METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian Bogor dan Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka Lembaga Penelitian dan Pengabdian pada Masyarakat IPB Bogor, dari bulan April 2011 sampai Mei 2012.
Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit buah Langsat (Lansium domesticum) yang diperoleh dari Kabupaten Mamuju Provinsi Sulawesi Barat. Bahan kimia untuk ekstraksi terdiri dari heksana, etil asetat dan etanol 70%, serta bahan-bahan kimia lainnya untuk analisa. Bakteri uji yang digunakan adalah Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Escherichia coli ATCC 25922. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah larva udang (Artemia salina Leach), air laut untuk uji toksisitas, media padat nutrient agar (NA), media cair nutrient broth (NB) untuk perbanyakan dan pemeliharaan kultur bakteri, 1,1-difenil-1pikrilhidrazil (DPPH) dan butil hidroksi toluen (BHT) untuk uji antioksidan. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat shaker, vakum evaporator, autoklaf, inkubator, pipet mikro, multiwell plates, seperangkat alat elisa reader, spektrofotometer, oven microwave Panasonic tipe NN.S215WF/MF dan peralatan gelas untuk analisis kimia.
Tahapan Penelitian Penelitian ini akan dilakukan dalam beberapa tahapan percobaan yang meliputi : 1) Preparasi sampel, 2) Ekstraksi kulit buah langsat, 3) Identifikasi fitokimia dan evaluasi toksisitas ekstrak kulit buah langsat, 4) Uji aktivitas antibakteri dan antioksidan ekstrak kulit buah langsat, 5) Optimasi proses ekstraksi kulit buah langsat dengan bantuan gelombang mikro. Diagram alir tahapan penelitian seperti terlihat pada Gambar 7.
24
Kulit buah langsat Preparasi sampel
Ekstraksi secara Maserasi (dengan pelarut heksana, etil asetat dan etanol)
Ekstrak heksana Ekstrak etil asetat Ekstrak etanol 70%
Uji fitokimia Uji toksisitas Uji antibakteri Uji Antioksidan
Ekstrak terpilih
Penentuan KHM dan KBM
Optimasi proses ekstraksi
Ekstrak optimal
Validasi
Gambar 7 Diagram alir pelaksanaan penelitian Dari tahapan yang disajikan pada Gambar 7, dapat dikelompokan menjadi 3 tahapan besar dengan beberapa ruang lingkup penelitian seperti disajikan pada Gambar 8.
25
AKTIVITAS
TAHAPAN KERJA
Ruang lingkup penelitian : Pengambilan dan preparasi sampel; Ekstraksi dengan 3 jenis pelarut Identifikasi fitokimia Uji toksisitas BSLT
Ruang lingkup penelitian : Uji aktivitas antibakteri Ekstrak heksana, etil asetat, dan etanol kulit buah langsat Penentuan KHM dan KBM Uji Antioksidan ekstrak heksana, etil asetat dan etanol kulit buah langsat
Ruang lingkup penelitian : Ekstraksi kulit buah langsat dengan bantuan gelombang mikro Pembandingan ekstraksi kulit buah langsat dengan gelombang mikro dengan ekstraksi konvensional Optimasi proses ekstraksi kulit buah langsat dengan bantuan gelombang mikro
Ekstraksi, identifikasi fitokimia dan uji toksisitas
Uji aktivitas antibakteri dan antioksidan, serta penentuan nilai HKM dan KBM
Optimasi proses ekstraksi
LUARAN Diperoleh ekstrak teridentifikasi fitokimia yang memiliki potensi sebagai bahan fitofarmaka
Diperoleh ekstrak kulit buah langsat dengan aktivitas antibakteri dan antioksidan tebaik. Diketahui nilai KHM dan KBM
Diperoleh kondisi proses ekstrasi optimum untuk ekstraksi kulit buah langsat
Gambar 8 Aktivitas dan ruang lingkup penelitian
Preparasi Sampel Tahapan ini terdiri dari evaluasi taksonomi, persiapan sampel dan analisis proksimat kulit buah langsat sebagai bahan baku penelitian. Evaluasi taksonomi tanaman bertujuan untuk memastikan bahwa tanaman yang diteliti adalah tanaman langsat dan akan dilakukan di Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong - Bogor. Tahapan persiapan sampel meliputi penyortiran buah langsat untuk memisahkan buah yang rusak dan baik, buah yang baik kemudian dikupas untuk
26
memisahkan kulit buah dari daging buahnya. Kulit buah kemudian dikeringkan dengan oven selama 6 jam pada suhu 60o C. Setelah kering, kulit buah dihaluskan menggunakan hammer mill menjadi berbentuk serbuk dengan ukuran 60 mesh. Analisis proksimat dilakukan untuk menentukan karakteristik kulit buah langsat yang meliputi analisis kadar air, kadar protein, kadar lemak, kadar abu, kadar serat, dan kadar karbohidrat.
Ekstraksi kulit buah langsat Proses ekstraksi kulit buah langsat dilakukan secara maserasi menggunakan pelarut- pelarut yang berbeda polaritasnya, yaitu pelarut heksana (nonpolar), etilasetat (semipolar) dan etanol (polar). Ekstraksi dilakukan pada suhu ruang selama 24 jam. Serbuk kulit buah langsat sebanyak 25 g direndam dalam pelarut heksana, etil asetat dan etanol dengan perbandingan 1:10 (b/v) sambil dishaker. Campuran- campuran tersebut kemudian disaring, dan selanjutnya ampas serbuk kulit buah langsat tersebut dimaserasi kembali dengan perlakuan sama seperti diatas. Filtrat-filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan vakum evaporator. Filtrat-filtrat tersebut diambil sebagai ekstrak heksana, ekstrak etil asetat dan ekstrak etanol.
Ekstrak-ekstrak yang diperoleh digunakan sebagai
sampel untuk analisis fitokimia dan pengujian aktivitas lainnya. Rendemen ekstrak dinyatakan dalam persen ekstrak kering (tanpa pelarut) dan dihitung dengan persamaan : berat ekstrak yang diperoleh (g) per berat bahan yang diekstraksi (g) x 100%.
Penentuan kandungan fitokimia (Harborne, 1996) Penentuan
kandungan
fitokimia
secara
kualitatif
dilakukan
untuk
mengetahui ada tidaknya golongan senyawa aktif yang terdapat pada simplisia dan ekstrak kulit buah langsat, meliputi tanin, flavonoid, saponin, alkaloid, triterpenoid, dan steroid. Uji tanin Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambahkan 2 ml air, kemudian didihkan selama beberapa menit, lalu disaring dan filtratnya ditambah 1 tetes FeCl 3 10 %. Sampel yang positif ditandai dengan warna hijau kehitaman.
27
Uji Flavonoid Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambahkan 2 ml air, kemudian didihkan selama beberapa menit, lalu disaring dan filtratnya ditambahkan serbuk Mg sebanyak satu ujung spatula, kemudian diteteskan dengan HCl pekat sebanyak 2-3 tetes, setelah itu ditambahkan dengan 1 mL amil alkohol. Campuran tersebut kemudian dikocok sampai homogen. Sampel yang positif akan
warna jingga atau kuning pada
lapisan amil alkohol. Uji saponin Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambahkan 2 ml air, kemudian didihkan selama beberapa menit, lalu disaring, filtrat hasil penyaringan dikocok kuat. Sample yang positif akan memunculkan busa yang stabil yang dapat bertahan selama 5 menit. Uji alkaloid Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambahkan dengan NH3 cair sebanyak 3 tetes, dan kloroform sebanyak 5 ml ke dalam tabung reaksi. Sampel tersebut kemudian dihomogenkan dengan menggunakan vortex, dan disaring, setelah itu tambahkan H2SO4 2 M sebanyak 3 ml dan dihomogenkan kembali sehingga terbentuk lapisan asam. Lapisan asam tersebut kemudian diuji dengan penambahan pereaksi Dragendroff, Mayern, dan Wagner. Sampel positif mengandung alkaloid, jika berturut-turut akan membentuk endapan jingga, putih, dan cokelat . Uji triterpenoid dan steroid Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambah 5 ml etanol 96 % lalu dipanaskan selama 2 menit dan disaring. Filtrat hasil penyaringan kemudian dipanaskan kembali sampai kering. Sample kering kemudian ditambahkan 1 ml dietil eter sampai larut dan dipindahkan ke dalam cawan porselen. Cawan yang berisi sample tersebut kemudian ditambahkan dengan satu tetes H2SO4 pekat dan satu tetes asam asetat anhidrat. Sampel yang positif mengandung senyawa triterpenoid akan memberikan warna merah. Sampel yang positif mengandung senyawa steroid akan memberikan warna hijau atau biru. Sample yang positif mengandung senyawa triterpenoid dan steroid akan memberikan warna ungu.
28
Uji toksisitas menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Sebanyak 10 ekor larva Artemia Salina Leach yang sehat berumur 48 jam dimasukan ke dalam vial uji yang berisi air laut. Tambahkan larutan ekstrak pada masing-masing vial uji dengan konsentrasi 10, 100, 500, dan 1000 ppm. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan menghitung jumlah larva yang mati dari total larva yang dimasukan dalam vial uji. Penghitungan LC 50 dengan menggunakan analisis probit dari data persen mortalitas dengan selang kepercayaan 95% pada program SPSS.
Pengujian aktivitas antibakteri (Mukesh et al. 2011; Doughari 2006) Peremajaan dan penyiapan stok bakteri Isolat bakteri sebelum dipergunakan, terlebih dahulu disegarkan dalam media cair Nutrient broth (NB). Stok bakteri murni dalam bentuk liofil dibuka secara aseptis lalu dipindahkan kedalam tabung yang berisi NB steril, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Sebagai stok bakteri dibuat kultur bakteri dalam agar miring dengan medium Nutrient agar (NA),dengan cara satu ose larutan kultur diinokulasi ke permukaan NA miring kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Uji aktivitas antibakteri Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan cara sebagai berikut, sebanyak 20 ml media NA steril diinokulasikan dengan 20 µL kultur segar berumur 24 jam dalam media NB, dikocok merata kemudian dituang dalam cawan petri steril dan dibiarkan membeku. Sebanyak 10 µL ekstrak kulit buah langsat diteteskan dalam kertas cakram berukuran 6 mm, kemudian kertas cakram diletakkan pada cawan petri yang berisi media agar padat. Selanjutnya cawancawan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Pengamatan dilakukan dengan mengukur zona bening di sekitar kertas cakram dengan alat kaliper yang menyatakan besarnya aktivitas antibakteri.
Penentuan nilai KHM dan KBM (Mukesh et al. 2011; Doughari 2006) Penentuan nilai KHM (konsentrasi hambat minimum) dan KBM (konsentrasi bunuh minimum) dilakukan dengan metode dilusi. Ekstrak etanol
29
sebanyak 1 ml dengan berbagai konsentrasi (1000 ppm sampai 15.625 ppm) dikontakkan dengan 1 ml media NB yang telah mengandung bakteri uji. Masingmasing dimasukan dalam tabung reaksi, kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Konsentrasi ekstrak yang bening secara visual (tidak terdapat pertumbuhan bakteri) dideskripsikan sebagai nilai KHM. Konsentrasi ekstrak yang bening dicampur dengan media NA pada cawan petri, kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Nilai KBM ditentukan pada konsentrasi ekstrak terkecil dimana pada media tidak terdapat pertumbuhan koloni bakteri.
Pengujian aktivitas antioksidan (Armoskaite et al. 2011; Batubara et al. 2009) Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH. Ekstrak kulit buah langsat dibuat dengan berbagai konsentrasi (2000 ppm sampai 31.25 ppm) dalam etanol . Sebanyak 100 µl ekstrak dimasukin kedalam well plate dan tambahkan 100 µl larutan DPPH (1.18 mg DPPH dalam 10 ml etanol). Kemudian inkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit, setelah itu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 517 nm dengan alat elisa reader. Sebagai kontrol posistifnya digunakan BHT dengan konsentrasi 20 sampai 6.25 ppm dan etanol sebagai blanko. Setiap perlakuan dilakukan dua kali pengulangan. Persen inhibisi dihitung berdasarkan rumus : % inhibisi = 1- (absorbansi sampel/absorbansi blanko) x 100 %. Nilai konsentrasi hambat 50 % (IC50) dihitung dengan menggunakan persamaan regresi yang menyatakan hubungan antara konsentrasi sampel (sumbu x) dengan persen inhibisi (sumbu y).
Uji kandungan total fenol (Ramamoorthy dan Bono 2007) Uji kandungan total fenol dilakukan untuk mengetahui jumlah fenol yang terdapat pada ekstrak kulit buah langsat. Metode yang dipakai mengacu pada metode Ramamoorthy dan Bono (2007) yang dimodifikasi. Ekstrak kasar dengan berat 10 mg dilarutkan dengan 10 ml etanol 95%. Kemudian pipet 2 ml dan tambahkan 5 ml akuades dan 0,5 ml reagen Folin-Ciocalteau 50% (v/v). Campuran didiamkan selama 5 menit dan ditambahkan 1 ml Na2CO3 5% (b/v).
30
Campuran dihomogenkan lalu diinkubasi dalam kondisi gelap selama satu jam. Setelah inkubasi, campuran tersebut diukur dengan spektrofotometer UV-Visible pada panjang gelombang 725 nm. Asam tanat digunakan sebagai standar dengan konsentrasi 10, 30, 50, 70, dan 100 ppm. Kandungan total fenol diinterpretasikan sebagai milligram ekivalen asam tanat (TAE = Tanin Acid Equivalent) per gram sampel (mg TAE/g sampel).
Optimasi proses ekstraksi kulit buah langsat Optimasi proses ekstraksi kulit buah langsat diawali dengan percobaan pendahuluan proses ekstraksi dengan gelombang mikro dan pembandingan beberapa teknik ekstraksi yang bertujuan untuk menentukan teknik ekstraksi terbaik yang akan digunakan pada proses optimasi. Ekstraksi dengan gelombang mikro Faktor yang dikaji pada metode ekstraksi dengan gelombang mikro adalah daya gelombang mikro dan waktu ekstraksi. Pelarut yang digunakan adalah pelarut etanol yang merupakan pelarut terbaik pada tahapan percobaan sebelumnya. Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) faktorial dengan 2 faktor dan 2 kali ulangan. Masing-masing faktor yang dikaji disajikan pada Tabel 3. Data yang diperoleh dianalisis secara statistika menggunakan analisis keragaman (ANOVA) dan dilajutkan dengan uji beda Duncan. Tabel 3 Faktor dan level faktor yang dikaji pada proses ekstraksi kulit buah langsat dengan gelombang mikro Perlakuan Faktor A : daya gelombang mikro Faktor B : waktu ekstraksi (watt) (menit) A1 : 80 B1 : 1 menit A2 : 240 B2 : 3 menit A3 : 400 B3 : 5 menit A4 : 560 B4 : 7 menit B5 : 9 menit Pelarut etanol 70%, perbandingan bahan dan pelarut 1:10 (w/v)
Pelaksanaan penelitian ekstraksi dengan gelombang mikro adalah sebagai berikut. Kulit buah langsat kering direndam dalam pelarut etanol 70% dengan perbandingan 1:10(b/V) dan diekstraksi pada daya gelombang mikro dan waktu
31
ekstraksi sesuai perlakuan. Campuran tersebut kemudian disaring dan filtrat hasil penyaringan dipekatkan dengan vakum evaporator. Ekstrak yang diperoleh diukur kandungan total fenol. Pembandingan proses ekstraksi Pembandingan proses ekstraksi bertujuan untuk menentukan proses ekstraksi yang secara kuatitatif dapat meningkatkan efisiensi ekstraksi. Proses ekstraksi kulit buah langsat dilakukan dengan beberapa teknik ekstraksi yaitu ekstraksi dengan gelombang mikro, maserasi, dan refluks. Proses ekstraksi dengan cara refluks dilakukan dengan merendam serbuk kulit buah langsat sebanyak 25 g dalam pelarut etanol 70% dengan perbandingan 1:10 (b/v) selama 6 jam disertai pengadukan, dan direfluks selama 3 jam pada suhu 50 oC. Hasil refluks disaring dan dipekatkan dengan vakum evaporator. Ekstrak yang diperoleh diukur kandungan total fenol. Optimasi proses ekstraksi Optimasi proses ekstraksi kulit buah langsat dilakukan dengan teknik ekstraksi terbaik pada tahapan sebelumnya yaitu tahapan hasil pembandingan proses ekstraksi. Optimasi proses ekstraksi dilakukan dengan metode permukaan respon (RSM) menggunakan historical data ekstraksi dengan gelombang mikro. Untuk membantu penyelesaian optimasi digunakan perangkat lunak Design Expert 7.
