Academiejaar 2013-2014
WORDEN BRCA1- EN BRCA2-MUTATIEDRAGERS GEKENMERKT DOOR EEN VERHOOGDE IN VITRO STRALINGSGEVOELIGHEID?
Valerie TAELMAN Pauwelijn VERHOESTRAETE
Promotor: Prof. Dr. A. Vral Co-Promotor: Prof. Dr. K. Claes Begeleidster: J. Depuydt
Masterproef voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE
Academiejaar 2013-2014
WORDEN BRCA1- EN BRCA2-MUTATIEDRAGERS GEKENMERKT DOOR EEN VERHOOGDE IN VITRO STRALINGSGEVOELIGHEID?
Valerie TAELMAN Pauwelijn VERHOESTRAETE
Promotor: Prof. Dr. A. Vral Co-Promotor: Prof. Dr. K. Claes Begeleidster: J. Depuydt
Masterproef voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE
1. Toelating tot bruikleen
II
2. Voorwoord Twee jaar geleden kozen we vol overtuiging voor het onderwerp van deze thesis. We wilden graag meewerken aan een experimenteel onderzoek in de hoop enigszins bij te dragen tot de verdere ontwikkeling van de geneeskunde. Hoewel slechts deel van een groter geheel, zijn we zeer tevreden dat we deel mochten uitmaken van dit onderzoek en zijn we ervan overtuigd dat de kennis die uit dit onderzoek voortvloeit, op lange termijn belangrijke implicaties kan hebben op het screeningsbeleid voor borstkanker bij BRCA-mutatiedragers. Uiteraard had deze thesis niet tot stand kunnen komen zonder de medewerking en steun van verschillende personen. Graag willen we hen dan ook oprecht bedanken. Op de eerste plaats wensen we onze promotor, Professor Dr. Anne Vral, te bedanken voor de begeleiding bij het tot stand brengen van deze thesis. Professor Vral gaf ons het nodige theoretisch inzicht in de materie, wees ons in de juiste richting en deed een grondig nazicht van onze thesis zowel wat inhoud als vorm betreft. In het bijzonder willen we ook onze begeleidster Julie Depuydt bedanken voor alle hulp die zij ons geboden heeft. Gedurende de gehele periode waarin we werkten aan deze thesis was Julie steeds beschikbaar om ons bij te staan met advies, praktische tips, uitleg en feedback. Zij leerde ons geduldig de nodige laboratoriumtechnieken aan en gaf begeleiding bij de uitvoering ervan. Zowel voor de literatuurstudie als de statistische analyses kregen we nuttige tips en ondersteuning van haar. Tevens gaat onze dank uit naar Professor Dr. Kathleen Claes gezien zij ons geïntroduceerd heeft in de wereld van de DNA mutatie-analyse en ons de nodige inzichten heeft bijgebracht in die materie. Ook haar naleeswerk stellen we ten zeerste op prijs. Vervolgens willen we Annelot Baert bedanken voor het toelichten en het demonstreren van de lymfocyten invriezing en de BrdU-kleuring. Daarnaast gaat onze dank uit naar Leen van het labo, voor de praktische tips en de aangename gesprekken tijdens de uurtjes die we in het labo doorbrachten. Dr. Pieter De Visschere wensen we ook te bedanken. Hij gaf ons een blik achter de schermen bij de mammografie-screening en verschafte ons informatie over de screeningsprocedures. Ten slotte willen we ook uitgebreid onze familie en vrienden bedanken, niet alleen voor het nalezen van deze thesis maar bovenal voor alle morele steun die wij als een continuüm ervaren hebben gedurende onze gehele studentenperiode.
Van harte bedankt, Valerie en Pauwelijn
III
3. Inhoudstabel 1.
Toelating tot bruikleen ...................................................................................................... II
2.
Voorwoord ....................................................................................................................... III
3.
Inhoudstabel ..................................................................................................................... IV
4.
Abstract .............................................................................................................................. 1
5.
Inleiding ............................................................................................................................. 3
5.1. Borstkanker en de BRCA-genen .......................................................................................... 3 5.1.1. Epidemiologie .................................................................................................................. 3 5.1.2. Genetische achtergrond van borstkanker ......................................................................... 4 5.1.2.1. BRCA-genen .................................................................................................................. 5 5.1.2.2. Criteria voor opsporing van genetische defecten .......................................................... 5 5.1.2.3. Genetisch onderzoek naar een BRCA-mutatie .............................................................. 6 5.1.3. Borstkankerscreening ....................................................................................................... 7 5.1.3.1. Algemeen ...................................................................................................................... 7 5.1.3.2. Mammografie ................................................................................................................ 8 5.1.3.3. MRI ............................................................................................................................. 10 5.1.3.4. Echografie ................................................................................................................... 11 5.1.3.5. Screeningsrichtlijnen bij BRCA-mutatiedragers .......................................................... 12 5.1.4. Ioniserende straling ........................................................................................................ 13 5.1.4.1. Ioniserende straling en schade ..................................................................................... 13 5.1.4.2. Interactie met weefsels en biologische effecten .......................................................... 13 5.1.5. Dubbelstrengsbreuken .................................................................................................... 13 5.1.5.1. Detectie en signalisatie van dubbelstrengsbreuken ..................................................... 15 5.1.5.2. Herstel van dubbelstrengsbreuken .............................................................................. 17 5.1.5.3. BRCA1 en BRCA2 ....................................................................................................... 18 5.1.5.4. Dubbelstrengsbreuken (DSB) en kanker ..................................................................... 20 IV
5.1.6. Micronucleustest ............................................................................................................ 21 5.1.7. ATM als proof of concept. .............................................................................................. 24 6.
Doelstelling ...................................................................................................................... 26
7.
Materialen en Methoden ................................................................................................... 27
7.1. Groepen ............................................................................................................................. 27 7.2. Methode ............................................................................................................................. 27 7.2.1. In cultuur brengen van de stalen .................................................................................... 27 7.2.2. Bestraling ....................................................................................................................... 27 7.2.3. Toevoeging cytochalasine B (CytoB), cafeïne en Bromodeoxyuridine (BrdU) ............ 28 7.2.4. Fixatie en slides maken .................................................................................................. 28 7.2.4.1. Eerste en tweede fixatie............................................................................................... 28 7.2.4.2. Slides maken ............................................................................................................... 29 7.2.5. Metafer 4, inscannen en interpreteren ............................................................................ 29 7.2.6. Statistiek ......................................................................................................................... 30 8.
Resultaten ......................................................................................................................... 31
8.1. Overzicht donoren ............................................................................................................. 31 8.2. Werkwijze ......................................................................................................................... 31 8.3. Controlegroep .................................................................................................................... 32 8.4. Radiosensitiviteit bij BRCA1- en BRCA2-mutatiedragers ................................................ 33 8.5. Resultaten als individu ...................................................................................................... 37 8.5.1. De BRCA1-mutatiedragers ............................................................................................. 37 8.5.2. De BRCA2-mutatiedragers ............................................................................................. 39 9.
Discussie........................................................................................................................... 42
9.1. Controlegroep .................................................................................................................... 43 9.2. Radiosensitiviteit bij BRCA1- en BRCA2-mutatiedragers ................................................ 45 9.3. Resultaten als individu ...................................................................................................... 47 V
9.3.1. De BRCA1-mutatiedragers ............................................................................................. 47 9.3.2. De BRCA2-mutatiedragers ............................................................................................. 51 9.4. Toekomstperspectieven ..................................................................................................... 53 10.
Conclusie ...................................................................................................................... 54
11.
Bibliografie................................................................................................................... 55
12.
Bijlagen ........................................................................................................................ 58
12.1. Bijlage 1 .......................................................................................................................... 58 12.2. Bijlage 2 .......................................................................................................................... 60
VI
4. Abstract Eén op de negen vrouwen krijgt ooit te horen dat ze borstkanker heeft. Hoewel er een dalende trend in de mortaliteit merkbaar is, zal nog steeds 26% van deze vrouwen aan de ziekte overlijden. Zo’n 20% van de vrouwen met een borstcarcinoom vertoont een duidelijke familiale belasting. Meestal is er hierbij sprake van een multifactoriële wijze van overerving die niet eenduidig vast te leggen valt. In bepaalde families echter is een mutatie in één gen verantwoordelijk voor het ontstaan van borstkanker. Veelal gaat het om een mutatie in het BRCA1- of BRCA2-gen. Dit zijn beide tumorsupressorgenen die autosomaal dominant overgeërfd worden. Ten gevolge van de hoge penetrantie van de BRCA-genen is een mutatie in een van deze twee genen verantwoordelijk voor een sterk verhoogd risico zowel op borstals op ovariumkanker.
Vrouwen met een BRCA-mutatie kunnen op een opmerkelijk jonge leeftijd geconfronteerd worden met borstkanker. Bij een vrouw met een BRCA-mutatie is een intensieve screening om het half jaar dan ook aangewezen en dit doorgaans vanaf de leeftijd van 25 jaar. Momenteel wordt een variabele combinatie van een MRI en een echografie op jonge leeftijd aangeboden, later aangevuld met mammografieën. De exacte invulling van deze screening van BRCA-mutatiedragers loopt sterk uiteen in de verschillende ziekenhuizen.
Screening door middel van mammografieën is zeker niet zonder risico, gelet op het gebruik van ioniserende stralen. Gezien bij mutatiedragers reeds op relatief jonge leeftijd gestart wordt met het nemen van mammografieën, worden zij blootgesteld aan een veel grotere cumulatieve stralingsdosis dan vrouwen zonder de mutatie, want populatiescreening d.m.v. mammografie in de regel enkel gebeurt bij vrouwen tussen 50 en 69 jaar en dit slechts tweejaarlijks.
Ioniserende stralen kunnen in het DNA van de blootgestelde weefsels dubbelstrengsbreuken (DSB) veroorzaken. Het herstel van DSB gebeurt d.m.v. twee herstelpathways, namelijk nonhomologous end joining (NHEJ) en homologe recombinatie (HR). HR resulteert normaliter in een volledig herstel van het DNA, dit in tegenstelling tot NHEJ dat meer vatbaar is voor foutief herstel. Zowel het BRCA1- als het BRCA2-eiwit spelen een rol in HR. Bovendien functioneert het BRCA1-eiwit als een activator van het G2/M checkpoint. Dit checkpoint 1
heeft tot doel de cel voldoende tijd te geven zodat herstel kan plaatsvinden. Een mutatie in één van de BRCA-genen kan bijgevolg verantwoordelijk zijn voor een sterk verminderde herstelcapaciteit na blootstelling aan ioniserende straling.
Dit onderzoek richt zich dan ook op het aantonen van een al dan niet verhoogde stralingsgevoeligheid bij BRCA1-en BRCA2-mutatiedragers. Er wordt gebruik gemaakt van de G2-micronucleustest, ontwikkeld door de onderzoeksgroep van Prof. Dr. A. Vral (Universiteit Gent). De stralingsgevoeligheid wordt geëvalueerd en geïnterpreteerd d.m.v. vier parameters, namelijk
het
aantal
micronuclei
per
1000
binucleairen
en
de
individuele
radiosensitiviteitsparameter (IRP), dit telkens na bestraling met 2 Gray en 4 Gray.
De bekomen resultaten wijzen op een verhoogde stralingsgevoeligheid bij BRCA1mutatiedragers. Er wordt een significant verschil t.o.v. de controlegroep vastgesteld en dit systematisch bij elke gebruikte parameter. De BRCA2-mutatiedragers vertonen een verhoogde stralingsgevoeligheid die echter niet significant is.
Ook de individuele stralingsgevoeligheid werd onderzocht. Opmerkelijk is de vaststelling van een aanzienlijke variatie in resultaten binnen elke mutatiegroep. Het verdient aanbeveling een graderingssysteem op te stellen om te kunnen bepalen wie al dan niet radiosensitief wordt bevonden. In de toekomst zal de onderzoeksgroep verder onderzoek verrichten om de specifieke mutaties te linken aan de mate van radiosensitiviteit.
De conclusies uit dit onderzoek kunnen resulteren in een aanpassing van de guidelines omtrent het screenen van BRCA-mutatiedragers naar borstkanker. Deze guidelines dienen gericht te zijn op het zoveel mogelijk vermijden van mammografieën en andere technische onderzoeken met een stralingsbelasting. Idealiter dienen deze guidelines vervolgens als (inter)nationale standaard consequent in elk ziekenhuis toegepast te worden.
2
5. Inleiding 5.1. Borstkanker en de BRCA-genen 5.1.1. Epidemiologie In 2011 werden in België 10.490 vrouwen gediagnosticeerd met borstkanker. Deze groep patiënten vormt 33% van het totaal aantal vrouwelijke kankerpatiënten. Borstkanker is de meest voorkomende kanker bij vrouwen, met een cumulatief lifetime risico van ongeveer 1/9. (1)
Er is een dalende trend merkbaar betreffende de sterfte aan borstkanker. Dit wordt weerspiegeld in de gestandaardiseerde mortaliteitcijfers: men ziet elke 2 jaar een daling van de gestandaardiseerde sterfte met 1 per 100.000 vrouwen. In figuur 1 kan men deze dalende trend van de mortalteit in België en Vlaanderen bemerken. Men kan stellen dat 26% van de vrouwen die door borstkanker getroffen zijn uiteindelijk aan deze ziekte zal overlijden. (2)
Figuur 1: Borstkanker incidentie en mortaliteit in Vlaanderen (1999-2009) en België (2004-2009 ). (3)
3
5.1.2. Genetische achtergrond van borstkanker Reeds lang is bekend dat er in het ontstaansmechanisme van zo’n 20% van de borstcarcinomata een genetische component meespeelt die niet eenduidig vast te leggen valt. Wanneer er een eerstegraads verwant gediagnosticeerd werd met borstkanker, heeft de vrouw drie maal meer risico op de ontwikkeling van borstkanker. Wanneer er meer dan één eerstegraads verwant de ziekte heeft (gehad), vergroot het risico met een factor 10. Meestal is er bij een positieve familiale anamnese sprake van een multifactoriële wijze van overerving. Het is echter ook mogelijk dat een defect in slechts één gen verantwoordelijk is voor de familiale belasting. Men spreekt dan over Mendeliaanse overerving van een gendefect, verantwoordelijk voor het ontstaan van borstkanker. De overerving kan recessief of autosomaal dominant zijn. (4)
De penetrantie van deze mutaties kan variabel zijn. Hoog-penetrerende genen hebben een sterk verhoogd risico op het ontwikkelen van borstkanker, namelijk zo'n 5 tot 20 keer groter. Zo kennen we onder andere de BRCA1- en BRCA2-genen en het tp53-gen. Een mutatie in het tp53-gen is de causale factor in het ontstaan van het Li-Fraumeni syndroom. (5)
Recent heeft men nog een hoog penetrerend gen ontdekt, het RAD51C-gen. Een mutatie in dit gen is naar schatting aanwezig bij 1.5 - 4% van alle families met een verhoogd risico op zowel borst- als ovariumkanker. Het RAD51C-eiwit speelt immers ook als tumorsuppressor een centrale rol in het herstel van DNA. Verder onderzoek is nodig, zowel naar de mate van penetrantie van dit gen als naar mogelijke screening in de toekomst bij BRCA-negatieve families met sterk vermoeden van genetische belasting. (5)
Deze genen met sterk verhoogd risico zijn verantwoordelijk voor naar schatting de helft van de familiale gevallen van borst- en ovariumkanker. Men spreekt van het HBOC of het Hereditair Borst- en Ovariumcarcinoom syndroom. Ook andere genen kunnen aanleiding geven tot dit syndroom. Zo'n 50% van de familiale gevallen van borstkankers kan niet door een BRCA-mutatie verklaard worden. Men vermoedt bij deze families één of meerdere mutaties in andere DNA-herstelgenen met een wisselende penetrantie, zoals o.a. ATM, CHEK2 en PALB2. Figuur 2 toont de wisselende penetrantie van de verschillende risicogenen. Zo brengt een mutatie in een matig penetrerend gen, zoals o.a. ATM, een 1.5 tot 5 keer verhoogd risico op borstkanker met zich mee. (5)
4
Figuur 2: Het effect van borstcarcinoomgerelateerde genen op het borstkankerrisico. (5)
5.1.2.1. BRCA-genen Er zijn twee gekende BRCA-genen: het BRCA1-gen op chromosoom 17q21 en het BRCA2gen op chromosoom 13q12.3. BRCA1 en BRCA2 zijn tumorsuppressorgenen die autosomaal dominant overgeërfd worden. (5, 6)
BRCA-mutaties spelen een majeure rol in naar schatting 5% van alle borstkankers op populatieniveau. Patiënten met een BRCA-mutatie hebben een lifetime risico op borstkanker van zo’n 60-70% en lifetime risico op ovariumkanker van naar schatting zo’n 40%. Naast borst- en ovariumkanker is er ook een significant verhoogd risico op prostaatkanker, coloncarcinoom, pancreascarcinoom en een algemeen verhoogd risico op de ontwikkeling van een maligniteit. (5, 6)
5.1.2.2. Criteria voor opsporing van genetische defecten Wanneer men anamnestisch vermoedt dat er een verhoogd familiaal risico op borst- en ovariumkanker is, kan men overgaan tot genetisch onderzoek. Dit dient altijd uit vrije wil te gebeuren en mag door de patiënt nooit als een verplichting aanzien worden. Standaard wordt in de meeste ziekenhuizen enkel gescreend op BRCA1- en BRCA2-mutaties. Er zijn verschillende criteria om te bepalen bij wie al dan niet genetisch onderzoek wordt aangeboden, waaronder de Manchester Score, die weergegeven wordt in tabel 1. (7)
De procedure begint met een genetisch consult, waarbij een arts-geneticus en een psycholoog aanwezig zijn. In eerste instantie wordt een stamboom opgemaakt aan de hand van de familiale anamnese. Vervolgens wordt er met behulp van de Manchester Score bepaald of er 5
familiaal een voldoende hoog a priori risico is om te screenen. Bij dit model wordt een grenswaarde van 15 gebruikt. Indien de totale waarde van de Manchester Score voor een familie 15 of meer is, wordt overgegaan tot een voorstel voor genetische screening. Een waarde van 15 stemt overeen met een a priori risico van 10% bij benadering. (7, 8)
Tabel 1: Manchester scoring systeem (8)
Kanker Vrouw, borstkanker Vrouw, borstkanker Vrouw, borstkanker Vrouw, borstkanker Vrouw, borstkanker Man, borstkanker Man, borstkanker Eierstokkanker Eierstokkanker Pancreaskanker Prostaatkanker Prostaatkanker
Leeftijd van diagnose < 30 30-39 40-49 50-59 > 59 < 60 > 59 < 60 > 59 > 59 < 60 > 59
Manchester score 11 8 6 4 2 13 10 13 10 1 2 1
Wanneer de totale Manchester Score minder dan 15 is, kan men echter beslissen om alsnog over te gaan tot genetische screening. Dit kan bijvoorbeeld als er bij een vrouw jonger dan 50 jaar borstkanker wordt vastgesteld, die bilateraal blijkt te zijn en/of triple negatief (oestrogeen-, progesteron- en HER2-receptor negatief). (9) Een overzicht van de meest recente guidelines, gebruikt in België, kan men terugvinden via de website www.beshg.be. Deze dateren van maart 2013 en worden weergegeven in bijlage 1.
5.1.2.3. Genetisch onderzoek naar een BRCA-mutatie De standaard diagnostische genetische screening voor borstkankergenen omvat momenteel enkel BRCA1 en BRCA2. Andere genen worden voorlopig uitsluitend in experimentele context gescreend, omdat men onvoldoende gegevens heeft over de penetrantie en de pathogeniciteit van deze genen. (7)
Wanneer de patiënt voldoet aan de criteria voor screening naar een BRCA-mutatie en hiermee instemt, neemt men een staaltje bloed af in combinatie met een staaltje cellen van het wangslijmvlies of een tweede bloedstaal als controlestaal. Men analyseert dus altijd twee stalen om menselijke en technische fouten uit te sluiten. (7)
6
Genetische screening naar een BRCA-mutatie gebeurt klassiek met de High-resolution melting analysis en de Sanger methode. (7)
Indien mogelijk test men eerst een familielid dat de ziekte reeds ontwikkeld heeft. Deze patiënt wordt de proband genoemd. Op het DNA van de proband voert men een uitgebreide screening van de twee BRCA-genen uit, met als doel het identificeren van een pathogene mutatie die specifiek is voor die familie. Dit is een zeer duur en tijdrovend onderzoek. Het resultaat kan al snel zo'n zes maand op zich laten wachten. Per uitgevoerde test krijgt het ziekenhuis een terugbetaling van €1350. De patiënt zelf betaalt slechts €8.68. (7)
Indien een mutatie is vastgesteld, kan men vervolgens de andere familieleden screenen indien zij dit wensen. Men onderzoekt in dit geval enkel of men de reeds gedocumenteerde familiale mutatie kan terugvinden bij
de andere familieleden. Dit is een zeer gericht
screeningsonderzoek, waarbij men dan ook veel sneller (na 4 tot 6 weken) kan meedelen of er al dan niet eenzelfde mutatie teruggevonden werd. De kostprijs voor het ziekenhuis bedraagt €150 per analyse. Ook deze screening wordt telkens uitgevoerd op twee verschillende stalen (normaliter een bloedstaal en een wangslijmvliesstaal) om menselijke en technische fouten uit te sluiten. (7)
Het resultaat van de DNA-analyse wordt door een ervaren arts (geneticus) medegedeeld, in samenwerking met een psycholoog. (7)
5.1.3. Borstkankerscreening 5.1.3.1. Algemeen In Vlaanderen wordt screening naar borstkanker standaard om de 2 jaar aangeboden bij vrouwen tussen 50 en 69 jaar d.m.v. een bilaterale mammografie en dit met volledige terugbetaling. Uit gegevens van het centrum voor kankeropsporing blijkt dat slechts 51.2% van het vooropgestelde aantal vrouwen gebruik maakt van deze screening. (10) Dit kan mogelijks verklaard worden door het ongemak gepaard gaande met het nemen van mammografieën, door de schrik om via deze schadelijke ioniserende stralen borstkanker uit te lokken of door een vals gevoel van veiligheid wegens een normaal uitzicht van de borst of een normaal klinisch onderzoek. (11)
7
Europese observaties tonen aan dat de mortaliteit door borstkanker daalt met 38-48% bij vrouwen die gescreend worden, globaal is dit echter slechts 25-31%, wegens het aantal nietparticipanten. (12)
Anderzijds schat men dat de overdiagnostisering bij de mammografische screening in de grootte-orde ligt van 1 tot 10%. (13)
Er dient een duidelijk onderscheid te worden gemaakt tussen borstkankerscreening in de algemene populatie en screening in een populatie met verhoogd risico op borstkanker. Hoogrisico vrouwen (eerste- of tweedegraads verwanten van een vrouw met borstkanker ontwikkeld op jonge leeftijd of dragers van een mutatie in één van de BRCA-genen) ontwikkelen frequenter en vaak op jongere leeftijd borstkanker. Deze populatie dient dan ook intensiever gescreend te worden. Concrete richtlijnen op dit vlak ontbreken echter zodat de richtlijnen i.v.m. screening kunnen variëren tussen de verschillende ziekenhuizen. (11)
5.1.3.2. Mammografie Mammografie is een beeldvormingstechniek waarbij men met behulp van laag energetische X-stralen (digitale) foto’s maakt van de borsten van de vrouw. Het doel van de screeningsmammografie bestaat erin vroegtijdig pre-maligne of maligne letsels op te sporen, om zo de overlevingskans gunstig te beïnvloeden. Mammografie kan immers reeds letsels opsporen die kleiner zijn dan 10 mm en die nog niet palpabel zijn. (14)
Het is dus belangrijk te beseffen dat mammografie een hulpmiddel is om vroegtijdig borstkanker op te sporen in een nog niet klinisch detecteerbare status. Sommige borstcarcinomata kunnen echter aanleiding geven tot een vals-negatief resultaat (10 à 20%). De gouden standaard voor screening blijft om deze reden de combinatie van klinisch onderzoek en mammografie. (14)
In Vlaanderen krijgt elke vrouw tussen 50 en 69 jaar een tweejaarlijkse uitnodiging om deel te nemen aan de screeningsmammografie. Deze bestaat uit een bilaterale mediolateraal oblique en cranio-caudale opname. (14)
De effectieve stralingsdosis van een mammografie bedraagt gemiddeld 0.56 millisievert (mSv). De Sievert is de grootheid voor de kwantificatie van de stralingsbelasting voor de 8
patiënt. Als er echter gebruik gemaakt wordt van digitale mammografie, vermindert de dosis met zo’n 22% en bekomt men een effectieve dosis die gemiddeld 0.44 mSv bedraagt . Bij wijze van vergelijking: deze dosis komt bij benadering overeen met twee maanden natuurlijke achtergrondstraling. De dosis is relatief lager bij een adequate compressie van de borst zoals wordt weergegeven in figuur 3. Deze figuur geeft eveneens de gemiddelde glandulaire dosis weer, dewelke in totaal ongeveer 4 mGy bedraagt. Bij elke opname is er immers een stralingsdosis van 2 mGy en van elke borst wordt een two-view opname gemaakt. (15)
Figuur 3: Gemiddelde glandulaire dosis per view in functie van de dikte van een gecomprimeerde borst. (15)
Het risico op de inductie van een mammacarcinoom door de ioniserende straling van mammografie is sterk leeftijdsafhankelijk. In figuur 4 worden de leeftijdsspecifieke incidentie en mortaliteit van stralingsgeïnduceerde borstkanker besproken wanneer men een two-view screeningsmammografie neemt van beide borsten. (15)
Men kan zien dat de incidentie en de mortaliteit van een stralingsgeïnduceerde borstkanker veel groter is op jonge leeftijd en zeer klein wordt op oudere leeftijd. Dit verklaart de gunstige detectie-inductie ratio (DIR) van mammografie op oudere leeftijd. Hier zal men dus eerder (pre-)cancereuze laesies opsporen dan induceren. Dit in tegenstelling tot detectie op jonge leeftijd, waar de DIR ongunstig is. (15)
9
Figuur 4: Lifetime toeschrijfbare risico's (LARs) van de incidentie en de mortaliteit van borstkanker (15).
Men heeft aangetoond dat voor alle vrouwen boven de 50 jaar de voordelen van mammografie-screening duidelijk
opwegen tegen de nadelen, namelijk stralings-
geïnduceerde DNA-schade. De screening van vrouwen met een sterk verhoogd risico op borstkanker dient echter al veel vroeger te starten. Bij deze vrouwen wordt onder de 30 jaar niet aangeraden een mammografie uit te voeren. Dit omwille van verschillende redenen: te dens borstklierweefsel, vaak zeer agressieve tumoren op jonge leeftijd, grote cumulatieve stralingsdosis en hoge gevoeligheid voor schade door straling. Hier wordt meestal geopteerd voor een combinatie van screenings-MRI, eventueel aangevuld door ultrasonografie. Zodra men de leeftijd van 30 à 35 jaar bereikt, ziet men bij deze vrouwen wel een gunstige batenrisico verhouding wanneer screeningsmammografie wordt toegepast. (16)
5.1.3.3. MRI MRI, Magnetic-Resonance Imaging, is een beeldvormingstechniek gebruikt in de screening naar borstkanker bij hoog-risico patiënten. Hiernaast wordt MRI onder andere ook gebruikt in de evaluatie van multifocaliteit of bilateraliteit bij borstcarcinomata, de evaluatie van de respons op chemotherapie, verdere uitwerking van een onduidelijke laesie op mammografie en echografie enzovoort. (11)
Kenmerkend voor de MRI is de hoge sensitiviteit. Hiertegenover staat de lage specificiteit. Gezien MRI geen gebruik maakt van ioniserende straling, zijn er geen schadelijke gevolgen aan verbonden en kan deze techniek als veilig beschouwd worden. (11)
10
Zowel mammografie als echografie kunnen vals-negatieve resultaten geven, dit voornamelijk bij te dens borstklierweefsel of in geval van lobulair carcinoma in situ. Meer sensitiviteit kan bekomen worden door gebruik te maken van een MRI met contrast. Zo spoort men een toegenomen angiogenese op die typisch optreedt bij een maligne proces. Meer specifiek kijkt men of er een toegenomen densiteit is van kleine bloedvaatjes en of er veranderingen kunnen gezien worden in de vasculaire structuur. (11)
Nadelen van het gebruik van MRI in deze indicatie zijn onder andere een lage specificiteit, het feit dat deze techniek niet bij alle vrouwen toepasbaar is, niet altijd beschikbaar is en een lage sensitiviteit in de detectie van een ductaal carcinoma in situ. Als alternatief kan gebruik gemaakt worden van een digitale mammografie met contrast. (11)
Algemeen kan men stellen dat het toevoegen van MRI aan de screening, op welke leeftijd dan ook, een bewezen nut heeft bij vrouwen met een hoog-risico voornamelijk door het verhogen van de sensitiviteit. (16)
5.1.3.4. Echografie Echografie is een techniek die gebruik maakt van ultrasone geluidsgolven. Ook deze techniek kan dus als volkomen veilig beschouwd worden. Echografie van de borsten wordt echter weinig gebruikt als screeningsonderzoek, dit wegens een te lage specificiteit. Mogelijke indicaties zijn wel: evaluatie van een palpabele afwijking, aanvulling op mammografisch onderzoek wanneer het beeld inconclusief is en differentiatie tussen cysteuze en vaste letsels. Bij jonge hoog-risico patiënten kan echografische screening toegepast worden afwisselend met MRI. (11)
11
5.1.3.5. Screeningsrichtlijnen bij BRCA-mutatiedragers De richtlijnen in het kader van screening variëren sterk tussen verschillende ziekenhuizen, voornamelijk op vlak van leeftijd waarop het screeningsonderzoek best gestart wordt.
In het UZ Gent biedt men standaard de
volgende screeningsonderzoeken aan voor
BRCA-mutatiedragers (7): −
voor vrouwen met een BRCA1- of BRCA2-mutatie: om vroegtijdig een borstcarcinoom op te sporen wordt zelfonderzoek, klinisch onderzoek door een arts en mammografie of een combinatie van MRI en echografie aangeraden naargelang de situatie. Een vroegtijdig ovariumcarcinoom opsporen gebeurt d.m.v. klinisch-gynaecologisch onderzoek, transvaginale echografie en een CA.125 bepaling. Een ileocoloscopie wordt aangeraden om een colorectaal carcinoom op te sporen.
−
voor mannelijke BRCA1-mutatiedragers: ileocoloscopie, rectaal toucher, echografie van de prostaat en PSA-bepaling. In kader van het verhoogde risico op borst- en pancreascarcinoom wordt voornamelijk aangeraden alert te zijn voor mogelijke alarmsymptomen.
−
voor mannen met een BRCA2-mutatie gelden dezelfde screeningsmogelijkheden als voor mannen met een BRCA1-mutatie. Mannen met een BRCA2-mutatie hebben echter bovendien een verhoogd risico op een melanoom, daarom wordt jaarlijks een inspectie van de volledige huid aangeraden.
Een volledig overzicht van de aanbevolen screeningsonderzoeken naar borstkanker in het UZ Gent wordt voor zowel niet-risicopatiënen als risicopatiënten weergegeven in bijlage 2.
Naast deze screeningsonderzoeken biedt men de mogelijkheid aan vrouwen met een BRCA1of BRCA2-mutatie om preventieve chirurgie toe te passen, waardoor de levenslange intensieve screening gereduceerd wordt. Men kan dan opteren voor een preventieve bilaterale mastectomie en/of bilaterale salpingo-ovariëctomie. Een bilaterale mastectomie reduceert het lifetime borstcarcinoomrisico tot zo’n 5%, wat minder is dan het populatierisico. Voornamelijk de salpingo-ovariëctomie wordt sterk aangeraden van zodra de kinderwens voltooid is. Zo wordt het risico op een ovariumcarcinoom praktisch onbestaande, bovendien vermindert deze ingreep het risico op een borstcarcinoom. (17)
12
5.1.4. Ioniserende straling 5.1.4.1. Ioniserende straling en schade Ioniserende stralen (X-stralen en γ-stralen) zijn electromagnetische golven die zich in de ruimte verplaatsen aan de lichtsnelheid. Een radiografisch beeld, zoals bijvoorbeeld een klassieke mammografie, wordt bekomen doordat zilver in de fotografische film geïoniseerd wordt. Het DNA in de weefsels waardoor de straling passeert, wordt echter ook geïoniseerd. Dit proces is verantwoordelijk voor de schadelijke gevolgen die kunnen gepaard gaan met radiologische beeldvorming. (18)
5.1.4.2. Interactie met weefsels en biologische effecten Wanneer een X-straal in contact komt met weefsel van de patiënt, wordt de energie van dit foton volledig overgedragen op een orbitaal elektron van een atoom van dat weefsel. Dit elektron, het foto-elektron, verlaat het atoom. Zo wordt het atoom geïoniseerd. Het fotoelektron is een direct ioniserend deeltje dat verantwoordelijk is voor de biologische effecten van straling in de weefsels van de patiënt. (18)
Als een stralenbundel, gebruikt voor beeldvorming, door de weefsels gaat, ontstaan er aldus een groot aantal foto-elektronen die zich ongestructureerd verplaatsen door de weefsels. Deze foto-elektronen kunnen onder andere aanleiding geven tot enkelstrengige en dubbelstrengige breuken in het DNA. Een enkelstrengige breuk is het gevolg van een geïsoleerde ionisatie en kan vlot enzymatisch hersteld worden. Als er echter een cluster van ionisaties ontstaat of als de ionisatiedichtheid vergroot, kunnen er dubbelstrengige DNA-breuken ontstaan. Herstel van dubbelstrengige breuken kan plaatsvinden aan de hand van homologe recombinatie (HR) of non-homologous end joining (NHEJ). Het herstel van dubbelstrengsbreuken verloopt echter veel complexer en met een kleinere slaagkans in vergelijking met het herstel van enkelstrengsbreuken. Als er geen volledig herstel wordt bekomen, resulteert dit in permanente DNA-schade. Derhalve zijn DNA dubbelstrengsbreuken de meest toxische DNA-laesies. (18)
5.1.5. Dubbelstrengsbreuken Dubbelstrengsbreuken (DSB) kunnen geïnduceerd worden zowel door endogene als exogene factoren, zoals weergegeven in figuur 5. Er zijn in het menselijk lichaam meerdere belangrijke endogene mechanismen gekend die leiden tot DSB. Zo is een cel die een meiotische deling ondergaat, geprogrammeerd om DSB te induceren. Het herstel van deze DSB zorgt ervoor dat de gameten allelische variaties vertonen, verschillend van het ‘ouderlijke’ DNA. 13
Het induceren van dubbelstrengsbreuken is bovendien essentieel bij het proces van de V-(D)J-recombinatie in voorlopercellen van B- en T-lymfocyten, dit om voldoende immunologische diversificatie te verkrijgen. Ook bij het herstel van replicatiefouten, inherent aan de deling van cellen, kunnen DSB en het herstel ervan een belangrijke rol spelen. Als exogene factoren in het ontstaan van DSB, weerhoudt men onder andere ioniserende straling, chemotherapeutica en chemicaliën. (19)
Figuur 5: Mechanismen van ontstaan van dubbelstrengsbreuken. (19)
Om de integriteit van het DNA zoveel mogelijk te herstellen na een DSB zijn er twee belangrijke pijlers. Enerzijds is er activatie van de pathways die het DNA herstellen, dit via homologe recombinatie of niet-homologe end joining. Anderzijds worden de celcyclus checkpoints geactiveerd. Deze checkpoints bevinden zich tussen G1 en S, intra-S en tussen G2 en M. Via activatie van deze checkpoints wordt de celcyclus tijdelijk een halt toegeroepen, wat tijd geeft voor het herstel van de DNA-schade of het initiëren van apoptose. Het doel van de G1/S en intra-S checkpoints is preventie van replicatie van beschadigd DNA. Het doel van het G2/M checkpoint is preventie van de segregatie van beschadigde chromosomen. (20, 21)
14
Algemeen kunnen de proteïnes die een rol spelen in DNA-herstel bij DSB opgedeeld worden in drie groepen volgens functionaliteit: de sensoren die de schade detecteren, de mediatoren (transducers) die de signaaltransductie verzekeren en zo de nodige herstelproteïnes rekruteren en tenslotte de effectoren die de DNA-schade uiteindelijk zullen herstellen, apoptose induceren of de celcyclus stilleggen, zoals weergegeven in figuur 6. Er is sprake van een grote overlap in functies van verschillende proteïnes en tot op heden is het niet exact geweten hoe divers de functies van de verschillende proteïnes zijn. (22)
Figuur 6: Ontstaan van DSB, organisatie van het herstel en resultaat. (21)
5.1.5.1. Detectie en signalisatie van dubbelstrengsbreuken Alvorens er herstel kan zijn, moet de DNA-schade eerst gedetecteerd worden. Hierbij is het kinase ATM, ataxia telangiectasia mutated, van cruciaal belang. Dit kinase staat aan het begin van de signaalcascade en wordt geactiveerd door een DSB. De manier waarop herkenning van DNA-schade gebeurt door ATM, is nog niet volledig uitgeklaard. Er worden echter wel verschillende hypotheses onderzocht. (20, 22)
ATM en het MRN-complex (Mre11/RAD50/Nbs1) hebben een wisselwerking waarin ze elkaar wederzijds activeren en promoten. Het MRN-complex verhoogt namelijk de kinaseactiviteit van ATM en ATM fosforyleert op zijn beurt Nbs1, een deel van het MRN-complex. Nbs1 bevat twee domeinen die gefosforyleerde proteïnes binden. Zo binden zij proteïnes die reeds gefosforyleerd zijn door ATM en die een functie hebben in de signaaltransductie. (20)
Geactiveerd ATM start de signaaltransductiecascade d.m.v. fosforylatie van verschillende proteïnes, waaronder p53, MDC1, BRCA1, Nbs1 en c-Abl. Ook het ATR, het ATM-related 15
proteïne, is een eiwit dat de herstelpathway kan initiëren. Beide hebben overlappende substraten en fosforyleren deze. Deze gefosforyleerde proteïnesubstraten beïnvloeden elkaar op een complexe wijze zoals weergegeven in figuur 7. (21, 22)
Figuur 7: Schade sensing cascade. (21)
De mediatoren van de herstelpathways hebben als doel de verschillende proteïnes met een functie in het herstel samen te brengen. Verschillende van deze mediatoren zijn proteïnes die een BRCT domein bevatten. Dit is een BRCA1 carboxy terminal repeat domein dat binding met fosfoproteïnes faciliteert. Deze groep omvat onder andere Nbs1, MDC1, p53 en BRCA1. (20, 21)
Nbs1 is dus een deel van het MRN-complex dat een functie heeft zowel in de detectie van schade alsook in het activeren van ATM. Door middel van het BRCT bindt Nbs1 mogelijks met ATM targets nadat deze gefosforyleerd zijn. MDC1 interageert met het RAD51 alsook met ATM. Via de interactie met ATM versterkt MDC1 het schadesignaal, wat leidt tot een meer efficiënte en meer langdurige respons. BRCA1 interageert met RAD51 en BRCA2. Dit wordt verder uitgebreider besproken. (20)
Het p53 werkt als transcriptiefactor. Een gestabiliseerd p53 kan dus een transcriptie induceren. In zijn normale toestand is het p53 niet stabiel omdat het gebonden is aan MDM2, wat een negatieve regulator is van het p53 en die degradatie van p53 in de hand werkt. Eens gefosforyleerd door ATM, CHEK1 of CHEK2, stabiliseert het proteïne omdat er geen binding met MDM2 meer mogelijk is. Het gestabiliseerde proteïne kan dan binden met de nodige 16
target genen die coderen voor die eiwitten die de celcyclus stopzetten en apoptose induceren. (21)
Voorts zijn er ook mediatoren die geen BRCT bevatten, waaronder de proteïne kinasen CHEK1 en CHEK2. Voor hun activatie zijn deze proteïnes afhankelijk van fosforylatie door ATM. Hun functie omvat onder andere stabilisatie van het p53 zoals hierboven beschreven. Bovendien kan CHEK2 BRCA1 fosforyleren en aldus activeren. (21)
Finaal worden verschillende effectoreiwitten geactiveerd en gemobiliseerd naar de plaats van de dubbelstrengsbreuk. Afhankelijk van de grootte van de schade en de fase van de celcyclus waarin de cel zich bevindt, kan er herstel plaatsvinden. Homologe recombinatie en nonhomologous end joining zijn hierbij zeer belangrijke mechanismen. (20)
5.1.5.2. Herstel van dubbelstrengsbreuken 5.1.5.2.1. Homologe recombinatie Homologe recombinatie (HR) is een herstelmechanisme dat enkel voorkomt tijdens de late Sfase en de G2-fase. Het maakt gebruik van de zusterchromatide als substraat om het beschadigde DNA te reconstrueren. Hierdoor is HR minder vatbaar voor fouten dan NHEJ. Figuur 8 geeft HR en NHEJ schematisch weer. (20)
Het herstel vangt aan met de resectie van een streng van 5' naar 3' aan elke kant van de breuk. Deze strengen worden gecoat met RPA, waardoor RAD51 op de strengen geladen kan worden. RAD51 is een recombinase enzym dat RAD51 nucleoproteïne filamenten produceert. Deze filamenten scannen vervolgens de intacte zusterchromatide op een stuk dat homoloog is aan zichzelf. Eens dit gevonden is, invadeert het filament het homologe deel van de zusterchromatide, dat dan als template wordt gebruikt voor de DNA-polymerasen. Deze synthetiseren nieuw DNA compatibel aan de breukplek om deze te herstellen. Vervolgens knippen endonucleasen de Hollidayjuncties los. Dit is een complex gevormd door de 4 bekomen DNA-strengen. Het RAD51 interageert met bepaalde tumorsuppressorproteïnes, waaronder het p53, BRCA1 en BRCA2. De interactie met BRCA2 is direct, deze met BRCA1 indirect, mogelijks zelfs via BRCA2. (20, 21)
17
Figuur 8: homologe recombinatie versus non-homologe end-joining. Aangepast naar Kee et al. (23)
5.1.5.2.2. Non-homologe end joining Een tweede herstelmechanisme voor DNA-schade is de non-homologous end joining (NHEJ), eveneens weergegeven in figuur 8. Dit mechanisme vindt voornamelijk zijn werking in de G1-fase en in de vroege S-fase, gezien er geen zusterchromatide nodig is om het herstel uit te voeren. Aldus is de NHEJ overheersend in de fasen voor de duplicatie van het DNA. (20, 21)
Het herstel van een DSB d.m.v. NHEJ wordt gekenmerkt door veel meer fouten in vergelijking met het herstel via HR. De werking van NHEJ bestaat erin de uiteinden van de DSB aan elkaar te bevestigen d.m.v. een ligase complex. Vanzelfsprekend kunnen hierbij fouten gemaakt worden, zoals deleties. (20)
5.1.5.3. BRCA1 en BRCA2 BRCA1 en BRCA2 zijn beide tumorsuppressorgenen. Een mutatie in deze genen wordt autosomaal dominant overgeërfd, waarbij de homozygote mutatiedragers niet levensvatbaar zijn. Deze twee genen bevatten geen homologie in de coderende regio's, doch ze kunnen een gelijkaardig fenotype vertonen, namelijk het HBOC syndroom, het Hereditair Borst- en Ovariumcarcinoom syndroom. (24) 18
Beide eiwitten hebben een functie in HR. BRCA1 is hoofdzakelijk een mediator in de signaalcascade, BRCA2 een effector. Figuur 9 geeft een schematische weergave van de functies van beide eiwitten in de celcyclus. (22)
Bij HR interageert BRCA1 met het MRN complex en fungeert het als een mediator in de signaalcascade van DNA-schade. Het is essentieel voor de rekrutering van RAD51 naar de DSB, dit via interactie met PALB2 en BRCA2. Voor deze interactie is er eerst fosforylatie nodig van BRCA1 door CHEK2. Het BRCA1-eiwit heeft dus een belangrijke rol in de homologe recombinatie. Over de rol van het eiwit bij NHEJ heerst echter meer controverse. (22)
Naast deze in hoofdzaak mediërende functie in HR, heeft BRCA1 ook een functie in het activeren van checkpoints G1/S, intra-S en G2/M, zoals te zien is in figuur 9. Het mechanisme van de activatie van G1/S begint met fosforylatie van BRCA1 door ATM of ATR. Deze interactie zou op zijn beurt de fosforylatie van p53 faciliteren, waardoor p53 vervolgens de transcriptie induceert van de cycline-dependent kinase inhibitor p21. Zo wordt de celcyclus tijdelijk onderbroken. Het mechanisme van de activatie van de checkpoints intra-S en G2/M is niet exact gekend. (22)
Uit bovenstaande kan worden geconcludeerd dat BRCA1 een brede waaier aan activiteiten heeft in HR en checkpointactivatie, waardoor BRCA1-mutatiedragers meer genomische instabiliteit kunnen vertonen dan BRCA2-mutatiedragers. (22)
BRCA2 heeft, in tegenstelling tot de vele functies van BRCA1, zijn primaire functie in de HR zoals te zien in figuur 9. Het eiwit beïnvloedt namelijk de rekrutering van RAD51 naar de plaats van de DSB. Functioneel zijn er twee belangrijke domeinen in het BRCA2-proteïne. Enerzijds heeft het BRCA2-eiwit een DNA-bindend domein dat een verbinding vormt tussen ssDNA of dsDNA, anderzijds bezit het proteïne een domein bestaande uit 8 BRC repeats die kunnen binden met RAD51. Bij BRCA2-mutatiedragers zien we dus vaker problemen met de rekrutering van RAD51. (22)
19
Figuur 9: Functies van BRCA1 en BRCA2 in de celcyclus. Aangepast naar Foulkes et al. (24)
5.1.5.4. Dubbelstrengsbreuken (DSB) en kanker Het complexe herstelmechanisme van DSB is essentieel om de integriteit van het genoom te bewaren. Indien DSB niet of foutief hersteld worden, kan dit leiden tot chromosomale instabiliteit, gekenmerkt door het voorkomen van chromosoomaberraties (CA), weergegeven in figuur 10. Voorbeelden van CA zijn deleties en inserties van chromosoomfragmenten en reciproke translocaties van chromosoomarmen. Het voorkomen van chromosoomaberraties gaat gepaard met een verhoogd risico op carcinogenese, o.a. door de deletie van tumorsupressorgenen en de activatie van protooncogenen. Een mutatie in een BRCA1- of BRCA2-gen interfereert met het normale herstelproces van DSB, leidend tot een verhoogde incidentie aan chromosoomaberraties en bijgevolg tot een verhoogd kankerrisico. (25)
20
Figuur 10: Chromosoomaberraties. (26)
5.1.5.4.1. In vitro detectie van chromosoomaberraties Chromosoomaberraties kunnen met behulp van verschillende cytogenetische testen opgespoord worden. Deze testen vereisen het gebruik van cellen met delingscapaciteit. Er wordt veelal gebruik gemaakt van lymfocyten, gezien de relatief eenvoudige bemachtiging van een bloedstaal. Klassiek onderzoekt men cellen op het moment van de mitose, waarbij wordt gekeken naar het aantal en het type chromosoomfragmenten als maat voor schade. Een minder arbeidsintensief alternatief is het onderzoeken van cellen in de interfase, zoals gebeurt met de micronucleustest. Scoring van het aantal micronuclei (of chromosoomaberraties) kan dan uitgevoerd worden op automatische of semi-automatische basis. (27)
Het aantal spontane CA of micronuclei (MN) is echter laag. Maar als de te onderzoeken cellen eerst bestraald worden, induceert men een veel groter aantal DSB. Zo kan men een betere inschatting maken van het aantal CA of MN bij een mutatiedrager t.o.v. een controleindividu.
Het
aantal
stralingsgeïnduceerde
CA
of
MN is
een
maat
voor
de
stralingsgevoeligheid van deze individuen en bij uitbreiding voor het kankerrisico. (27)
5.1.6. Micronucleustest Wanneer men de DNA-schade, geïnduceerd door bestraling van een bloedstaal, kwantitatief wil opmeten, kan men gebruik maken van de in vitro micronucleustest. Deze test wordt dus gebruikt om de in vitro chromosomale stralingsgevoeligheid van de lymfocyten na te gaan. (28)
Zoals reeds besproken, kunnen ioniserende stralen DSB veroorzaken. Wanneer deze incorrect hersteld worden en de cel vervolgens gestimuleerd wordt tot deling, kunnen er tijdens de mitose acentrische chromosoomfragmenten ontstaan die niet opgenomen worden door de spoelfiguur. Zo’n fragment vormt dan een kleine kern of een micronucleus. Door toevoeging 21
van Cytochalasine B na de bestraling, wordt de cytokinese gestopt via inhibitie van de polymerisatie van de actinefilamenten. Dit houdt in dat er geen celdeling plaatsvindt, maar enkel kerndeling. Dus alle lymfocyten die na blootstelling éénmaal gedeeld hebben, vertonen twee kernen in hun cytoplasma. Micronuclei worden enkel in deze binucleaire cellen gescoord. Deze vorming van micronuclei in binucleaire cellen wordt schematisch weergegeven in figuur 11. Figuur 12 is een afbeelding van het typische uitzicht van een binucleaire cel met een micronucleus. (28-30)
Figuur 11: Vorming van micronuclei. (31)
Figuur 12: Binucleaire cel, met (rechts) en zonder (links) micronucleus. (Dienst Histologie, UGent)
De klassieke test is de G0-micronucleustest. Deze meet de in vitro stralingsgevoeligheid van lymfocyten aanwezig in een perifeer bloedstaal. Deze bevinden zich in de G0-fase. Bloedstalen worden bestraald en vervolgens in cultuur gebracht. Door toevoeging van Phytohemagglutinine worden de T-lymfocyten aanwezig in de bloedcultuur gestimuleerd tot
22
proliferatie. Na 24u wordt dan Cytochalasine B toegevoegd en na 72u worden de cellen gefixeerd en gekleurd. (30)
Wanneer in de G0-fase DSB worden geïnduceerd, worden deze hersteld door NHEJ. De BRCA-eiwitten spelen echter een veel belangrijkere rol in HR, een herstelmechanisme dat geactiveerd wordt in de late S-fase en de G2-fase. Dit impliceert dat verlies in functionaliteit van HR t.g.v. BRCA-mutaties beter kan geanalyseerd worden met een test waarbij de lymfocyten zich op het moment van bestraling in de late S-fase of G2-fase bevinden. Vandaar dat de onderzoeksgroep van Prof. Dr. A. Vral (Universiteit Gent) een G2micronucleustest ontwikkelde met als doel verhoogde stralingsgevoeligheid van o.a. BRCAmutatiedragers te detecteren. (20, 32)
Gezien bij de G2-micronucleustest de lymfocyten moeten bestraald worden in de S- of G2fase van de celcyclus, verloopt het testprotocol anders dan bij de G0-micronucleustest. Bloedculturen worden opgestart in aanwezigheid van Phytohemagglutinine en pas na 72u worden ze bestraald. Na de bestraling wordt onmiddellijk Cytochalasine B toegevoegd. De fixatie gebeurt na 8u voor een eerste groep stalen en na 16u voor een tweede groep stalen. Het belangrijkste verschil tussen de G0 - en de G2-micronucleustest is dus het tijdstip van de bestraling en de post-bestralingstijd. (30)
Door de uitvoering van
BrdU-kleuringen op de micronucleuspreparaten kon worden
aangetoond dat meer dan 90% van de binucleaire cellen zich na 8h post-bestralingstijd in de G2-fase bevonden. Dit onderzoek werd reeds uitgevoerd door de onderzoeksgroep.
Naast het analyseren van het aantal stralingsgeïnduceerde micronuclei per 1000 binucelairen via de G2-micronucleustest, zal nog een tweede parameter worden gebruikt om stralingsgevoeligheid na te gaan. Bij cellen bestraald in G2 zal het goed functioneren van het G2/M checkpoint, een proces waarin ook BRCA1 betrokken is, worden nagegaan d.m.v. toevoeging van cafeïne aan de bloedcultuur. (30, 33-35)
Een belangrijk effect van cafeïne is dat het de G2/M checkpoint opheft waardoor cellen die bestraald worden in G2 en aldus schade kunnen oplopen in G2, niet worden gestopt in G2/M om hun schade te herstellen. Dit zal resulteren in een verhoogd aantal chromosoomaberraties of micronuclei na deling. 23
Bij gezonde individuen met een goed werkende G2/M checkpoint zal de verhouding van het aantal micronuclei verkregen met cafeïne op het aantal micronuclei verkregen zonder toevoeging van cafeïne groot zijn. Bij individuen met een slecht werkend G2/M checkpoint t.g.v. een mutatie in een gen betrokken in de G2/M checkpoint controle, zal deze verhouding kleiner worden. Bij AT-patiënten die zeer stralingsgevoelig zijn t.g.v. een germinale mutatie in het ATM-gen, zal er bijna geen verschil zijn in aantal micronuclei met of zonder cafeïne aangezien het ATM kinase nodig is voor het activeren van het G2/M checkpoint. (30, 33, 34) Alhoewel het effect van cafeïne in het G2/M checkpoint beschreven wordt, is het exacte werkingsmechanisme nog niet gekend. Ook zou cafeïne inspelen op de andere checkpoints en zou het interfereren met RAD51, waardoor het ook de HR-pathway kan beïnvloeden. (33-36)
5.1.7. ATM als proof of concept. Ataxia telangiëctasia is een zeldzame autosomaal recessieve aandoening, gekenmerkt door een mutatie in het ATM-proteïne (ataxia telangiëctasia mutated proteïne). Het betreft een serine-threonine kinase dat in een groot aantal verschillende weefsels tot uiting komt. De kliniek wordt gekenmerkt door een variabele combinatie van cerebellaire ataxie, oculomotore apraxie, oculocutane telangiëctasieën en immunodeficiëntie. (30, 37)
Reeds lang is bekend dat homozygote en compound heterozygote AT-mutatiedragers gekenmerkt
worden
door
een
verhoogde
stralingsgevoeligheid.
Deze
verhoogde
stralingsgevoeligheid werd meermaals bevestigd via verschillende onderzoeksprotocollen en werd in verband gebracht met een verhoogd kankerrisico, in het bijzonder een verhoogd risico op hematologische maligniteiten. (38-40)
In dit onderzoek wordt gebruik gemaakt van de G2-micronucleustest ter evaluatie van stralingsgevoeligheid van BRCA1- en BRCA2-mutatiedragers. Claes et al., 2013, (30) valideerden deze test reeds in de onderzoeksgroep. Er werd nagegaan of er een verhoogde radiosensitiviteit via de G2-micronucleustest kon vastgesteld worden bij een AT-patiënt, overeenkomstig met de verwachtingen. De variant AT-patiënt fungeerde hierbij als proof of concept voor de G2-micronucleustest.
De onderzochte patiënt is een compound heterozygote variant ataxia telangiëctasie patiënt, met twee pathogene mutaties in het ATM-proteïne: c.8122G>A (p.Asp2708Asn), een missense mutatie en c.8851-1G>T, resulterend in een in frame verlies van 63 nucleotiden. 24
Er werd nog een residuele kinase activiteit gedetecteerd, komende van het p.Asp2708Asn allel. De residuele activiteit van het ATM-proteïne ligt aan de basis van het milder klinisch beeld gezien bij deze patiënt. (30)
Er zijn verschillende mogelijkheden om radiosensitiviteit te definiëren. In dit onderzoek en in de studie van Claes et al., 2013, wordt radiosensitiviteit gedefinieerd naar analogie met het onderzoek van Terzoudi et al., 2009, (33). Een eerste parameter is het aantal micronuclei (MN) per 1000 binucleairen (BN), waarbij een individu als radiosensitief wordt beschouwd wanneer het aantal MN/1000BN tussen μMN/1000BN +1SD < MN/1000BN ≤ μMN/1000BN +2SD ligt. Een individu is sterk radiosensitief indien het aantal MN/1000BN > μMN/1000BN +2SD. Een
tweede
parameter
die
gehanteerd
wordt,
is
de
IRP,
de
individuele
radiosensitiviteitsparameter. Dit is de verhouding van het aantal MN/1000BN na toevoeging van cafeïne ten opzichte van het aantal MN/1000BN zonder toevoeging van cafeïne (IRP= C+/C-). Overeenkomstig wordt een individu als stralingsgevoelig beschouwd indien de IRP tussen μIRP - 2SD ≤ IRP < μIRP - 1SD ligt. Indien de IRP < μIRP -2SD, spreekt men over een sterk radiosensitief individu. (33, 37)
Claes et al., 2013, vergeleken het aantal MN/1000BN, bekomen via de G2-micronucleustest, van gezonde individuen met dat van de variant AT-patiënt en heterozygote familieleden. Dit resultaat wordt weergegeven in figuur 13. Na herhaalde staalafname en analyse werd aangetoond dat het aantal micronuclei van de variant AT-patiënt met een factor 3.98 verhoogd was ten opzichte van gezonde individuen. Bij de G0-micronucleustest werd een factor van 1,8 bekomen. De geobserveerde schade was aldus veel meer uitgesproken via de G2- dan via de G0-micronucleustest. De resultaten bevestigden bijgevolg dat de G2-micronucleustest veel sensitiever is om stralingsgevoeligheid bij deze variant AT-patiënt aan te tonen. De belangrijke functie van ATM in de DSB herstelpathway werd reeds uitvoerig besproken in 5.1. (37)
Ook de IRP werd bestudeerd in Claes et al., 2013, en deze ratio was 1.85. Dit resultaat toonde aan dat de variant AT-patiënt als zeer radiosensitief scoorde via de G2-micronucleustest (namelijk μIRP-2SD=1.86 en aldus is de IRP< μIRP-2SD). Dit wordt weergegeven in figuur 14. (30)
25
Figuur 13 en figuur 14: Weergave van respectievelijk het aantal micronuclei en de IRP van gezonde individuen, de variant AT-patiënt en haar familieleden. (30)
Zowel het aantal MN/1000BN als de IRP toonden een sterk verhoogde radiosensitiviteit bij deze patiënt in de studie van Claes et al., 2013. Deze resultaten zijn conform de resultaten van Pantelias en Terzoudi, 2011, (34) en meerdere andere auteurs, waarbij een verhoogd aantal chromatide breuken werd gezien na bestraling van mitotische cellen van AT-patiënten in de G2-fase. (33, 34, 41-44)
De G2-micronucleustest heeft echter belangrijke voordelen ten opzichte van de analyse van het aantal chromatide breuken in cellen bestraald in de G2-fase. Er kunnen namelijk een groter aantal binucleairen worden geanalyseerd, het maken van slides is eenvoudiger en via de automatische telmethode verloopt het tellen snel en objectief. Tot op heden blijft het echter aangewezen een semi-automatische telling uit te voeren, gebaseerd op de automatische telresultaten. (30)
6. Doelstelling Dit onderzoek heeft tot doel de stralingsgevoeligheid te onderzoeken bij BRCA1- en BRCA2mutatiedragers. Hiervoor wordt er gebruik gemaakt van de G2-micronucleustest. Stralingsgevoeligheid kan gezien worden als een maat voor het kankerrisico en heeft bovendien belangrijke implicaties in het kader van screeningsmammografieën bij deze hoogrisico groepen.
26
7. Materialen en Methoden 7.1. Groepen Dit onderzoek werd goedgekeurd door het ethisch comité van het UZ Gent (registratienummer B670201111641). Indien de mutatiedrager of controlepersoon instemt om te participeren in deze studie, collecteert men een bloedstaal in heparinebuizen. Dit gebeurt in samenwerking met de dienst Medische Genetica van het UZ Gent. In dit onderzoek wordt in totaal gebruik gemaakt van 10 bloedstalen van BRCA1mutatiedragers, 10 bloedstalen van BRCA2-mutatiedragers en 23 bloedstalen van donoren zonder de mutatie. Deze laatste groep wordt vervolgens opgedeeld in twee groepen. De eerste groep zijn gezonde donoren met een bewezen mutatie aanwezig in de familie, maar zelf zijn ze negatief getest op de aanwezigheid van de mutatie (9). De tweede groep zijn 14 gezonde vrijwilligers zonder familiale belasting en zonder vermoeden van een gestegen risico (de controles).
7.2. Methode De G2-micronucleustest bestaat uit een opeenvolging van het in cultuur brengen van de bloedstalen, het bestralen, fixeren, op slides brengen, kleuren en ten slotte inscannen en interpreteren van de stalen met behulp van de Metafer 4.
7.2.1. In cultuur brengen van de stalen Per ontvangen bloedstaal worden culturen opgestart. Het in cultuur brengen van de stalen heeft tot doel de T-lymfocyten te stimuleren tot deling d.m.v. toevoeging van Phytohemagglutinine (Gibco). Zo wordt een groter aantal delende T-lymfocyten, die zich in de S- of G2-fase bevinden tijdens de bestraling, bekomen. Elke cultuur bevat 0.5 ml gehepariniseerd bloed, 4 ml cRPMI (Complete RPMI-1640 medium, d.i. RPMI aangevuld met penicilline/streptomycine en L-glutamine)(Gibco), 0.5 ml FCS (Fetal calf serum) en 100 µl Phytohemagglutinine (PHA). Na het in cultuur brengen worden de stalen drie dagen in de CO2 incubator bij 37° geplaatst vooraleer te worden bestraald. 7.2.2. Bestraling De bestraling van de stalen vindt plaats in het Instituut voor Nucleaire Wetenschappen van de UGent (Prof. Dr. H. Thierens). De stalen worden warm gehouden in een warmwaterbad op
27
een temperatuur van 37° en worden bestraald met 60Co γ-stralen. De totale stralingsdosis is 2 of 4 Gray (Gy) aan een dose rate van 1 Gray per 6 minuten.
7.2.3. Toevoeging cytochalasine B (CytoB), cafeïne en Bromodeoxyuridine (BrdU) Onmiddellijk na de bestraling van de cellen worden CytoB (20µl per 5 ml met een concentratie van 6 µg/ml)(Sigma) en BrdU (50µl per 5 ml met een concentratie van 10mM)(Sigma-Aldrich) toegevoegd. Bij de helft van de bestraalde culturen wordt vervolgens cafeïne toegevoegd (200µl per cultuur van 5 ml met een concentratie van 100mM)(SigmaAldrich). Zo ontstaan de 18 condities die worden weergegeven in tabel 2.
Tabel 2: Condities van de G2-micronucleustest.
Dosis (Gy)
0 Gy
2Gy
4Gy
8h cafeïne -
8h cafeïne - A
8h cafeïne - A
8h cafeïne - B
8h cafeïne - B
8h cafeïne + A
8h cafeïne + A
8h cafeïne + B
8h cafeïne + B
16h cafeïne - A
16h cafeïne - A
16h cafeïne - B
16h cafeïne - B
16h cafeïne + A
16h cafeïne + A
16h cafeïne + B
16h cafeïne + B
Tijd (h) 8h
16h
16h cafeïne -
7.2.4. Fixatie en slides maken 7.2.4.1. Eerste en tweede fixatie Nadat de bloedculturen 8 of 16 uur in de incubator verbleven hebben na bestraling, worden ze gefixeerd. Deze procedure start met het centrifugeren van de stalen (8 min., 1000 rpm), gevolgd door het afzuigen van het supernatans (het cultuurmedium) tot net boven de pellet gevormd door de bloedcellen. Vervolgens wordt 7 ml KCl (hypotone oplossing, 75 mM, bewaard op 4 °C) druppelsgewijs toegevoegd aan de stalen terwijl ze gevortext worden. Door de toevoeging van KCl worden de rode bloedcellen vernietigd en zwellen de lymfocyten mooi rond op, zodat de micronuclei duidelijk detecteerbaar worden wanneer ze met de Metafer worden gescand. Na een tweede centrifugatie en afzuiging van het supernatans wordt aan elk staal 7ml methanol/azijnzuur/Ringer-oplossing toegevoegd in een 4/1/5 verhouding (4 °C) terwijl ze opnieuw gevortext worden. Hierna is de eerste fixatie voltooid en worden de stalen 28
1 nacht op 4 °C bewaard. De volgende dag voert men de tweede fixatie uit. Na centrifugatie en afzuiging van het bekomen supernatans wordt 5 ml methanol/azijnzuur in een 4/1 verhouding aan elk staal toegevoegd (4 °C). Deze stap wordt driemaal uitgevoerd, tot er een volledig helder fixatief bekomen wordt. Nadat deze stappen succesvol uitgevoerd zijn, kan onmiddellijk worden overgegaan naar het maken van slides of kan men ervoor opteren de stalen terug te bewaren gedurende 1 nacht op 4 °C om de volgende dag de slides te maken.
7.2.4.2. Slides maken De slides worden eerst gereinigd met behulp van 100% alcohol met 1% HCl, dit om vet of andere storende elementen die het inscannen kunnen bemoeilijken, te verwijderen. Nadat de stalen een tweede fixatie hebben ondergaan, worden ze opnieuw gecentrifugeerd. Om de juiste celconcentratie te bekomen, wordt het supernatans afgenomen tot ongeveer 1 cm boven de pellet. Een inschatting van de hoeveelheid resterend supernatans die nodig is, gebeurt visueel en hangt af van de grootte van de pellet. Vervolgens wordt grondig gevortext, gevolgd door het aanbrengen van 40 µl van de celsuspensie op de slides. Deze worden gedroogd aan de lucht. De eerste slide wordt onder de microscoop bekeken om te evalueren of de concentratie goed is, vervolgens wordt de rest van de slides gemaakt.
Ten slotte worden 2 druppels DAPI + Vectashield™(Vector Laboratories) toegevoegd aan 2 van de 5 slides per staal. Wanneer DAPI bindt op DNA van de cel, resulteert dit in een blauwe fluorescentie. Vectashield H-1200 zorgt voor het behoud van de fluorescentie.
7.2.5. Metafer 4, inscannen en interpreteren De gemaakte slides worden per 8 ingescand door het Metafer 4 automatisch scanning systeem (Metasystems) en opgeslagen. Vervolgens worden de slides gecodeerd, dit om bias tegen te gaan. Per slide worden de micronuclei van 600 binucleaire cellen geteld. Gezien er per conditie 2 culturen (A en B) worden opgestart en per cultuur 2 slides worden ingescand, interpreteert men zo’n 2400 binucleairen per conditie. De analyse van het aantal micronuclei gebeurt op automatische en semi-automatische basis. Automatische tellingen van micronuclei gebeuren rechtstreeks door de Metafer. De resultaten van deze telling zijn onmiddellijk zichtbaar, zoals weergegeven in figuur 15. De Metafer selecteert automatisch 600 binucleairen. Hierna worden deze ook allemaal gecontroleerd, zo 29
bekomt men het semi-automatische resultaat. Zowel de vals-positieve binucleairen als de vals-positieve en vals-negatieve micronuclei uit de automatische telling worden op deze manier geëlimineerd.
Figuur 15: Beeld van de automatische telling via de Metafer 4. Het cijfer linksonder geeft het aantal MN aan dat automatisch geteld is. Het cijfer rechtsonder kan indien nodig aangepast worden via de semi-automatische telling naargelang het aantal MN dat zich daadwerkelijk in de binucleair bevindt. (Dienst Histologie, UGent)
7.2.6. Statistiek De gegevens worden verwerkt d.m.v. Microsoft Excel (MS Excel 2010). De statistische berekeningen worden met behulp van GraphPad (GraphPad Software, Inc.) uitgevoerd. Er wordt gebruik gemaakt van de chi-kwadraattest en de ongepaarde t-test. De chi-kwadraattest deelt een populatie op in verschillende klassen, namelijk normaal, sensitief of zeer sensitief. De test gaat na of er een verschillende verdeling is van twee populaties (in casu mutatiedragers en controles) in de 3 klassen. De ongepaarde t-test vergelijkt het aantal micronuclei tussen twee verschillende groepen. Om een significant resultaat te bekomen, moet de p-waarde kleiner of gelijk aan 0.05 zijn.
30
8. Resultaten 8.1. Overzicht donoren In tabel 3 worden de verschillende donoren, gebruikt in dit onderzoek, weergegeven volgens mutatie. In totaal werden 43 verschillende donorstalen geanalyseerd.
Tabel 3: Overzicht donoren.
Donorgroep (aantal)
Gemiddelde leeftijd (jaar)
Aantal vrouwen/ aantal mannen
Controles (14)
D01, D04, D05, D06, D12, D13, D14, 32 D15, D16, D17, D21, D24, D30, D31
11/3
Familieleden zonder mutatie (9)
BC01, BC03, BC07, BC08, BC25, 37 BC28, BC34, BC38 en BC43
7/2
BRCA1-mutatiedragers (10)
BC04, BC06, BC16, BC23, BC24, 43 BC33, BC35, BC36, BC37 en BC42
6/4
BRCA2-mutatiedragers (10)
BC05, BC09, BC10, BC26 , BC27, 35 BC29, BC30, BC32, BC41 en BC46
6/4
8.2. Werkwijze Zoals reeds vermeld, worden in dit onderzoek twee parameters gebruikt om de stralingsgevoeligheid te bepalen. Men analyseert ten eerste het aantal stralingsgeïnduceerde micronuclei (MN) per 1000 binucleairen (BN). Ten tweede wordt de individuele radiosensitiviteitsparameter (IRP) berekend, naar analogie van Terzoudi et al., 2009 (33). De IRP is de verhouding van het aantal micronuclei per 1000 binucleairen na toevoeging van cafeïne ten opzichte van het aantal micronuclei per 1000 binucleairen zonder toevoeging van cafeïne (IRP= C+/C-). Hoe lager de waarde, hoe meer er sprake is van een verhoogde radiosensitiviteit (zie 5.1.7) . Een hoog aantal stralingsgeïnduceerde micronuclei kan duiden op een defect in HR, waarbij zowel BRCA1 als BRCA2 betrokken zijn. Een lage IRP-waarde wijst eerder op een defect in het G2/M checkpoint, wat voornamelijk bij een defect in het BRCA1-proteïne te verwachten valt. Er wordt gekeken naar beide parameters en dit telkens na bestraling van de cellen met 2 Gray en 4 Gray. (33)
31
8.3. Controlegroep In deze studie zijn er 2 controlegroepen. De eerste subgroep omvat 14 ‘donoren’, dit zijn vrijwilligers van de dienst Histologie van het UZ Gent. Deze donoren vertonen geen verhoogd familiaal risico op borst- of ovariumkanker. De tweede subgroep bestaat uit 9 familieleden van mutatiedragers. Bij elk van hen werd gescreend naar de familiale mutatie met een negatief resultaat tot gevolg.
Er wordt nagegaan d.m.v. een ongepaarde t-test met een 95% betrouwbaarheidsinterval of het aantal micronuclei per 1000 binucleairen van deze groepen significant verschilt van elkaar.
Donoren vs. familieleden zonder mutatie
Aantal MN/1000 BN
250 200
*
150
Donoren 100
familieleden zonder mutatie
50 0 8h 0Gy
8h 2Gy
8h 4Gy 16h 0Gy 16h 2Gy 16h 4Gy
Figuur 16: Gemiddeld aantal MN/1000BN (± 1SD) voor de donoren en familieleden zonder mutatie.
Men kan in figuur 16 een verschil opmerken in het gemiddeld aantal MN per 1000 BN tussen de groep donoren en de groep familieleden zonder mutatie, waarbij de familieleden zonder mutatie telkens gemiddeld een hoger aantal MN per 1000 BN hebben. Via de ongepaarde ttest werd dit verschil significant bevonden in de situatie 8h 4Gy met een p-waarde van 0.017.
Om deze reden wordt bij de interpretatie van de gegevens telkens gewerkt met de groep donoren zonder verhoogd familiaal risico als controlegroep.
In tabel 4 worden vervolgens de gemiddelde waarden (µ) voor de verschillende onderzochte radiosensitiviteitsparameters
in
de
controlegroep
weergegeven
samen
met
de
standaarddeviatie (SD) en de Coefficient of Variation (CV). De CV wordt berekend volgens de formule (SD/µ)*100 en laat toe de variabiliteit tussen de verschillende controles na te 32
gaan. De verkregen CV-waarden variëren tussen 16.7% en 35.5% zonder duidelijk verschil tussen 8h en 16h. Aangezien BrdU-kleuringen, uitgevoerd door de onderzoeksgroep, hebben aangetoond dat 8h postbestralingstijd resulteert in de hoogste opbrengst aan G2-bestraalde cellen, werd geopteerd om enkel de resultaten verkregen met 8h postbestralingstijd verder te analyseren in deze studie. (45) Tabel 4: Weergave van het gemiddelde μ, de standaard deviatie SD en de Coefficient of Variation (CV) van het aantal MN/1000BN en de IRP-waarde bij de controlegroep.
μ
SD
CV (%)
MN 8h 2Gy
64
23
35.5
MN 8h 4Gy
84
25
29.7
MN 16h 2Gy
111
28
25.0
MN 16h 4Gy
132
40
29.9
IRP 8h 2Gy
2.1
0.6
28.7
IRP 8h 4Gy
3.2
0.6
19.1
IRP 16h 2Gy
2.4
0.4
16.7
IRP 16h 4Gy
4.8
1.5
30.7
8.4. Radiosensitiviteit bij BRCA1- en BRCA2-mutatiedragers Figuur 17 geeft een overzicht van de gemiddelde micronucleuswaarden waargenomen in de verschillende groepen na bestraling met 4 Gray. De horizontale lijnen geven de standaarddeviaties (+1SD en +2SD) weer op de gemiddelde MN waarde van de controlegroep. De waarde van +1SD is 108 MN/1000BN, de waarde van +2SD bedraagt 133 MN/1000BN.
33
Overzicht per groep - 8h 4Gy 160
µ controles = 84 µ BRCA1 = 144 µ BRCA2 = 111
*
Gemiddeld aantal MN/1000 BN
140
+2SD
120
+1SD 100 80 60 40 20 0 Controles
BRCA1
BRCA2
Figuur 17: Gemiddeld aantal micronuclei per 1000 binucleairen voor de situatie 8h 4Gy, gegeven voor de BRCA1- en BRCA2-mutatiedragers en de controlegroep.
Indien de verdeling in klassen (niet-radiosensitief, radiosensitief of sterk radiosensitief) van een bepaalde mutatiegroep significant verschilt van de verdeling van de controlegroep in dezelfde klassen, wordt dit aangegeven door een asterisk (*). Dit werd berekend door middel van de chi-kwadraattest voor een 95% betrouwbaarheidsinterval. De significante p-waarde voor de BRCA1-mutatiedragers bedraagt 0.014. Voor de BRCA2-mutatiedragers wordt een niet-significante p-waarde gevonden van 0.12.
Eenzelfde resultaat wordt bekomen wanneer men het verschil in stralingsgevoeligheid onderzoekt tussen de familieleden zonder mutatie en de mutatiedragers. Bij het vergelijken van de familieleden zonder mutatie met de BRCA1-mutatiegroep, bekomt men een significante p-waarde van 0.04, eveneens verkregen d.m.v. de chi-kwadraattest. Er wordt geen significant verschil (p-waarde = 0.36) gevonden wanneer men de stralingsgevoeligheid van de familieleden zonder mutatie vergelijkt met de stralingsgevoeligheid van de BRCA2-groep.
34
Figuur 18 toont de gemiddelde IRP van de verschillende groepen voor de situatie 8h 4Gy. De waarde van -1SD is 2.6 en de waarde van -2SD is 2.0. Bij uitvoering van de chi-kwadraattest bekomt men een sterk significante p-waarde van 0.002 voor de BRCA1-mutatiedragers. De niet-significante p-waarde van de BRCA2-mutatiedragers bedraagt 0.24.
IRP 8h 4Gy 3,5
µ controles = 3.2 µ BRCA1 = 2.1 µ BRCA2 = 3.1
µ BRCA1 = 2.1 µ BRCA2 = 3.1
3
-1SD
2,5
* -2SD
IRP
2 1,5 1 0,5 0 Controlegroep
BRCA1
BRCA2
Figuur18: Individuele radiosensitiviteitsparameter gegeven voor de BRCA1- en BRCA2-mutatiedragers en de controlegroep.
Figuur 19 geeft een weergave van de MN distributie bij de controlegroep en bij de BRCA1- en BRCA2-mutatiedragers. De verticale, zwarte lijnen duiden de waarde van één en twee standaarddeviaties op de gemiddelde micronucleuswaarde van de controles aan (μ=84; -1SD=59; +1SD=108; +2SD=133). Van de BRCA1-mutatiedragers heeft 10% een MN waarde >1SD en ≤2SD en 60% een MN waarde >2SD. In totaal wordt dus 70% van de BRCA1mutatiedragers radiosensitief bevonden. Veertig procent van de BRCA2-mutatiedragers wordt sterk radiosensitief bevonden (waarde > 2SD), de overige 60% zijn niet radiosensitief.
35
Controles, BRCA1- en BRCA2-mutatiedragers 8h 4Gy 7 -1SD
+1SD
+2SD
Aantal individuen
6 5 4
Controles 3
BRCA1
2
BRCA2
1 0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
Aantal MN/ 1000 BN
Figuur 19: Histogram met weergave van de frequentie van het aantal micronuclei (MN) per 1000 binucleairen (BN) in klassen van 20, gegeven voor de controlegroep en de BRCA1- en BRCA2-mutatiedragers na bestraling met 4Gy.
Bij stalen die niet bestraald werden, kon d.m.v. een ongepaarde t-test geen significant verschil in spontane micronucleusfrequentie vastgesteld worden tussen de verschillende groepen (controlegroep, groep familieleden zonder de mutatie en de mutatiegroepen).
36
8.5. Resultaten als individu 8.5.1. De BRCA1-mutatiedragers Tabel 5 geeft een overzicht van de verschillende mutaties van de BRCA1-mutatiedragers in het DNA en de overeenkomstige wijziging in het proteïne.
Tabel 5: BRCA1-mutatiedragers, hun DNA-mutatie en de overeenkomstige wijziging in het proteïne.
BRCA1
mutatie (DNA)
wijziging proteïne
BC16 BC24 BC33 BC06 BC23 BC35 BC04 BC42 BC36 BC37
c.1A>G c.1A>C c.212+3A>G c.2359dup c.2359dup c.2359dup c.3331_3334del c.3661G>T c.4327C>T c.4327C>T
p.Met1Val p.Met1Leu n/a p.Glu787fs p.Glu787fs p.Glu787fs p.Gln1111fs p.Glu1221* p.Arg1443* p.Arg1443*
Figuur 20 is een weergave van het aantal micronuclei per 1000 binucleaire cellen voor elke BRCA1-mutatiedrager individueel na bestraling met 4Gy. De getallen boven de staven van het diagram vertegenwoordigen de factor waarmee de waarde van de BRCA1-mutatiedrager verhoogd is ten opzichte van het gemiddelde van de controles. Men kan één radiosensitieve en zes sterk radiosensitieve BRCA1-mutatiedragers bemerken. Drie mutatiedragers worden niet radiosensitief bevonden.
37
µ controles = 84 µ BRCA1 = 144
BRCA1 - 8h 4Gy 250
Aantal MN/1000 BN
200 150
x2.5 x2.0
x2.1
x1.9 x1.7
x2.0
x1.4
x1.7
+2SD +1SD
100 50 0
Figuur 20: Aantal micronuclei per 1000 binucleaire cellen na bestraling met 4Gy voor elke BRCA1mutatiedrager individueel en ten opzichte van het gemiddelde van de controles.
Figuur 21 is een weergave van de IRP voor elke BRCA1-mutatiedrager individueel voor de situatie van 8h 4Gy. Vijf BRCA1-mutatiedragers worden als radiosensitief geclassificeerd en vier als sterk radiosensitief. Slechts één mutatiedrager vertoont geen radiosensitiviteit. Dit resulteert bijgevolg in een verhoogde radiosensitiviteit bij 90% van de BRCA1mutatiedragers.
38
BRCA1 - 8h 4Gy - IRP
µ controles = 3.2 µ BRCA1 = 2.1
3,5 3
-1SD
IRP
2,5
-2SD
2 1,5 1 0,5 0
Figuur 21: IRP na bestraling met 4Gy voor elke BRCA1-mutatiedrager individueel en ten opzichte van het gemiddelde van de controles.
8.5.2. De BRCA2-mutatiedragers Tabel 6 geeft een overzicht van de verschillende mutaties van de BRCA2-mutatiedragers in het DNA en de overeenkomstige wijziging in het proteïne.
Tabel 6: BRCA2-mutatiedragers, hun DNA-mutatie en de overeenkomstige wijziging in het proteïne.
BRCA2
mutatie (DNA)
wijziging proteïne
BC30 BC09 BC10 BC26 BC32 BC46 BC27 BC05 BC41 BC29
c.2219del c.4171del c.4171del c.4936_4939del c.4936_4939del c.6275_6276del c.6275_6276del c.6275_6276del c.8167 G>C c.8332_8487del
p.Pro740fs *32 p.Glu1391fs*19 p.Glu1391fs*19 p.Glu1646fs*23 p.Glu1646fs*23 p.Leu2092fs*7 p.Leu2092fs*7 p.Leu2092fs*7 p.Asp2723His p.Ile2778_Gln2829del
39
Figuur 22 is een weergave van het aantal MN/1000BN voor elke BRCA2-mutatiedrager individueel voor de situatie van 8h 4Gy. Men bekomt een sterke radiosensitiviteit bij 40% van de BRCA2-mutatiedragers. De overige 60% vertoont geen verhoogde stralingsgevoeligheid.
BRCA2 - 8h 4Gy
µ controles = 84 µ BRCA2 = 111
250
x2.3 Aantal MN/1000BN
200
x1.8 150
x1.6
x2.1 x1.3
100
+2SD +1SD
50 0
Figuur 22: Aantal micronuclei per 1000 binucleaire cellen na bestraling met 4 Gy voor elke BRCA2mutatiedrager individueel en ten opzichte van het gemiddelde van de controlegroep.
Figuur 23 is een weergave van de IRP voor elke BRCA2-mutatiedrager individueel voor de situatie van 8h 4Gy. In totaal vertoont 40% van de BRCA2-mutatiedragers een verhoogde radiosensitiviteit. Twee BRCA2-mutatiedragers vertonen een verhoogde radiosensitiviteit, de andere twee vertonen een sterk verhoogde stralingsgevoeligheid. De overige 60% wordt niet radiosensitief bevonden.
40
BRCA2 - 8h 4Gy - IRP
µ controles = 3.2 µ BRCA2 = 3.1
6 5
IRP
4 3
-1SD 2
-2SD
1 0
Figuur 23: De IRP na een bestralingsdosis van 4Gy voor elke BRCA2-mutatiedrager individueel en ten opzichte van het gemiddelde van de controles.
41
9. Discussie Dit onderzoek beoogt het aantonen van een al dan niet verhoogde radiosensitiviteit bij BRCA1- en BRCA2-mutatiedragers door middel van de G2-micronucleustest. Uit de literatuur blijkt dat er reeds veelvuldig gebruik gemaakt wordt van de G0-micronucleustest om de in vitro stralingsgevoeligheid bij verschillende patiëntenpopulaties te kwantificeren. Zo werden onder andere reeds verschillende onderzoeken uitgevoerd op bloedstalen verkregen van borstkankerpatiënten. Een geobserveerde verhoogde stralingsgevoeligheid bij deze patiënten wordt toegeschreven aan een vermoedelijke mutatie in één van de DNA repair genen. (45)
De BRCA1- en BRCA2-eiwitten hebben een belangrijke bijdrage in de pathway voor het herstel van DNA-dubbelstrengsbreuken. Zij worden pas geactiveerd tijdens de homologe recombinatie, die zijn werking vindt tijdens de late S- en G2-fase. Het onderzoek van Febrer et al., 2008, (46) toonde het belang aan van correct functionerende BRCA1-eiwitten tijdens de HR voor het herstel van DNA-schade opgelopen na bestraling. Febrer et al. toonden immers aan dat lymfocyten met een BRCA1-mutatie na bestraling een langere G2-fase delay doormaken in vergelijking met controlecellen en dat zij ondanks de G2-delay, met meer DNA-schade de M-fase aanvatten.
Gezien dus de BRCA-eiwitten pas in werking treden tijdens de late S- en G2-fase van de celcyclus, zal de G0-micronucleustest minder gevoelig zijn om de functionaliteit van deze eiwitten specifiek te onderzoeken. Omwille van dit gegeven ontwikkelde de onderzoeksgroep van Prof. Dr. A. Vral (Universiteit Gent) de G2-micronucleustest die meer specifiek op de Sen G2-fase van de celcyclus gericht is.
In dit onderzoek worden via de G2-micronucleustest 2 parameters geanalyseerd voor de bepaling van radiosensitiviteit, namelijk het aantal stralingsgeïnduceerde micronuclei per 1000 binucleairen enerzijds en de individuele radiosensitiviteitsparameter (IRP) anderzijds (zie 5.1.7.). Aangezien er overlap is tussen de MN-distributies van controles en mutatiedragers, moet een cut-off waarde voor radiosensitiviteit worden bepaald. In deze studie wordt als cut-off waarde voor radiosensitiviteit de waarde van de eerste standaarddeviatie t.o.v. het gemiddelde van de controlegroep gehanteerd. Als het resultaat boven (aantal MN/1000 BN) of onder (IRP) de tweede standaarddeviatie ligt, spreekt men van sterk radiosensitief, naar analogie met de studie van Terzoudi et al., 2009 (33). Sommige andere onderzoekers kiezen ervoor de 90ste percentielwaarde van de controlepopulatie te 42
gebruiken als arbitraire grens voor stralingsgevoeligheid. Bij toepassing van het 90ste percentiel als cut-off waarde classificeert men 10% van de controlegroep als stralingsgevoelig en bij toepassing van 1SD is dit 16%. Wanneer 2SD als cut-off gebruikt wordt, wordt 2.5% van de controlegroep geclassificeerd als sterk radiosensitief. De betrekkelijk grote overlap tussen de micronucleuswaarden verkregen bij mutatiedragers en de controle-individuen bij toepassing van cytogenetische testen zoals de G0- en de G2-micronucleustest voor analyse van stralingsgevoeligheid blijft een heikel punt. (45, 47-50)
9.1. Controlegroep Als men de 14 controlestalen van vrijwilligers zonder familiale belasting met borst- en ovariumcarcinoom vergelijkt met deze van de 9 familieleden van mutatiedragers zonder dat zij zelf drager zijn, resulteert dit systematisch in hogere micronucleuswaarden bij de familieleden. Bij toepassing van de ongepaarde t-test wordt enkel een significant verschil in aantal micronuclei bekomen voor de situatie 8h 4Gy. Ondanks de afwezigheid van een BRCA1- en BRCA2-mutatie, geven de stalen van de familieleden dus toch blijk van een hogere stralingsgevoeligheid dan de controlestalen.
Tot op heden worden personen die zelf negatief testen op de gekende BRCA-mutatie in de familie, gerustgesteld. Er wordt hen medegedeeld dat hun risico op borstkanker hetzelfde bedraagt als het populatierisico (zo’n 11 tot 13%). Recent hebben echter verschillende, eerder kleinschalige studies dit in vraag gesteld. Uit deze studies bleek dat familieleden zonder de BRCA-mutatie toch een licht verhoogd risico zouden hebben op borstkanker in vergelijking met de algemene populatie. Het zou gaan om een relatief risico van 2.0 bij benadering. Een mogelijke verklaring hiervoor zou zijn dat er alteraties in andere genen overgeërfd worden, die niet gekoppeld zijn aan de overerving van een BRCA1- of BRCA2-mutatie. (51-54) Vral et al., 2011, (55) toonden bijvoorbeeld aan dat single nucleotide polymorphisms (SNPs) in RAD51 en Xrcc3, twee proteïnes eveneens betrokken in de HR, het totale borstkankerrisico kunnen beïnvloeden bij dragers van een BRCA-mutatie. De overerving van deze SNPs gebeurt onafhankelijk van de overerving van de BRCA-mutatie. Deze SNPs kunnen bijgevolg mogelijks ook bij familieleden zonder de BRCA-mutatie een verhoging van het borstkankerrisico inhouden.
43
Andere studies hieromtrent observeerden daarentegen geen verhoogd borstkankerrisico bij familieleden zonder de BRCA-mutatie. (54, 56) Verder onderzoek op een groter aantal stalen is aanbevolen om meer duidelijkheid te krijgen over dit familiale risico dat niet aan de BRCA-mutatie gebonden is.
Functionele testen voor het nagaan van de stralingsgevoeligheid, zoals cytogenetische testen, hebben als nadeel dat ze vaak worden gekenmerkt door inter- en intra-individuele variaties. Hoge variaties beïnvloeden de gevoeligheid van de test. In deze studie werd dan ook de interindividuele
variabiliteit
binnen
de
controlegroep
nagegaan.
Relatief
hoge
variabiliteitswaarden werden verkregen (CV 16.7% - 35.5%).
Ook in de studie van Vral et al., 2004, (57) werden vrij hoge inter- en intravariabiliteitswaarden bekomen bij toepassing van de G0-micronucleustest en de G2chromatide test. De intra-variabiliteit bekomen door de analyse van verschillende culturen van eenzelfde bloedstaal, was echter klein, in tegenstelling tot de grotere intra-variabiliteit bekomen door analyse van stalen van eenzelfde patiënt afgenomen op verschillende tijdstippen. De geobserveerde intra-individuele variatie kan dus niet louter beschouwd worden als een gevolg van de experimentele parameters, maar vindt mede zijn verklaring in schommelingen in een aantal parameters zoals o.a. de immuunstatus, de hormoonspiegels,… bij eenzelfde individu. Om tot betrouwbare conclusies te kunnen komen, is het dan ook belangrijk dat er meer dan één bloedstaal wordt afgenomen. De geobserveerde interindividuele variabiliteit uit de studie kon toegeschreven worden aan echte inter-individuele verschillen tussen de donoren.
De intra-variabiliteit bij donoren uit dit onderzoek dient nagegaan te worden. Dit was echter tot op heden onmogelijk wegens het te kleine aantal stalen van eenzelfde donor. Idealiter onderzoekt men de intra-variabiliteit op een groter aantal stalen van dezelfde donor, aangevuld met een intra-variabiliteitsanalyse op stalen van een mutatiedrager. Om deze test te valideren als merker van radiosensitiviteit bij een individu zijn er bijgevolg bijkomende studies nodig. Gemiddeld stellen we echter duidelijk vast dat de G2micronucleustest een hoge radiosensitiviteit vaststelt bij BRCA1-mutatiedragers in vergelijking met zowel de familieleden die geen drager zijn als de controle-individuen zonder familiale voorgeschiedenis van borstkanker. Om een zo accuraat mogelijk resultaat te
44
verkrijgen, is het aan te raden meerdere bloedstalen van eenzelfde donor te analyseren op verschillende tijdstippen.
9.2. Radiosensitiviteit bij BRCA1- en BRCA2-mutatiedragers Deze studie toont een significant verhoogde radiosensitiviteit aan bij BRCA1-mutatiedragers, zowel wanneer men het aantal MN/1000BN als de IRP als parameter voor radiosensitiviteit hanteert. De BRCA2-mutatiegroep vertoont verhoogde waarden t.o.v. de controlegroep, deze zijn echter niet statistisch significant. Dit kan mogelijks te verklaren zijn door het feit dat deze resultaten gebaseerd zijn op een kleine populatie van 10 mutatiedragers.
Zoals reeds besproken, hebben de BRCA1- en BRCA2-eiwitten een belangrijke functie bij het herstel van dubbelstrengsbreuken. Zij treden voornamelijk in werking tijdens de homologe recombinatie. Daarenboven speelt BRCA1 een rol in de activatie van verschillende checkpoints. Zhong et al., 1999, (58) suggereerden bovendien een interactie tussen het BRCA1-eiwit, het RAD50 eiwit en de NHEJ.
De bredere waaier aan functies van het BRCA1-eiwit zou een verklaring kunnen vormen voor het feit dat bij de BRCA1-mutatiegroep een significant verhoogde radiosensitiviteit wordt gevonden, dit in tegenstelling tot de BRCA2-mutatiegroep. Gezien het BRCA2-eiwit geen duidelijke functie heeft bij de activatie van het G2/M checkpoint, kan de IRP bij de BRCA2mutatiedragers beschouwd worden als een minder relevante parameter. Het feit dat cafeïne ook de HR pathway zou kunnen beïnvloeden, sluit echter een effect van de BRCA2-mutatie op de IRP niet volledig uit. (35)
Verschillende onderzoeken in het verleden maakten gebruik van de G0-micronucleustest om stralingsgevoeligheid bij BRCA-mutatiedragers aan te tonen. Zo kon het onderzoek van Rothfuss et al., 2000, (49) een significant verhoogd aantal micronuclei en dus een verhoogde stralingsgevoeligheid bij BRCA1-mutatiedragers aantonen, maar niet bij verwanten zonder de mutatie. Trenz et al., 2002, (59) beschreven een significant verhoogde stralingsgevoeligheid voor zowel de BRCA1- als de BRCA2-mutatiedragers. Ernestos et al., 2010, (60) bestudeerden zowel BRCA1- en BRCA2-positieve borstkankerpatiënten als gezonde mutatiedragers en vonden bij beide een significant verhoogd aantal chromatide breuken ten opzichte van de controlegroep. Een verschil tussen mutatiedragers met en zonder borstkanker werd echter niet
45
statistisch onderzocht, hoewel een grafische weergave een verschil in aantal chromatide breuken per mitose doet vermoeden.
Er zijn echter ook een aantal studies waarbij geen verhoogde radiosensitiviteit van BRCAmutatiedragers kon worden vastgesteld. Baeyens et al., 2004, (61) constateerden bijvoorbeeld d.m.v. de G0-micronucleustest en G2-assay, dit is een test die het aantal chromatide breuken opmeet, een verhoogde stralingsgevoeligheid bij borstkankerpatiënten ten opzichte van een controlegroep, losstaand van het feit of ze al dan niet een BRCA1- of BRCA2-mutatie hebben. Bij mutatiedragers zonder borstkanker kon geen verhoogde stralingsgevoeligheid worden vastgesteld.
Wanneer men een literatuurstudie uitvoert over in vitro radiosensitiviteit bij BRCA1- en BRCA2-mutatiedragers, stelt men dus inconsistente resultaten vast. Globaal wordt radiosensitiviteit aangetoond bij een kleine meerderheid van de reeds verschenen studies. Aan de basis van de inconsistentie kunnen onder andere een verschillende werkwijze liggen zoals bv. een andere stralingsdosis, evenals een verschil in onderzochte mutaties (zie verder). Bovendien wordt in vele studies gebruik gemaakt van stalen van BRCA1- of BRCA2mutatiedragers die reeds borstkanker hadden of doorgemaakt hadden. Men kan zich de vraag stellen of dit gegeven (het reeds hebben van borstkanker en/of de behandeling ervan) de resultaten beïnvloedt. (60)
In dit onderzoek zijn de meeste BRCA1- en BRCA2-mutatiedragers asymptomatisch. Er werden slechts twee borstkankerpatiënten geïncludeerd (BC16 en BC23), beide met een BRCA1-mutatie. Bij deze patiënten werd de chemo- en radiotherapiebehandeling echter reeds meer dan 1 jaar voor de staalafname afgerond. Er wordt aangenomen dat deze behandelingen geen beïnvloedende factor vormen in deze studie, maar verder onderzoek is nodig om dit volledig uit te sluiten.
46
9.3. Resultaten als individu 9.3.1. De BRCA1-mutatiedragers Tabel 7: Overzicht van de radiosensitiviteit bij BRCA1-mutatiedragers
8h 2Gy BC16 c.1A>G BC24 c.1A>C BC33 c.212+3A>G BC06 c.2359dup
+ -
BC23 c.2359dup BC35 c.2359dup BC04 c.3331_3334del BC42 c.3661G>T BC36 c.4327C>T BC37 c.4327C>T ++
Sterk stralingsgevoelig
+
Stralingsgevoelig
-
Niet stralingsgevoelig
++ + ++ ++
8h 4Gy
++ ++ ++ ++ + ++ ++
8h 2Gy IRP
+ + + + + + +
8h 4Gy IRP
++ + ++ + + ++ ++ + +
Hoewel het gemiddelde MN aantal van de BRCA1-mutatiegroep significant verhoogd is t.o.v. de controlegroep en hoewel 70% van de BRCA1-mutatiedragers radiosensitief wordt bevonden via de micronucleusparameter, ziet men een grote variatie in de bekomen resultaten als men de radiosensitiviteit van elke BRCA1-mutatiedrager afzonderlijk evalueert. Dit wordt weergegeven in tabel 7. De bekomen resultaten variëren, zowel wanneer men kijkt naar het aantal MN/1000 BN als naar de IRP en dit na bestraling met 2Gy en 4Gy.
Om te bepalen of een individu al dan niet radiosensitief is, worden deze vier situaties dan ook best samen geëvalueerd en geïnterpreteerd. Idealiter wordt in de toekomst een graderingssysteem voor stralingsgevoeligheid opgesteld waarbij men bepaalt in hoeveel van deze vier situaties een individu stralingsgevoeligheid vertoont en in welke mate dit gebeurt (radiosensitief of sterk radiosensitief).
In dit onderzoek vertoont 20% van de BRCA1-dragers stralingsgevoeligheid in de vier situaties, 70% in minstens drie van de vier situaties en alle BRCA1-mutatiedragers vertonen in
47
minstens de helft van de situaties stralingsgevoeligheid. In tabel 8 worden de resultaten van de controlegroep weergegeven ter vergelijking.
Tabel 8: Overzicht van de radiosensitiviteit bij de controle-individuen.
8h 2Gy D01 D12 D13
8h 4Gy
+ -
D14 D15 D16 D17 D21 D24 D04 D05 D06 D30 D31 ++
Sterk stralingsgevoelig
+
Stralingsgevoelig
-
Niet stralingsgevoelig
+ + -
+ ++ -
8h 2Gy IRP
-
8h 4Gy IRP
-
-
+
+
+ +
+ -
De vraag blijft hoe deze geobserveerde variabiliteit tussen BRCA1-mutatiedragers op vlak van stralingsgevoeligheid kan verklaard worden. Hiervoor kan men meer in detail kijken naar de precieze lokalisatie van de mutatie in het BRCA1-gen, zoals weergegeven in figuur 24.
48
Figuur 24: Het BRCA1-gen met aanduiding van de inter-agerende eiwitten en de lokalisatie van de verschillende onderzochte mutaties. Aangepast naar Roy et al. (22)
Als men kijkt naar het aantal MN/ 1000 BN na bestraling met 4 Gray, bekomt men de hoogste waarden bij BC16 en BC24. Bij deze mutatiedragers werd een mutatie gevonden in het startcodon. Ook BC36 en BC37 vertonen sterke radiosensitiviteit. Als men kijkt naar de gevonden mutatie, ziet men dat deze in een functioneel belangrijk domein van het BRCA1-gen gelegen is. Dit domein gaat in interactie met meerdere andere eiwitten van het herstelmechanisme. Op basis van de lokalisatie van deze specifieke mutaties, weergegeven in figuur 24, valt het dan ook niet te verwonderen dat deze vier mutatiedragers sterk radiosensitief scoren.
De mutatie van BC06, BC23 en BC35 bevindt zich in een DNA-bindend domein van het BRCA1-eiwit, zoals te zien is in figuur 24. Hier ziet men echter enkel een sterke radiosensitiviteit bij BC06 en BC23. BC35 vertoont geen verhoogd aantal MN/1000 BN. Bij BC33 werd een splice site mutatie in het RING-domein geconstateerd, dit is een domein dat minder functionele waarde heeft bij de homologe recombinatie. BC33 vertoont dan ook geen verhoogde stralingsgevoeligheid. Ook bij BC04 en BC42 wordt geen verhoogd aantal MN/1000 BN waargenomen.
De individuele IRP-waarden vertonen echter bij enkele BRCA1-mutatiedragers een ander resultaat op vlak van stralingsgevoeligheid in vergelijking met het aantal MN/1000 BN. Opmerkelijk is bijvoorbeeld dat BC33 de laagste IRP-waarde vertoont. Dit kan erop wijzen dat het RING-domein wel een belangrijke functie uitoefent bij de activatie van het checkpoint. Zoals reeds vermeld, verdient het aanbeveling om bij de bepaling van de 49
stralingsgevoeligheid van een individu, het aantal MN/1000 BN en de IRP samen te analyseren en dit zowel na bestraling met 2Gy als met 4Gy.
Hoewel een deel van de geobserveerde radiosensitiviteit mogelijks kan verklaard worden door de lokalisatie van de verschillende mutaties, wat nog verder moet onderzocht worden, dient men ook andere factoren te betrekken bij de verklaring van de geobserveerde variatie in stralingsgevoeligheid bij BRCA-mutatiedragers.
Zo kan men proberen nagaan welke functionele impact de specifieke mutatie heeft op het BRCA-eiwit. Men kan zich bijvoorbeeld afvragen of de mutatie in het startcodon van BC16 en BC24 leidt tot haplo-insufficiëntie of dat er een tweede, ‘rescue’ startcodon tot uiting komt en het DNA bijgevolg wel nog (deels) afgeschreven wordt. Men kan zich baseren op in silico prediction om de resterende functionaliteit van het gemuteerde gen te voorspellen. Een meer accurate voorspelling van de functionaliteit van het BRCA-eiwit zou kunnen bekomen worden door een Western-Blot analyse uit te voeren. Dit is echter een zeer arbeidsintensief proces. Als alternatief zou een mRNA-analyse van het gemuteerde gen kunnen uitgevoerd worden. Men kan hier voornamelijk besluiten uit trekken indien geen mRNA meer wordt gevormd. Hoewel men bij uitvoering van deze testen in theorie veel informatie kan verkrijgen omtrent de functionele impact van de mutatie, blijkt in de praktijk dat de nodige voorzichtigheid in acht moet worden genomen bij de interpretatie van de bekomen resultaten. Men dient er zich immers van bewust te zijn dat elke mutatie anders is en de experimentele variatie groot kan zijn. (62)
Eenzelfde mutatie kan aanleiding geven tot een verschil in geobserveerde graad van radiosensitiviteit (bijvoorbeeld BC35 vs. BC06 en BC23). Men vermoedt dat varianten in andere repair-genen zoals RAD51 en Xrcc3, bepaalde omgevingsfactoren waaraan de mutatiedrager werd blootgesteld en de variatie van de G2-micronucleustest aan de basis kunnen liggen van deze variatie in stralingsgevoeligheid. (55)
Ten slotte dient, zoals hierboven reeds vermeld, rekening te worden gehouden met een voorgeschiedenis van borstkanker. Bij BC16 en BC23 werd een borstcarcinoom vastgesteld. Bij deze patiënten ziet men een sterk verhoogd aantal micronuclei per 1000 binucleairen. Een zeker effect van chemo- of radiotherapiebehandeling kan niet uitgesloten worden, hoewel dit weinig waarschijnlijk lijkt gezien het spontaan aantal micronuclei per 1000 binucleairen bij 50
deze patiënten niet verhoogd is. Bijkomende factoren, losstaand van de BRCA-mutatie, zijn naar alle waarschijnlijkheid verantwoordelijk (zie bovenstaande paragraaf).
9.3.2. De BRCA2-mutatiedragers Tabel 9: Overzicht van de radiosensitiviteit bij BRCA2-mutatiedragers
8h 2Gy BC30 c.2219del BC09 c.4171del BC10 c.4171del BC26 c.4936_4939del BC32 c.4936_4939del BC46 c.6275_6276del BC27 c.6275_6276del BC05 c.6275_6276del BC41 c.8167 G>C BC29 c.8332_8487del ++
Sterk stralingsgevoelig
+
Stralingsgevoelig
-
Niet stralingsgevoelig
++ + ++ ++ -
8h 4Gy
++ ++ ++ ++ -
8h 2Gy IRP
+ + -
8h 4Gy IRP
+ ++ + ++
BRCA2-mutatiedragers vertonen gemiddeld een verhoogd aantal MN/1000 BN t.o.v. de controlegroep, dit werd echter niet significant bevonden. Als men het overzicht van de radiosensitiviteit bekijkt, zoals weergegeven in tabel 9, valt op dat bij de BRCA2mutatiedragers veel frequenter een niet stralingsgevoelig resultaat bekomen wordt in vergelijking met de BRCA1-mutatiedragers. Slechts één BRCA2-mutatiedrager (BC46) vertoont radiosensitiviteit in alle situaties. Dertig procent vertoont in minstens 3 situaties stralingsgevoeligheid, 40% in minstens 2 en 60% in ten minste één van de vier situaties. Veertig procent vertoont dus in geen enkele situatie radiosensitiviteit. Ook hier wordt het verschil in stralingsgevoeligheid duidelijk tussen BRCA1- en BRCA2-mutatiedragers. Opvallend is dat een positief resultaat in 65% van de gevallen boven de tweede SD reikt en dus als sterk radiosensitief wordt geclassificeerd, bij de BRCA1- mutatiedragers is dit in 46%
51
van de gevallen zo. Wanneer een verhoogde waarde gezien wordt, scoren BRCA2mutatiedragers dus vaker sterk radiosensitief dan radiosensitief. Zoals reeds eerder besproken, is de IRP een minder relevante parameter bij BRCA2mutatiedragers, gezien het BRCA2-eiwit geen duidelijke rol heeft in de checkpoint-activatie.
Figuur 25: Het BRCA2-gen met aanduiding van de inter-agerende eiwitten en de lokalisatie van de verschillende onderzochte mutaties. Aangepast naar Roy et al. (22)
Als men de precieze lokalisatie van de verschillende BRCA2-mutaties in het gen nagaat, zoals weergegeven in figuur 25, ziet men onder andere dat BC30 een mutatie heeft die zich relatief vroeg in het gen bevindt. Dit kan een verklaring vormen voor het feit dat BC30 een sterk verhoogd aantal micronuclei per 1000 binucleairen vertoont. Zowel BC26 als BC32 vertonen vergelijkbare resultaten, evenals BC27 en BC05. Ze hebben immers een identieke mutatie. BC46 vertoont daarentegen een sterk verhoogd aantal MN/1000 BN, in tegenstelling tot de normale waarden bekomen bij BC27 en BC05. Ook BC09 en BC10 vertonen een substantieel verschil in opgelopen schade na bestraling. Men dient bijgevolg op zoek te gaan naar andere factoren dan lokalisatie om een verklaring te vinden voor het geobserveerde verschil in radiosensitiviteit (zie vroeger). Voor BC41 en BC29 wordt de juiste lokalisatie nog onderzocht.
Men kan concluderen dat niet alle BRCA1- en BRCA2-mutatiedragers eenzelfde mate van radiosensitiviteit vertonen. De specifieke lokalisatie van de mutatie in het gen en de nog resterende functionaliteit kunnen mogelijks een verklaring vormen voor de graad van radiosensitiviteit geobserveerd bij de verschillende mutatiedragers. Ook varianten in andere genen betrokken bij herstel, bepaalde omgevingsfactoren en de experimentele variatie van de 52
G2-micronucleustest kunnen een invloed hebben op de mate van stralingsgevoeligheid bij een individu met een BRCA-mutatie.
9.4. Toekomstperspectieven Het aantal patiëntenstalen waarop de conclusies van deze studie zijn gebaseerd, is momenteel nog beperkt en dient in de toekomst verder uitgebreid te worden om de bekomen resultaten te valideren en verder uit te werken. Zo kan er meer duidelijkheid verkregen worden over de mogelijke stralingsgevoeligheid bij BRCA2-mutatiedragers.
Uit de reeds bekomen preliminaire resultaten blijkt dat de G2-micronucleustest belangrijke medische implicaties kan hebben voor de toekomst. Als men een verhoogde stralingsgevoeligheid bij een individu met een BRCA1- of BRCA2-mutatie vaststelt, zou het aangewezen zijn de richtlijnen voor borstkankerscreening individueel aan te passen. Zo kan men opteren voor het uitvoeren van MRI aangevuld met echografie als screeningsmethode en dient men in de mate van het mogelijke mammografieën te vermijden.
Men kan ook argumenteren dat de algemene screeningsguidelines voor de BRCAmutatiedragers opnieuw zouden geëvalueerd en aangepast moeten worden indien een meer individuele aanpak niet haalbaar lijkt. Er dient bijgevolg gewerkt te worden aan (inter)nationale guidelines voor borstkankerscreening bij deze hoog-risicogroep, die dan consequent in elk ziekenhuis worden toegepast. Met de kennis uit deze studie, moet de volgende stap erin bestaan kosten-effectiviteitsstudies uit te voeren om dit vervolgens te toetsen aan de haalbaarheid.
Bij uitbreiding zou men er baat bij hebben de radiosensitiviteit te onderzoeken bij vrouwen die radiotherapie moeten ondergaan omwille van een gediagnosticeerde borstkanker. Men kan deze resultaten gebruiken om een op maat gemaakt schema voor radiotherapie op te stellen. BRCA-mutatiedragers zouden immers een verhoogd risico op radiotoxiciteit en op het induceren van een secundaire borstkanker kunnen hebben. Tot op heden werd echter geen verband gezien tussen BRCA1- of BRCA2-mutaties en een verhoogd aantal complicaties geassocieerd aan de radiotherapie. (60)
53
10. Conclusie Dit onderzoek beoogt het aantonen van een al dan niet verhoogde radiosensitiviteit bij BRCA1- en BRCA2-mutatiedragers. Er wordt voor het eerst gebruik gemaakt van de G2micronucleustest.
De bekomen resultaten wijzen systematisch op een significant verhoogde radiosensitiviteit bij BRCA1-mutatiedragers. De BRCA2-mutatiedragers vertonen een verhoogde stralingsgevoeligheid, maar deze is niet significant. Alhoewel niet significant, vertoont 40% van de BRCA2-patiënten toch een sterk verhoogde stralingsgevoeligheid na 4Gy bestraling. De meer uitgesproken stralingsgevoeligheid waargenomen bij BRCA1-mutatiedragers kan verklaard worden door het groter aantal functies van het BRCA1-eiwit in de homologe recombinatie en in de activatie van de checkpoints bij herstel van dubbelstrengsbreuken. Verder onderzoek naar de bepaling van radiosensitiviteit bij individuen met een BRCAmutatie en naar optimalisatie van de G2-micronucleustest verdient aanbeveling.
54
11. Bibliografie 1.
2. 3. 4. 5.
6.
7. 8.
9.
10.
11. 12.
13.
14. 15. 16.
17. 18. 19. 20. 21. 22.
23.
24.
Belgium: Females, number of invasive tumours by primary site and age group in 2011: Belgian Cancer Registry; 2013 [01/10/2013]. Available from: http://www.kankerregister.org/media/docs/SKRstats/2011/2011-F-BEL-Abs.pdf. Borstkanker: mortaliteit versus incidentie: Vlaams Agentschap Zorg en Gezondheid; 2013. Available from: http://www.zorg-en-gezondheid.be/Cijfers/Ziekten/Kanker/Borstkanker--mortaliteit-versus-incidentie/. Jaarrapport 2011 Bevolkingsonderzoek naar borstkanker. Centrum voor borstkankeropsporing; 2011. p. 83. R.L. Nussbaum RRM, H.F. Willard. Thompson & Thompson Genetics in Medicine. 7 ed: Saunders Elsevier; 2007. Meindl A, Ditsch N, Kast K, Rhiem K, Schmutzler RK. Hereditary breast and ovarian cancer: new genes, new treatments, new concepts. Deutsches Arzteblatt international. 2011 May;108(19):323-30. PubMed PMID: 21637635. Pubmed Central PMCID: 3106175. Pal T, Vadaparampil ST. Genetic risk assessments in individuals at high risk for inherited breast cancer in the breast oncology care setting. Cancer control : journal of the Moffitt Cancer Center. 2012 Oct;19(4):25566. PubMed PMID: 23037493. Claes K. Genetische screening: praktische aanpak bij vermoeden BRCA-mutatie in het UZ Gent. 2013. Evans DG, Lalloo F, Wallace A, Rahman N. Update on the Manchester Scoring System for BRCA1 and BRCA2 testing. Journal of medical genetics. 2005 Jul;42(7):e39. PubMed PMID: 15994864. Pubmed Central PMCID: 1736089. Epub 2005/07/05. eng. Rahman N. BRCA1 and BRCA2 mutation testing guidelines 2013. Available from: http://www.icr.ac.uk/research/team_leaders/Rahman_Nazneen/Rahman_Nazneen_Protocols/Protocols/2277 8.pdf. Deelnamegraad aan het bevolkingsonderzoek naar borstkanker: Vlaams Agentschap Zorg en Gezondheid; 2011-2012. Available from: http://www.zorg-engezondheid.be/Cijfers/Ziekten/Borstkankeropsporing/Deelnamegraad-aan-het-bevolkingsonderzoek-naarborstkanker/. Van_den_Broecke R. partim senologie uit: BLOK UROGENITAAL STELSEL: Universiteit Gent; 2012. Broeders M, Moss S, Nystrom L, Njor S, Jonsson H, Paap E, et al. The impact of mammographic screening on breast cancer mortality in Europe: a review of observational studies. Journal of medical screening. 2012;19 Suppl 1:14-25. PubMed PMID: 22972807. Puliti D, Duffy SW, Miccinesi G, de Koning H, Lynge E, Zappa M, et al. Overdiagnosis in mammographic screening for breast cancer in Europe: a literature review. Journal of medical screening. 2012;19 Suppl 1:4256. PubMed PMID: 22972810. Verstraete K. Urogenitaal stelsel: uit CURSUS RADIOLOGIE EN MEDISCHE BEELDVORMING. Gent U, 2012. Hendrick RE. Radiation doses and cancer risks from breast imaging studies. Radiology. 2010 Oct;257(1):246-53. PubMed PMID: 20736332. Secretariat MA. Cancer screening with digital mammography for women at average risk for breast cancer, magnetic resonance imaging (MRI) for women at high risk: an evidence-based analysis. Ont Health technol Assess Ser [Internet]. 2010 Mar;10(3):1-55. De_Paepe A. Klinische Genetica uit: BLOK PROBLEMEN VAN KLINISCHE GENETICA, VERLOSKUNDE, PEDIATRIE EN ADOLESCENTIE: UGent; 2014. Thierens H. De fysische basis van de medische beeldvorming uit: BLOK DIAGNOSTISCH EN THERAPEUTISCH DENKEN: Universiteit Gent; 2011-2012. Chapman JR, Taylor MR, Boulton SJ. Playing the end game: DNA double-strand break repair pathway choice. Molecular cell. 2012 Aug 24;47(4):497-510. PubMed PMID: 22920291. Cann KL, Hicks GG. Regulation of the cellular DNA double-strand break response. Biochemistry and cell biology = Biochimie et biologie cellulaire. 2007 Dec;85(6):663-74. eng. Kum Kum Khanna SPJ. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 2001 maart 2001;27:247-54. Roy R, Chun J, Powell SN. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature reviews Cancer. 2012 Jan;12(1):68-78. PubMed PMID: 22193408. Epub 2011/12/24. eng. Kee Y, D'Andrea AD. Expanded roles of the Fanconi anemia pathway in preserving genomic stability. Genes & development. 2010 Aug 15;24(16):1680-94. PubMed PMID: 20713514. Pubmed Central PMCID: 2922498. Foulkes WD, Shuen AY. In brief: BRCA1 and BRCA2. The Journal of pathology. 2013 Aug;230(4):347-9. PubMed PMID: 23620175. Epub 2013/04/27. eng.
55
25. Pfeiffer P, Goedecke W, Kuhfittig-Kulle S, Obe G. Pathways of DNA double-strand break repair and their impact on the prevention and formation of chromosomal aberrations. Cytogenetic and genome research. 2004;104(1-4):7-13. PubMed PMID: 15162009. Epub 2004/05/27. eng. 26. Pouget JP, Mather SJ. General aspects of the cellular response to low- and high-LET radiation. European journal of nuclear medicine. 2001 Apr;28(4):541-61. PubMed PMID: 11357507. 27. International_Atomic_Energy_Agency. Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies. Vienna 2011. 28. Delvaeye T. De in vitro stralingsrespons van MCF10A borstepitheelcellen na downregulatie van de borstkankereiwitten BRCA1 & BRCA2. Gent: Universiteit Gent; 2012. 29. Fenech M. The in vitro micronucleus technique. Mutation research. 2000 Nov 20;455(1-2):81-95. PubMed PMID: 11113469. Epub 2000/12/13. eng. 30. Claes K, Depuydt J, Taylor AM, Last JI, Baert A, Schietecatte P, et al. Variant ataxia telangiectasia: clinical and molecular findings and evaluation of radiosensitive phenotypes in a patient and relatives. Neuromolecular medicine. 2013 Sep;15(3):447-57. PubMed PMID: 23632773. 31. Vral A. Cursus radiobiologie en radiopathologie. 1e master Biomedische wetenschappen. Universiteit Gent, Faculteit geneeskunde en gezondheidswetenschappen2012. 32. Lodish H, Berk A, Kaiser CA, Scott MP, Bretscher A, Ploegh H, et al. Molecular cell biology. New York: Tenney S.; 2008. 33. Pantelias. G2-checkpoint abrogation in irradiated lymphocytes: A new cytogenetic approach to assess individual radiosensitivity and predisposition to cancer. International Journal of Oncology. 2009;35(05). 34. Terzoudi GI, Hatzi VI, Donta-Bakoyianni C, Pantelias GE. Chromatin dynamics during cell cycle mediate conversion of DNA damage into chromatid breaks and affect formation of chromosomal aberrations: biological and clinical significance. Mutation research. 2011 Jun 3;711(1-2):174-86. PubMed PMID: 21185845. 35. Zelensky AN, Sanchez H, Ristic D, Vidic I, van Rossum-Fikkert SE, Essers J, et al. Caffeine suppresses homologous recombination through interference with RAD51-mediated joint molecule formation. Nucleic acids research. 2013 Jul;41(13):6475-89. PubMed PMID: 23666627. Pubmed Central PMCID: 3711438. Epub 2013/05/15. eng. 36. Bin-Bing S. Zhou‡§ PC, Kevin Spring¶, Shaun P. Scott¶, Roy A. Johanson‡, Rubin Mishra‡, Michael R. Mattern‡, James D. Winkler‡, and Kum Kum Khanna. Caffeine Abolishes the Mammalian G2/M DNA Damage Checkpoint by Inhibiting Ataxia-Telangiectasia-mutated Kinase Activity. J Biol Chem. 2000;275(of April 7):10342–8. 37. Kuhne M, Riballo E, Rief N, Rothkamm K, Jeggo PA, Lobrich M. A double-strand break repair defect in ATM-deficient cells contributes to radiosensitivity. Cancer research. 2004 Jan 15;64(2):500-8. PubMed PMID: 14744762. 38. Jorgensen TJ, Shiloh Y. The ATM gene and the radiobiology of ataxia-telangiectasia. International journal of radiation biology. 1996 May;69(5):527-37. PubMed PMID: 8648240. Epub 1996/05/01. eng. 39. Lavin MF. Ataxia-telangiectasia: from a rare disorder to a paradigm for cell signalling and cancer. Nature reviews Molecular cell biology. 2008 Oct;9(10):759-69. PubMed PMID: 18813293. Epub 2008/09/25. eng. 40. Chen PC, Lavin MF, Kidson C, Moss D. Identification of ataxia telangiectasia heterozygotes, a cancer prone population. Nature. 1978 Aug 3;274(5670):484-6. PubMed PMID: 672974. Epub 1978/08/03. eng. 41. Tchirkov A, Bay JO, Pernin D, Bignon YJ, Rio P, Grancho M, et al. Detection of heterozygous carriers of the ataxia-telangiectasia (ATM) gene by G2 phase chromosomal radiosensitivity of peripheral blood lymphocytes. Human genetics. 1997 Dec;101(3):312-6. PubMed PMID: 9439660. Epub 1998/01/24. eng. 42. Scott D, Hu Q, Roberts SA. Dose-rate sparing for micronucleus induction in lymphocytes of controls and ataxia-telangiectasia heterozygotes exposed to 60Co gamma-irradiation in vitro. International journal of radiation biology. 1996 Nov;70(5):521-7. PubMed PMID: 8947533. Epub 1996/11/01. eng. 43. Sanford KK, Parshad R, Price FM, Jones GM, Tarone RE, Eierman L, et al. Enhanced chromatid damage in blood lymphocytes after G2 phase x irradiation, a marker of the ataxia-telangiectasia gene. Journal of the National Cancer Institute. 1990 Jun 20;82(12):1050-4. PubMed PMID: 2348470. Epub 1990/06/20. eng. 44. Chen P, Farrell A, Hobson K, Girjes A, Lavin M. Comparative study of radiation-induced G2 phase delay and chromatid damage in families with ataxia-telangiectasia. Cancer genetics and cytogenetics. 1994 Aug;76(1):43-6. PubMed PMID: 8076350. Epub 1994/08/01. eng. 45. Baeyens A. In vitro chromosomal radiosensitivity in breast cancer patients [Doctoral thesis]. Ghent: Ghent University; 2005. 46. Febrer E, Mestres M, Caballin MR, Barrios L, Ribas M, Gutierrez-Enriquez S, et al. Mitotic delay in lymphocytes from BRCA1 heterozygotes unable to reduce the radiation-induced chromosomal damage. DNA repair. 2008 Nov 1;7(11):1907-11. PubMed PMID: 18765304. 47. Baria K, Warren C, Roberts SA, West CM, Evans DG, Varley JM, et al. Correspondence re: A. Rothfuss et al., Induced micronucleus frequencies in peripheral blood lymphocytes as a screening test for carriers of a
56
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
BRCA1 mutation in breast cancer families. Cancer Res., 60: 390-394, 2000. Cancer research. 2001 Aug 1;61(15):5948-9. PubMed PMID: 11479238. Epub 2001/08/02. eng. Riches AC, Bryant PE, Steel CM, Gleig A, Robertson AJ, Preece PE, et al. Chromosomal radiosensitivity in G2-phase lymphocytes identifies breast cancer patients with distinctive tumour characteristics. British journal of cancer. 2001 Oct 19;85(8):1157-61. PubMed PMID: 11710829. Pubmed Central PMCID: Pmc2375149. Epub 2001/11/17. eng. Rothfuss A, Schutz P, Bochum S, Volm T, Eberhardt E, Kreienberg R, et al. Induced micronucleus frequencies in peripheral lymphocytes as a screening test for carriers of a BRCA1 mutation in breast cancer families. Cancer research. 2000 Jan 15;60(2):390-4. PubMed PMID: 10667592. Epub 2000/02/10. eng. Vral A, Thierens H, Baeyens A, De Ridder L. The micronucleus and G2-phase assays for human blood lymphocytes as biomarkers of individual sensitivity to ionizing radiation: limitations imposed by intraindividual variability. Radiation research. 2002 Apr;157(4):472-7. PubMed PMID: 11893251. Epub 2002/03/15. eng. Smith A, Moran A, Boyd MC, Bulman M, Shenton A, Smith L, et al. Phenocopies in BRCA1 and BRCA2 families: evidence for modifier genes and implications for screening. Journal of medical genetics. 2007 Jan;44(1):10-5. PubMed PMID: 17079251. Pubmed Central PMCID: Pmc2597903. Epub 2006/11/03. eng. Gronwald J, Cybulski C, Lubinski J, Narod SA. Phenocopies in breast cancer 1 (BRCA1) families: implications for genetic counselling. Journal of medical genetics. 2007 Apr;44(4):e76. PubMed PMID: 17400795. Pubmed Central PMCID: Pmc2598043. Epub 2007/04/03. eng. Rowan E, Poll A, Narod SA. A prospective study of breast cancer risk in relatives of BRCA1/BRCA2 mutation carriers. Journal of medical genetics. 2007 Aug;44(8):e89; author reply e8. PubMed PMID: 17673443. Pubmed Central PMCID: Pmc2597932. Epub 2007/08/04. eng. Domchek SM, Gaudet MM, Stopfer JE, Fleischaut MH, Powers J, Kauff N, et al. Breast cancer risks in individuals testing negative for a known family mutation in BRCA1 or BRCA2. Breast cancer research and treatment. 2010 Jan;119(2):409-14. PubMed PMID: 19885732. Epub 2009/11/04. eng. Vral A, Willems P, Claes K, Poppe B, Perletti G, Thierens H. Combined effect of polymorphisms in Rad51 and Xrcc3 on breast cancer risk and chromosomal radiosensitivity. Molecular medicine reports. 2011 SepOct;4(5):901-12. PubMed PMID: 21725594. Epub 2011/07/05. eng. Korde LA, Mueller CM, Loud JT, Struewing JP, Nichols K, Greene MH, et al. No evidence of excess breast cancer risk among mutation-negative women from BRCA mutation-positive families. Breast cancer research and treatment. 2011 Jan;125(1):169-73. PubMed PMID: 20458532. Pubmed Central PMCID: Pmc3110729. Epub 2010/05/12. eng. Vral A, Thierens H, Baeyens A, De Ridder L. Chromosomal aberrations and in vitro radiosensitivity: intraindividual versus inter-individual variability. Toxicology letters. 2004 Apr 1;149(1-3):345-52. PubMed PMID: 15093280. Epub 2004/04/20. eng. Zhong Q, Chen CF, Li S, Chen Y, Wang CC, Xiao J, et al. Association of BRCA1 with the hRad50hMre11-p95 complex and the DNA damage response. Science (New York, NY). 1999 Jul 30;285(5428):747-50. PubMed PMID: 10426999. Epub 1999/07/31. eng. Trenz K, Rothfuss A, Schutz P, Speit G. Mutagen sensitivity of peripheral blood from women carrying a BRCA1 or BRCA2 mutation. Mutation research. 2002 Mar 20;500(1-2):89-96. PubMed PMID: 11890937. Epub 2002/03/14. eng. Ernestos B, Nikolaos P, Koulis G, Eleni R, Konstantinos B, Alexandra G, et al. Increased chromosomal radiosensitivity in women carrying BRCA1/BRCA2 mutations assessed with the G2 assay. International journal of radiation oncology, biology, physics. 2010 Mar 15;76(4):1199-205. PubMed PMID: 20206018. Baeyens A, Thierens H, Claes K, Poppe B, de Ridder L, Vral A. Chromosomal radiosensitivity in BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. International journal of radiation biology. 2004 Oct;80(10):745-56. PubMed PMID: 15799620. Epub 2005/04/01. eng. Anczukow O, Ware MD, Buisson M, Zetoune AB, Stoppa-Lyonnet D, Sinilnikova OM, et al. Does the nonsense-mediated mRNA decay mechanism prevent the synthesis of truncated BRCA1, CHK2, and p53 proteins? Human mutation. 2008 Jan;29(1):65-73. PubMed PMID: 17694537. Epub 2007/08/19. eng.
57
12. Bijlagen 12.1. Bijlage 1
Guidelines for analysis of the genes for HBOC (hereditary breast and/or ovarian cancer) Woman with breast cancer + one or more of the following :
diagnosed ≤ 35 yrs, diagnosed < 50 yrs and one relative with bilateral, or ovarian, or breast < 50, or male breast cancer bilateral breast cancer and both diagnosed < 50 yrs ovarian cancer, any age triple negative breast cancer three individuals with breast cancer, one is a first degree relative (FDR) of the other two (excluding male transmitters) and one diagnosed < 50 years individual of ethnicity associated with higher frequency of specific mutations (e.g., Ashkenazi Jewish): eligible for founder mutation testing other family situations (e.g. multiple pancreatic cancer) with a priori chance of mutation >10% according to BRCAPRO or Evans criteria or Manchester score test more than one affected relative if criteria remain positive after excluding the negative case as a phenocopy
Woman with epithelial ovarian cancer
diagnosed <70 yrs
Male with breast cancer Individual with pancreatic cancer at any age with ≥ 2 FDR excluding male transmitters with breast where one diagnosed <50 or bilateral ,or ovarian, or 2 more pancreatic cancer at any age.
58
Family history
First degree unaffected relative of any of the above on a case by case basis Testing of unaffected family members should only be considered when no affected family member is available and then the unaffected family member with the highest probability of mutation should be tested.
The above mentioned guidelines were prepared by Karin Dahan and reviewed and approved on 29/03/2013 by Y. Sznajer, K. Devriendt, V. Bours, M. Abramowicz, Ch. Verellen – Dumoulin, K. Keymolen, E. De Baere, G. Mortier at the Meeting of the High Council for Anthropogenetics (now College for Medical Geneticists).
59
12.2. Bijlage 2
60
