Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství

Choroby jetele lučního způsobované virovými patogeny a fytoplazmami Bakalářská práce

Vedoucí práce: doc. Ing. Radovan Pokorný, Ph.D. Brno 2010

Vypracovala: Marie Orságová

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Choroby jetele lučního způsobované virovými patogeny a fytoplazmami vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.

Dne………………………………………… Podpis diplomanta…………………………..

Poděkování Za ochotu, nápomocný přístup a za poskytnutí zázemí své firmy děkuji Ing. Haně Jakešové, CSc. a jejím spolupracovníkům. Za příjemný pobyt v Českých Budějovicích a poskytnuté informace děkuji Ing. Janě Fránové, Ph.D. a kolektivu. Za poklidné vedení bakalářské práce jsem vděčna doc. Ing. Radovanu Pokornénu, Ph.D.

Abstrakt Viry a fytoplazmy negativně ovlivňují kvalitativní a kvantitativní vlastnosti jetelů. Snižují především výnos píce. Zdravé jetele lze získat vyšlechtěním na rezistenci. K tomu je potřeba viry a fytoplazmy dobře prostudovat. Příznaky virových a fytoplazmových chorob byly na jaře a v létě roku 2009 pozorovány a fotografovány v kmenových školkách jetelů (Trifolium pratense, T. medium a T. ambiguum) Ing. Hany Jakešové, CSc. v Hladkých Životicích. Výsledky detekce virů a fytoplazem u vybraných jetelů sérologickou analýzou ELISA a molekulárními metodami poskytlo Biologické centrum AV ČR, v. v. i. ÚMBR. Příznaky na rostlinách byly popsány a výsledky detekce komentovány. Klíčová slova: jetele, virus, fytoplazmy, ELISA, RT-PCR

Abstract The viruses and phytoplasmas have a negative impact on qualitative and quantitative traits of clover. Mainly the decrease in forage yield is caused. Healthy clovers can be get by breeding for resistance. Knowledge of viruses and phytoplasmas is necessary for it. The symptoms of diseases caused by viruses and phytoplasmas were observed and photographed in clovers breeding nurseries (Trifolium pratense, T. medium a T. ambiguum) from Ing. Hana Jakešová, CSc. in Hladké Životice in spring and summer 2009. The results of detection viruses and phytoplasmas by serological test (ELISA) and molecular analyses at the chosen clovers were done by Biologické centrum AV ČR, v. v. i. ÚMBR. The symptoms on plants were described and the results of detection were commented. Key words: clover, virus, phytoplasma, ELISA, RT-PCR

OBSAH 1. ÚVOD............................................................................................................................7 2. CÍL PRÁCE...................................................................................................................9 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED.............................................................................................10 3.1. Jetel luční......................................................................................................10 3.1.1. Morfologie a fyziologie jetele lučního...........................................11 3.1.2. Rozšíření........................................................................................12 3.1.3. Význam pěstování jetele................................................................13 3.1.4. Agrotechnika..................................................................................14 3.1.5. Historie a šlechtění jetele...............................................................15 3.1.6. Šlechtitelské cíle a metody.............................................................16 3.1.6.1. Polyploidizace.................................................................17 3.1.7. Škůdci a choroby jetele lučního.....................................................18 3.1.8. Jetel prostřední a jetel kavkazský...................................................21 3.2. Viry (Vira)....................................................................................................22 3.2.1. Životní cyklus virů.........................................................................22 3.2.2. Příznaky viróz na rostlinách...........................................................23 3.2.3. Detekce virů...................................................................................23 3.2.4. Systematika virů.............................................................................24 3.2.5. Virové choroby na jeteli.................................................................25 3.3. Fytoplazmy...................................................................................................29 3.3.1. Historie...........................................................................................31 3.3.2. Detekce fytoplazem........................................................................32 3.3.3. Fytoplazmy na jeteli.......................................................................33 4. MATERIÁL A METODY...........................................................................................35 4.1. Lokalita.........................................................................................................35 4.2. Pozorování příznaků a detekce patogenů......................................................36 4.3. Charakteristika metod...................................................................................37 5. VÝSLEDKY A DISKUZE..........................................................................................39 6. ZÁVĚR........................................................................................................................41 7. SEZNAM UŽITÉ LITERATURY..............................................................................42 8. SEZNAM OBRÁZKŮ................................................................................................48

1. ÚVOD Jetel luční patří k našim nejdůležitějším pícninám. Pro zemědělské podniky se živočišnou výrobou je vhodné jej pěstovat pro vysokou produkci kvalitní píce (SELGEN A. S., 2010). Nejlepší krmivo pochází ze zdravých rostlin, které jsou chutné, dobře stravitelné a získává se z nich vysoký výnos biomasy. Rostliny bez patogenů určitě také lépe fixují vzdušný dusík a obohacují jím půdu. Mohutný kořenový systém vytahuje z hloubky důležité prvky, které jsou po odumření a dekompozici biomasy jetele, přístupné dalším rostlinám kořenícím mělce. Vyjmenované aspekty poukazují na důležitost pěstování zdravého neinfikovaného jetele. Bohužel porosty jetele bývají často napadány kromě škůdců i houbovými a bakteriálními patogeny a méně známými virovými a fytoplazmovými původci onemocnění, kteří způsobují nemalé škody na kvalitě a kvantitě biomasy. K eliminaci virů a fytoplazem je jistě zapotřebí je nejprve důkladně poznat a popsat. Charakterizovat jejich životní nároky, jejich stavbu a fyziologii, rozmnožování, přenos na hostitele, vektory, rozšíření a také je třeba jejich přítomnost v jeteli prokázat. Okem viditelné příznaky na rostlinách většinou nemohou indikovat specifického původce. Někdy se původce choroby dokonce neprojevuje a způsobuje latentní infekce. Ale díky imunologickým a molekulárním analýzám nebo pomocí elektronového mikroskopu lze jednotlivé druhy virů či fytoplazem detekovat a odlišit. Tyto metody velice pomáhají při diagnostice virů a fytoplazem ve šlechtitelském materiálu. Ulehčují selektovat zdravé rostliny, které mohou být patogenům tolerantní nebo rezistentní a které se uplatňují v dalším šlechtitelském procesu. Výsledné odrůdy by potom měly poskytovat zdravý a velký výnos. V bakalářské práci přibližuji problematiku jetele a jeho chorob a to hlavně virových a fytoplazmových onemocnění. V praktické části jsem pozorovala jetele ve šlechtitelských školkách soukromé šlechtitelky jetelů a trav Ing. Hany Jakešové, CSc. v Hladkých Životicích a porovnávám je s výsledky Biologického centra AV ČR, v. v. i. ÚMBR (Biologické centrum akademie věd České republiky, veřejná výzkumná instituce, Ústav molekulární biologie rostlin s hlavní řešitelkou Ing. Janou Fránovou, Ph.D.), kde byly jetele Ing. Jakešové analyzovány. Práci jsem řešila v rámci projektu „Diagnostika virů a fytoplazem ve šlechtitelském materiálu jetele lučního“, identifikačního kódu QH71145, financovaným Ministerstvem zemědělství České republiky. Doba řešení: 05/2007 – 12/2011. Cílem projektu je charakterizovat nově

7

nalezené viry a fytoplazmy jetele lučního z různých lokalit České republiky, vyvinout a aplikovat metody jejich detekce pro zlepšení zdravotního stavu výchozího šlechtitelského materiálu pro vyšlechtění nové odrůdy. Mé poznatky o pěstování jetele lučního a s ním spojenými problémy se začaly prohlubovat od roku 2007, kdy jsem nastoupila jako brigádnice u Ing. Jakešové. Následující dva roky jsem pracovala buď u Ing. Jakešové nebo na Šlechtitelské stanici Hladké Životice. Při výběru tématu bakalářské práce jsem oslovila Ing. Jakešovou, zda by měla dobrý nápad a zájem poskytnout mi zázemí její firmy a s prací mi poradit. Byla velmi ochotná a souhlasila. Poté jsem vyhledala vedoucího práce, doc. Ing. Radovana Pokorného, Ph.D. a téma dostalo název „Choroby jetele lučního způsobované virovými patogeny a fytoplazmami“.

8

2. CÍL PRÁCE Cílem práce bylo prostudovat dostupnou literaturu, seznámit se s problematikou tématu a následně vypracovat literární rešerši zaměřenou na charakteristiku několika druhů z rodu Trifolium. Popsala jsem také nejdůležitější patogeny jetelů, přičemž důraz jsem kladla na virové patogeny a fytoplazmy. V praktické části jsem měla na zvoleném stanovišti pozorovat napadení jetele viry a fytoplazmami. Výsledky jsem měla zpracovat do tabulek a doplnit fotografiemi a porovnat výsledky determinace patogenů se symptomy, které způsobovaly.

9

3. LITERÁRNÍ PŘEHLED

3.1. Jetel luční Jetel luční (Trifolium pratense L.) je dvouděložná rostlina. Řadí se do čeledi bobovitých (Fabaceae). Zobrazen je na obr. 1. Jetel je mimořádně proměnlivý, a proto můžeme mezi rostlinami např. z různých stanovišť najít mnoho odlišností.

Obr. 1: Litografie Otta Wilhelma Thomého z roku 1885 detailně ukazuje jednotlivé části jetele lučního (WIKIMEDIA.ORG, 2008)

10

V této bakalářské práci uvádím obecný popis jetele lučního, jeho výskyt, formy, pěstování, význam, historii, šlechtění a jeho nejdůležitější škůdce a choroby. Kromě toho se v práci zabývám i jeteli jiných druhů – Trifolium medium a Trifolium ambiguum, a tudiž bude zařazena zmínka i o nich.

3.1.1. Morfologie a fyziologie jetele lučního Kořenová soustava je rozložena v orniční a podorniční vrstvě s typicky mohutným kůlovým kořenem sahajícím do hloubky 1,5 – 2 m (SKLÁDANKA, 2005). U kořenů bobovitých rostlin je velmi důležitá symbióza s bakteriemi schopnými asimilovat vzdušný dusík (Rhizobium leguminosarum). Bakterie uvolňující cytokininy a auxiny stimulují pletivo kořenů ke vzniku hlízek. Bakterie vlastně zprvu parazitují na bobovité rostlině a teprve od určité doby jsou zelené rostlině užitečné. Bakterie fixují totiž vzdušný dusík i pro potřebu bobovité rostliny, která bakterie zásobuje potřebnými živinami. Po odumření kořene se hlízky (nádorky) rozpadají a obohacují dusíkem půdu (PROCHÁZKA ET AL., 2006). Na přechodu mezi kořenem a bazální nadzemní částí se nachází kořenový krček. Představuje centrum tvorby nových lodyh. Podle stavby kořenového krčku můžeme jeteloviny rozdělit na trsnaté (vzpřímené lodyhy vhodné k seči, např. u Trifolium pratense) a výběžkaté (poléhavé lodyhy, rostliny pastvin, např. Trifolium repens). Pupeny se na kořenovém krčku zakládají v horizontální poloze, což podporuje konkurenční schopnost jetele lučního a jeho uplatnění v jetelovinotravních porostech. Nevýhodou horizontálního uspořádání pupenů je náchylnost k vymrzání (SKLÁDANKA, 2005). Počet lodyh je závislý na prostředí. Jeteloviny mají značnou kompenzační schopnost, se snižujícím se počtem rostlin na ploše stoupá počet lodyh na rostlině (SKLÁDANKA, 2005). Lodyhy bývají hranaté, přímé nebo krátce vystoupavé, řídce větvené s 3 – 5 články. Rostou do výšky 20 – 50 cm (často až 100 cm) (DOSTÁL, 1989). Listy jsou střídavé trojčetné. Dolní listy bývají dlouze řapíkaté, prostřední a horní s krátkými řapíky až téměř přisedlé; lístky jsou celokrajné obvejčité až okrouhlé, 1 – 7 cm dlouhé. Často mívají příčnou půlměsíčitou bělavou nebo červenohnědou skvrnu (SLAVÍK

AJ.,

1995). Někdy se na jeteli vytvářejí listy čtyřčetné i vícečetné, což je

způsobeno mutacemi. 11

Karmínově až masově červené květy jsou uspořádany ve vícekvětých, kulovitých nebo vejčitých hlávkách (často po 2 hlávkách). Korunní lístky jsou na bázi s tyčinkami srostlé v trubku obsahující nektar. Jetel luční kvete od května do září a mnohdy až do pozdního podzimu (GRAU

ET

AL.,

1996). Jetel je hmyzosnubný, cizosprašný,

autoinkompatibilní. Je významným zdrojem nektaru pro čmeláky a motýly a hostitelskou rostlinou pro housenky různých druhů denních motýlů (Colias crocea, Colias hyale, Cyaniris semiargus, Everes argiades) (SKLÁDANKA, 2005). Je významnou medonosnou rostlinou. Plodem je jednosemenný lusk. Semena jsou vejčitá až tupě trojhranná, hladká, lesklá, citronově žlutá až fialová o velikosti 1,5 – 2,3 mm x 1,2 – 2,0 mm (obr. 2) (SKLÁDANKA, 2005). Jetel luční je vytrvalý, tedy jeho planá forma. Kulturní formy mají vytrvalost 2 – 3 roky.

Obr. 2: Porovnání velikosti semen, vlevo 4n, vpravo 2n (PBHZ, 2010)

3.1.2. Rozšíření Jetel luční se rozšířil téměř po celé Evropě, na severu po 70° s.š., na východ zasahuje do západní Asie po Altaj, Bajkal a severní Indii. Je zavlečený, zdomácnělý a pěstovaný ve východní Asii, v Severní i Jižní Americe, v Austrálii, na Novém Zélandu a v jižní Africe. Rostliny v České republice patří ke třem poddruhům, které bývají někdy hodnoceny jako odrůdy: •

Subsp. americanum – jetel luční americký (kultivary vyšlechtěné v Americe a pěstované v Evropě)

•

Subsp. pratense – jetel luční pravý (planý)

•

Subsp. sativum – jetel luční setý (pícnina) (SLAVÍK ET AL., 1995)

12

Jetel luční pravý roste na lukách, polích, ve světlých lesích, na výživných půdách, vystupuje do výšky přes 3000 m (GRAU ET AL., 1996). Trifolium pratense subsp. sativum představuje jednu z nejvýznamnějších pícnin. V českých zemích se pěstuje ve větší míře od roku 1771 (SLAVÍK ET AL., 1995).

3.1.3. Význam pěstování jetele Jetel luční patří k nejdůležitějším pícninám České republiky. Pro zemědělské podniky s živočišnou výrobou je vhodné pěstovat jej pro vysokou produkci kvalitní píce, kterou přednostně využívají v čerstvém stavu pro přímé krmení po podstatnou část vegetačního období. Píce je chutná a dobře stravitelná. Biomasa je také vhodná ke konzervaci sušením či senážováním (SELGEN

A. S.,

2010). Kromě produkce píce

přináší jetel luční i další výhody: •

Obohacuje půdu o dusík fixovaný z ovzduší a o organickou hmotu z posklizňových zbytků.

•

Zlepšuje fyzikální, biologické a agrochemické vlastnosti půdy. Jetel luční vykazuje vysokou předplodinovou hodnotu (dochází k regeneraci půdní úrodnosti), která se projeví ve zvýšení produkce následně pěstovaných plodin.

•

Vyznačuje se vysokým obsahem dusíkatých látek a vodorozpustných cukrů, v porovnání s vojtěškou i širším úživným poměrem. (SELGEN A. S., 2010)

•

Odplevelovací

účinek

(vysoká

konkurenční

schopnost,

vysoká

pokryvnost listová, častá frekvence sečí). (SKLÁDANKA, 2005) •

Léčebné využití: zevně k léčbě ekzémů a lupénky, vnitřně na zklidnění trávicího ústrojí, při potížích v klimakteriu, kašli, bronchitidě a černém kašli a také proti rakovině (CASTLEMAN, 2004). Obsahuje látky jako třísloviny, kumariny,

saponiny, kyanogenní glykosidy,

fenolické

glykosidy. Nadějný zdroj flavonoidů a isoflavonoidů pro výrobu léčiv. (KAŠPAROVÁ, 1996)

13

•

Mladé listy jsou připravovány jako zelenina podobně jako špenát. V Irsku a Skotsku se vyrábí ze sušených květů pěchovaný chléb zvaný „thambrak“ (GRAU ET AL., 1996).

3.1.4. Agrotechnika

Jetel luční setý je pěstován na orné půdě. Má obdobné požadavky na stanoviště jako travní druhy. Z tohoto důvodu je jetel luční velmi vhodným komponentem do jetelovinotravních společenstev a je vhodný pro luční využívání. Základní výsevek je 7 – 9 MKS (15 – 20 kg.ha-1). Hnojení se provádí podle půdní zásoby jednotlivých prvků. Fosfor 25 – 40 kg.ha-1, draslík 80 – 150 kg.ha-1. Pro posílení kontrakce kořenového krčku a snížení nebezpečí poškození rostlin nízkými teplotami je nutné provést na jaře válení (SKLÁDANKA, 2005). V současné době slouží jetel luční jako významný přerušovač v osevních postupech s vysokým zastoupením obilnin. Nevhodné jsou pozemky vysušené nebo setí po předplodinách s nebezpečím reziduálního působení herbicidů (např. po řepce ozimé). Jetel luční nevyséváme na stejný pozemek po sobě dříve než za 4 roky. Při umístění množitelských porostů diploidních odrůd je třeba dodržet normou stanovené prostorové izolační vzdálenosti jednak od jiných diploidních odrůd a hlavně pak od odrůd tetraploidních. V uznávaných množitelských porostech je závažným problémem hlavně zaplevelenost. Z porostů odstraňujeme parazitické kokotice a zárazy a dále šťovíky a knotovky, které patří mezi obtížně čistitelné plevele z osiva (SELGEN A. S., 2010). Jetele sečeme jednou až dvakrát do roka. Jednosečné jetele se vyznačují mohutným vzrůstem (80 – 100 cm vysoké, 8 – 13 lodyžních článků), mohutným kořenovým systémem a větší odolností vůči suchu. Kultivary dvousečných jetelů dorůstají u nás menší výšky (5 – 7 internodií) a jsou poměrně náročné, citlivé na nedostatek vláhy, humusu a některých živin. Tetraploidní kultivary poskytují zpravidla vyšší výnos kvalitnější píce (10 - 12 t.ha -1) a jsou ve srovnání s diploidními (6 - 8 t.ha-1) více vytrvalé (SLAVÍK

ET AL.,

1995). Potenciál je až 18 t.ha-1 v prvním

užitkovém roce. Maximální produkce je dosahováno v prvním užitkovém roce, ve druhém užitkovém roce klesá produkce na 60 %. Nejvyšší kvalita píce je na počátku butonizace. Jednotlivé seče jsou přibližně stejné kvality. Není vhodný pro sušení

14

na zemi, protože lodyhy pomaleji zasychají a listy se odrolují. Je vhodný pro silážování (SKLÁDANKA, 2005).

3.1.5. Historie a šlechtění jetele Pro svou důležitou roli v raném zemědělství se stal jetel náboženským symbolem. Staří Řekové, Římané i Keltové v předkřesťanském Irsku jej drželi ve velké úctě. Raní křesťané bylinu spojovali se svatou Trojicí, někteří dokonce tvrdili, že jetel luční byl předlohou pro symbol Irska (tzv. shamrock). Také dal vzniknout karetnímu symbolu nahrazujícímu hole, také nazývané kříže. Ve středověku byl považován jetel luční za magický prostředek proti čarodějnictví. Ještě silnější byl čtyřlístek, který představoval kříž a čtyři složky štěstí, jimiž byly: zdraví, bohatství, sláva a věrný milenec (CASTLEMAN, 2004). Podle některých údajů (STEHLÍK, 1968) začali lidé pěstovat jetel v kultuře již ve 12. století a pravděpodobně i dříve. Většího významu však začal nabývat v Evropě teprve v 16. století a hlavně v 17. a 18. století. K většímu rozšíření jetele došlo teprve po rozbití feudálního úhorového systému hospodaření, kdy se vytvořily vhodné podmínky pro uplatnění jeho předností. Vývoj pěstování jetele v českých zemích popisuje JAKEŠOVÁ, SVĚTLÍK (2002). Jetel luční se v našich zemích začal ojediněle pěstovat v 18. století. Nejvíce se však jeho pěstování rozšířilo v 19. století. První šlechtitelská stanice byla založena v Měšicích u Tábora roku 1893, kde Ing. J. Kolář vyšlechtil odrůdu jetele Táborský. Za prvého specializovaného pícnináře je však považován prof. Dr. K. Holý, který se nejvíce zasloužil o rozvoj šlechtění a semenářství jetelovin a trav v jihočeské oblasti. Šlechtění jetele lučního se záhy rozšířilo i na další vhodná šlechtitelská pracoviště mimo oblast jižních Čech, především do Polabí, na Hanou, Třebíčsko, Litomyšlsko a Jičínsko. V Chlumci nad Cidlinou byly vyšlechtěny dvě odrůdy, z nichž jedna dala základ odrůdě Chlumecký. V Horních Moštěnicích byl v roce 1940 vyšlechtěn Ing. Hudcem jetel luční Přerovský. Několik odrůd bylo vyšlechtěno ve šlechtitelské stanici Slavice známým pícninářským odborníkem Dr. J. Vařečkou. Dále ve šlechtitelské stanici Jičín - Soudná, kde působil šlechtitel Ing. A. Klimeš, byl vyšlechtěn jetel Jičínský (1943). V Domoradicích byla vyšlechtěna odrůda Start, která je standardní odrůdou našeho diploidního sortimentu. 15

Velkým přínosem ve šlechtění jetele lučního bylo zavedení polyploidizace (viz níže) diploidních odrůd. Touto problematikou se zabývali od roku 1962, po nástupu Ing. A. Fojtíka, CSc., především pracovníci šlechtitelské stanice v Hladkých Životicích. V tomto období vzešla ze spolupráce šlechtitelů jetelů z Československa, Polska a tehdejší Německé demokratické republiky většina dnes povolených tetraploidních odrůd. Spolupráce byla přínosná hlavně kvůli výměně výchozích materiálů jak na diploidní, tak na tetraploidní úrovni a bylo započato s rezistentním šlechtěním na houbu Sclerotinia trifoliorum a houby rodu Fusarium. Získané tetraploidní odrůdy přispěly vyšším výnosem zelené i suché píce k intenzifikaci polního pícninářství. Podle údajů ÚKZUZU bylo k 15. 6. 2009 zapsáno ve Státní odrůdové knize třicet pět odrůd jetele lučního, z toho devatenáct tetraploidních. Nejstarší odrůda Chlumecký je dokonce z roku 1935, dalšími dlouho registrovanými jsou: diploidní Start (1973), Radan (1981) a Tábor (1989); tetraploidní Kvarta (1974), Radegast (1978) a Tempus (1988). V roce 2009 byly zapsány odrůdy Agil, Brisk, Pavo a Spurt. Všechny jsou diploidní. Vyšlechtit odrůdu jetele lučního zapsanou v České republice se podařilo následujícím firmám: OSEVA UNI, a. s. v Chocni; AGROGEN, spol. s. r. o. v Troubsku; SELGEN, a. s. v Praze; Šlechtitelská stanice Hladké Životice, s. r. o.; TAGRO Červený Dvůr, spol. s. r. o. v Táboře a Centru výskumu rastlinnej výroby Piešťany.

3.1.6. Šlechtitelské cíle a metody Šlechtění je mnohaletý cílevědomý řízený proces. Spotřebitel by měl po šlechtitelích chtít určité vylepšení nedostatků stávajících odrůd a inspirovat je tak k dalším šlechtitelským cílům. Šlechtitelským cílem u jetele je podle CHLOUPKA (2000) adaptabilita (dnes hlavně k suchu), rezistence k houbám rodu Fusarium, k virům, k původci bílé hniloby jetele (Sclerotinia trifoliorum) a padlí (Erysiphe trifolii); vytrvalost, vysoký výnos píce a semene aj. Heritabilita v užším slova smyslu je u jetele lučního jak pro výnos píce, tak i pro vytrvalost nízká (14 – 17 %). Rezistence k padlí a ke rzi je dominantní a monogenická, rezistence k virům je trojího typu a řízená rozličnými dominantními geny. Odolnost k mšicím má vysokou heritabilitu, odolnost k háďátku zhoubnému je u jetele lučního řízena dvěma dominantními geny. 16

Za perspektivní selekční kritéria lze považovat antinutriční faktory, které např. zabraňují nadýmání zvířat po zkrmení píce, dále nízký obsah estrogenů. Ze šlechtitelských metod lze použít hromadné selekce, rekurentní fenotypové selekce a hodnocení klonů vedoucí k tvorbě syntetických populací, což je zřejmě nejprogresivnější metoda (CHLOUPEK, 2008). Genetická variabilita se získává křížením, pomocí rostlinných explantátů (suspenzními, protoplastovými kulturami a indukcí haploidů), mutagenezí či polyploidizací. 3.1.6.1. Polyploidizace Polyploidizace je genomová mutace. Jejím cílem je zvýšení chromozomových sádek na dvojnásobek (CHLOUPEK, 2008). Změna počtu chromozomů v buňce je jeden z nejdůležitějších zdrojů dědičné proměnlivosti organizmů v evolučním procesu a široce se využívá ve šlechtění rostlin. Polyploidie může vzniknout spontánně (v průběhu ontogeneze) nebo může být uměle vyvolána. Spontánní polyploidy se ve zvýšené míře nacházejí ve velkých nadmořských výškách, v severnějších zeměpisných šířkách a ve vzdálenějších oblastech od základního centra vývoje čeledí (BEDNÁŘ ET AL., 2008). Ze všech v současné době známých způsobů experimentálního získávání polyploidů je nejrozšířenější metoda zdvojení počtu chromozomů pomocí kolchicinu (alkaloid ocúnu jesenního). Dále se k indukci polyploidie používá oxid dusný. Uvedená činidla potlačují funkci dělícího vřeténka, čímž je inhibováno rozestupování dceřiných chromozomů k pólům a tak vzniká buňka se zdvojeným počtem chromozomů (= C-mitóza). Koncentrace použitého kolchicinu se různí v závislosti na pokusném rostlinném druhu (BEDNÁŘ

ET AL.,

2002). Podle CHLOUPKA (2008) lze k polyploidizaci využít křížení

stávajících tetraploidních odrůd. Detekce polyploidů se provádí nejčastěji cytologickou metodou (počítání chromozomů v cytogenetickém mikroskopickém preparátu) a flow cytometrickou analýzou, kde změnu počtu chromozomů signalizuje změna obsahu jaderné DNA (BEDNÁŘ ET AL., 2002). Nejobecnější vlastností polyploidů je zvětšení buněk a s tím spojené fyziologické a biochemické změny, např. zvýšení obsahu vody v buňkách, snížení osmotického tlaku, změna obsahu bílkovin, chlorofylu, růstových regulátorů, vitamínů atd. Tyto změny se mohou projevit změnou rezistence k patogenům, fyzikálním faktorům vnějšího prostředí apod. Často také dochází ke zvětšení rozměru rostlin a jejich jednotlivých orgánů (BEDNÁŘ, VYHNÁNEK, 2004). 17

Jetel luční se vyskytuje jako diploidní (2n = 14), ale byly vyšlechtěny i tetraploidní odrůdy (tab. 1). Polyploidizace jetele lučního vede k formám s vyšší produkcí čerstvé píce (v seně jsou rozdíly menší), s vyšší perzistencí (vytrvalostí), s vyšší odolností k padlí, ale takové formy mívají nižší výnos semen (CHLOUPEK, 2008). Tab. 1: Velikost genomu jetele lučního (JAKEŠOVÁ, KLIMO, 2002) Počet měření: 277 Průměrný relativní obsah DNA Směrodatná odchylka 2n (kontrola) 99,059 3,3778 4n 200,537 6,8517

Velikost genomu (pg) 1,00 2,02

3.1.7. Škůdci a choroby jetele lučního

Častým škůdcem jetele lučního je hraboš polní (Microtus arvalis). Každoročně jsou instalovány od podzimu do jara na pozemcích berličky k podpoře ptačích predátorů. Při přemnožení hrabošů je pak nutné využít nástrahové přípravky buď plošně nebo vkládáním do nor (SELGEN A. S., 2010). Listopasi rodu Sitona jsou nosatcovití brouci o velikosti 4 – 5 mm způsobující škody žírem na vzcházejících bobovitých rostlinách. Jejich larvy se vyvíjejí na kořenovém systému, kde vyžírají bakteriální hlízky. Jedná se především o druhy: listopas čárkovaný (Sitona lineatus), listopas pruhovaný (S. humeralis) a listopas zdobený (S. macularius) (ROTREKL, 2009). Významným škůdcem semenných porostů jsou nosatčíci rodu Apion, kteří škodí v hlávkách. Ošetření se provádí před kvetením druhé – semenné seče – použitím insekticidu (SELGEN A. S., 2010). Důležitou skupinou škůdců je hmyz se sacím ústním ústrojím, který při sání přenáší viry či fytoplazmy. Mezi tyto škůdce patří ploštice klopušky. ROTREKL (2009) uvádí, že škodí larvy i dospělci sáním na generativních orgánech. Poškozená poupata a květy opadávají a sáním na žlutých luscích se snižuje biologická hodnota osiva. Dalšími škůdci z řádu polokřídlí kromě ploštic jsou mšice (kyjatka hrachová, Acyrthosiphon pisum) a křísi (např. dle ŠINDELKOVÉ (2004) přenáší žilnatka vironosná fytoplazmu stolbur), z řádu stejnokřídlých třásněnky. Na jeteli lučním můžeme najít i cizopasné rostliny. Podle údajů VAVERKY (1995) se nejvíce vyskytuje kokotice jetelová (Cuscuta trifolii) a záraza menší (Orobanche

18

minor). Po kontaktu s hostitelem vytvářejí haustoria, která proniknou až do svazků cévních a odebírají živiny a vodu. Jetel luční může být hostitelem více než 60 druhů patogenních organismů, které mají vliv na vytrvalost, kvantitu a kvalitu sklizně. Největší ztráty způsobují choroby vaskulárního a kořenového systému, významné jsou samozřejmě i choroby nadzemních částí rostlin. Působení patogenů je predispozicí k napadení dalšími mikroorganismy, omezuje asimilační plochu (dochází ke snížení výnosů) a oslabuje rostlinu před zimou. Nezanedbatelná je také produkce širokého spektra antinutričních látek. Možnost ochrany spočívá ve výběru vhodné lokality a odrůdy, výsevu kvalitního certifikovaného osiva, dodržení základních pěstitelských zásad, moření osiva a aplikace pesticidů (NEDĚLNÍK, POKORNÝ, 2005). Následující choroby jetele lučního patří mezi nejzávažnější. Intenzivněji se pak problematikou virů a fytoplazem zabývají kapitoly 3.2. a 3.3. Padání klíčních rostlin jetele (seed rot and damping-off) Rané růstové fáze jsou ohroženy patogenními mikroorganismy, např. druhy rodů Pythium a Fusarium. Ve spojení s nevhodnými kultivačními podmínkami (zamokřený pozemek, nevyrovnaná výživa) dochází k padání klíčních rostlin a tím k výrazné redukci počtu jedinců již v okamžiku založení porostu. Pokud se k působení mikroorganismů přidá ještě žír brouků – listopasů, může dojít k totálnímu odumření vzcházejícího porostu (NEDĚLNÍK, POKORNÝ, 2005). Krčkové a kořenové choroby jetele V současné době jsou choroby kořenového systému hlavním limitujícím faktorem při pěstování jetele lučního. Patogeny se projevují poškozením pletiv kořenového krčku a kořenů, což je patrné na příčném i podélném řezu. Do tohoto komplexu patogenů můžeme zařadit původce bílé hniloby jetele (Sclerotinia crown and root rod) houbu Sclerotinia trifoliorum. Dříve byla choroba nesprávně označována jako rakovina jetele (NEDĚLNÍK, POKORNÝ, 2005). Choroba způsobuje hynutí jetelů během zimy. Napadené rostliny na jaře neobrážejí. Kořenový krček je zčernalý a uhnilý. Důkazem napadení je přítomnost černých 1,5 cm velkých tělísek – sklerocií – na povrchu nebo uvnitř pletiv (STEHLÍK, 1981). Šlechtěním nových odrůd a zlepšením technologií pěstování se bílou hnilobu podařilo eliminovat, odrůda Tábor je dokonce rezistentní. Za další hlavní původce patologických poškození kořenových pletiv 19

se považují zástupci rodu Fusarium, v našich podmínkách především F. avenaceum, F. culmorum, F. solani a F. oxysporum. Způsobují krčkovou a kořenovou hnilobu jetele (Fusarium root rot) (NEDĚLNÍK, POKORNÝ, 2005). Padlí jetele (powdery mildew) K nejvýznamnějším původcům padlí patří houba Erysiphe trifolii, poškozující nadzemní části rostlin jetele lučního. Typickými symptomy během vegetace jsou bělavé moučnaté povlaky listových čepelí, tvořené konidiovým stádiem houby. Patogen se šíří především v teplém a suchém počasí letních měsíců. Při delší periodě napadení dochází k redukci výnosu, ke snížení vytrvalosti a schopnosti rostlin přezimovat. Narušení integrity pletiv umožňuje infekci sekundárními patogeny. Tetraploidní odrůdy jsou k padlí náchylnější (NEDĚLNÍK, POKORNÝ, 2005). Spála jetele Jde o běžně rozšířenou chorobu způsobenou houbou Aureobasidium caulivorum, syn. Kabatiella caulivora. Napadeny mohou být všechny nadzemní části rostliny. Lehké symptomy v podobě nekrotických skvrn mohou být mezi listovou nervaturou. Nebezpečné jsou protáhlé a vpadlé načernalé skvrny na stoncích. Mohou způsobovat vadnutí rostlin, často i nalomení stonku. Patogen se přenáší osivem (VAVERKA, 1995). Listové skvrnitosti Skupinou hospodářsky významných hub jsou parazité způsobující listové skvrnitosti. Patří mezi ně především Phoma pinodella (jarní černá skvrnitost jetele) vytvářející na čepelích listů drobné skvrny, které se často slévají a způsobují vadnutí a opad listů. Vyskytuje se velmi časně zjara. Každoročně se v porostech jetele vyskytuje houba Pseudopeziza trifolii (obecná skvrnitost jetele). Listové čepele jsou posety drobnými okrouhlými skvrnami s nepravidelným ozubeným okrajem. Uprostřed skvrny se v druhé polovině léta vytváří i pouhým okem viditelné pohárkovité apothecium (pohlavní plodnice houby). Silněji napadené listy vadnou a usychají. Další významnou chorobou je rzivost jetele způsobená houbou Uromyces trifolii. Pletiva v místě infekce žloutnou a zasychají. Při vlhčím průběhu počasí lze na porostech nalézt houbu Colletotrichum trifolii (způsobuje antraknózu jetele), která na horní straně listů vytváří nažloutlé až hnědé skvrny rozložené především podél žilnatiny (NEDĚLNÍK, POKORNÝ, 2005). 20

3.1.8. Jetel prostřední a jetel kavkazský V této bakalářské práci se zabývám kromě jetele lučního i jinými druhy, a to jetelem prostředním (Trifolium medium L.)

a jetelem kavkazským (Trifolium

ambiguum Bieb.). Jetel prostřední je vystoupavá bylina s trojčetnými podlouhlými listy. Je perspektivní pícninářská rostlina. Z dosavadních výzkumů bylo zjištěno, že je ve srovnání s T. pratense odolnější proti poškození podzemních částí těžkou mechanizací, proti padlí Erysiphe trifolii a že je mimořádně rezistentní proti původcům virových chorob. Diploidní jetel prostřední obsahuje v České republice ±80 chromozomů, na Slovensku byl opakovaně nalezen diploidní jetel se 64 chromozomy (SLAVÍK ET AL., 1995). Některé druhy jetelů byly nalezeny jako velmi vzácně a přechodně zavlečené rostliny, některé byly a jsou pokusně zaváděny do kultury. Mezi tyto druhy patří např. Trifolium ambiguum (SLAVÍK

ET AL.,

1995). Na první pohled zaujme relativně tuhými

listy a bílým či narůžovělým (hlavně spodní květy) květenstvím. Má dlouhé rhizomy a je velmi vytrvalý.

21

3.2. Viry (Vira) Viry jsou nebuněční činitelé schopní se množit (replikovat) výhradně v živé buňce. Nemají vlastní metabolismus a pro svou replikaci využívají energetické a metabolické systémy hostitelské buňky. Svou strukturou a způsobem replikace se viry výrazně liší od buněčných mikroorganismů (KUDRNA ET AL., 1989). Základní jednotkou viru je virová částice, pro niž se vžil název virion. Skládá se z nukleové kyseliny, a to vždy jen z jednoho typu - z DNA (živočišné viry) nebo RNA (převážně u rostlinných virů, obvykle je RNA jednovláknová), a ze strukturních bílkovinných subjednotek (kapsomér), které vytvářejí kolem nukleové kyseliny ochranný obal, zvaný kapsida (KUDRNA

ET AL.,

1989). Některé viriony mají kolem

kapsidy ještě membránový obal tvořený bílkovinami a fosfolipidy. Virové bílkoviny jsou vždy specifické a přidělují viru antigenitu (JELÍNEK, ZICHÁČEK, 2003). Viry jsou, co se týče velikosti, velice variabilní (NAVRÁTIL, 2005). Podle tvaru se rozlišují viriony na víceméně sférické (kulovité – většina virů), tyčinkovité až vláknité (mnohé rostlinné viry), baciliformní či projektilového tvaru (rhabdoviry), nepravidelné (orto- a paraviry), tvaru cihly (poxviry) nebo viriony se složitou strukturou (některé bakteriofágy – viry bakterií) (KUDRNA

ET AL.,

1989). Tyčinkovité a vláknité viry mají

šroubovicovou symetrii (KŮDELA ET AL., 1989). 3.2.1. Životní cyklus virů Viry mimo buňku nevykazují biochemickou aktivitu, nemají metabolismus a nemohou se tedy rozmnožovat. K rozmnožování virů dochází pouze uvnitř živých buněk (NEČAS

ET AL.,

1969). Do rostlin a jejich buněk se viry dostávají mechanickým

přenosem (šťávou) nebo vektory (mšice) či semenem. Uvnitř rostliny se částice pohybují přes plazmodezmy z buňky do buňky nebo se šíří floémem a xylémem (KŮDELA ET AL., 1989). Popis průběhu virové infekce u rostlin: Virus je injektován např. mšicí do rostlinné buňky, uvolňuje svou nukleovou kyselinu do cytoplasmy, kde ji buňka použije jako předlohu pro tvorbu nových stejných nukleových kyselin, kterým poté dotvoří obalové proteiny. Vzniká tak mnoho kopií viru. Stavební materiál ke tvorbě nových virionů a potřebnou energii dodává hostitelská buňka (NEČAS ET AL., 1969), která postupně strádá a to vede k patologickým příznakům. 22

3.2.2. Příznaky viróz na rostlinách Téměř všechna virová onemocnění způsobují inhibice růstu rostlin nebo zakrnění

a

redukci

výnosu.

Viry

obvykle

infikovaným

rostlinám

snižují

životaschopnost, rostliny odumírají. Příznaky na napadených rostlinách mohou být snadno patrné nebo mohou být lehce přehlédnutelné. Nejnápadnější příznaky se objevují na listech, stoncích, plodech a kořenech (AGRIOS, 1997). Listy lokálně infikované mohou mít chlorotické nebo nekrotické léze (skvrny), jejichž vzhled je často pro určité viry charakteristický. Systémově infikované listy jsou u mnoha viróz difúzně chloroticky skvrnité nebo mozaikové. Dalšími příznaky jsou žloutnutí žilek, okrajová nebo celková chloróza čepele, proužkovitost (u jednoděložných), páskování kolem žilek, antokyanizace a bronzovitost. Uvedené příznaky na listové čepeli bývají provázeny její deformací, zúžením až nitkovitostí, vrásčitostí, kadeřením, kroucením do strany nebo epinastií. Uschne-li nekrotický list, může buď opadnout nebo zůstane viset na stonku. Dalšími příznaky na listech může být žloutnutí, nekrotické tečky a např. enace (výrůstky na povrchu rostlinných orgánů), na květních obalech pestrobarevnost a nepravidelné pruhování, na plodech a semenech barevné projevy, deformační a nekrotické změny (KŮDELA ET AL., 1989). K histologickým příznakům kromě hyperplazií a hypoplazíí patří např. neúplná diferenciace mezofilu. Cytologické změny se projevují především tvorbou inkluzí (útvary tvořené normálními či poškozenými organelami). Viry jsou histotropní - některé viry dosahují vyšší koncentrace v pokožce, jiné v lýku. Meristémová zóna vegetačních vrcholů je často bez viru. Tohoto jevu se prakticky využívá k rekonstituci zdravých rostlin. K běžným cytologickým změnám patří i tloustnutí a deformace buněčné stěny, patologické změny chloroplastů a mitochondrií aj. (KŮDELA ET AL., 1989).

3.2.3. Detekce virů Zakladatelem nauky o virech - virologie (vyčleněné z odvětví mikrobiologie) je ruský vědec D. I. Ivanovskij, který v roce 1892 objevil infekční chorobu způsobenou virem tabákové mozaiky (KŘÍŽ

ET AL.,

1971). Studium struktury virů je spojeno

s významnými objevy fyziky a chemie. Jako první byla určena velikost virů a to na základě průchodnosti filtry. Během druhé světové války byl v elektronovém 23

mikroskopu pozorován virus mozaiky tabáku. Pozdější objev negativního barvení Huxleyem v roce 1957 umožnil zhotovit první kontrastní fotografie. Zdokonalená technika elektronové mikroskopie a krystalografie pak umožnila detailně poznat strukturu virové částice (NAVRÁTIL, 2005). K výzkumu se potřebná množství virů získávají zpravidla namnožením ve vhodných hostitelských rostlinách (KUDRNA

ET AL.,

1989). Ke spolehlivé identifikaci jednotlivých druhů virů není možné využít jen vizuální hodnocení makrosymptomů, protože ty jsou u mnoha druhů virů stejné. Prakticky nejpoužívanější a nejspolehlivější diagnostickou metodou je sérologický ELISA test (CLARK, ADAMS, 1977), založený na specifické vazbě antigenu s příslušnou protilátkou (FERENČÍK, 1989), a dále užití elektronového mikroskopu. Kromě toho existují molekulární metody (hybridizace, PCR, sekvenování). JAKEŠOVÁ (2009) uvádí, že pracovníci Biologického centra AV ČR, v. v. i. ÚMBR testovali vzorky jetele metodou RT-PCR: ze vzorků izolovali RNA, připravili cDNA a tento materiál testovali PCR s deseti páry primerů specifických na přítomnost virů rodů Potyvirus, Comovirus, Carmovirus, Carlavirus, Potexvirus, Closterovirus, Cryptovirus a Rhabdovirus. Tímto způsobem byli schopni zachytit nejméně 450 různých virů, známých i nepopsaných. FRÁNOVÁ (ÚSTNÍ

SDĚLENÍ)

však upozorňuje, že molekulární analýzy nejsou vždy 100%

důvěryhodné, protože primer může naamplifikovat např. nukleovou kyselinu rostliny.

3.2.4. Systematika virů Viry představují velice heterogenní skupinu mikroorganismů. Existence velkého počtu virových druhů schopných infikovat všechny známé buněčné organismy si vyžádala jejich systematické rozčlenění. O vytvoření prvního taxonomického systému se pokusil v roce 1948 rostlinný virolog Holmes, který vytvořil umělý systém založený na popisu projevů chorob a okruhu hostitelů a navrhnul latinské pojmenování jednotlivých taxonů. Až po 18 letech byla založena Mezinárodní komise pro nomenklaturu virů (později přejmenována na Mezinárodní komisi pro taxonomii virů, International Comitee for Taxonomy of Viruses, ICTV). ICTV zařazuje viry do řádů, čeledí, podčeledí, rodů, podrodů a druhů, přičemž zohledňuje vlastnosti jako typ a organizaci virového genomu, replikační strategii viru a strukturu virionu. ICTV uznává klasickou latinskou nomenklaturu jednotlivých taxonů. V řadě případů se jedná o přepisy dříve mezinárodně používaných anglických názvů (NAVRÁTIL, 2005). 24

3.2.5. Virové choroby na jeteli Viroví patogeni jsou závažnými původci chorob jetele lučního. Nejrozšířenějším je virus žluté mozaiky fazolu (Bean yellow mosaic virus – BYMV). Kromě tohoto druhu se z virových patogenů vyskytují i virus mozaiky okurky (Cucumber mosaic virus, CMV, synonymem je Pea top necrosis virus – PTNV, virus vrcholové nekrózy hrachu), virus žilkové mozaiky jetele lučního (Red clover vein mosaic virus – RCVMV), virus mozaiky vojtěšky (Alfalfa mosaic virus – AMV) aj. Viroví patogeni způsobují na rostlinách jetele lučního různé typy příznaků – mozaiky, strakatosti, skvrnitosti, kroucení listů apod. V přírodě se většina těchto patogenů rozšiřuje hmyzími přenašeči, převážně mšicemi. Virové choroby patří k činitelům negativně ovlivňujícím výnos zelené hmoty a semen, napadené rostliny jsou často retardovány v růstu a vytvářejí méně hlávek, častěji u nich dochází k úhynu. Jelikož vůči virovým patogenům není známa komerčně využitelná chemická ochrana, pozornost se zaměřuje na šlechtění na rezistenci (např. odrůda jetele lučního Rezista). (NEDĚLNÍK, POKORNÝ, 2005)

Virus žluté mozaiky fazolu Rod: Potyvirus, druh: Bean yellow mosaic virus, zkratka BYMV. Flexibilní vláknitý virus měří 750 x 12 nm, membránový obal nemá, podélný kanálek je nezřetelný. TIP (thermal inactivation point, nejvyšší teplota, při které už rostlinná šťáva s viry není schopna vyvolat infekci): 65 °C. LIV (longevity in vitro, doba nakažlivosti šťávy v podmínkách in vitro): 2-7 dní. DEP (dilution end point, maximální naředění šťávy, která je ještě schopna vyvolat infekci): 10-2 – 10-4 (BRUNT

ET AL.,

1996). Napadá

fazol, hrách, jetel, vikev, trnovník akát, mečík, tykev aj. (AGRIOS, 1997). BYMV se rozšířil po celém světě (BRUNT

ET

AL.,

1996). BYMV indikuje žlutozelené

odbarvování listů, mozaiku a mírné zkadeření čepelí. Tyto příznaky jsou součástí komplexu příznaků na jeteli vyvolaných spolupůsobícími viry jiných druhů (VAVERKA, 1995). SMITH

ET AL.

(2004) upozorňují na první vyšlechtěný BYMV rezistentní jetel

u Trifolium vesiculosum, kultivar Apache. Přirozeně rezistentní je Trifolium medium.

25

Virus mozaiky vojtěšky ICTV jej zařadil do rodu Alfamovirus, druh Alfalfa mosaic virus, zkratka AMV. Viriony jsou baciliformního tvaru, měří v průměru 18nm, dlouhé jsou 30 – 57 nm (ICTV

DATABÁZE).

TIP: 60-65 °C. LIV: 1-4 dny. DEP: 10-2 – 10-3 (BRUNT

ET AL.,

1996).

AMV je rozšířený celosvětově na všech kontinentech. Má široké spektrum hostitelů (více než 400 rostlinných druhů). Může způsobovat ztráty ve výnosu jetele, hrachu, brambor, tabáku, paprik, rajčat a celeru. Počátečními příznaky AMV na mladých listech jsou malé, kulaté zelenožluté skvrny. Chlorotické skvrny se rozšiřují a tvoří pruhy a kroužky nebo nerovnoměrné zbarvení. Další listy bývají světle žluté až bělavé. Infikované listy bývají zkroucené a retardované v růstu (ŠUTIĆ ET AL., 1999). Virus mozaiky okurky ICTV zařazuje virus do rodu Cucumovirus, druhu Cucumber mosaic virus, zkratka CMV. Viriony jsou stejnoměrné dvacetistěny (ICTV

DATABÁZE)

o 29 nm

v průměru, jsou bez membránového obalu a bez zřejmého uspořádání jednotek kapsidy. TIP: 55-70 °C. LIV: 1-10 dní. DEP: 10-2 – 10-5 (BRUNT

ET AL.,

1996). CMV způsobuje

světle zelenou strakatost na listech. Mladé listy jsou nepatrně znetvořené a rostliny mají zpomalený růst a sníženou životaschopnost (ŠUTIĆ ET AL., 1999).

Obr. 3: Cucumber mosaic virus (BRUNT ET AL., 1996) Virus žilkové mozaiky jetele lučního Rod: Carlavirus, druh: Red clover vein mosaic virus, zkratka: RCVMV. Virion je rovný vláknitý o délce 600 – 700 nm a šířce 12 nm (ICTV

DATABÁZE),

je

bez membránového obalu, má zřetelný podélný kanálek o průměru 3,5 nm. TIP: 60 °C.

26

LIV: 2-3 dny. DEP: 10-2 (BRUNT ET AL., 1996). RCVMV je rozšířený v Severní Americe, jižní Africe a Evropě. Infikuje rostliny čeledi Fabaceae (upřednostňuje jetel luční), Amaranthaceae, Chenopodiaceae a Solanaceae. Příznaky RCVMV na leguminózách se vyznačují chlorózami mezi žilkami listů, mozaikou, skvrnitostí a zakrslostí rostlin. Choroba je pojmenována podle žloutnoucích žilek na listech (ŠUTIĆ ET AL., 1999).

Obr. 4: Red clover vein mosaic virus (BRUNT ET AL., 1996) Virus mozaiky jetele plazivého Rod: Potexvirus, druh: White clover mosaic virus, zkratka: WCMV (ICTV DATABÁZE).

Vláknité zprohýbané viriony bez membránového obalu měří 480 x 13 nm.

Podélný kanál o průměru 3,5 nm je nezřetelný. TIP: 60 °C. LIV: 10-99 dní. DEP: 10 -3 – 10-4 (BRUNT

ET AL.,

1996). WCMV je velmi rozšířen v různých oblastech, byl nalezen

v Severní Americe, Novém Zélandu a v mnoha evropských zemích. Vyznačuje se světlými žlutozelenými proužky na infikovaných listech. Mezi žilkami na okrajích listů se objevují chlorotické kroužky nebo nepravidelné skvrny, které později tmavnou. Listy se mírně kroutí (ŠUTIĆ ET AL., 1999). Virus žluté žilkovitosti jetele Rod: Potyvirus, druh: Clover yellow vein virus, zkratka: CYVV. Vláknitý ohebný virion měří 760 x 12 (až 15) nm (ICTV

DATABÁZE),

membránový obal chybí,

podélný kanálek je nezřetelný. TIP: 65 °C. LIV: 2-8 dní. DEP: 10 -2 – 10-4 (BRUNT ET AL., 1996). Hostiteli CYVV jsou jetele, především jetel plazivý, na kterém způsobuje žloutnutí žilek a listovou skvrnitost (ŠUTIĆ ET AL., 1999).

27

Virus strakatosti jetele lučního Rod: Comovirus, druh: Red clover mottle virus, zkratka: RCMV. Virus tvoří pravidelný dvacetistěn o průměru 28 nm (ICTV DATABÁZE), je bez membránového obalu a bez zřejmého uspořádáni jednotek kapsidy. TIP: 55-60 °C. LIV: 14 dní. DEP: 10 -3 (BRUNT ET AL., 1996). Je rozšířen v Evropě. Přirozeným hostitelem je hlavně jetel luční a hrách. U této choroby se projevují příznaky jako diskolorace mezi žilkami listů doprovázené odumíráním pletiv. Chlorózní kroužky se rozprostírají v rozsáhlé skvrny mezi žilnatinou listů. Mladé infikované listy se svinují a deformují (ŠUTIĆ ET AL., 1999). X virus bramboru Rod: Potexvirus, druh: Potato virus X, zkratka: PVX. Viriony jsou obvykle zprohýbané vláknité, 515 nm dlouhé a široké 13 nm, bez membránového obalu. Podélný kanálek je nezřetelný o průměru 3,4 nm. TIP: 68-76 °C. LIV: 40-60 dní. DEP: 10 -4 – 105

(BRUNT

ET AL.,

1996). PVX je rozšířen celosvětově všude, kde jsou pěstovány

brambory. Způsobuje mírné onemocnění, a proto i menší škody. Na mladých listech na počátku infekce je viditelná mírná mozaika, která se se zvyšující teplotou sezóny vytrácí nebo je naopak závažnější a vede k deformacím listů. Zamračené počasí o teplotách 16 – 20°C příznivě rozvíjí symptomy (ŠUTIĆ bramboru na jeteli uvádí JAKEŠOVÁ (2008).

Obr. 5: Potato virus X (BRUNT ET AL., 1996)

28

ET AL.,

1999). Nález X viru

3.3. Fytoplazmy Fytoplazmy jsou bakteriální patogeny rostlin (OLIVIER

AT AL.,

2009), dle IRPCM,

2004 reprezentují třídu Mollicutes. Jsou to jednoduché nehelikální prokaryotní organismy bez pevné buněčné stěny, které jsou pozorovatelné pomocí elektronového mikroskopu (obr. 6) ve hmyzích vektorech nebo v sítkovících rostlin (NAVRÁTIL

ET AL.,

2008), v nichž se množí a jimiž se spolu s asimilačním tokem šíří v hostiteli, někdy poměrně značnou rychlostí (FIALOVÁ, 2008). Představují je kulovité, oválné až protáhlé buňky obalené pouze jednotkovou plazmatickou membránou. V jejich cytoplazmě můžeme pozorovat ribozomy a vlákna DNA. Velikost fytoplazem je velice proměnlivá a pohybuje se cca od 200 nm do 500 nm, u protáhlých tvarů až do 800 nm (NAVRÁTIL ET AL.,

2008).

Obr. 6: Ukázka fytoplazmy pozorovaná elektronovým mikroskopem (CHEN, 2005) Množí se pučením nebo přehrádečným dělením (ŠINDELKOVÁ, 2006). Rozšiřují se hmyzími vektory (merami, křísi, plošticemi), v kterých se, jak uvádí OLIVIER

ET AL.

(2009), reprodukují a přenášejí slinnými sekrety do nových hostitelských rostlin během sání. Rozšiřují se také vegetativně, a to např. pomocí roubů, oček a hlíz nebo přes parazitickou rostlinu (kokotici). Prozatím se nepodařilo potvrdit přenos fytoplazem semeny a fytoplazmy nejsou přenosné ani mechanickou inokulací. Specifické životní 29

nároky fytoplazem neumožňují jejich kultivaci in vitro. Rozvoj epidemiologické situace je v našich klimatických podmínkách spojen vždy s existencí primárních (infikované vytrvalé rostliny, přezimující vektoři) a sekundárních (nově infikované, obvykle jednoleté byliny) zdrojů infekce, vnímavých hostitelských rostlin a přítomností efektivních vektorů (NAVRÁTIL

ET AL.,

2008). Hostitelský okruh fytoplazem některých

druhů může být velmi široký. Např. většina fytoplazem je schopna infikovat druh Catharanthus roseus (barvínek růžový), který je proto vhodný pro udržování izolátů fytoplazem (FIALOVÁ, 2008). NAVRÁTIL ET AL. (2008) uvádí, že v současnosti neexistuje účinná metoda ochrany před fytoplazmovými chorobami. Byla sice objevena citlivost vůči antibiotikům tetracyklinové řady, které potlačují vývoj příznaků, ale po ukončení aplikace antibiotik se příznaky znovu objevují.

Kontrola fytoplazmóz se soustřeďuje na preventivní

opatření: používání certifikovaných materiálů, odstranění zdrojů infekce, monitorování hmyzích vektorů v porostu a používání tolerantních kultivarů, kterých je vyšlechtěno jen málo. Fytoplazmy vyvolávají řadu významných chorob zemědělských plodin, představují patogeny významně snižující výnos a jeho kvalitu a může docházet i k negativnímu vlivu na množitelských plochách (NAVRÁTIL

ET AL.,

2008).Vyvolávají

různé příznaky včetně žloutenky a svinutky listů, chlorózy, malolistosti, proliferace výhonů i kořenů, zakrslosti, virescence, fylodie (neboli zlistnatění je podle KŮDELY AL.

ET

(1989) přetvoření některých květních částí na zelené, listům podobné útvary, obr. 7),

květní sterility, odumírání výhonů a celých rostlin. Vnější symptomy vyvolané přítomností fytoplazem naznačují, že hostitelská rostlina má narušenou hormonální rovnováhu a funkci floému. Symptomy indukované u napadených rostlin mohou velmi kolísat podle druhu hostitele, druhu fytoplazmy a stadia infekce; některé druhy rostlin jsou k fytoplazmové infekci tolerantní nebo rezistentní. Na úrovni pletiv se infekce fytoplazmami projevuje potlačením floémového transportu, hromaděním cukrů ve stonku a snížením obsahu škrobu v kořenech. Vlivem fytoplazem dochází i ke změnám genové exprese hostitele (FIALOVÁ, 2008).

30

a

b

Obr. 7: a) Zdravý jetel luční vpravo a dvě květenství postižené fylodií vlevo (DAVIS ET AL.,

2010). b) Fylodie hlávky jetele plazivého (BUSSELEN, 2008).

3.3.1. Historie První zmínky o fytoplazmových onemocněních, o žloutenkách rostlin, pocházejí z počátku devatenáctého století. Původci těchto chorob byli považováni za viry, protože jejich tehdy známá biologie připomínala chování virů v přírodě. Přesto se objevila řada prací jednoznačně odlišujících etiologii fytoplazmóz. Ve výzkumu fytoplazem byl přelomový rok 1967, kdy DOI

ET AL.

(1967) pozorovali elektronovým mikroskopem

v lýku aster s příznaky žloutenky oválné buňky podobné živočišným mykoplazmám. Tyto organismy byly označeny jako MLOs (mycoplasma-like organisms). Poznávání fytoplazem bylo relativně pomalé a metodicky velice komplikované. Skutečně bylo prokázáno, že většina chorob popisovaných jako virescence, bezsemenost, fylodie, proliferace nebo stolbur, jsou fytoplazmového původu. Byly prohloubeny poznatky o příznacích na infikovaných rostlinách, o geografickém rozšíření fytoplazem, o vztahu fytoplazem k vektorům a o jejich epidemiologických cyklech. Bez použití molekulárních technik (molekulární hybridizace, PCR, RFLP a sekvenování) bylo ale obtížné přiřadit k sobě fytoplazmu, vektora a chorobu. Na počátku 90. let minulého století se tyto metody začaly rozvíjet a podařilo se tak získat první informace o genomu fytoplazem. Analýzy se soustředily zejména na konzervativní úsek 16S rDNA, který byl 31

již používán pro klasifikaci bakterií. V roce 1993 byl přijat mezinárodní komisí pro taxonomii bakterií nový název MLO, fytoplazmy. V roce 2004 bylo navrženo zahrnout všechny fytoplazmy do nového rodu ´Candidatus Phytoplasma´ (NAVRÁTIL AL.,

2008). LEE

ET AL.

ET

(1998) rozlišili rozdílné sekvence 16S rDNA pomocí RFLP

analýzy a 17 restrikčních enzymů a klasifikovali 14 skupin fytoplazem. SEEMÜLER

ET AL.

(1998) rozdělili podobným způsobem fytoplazmy do 20 velkých skupin. Současná klasifikace fytoplazem dle IRPCM (2004) rozlišuje na základě analýzy 16S rDNA 15 skupin (tab. 3). Tab. 3: Současná klasifikace 15 skupin fytoplazem dle IRPCN (2004) (pozn.: v ČR byly některé druhy fytoplazem detekovány na jeteli, skupiny těchto druhů jsou označeny tučně, NAVRÁTIL ET AL., 2008) Skupina 16SrI 16SrII 16SrIII 16SrIV 16SrV 16SrVI 16SrVII 16SrVIII 16SrIX 16SrX 16SrXI 16SrXII 16SrXIII 16SrXIV 16SrXV

Aster Yellows Peanut witches´-broom X-disease Coconut lethal yellowing Elm yellows group Clover proliferation Ash yellows Loofah witches´-broom Pigeon pea witches´-broom Apple proliferation Rice yellow dwarf Stolbur Mexican periwinkle virescence Bermuda grass white leaf ´Ca. Fytoplasma brasiliense´

3.3.2. Detekce fytoplazem Detekce fytoplazem podle FRÁNOVÉ (2008): •

Biologickými testy na indikátorech – např. odlišné symptomy po infekci fytoplazmami na Catharanthus roseus.

•

Fluorescenčním mikroskopem – na přítomnost fytoplazem v pletivech.

•

Elektronovou mikroskopií – k určení přítomnosti fytoplazem v pletivech, na jejich tvar a velikost.

32

•

Sérologickými metodami – ELISA testem (specifické protilátky prokáží jen vysoké koncentrace fytoplazem).

•

Molekulárními metodami - hybridizací (identifikace geneticky odlišné fytoplazmy a zařazení do skupiny). -

polymerázovou

řetězovou

reakcí,

PCR

(univerzálními

i

skupinově

specifickými primery fytoplazem odvozenými od sekvence 16S rRNA genu a od sekvencí pro geny ribozomálních proteinů – SecY a Tuf genů a genů kódujících proteiny asociované s membránami fytoplazem – imp. Technika je velmi citlivá, její citlivost lze ještě zvýšit provedením tzv. nested-PCR.), RTPCR. - délkovým polymorfismem restrikčních fragmentů, RFLP (slouží k potvrzení výsledků PCR a případnému vyloučení falešně pozitivních reakcí a pro rozlišení skupin a podskupin fytoplazem). - sekvenováním (stanovení sekvence 16SrDNA – 23SrDNA a dalších oblastí a následné srovnání sekvence s databází http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

3.3.3. Fytoplazmy na jeteli Skupina Aster yellows (AY) LEE

ET AL.

(2004) uveřejnili fylogenetický strom Aster yellows, kromě toho

skupinu 16SrI také popisují. Aster yellows (AY) skupiny 16SrI jsou spojené s více než stovkou ekonomicky důležitých chorob celého světa. Příznaky na rostlinách jsou různé, závisí na druhu fytoplazmy. Mezi typické symptomy Aster yellows patří virescence (zezelenání květních lístků) a fylodie (přeměna květních částí do podoby listů), pruhování a malformace květů, žloutnutí a svislé postavení listů, prodlužování a etiolizace internodií, nadměrné větvení, tvorba čarověníků a celková zakrslost rostlin. U infikovaných rostlin se však mohou projevovat jen některé příznaky. Příznaky podskupiny fytoplazem 16SrI-C zahrnují virescenci a fylodii, neobjevuje se nadměrná proliferace prýtů. Fytoplazmy dalších podskupin 16SrI způsobují celkovou zakrslost (drobné listy, malé květy, zkrácení internodií), kadeření a vinutí listů, malé a mdle zbarvené květy a další příznaky typické pro Aster yellows. Infikované rostliny mohou být bez očividných příznaků.

33

Ze skupiny 16SrI byla na jetelích pěstovaných v České republice nalezena fytoplazma žloutenky aster (AY, aster yellows, podskupina 16SrI-B), dle IRPCN (2004) rodu ,Ca. Phytoplasma asteris´ nebo druh fylodie jetele (Cph, clover phyllody, podskupina 16SrI-C) rodu ,Ca. Phytoplasma asteris´. Skupina Stolbur Na jeteli lučním byla v České republice nalezena v této skupině fytoplazma s názvem stolbur fytoplazma podskupiny 16SrXII-A, která byla detekována FRÁNOVOU ET AL.

(2009). IRPCN (2004) ji řadí do rodu ,Ca. Phytoplasma solani´. Významnými hostitelskými rostlinami jsou rostliny z čeledi lilkovitých

(brambor, rajče, paprika aj.), réva vinná, jetel, svlačec rolní a další. Patogen vytváří různé příznaky na různých hostitelských rostlinách. Na květech bramboru se projevuje zelenokvětost a malformace jednotlivých květních částí, listy bramboru předčasně vadnou a žloutnou, svinují se. Dochází k zakrslosti rostlin a zkrácení internodií. Objevují se nekrózy na stonku, infikované rostliny odumírají. Hlízy jsou malé, měkké, gumovité. Patogen je rozšířen v Evropě a v Asii. V posledních letech narůstá počet zjištěných výskytů této fytoplazmy v České republice. I z jiných zemí je hlášen nárůst výskytu, zejména na révě vinné.Výskyt fytoplazmy stolburu vzrůstá v obdobích s vyššími teplotami, kdy se zvyšuje i aktivita jejich přenašečů (RŮŽIČKA, 2008). Přenašeči stolburu jsou některé druhy křísů, nejvýznamnější pro střední Evropu je žilnatka virusonosná (Hyalesthes obsoletus) (ŠINDELKOVÁ, 2004). Skupina Apple proliferation Ze skupiny Apple proliferation můžeme u nás na jeteli detekovat fytoplazmu proliferace jabloně (AP, apple proliferation, podskupina 16SrX-A). Nalezneme ji pod rodem ,Ca. Phytoplasma mali´ (IRPCN, 2004). Hlavním hostitelem je jabloň domácí, fytoplazma napadá i další druhy rodu Malus. Je rozšířena prakticky v celé Evropě (RŮŽIČKA, 2008). U jabloně vyvolává celou řadu příznaků. Postranní pupeny raší a vytváří se metlovitost. Listy jsou obvykle menší a palisty jsou zvětšené. Kvetení je opožděné. Zaschlé květy neopadávají. Stopky květů a plodů jsou nápadně dlouhé. Napadené plody jsou často nevybarvené. Výnos je nízký (PLANTPRO, 2002 - 2005).

34

4. MATERIÁL A METODY

4.1. Lokalita Obec Hladké Životice se nachází v severnější části Moravské brány, která tvoří předěl mezi východní karpatskou a západní sudetskou soustavou. Tato sníženina je protáhlá od jihozápadu k severovýchodu. Okolí je převážně ploché, s mírným stoupáním v západním směru. Obec leží v nadmořské výšce 254 metrů. Nejvyšším bodem v okolí je Stachovický vrch s nadmořskou výškou 369 metrů. Obec leží v povodí Husího potoka, který je levostranným přítokem řeky Odry, která ústí do Baltského moře (ORSÁG, 2009). JAROŠEK (2005) uvádí o geologii a klimatu Hladkých Životic: „Obec leží v klimaticky mírně teplé oblasti. Geologicky je území součástí Českého masívu. Podloží tvoří především třetihorní vápnité jíly. Na nich spočívají ledovcovo-jezerní písky, říční pískoštěrky, ledovcovo-jezerní jíly a písky. Povrch pak zcela kryjí sprašové hlíny.“ Novošlechtění jetele lučního se nacházelo na levém břehu Husího potoka v okolí domu č. p. 72 (obr. 8) na pronajmutém poli. Jetelové školky zde byly založeny v roce 2007 (na založení jsem se také podílela). Rostly zde třetím rokem, jejich životnost tedy končila, a proto byly na podzim roku 2009 zaorány. Pole bylo na výsluní, značně

85

72 80

79

74

70

73 13 4

71 kostel

31

39

29

Obr. 8: Přibližná pozice kmenových školek je označena oranžovými rámečky (PLANstudio, 2005 – 2009), GPS souřadnice: Loc: 49°41'0.663"N, 17°58'3.681"E

35

kamenité. Během letních prázdnin 2009 působil na rostliny velký stres, který podporoval rozvoj chorob. Stres byl způsoben extrémním počasím. Červenec byl deštivý (povodňový) tak, že ve školkách stála voda, srpen a září naopak nadměrně suchý. Podrobný průběh počasí lze nalézt na http://meteo.toje.in/ .

4.2. Pozorování příznaků a detekce patogenů Za pomoci Ing. Jakešové byly vybrány a označeny štítkem nemocné rostliny z kmenových školek. JAKEŠOVÁ (ÚSTNÍ

SDĚLENÍ)

uvádí, že zde byly školky s označením

JEH 1 F, JEH 1 V, JL HJ PO, jetel prostřední a jetel kavkazský . JEH zahrnuje mezidruhové křížence jetele lučního tetraploidního a jetele prostředního oktoploidního. Jde o zpětné křížence s jetelem lučním metodou volného sprášení během šesti až sedmi generací. Byly vybrány hlavně rostliny s počtem chromozomů 28,5 – 30, které jsou náchylnější k chorobám. JEH 1 F byl infikován ve dvou generacích směsným inokulem houby Fusarium (F. oxysporum, F. solani a F. avenaceum). JEH 1 V byl inokulován ve dvou generacích virem žluté mozaiky fazolu. U obou školek byly do polních podmínek vysázeny pouze rostliny, které byly po inokulačních testech zdravé. Pod zkratkou JL HJ PO se skrývá jetel luční tetraploidní odolný padlí rdesnovému. Jetel prostřední je oproti jeteli lučnímu odolnější patogenům a poškození mechanizací. Jetel kavkazský je šlechtěn pro dlouhé rhizomy a pro svou velkou vytrvalost. Během jara a léta 2009 jsem vyhledala označené rostliny. Za vhodného počasí, což bylo bezvětrno a pod mrakem avšak s dostatečným světlem, jsem od každého napadeného jetele pořídila fotografii a odebrala několik listů s nápadnými příznaky chorob. Za slunečna byly fotografie rostlin přesvětlené. Za poměrně větrného počasí byly problémy s rozmazáním expozice a větrem se přetáčely papírové štítky s označením rostliny. Posbírané listy jsem potom fotodokumentovala za denního světla na bílém podkladu. Měřítkem pro rozměr listu může být štítek s velikostí písma 12 (Word). Fotografie jsem pořizovala přístrojem Olympus Corporation nebo Canon Power Shot A620. Listy byly následně použity pro detekci přítomnosti patogenů v Biologickém centru AV ČR, v.v.i. ÚMBR v Českých Budějovicích. Zde byla analyzována přítomnost virů ELISA testem, RT-PCR, sekvenováním a transmisním elektronovým mikroskopem. ELISOU i molekulárními metodami byly determinovány BYMV, AMV, CMV, RCVMV, WCMV, CYVV, RCMV a PVX, rod Potyvirus a čeleď 36

Rhabdoviridae. Fytoplazmy byly detekovány především metodou PCR a RFLP. Jeden týden v září 2009 jsem strávila v laboratoři v Českých Budějovicích pod vedením Ing. Fránové a ve společnosti její laborantky a dvou studentek. Během tohoto týdne jsem si vyzkoušela izolovat DNA z jetelových listů a řapíků, získanou DNA jsem připravovala k PCR a poté nanášela na agarózový či polyakrylamidový gel. Ve výsledku měly být detekovány fytoplazmy.

4.3. Charakteristika metod ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) je imunoanalytická metoda. Při detekci byla použita modifikace ELISY, a to nekompetitivní přímá (sendvičová) ELISA pro antigeny. Na tuhou fázi (mikrotitrační destičku) se naváže protilátka a na tu se poté naváže antigen (virus). Přidají se volné protilátky značené enzymem, které reagují „z druhé strany“ s volnými determinanty navázaného antigenu. Nenavázané protilátky se promyjí a přidá se substrát, který zapříčiní změnu barvy přímo úměrnou množství přítomného antigenu. Výhodou je, že hledaný antigen může být ve směsi jiných antigenů. Nevýhodou je, že použité protilátky musí být velmi monospecifické (FERENČÍK, 1989). Polymerázovou řetězovou reakcí, PCR (Polymerase Chain Reaction), docílíme zmnožení molekul DNA a zvýšení její koncentrace na požadovanou úroveň. Proces PCR je automatizován a provádí se v cyklerech. Cyklus se opakuje 30x – 40x a má tři kroky: •

Denaturace

DNA

–

rozpletení

dvoušroubovice

DNA

a

vznik

jednovláknových molekul DNA při 95 °C během několika sekund. •

Annealing - nasednutí primerů k jednovláknovým molekulám DNA při 40 ° - 70 °C během několika sekund.

•

Elongace – DNA polymerasa dostaví DNA podle komplementarity bazí, začíná od primerů, elongace probíhá při 72 °C a trvá sekundy až dvě minuty (KLOUDA, 2005).

Při diagnostice RNA virů je využívána reverzní transkripce, při které dochází k syntéze c-DNA (complementary DNA) přepisem z mediátorové RNA. K namnožení nukleové

37

kyseliny RNA viru se používá RT-PCR, při které je vyžadován primer hybridizující s RNA a reverzní transkriptasa místo DNA polymerasy (KLOUDA, 2005). Polymorfismus v délkách restrikčních fragmentů (RFLP, restriction fragment lenght polymorphism) je metoda, při které se vytvářejí rozdíly v počtu a velikosti restrikčních fragmentů při štěpení DNA genomových DNA dvou a více jedinců příbuzných druhů určitou restrikční endonukleázou (ROSYPAL

ET AL.,

2001). Porovnáním

restrikčních spekter s kontrolními vzorky nebo literárními údaji je možné přesně identifikovat danou fytoplazmu (FRÁNOVÁ, 2008). Transmisní (prozařovací) elektronová mikroskopie (TEM) je zaměřena na sledování buněčné struktury ultratenkých řezů vzorků, jejichž příprava a zhotovení jsou velmi pracné a náročné. Elektronový mikroskop je složitý elektronově optický systém (BEDNÁŘ

ET AL.,

2002). Místo fotonů využívá elektronů s kratšími vlnovými délkami a

místo optických čoček elektromagnetické pole. Může dosáhnout zvětšení až 1 000 000x.

38

5. VÝSLEDKY A DISKUZE Příznaky onemocnění na rostlinách jetele v kmenových školkách JEH, JL HJ PO, jetele prostředního a jetele kavkazského jsem pozorovala od května do září roku 2009. Během této doby se příznaky na jeteli postupně zvýrazňovaly a byly tedy zřetelněji vidět. Většina rostlin byla napadena více než jedním druhem patogenu. Šlo především o Pseudopeziza trifolii, Uromyces trifolii, Erysiphe trifolii a dále o virové a fytoplazmové patogeny. Padlí a rzivost se rozvinuly především v druhé polovině léta. V kmenové školce byly samozřejmě i rostliny, které vypadaly zdravě a daly by se považovat za všeobecně tolerantní či rezistentní vůči patogenům napadajícím jetel. Semena těchto rostlin budou určitě následující rok 2010 vyseta, bude se s nimi pokračovat ve šlechtitelském procesu. Kromě chorob se na jeteli projevili také hmyzí škůdci, kteří škodili požerky a posátím na listech. Ve školkách bylo vybráno 51 rostlin jetelů s výrazným průběhem chorob, které by mohly být virového či fytoplazmového původu. Od každé rostliny byla pořízena fotografie celkového habitu rostliny a detailní snímky tří až čtyř infikovaných listů. Jetele kmenové školky JEH 1 V byly foceny dvakrát, a to 22. května a 1. června. Při druhém focení byly příznaky chorob rozvinutější. 4. června byl dokumentován jetel kavkazský a prostřední. Druhy jetel kavkazský a jetel prostřední vypadaly oproti JEH nebo JL HJ PO mnohem zdravěji. Tyto jetele nevykazovaly příznaky houbových ani bakteriálních chorob. Na listech se projevovaly červené až hnědé diskolorace, které se šířily od okrajů listů směrem ke střední žilce (obr. 10, 12, 14, 15, 16 v příloze). U dalších rostlin byly celé listy nebo jen okraje světle žlutozelené, pravděpodobně ztrácely chlorofyl (obr. 9, 11 v příloze). Jetel kavkazský vytvářel málo květenství. Choroby dosáhly velkého rozvoje po deštivém červenci a suchém srpnu, kdy byla fotografována školka JEH 1 F a JL HJ PO. Na JEH a JL HJ PO se projevily kromě syndromů padlí, skvrnitosti či rzivosti příznaky virových a fytoplazmových chorob. Rostliny byly často retardované v růstu, měly málo květenství, někdy vůbec nevytvářely lodyhy a tvořily jen listovou růžici (obr. 9, 17, 18, 19, 20, 21 v příloze). Listy byly obvykle malé, některé zcela zakrnělé, deformované – různě zprohýbané, někdy s prasklinami podél žilnatiny a byly nepřirozeně zbarvené. Mezi nervaturou se objevovaly žluté skvrny (obr. 23, 24, 25, 26 v příloze), strakatosti (obr. 22 v příloze) a mozaiky, které hnědly a nekrotizovaly (obr. 27, 29 v příloze) někdy až tak dalece, že z listu zbyly jen cévní

39

svazky (obr. 28, 30 v příloze), jindy uschnul celý list. Někdy byly prosvětlené žilky a okraje listů načervenalé. Virescence nebo fylodie nebyly nalezeny na žádném z druhů jetele. Výsledky detekce virů detekovaných Biologickým centrem AV ČR, v. v. i. ÚMBR nejsou dosud plně hotovy. V tab. 4 (v příloze) je uveden přehled již determinovaných virových patogenů za použití dvou metod – ELISA testem, který by měl být přesný a RT-PCR, která u virů není 100 % spolehlivá. Rostliny, u kterých jsou výsledky v tabulce označené otazníkem, budou znovu přetestovány. ELISA testem byly prokázány virózy White clover mosaic virus, Red clover mosaic virus a Alfalfamosaic virus. Molekulárními metodami byly jetele pozitivní na Alfalfa mosaic virus, White clover mosaic virus, Red clover mosaic virus, Cucumber mosaic virus, Potexvirus, do kterého patří White clover mosaic virus nebo X virus bramboru. Byl objeven neznámý virus čeledi Rhabdoviridae. Ve výsledcích všech vzorků se střídají opakovaně stejné viry, rozdíl je jen u jetele kavkazského a jednoho vzorku JEH 1 V, kde se navíc objevuje Cucumovirus. Výsledky ELISA testu by se měly shodovat s výsledky molekulárních metod, ale není tomu tak. Často se stalo, že ELISA testem byl identifikován původce, ale molekulární metody ho nezachytily. Příkladem může být vzorek číslo 9, kdy ELISA prokázala WCMV, ale molekulární metody nikoli, i když naopak zachytily AMV. Dalo by se očekávat, že u JEH 1V (inokulovaného BYMV) bude u všech vzorků Bean yellow mosaic virus nalezen, ale opak je pravdou. ELISA ani RT-PCR Potyvirus neodhalily. Na rostlinách také nebylo pozorováno žádné žlutozelené odbarvování pro toto onemocnění typické. Může to být pravděpodobně tím, že POKORNÝ ET AL. (2008) prokázali významnou rezistenci mezidruhových hybridů Trifolium spp. k BYMV. Tyto původy jetele byly po inokulaci BYMV infikované od 0 do 13,3 %. Rezistence pochází z genomu jetele prostředního. Vzorky, které byly analyzovány v září 2009 na výskyt fytoplazem a na jejichž detekci jsem se podílela, nebyly v žádném případě pozitivní. Buď se ve vzorcích vůbec nevyskytovaly nebo byly přítomny ve velmi malém množství, které při testování nebylo zachyceno. Mohlo se také stát, že DNA byla izolována ze zdravé části rostliny, kam se ještě bakterie přinesena hmyzem nestačila rozšířit (list napadený, ale řapík zdravý a použitý na izolaci DNA a na následnou detekci).

40

6. ZÁVĚR Nově získané a stávající informace o jeteli, virech a fytoplazmách jsem shrnula do literárního přehledu. Na lokalitě v Hladkých Životicích jsem na jaře a v létě roku 2009 pozorovala a fotodokumentovala infikované jetele se symptomy, které by mohly být virového či fytoplazmového původu. Nejvýraznější příznaky jsem popsala a přiřadila k nim fotografie uvedené v příloze. Z výsledků Biologického centra AV ČR, v. v. i. ÚMBR jsem vytvořila přehlednou tabulku. Z celkového počtu 51 testovaných rostlin byl nalezen AMV u 32 rostlin, CMV u 7 rostlin, RCMV u 13 rostlin, WCMV u 20 jetelů plus další viry rodu Potexvirus u 11 rostlin a dále byl(y) nalezen(y) druh(y) z čeledi Rhabdoviridae u 27 rostlin jetele. Analýzy na přítomnost fytoplazem byly u všech 51 vzorků negativní.

41

7. SEZNAM UŽITÉ LITERATURY Agrios, G. N.: Plant pathology. Vydal Academic Press, Londýn. 4. vydání, 1997. 922 s. ISBN 0-12-044-564-6 Bednář, J., Kuciel, J., Vyhnánek, T.: Genetika. MZLU v Brně. Dotisk prvního vydání, 2008. 148 s.. ISBN 978-80-7157-862-8 Bednář, J., Vyhnánek, T., Jedličková, D.: Cvičení z genetiky rostlin. MZLU v Brně. Dotisk prvního vydání, 2002. 140 s.. Bednář, J., Vyhnánek, T.: Genetika rostlin. MZLU v Brně. První vydání, 2004. 147 s. ISBN 80-7157-814-2 Brunt, A.A., Crabtree, K., Dallwitz, M.J., Gibbs, A.J., Watson, L. and Zurcher, E.J. (eds.) (od roku 1996 a dále). `Plant Viruses Online: Descriptions and Lists from the VIDE Database. Version: 20th August 1996.' URL http://biology.anu.edu.au/Groups/MES/vide/ Staženo 16. 3. 2010 Busselen, P.: Obrázek fylodie hlávky jetele bílého. Katholieke Universiteit Leuven, 2008. URL http://www.kuleuven-kortrijk.be/bioweb/ Staženo 19. 3. 2010 Castleman, M.:Velká kniha léčivých rostlin. Přel. Černá, J. Columbus, spol. s r. o. Praha. První vydání, 2004. 638 s. Přel. z: The new Healing Herbs. Clark, M. F., Adams A. N., 1977: Characteristics of the micro plate method of enzyme linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of General Virology 34, 475-483. Davis, R. E., Shao, J., Lee, I.-M., Wei, W., Zhao, Y., Phytoplasma Resource Center: Obrázek fytoplazmy na jeteli, 2010. URL http://plantpathology.ba.ars.usda.gov/pclass/pclass_pictures.html Staženo 19. 3. 2010 Dostál, J.: Nová květena ČSSR 1. Academia Praha, 1989, 768 s.. ISBN 80-200-0095-X 42

Ferenčík, M.: Imunochémia. Alfa, Bratislava. Druhé přepracované vydání, 1989. 591 s. ISBN 80-05-00043-X Fialová, R: Interakce fytoplazem s rostlinným hostitelem a hmyzím vektorem. Fytoplazmy – obligátní intrabuněčné patogeny. Fytoplazmy, významné patogeny rostlin. Univerzita Palackého v Olomouci ve spolupráci s Českou fytopatologickou společností. První vydání, 2008, s. 26 – 33. ISBN 80-903545-2-1 Fránová, J: Metody detekce fytoplazmových onemocnění. Fytoplazmy – obligátní intrabuněčné patogeny. Fytoplazmy, významné patogeny rostlin. Univerzita Palackého v Olomouci ve spolupráci s Českou fytopatologickou společností, První vydání, 2008, s.34 - 43. ISBN 80-903545-2-1 Fránová, J., Navrátil, M., Jakešová, H.: Molecular identification of stolbur fytoplasma associated with red clover dwarf disease symptoms. Journal of Phytopathology. Germany, 2009. 157: 7/8. 502 – 506 Grau,J., Jung, R., Münker, B.: Bobulovité, užitkové a léčivé rostliny. Přel. Váňa, J. Knižní klub, k. s. Praha, 1996. 288 s. Přel. z : Beeren, Wildgemüse, Heilkräuter. ISBN 80-7202-023-4 Chen, A.: Fotografie fytoplazmy, 2005. URL http://www.ualberta.ca/~mingchen/tem.htm Staženo 16. 3. 2010 Chloupek, O.: Genetická diverzita, šlechtění a semenářství. Academia Praha. Třetí vydání, 2008. 192 s. ISBN 80-7157-388-4 Jakešová, H: „Diagnostika virů a fytoplazem ve šlechtitelském materiálu jetele lučního“ za rok 2007. Redakčně upravená roční zpráva o průběhu prací na projektu, Ministerstvo zemědělství, 2008 Jakešová, H: „Diagnostika virů a fytoplazem ve šlechtitelském materiálu jetele lučního“

43

za rok 2008. Redakčně upravená roční zpráva o průběhu prací na projektu, Ministerstvo zemědělství, 2009 Jakešová, H., Klimo, M.: Přímá detekce polyploidie jetele lučního pomocí flow cytometru, 2002. URL http://www.pbhz.cz/news/selekce_jetelu/selekcejetelutab1.gif Staženo 22. 1. 2010 Jakešová, H., Světlík, V.: Historie a současnost českého šlechtění jetele lučního, 2002. URL http://www.pbhz.cz/news/55_let_SS/55slechteni_jetelu.htm Staženo 22. 1. 2010 Jarošek, R.: Přírodní podmínky, Poodří – časopis obyvatel horní Odry, 1/2005 Jelínek, J., Zicháček, V.: Biologie pro gymnázia. Vydalo Nakladatelství Olomouc. Šesté vydání, 2003. 576 s. ISBN 80-7182-159-4 Kašparová, M., Siatka, T., Spilková, J., Dušek, J.: Explantátová kultura Trifolium pratense L., 1996. Získáno od [email protected], 1. 4. 2009 Klouda, P.: Základy biochemie. Vydalo nakladatelství Pavel Klouda, Ostrava. Druhé, přepracované vydání, 2005. 144 s. ISBN 80-86369-11-0 Kříž, Z., Králik, J., Michálek, J., Richtár, V.: Lesnická botanika. Státní zemědělské nakladatelství, Praha. Vydání první, 1971. 450 s. 07-043-71 Kůdela, V., Bartoš, P., Čača, Z., Dirlbek, J., Frič, F., Lebeda, A., Čebesta, J., Ulrychová, M., Valášková, E., Veselý, D.: Obecná fytopatologie. Academia, Praha. První vydání, 1989. 388 s. ISBN 80-200-0156-5 Lee, I. M., Gundersen – Rindal, D. E., Davis, R. E., Bottner K. D., Marcone C., Seemüler, E.: ,Candidatus Phytoplasma asteris´, a novel phytoplasma taxon associated with aster yellows and related diseases. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2004. 54. 1037 – 1048. Navrátil, M.: Základy virologie. Skripta Univerzity Palackého Olomouc, 2005. 48 s. 44

Navrátil, M., Válová, P., Starý, M.: Fytoplazmy – obligátní intrabuněčné patogeny. Fytoplazmy, významné patogeny rostlin. Univerzita Palackého v Olomouci ve spolupráci s Českou fytopatologickou společností. První vydání, 2008, s. 6 – 25. ISBN 80-903545-2-1 Nečas, O., Hoja, Š., Macků, J., Magrot, T., Soška, J., Soudek, D.: Obecná biologie.Vydalo Státní zdravotnické nakladatelství. První vydání, 1969. 512 s. Nedělník, J., Pokorný, R.: Choroby víceletých pícnin a možnost ochrany proti nim. 2005. URL http://www.vupt.cz/dokumenty/nedel_05_01.pdf Staženo 21. 1. 2010 Olivier, C. Y., Lowery, D. T., Stobbs, L. W.: Phytoplasma diseases and their relationships with icsect and plant hosts in Canadian horticultural and field crops. Canadian Etomologist. Vydal Entomological Society of Canada. Ottawa, 2009. 141: 5. 425 – 462. Orság, P: Meteostanice Hladké Životice, 2009: http://meteo.toje.in/ Staženo 5. 2. 2010 PBHZ, Šlechtitelská stanice Hladké Životice, obrázky semen, webové stránky, 2010: URL http://www.pbhz.cz/praxe/seminka.htm Staženo 22. 1. 2010 PLANstudio: Mapa Hladých Životic, 2005-09: URL http://mapy.cz/#mm=FP@x=141241632@y=134643264@z=15 Staženo 22. 3. 2010 Plantpro: Vše o jabloních. Projekt podporovaný programem Evropské unie Leonardo da Vinci, 2002 – 2005. URL http://www.plantprotection.hu/modulok/cseh/apple/withesbroom_app.htm Staženo 19. 3. 2010 Pokorný, R., Jakešová, H., Poláková, M., Moravcová, H., Řepková, J.: Rezistence mezidruhových hybridů Trifolium spp. k viru žluté mozaiky fazolu. [CDROM]. In Aktuální poznatky v pěstování, šlechtění, ochraně rostlin a zpracování produktů. Vědecká příloha časopisu Úroda, s. 305-308. ISSN 0139-6013 45

Procházka, S., Šebánek, J., Gloser, J., Sladký, Z.: Botanika. Morfologie a fyziologie rostlin. MZLU v Brně. Dotisk druhého vydání, 2006. 242 s.. ISBN 80-7157-870-3 Rotrekl, J.: Hmyzí škůdci semenných porostů vojtěšky (Medicago sativa L.) a ochrana proti nim. 2009 URL http://www.vupt.cz/dokumenty/metodiky/metodika_vojteska2.pdf Staženo 1. 2. 2010 Selgen, a.s., webové stránky: URL http://www.selgen.cz/katalog/agrotechnika-5/jetellucni-71/ Staženo 22. 1. 2010 Skládanka, J.: Multimediální učební texty pícninářství – Jeteloviny, 2005. Mendelova univerzita v Brně. URL http://web2.mendelu.cz/af_222_multitext/picniny/sklady.php? odkaz=jeteloviny.html Staženo 20. 1. 2010 Slavík, B. a kol.: Květena České republiky 4. Nakladatelství Akademie věd ČR, 1995. 532 s. ISBN 80-200-0384-3 Smith, G. R., Rouguette, F. M., Pemberton, I. J.: Registration of „Apache“ arrowleaf clower. Crop Science. USA. 2004. 44: 3, 1018. Stehlík, V. (hlavní koordinátor): Naučný slovník zemědělský. Vydal Ústav vědeckotechnických informací pro zemědělství v Praze. Slovník 2, e – j. První vydání, 1968. 1220 s. 07-005-68-04/11 Slovník 8, q – ř. První vydání, 1981. 628 s. Slovník 12, v. Kudrna, K. (hlavní koordinátor): Vydání první, 1989. 792 s. 07-070-89-04/11 Šindelková, M.: Stolbur, potato stolbur phytoplasma – choroba stále významná. Vydalo Ministerstvo zemědělství ve spolupráci se státní rostlinolékařskou správou, 2006 URL http://www.srs.cz/portaldoc/o_nas/publikace_srs/Stolbur_letak.pdf Staženo 15. 3. 2010 Šutić, D. D., Ford, R. E., Tošić, M. T.: Handbook of plant virus diseases. Boca Raton: CRC Press, 1999. 553 s. ISBN 0-8493-2302-9 The IRPCM (International Research Project for Comparative Mycoplasmology) 46

Phytoplasma/Spiroplasma Working Team – Phytoplasma taxonomy group: ,Candidatus Phytoplasma´, a taxon for the wall-less, non-helical prokaryotes that colonize plant floem and insects. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. Vydal Society for general Microbiology, 2004. 54: 4. 1243 – 1255. Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský, webové stránky: URL http://www.ukzuz.cz/Articles/4178-2Seznam+odrud+zapsanych+ve+Statni+odrudove+knize+.aspx Staženo 29. 1. 2010 Vaverka, S.: Zemědělská fytopatologie. Skripta MZLU v Brně, 1995. 247 s. Widimedia.org, 2008:: Litografie jetele lučního. Otta Wilhelm Thome, 1885. URL http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Illustration_Trifolium_pratense0.jpg Staženo 1. 2. 2010

47

8. SEZNAM OBRÁZKŮ Litografie Otta Wilhelma Thomého z roku 1885 detailně ukazuje jednotlivé části jetele lučního (WIKIMEDIA.ORG, 2008) 1. Porovnání velikosti semen, vlevo 4n, vpravo 2n (PBHZ, 2010) 2. Cucumber mosaic virus (BRUNT ET AL., 1996) 3. Red clover vein mosaic virus (BRUNT ET AL., 1996) 4. Potato virus X (BRUNT ET AL., 1996) 5. Ukázka fytoplazmy pozorovaná elektronovým mikroskopem (CHEN, 2005) 6. a) Zdravý jetel luční vpravo a dvě květenství postižené fylodií vlevo (Davis et al., 2010), b) Fylodie hlávky jetele plazivého (BUSSELEN, 2008) 7. Přibližná pozice kmenových školek je označena oranžovými rámečky (PLANstudio, 2005 – 2009, GPS souřadnice: Loc: 49°41'0.663"N, 17°58'3.681"E)

Seznam obrázků přílohy 9. Světlá rostlina, bez prýtů s květenstvím (Trifolium ambiguum, vzorek č. 25) 10. Rostlina s načervenalými listy, kvete poskrovnu (Trifolium ambiguum, vzorek č. 28) 11, 13. Světlé listy (Trifolium ambiguum, vzorek č. 25; T. medium, vzorek č. 29) 12, 14, 15, 16. Načervenalé listy (Trifolium ambiguum, vzorek č. 21, 27, 28, 30) 17, 18, 19, 20. Zakrslé jetele, netvoří prýty, deformace a skvrnitost listů (JEH 1 V, vzorek č. 16; JEH 1 F, vzorek č. 42; JEH 1 V, vzorek č. 2; JEH 1 V, vzorek č. 9) 21. Zakrslá listová růžice s drobnými namodralými listy (JEH 1 V, vzorek č. 15) 22. Strakatost listu (JEH 1 F, vzorek č. 42) 23, 24, 25, 26. Žluté skvrny a deformace listů (JEH 1 V, vzorek č. 12, 1, 2) 27, 29. Nekrózy a vypadávání pletiv (JEH 1 F, vzorek 35, 36) 28, 30. Z pletiv zbyly jen cévní svazky (JEH 1 V, vzorek č. 10, 9)

48