstel. Bovendien is de molecule betrokken in glycolytische pathways, angiogenese en veroudering.(24, 25) Dit syndroom is gekenmerkt door een familiale clustering van vroegtijdig optredende tumoren zoals sarcomen, premenopauzale borstkankers, hersentumoren en adrenocorticale carcinomen. De definitie van het LFS door Li en Fraumeni werd in 1988 als volgt gesteld: een proband met een sarcoom onder 45 jaar met een eerstegraadsverwant gediagnosticeerd met een maligniteit onder 45 jaar met een bijkomende eerste- of tweedegraadsverwant in dezelfde lijn met een maligniteit onder 45 jaar of een sarcoom op iedere leeftijd. (26) Gezien niet bij alle families die beantwoordden aan de oorspronkelijke definitie, een familiale TP53 mutatie kon vastgesteld worden, zijn er andere definities voor handen die extensiever zijn. Het procent TP53 mutaties bij LFS families varieert tussen 29% en 83% afhankelijk van de gehanteerde definitie. Dit fenomeen is nog steeds niet volledig opgehelderd, omdat geen enkel ander gen significant geassocieerd kon worden aan het Li-Fraumeni syndroom. (24) Erfelijke TP53 mutaties hebben een prevalentie van circa 1 op 5000 geboortes.(27) TP53 mutatiedragers hebben ongeveer 50% kans om een tumor te ontwikkelen vóór de leeftijd van 40 jaar, wat in de algemene populatie 1% bedraagt. 90% van de mutatiedragers worden vóór de leeftijd van 60 jaar met kanker gediagnosticeerd. Bovendien bestaat bij dit ziektebeeld het risico op het ontwikkelen van multiple tumoren over verloop van tijd. Dit risico is het hoogst bij kinderen die reeds een maligniteit overwonnen hebben. (25) Pediatrische maligniteiten zijn een belangrijk onderdeel van dit syndroom. Op kinderleeftijd bestaat er een significant verhoogd risico op het ontwikkelen van een adrenocorticaal carcinoom. Dit is een opmerkelijke associatie, gegeven het feit dat deze tumor in de algemene populatie doorgaans pas vanaf 40 jaar optreedt. De gemiddelde leeftijd van TP53 14
mutatiedragers bij diagnose van deze tumor bedraagt slechts 4,8 jaar. (24) Het optreden van adrenocorticaal carcinoom op jonge leeftijd is een sterke aanwijzing voor de aanwezigheid van een TP53 mutatie. Onderzoek kon bij families waar een kind een adrenocorticaal carcinoom ontwikkelde in 88% van de gevallen een erfelijke TP53 mutatie aantonen. (28). Verder lopen Li-Fraumeni kinderen risico op het ontwikkelen van botsarcomen, hersentumoren en weke-delen sarcomen. (24) TP53 en BRCA1-2 TP53 en BRCA1 en -2 worden meermaals gelinkt in de literatuur. Als eerste is er het feit dat in tumoren met BRCA1 en -2 mutaties, TP53 in een verhoogde frequentie gemuteerd is. (12, 19, 29) Bovendien kan BRCA1 binden aan TP53 om de ATM-afhankelijke fosforylatie ervan te moduleren en zo de functie van TP53 te versterken. (18, 29) Deze gegevens ondersteunen de gedachte dat BRCA1 en -2 verantwoordelijk kunnen zijn voor maligniteiten op kinderleeftijd. Dit kan hypothetisch gebeuren via twee mechanismen. Enerzijds kunnen BRCA1 en -2 mutaties onstabiliteit van het genoom met zich meebrengen en TP53 mutaties veroorzaken. Anderzijds kan door defectief BRCA1, de fosforylatie van TP53 niet naar behoren gebeuren en wordt TP53 niet volledig functioneel. Verder zijn er enkele analoge aspecten aanwezig bij beide syndromen, wat impliceert dat BRCA1 en -2 mutaties gelijkaardige effecten hebben als TP53 mutaties en aldus ook causatief kunnen zijn voor pediatrische maligniteiten. Zo hebben TP53 mutatiedragers, net als BRCA12 mutatiedragers, een verhoogd risico op premenopauzale borstkanker.(24, 25) Ondanks de belangrijke functie die beide genen hebben in het behoud van genoomintegriteit, zien we bij beide syndromen geen verhoogd risico op bv. longkanker geïnduceerd door tabaksgebruik, hoewel tabak belangrijke oncogenen bevat die het DNA beschadigen. (12, 24) o Ataxia telengiectasia. Ataxia telengiectasia is een autosomaal recessieve neurodegeneratieve aandoening die veroorzaakt wordt door homozygote of compound heterozygote mutaties van Ataxia Teleangiectasia Mutated gen (ATM). De geschatte incidentie ligt tussen 1 op 40 000 en 1 op 300 000 geboortes.(30) De prevalentie van de mutatie in de Westerse populatie bedraagt 0,5 à 1%. (31) Het etiopathogenetisch gen is gelokaliseerd op chromosoom 11q23 en codeert voor een proteïne die behoort tot de familie van de fosfatidyl-inositol 3-kinases. Het betreft een serine/threonine proteïne kinase. ATM speelt een centrale rol in het herstel van dubbelstreng
15
DNA-breuken, doordat het in staat is de breuk te identificeren en de herstelcascade in gang te zetten via de fosforylatie van effectormolecules. Tijdens dit proces ondergaat ATM een autofosforylatie op Serine1981 waardoor het monomeriseert en actief wordt. ATM is ook betrokken in de activatie van het G1/S-, S- en G2/M-checkpunt, in de mitotische recombinatie en in de controle van telomeerlengte. De substraten van ATM betreffen onder andere TP53, Chk2, Nbs1, BRCA1, SMC1 en FANCD2. (31-34) De typische symptomen van dit syndroom zijn vroegtijdige cerebellaire ataxie, oculocutane teleangiëctastieën, susceptibiliteit voor pulmonale problemen en verhoogd risico op kanker.(30, 32-34) Het meest prominente kenmerk is de neurodegeneratie die deterioratie van grove en fijne motoriek veroorzaakt, wat samengaat met oculomotore apraxie en onwillekeurige bewegingen van handen en voeten. Door de progressieve ataxie zijn de meeste kinderen op de leeftijd van 10 jaar rolstoel gebonden.(33, 34) Een derde van de A-T patiënten zal een maligniteit ontwikkelen, wat op kinderleeftijd overwegend tumoren van lymfoïde origine zijn, epitheliale tumoren domineren het beeld bij volwassen.(31, 33) Andere kenmerken zijn immuundeficiëntie, groeivertraging en diabetes mellitus. Biochemische eigenschappen van de aandoening zijn een verhoogd serum alfa-foetoproteïne, chromosomale instabiliteit en sterk verhoogde gevoeligheid voor radiatie.(30, 34) Vrouwelijke heterozygote mutatiedragers, zonder A-T, hebben een verhoogd risico op borstkanker.(19, 31-35) Ongeveer 10 à 15% van de kinderen met A-T zullen een maligniteit ontwikkelen. De meerderheid van deze maligniteiten zijn lymfoïd van oorsprong, zoals B-cel non-Hodgkin lymfoom, T-cel acute lymfoblastische leukemie, T-cel lymfoom en Hodgkin lymfoom.(34) Belangrijk om te vermelden is dat onderzoek wijst op het feit dat heterozygote dragers van een ATM mutatie, mogelijk ook een verhoogd risico hebben op ontwikkeling van Hodgkin en T-cel ALL op kinderleeftijd. (36, 37) Opvallend is dan wel dat enkele studies rapporteren dat naarmate er meer residuele ATM-kinase activiteit aanwezig is, het risico op ontwikkelen van pediatrische maligniteiten daalt. Dit is enigszins contradictorisch ten opzichte van vorige vaststelling. Deze studies rapporteren echter wel dat het totale risico hoger blijft dan in de normale populatie, ook bij sterk residuele ATM-kinase activiteit.(30, 35) ATM en BRCA1-2 In de literatuur zijn meerdere connecties aangetoond tussen deze moleculen. Vooreerst is de ATM-gemedieerde Ser1387 fosforylatie van BRCA1 noodzakelijk voor de activatie van het S-fase checkpunt na schade door ioniserende straling. Omgekeerd kan BRCA1 de activatie 16
van ATM in de S-fase na DNA-schade regelen doordat het colokaliseert en interageert met Mre11/Rad50/NBS1 complex, een complex dat ATM direct activeert.(18) BRCA1 kan bovendien ook dienen als scaffold voor ATM, waardoor het de verdere fosforylatie van substraten van dit kinase faciliteert. (38) Hieruit volgend kan de hypothese geformuleerd worden dat defectief BRCA1, de functie van ATM compromitteert of eventueel zelfs elimineert en zo de oorzaak kan zijn van maligniteiten op kinderleeftijd. Bij BRCA1 en BRCA2 mutatie positieve tumoren werd er bovendien gezien dat ATM expressie abnormaal gereduceerd of zelfs volledig verloren was. Dit kan betekenen dat de genomische instabiliteit die heterozygote BRCA1 en -2 mutaties met zich meebrengen, voor selectie kunnen zorgen van ATM-deficiënte cellen of secundair ATM mutaties kunnen veroorzaken. (12) Dit ondersteunt nogmaals het idee dat BRCA1 en -2 mutaties oorzaak kunnen zijn van pediatrische maligniteiten. Verder zien we dat heterozygote ATM mutatiedraagsters een verhoogd risico hebben op borstkanker, net zoals dat is bij BRCA1 en -2 mutatiedraagsters. Het risico is echter discreter dan dat geassocieerd met BRCA1 en -2 mutaties.(19, 31-35) Deze analogieën wijzen op de gelijkaardige functie van beide moleculen en opnieuw op de implicatie dat BRCA1 en -2 mutaties geassocieerd kunnen worden met pediatrische maligniteiten. o Fanconi anemie. Fanconi anemie is een autosomaal recessieve aandoening (met uitzondering van 1 gen, FANCB is gelegen op het X-chromosoom) waarbij meest frequent de volgende genen gemuteerd zijn: FANCA, FANCC, FANCG en FANCD2. Andere etiologische mutaties betreffen laesies in FANCD1/BRCA2, FANCN/PALB2, FANCO/RAD51C. De cascade waarin al deze moleculen functioneren is hierboven reeds beschreven. De kenmerken van dit syndroom zijn sterk leeftijdgebonden. Bij de geboorte en in de vroege kindertijd kunnen er fysieke symptomen zoals een kleine gestalte, Fanconi facies, microftalmie, café au lait spots, duim- en radiusafwijkingen,… aanwezig zijn. Dit aspect van het fenotype heeft een variabele penetrantie. Tussen de leeftijd van 5 en 15 jaar ontwikkelen patiënten beenmergfalen wat zich uit in cytopenieën. De gemiddelde leeftijd bij het ontstaan van hematologische afwijkingen bedraagt 7 jaar. Verder in de tienerjaren en op jongvolwassen leeftijd is het risico manifest toegenomen op het ontwikkelen van acute
17
myeloïde leukemie en myelodisplastisch syndroom (MDS). Bij volwassenen kan een spectrum van solide tumoren gezien worden, voornamelijk orale maligniteiten. (16, 39) Fanconi anemie en BRCA2. Uit onderzoek blijkt dat homozygote FANCD1 ofwel BRCA2 mutaties aangetroffen kunnen worden bij 2-4% van alle Fanconi anemie patiënten. Deze DNA-laesies zijn het etiopathogenetisch mechanisme voor een specifiek subtype FA. FANCD1 patiënten vertonen een ernstiger fenotype wat gekenmerkt wordt door het vroeger ontstaan en verhoogde incidentie van leukemie en solide tumoren in vergelijking met andere types FA. Deze aandoening wordt in de resultaten van deze studie verder uitgewerkt.(40) Fanconi anemie en BRCA1. Dit verband is niet zo eenduidig als dat met BRCA2. BRCA1 mutaties zijn niet gekend als causale factor voor FA. BRCA1 is echter wel een bekende downstream molecule in de FA pathway en in cellen met BRCA1 mutaties gebeurt de monoubiquitinatie van FANCD2 als reactie op DNA-schade minder efficiënt.(16, 41) Aanvullend hierop is de observatie dat biallelische mutaties in PALB2/FANCN de oorzaak zijn van een subtype Fanconi anemie die geassocieerd is met pediatrische maligniteiten. Het spectrum van de tumoren en leeftijdsdistributie bij diagnose bij deze patiënten is zeer gelijkend op dat van FANCD1 subtype FA patiënten. (42, 43) Belangrijk hierbij is dat PALB2 gekend is als fysieke link tussen BRCA1 en BRCA2 in homologe recombinatie.(12, 43) Er werd gezien dat bij mutatie van PALB2 de vorming van RAD51 foci onmogelijk is, doordat BRCA2 niet gecolokaliseerd wordt bij de DNA-breuk. Dit werd ook waargenomen in cellen die defectief BRCA1 bevatten. (42) Uit deze observaties blijkt dus dat cellen met PALB2 en BRCA1 mutaties gelijkaardige moeilijkheden ondervinden bij homologe recombinatie na het ontstaan van DNA-schade. Dit ondersteunt de mogelijkheid dat BRCA1 mutaties geassocieerd is met maligniteiten op kinderleeftijd.
18
Tabel 1: Syndromen met pediatrische maligniteiten
Syndroom
Belangrijkste tumortypes
Overerving
Gen
Type gen
Hereditair Retinoblastoom
Retinoblastoom, osteosarcoom
Autosomaal dominant
RB1
Tumorsuppressor
Li-Fraumeni syndroom
Weke-delen sarcomen, osteosarcomen, borstcarcinoom, adrenocorticaal carcinoom Retinale en centraal zenuwstelsel hemangioblastomen, feochromocytomen, renaal cel carcinoom.
Autosomaal dominant
TP53
Tumorsuppressor
Autosomaal dominant
VHL
Tumorsuppressor
MEN1
Tumorsuppressor
RET
Oncogen
Tumorsuppressor
Von-Hipppel Lindau syndroom Multiple endocriene neoplasie syndroom - MEN1
-
MEN2
Autosomaal dominant pancreastumor, hypofyse adenoom, parathyroïd adenoom
Medullair thyroïd carcinoom, feochromocytoom, parathyroïd hyperplasie
Familiale adenomateuze polypose Fanconi anemie
Colon- , thyroïd- , maag- , darmkanker, hepatoblastoom
Autosomaal dominant
APC
Leukemie, plaveiselcelcarcinoom, gynaecologische tumoren
Autosomaal recessief
FANCA,B ,C, D1,D2,E, F,G,I,J, L,M,N,O,P
DNA-stabiliteit gen
Familiale Wilmstumor
Nefroblastoom
Autosomaal dominant
WT1
Tumorsuppressor
Ataxia telengiectasia
Leukemie, lymfoom
Autosomaal recessief
ATM
DNA-stabiliteit gen
Bloom’s syndroom
Leukemie, lymfoom, huidkanker
Autosomaal recessief
BLM
DNA-stabiliteitsgen
a
a: is niet autosomaal maar X-gebonden recessieve overerving.
19
VII.
Aanleiding tot en doel van dit onderzoek.
Uit de hierboven aangehaalde vaststellingen vloeide de interesse voor de mogelijke associatie BRCA1 en -2 mutaties en pediatrische maligniteiten voort. Kort gesteld zijn dit de meest belangrijke stimulansen geweest tot het formuleren van huidige onderzoeksvraag. Eerst en vooral het feit dat kanker op kinderleeftijd erfelijk kan zijn, met reeds talrijk gekende voorbeelden. Daarnaast ook dat BRCA1 en -2 functioneren in een zeer belangrijke genoomprotectieve cascade waar eiwitten mee in functioneren die indien defectief, predisponeren tot het ontwikkelen van pediatrische maligniteiten. Verder is de reeds bekende associatie van homozygote BRCA2 mutaties en FA een aanleiding geweest voor deze vraagstelling. Als laatste zijn ook de multiple interacties van BRCA1 en -2 met het TP53, ATM en FA een aanleiding voor deze studie. Bij deze feiten komt ook het besef dat het kennen van deze associatie belangrijke implicaties kan hebben. Prenatale screening zou dan nog meer belang moeten krijgen. Indien een mutatie aanwezig is, zou de opvolging van deze kinderen totaal anders moeten gebeuren en indien mogelijk, zou preventieve screening moeten worden aangeboden. Dit allen om een betere outcome in geval van tumorontwikkeling te kunnen bekomen. Vandaar het belang van grondig onderzoek naar de mogelijke associatie van BRCA1 en -2 mutaties met pediatrische tumoren. Het doel van dit onderzoek is aanzet te geven tot verder onderzoek. Het ontwerp van deze studie is niet van die aard dat de resultaten die eruit voortvloeien als conclusief kunnen worden gezien, maar eerder als een indicatie of verder onderzoek nodig is.
C. Methodologie I.
Literatuuronderzoek.
In eerste instantie werd Pubmed geraadpleegd met ‘BRCA1’ en ‘BRCA2’ als trefwoorden. Het doel hiervan was de kennis over deze twee moleculen uit te breiden. Verdere zoektermen waren: ‘BRCA1 function’, ‘BRCA2 function’. Hierna werd Pubmed doorzocht gericht op het vinden van bestaande artikels rond BRCA en pediatrische maligniteiten. Dit aantal blijkt zeer schaars, slechts 2 klinische studies hebben deze hypothese onderzocht. Trefwoorden waren: ‘BRCA1 BRCA2 and childhood cancer’, ‘BRCA1 and childhood cancer’, ‘BRCA2 and childhood cancer’.
20
Doordat deze moleculen functioneren in DNA-herstelprocessen, werd ook dit verder uitgediept. Trefwoorden waren: ‘DNA repair review’, ‘single strand break repair’, ‘base excision repair review’, ‘nucleotide excision repair’, ‘mismatch repair review’, ‘double strand break repair’, ‘homologous recombination pathway review’. Ook de kennis rond pediatrische maligniteiten werd verder uitgebreid via literatuur raadpleging met volgende zoektermen: ‘pediatric cancer’, ‘ heriditairy pediatric cancer review’, ‘the pediatric cancer genome project’. Om de hypothese verder te ondersteunen werd gezocht naar verbanden van BRCA1 en- 2 met moleculen die in gemuteerde versie reeds gekend predisponeren tot pediatrische maligniteiten. Pubmed werd geraadpleegd met als trefwoorden ‘ATM, ataxia telangiectasia, TP53, LiFraumeni syndrome, Fanconi anemia, FANCD2’. Vaak werden hieraan de trefwoorden ‘pediatric malignancies’ toegevoegd. Via deze zoektermen werden een belangrijk aantal relevante studies en reviews gevonden. Ook werd de bronnenlijst van de artikels nagegaan op interessante studies. Op deze manier kwam het onderwerp homozygote BRCA2 mutaties en medulloblastoom naar voor en gezien dit een belangrijke topic is die aansluit bij deze masterproef, werd het diepgaander onderzocht met de specifieke termen ‘ BRCA2 and medulloblastoma, homozygous BRCA2 mutations and medulloblastoma’. De gevonden literatuur werd doorgenomen en geselecteerd op relevantie en onderbouwend karakter van dit onderzoek. De informatie die hieruit kon weerhouden worden, werd gebruikt in de inleiding en specifiek in het resultatendeel van deze studie.
II.
Stamboomonderzoek.
Het voorwerp van onderzoek waren papieren dossiers behorende tot het patiëntenbestand van de dienst Medische genetica van het UZ Gent. Het betrof dossiers die opgesteld waren naar aanleiding van aanvragen voor genetische testing op BRCA1 en -2 mutaties. Dit verzoek tot testing gebeurde enerzijds op verwijzing van behandelende artsen en anderzijds op eigen initiatief van personen of families, dit allen voortvloeiend uit het vermoeden van een verdachte kankerdistributie in de familie. Deze dossiers werden bij het 1e consult steeds voorzien van een handgeschreven stamboom op basis van de informatie die de patiënten aanreiken. Per persoon in deze stamboom wordt er aangegeven of hij/zij reeds overleden is, of hij/zij een maligniteit ontwikkeld heeft, indien wel, welke maligniteit en op welke leeftijd dit was. Vaak worden deze stambomen later nog aangevuld met nieuwe personen en gegevens. Belangrijke opmerking hierbij is echter wel dat niet alle gegevens in de stambomen altijd 21
strikt up to date gehouden worden en dat de datum van de laatste aanpassing vaak niet aangegeven staat. Alle personen gaven hun informed consent voor het gebruiken van deze gegevens voor eventuele studiedoeleinden. Er werden 159 dossiers van BRCA1 of -2 mutatie positieve families geselecteerd. De stambomen van deze families werden doorlopen met het oog op het vinden van personen die in de leeftijdscategorie 0- 21 jaar een maligniteit ontwikkeld hebben. Indien een case aanwezig was in de stamboom, werd gezocht of deze persoon genetisch positief getest was voor een BRCA mutatie. Indien de persoon negatief getest was, werd deze niet weerhouden. Indien de patiënt niet getest was om welke reden dan ook, werd er overlegd of de mogelijkheid voldoende reëel was dat deze patiënt de mutatie geërfd heeft. Bij positieve evaluatie werd dit geval in de cases lijst opgenomen. Voorwaarde hiervoor was dat het verwantschap van het kind niet verder dan de 4e graad was met een mutatiedragend persoon. Dit onderzoek leidde tot een lijst met kinderen die een maligniteit ontwikkeld hebben waarbij dragerschap voor een BRCA1 of -2 mutatie aangetoond of plausibel is. Gezien de specifieke eigenschappen van de studiegroep en de resultaten van dit onderzoek, is het zeer moeilijk om valabele referentiewaarden te vinden om deze resultaten mee te vergelijken. De lijst met gevonden cases is moeilijk in een epidemiologische parameter te gieten. Een incidentie kan niet worden afgeleid omdat de tijdsperiode waarin deze dossiers opgesteld werden te verschillend is voor al deze gevallen. Bovendien zijn de stambomen retrograad opgesteld, met onder andere personen die reeds een aantal jaar overleden zijn. Een prevalentie kan ook niet worden berekend gezien er een belangrijk deel van de personen die op deze stambomen staan, niet relevant zijn voor dit onderzoek. De eigenschappen van de algemene populatie en van de resultatenpopulatie zijn dus te verschillend om die te kunnen gebruiken in een statische test. De resultaten die hieruit zouden vloeien zouden te gebiased zijn. Vandaar dat geopteerd werd voor een beschrijvende analyse van de gevonden resultaten, aangevuld met gegevens uit de literatuur, die via Pubmed werden geconsulteerd. De trefwoorden hierbij waren: ‘osteosarcoma and BRCA’, ‘Osteosarcoma, genetics ’, ‘ ALL and BRCA’, ‘ALL, genetics’ ‘BRCA and Hodgkin lymfoma’, ‘Hodgkin lymfoma, genetics’.
22
D. Resultaten. I.
Literatuuronderzoek
a) BRCA en pediatrische tumoren. De rechtstreekse link tussen BRCA1 en -2 mutaties en kanker op kinderleeftijd is nog relatief onontgonnen terrein. Er zij slechts 2 studies die deze hypothese onderzocht hebben en de resultaten ervan zijn conflicterend. Brooks et al. onderzochten de relatie via een retrospectieve analyse van de prevalentie van pediatrische maligniteiten in families met en zonder BRCA1 en -2 mutaties, allen afkomstig uit de patiëntpopulatie van een polikliniek gespecialiseerd in hoog risico borstkankerpatiënten. De studie onderzocht 379 families met en 426 families zonder BRCA1 of -2 mutaties. Ze ging pediatrische tumoren na bij de families tot in de 4e graadsverwanten van de indexpatiënten. In de BRCA1 mutatiegroep werden er 9 pediatrische maligniteiten aangetroffen en in de BRCA2 mutatiegroep 11. In de groep zonder mutatie werden er 35 cases aangetroffen. Dit is een niet significant verschil, met een p-waarde van 0,12. Een niet significant resultaat werd opnieuw weerhouden wanneer men het aantal families met elkaar vergeleek in plaats van het aantal gevallen van pediatrische tumoren. Er was geen verschil in geslachtsdistributie, noch in het patroon van soorten pediatrische tumoren die aangetroffen werden, dit met uitzondering van 2 zeer vroege gevallen van borstkanker. Er werd wel een verschil in leeftijd bij diagnose waargenomen in de families met BRCA1 of -2 mutaties ten opzichte van families zonder. De gemiddelde leeftijd betrof 16 jaar in de mutatie positieve groep tegenover 10 jaar in de controlegroep. Men ging ook na welke families aan de Li-Fraumeni en Li-Fraumeni like criteria voldeden, om mogelijke externe oorzaken van pediatrische maligniteiten na te gaan. In de groep met BRCA mutaties bleek van de 18 families, waarin een pediatrische maligniteit werd aangetroffen, 1 familie te voldoen aan de Li-Fraumeni criteria en 12 aan de Li-Fraumeni like criteria. Daartegenover voldeed geen enkele familie zonder BRCA mutatie aan de criteria voor het Li-Fraumeni syndroom. 13 van de 31 families vielen wel onder de Birch criteria van het Li-Fraumeni like syndroom. Dit betrof echter geen significant verschil. (44)
Belangrijke opmerkingen die bij deze studie kunnen gemaakt worden, zijn de volgende. Alle families die onderzocht werden, zijn afkomstig uit een borstkankerkliniek die gespecialiseerd is in hoog risico borstkankerpatiënten. Dit vormt op zich geen betrouwbare referentie voor de algemene populatie. Door het feit dat deze families te maken hebben met verhoogd risico op
23
borstkanker, kunnen ze een tot nu toe nog ongekende factor bezitten die niet alleen predisponeert voor borstkanker maar ook een effect heeft op het optreden van kanker op kinderleeftijd. Die factor kan bij beide groepen aanwezig zijn en zo de resultaten biassen. Samen met het retrospectieve karakter, het beperkte aantal families en het onbekend zijn van dragerschapsstatus bij de kinderen, zorgt dit ervoor dat de resultaten hiervan niet als conclusief mogen worden ervaren. Daarenboven voldeden veel families, waarin pediatrische maligniteiten aangetroffen werden, aan de criteria van Li-Fraumeni like, wat kan impliceren dat deze families ook een TP53 mutatie bezitten, waardoor het resultaat opnieuw gebiasd wordt. Als laatste kan ook vermeld worden dat de resultaten gebiased kunnen zijn doordat de studie kanker tot de leeftijd van 21 als pediatrische maligniteiten beschouwde, waardoor meer tumoren werden ingesloten en dat de familiegroottes niet gelijklopend waren in beide groepen. Magnusson et al. onderzochten de associatie van pediatrische maligniteiten met enkele gekende adulte kankersyndromen, meer bepaald de syndromen geassocieerd met BRCA1 en 2, MMR en CDKN2A mutaties. Ze onderzochten 141 BRCA mutatie positieve families, waarvan 98 een BRCA1 mutatie en 43 een BRCA2 mutatie droegen. Alle families werden geselecteerd uit het register van de oncogenetische kliniek van het Lund universiteitshospitaal in Zweden in een tijdsperiode tussen 1993 en 2006. De gegevens over het voorkomen van pediatrische tumoren in de families werd bekomen aan de hand van stambomen opgesteld op basis van een vragenlijst die alle patiënten moesten invullen bij het eerste consult. De familiale mutatie werd gedetecteerd bij een volwassene van de familie, geen enkel kind onderging testing wegens ethische redenen. Er werden 2 controlegroepen geselecteerd. De eerste groep was afkomstig vanuit de inwoners van de Heliga Trefaldighetsparochie tussen 1951 en 1963. Er werden 148 families geselecteerd met kinderen die geboren waren tussen 1958 en 1963 en die werden gematched met het Nationaal kankerregister en Regionaal kankerregister van Zuid-Zweden voor de identificatie van de pediatrische tumoren. De tweede groep, bestaande uit 706 families, werd gehaald uit een case-controle studie over nonHodgkin lymfomen waarbij de informatie bekomen werd via een gestandaardiseerde vragenlijst. Beide groepen hadden een gelijkaardige frequentie van kanker op kinderleeftijd in de families, met name 0,7 (1/148) en 0,8% (6/706). In de analyse van de gegevens, werden BRCA1 en -2 mutatiedragende families eerst in een groep geanalyseerd. Bij hen werd in 3,5% van de families pediatrische neoplasieën aangetroffen. Dit was een significant resultaat met een p-waarde van 0,02. Bij analyse in 2 aparte groepen, zag men een significant resultaat optreden bij de families met BRCA2 24
mutaties maar niet bij die met BRCA1 mutaties. In de BRCA2 mutatiedragende families lag de frequentie van pediatrische maligniteiten op 9,3% wat een p-waarde met zich meebracht van 0,001. Bij de BRCA1 mutatie groep was de frequentie slechts 1% en dit resulteerde in een pwaarde van 0,6. Bij de risico-assessment werd een licht verhoogd risico op pediatrische maligniteiten genoteerd in de gecombineerde BRCA1 en -2 positieve groep. Dit werd ook aangetroffen bij de BRCA2 mutatiedragende groep. Deze studie concludeert dus dat heterozygote mutaties van BRCA2 geassocieerd zijn met een verhoogde frequentie van kanker op kinderleeftijd en dat ze ook een licht verhoogd risico op pediatrische tumoren met zich meebrengen.(45) Dit resultaat staat in conflict met het resultaat dat Brooks et al gevonden heeft. De onderzoekers bespreken daarom de biasfactoren die aanwezig kunnen zijn in hun studiedesign. Vooreerst kan recall bias aanwezig zijn gezien de identificatie van de pediatrische tumoren in beide groepen gebaseerd was op vragenlijsten. Verder werd de aangetroffen frequentie van neoplasieën niet aangepast aan familiegrootte bij de beide controlegroepen, wat een bias kan betekenen. Daarbovenop kan survival bias ook een rol gespeeld hebben, gezien homozygote mutaties in BRCA1 en -2 bij muizen embryonaal al lethaal is. Belangrijk blijft ook dat zowel pediatrische tumoren als familiale mutaties zeldzame events zijn en de studiepopulatie dus klein is. De hoofdopmerking bij deze studie blijft natuurlijk ook het feit dat de kinderen niet getest zijn en dus dragerschap alleen vermoed is. Dit verhindert het aantonen van een causaal verband tussen BRCA mutaties en het ontwikkelen van pediatrische tumoren. Bovendien moet er ook hier met de mogelijkheid van andere modificerende genen rekening worden gehouden, zeker in families met hoge tumor penetrantie. Als laatste is er nog een case studie van een monozygote tweeling waarbij een van de twee zussen B-cel lymfoblastische leukemie ontwikkelde op 4 jaar en 8 maanden. Bij deze patiënte werd er een BRCA1 promotor hypermethylatie aangetroffen, wat niet het geval was bij de andere tweelingzus. Het artikel stelt dat deze hypermethylatie die met een verminderde BRCA1 concentratie in de geaffecteerde cellen gepaard gaat, een causatieve rol zou kunnen spelen bij de ontwikkeling van de B-cel lymfoblastische leukemie.(46) b) BRCA 2 en medulloblastoom. Biallelische mutaties van BRCA2 worden in verband gebracht met het optreden van medulloblastoom. (47-49) Medulloblastoom is een hoog maligne tumor van het cerebellum en vormt 20% van alle pediatrische centraal zenuwstelseltumoren.(49) BRCA2 blijkt van
25
cruciaal belang te zijn in de onderdrukking van het ontstaan van deze tumor bij kinderen.(47, 48) De rol van deze molecule in de neuronale ontwikkeling werd onderzocht in een studie met biallelische knock-out muizen voor BRCA2. De twee genen werden selectief gesilenced in het neuronaal systeem, gezien de volledige deficiëntie van BRCA2 rond de 6e dag van embryonale ontwikkeling bij muizen lethaal is. (47, 48) Daaruit bleek dat BRCA2 deficiëntie leidde tot verhoogde apoptose van neuronale cellen met microcefalie tot gevolg. Wanneer bijkomend TP53 geëlimineerd werd in de cellen, was een significante reductie van de microcefalie en een structurele verbetering van het cerebellum vast te stellen. Bovendien werd er vanaf week 10 bij het merendeel van deze muizen de ontwikkeling van een medulloblastoom geconstateerd. In de muizen heterozygoot voor TP53 mutatie ontstond na verloop van tijd ook medulloblastoom en in deze tumoren kon het verlies van het wildtype allel van TP53 aangetoond worden. Daaruit werd geconcludeerd dat door BRCA2 deficiëntie er genomische schade in de wild type TP53 regio ontstaat tijdens replicatie, uiteindelijk leidende tot de vorming van medulloblastoom. (48) Bovendien wordt de cruciale rol van BRCA2 tijdens replicatie sterk onderstreept door het feit dat de tumor zich quasi uitsluitend manifesteert ter hoogte van het cerebellum, een structuur die postnataal een duizendvoudige volumetoename kent.(47) Er is ook een geval medulloblastoom bij een 13-jarige bekend die homozygoot was voor p.Asn372His mutatie (c.1114A>C) in exon 5 van BRCA2, een mutatie die ook geassocieerd is met verhoogd risico op borstkanker. De TP53 allel status wordt niet besproken in het artikel, maar dit geval kan gezien worden als voorbeeld van genomische instabiliteit die volgt uit BRCA2 deficiëntie en aanleiding geeft tot de ontwikkeling van een tumor op kinderleeftijd. Het geval suggereert dat samen met het aantreffen van medulloblastoom in Fanconi anemie patiënten die homozygoot zijn voor een mutatie in FANCD1/BRCA2, het verlies van TP53 activiteit in mensen niet vereist is voor de ontwikkeling van de tumor. (49) c) FANCD1/BRCA2 mutaties en Fanconi anemie. Fanconi anemie met de typische karakteristieken is reeds beschreven. Bij een subtype van dit heterogeen syndroom zijn de onderliggende etiologische mutaties, biallelische mutaties in FANCD1/BRCA2. Het fenotype dat specifiek met deze mutaties gepaard gaat, loopt niet volledig gelijk met het klassieke FA beeld. Het typische FA fenotype met onder andere een kleine gestalte, café au lait spots, … wordt hier gezien in associatie met een sterk verhoogde incidentie van leukemie en solide tumoren, die bovendien op jongere leeftijd optreden dan bij de andere FA patiënten. (40, 50-52) Wagner et al. rapporteert een gemiddelde leeftijd bij het 26
ontwikkelen van leukemie van 2,2 jaar, waar dit bij andere FA patiënten gemiddeld 13,4 jaar bedraagt. (51) Offit et al. stelt een gemiddelde leeftijd van 3,5 jaar vast bij de diagnose van een hersentumor in patiënten met dit subtype FA.(52) Bovendien hebben de FANCD1 patiënten een cumulatieve probabiliteit van 79% voor leukemie ontwikkeling vóór de leeftijd van 10 jaar en een probabiliteit van 97% voor het ontwikkelen van een tumor vóór de leeftijd van 5,2 jaar. Dit staat in schril contrast tot 30% cumulatieve probabiliteit voor leukemie en 25% probabiliteit voor het ontwikkelen van een solide tumor voor de leeftijd van 30 jaar bij patiënten afkomstig uit het Internationale FA register.(40) Het tumorspectrum dat bij FANCD1 patiënten wordt gezien is verschillend van dat bij de andere FA patiënten. Er wordt rapportage gemaakt van T-cel acute lymfoblastische leukemie, een hematologische maligniteit die slechts zelden bij andere FA patiënten aangetroffen wordt. De solide tumoren die bij FANCD1 patiënten worden aangetroffen betreffen Wilms tumor, neuroblastoom, medulloblastoom,
glioblastoma
multiforme
en
astrocytoom.
Medulloblastoom
en
nefroblastoom (Wilms tumor) worden heel uitzonderlijk aangetroffen bij andere FA patiënten.(39, 40, 42, 50) Vele FANCD1 patiënten ontwikkelen bovendien multiple maligniteiten waarbij de tijd waarbinnen de 2e neoplasie ontstaat sterk verkort lijkt. (39, 40, 50) Myers et al. rapporteren bij de 3 bestudeerde cases een interval van minder dan een jaar. (40) Op cytologisch niveau is het opmerkelijk dat de cellen bij FANCD1 patiënten niet alleen hoge niveaus DNA-schade ontwikkelen in respons op crosslinking agentia, maar ook een hoog gehalte van spontane chromosomale aberraties vertonen. Het gaat zowel om eenvoudige mutaties als meer complexe herschikkingen. De frequentie van aberraties ligt bovendien veel hoger dan die in andere FA patiënten.(39, 50) Deze gegevens suggereren dat BRCA2 deficiënte cellen zeer vroeg in het leven kunnen ontaarden en aanleiding geven tot het ontwikkelen van maligniteiten. De vraag die hierbij pertinent gesteld moet worden is of heterozygote mutaties in BRCA2 een gelijkaardig effect kunnen veroorzaken. In de literatuur is dit nog onvoldoende onderzocht. Het kan echter niet ontkend worden dat er een verband bestaat tussen BRCA2 mutaties en tumorontwikkeling op kinderleeftijd, maar welk niveau van BRCA2 deficiëntie noodzakelijk is voordat een neoplasie zich ontwikkelt en welke rol de deficiëntie speelt in de genese van de tumor, moet nog uitgeklaard worden.
27
II.
Stamboomonderzoek.
a) Algemeen Er werden 11 gevallen van pediatrische maligniteiten vastgesteld in de 159 dossiers van families met erfelijke mutaties in BRCA1 en -2. Van deze 11, kwamen er 7 voor in families met geïdentificeerde BRCA1 mutatie, 4 in BRCA2 mutatie positieve families. Van deze 11 gevallen werden twee personen getest op mutaties en beiden waren positief voor een BRCA1 mutatie. Het ging respectievelijk om volgende mutaties: BRCA1 c.2359dup (pGlu787fs) en BRCA1 c.4510delCTAinsTT. Bij de andere aanwezige familiale mutaties werd enkel de BRCA1 c.2359dup (pGlu787fs) mutatie drie maal aangetroffen. In de BRCA2 mutatie positieve families werd geen enkele mutatie twee maal aangetroffen. Een overzicht van alle aangetoonde mutaties wordt gegeven in tabel 2. Bij de niet geteste kinderen was de verwantschap tot een positief getest persoon maximaal van de vierde graad. De leeftijden waarop de kinderen een tumor ontwikkelden varieerde van 15 maand tot 18 jaar. In twee gevallen was alleen de leeftijd bij overlijden gekend, respectievelijk 17 jaar en 21 jaar. De geslachtsdistributie betrof 8 meisjes en 3 jongens. Het spectrum aan tumoren die werden aangetroffen zijn: leukemie, hersentumoren, osteosarcomen, Hodgkin lymfoom, niertumor en een niet verder gedefinieerde “Bot/spier tumor”. Dit scala aan tumoren is gelijkaardig aan de tumoren gevonden in de 2 reeds bestaande studies van Magnussen et al. en Brooks et al.(44, 45) De frequentie van pediatrische tumoren in deze BRCA1 en -2 mutatiedragende families is 6,9%. Gegeven het feit dat slechts bij 2 patiënten dragerschap voor de familiale mutatie werd aangetoond, werd er ook een alternatieve frequentie berekend aan de hand van de probabiliteiten op de aanwezigheid van een BRCA mutatie. Dit cijfer zou correcter kunnen worden genoemd, gezien het rekening houdt met de kans op het niet aanwezig zijn van een mutatie. Deze aanpak leverde en frequentie van 5,5% op1. Zoals hoger vermeld werd er in een studie in Zweden gebruik gemaakt van een controle populatie van 148 families en in deze populatie was dergelijke prevalentie slechts 0,7%.(45) Het groot verschil tussen deze en beide andere frequenties kan geïnterpreteerd worden als een aanwijzing dat er weldegelijk een verband bestaat tussen BRCA1 en -2 mutaties en het ontwikkelen van pediatrische maligniteiten. Belangrijk om op te merken is dat deze controlepopulatie afkomstig is vanuit Zweden en dit kan een andere patroon van blootstelling aan omgevingsfactoren met zich 1
Berekeningswijze: zie bijlage.
28
meebrengen. Daarbij komt dat de karakteristieken van de families niet gekend zijn en dus sterk kunnen verschillen van die van de hier bestudeerde families. Zodoende moet deze vaststelling als sterk indicatief beschouwd worden, maar niet conclusief. b) Casussen. o Familie 1 In deze familie is er een BRCA1 mutatie aangetoond. Een vrouwelijk lid van de familie ontwikkelde een acute lymfatische leukemie op de leeftijd van 3 jaar. Deze patiënte is ondertussen gekend drager van de familiale mutatie. Haar moeder ontwikkelde op 44-jarige leeftijd een borstcarcinoom, bij een maternele tante werd borstkanker op 36-jarige leeftijd vastgesteld en een andere maternele tante ontwikkelde bilateraal borstcarcinoom, respectievelijk op 36- en 40-jarige leeftijd. De familiale mutatie is aanwezig bij haar moeder, bij de maternele tante die bilateraal borstcarcinoom ontwikkelde en bij een maternele oom. De associatie BRCA2 mutaties en leukemie op kinderleeftijd is reeds aangehaald in het kader van Fanconi anemie. In deze familie segregeert er echter een BRCA1 mutatie. Een metaanalyse kon wel op basis van epidemiologische studies een verhoogd risico voor leukemie/lymfoom aantonen bij BRCA mutatie dragers.(53) Dit risico is niet specifiek voor kinderen, maar wordt als algemeen risico geformuleerd. Het vinden van deze case, kan perfect binnen deze vaststelling kaderen en kan eventueel een bevestiging betekenen dat het risico op leukemie bij BRCA mutatie dragers ook op kinderleeftijd al tot uiting komt.
Figuur 4: stamboom2 familie 1.
2
Legende: zie bijlage.
29
o Familie 2 De familiale mutatie betreft hier een BRCA2 mutatie. De aangetroffen pediatrische maligniteit bedraagt een acute lymfatische leukemie, ontwikkeld op de leeftijd van 15 maanden bij een vrouwelijke lid van de familie. Over dragerschap voor de mutatie zijn geen gegevens bekend. De familiale mutatie werd echter wel aangetoond bij de moeder en maternele grootmoeder. Het risico op dragerschap voor de getroffen patiënte bedraagt op deze manier 50%. De maternele grootmoeder ontwikkelde bilateraal borstcarcinoom respectievelijk op 39- en 45jarige leeftijd. Ook werd er bij twee maternele groottantes borstcarcinoom aangetroffen op 50en 68-jarige leeftijd. Bij de maternele grootoom werd een levertumor vastgesteld op 62-jarige leeftijd. FANCD1, het subtype Fanconi anemie, dat reeds hierboven aangehaald werd, heeft een bijzonder fenotype. Opmerkelijk bij deze FA patiënten is de zeer jonge leeftijd bij diagnose en het type leukemie dat aangetroffen wordt. T-cel acute lymfoblastische leukemie wordt in dit subtype aangetroffen, terwijl dit bij andere FA slechts zeer uitzonderlijk voorkomt. In deze familie is het type leukemie ook ALL (T- of B-cel niet te achterhalen) en is de leeftijd bij optreden ook zeer jong, namelijk 1 jaar en 3 maand. Bovendien is de familiale mutatie van het BRCA2 type. Al deze argumenten samen zouden kunnen impliceren dat heterozygote mutaties ook een rol spelen bij het ontstaan van ALL op kinderleeftijd. Dit moet echter met voorzichtigheid gesteld worden, gegeven het niet gekend zijn van de dragerschapsstatus van de patiënte.
Figuur 5: stamboom familie 2.
30
o Familie 3 De mutatie die in deze familie segregeert betreft een BRCA1 mutatie. Er werd in deze familie een patiënte aangetroffen die leukemie ontwikkelde waaraan ze op 21-jarige leeftijd overleed. Dragerschap voor de familiale mutatie was bij deze patiënte niet aangetoond. De mutatie werd wel aangetroffen bij een zus en 2 kinderen van deze zus. Over de maternele of paternele antecedenten is niets geweten, dus er is zowel de mogelijkheid dat de aangetroffen familiale mutatie de novo ontstaan is bij haar zus, als de mogelijkheid dat haar moeder reeds drager was van de mutatie. In de algemene populatie zijn prevalenties van van 0,07%, 0,12% en 0,24% voor BRCA1 mutaties gerapporteerd.(54, 55) De kans op het ontstaan van een de novo mutatie is algemeen laag. Gegeven het feit dat er geen informatie is omtrent de grootmoeder of grootvader en eventuele tumorontwikkeling bij deze personen, kan er geen uitspraak gedaan worden over de waarschijnlijkheid van beide hypotheses. Wanneer aangenomen wordt dat het om een overgeërfde mutatie gaat, is de kans op dragerschap bij de patiënte 50%. De zus ontwikkelde een borstcarcinoom op 50-jarige leeftijd en bij haar dochters werd borstcarcinoom vastgesteld op 23-, 27- en 30-jarige leeftijd. Daarenboven ontwikkelde een mutatiedragende dochter ook ovariumcarcinoom op 58-jarige leeftijd. In de literatuur is terug te vinden dat BRCA1 deficiëntie sterk geassocieerd is met de novo en therapie gerelateerde acute myeloïde leukemie. Bij 32% van primaire AML’s en 75% van therapie geassocieerde AML’s zag men een gereduceerde BRCA1 expressie. Dit werd ook gezien bij chronische myeloïde leukemische cellen.(56) Deze bevindingen zijn niet leeftijdsspecifiek. In deze familie is een BRCA1 mutatie aangetroffen en gezien het type leukemie niet verder gedefinieerd werd in het dossier, kan dit geval van leukemie kaderen binnen de in de literatuur aangegeven associatie. Opnieuw kan dit een bevinding zijn die aanduidt dat het risico op leukemie bij BRCA1 mutatiedragende personen ook op kinderleeftijd meespeelt. Deze stelling moet met grote voorzichtigheid gehanteerd worden gegeven het feit dat de dragerschapsstatus van patiënte niet gekend is.
Figuur 6: stamboom familie 3.
31
o Familie 4 In deze familie segregeert een BRCA2 mutatie. Bij een vrouwelijk lid werd leukemie vastgesteld op 17-jarige leeftijd. Van deze patiënte is dragerschapsstatus voor de BRCA2 mutatie ongekend, een zus, een broer en een nicht zijn wel gekend drager voor de familiale mutatie. Dit impliceert dat de mutatie overgeërfd wordt vanuit de moeder of vader van de patiënte, wat het risico op dragerschap bij haar op 50% brengt. Uit de stamboom is aan te nemen dat de mutatie via de mannelijke kant overgeërfd is, gezien de paternele tante en grootmoeder van de patiënte beiden borstcarcinoom ontwikkelden respectievelijk op 39 en 40 jaar. Verder werd er ook bij 2 zussen van de patiënte borstkanker vastgesteld op 49 en 46 jaar. Haar vader ontwikkelde zelf een hersentumor. Zoals hierboven aangehaald is deficiënt BRCA1 geassocieerd met AML en CML. Voor BRCA2 is in de literatuur de associatie met leukemie enerzijds beschreven in het kader van FA en anderzijds is er terug te vinden dat mutaties in deze sequentie overgerepresenteerd zijn in gevallen van T-cel Non-Hodgkin lymfoom en in chronisch lymfoïde leukemie.(56) In deze familie werd een BRCA2 mutatie aangetoond en het type leukemie was niet vermeld in het dossier, waardoor deze casus kan passen binnen de gegevens gevonden in de literatuur. Aanvullend aan die gegevens kan aan de hand van deze casus gesuggereerd worden dat het risico op hematologische maligniteiten bij heterozygote BRCA2 mutaties reeds op kinderleeftijd tot uiting komt. Opnieuw dient vermeld te worden dat de dragerschapsstatus van de patiënte niet gekend is en dit dus met voorzichtigheid gesteld wordt.
Figuur 7: stamboom familie 4.
32
o Familie 5 In deze familie werd een BRCA1 mutatie aangetoond. De pediatrische maligniteit die in deze familie werd aangetroffen, betreft een Hodgkin lymfoom dat een vrouwelijk lid ontwikkelde op 18-jarige leeftijd. Bij haar werd ook op 33-jarige leeftijd een borstcarcinoom vastgesteld. Deze patiënte is gekend drager voor de familiale mutatie. De mutatie werd ook aangetroffen bij haar zus, vader, twee paternele nichten en een paternele achternicht. Drie paternele tantes ontwikkelden borstcarcinoom op leeftijd van 40 en 45 jaar. Bij twee mutatiedragende paternele nichten werd borstcarcinoom op 35- en 45-jarige leeftijd vastgesteld. De enige gegevens die in de literatuur terug te vinden zijn omtrent BRCA mutaties en Hodgkin lymfoomontwikkeling, is de algemene stelling die Friedenson formuleerde, met name dat BRCA mutatie dragers een verhoogd risico hebben op de genese van leukemie en lymfomen.(53) Belangrijk is te vermelden dat in deze meta-analyse de gegevens omtrent lymfoom en leukemie samen werden geanalyseerd en dus de mogelijkheid bestaat dat het risico op lymfomen miniem is. Dit geval blijft echter interessant, mede doordat over het raakvlak BRCA mutaties en Hodgkin lymfoom nog weinig geweten is, maar vooral gezien het dragerschap van de patiënte voor een BRCA1 mutatie. Dit lijkt een zeer interessant en belangrijk topic van verder onderzoek.
Figuur 8: stamboom familie 5.
o Familie 6 In deze case betreft de familiale mutatie een BRCA1 mutatie. Binnen deze familie ontwikkelde een vrouwelijk lid een niet verder gedefinieerde bot/spiertumor waaraan ze overleed op 17-jarige leeftijd. De dragerschapsstatus van deze patiënte is onbekend, maar haar zus en moeder zijn wel bekende dragers van de familiale mutatie. De kans dat desbetreffende 33
patiënte drager was, is zo 50%. Bij een maternele tante werd de mutatie ook aangetroffen. De moeder van de patiënte ontwikkelde ovariumcarcinoom op 57-jarige leeftijd. Deze tumor werd ook vastgesteld bij de maternele tante, op 43-jarige leeftijd. De maternele grootvader en de partner van de maternele tante ontwikkelden respectievelijk darmkanker en Hodgkin lymfoom. Ze overleden op 64- en 53-jarige leeftijd. Gegeven de algemene term voor de maligniteit die de patiënte in deze familie ontwikkelde, is het moeilijk om in de literatuur aanvullende gegevens te vinden.
Figuur 9: stamboom familie 6.
o Familie 7 In deze familie werd dragerschap voor een BRCA1 mutatie aangetoond. De pediatrische maligniteit die aangetroffen werd, betreft een niertumor ontwikkeld bij een mannelijk lid op 6-jarige leeftijd. Er is geen informatie over de dragerschapsstatus van deze patiënt. De familiale mutatie werd wel aangetroffen bij een maternele tante, neef, grootoom en een dochter van een maternele groottante. Dit betekent dat de mutatie via de maternele grootmoeder overerft en dus de kans op dragerschap bij de patiënt 25% bedraagt. Bij de mutatiedragende maternele tante werd borstcarcinoom vastgesteld op 46-jarige leeftijd. Verder ontwikkelde een maternele groottante borstkanker op 43-jarige leeftijd, een maternele grootoom longcarcinoom op de leeftijd van 65 jaar en een andere maternele groottante pancreascarcinoom waaraan ze overleed op 64-jarige leeftijd. Bij twee dochters van een maternele groottante werd ook borstcarcinoom vastgesteld, waarvan 1 dochter een bilateraal carcinoom ontwikkelde op 35 en 42 jaar en de andere een unilateraal borstcarcinoom op 54 jaar.
34
FANCD1 patiënten hebben ook een verhoogd risico op het ontwikkelen van een nefroblastoom, opnieuw een type tumor die bij andere Fanconi anemie subtypes slechts met uitzondering wordt aangetroffen. De niertumor wordt hier niet verder gedifferentieerd en de familiale mutatie betreft hier een BRCA1 mutatie, wat de parallel met FANCD1 moeilijk maakt. Het kan echter een aanwijzing betekenen dat zowel gemuteerd BRCA1 als BRCA2 een rol kunnen spelen in pediatrische nefrologische tumorgenese. Deze stellingen zijn onder voorbehoud, rekening houdend met het onbekend zijn van de mutatiestatus van de patiënt.
Figuur 10: stamboom familie 7.
o Familie 8 De mutatie die in deze familie werd vastgesteld, betreft een BRCA1 mutatie. Een vrouwelijk lid van de familie ontwikkelde een osteosarcoom op 18-jarige leeftijd. Bij deze patiënte is de dragerschapsstatus onbekend. De familiale mutatie werd wel aangetroffen bij een zus en bij drie paternele nichten. Dit impliceert met hoge waarschijnlijkheid dat de vader van de patiënte ook drager was voor de BRCA1 mutatie. Dit impliceert een dragerschapsrisico van 50% voor de familiale mutatie. Een zus ontwikkelde borstcarcinoom op 42-jarige leeftijd. Verder werd er bij een paternele tante en 3 paternele nichten borstcarcinoom vastgesteld, respectievelijk op 44-, 41-, 48- en 53-jarige leeftijd. De vader van de patiënte ontwikkelde een maagdarmtumor. Een andere paternele tante ontwikkelde een tumor van ongekende aard. De literatuur is zeer beperkt over de associatie BRCA mutaties en osteosarcoom. Martin et al. formuleert echter dat er in conventioneel osteosarcoom herschikkingen van de 17q regio gezien werden en op die manier er verlies van heterozygositeit voor BRCA1 in de tumor
35
ontstond.(57) Wat de precieze rol van BRCA1 in de genese van conventioneel osteosarcoom is, valt uit deze vaststelling moeilijk af te leiden. Het is echter een aanwijzing dat defectief BRCA1 mogelijk betrokken kan zijn bij het ontstaan van de tumor. Het osteosarcoom in deze familie kan een ondersteuning betekenen van deze opvatting. De dragerschapsstatus bij de patiënte is echter niet gekend, wat betekent dat we deze stelling met voorzichtigheid moeten hanteren. Verder onderzoek over de precieze rol van BRCA1 in osteosarcoom lijkt zeker aangewezen.
Figuur 11: stamboom familie 8.
o Familie 9 De familiale mutatie in deze case betreft een BRCA1 mutatie. Een mannelijk lid van de familie ontwikkelde een osteosarcoom op 18-jarige leeftijd. De dragerschapsstatus is bij deze patiënt ongekend. De familiale mutatie werd aangetroffen bij een maternele nicht en achternicht. Deze patiënten ontwikkelden borstcarcinoom op respectievelijk 45- en 29-jarige leeftijd. Bij de maternele grootmoeder en 2 dochters van de maternele grootoom werd ook borstkanker vastgesteld. Deze distributie van tumoren maakt de kans dat het hier om een de novo mutatie gaat miniem. De assumptie is dat de mutatie via de maternele grootmoeder van de patiënt overerft, wat een dragerschapskans van 25% met zich mee brengt. Bij de andere kinderen van de maternele grootoom werd er bij een dochter een maagcarcinoom en bij een zoon een tumor van ongekende aard aangetroffen. Zoals hierboven reeds aangehaald werd, is de link osteosarcoom - BRCA weinig geëxploreerd in de literatuur. Martin et al. stelden wel mutaties in BRCA1 bij conventioneel sarcoom vast. Welke rol er voor BRCA1 mutaties weggelegd is, blijft echter onduidelijk. Dit tweede geval van osteosarcoom in een BRCA1 mutatie positieve familie, is wel een nieuwe ondersteuning
36
van de stelling dat defectief BRCA1 mogelijk betrokken is bij de genese van osteosarcoom. Belangrijk is ook te noteren dat de dragerschapsstatus bij deze patiënt niet gekend is en deze opvatting dus met voorbehoud wordt geformuleerd. Verder onderzoek lijkt echter wel aangewezen.
Figuur 12: stamboom familie 9.
o Familie 10 De mutatie die in deze familie segregeert is een BRCA2 mutatie. Bij deze case betreft de pediatrische maligniteit een hersentumor die een mannelijke lid ontwikkelde op 6-jarige leeftijd. De dragerschapsstatus van deze patiënt is niet gekend. De familiale mutatie werd aangetroffen bij een paternele nicht. Deze mutatie kan de novo ontstaan zijn, maar een andere paternele nicht ontwikkelde bilateraal borstcarcinoom op 34- en 40-jarige leeftijd wat weinig waarschijnlijk te wijten is aan een sporadische vorm van borstkanker. Dit zou impliceren dat de paternele nichten de mutatie overgeërfd hebben via hun paternele of maternele lijn. Via de paternele lijn kan de mutatie doorgegeven zijn en fenotypisch niet tot uiting gekomen zijn, gezien het 2 mannen betreft. Dan is de dragerschapskans voor het mannelijk lid met de pediatrische tumor 25%. Een argument hiervoor vormt ook de paternele oom die prostaatcarcinoom op 56-jarige leeftijd ontwikkelde. In de maternele lijn, valt alleen een borstcarcinoom bij de moeder en tante op respectievelijk 70 en 78 jaar te weerhouden. Deze leeftijden kunnen wijzen op het feit dat het eerder om een sporadische vorm gaat, dan wel kaderend in het hereditair borst- en ovariumcarcinoom syndroom. Dit is een extra argument om aan te nemen dat de mutatie via paternele lijn overgeërfd is. 37
De hersentumor die in deze familie aangetroffen is, kan eventueel een medulloblastoom zijn. Dit type tumor is in de literatuur reeds in verband gebracht met biallelische BRCA2 mutaties, enerzijds binnen het specifieke subtype Fanconi anemie, FANCD1, en anderzijds in nietsyndromale vorm. Gegeven het feit dat de familiale mutatie hier van het type BRCA2 is, kan het zijn dat deze heterozygote mutatie een belangrijke etiologische rol gespeeld heeft bij de genese van deze tumor. Aangezien het tumortype niet verder gedefinieerd werd en de dragerschapsstatus niet gekend is, zijn dit hypothetische uitspraken maar ze kunnen wel een onderwerp voor verder onderzoek zijn.
Figuur 13: stamboom familie 10.
o Familie 11 De familiale mutatie in deze case betreft een BRCA1 mutatie. Een vrouwelijk lid van deze familie ontwikkelde op 5-jarige leeftijd een cerebellaire tumor. De dragerschapsstatus in deze patiënte is niet gekend. De mutatie werd aangetroffen bij een maternele tante en nicht. Deze tante ontwikkelde een ovariumcarcinoom op 49-jarige leeftijd. De aangetroffen mutatie kan een de novo mutatie betreffen, maar gezien zowel de moeder van de patiënte en een andere maternele tante borstcarcinoom ontwikkelde op respectievelijk 57- en 40-jarige leeftijd, lijkt deze hypothese minder realistisch. Dit impliceert dat de mutatie via de maternele grootmoeder overgeërfd is en bedraagt de dragerschapskans bij de patiënte 25%. Daarbij ontwikkelde de maternele grootmoeder ook borstcarcinoom, ze overleed op 98-jarige leeftijd. Opmerkelijk aan deze familie is dat de zus van de patiënte negatief is voor de familiale BRCA1 mutatie maar er kon wel een onbekende variant van BRCA2 vastgesteld worden. De verandering betrof de volgende: c.5529C>A. Bij deze zus werd op 44-jarige leeftijd borstcarcinoom
38
aangetroffen. Deze onbekende variant kan zowel via maternele als paternele zijde zijn overgeërfd. Zoals eerder vermeld zijn homozygote BRCA2 mutaties in de literatuur reeds geassocieerd met een verhoogd risico op medulloblastoom ontwikkeling. De cerebellaire tumor in deze familie is niet verder gedefinieerd, maar kan een medulloblastoom zijn. Gegeven de onbekende variant van BRCA2 die geïdentificeerd is bij de zus van deze patiënte, is dit een interessant geval. De mogelijkheid bestaat dat deze variant ook aanwezig was bij de patiënte en dus een etiologische rol gespeeld heeft bij het ontwikkelen van deze cerebellaire tumor. Het lijkt opportuun de rol van deze variant in tumorgenese te onderzoeken.
Figuur 14: stamboom familie 11.
39
Tabel 2: Cases van pediatrische maligniteiten in families met BRCA1/2 mutaties.
Nr.
Geslacht
Leeftijd bij
Maligniteit
Mutatie
diagnose
3
Verwantschap met mutatie drager
1
V
3 jaar
ALL
BRCA1 c.2359dup
Zelf positief.
2
V
15 maand
ALL
BRCA2 c.4399delG
1e graad
3
V
d. 21 jaar3
Leukemie
BRCA1 c.4327C>T
2e graad
4
V
17 jaar
Leukemie
BRCA2 c.7235G>A
2e graad
5
V
18 jaar
Hodgkin lymfoom
BRCA1 c.4510delCTAinsTT
Zelf positief
6
V
d. 17 jaar
“ Bot/spier tumor”
BRCA1 c.212+3A>G
1e graad
7
M
6 jaar
Niertumor
BRCA1 c.3780G>T
3e graad
8
V
18 jaar
Osteosarcoom
BRCA2 c.6275_6276del
2e graad
9
M
18 jaar
Osteosarcoom
BRCA1 c.2359dup
4e graad
10
M
6 jaar
Hersentumor
BRCA2 c.1389_1390del
4e graad
11
V
5 jaar
Cerebellaire tumor
BRCA2 c.5529A>C
4e graad
d: leeftijd bij diagnose niet gekend, alleen sterftedatum
40
E. Discussie. BRCA1 en 2 zijn belangrijke factoren in het DNA-herstel en behoud van genoom integriteit, zoals hiervoor duidelijk aangetoond is. Ze fungeren in het homologe recombinatie proces als belangrijke effectormoleculen en indien de cel defectief is voor deze proteïnes, functioneert deze cascade inadequaat, wat risico op DNA-instabiliteit en mutaties met zich meebrengt. Daarnaast is ook aangetoond dat ze een functie hebben in de Fanconi anemie/BRCA pathway, waar homozygote mutaties in BRCA2 een specifiek subtype van Fanconi anemie veroorzaken. De interesse voor mutaties in deze genen als oorzaak van pediatrische maligniteiten is gegroeid uit de specifieke functie van BRCA1 en -2 samen met het feit dat ze samenwerken met eiwitten die in gemuteerde vorm reeds geassocieerd zijn met het veroorzaken van pediatrische tumoren. Niet alleen werken ze in het homologe recombinatie proces samen met ATM en TP53, in de literatuur zijn er herhaaldelijke linken gelegd tussen BRCA en deze moleculen. BRCA1 heeft ook een functie in de cel checkpunten en daar blijkt ook een nauwe samenwerking met ATM en TP53 plaats te vinden. De bewezen rol van BRCA2 mutaties in de etiologie van Fanconi anemie was ook een van de belangrijke impulsen voor het stellen van deze onderzoeksvraag. Het reeds bekend zijn van verschillende genetische syndromen die met kanker op kinderleeftijd gepaard gaan, ondersteunt de plausibiliteit van de studievraag. Het onderzoek naar heterozygote germinale mutaties in BRCA1 en -2 als oorzaak van pediatrische neoplasieën, is heel beperkt. Er zijn slechts twee studies, waarvan de resultaten tegenstrijdig zijn, voor handen die deze topic onderzocht hebben. Magnusson et al. rapporteren een significant verhoogd aantal pediatrische tumoren in families met BRCA2 mutaties, terwijl Brooks et al. niet in de mogelijkheid waren enig significant resultaat aan te tonen. (44, 45) Dit kan te wijten zijn aan het feit dat Magnusson et al. de controlegroep uit de populatie en een studie over non-Hodgkin lymfoom haalt, waar Brooks et al. een controlegroep gehaald heeft uit dezelfde borstkankerkliniek. Bij deze laatste studie heeft dit voor gevolg dat een tot nu toe onbekende genetische factor die mogelijk de oorzaak is van de sterke tumorprevalentie in de families, aanwezig kan zijn in zowel de case- als controlegroep. Dit zou de verschillen tussen beide groepen kunnen uitvlakken met een niet significant resultaat als gevolg. Wat ook een verschilpunt is tussen beide studies, is het aantal families die onderzocht werden. Magnussen et al. maakte gebruik van een veel kleinere steekproef, 141 families met BRCA mutaties, waar Brooks et al. beschikte over 379 families. De omvang van de controlegroepen verschilt ook sterk, ze bedragen respectievelijk 854 en 426. Deze
41
studieopzetten zijn enigszins conflicterend met de resultaten gezien met een grotere steekproef een verschil sneller significant wordt en zo Brooks et al. meer in de mogelijkheid waren om een significant verschil aan te tonen.(58) Redenen waarom de resultaten van deze studies onbetrouwbaar kunnen zijn, zijn de volgende. Beide studies haalden hun studiepopulatie uit settingen waar de families reeds met een kanker geconfronteerd waren en meestal in hogere frequentie dan de algemene populatie. Zoals hierboven aangegeven kan hierdoor niet uitgesloten worden dat er in deze families een tot nu toe nog niet geïdentificeerde factor aanwezig is, die algemeen predisponeert tot tumoren, op verschillende leeftijden. Wat het effect op het resultaat van Brooks et al. is reeds eerder vermeld. Dit zou echter ook kunnen impliceren dat het significant resultaat dat Magnussen et al. vonden in de BRCA2 mutatie groep, te wijten is aan die onbekende factor, dus niet aan de BRCA2 mutatie, die wel aanwezig is in de cases groep maar niet in de controle groep die uit de populatie werd gehaald. Dit wordt ontkracht door het feit dat een niet significant resultaat werd gevonden in de BRCA1 mutatie positieve groep. Door het significant resultaat gevonden in de algemene BRCA mutatiedragende groep, zou men in dezelfde redenering kunnen aannemen dat die onbekende factor ook aanwezig is in de BRCA1 mutatie positieve families, maar dit wordt tegengesproken door het niet significant resultaat. Volgende reden waarom de resultaten van deze studies ter discussie kunnen staan is het feit dat geen van de kinderen getest werden op mutatiedragerschap. Er werd aangenomen dat de kinderen drager werden vanuit de verwantschap met een volwassene die gekend drager is van een mutatie. Daardoor kan niet met uitsluiting worden gesteld dat de tumoren die de kinderen ontwikkelden het gevolg zijn van de BRCA mutatie. In de studie van Brooks et al., bleek dat er een groot deel van de families waar pediatrische tumoren voorkwamen, zowel in de cases als de controle groep, ook voldeden aan de Birch criteria van Li-Fraumeni like. Geen enkele familie had TP53 mutatie testing ondergaan, maar de mutatie kan dus wel degelijk aanwezig zijn en de causale factor zijn voor de aangetroffen pediatrische tumoren. In de studie van Magnussen et al werd dit niet nagegaan, dus hierover kunnen geen uitspraken gedaan worden. (44, 45) Behalve de vorige 2 studies is er enkel nog een case-studie over 1 persoon van een homozygote tweeling die een B-cel lymfoblastische leukemie ontwikkelde op 4-jarige leeftijd waarbij een hypermethylatie van de promotorsite van BRCA1 aangetroffen werd. Deze studie op zich is niet voldoende om conclusief te zijn over de associatie BRCA1 mutaties en pediatrische tumoren, maar geeft een aanduiding dat een verband plausibel is. (46)
42
Verder is er geen literatuur te vinden over de associatie van heterozygote mutaties in BRCA en kanker op kinderleeftijd. Dit is een punt waar zeker verdere aandacht en onderzoek aan besteed moet worden en in dat opzicht vormt deze studie een belangrijke aanduiding voor het belang van onderzoek naar dit onderwerp en de plausibiliteit van de onderzoeksvraag. Het verband tussen homozygote BRCA2 mutaties en pediatrische maligniteiten is reeds meer onderzocht. Dit gebeurde enerzijds in het kader van de functie van BRCA2 tijdens neuronale ontwikkeling en anderzijds in het kader van in Fanconi anemie. Uit dat onderzoek blijkt duidelijk dat biallelische BRCA2 mutaties een oorzaak zijn van kanker op kinderleeftijd. Dit feit, gelinkt aan de bevinding in de studie van Magnussen et al., zou een belangrijke indicatie kunnen zijn dat BRCA2 meer dan BRCA1 mutaties een rol hebben in het veroorzaken van tumoren op vroege leeftijd. Verklaring hiervoor kan zijn dat BRCA2 essentiëler dan BRCA1 is voor het rekruteren van RAD51 ter hoogte van de breuk. Tegenstrijdig hieraan is dan het feit dat BRCA1 ook functies heeft hoger in de HR-cascade en in de celcyclus checkpunten waardoor de molecule belangrijker zou kunnen geacht worden in het behoud van integriteit van het genoom. Deze tegenstrijdigheden moeten nog verder geëxploreerd worden. Het feit dat homozygote BRCA2 mutaties duidelijk gelinkt zijn aan pediatrische tumoren en heterozygote slechts in 1 studie, kan volgende verklaring hebben. Door het feit dat beide allelen van BRCA2 aangetast zijn, zal de concentratie werkend BRCA2 zeer laag, quasi onbestaande zijn, wat niet het geval is bij uniallelische aantasting. Daardoor zijn de cellen nog gevoeliger voor iedere DNA-schade veroorzakende factor en kan reeds een lage blootstelling grote gevolgen met zich meebrengen. Dit kan resulteren in snellere tumorvormingen dus op jongere leeftijd. De hypothese kan geformuleerd worden dat bij heterozygote mutatiedragers, de cellen minder gevoelig zijn voor genotoxische insulten en het dus langer duurt vooraleer er voldoende accumulatie van DNA-schade in de cel aanwezig is om maligne transformatie te induceren. Dit resulteert dan niet in tumorvorming op kinderleeftijd, maar later in het leven. Deze hypothese heeft nood aan wetenschappelijke onderbouwing en kan onderwerp vormen van verder onderzoek. Het stamboomonderzoek dat in deze studie uitgevoerd werd, is suggestief voor een link tussen BRCA mutaties en predispositie voor pediatrische tumoren, maar het exploratieve en beschrijvende karakter van deze studie laat niet toe het risico te kwantificeren. De gevonden frequentie van pediatrische tumoren in de BRCA mutatie positieve families van 6,9% (11/159), die in schril contrast staat met de gevonden 0,7% (1/148) in de populatie gebaseerde controlepopulatie van Magnussen et al., lijkt een duidelijke aanduiding in de richting van een 43
verband tussen de mutaties en het ontstaan van kanker op kinderleeftijd. De gecorrigeerde frequentie van 5,5% wijkt ook sterk af van de frequentie van die van de controlepopulatie, wat de plausibiliteit van deze link nog meer onderschrijft. De gevallen van individuele tumoren konden telkens als belangrijke aanvullingen gezien worden bij de reeds gekende gegevens uit de literatuur. De link leukemie - BRCA mutaties in de literatuur is al uitgebreid gekend, maar de 4 cases die in deze studie werden aangetroffen, brengen de suggestie met zich mee dat het reeds gekende verhoogd risico op hematologische maligniteiten bij BRCA mutatie dragers zich al manifesteert op kinderleeftijd. Het Hodgkin lymfoom, dat bij een BRCA1 mutatiedraagster werd aangetroffen, ondersteunt deze stelling opnieuw. Ook brengen deze cases belangrijke nieuwe topics voor onderzoek naar voor. Enerzijds de rol van BRCA1 in de genese van osteosarcoom en anderzijds de rol van heterozygote BRCA2 mutaties bij hersentumoren, lijken onderwerpen die verder moeten geëxploreerd worden. Er moet voorzichtig met deze bevindingen worden omgesprongen. Er zijn namelijk een aantal factoren die deze resultaten kunnen biassen. Eerst en vooral dient opgemerkt te worden dat de studiepopulatie en het aangetroffen aantal pediatrische tumoren klein is. Resultaten kunnen hierdoor al moeilijk veralgemeend worden. Daarbij komt dat de leeftijdsgrens, die gehanteerd werd voor het identificeren van pediatrische tumoren, tot 21 jaar gaat. Deze hoge grens kan resulteren in een groter aantal geïncludeerde tumoren en kan de resultaten biassen. Bovendien was de basis van dit onderzoek de papieren stambomen die bijgevoegd zitten in de dossiers van BRCA mutatie positieve families. Bij het opstellen van deze stambomen kan er recall bias optreden, met name dat de patiënten zich niet alle gevallen van pediatrische tumoren in de familie herinneren. Dit zou kunnen leiden tot een onderschatting van het aantal pediatrische neoplasieën in de studiepopulatie. Daarbij komt dat de nieuwe gegevens omtrent dragerschap voor de familiale mutatie en tumorontwikkeling bij familieleden op stambomen niet regelmatig aangevuld worden, wat opnieuw risico inhoudt voor onderschatting van pediatrische tumoren. In dit onderzoek zit opnieuw de mogelijkheid van een tot nu toe onbekende factor die predisponeert tot tumorontwikkeling op verschillende leeftijden. De families die geïdentificeerd werden als BRCA mutatiedragers zijn op eigen initiatief naar het genetisch centrum in het UZ Gent gestapt. Dit deden zij ofwel na doorverwijzing door een arts die een genetische oorzaak vermoedde van het veelvuldig voorkomen van bepaalde tumoren in de familie, ofwel deden zij dit op eigen initiatief wegens hetzelfde vermoeden. Iedere familie heeft dus een tumorfrequentie die afwijkend is van die van een familie in de 44
algemene populatie. Zoals eerder gesteld, kan een tot nu toe onbekende factor voor deze hoge tumorpenetrantie instaan en dus ook voor de pediatrische tumoren in deze families. Er zou dan onterecht aangenomen worden dat BRCA hiervoor verantwoordelijk is. Daarbij komt dan ook dat in deze studie slechts 2 van de kinderen met kanker getest zijn op BRCA mutaties en dat bij de overige kinderen er dragerschap werd aangenomen, gebaseerd op verwantschap met een geïdentificeerde drager. Dit vormt één van de belangrijke beperkingen van deze studie. Dit was ook het probleem bij de reeds uitgevoerde studies. Algemeen kan dus gesteld worden dat het onderzoek naar de link heterozygote BRCA mutaties en pediatrische tumoren nog zeer beperkt is en dat de reeds gevonden resultaten tegenstrijdig zijn. De literatuurgegevens, samen met de gegevens uit de stamboomstudie suggereren echter wel dat deze link sterk plausibel is. Om conclusieve resultaten hieromtrent te bekomen, zou volgende studieopzet kunnen gehanteerd worden. De studiepopulatie zou moeten bestaan uit kinderen die maligniteiten hebben ontwikkeld waarbij er mutaties in BRCA genen zouden moeten worden opgespoord. Dit sluit de bias van een ongeïdentificeerde factor die verantwoordelijk is voor verhoogde tumorpenetrantie in families uit. Zo kan de bekomen prevalentie vergeleken worden met de algemene prevalentie van de mutatie in de populatie. Probleem bij deze aanpak blijft dat in het huidig beleid testing aan kinderen niet word aangeboden, omdat het principe van vrije keuze bij hen niet is gewaarborgd. Een oplossing hiervoor zou een retrospectieve aanpak kunnen zijn, waarbij specimen van de pediatrische maligniteiten wordt bewaard tot patiënten meerderjarig zijn en hen dan mutatie screening aanbieden. Uit deze studie kan besloten worden dat de associatie BRCA mutaties en predispositie tot pediatrische maligniteiten zeer plausibel is. Volgend uit de beschrijvende en explorerende studieopzet, kan het risico echter niet gekwantificeerd worden. Gezien de andere bestaande studies ook niet conclusief konden zijn hieromtrent, dient verdere exploratie van deze link te gebeuren en voor dit toekomstig onderzoek kan deze scriptie een goede basis vormen.
45
F. Referentielijst. 1. Kavanagh J, Redmond K, Schettino G, Prise K. DSB Repair - A radiation perspective. Antioxidants & redox signaling. 2013 Jan 11. PubMed PMID: 23311752. 2. Dianov GL, Hubscher U. Mammalian Base Excision Repair: the Forgotten Archangel. Nucleic acids research. 2013 Feb 13. PubMed PMID: 23408852. 3. Smeenk G, van Attikum H. The Chromatin Response to DNA Breaks: Leaving a Mark on Genome Integrity. Annual review of biochemistry. 2013 Feb 14. PubMed PMID: 23414304. 4. Brandsma I, Gent DC. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome integrity. 2012;3(1):9. PubMed PMID: 23181949. Pubmed Central PMCID: 3557175. 5. Gonfloni S. Targeting DNA damage response: Threshold, chromatin landscape and beyond. Pharmacology & therapeutics. 2013 Jan 4. PubMed PMID: 23291058. 6. Friedberg EC. DNA damage and repair. Nature. 2003 Jan 23;421(6921):436-40. PubMed PMID: 12540918. Epub 2003/01/24. eng. 7. Kim H, D'Andrea AD. Regulation of DNA cross-link repair by the Fanconi anemia/BRCA pathway. Genes & development. 2012 Jul 1;26(13):1393-408. PubMed PMID: 22751496. Pubmed Central PMCID: 3403008. 8. Conde-Perezprina JC, Leon-Galvan MA, Konigsberg M. DNA mismatch repair system: repercussions in cellular homeostasis and relationship with aging. Oxidative medicine and cellular longevity. 2012;2012:728430. PubMed PMID: 23213348. Pubmed Central PMCID: 3504481. 9. Nouspikel T. DNA repair in mammalian cells : Nucleotide excision repair: variations on versatility. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 2009 Mar;66(6):994-1009. PubMed PMID: 19153657. 10. Barker CA, Powell SN. Enhancing radiotherapy through a greater understanding of homologous recombination. Seminars in radiation oncology. 2010 Oct;20(4):267-73 e3. PubMed PMID: 20832019. 11. Cerbinskaite A, Mukhopadhyay A, Plummer ER, Curtin NJ, Edmondson RJ. Defective homologous recombination in human cancers. Cancer treatment reviews. 2012 Apr;38(2):89-100. PubMed PMID: 21715099. Epub 2011/07/01. 12. Roy R, Chun J, Powell SN. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature reviews Cancer. 2012 Jan;12(1):68-78. PubMed PMID: 22193408. Epub 2011/12/24. 13. Maloisel L, Fabre F, Gangloff S. DNA polymerase delta is preferentially recruited during homologous recombination to promote heteroduplex DNA extension. Molecular and cellular biology. 2008 Feb;28(4):137382. PubMed PMID: 18086882. Pubmed Central PMCID: 2258756. 14. Ciccia A, Elledge SJ. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 2010 Oct 22;40(2):179-204. PubMed PMID: 20965415. Pubmed Central PMCID: 2988877. 15. Moldovan GL, D'Andrea AD. How the fanconi anemia pathway guards the genome. Annual review of genetics. 2009;43:223-49. PubMed PMID: 19686080. Pubmed Central PMCID: 2830711. 16. Soulier J. Fanconi anemia. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology American Society of Hematology Education Program. 2011;2011:492-7. PubMed PMID: 22160080. Epub 2011/12/14. eng. 17. Huang M, D'Andrea AD. A new nuclease member of the FAN club. Nature structural & molecular biology. 2010 Aug;17(8):926-8. PubMed PMID: 20683477. Pubmed Central PMCID: 2945811. 18. Wu J, Lu LY, Yu X. The role of BRCA1 in DNA damage response. Protein & cell. 2010 Feb;1(2):11723. PubMed PMID: 21203981. Pubmed Central PMCID: 3078634. Epub 2011/01/05. 19. van der Groep P, van der Wall E, van Diest PJ. Pathology of hereditary breast cancer. Cellular oncology. 2011 Apr;34(2):71-88. PubMed PMID: 21336636. Pubmed Central PMCID: 3063560. Epub 2011/02/22. 20. Pakakasama S, Tomlinson GE. Genetic predisposition and screening in pediatric cancer. Pediatric clinics of North America. 2002 Dec;49(6):1393-413. PubMed PMID: 12580371. Epub 2003/02/13. eng. 21. Strahm B, Malkin D. Hereditary cancer predisposition in children: genetic basis and clinical implications. International journal of cancer Journal international du cancer. 2006 Nov 1;119(9):2001-6. PubMed PMID: 16642469. 22. Field M, Shanley S, Kirk J. Inherited cancer susceptibility syndromes in paediatric practice. Journal of paediatrics and child health. 2007 Apr;43(4):219-29. PubMed PMID: 17444822. 23. Koren-Michowitz M, Friedman E, Gershoni-Baruch R, Brok-Simoni F, Patael Y, Rechavi G, et al. Coinheritance of BRCA1 and BRCA2 mutations with Fanconi anemia and Bloom syndrome mutations in Ashkenazi Jewish population: possible role in risk modification for cancer development. American journal of hematology. 2005 Mar;78(3):203-6. PubMed PMID: 15726604. 24. Palmero EI, Achatz MI, Ashton-Prolla P, Olivier M, Hainaut P. Tumor protein 53 mutations and inherited cancer: beyond Li-Fraumeni syndrome. Current opinion in oncology. 2010 Jan;22(1):64-9. PubMed PMID: 19952748. Epub 2009/12/03.
46
25. Pinto EM, Ribeiro RC, Figueiredo BC, Zambetti GP. TP53-Associated Pediatric Malignancies. Genes & cancer. 2011 Apr;2(4):485-90. PubMed PMID: 21779516. Pubmed Central PMCID: 3135643. Epub 2011/07/23. 26. Li FP, Fraumeni JF, Jr., Mulvihill JJ, Blattner WA, Dreyfus MG, Tucker MA, et al. A cancer family syndrome in twenty-four kindreds. Cancer research. 1988 Sep 15;48(18):5358-62. PubMed PMID: 3409256. Epub 1988/09/15. eng. 27. Malkin D. Li-fraumeni syndrome. Genes & cancer. 2011 Apr;2(4):475-84. PubMed PMID: 21779515. Pubmed Central PMCID: 3135649. Epub 2011/07/23. 28. Varley JM. Germline TP53 mutations and Li-Fraumeni syndrome. Human mutation. 2003 Mar;21(3):313-20. PubMed PMID: 12619118. Epub 2003/03/06. 29. Linger RJ, Kruk PA. BRCA1 16 years later: risk-associated BRCA1 mutations and their functional implications. The FEBS journal. 2010 Aug;277(15):3086-96. PubMed PMID: 20608970. Epub 2010/07/09. 30. Verhagen MM, Last JI, Hogervorst FB, Smeets DF, Roeleveld N, Verheijen F, et al. Presence of ATM protein and residual kinase activity correlates with the phenotype in ataxia-telangiectasia: a genotype-phenotype study. Human mutation. 2012 Mar;33(3):561-71. PubMed PMID: 22213089. Epub 2012/01/04. 31. Ahmed M, Rahman N. ATM and breast cancer susceptibility. Oncogene. 2006 Sep 25;25(43):5906-11. PubMed PMID: 16998505. Epub 2006/09/26. 32. Gumy-Pause F, Wacker P, Maillet P, Betts DR, Sappino AP. ATM alterations in childhood nonHodgkin lymphoma. Cancer genetics and cytogenetics. 2006 Apr 15;166(2):101-11. PubMed PMID: 16631465. Epub 2006/04/25. 33. Mavrou A, Tsangaris GT, Roma E, Kolialexi A. The ATM gene and ataxia telangiectasia. Anticancer research. 2008 Jan-Feb;28(1B):401-5. PubMed PMID: 18383876. Epub 2008/04/04. eng. 34. Taylor AM, Byrd PJ. Molecular pathology of ataxia telangiectasia. Journal of clinical pathology. 2005 Oct;58(10):1009-15. PubMed PMID: 16189143. Pubmed Central PMCID: 1770730. Epub 2005/09/29. 35. Reiman A, Srinivasan V, Barone G, Last JI, Wootton LL, Davies EG, et al. Lymphoid tumours and breast cancer in ataxia telangiectasia; substantial protective effect of residual ATM kinase activity against childhood tumours. British journal of cancer. 2011 Aug 9;105(4):586-91. PubMed PMID: 21792198. Pubmed Central PMCID: 3170966. Epub 2011/07/28. 36. Liberzon E, Avigad S, Stark B, Zilberstein J, Freedman L, Gorfine M, et al. Germ-line ATM gene alterations are associated with susceptibility to sporadic T-cell acute lymphoblastic leukemia in children. Genes, chromosomes & cancer. 2004 Feb;39(2):161-6. PubMed PMID: 14695997. Epub 2003/12/30. 37. Liberzon E, Avigad S, Yaniv I, Stark B, Avrahami G, Goshen Y, et al. Molecular variants of the ATM gene in Hodgkin's disease in children. British journal of cancer. 2004 Jan 26;90(2):522-5. PubMed PMID: 14735203. Pubmed Central PMCID: 2409549. Epub 2004/01/22. 38. Lin SY, Rai R, Li K, Xu ZX, Elledge SJ. BRIT1/MCPH1 is a DNA damage responsive protein that regulates the Brca1-Chk1 pathway, implicating checkpoint dysfunction in microcephaly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005 Oct 18;102(42):15105-9. PubMed PMID: 16217032. Pubmed Central PMCID: 1257745. Epub 2005/10/12. 39. Hirsch B, Shimamura A, Moreau L, Baldinger S, Hag-alshiekh M, Bostrom B, et al. Association of biallelic BRCA2/FANCD1 mutations with spontaneous chromosomal instability and solid tumors of childhood. Blood. 2004 Apr 1;103(7):2554-9. PubMed PMID: 14670928. Epub 2003/12/13. 40. Myers K, Davies SM, Harris RE, Spunt SL, Smolarek T, Zimmerman S, et al. The clinical phenotype of children with Fanconi anemia caused by biallelic FANCD1/BRCA2 mutations. Pediatric blood & cancer. 2012 Mar;58(3):462-5. PubMed PMID: 21548014. Epub 2011/05/07. eng. 41. Zdzienicka MZ, Arwert F. Breast cancer and Fanconi anemia: what are the connections? Trends in molecular medicine. 2002 Oct;8(10):458-60. PubMed PMID: 12383764. Epub 2002/10/18. eng. 42. Reid S, Schindler D, Hanenberg H, Barker K, Hanks S, Kalb R, et al. Biallelic mutations in PALB2 cause Fanconi anemia subtype FA-N and predispose to childhood cancer. Nature genetics. 2007 Feb;39(2):162-4. PubMed PMID: 17200671. Epub 2007/01/04. 43. Tischkowitz M, Xia B. PALB2/FANCN: recombining cancer and Fanconi anemia. Cancer research. 2010 Oct 1;70(19):7353-9. PubMed PMID: 20858716. Pubmed Central PMCID: 2948578. Epub 2010/09/23. 44. Brooks GA, Stopfer JE, Erlichman J, Davidson R, Nathanson KL, Domchek SM. Childhood cancer in families with and without BRCA1 or BRCA2 mutations ascertained at a high-risk breast cancer clinic. Cancer biology & therapy. 2006 Sep;5(9):1098-102. PubMed PMID: 16931905. Epub 2006/08/26. eng. 45. Magnusson S, Borg A, Kristoffersson U, Nilbert M, Wiebe T, Olsson H. Higher occurrence of childhood cancer in families with germline mutations in BRCA2, MMR and CDKN2A genes. Familial cancer. 2008;7(4):331-7. PubMed PMID: 18481196. 46. Galetzka D, Hansmann T, El Hajj N, Weis E, Irmscher B, Ludwig M, et al. Monozygotic twins discordant for constitutive BRCA1 promoter methylation, childhood cancer and secondary cancer. Epigenetics :
47
official journal of the DNA Methylation Society. 2012 Jan 1;7(1):47-54. PubMed PMID: 22207351. Pubmed Central PMCID: 3329502. 47. Frappart PO, McKinnon PJ. BRCA2 function and the central nervous system. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2007 Oct 15;6(20):2453-7. PubMed PMID: 17786054. Epub 2007/09/06. eng. 48. Frappart PO, Lee Y, Lamont J, McKinnon PJ. BRCA2 is required for neurogenesis and suppression of medulloblastoma. The EMBO journal. 2007 Jun 6;26(11):2732-42. PubMed PMID: 17476307. Pubmed Central PMCID: PMC1888666. Epub 2007/05/04. eng. 49. Bayrakli F, Akgun B, Soylemez B, Kaplan M, Gurelik M. Variation in the BRCA2 gene in a child with medulloblastoma and a family history of breast cancer. Journal of neurosurgery Pediatrics. 2011 Nov;8(5):476-8. PubMed PMID: 22044372. Epub 2011/11/03. 50. Reid S, Renwick A, Seal S, Baskcomb L, Barfoot R, Jayatilake H, et al. Biallelic BRCA2 mutations are associated with multiple malignancies in childhood including familial Wilms tumour. Journal of medical genetics. 2005 Feb;42(2):147-51. PubMed PMID: 15689453. Pubmed Central PMCID: 1735989. 51. Wagner JE, Tolar J, Levran O, Scholl T, Deffenbaugh A, Satagopan J, et al. Germline mutations in BRCA2: shared genetic susceptibility to breast cancer, early onset leukemia, and Fanconi anemia. Blood. 2004 Apr 15;103(8):3226-9. PubMed PMID: 15070707. Epub 2004/04/09. eng. 52. Offit K, Levran O, Mullaney B, Mah K, Nafa K, Batish SD, et al. Shared Genetic Susceptibility to Breast Cancer, Brain Tumors, and Fanconi Anemia. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 2003;95(20):1548-51. 53. Friedenson B. BRCA1 and BRCA2 pathways and the risk of cancers other than breast or ovarian. MedGenMed : Medscape general medicine. 2005;7(2):60. PubMed PMID: 16369438. Pubmed Central PMCID: PMC1681605. Epub 2005/12/22. eng. 54. Whittemore AS, Gong G, John EM, McGuire V, Li FP, Ostrow KL, et al. Prevalence of BRCA1 mutation carriers among U.S. non-Hispanic Whites. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 2004 Dec;13(12):2078-83. PubMed PMID: 15598764. Epub 2004/12/16. eng. 55. Group ABCS. Prevalence and penetrance of BRCA1 and BRCA2 mutations in a population-based series of breast cancer cases. Anglian Breast Cancer Study Group. British journal of cancer. 2000 Nov;83(10):1301-8. PubMed PMID: 11044354. Pubmed Central PMCID: PMC2408797. Epub 2000/10/25. eng. 56. Friedenson B. The BRCA1/2 pathway prevents hematologic cancers in addition to breast and ovarian cancers. BMC cancer. 2007;7:152. PubMed PMID: 17683622. Pubmed Central PMCID: 1959234. Epub 2007/08/09. 57. Martin JW, Squire JA, Zielenska M. The genetics of osteosarcoma. Sarcoma. 2012;2012:627254. PubMed PMID: 22685381. Pubmed Central PMCID: 3364016. 58. De Moor G, Van Maele G. Inleiding tot biomedische statistiek. Leuven: Acco; 2008. 331 p.
48
G. Bijlagen. Berekeningswijze gecorrigeerde frequentie: Aangetoond dragerschap = 1 Dragerschapskans 50% = 0,5 Dragerschapskans 25% = 0,25 Legende stambomen:
49
