10
METODE Desain, Tempat, dan Waktu Desain studi yang digunakan pada penelitian ini adalah uji klinis acak tersamar ganda (Randomized double blind clinical trial). Penelitian ini dilakukan 3 kecamatan yaitu kecamatan Dramaga dan Ciampea (Kabupaten Bogor) serta Kecamatan Bogor Tengah (Kota Bogor). Intervensi dilakukan selama 8 minggu. Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian payung dengan judul Studi Efikasi Intervensi Minyak Kelapa Sawit yang Diperkaya Plant Sterol Untuk Memperbaiki Profil Lipid Darah dan Status Inflamasi Pada Penderita Hiperlipidemia (Dewi et al. 2013) yang dibiayai oleh BASF Nutrition and Health Research Grant, Asia. Penelitian ini telah mendapat persetujuan etik dari Komisi Etik Penelitian Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro/RSUP Dr. Kariadi Semarang No. 333/EC/FK/RSDK/2012. Kriteria, Cara Pemilihan dan Jumlah Subjek Kriteria Sindroma Metabolik yang digunakan adalah kriteria berdasarkan konsensus dari IDF, NHLBI, AHA, WHF, IAS, dan IASO (Alberti et al, 2009) yang disajikan pada Tabel 1. Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah 1) wanita dan pria dengan umur 4060 tahun. 2) memenuhi 3 dari 5 kriteria Sindroma metabolik. 3) Bersedia berpartisipasi dan menandatangani informed consent. Kriteria esklusi pada penelitian ini memenuhi salah satu dari kriteria berikut : 1) Hiperlipidemia sekunder 2) menderita diabetes mellitus atau gula darah puasa > 126 mg/dl. 3) Indeks massa tubuh > 35 kg/m2. 4) Menggunakan obat penurun kolesterol selama penelitian 5) Menderita penyakit pencernaan kronis maupun penyakit lain yang berat. Tabel 1. Kriteria Sindroma Metabolik Sindrom Metabolik apabila memiliki 3 dari 5 kriteria dibawah ini. Obesitas Sentral Lingkar perut/abdomen (untuk Asia Selatan: Cina, Melayu, Asia-India) Pria : ≥ 90 cm ; Wanita : ≥ 80 cm Trigliserida (TG) ≥ 150 mg/dL (1.7 mmol/L) atau dalam pengobatan dislipidemi Kolesterol-HDL Pria : < 40 mg/dL (1.03 mmol/L) Wanita : < 50 mg/dL (1.29 mmol/L) Atau dalam pengobatan dislipidemi Tekanan Darah sistolik BP ≥ 130 mm Hg diastolik BP ≥ 85 mm Hg atau dalam pengobatan obat anti-hipertensi Gula Darah Puasa (GDP) GDP ≥ 100 mg/dL (5.6 mmol/L),
Jumlah sampel minimal dihitung dengan menggunakan rumus :
[
]
2
2
n = 2σ 2 Z1−α / 2 + Z1− β / (∂ )
11 Penelitian ini menggunakan selang kepercayaan sebesar 95% dan power test sebesar 80% dengan standar deviasi kolesterol total dari penelitian sebelumnya yaitu 22 mg/dl (Mijares et al. 2011). Perubahan kadar kolesterol total antara kontrol dan perlakuan sebesar 6% maka jumlah subjek minimal yang dibutuhkan yaitu 14 orang untuk setiap kelompok. Untuk mencegah drop out maka pada penelitian ini merekrut 15 orang untuk setiap kelompok. Pemilihan subjek pada penelitian ini mengikuti protokol pada penelitian payung. Tahap pertama dilakukan sosialisasi penelitian dan undangan untuk berpartisipasi pada warga yang berusia 40-60 tahun di kelurahan lokasi penelitian. Setelah dilakukan penjelasan, subjek yang bersedia diminta untuk menandatangani informed consent. Tahap selanjutnya adalah screening kadar kolesterol dengan pemeriksaan finger prick test dengan alat easy touch cholesterol kit. Subjek yang memiliki kadar kolesterol di atas 200 mg/dl diikutsertakan dalam pemeriksaan lanjutan yang meliputi pemeriksaan antropometri dan biokimia darah (GDP dan profil lipid). Subjek yang masuk dalam kriteria SM diikutsertakan pada penelitian ini. Jumlah subjek dari penelitian payung yang memenuhi kriteria SM dan diikutsertakan dalam penelitian ini sebanyak 30 orang dan dibagi secara acak menjadi kelompok kontrol (K) sebanyak 15 subjek dan kelompok perlakuan sebanyak 15 subjek. Bahan dan Alat Minyak sawit yang digunakan adalah RBDPO (Refine, Bleached, and Deodorized Palm Oil) atau secara umum disebut sebagai minyak sawit. Minyak sawit untuk kelompok perlakuan yaitu minyak goreng yang telah diperkaya dengan 65 g fitosterol ester dalam 1 kg minyak (6.5% w/w). Fitosterol ester yang digunakan yaitu Vegapure 95 FF® berasal dari derivasi kedelai yang mengandung campesterol, stigmasterol dan beta-sitosterol. (Cognis 2008). Proses pencampuran dilakukan dengan cara memanaskan minyak sawit hingga suhu 30-40oC untuk meningkatkan kelarutan dan memanaskan Vegapure 95 FF® hingga suhu 50-70oC. Lalu mencampurkan kedua bahan tersebut dan mengaduk secara konstan hingga bercampur sempurna, proses pencampuran ini (filling) dilakukan dengan nitrogen (Cognis 2008). Pada kelompok kontrol diberikan minyak sawit tanpa fitosterol. Seluruh proses produksi termasuk uji stabilitas minyak tersebut dilakukan oleh perusahaan minyak goreng multinasional. Kedua jenis minyak goreng tersebut memiliki penampakan, rasa dan warna serta kemasan yang tidak berbeda. Botol kemasan diberi label dengan kode 3 huruf yang dilakukan oleh pihak BASF yang tidak terlibat secara langsung pada penelitian ini. Kode tersebut dibuka setelah intervensi dan pengumpulan data penelitian selesai dilakukan. Peneliti maupun subjek tidak mengetahui kemasan minyak sawit mana yang diperkaya phystosterol dan yang tidak (double blind). Pelaksanaan penelitian Subjek sejumlah 30 orang terdiri dari 9 laki-laki dan 21 perempuan. Subjek tersebut diperoleh setelah dilakukan uji penapisan sesuai dengan protokol penelitian payung, subjek dilakukan pemeriksaan kolesterol total dengan alat portabel total cholesterol analyzer merk easytouch. Subjek yang memiliki kolesterol diatas 200 mg/dl akan dilakukan pemeriksaan antropometri, tekanan darah dan profil lipid darah. Selanjutnya subjek yang masuk kriteria sindroma metabolik diikutsertakan dalam penelitian ini.
12 Subjek dibagi dalam 2 kelompok yaitu kelompok perlakuan dan kontrol. Kelompok perlakuan mendapat minyak sawit yang diperkaya fitosterol sebanyak 6.5% w/w sedangkan kelompok kontrol mendapat minyak sawit yang sama namun tidak diperkaya fitosterol. Seluruh subjek diminta untuk menggunakan minyak sawit tersebut sebagai pengganti (substitusi) minyak goreng yang biasa dipakai sesuai dengan kebiasaan sehari-hari (habitual use) dan tidak diperkenankan mencampur dengan minyak goreng lain. Intervensi dilakukan selama 8 minggu. Sebanyak 2 liter minyak sawit didistribusikan setiap 2 minggu ke rumah subjek. Data konsumsi diperoleh dari wawancara enumerator pada subjek dengan menggunakan metode 24 hours-recall konsumsi pangan setiap 2 minggu. Pangan yang diolah menggunakan minyak goreng (misal digoreng, ditumis) dicatat secara lebih spesifik. Pengukuran antropometri, tekanan darah dan pengambilan sampel darah dilakukan 2 kali pada saat awal penelitian (baseline) dan akhir penelitian (endline). Pengukuran antropometri meliputi yaitu berat badan (BB), tinggi badan (TB), Indeks Massa Tubuh (IMT), lingkar abdomen/perut (LA), dan persentase lemak tubuh. Berat badan diukur menggunakan timbangan injak (ketelitian 0.1 kg) dan pengukuran tinggi badan menggunakan microtoise (ketelitian 0.1 cm). Lingkar abdomen diukur menggunakan meterline (ketelitian 0.1 cm). Persentase lemak tubuh diukur menggunakan alat Body Fat Monitoring OMRON HBF306 (ketelitian 4.1% dengan kisaran 4.0 – 50.0 %). Pengukuran tekanan darah dilakukan dengan menggunakan alat pengukur tekanan darah otomatis OMRON SEM-1 (ketelitian ±3 mmHg dengan kisaran 0-299 mmHg). Tekanan darah subjek diukur setelah subjek beristirahat minimal selama 15 menit. Tekanan darah diukur pada lengan kanan dengan posisi duduk. Pengambilan sampel darah dilakukan pada vena mediana cubiti oleh tenaga medis dengan mengikuti prosedur terstandar. Subjek dipuasakan selama minimal 8 jam sebelum pengambilan darah. Analisis biokimia darah dilakukan oleh laboratorium terakreditasi Prodia® Kota Bogor. Analisis Biokimia darah yang diperiksa meliputi gula darah puasa (GDP), kolesterol-total, kolesterol-HDL (HDL), kolesterol-LDL (LDL), trigliserida (TG). Metode analisis yang digunakan menggunakan metode standar yaitu GDP dengan metode heksokinase, kolesterol total dengan metode CHOD-PAP, LDL dan HDL dengan metode homogenous, TG dengan metode GPO-PAP . Analisis Profil Lipid Analisis profil lipid dilakukan di laboratorium Prodia Kota Bogor. Laboratorium tersebut telah mendapatkan akreditasi SNI ISO 15189. Preparasi sampel dilakukan di laboratorium prodia dengan waktu kurang dari 2 jam sejak pengambilan darah. Setelah dilakukan preparasi sampel, serum yang didapatkan disimpan di lemari pendingin dengan suhu terkontrol –20oC. Sampel dianalisis kurang dari 24 jam sejak pengambilan darah. Secara lebih detail analisis profil lipid dilakukan dengan cara sebagai berikut : Pengukuran Kadar Kolesterol Total Pengukuran kadar kolesterol total dilakukan dengan uji kolorimetrik enzimatis menggunakan Cholesterol Total Analysis kit. Kolesterol ditentukan setelah proses hidrolisis dan oksidasi secara enzimatis. Indikator quinoeimine terbentuk dari hasil
13 reaksi antara hidrogen peroksida dan 4-aminophenezone dengan adanya fenol dan peroksidase. Prinsi reaksi Kolesterol ester + H2O -----------> kolesterol + asam lemak Kolesterol + O2 -----------> kolesterol-3-one + H2O2 2H2O2 + 4-aminophenazone + phenol -------------> quinoneimine + 4H2O Pengukuran Kadar Kolesterol HDL Pengukuran kadar kolesterol HDL dilakukan dengan Cholesterol HDL Analysis kit. Sampel adalah serum yang berasal dari darah jantung yang diambil menggunakan spuit sesaat setelah tikus dimatikan dan dibedah. Pengukuran dilakukan dengan terlebih dahulu melakukan presipitasi terhadap lipoprotein densitas rendah (LDL dan VLDL) dan kilomikron. Presipitasi dilakukan dengan penambahan asam fosfotungstat dan ion magnesium(MgCl2). Setelah proses sentrifugasi, HDL dalam supernatan diukur menggunakan pereaksi kit untuk pengukuran kadar kolesterol (CHOD-PAP). a. Prosedur presipitasi. Sebanyak 200 µl serum darah dicampurkan dengan 500 µl pereaksi. Presipitasi yang telah diencerkan dengan akuabides (rasio 4:1), kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Setelah sentrifugasi pada 4000 rpm selama 10 menit, dihasilkan supernatan yang siap untuk dianalisis. b. Prosedur analisis 1) 200 ul serum + 500 ul pereaksi yang telah diencerkan dengan akuabides, diinkubasi selama10 mnt, lalu disentrifugasi selama 10 menit pada 4000 rpm. 2) Sebanyak 100 ul supernatan yang dihasilkan dicampur dengan 1000 ul pereaksi (kolesterol esterase, kolesterol oksidase, fenol, 4-aminoantipirin, peroksidase dan buffer. 3) Campuran diinkubasi pada suhu 37 C selama 5 menit. 4) Absorbansi dibaca pada λ=600 nm
Pengukuruan Kadar Trigliserida Analisis untuk mengukur kadar trigliserida serum dilakukan menggunakan Triglyceride Analysis Kit. Kadar trigliserida ditentukan setelah reaksi hidrolisis enzimatik dengan lipase. Indikator yang digunakan adalah quinoneimin yang dibentuk dari hidrogen peroksida, 4-amino-antipirin dan 4-klorofenol di bawah pengaruh katalitik dari peroksidase.
Sampel serum atau standar diambil sebanyak 10 µL dan dicampurkan dengan 1000 µL pereaksi kit, kemudian dimasukkan ke dalam tabung lalu dicampurkan sampai homogen. Campuran diinkubasi pada suhu 37 C selama 5 menit, dan
14 kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang (λ) 500 nm. Perhitungan kadar trigliserida dilakukan dengan menggunakan rumus:
Penetapan Kadar Kolesterol LDL Analisis kolesterol LDL menggunakan metode langsung sehingga dapat mengukur secara langsung kadar LDL-kolesterol dan dapat digunakan untuk memperkirakan kadar small dense LDL dengan menggunakan rasio kolesterol LDL /Apo B (Widiastuti 2003). Metode tersebut dengan menggunakan reaksi enzimatik, dimana pada reaksi awal LDL kolesterol diisolasi dengan protecting agent, kemudian ditambahkan enzim reaktan yang beraksi dengan LDL-kolesterol yang telah terisolasi. Kolesterol dipisahkan dari VLDL, kilomikron dan HDL, lalu dengan bantuan kolesterol esterasi dan kolesterol oksidase membentuk H202. H202 dengan aminoantipirin dengan bantuan peroksidase membentuk produk tidak berwarna. Pada reaksi pertama, LDL tetap. Pada reaksi kedua kolesterol terlepas dar LDL. Dengan koleserol esterase dan kolesterol oksidase membentuk H2O2 yang kemudian dengan aminoantipirin dan DSBT dengan bantuan enzim peroksidase akan memberikan hasil berwarna. Warna yang dihasilkan adalah biru. Intensitas warna menunjukkan kadar LDL-kolesterol. Lalu diukur pada panjang gelombang 550nm Pengolahan dan Analisis Data Analisis data menggunakan perangkat lunak Microsoft Excel 2007. Konsumsi pangan dihitung menggunakan Daftar Komposisi Bahan Makanan Indonesia 2007/2008 (DKBM 2007/2008). Estimasi konsumsi minyak goreng dihitung menggunakan Daftar Konversi Penyerapan Minyak (DPM) (Hardinsyah & Briawan 1994). Estimasi konsumsi minyak goreng diperoleh dari perhitungan dengan menggunakan Daftar Konversi Penyerapan Minyak (DPM) dan Daftar Konversi Berat Mentah Matang (DMM). Berat minyak yang diserap makanan diperoleh dari perkalian antara faktor konversi penyerapan minyak (DPM) dengan berat makanan dalam bentuk mentah. Untuk mendapatkan berat makanan dalam bentuk mentah, maka berat makanan masak dikonversi terlebih dahulu menjadi berat mentah dengan menggunakan DMM. DMM memuat angka perbandingan berat bahan sebelum dan setelah diolah. Berat mentah diperoleh dari hasil perkalian antara DMM dengan berat masak. Estimasi asupan fitosterol dihitung berdasarkan konsumsi minyak goreng dan tingkat retensi. Retensi fitosterol dipengaruhi oleh metode penggorengan dan tingkat pemanasan minyak goreng. Penelitian Salta et al 2008, untuk penggorengan pertama dengan menggunakan metode pan-frying didapatkan bahwa retensi fitosterol sebesar 80%, sedangkan dengan menggunakan metode deep-frying didapatkan retensi fitosterol sebesar 91%. Penelitian Winkler et al. (2008), dengan metode deep frying didapatkan retensi fitosterol berkisar antara 87 – 93%. Pada penelitian ini hampir seluruh minyak goreng digunakan untuk menggoreng menggunakan metode deep frying dan dipakai untuk 1 kali penggorengan. Oleh karena itu, pada penelitian ini nilai retensi fitosterol yang dipakai untuk perhitungan adalah sebesar 90%. Estimasi asupan fitosterol dilakukan dengan menghitung konsumsi minyak goreng dikalikan
