Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

Pravděpodobnostní charakteristika regulace tvorby hlíz brambor v in vitro podmínkách Diplomová práce

Vedoucí práce:

Vypracoval:

RNDr. Ing. Marek Klemš, Ph.D.

Brno 2010

Bc. Zdeněk Štěpán

Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma: Pravděpodobnostní charakteristika regulace tvorby hlíz brambor v in vitro podmínkách vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.

v Náměšti nad Oslavou dne ……………………. podpis diplomanta

...……….………….

Poděkování: Mé poděkování patří všem zaměstnancům Ústavu biologie rostlin, kterým upřímně děkuji za vytvoření krásného prostředí a za rady, které mi poskytli při psaní této práce. Vedoucímu práce RNDr. Ing. Marku Klemšovi, Ph.D. děkuji za cenné připomínky k diplomové práci a odborné konzultace. Dále děkuji i Dr. Ing. Heleně Fišerové, Mgr. Heleně Vítkové a Ing. Pavle Solnické za trpělivost a pomoc při laboratorním stanovení koncentrací fytohormonů.

Abstrakt: Tato práce se zabývá problematikou tvorby hlízek rostlin bramboru za kultivačních podmínek in vitro v závislosti na dvou úrovních anorganického dusíku v kultivačním médiu a vlivy fytohormonů na proces tuberizace se zdůrazněním jejich vzájemných interakcí. Cílem je objasnit, která úroveň nitrátového dusíku tvorbu hlíz stimuluje a která inhibuje, a také odhalit vzájemnou interakci fytohormonů a jejich vliv na tuberizaci a tak alespoň částečně objasnit životní pochody v tuberizaci rostlin lilku bramboru. Výsledky ze studia vlivu úrovně dusíku na frekvenci tuberizace jsem zpracoval užitím statisticko-matematických metod. Z výsledků práce vyplývá, že snížená koncentrace dusíku v indukčním médiu stimuluje tuberizaci, zvýšení koncentrace ji inhibuje, avšak stimuluje zvětšování hlízek. Snížená produkce ACC a tedy etylénu vede k dřívější a silnější indukci tvorby hlízek, akumulace etylénu v kultivační baňce tvorbu hlíz potlačuje. Cytokininy naopak tuberizaci stimulují. Kyselina abscisová se zvyšovala na počátku aktivace lodyžních segmentů k tuberizaci u rostlin bramboru pěstovaných na médiu obsahujícím sníženou koncentraci dusíku. Tyto principy se v praxi uplatňují při produkci zdravé a vitální sadby hlíz brambor.

Klíčová slova: tuberizace, lilek brambor, RIA, ABA, cytokininy, ELISA, ACC, plynová chromatografie, matematicko-statistické metody, nitrátový dusík, iontově selektivní elektroda

Abstract: This work deals with the problems of induction of tuber formation under two different levels of nitrogen sustenance of potato plants by in vitro cultivation conditions influenced by various phytohormones, the aim is to clear that if nitrogen in this conditions inhibits or inducts the tuber formation and also clear the effect of several phytohormones with emphasis on their interactions. The aim is to clear which level of nitrogen supports tuberization and which inhibit it and also clear if the concrete phytohormone stimulates of inhibits tuberization or other life process, thus to clear some life processes in tuberization of potato plant. The outcomes from the study of the influence of nitrogen level on tuberization frequency were processed with the use of statistical methods. It was found out that the decreased concentration of nitrogen supports tuberization and the increase in the nitrogen concentration inhibits it, but stimulates the growth of the tubers. The decreased concentration of ACC (and thus the ethylene) leads to earlier and stronger tuber induction and the accumulation of ethylene in the incubation vessels inhibits it. The cytokinins on the contrary stimulate the tuberization. The abscisic acid biosynthesis has increased at the start of the potato stem segment activation to tuberization by the plants grown on media containing decreased nitrogen. These principles are important for production of healthy seed tubers.

Key words: tuber formation, potato plant, RIA, ABA, cytokinins, ELISA, ACC, gas chromatography, mathematical and statistic methods, nitrate nitrogen, ion-selective electrode

Obsah: 1. ÚVOD 1 2. CÍL PRÁCE 3 3. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 3 3.1. Tuberizace 3 3.1.1. Indukce a růst stolonů 3 3.1.2. Ukončení růstu stolonů a tvorba hlízek 4 3.2. Vnější faktory ovlivňující tvorbu hlíz, jejich kvantitu a kvalitu 5 3.2.1. Vliv teploty na tvorbu hlíz 5 3.2.2. Vliv vlhkosti na tvorbu hlíz 6 3.2.3. Vliv fotoperiody na tvorbu hlíz 7 3.2.4. Vliv minerální výživy na tuberizaci a zdraví lilku bramboru 9 3.3. Vnitřní faktory tvorby hlíz 10 3.3.1. Hormonální regulace tvorby hlíz 10 3.3.1.1. Význam auxinů pro tuberizaci lilku bramboru 11 3.3.1.2. Význam cytokininů pro tuberizaci lilku bramboru 11 3.3.1.3. Význam giberelinů pro tuberizaci lilku bramboru 13 3.3.1.4. Význam kyseliny abscisové pro tuberizaci lilku bramboru 13 3.3.1.5. Význam etylénu pro tuberizaci lilku bramboru 14 3.3.1.6. Význam kyseliny jasmonové pro tuberizaci lilku bramboru 14 3.2. Crosstalk fytohormonů při tuberizaci 15 4. MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ 16 4.1. Přímé pozorování a ohodnocení počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou mikrohlízkou 17 4.2. Zkoumání vlivu úrovně dusíkaté výživy na vývoj obsahu kyseliny abscisové 18 4.3. Podstata metody RIA (radio-immuno assay) 19 4.4. Vliv úrovně dusíkaté výživy na vývoj obsahu cytokininů 19 4.5. Stanovení produkce etylenu a obsahu ACC metodou plynové chromatografie 21 4.6. Stanovení dusičnanových iontů 21 4.6.1. Stanovení dusičnanových iontů v médiu za použití potenciometrie 21 4.6.2. Stanovení dusičnanových iontů v rostlinné hmotě spektrofotometricky 22 4.7. Odvození regresní funkce pro indukci hlízek a možnosti jejího odvození u cytokininů 22 4.8. Tvar regresní funkce pro morfologický pokus s indukcí hlízek 24 4.9.1. Odvození regresní funkce pro indukci hlízek bez parametrů A1 a A2 26 4.9.2. Numerický výpočet parametrů regresní funkce MNČ 28 4.10. Statistické zpracování výsledků morfologického pokusu, přímého pozorování a ohodnocení počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou mikrohlízkou 28 4.10.1. Analýza rozptylu dvojného třídění k posouzení efektu sezónního opakování pokusu na indukci hlízek (na % baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou k celkovému počtu baněk) 30 4.10.2. Analýza rozptylu dvojného třídění k posouzení efektu ročního opakování pokusu na indukci hlízek (na % baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou k celkovému počtu baněk) 31 4.10.3. Analýza rozptylu dvojného třídění k posouzení vlivu jednotlivých souborů opakování pokusu na indukci hlízek (na % baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou k celkovému počtu baněk) 32

4.10.4. Analýza rozptylu dvojného třídění k posouzení vlivu koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu na indukci hlízek (na % baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou k celkovému počtu baněk) 33 4.10.5. Analýza rozptylu dvojného třídění k posouzení vlivu koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu na hmotnost hlízek 35 5. VÝSLEDKY POKUSŮ 36 5.1. Vypočtené parametry regresní funkce pro indukci hlízek 36 5.2. Vyhodnocení výsledků morfologického pokusu, přímého pozorování a ohodnocení počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou mikrohlízkou 39 5.3. Statistické zpracování výsledků morfologického pokusu, přímého pozorování a ohodnocení počtu vzniklých hlízek k celkovému počtu segmentů 45 5.4. Zpracování výsledků pokusu se stanovením koncentrace cytokininů v čerstvé hmotě rostliny metodou přímá ELISA 47 5.4.1. Vyhodnocení průběhu koncentrace cytokininu metatopolinu během fyziologické přípravy na tvorbu mikrohlízek 47 5.5. Kontrola složení média při zahájení a po skončení pokusů 74 5.6. Zpracování výsledků pokusu se stanovením obsahu dusičnatých iontů NO3- v čerstvé hmotě rostliny spektrofotometricky 74 5.7. Zpracování výsledků pokusu se stanovením vývoje koncentrace ACC u rostlin v lilku bramboru v závislosti na autoregulačních mechanismech 81 5.8. Zpracování výsledků pokusu se stanovením vlivu úrovně dusíkaté výživy na vývoj obsahu kyseliny abscisové 86 6. DISKUSE 91 7. ZÁVĚR 93 8. POUŽITÉ ZKRATKY 94 9. ODKAZY NA CITACE A SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 95 10. SEZNAM TABULEK, GRAFŮ A OBRÁZKŮ 112 10.1. Seznam tabulek 112 10.2. Seznam grafů 120 10.3. Seznam obrázků 126 11. ABSTRAKTY 127 12. PŘÍLOHY A TABULKOVÁ ČÁST 133

1. ÚVOD Rostliny představují jeden z nejdůležitějších faktorů rozvoje lidské civilizace. Už od pradávných dob jsou zdrojem potravin, léčiv a různých surovin včetně paliv a tím zlepšují naše životní podmínky. Získáváme z nich léčiva pro člověka a zvířata (farmaka), ale i pro jiné rostliny (pesticidy - fytofarmaka). V neposlední řadě jsou rostliny zdrojem kyslíku, který je prvkem nezbytným pro tak základní součást života člověka a zvířat, jako je dýchání. V poslední době se různé součásti rostlinného těla (zejména však celulóza) používají na výrobu plastů biologického původu. Snaha zlepšit možnosti využití rostlin je zřejmě stejně stará jako samo zemědělství. Velký pokrok v tomto úsilí nastal ve 20. století, kdy došlo k výraznému rozvoji vědních oborů biotechnologie rostlin, šlechtění, výživy a fyziologie rostlin. Významnou postavou této oblasti lidské činnosti se stal Holanďan Gottlieb Haberlandt, který roku 1902 jako první kultivoval listový mezofyl v podmínkách in vitro. Neznal sice ještě správné složení média z hlediska výživy, jeho kultura byla nesterilní, ale objev, že rostliny lze kultivovat na umělém médiu byl významným milníkem vědy o tkáňových kulturách. Jednou z rostlin, jež je velmi často kultivována in vitro, je rovněž lilek brambor, stará kulturní rostlina se značným hospodářským významem. Tvorba výnosu jeho hospodářsky významné části, hlízy, je předmětem zájmu vědců z mnoha vědních oborů, včetně fyziologie rostlin. Z endogenních látek (vzniklých uvnitř rostliny) lilku bramboru mají pro proces tvorby hlíz klíčový význam různé fytohormony, například cytokininy, ACC a kyselina abscisová. Posledně zmiňovaná látka má význam zejména jako indikátor stresu, při jehož snížení a ustálení hladiny této látky dochází k tvorbě hlíz. Kyselina abscisová (ABA) byla objevena dvakrát nezávisle na sobě – WAREINGEM (1965), jenž izoloval frakci z listů dormantního javoru (Acer pseudoplatanus), jež inhibovala růst segmentů koleoptilí a byla nazvána dormin a kolektivem vědců ADDICOTT et al. (1968) jež izoloval podobnou frakci z opadlých mladých plodů bavlníku a nazval ji kyselinou abscisovou. Ukázalo se, že účinná látka dorminu a kyseliny abscisové je tatáž. Cytokininy jsou fytohormony, které v přítomnosti auxinů (rovněž rostlinné hormony) stimulují buněčné dělení. Rovněž regulují růst rostlin a formování rostlinného těla (VU et al. 2006; SHIMIZU-SATO et al. 2008). Fytohormony se většinou neuplatňují samy, ale zejména v různých vzájemných interakcích (MACHÁČKOVÁ et al. 1997). Poznatky získané při mé práci by snad bylo možno použít pro optimalizaci pěstebních podmínek brambor či pro další modelování

1

chování rostlinných systémů z hlediska obsahu fytohormonů, jejich vzájemných interakcí a vlivu některých exogenních faktorů u lilku bramboru a možná i jiných rostlin, zejména pak z čeledi lilkovité. Pro dosažení optimální tuberizace, a to jak v podmínkách in vitro, tak in vivo, je důležité vytvořit vhodné podmínky – složení kultivačního média, délku dne, teplotu a vybrat vhodný materiál. Pěstování brambor in vitro má značný společenský význam, a to jak pro množení, tak zejména pro ozdravování sadby brambor od různých virových chorob. Uplatňuje se rovněž v procesu šlechtění a dokonce i vytváření geneticky modifikovaných organismů. In vitro kultura bramboru se rovněž dá použít pro záchranu a uchování starých krajových odrůd této plodiny. Velkou výhodou systému pěstování brambor in vitro je jednotnost získaného materiálu, u kterého jsou vyloučeny negativní vlivy spojené s počasím a klimatickými podmínkami stanoviště. Existují však i nevýhody, z nichž největší je jakási odtrženost od vnější, skutečné přírody a nestandardnost fyziologických pochodů a morfologické stavby oproti rostlinám kultivovaným in vivo. I přes tuto menší nepřesnost je však možno výsledky získané pozorováním a pokusy s in vitro materiálem s určitým úspěchem použít pro vyvození závěrů například pro polní kulturu.

2

2. CÍL PRÁCE Cílem práce bylo v in vitro kultivaci odvodit závislost tvorby hlíz na obsahu anorganického dusíku v kultivačním médiu, stanovit změny obsahu ABA, cytokininů, ACC a etylénu v jednotlivých částech rostliny pomocí moderních analytických metod, stanovit dynamiku změn anorganického dusíku v rostlinách a jejich částech a v médiu, pomocí fyziologické analýzy crosstalku fytohormonů odhalit podstatu zkoumaných fytohormonálních závislostí (závislost obsahu cytokininů na čase, závislost obsahu cytokininů na obsahu dusíku, závislost ACC, etylénu a ABA na čase a jejich vzájemné vztahy….), verifikovat, že obsah zkoumaných látek se s časem mění v závislosti na obsahu dusíku a konečně vytvořit alespoň hrubý model chování rostliny lilku bramboru při tuberizaci v podmínkách in vitro. Tohoto cíle mělo být dosaženo pomocí statistických a matematických metod. Jednalo se především o využití dvoufaktorové analýzy rozptylu a o aproximaci hodnot sledovaných veličin regresní funkcí s využitím MNČ. Analýzou rozptylu jsem se snažil získat odpověď na následující hypotézy: −

Vede snížená koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu k výraznější indukci tvorby hlízek u rostliny bramboru?

−

Může mít zvýšení obsahu nitrátového dusíku v indukčním médiu za následek i zvýšení hmotnosti hlízek?

−

Projevuje se efekt opakování pokusu na indukci hlízek stejně?

3. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 3.1. Tuberizace Tuberizace představuje klíčovou vývojovou etapu v životě rostliny bramboru, protože vede k rozmnožování rostliny a z hospodářského hlediska k vytvoření sklízeného produktu této plodiny. Je to proces vytvoření stonkové hlízy, který se skládá z dalších dílčích procesů – indukce stolonů, jejich růst, zastavení růstu stolonů a tvorba vlastních hlízek. Tyto dílčí procesy se však navzájem překrývají (BROWN 2008). 3.1.1. Indukce a růst stolonů Stolony představují boční prýty, které obvykle vznikají z bazálních podzemních internodií hlavních rostlinných stonků a vykazují diageotropický způsob růstu. Skládají

3

se z prodloužených internodií, spirálně uspořádaných šupinovitých lístečků a hákovité špičky s apikálním meristémem. Obecně se iniciují nejdříve v bazálních kmenových uzlinách a teprve až potom ve vyšších uzlinách. Stolony mohou být iniciovány z nadzemních stonkových uzlin a tato schopnost se projevuje tvořením vzdušných hlízek. Stolonizace z nadzemních uzlin se zřídka projevuje v polní kultuře, pro niž je typická tvorba výhonků s velkým množstvím listů, jež potlačuje růst z laterálních pupenů. Přiměřená vlhkost a temnota podporuje stolonizaci v bazálních uzlinách, ale jen v přítomnosti dominantního vrcholku stonků (BROWN 2008). Autor při vzniku stolonů sledoval nejprve prodlužování laterálních pupenů, a to v průběhu jednoho dne od pasážování při pěstování v nepřetržité temnotě. Při růstu stolonů dochází k prodlužování buněk a jejich příčnému dělení, čímž vznikají podélné celky buněk (VREUGDENHIL et al. 1999). Při jiném pokusu během prvních čtyřech dnů kultivace pupeny vyrostly v 1 cm dlouhé stolony s osmi internodiemi. Dva bazální listy nikdy nevyrostly. První internodium nad dvěma bazálními listy (počítáno od báze k apexu pupenu) bylo jediné dostatečně prodloužené k tomu, aby vytvořilo stolon. (XU et al. 1997).

3.1.2. Ukončení růstu stolonů a tvorba hlízek

Vývojová změna spojená s tvorbou hlízek začíná indukcí jejich tvorby, kdy apex stolonu získává schopnost hlízku vytvořit. Indukce zahrnuje signály z prýtu, které je možno přenést jeho transplantací (BROWN 2008). Fyziologická změna, ke které dochází během indukce, se nejdříve projeví postupným zpomalováním a ustáváním prodlužování buněk stolonu. Dochází také ke zvětšování šířky koncové části stolonu a jeho radiálnímu růstu (VREUGDENHIL et al. 1999). Při pěstování ve tmě dochází nejdříve ke ztluštění kolem první uzliny nad dvěma bazálními listy (XU et al. 1997). Důvodem je zahájení podélného dělení, které je s průběhem času stále intenzivnější a postupně k němu dochází nejen v apikální, ale i v subapikální oblasti. Plochy dělení buněk se postupně stávají náhodnými (VREUGDENHIL et al. 1999). Průměrná velikost buňky v této oblasti se zvětší v průběhu pokusu z 20 na 35 µm. Prvním viditelným náznakem tuberizace je zduřenina subapikální oblasti špičky stolonu. Během indukce hlízek dojde ke změně orientace cytoskeletu koncové části stolonu z podélné do radiální osy, což umožňuje příčný růst buněk. Na začátku radiální expanze stolonu dochází ke zvětšení turgoru pletiv, což může být součástí tuberizačního stimulu. Během procesu tuberizace se zastaví mitotická aktivita apikálního meristému a změny metabolizmu 4

sacharidů mají za následek rychlou akumulaci škrobu a pro hlízky specifických glykoproteinů (především patatinu) v nově utvářených buňkách hlízky. Během růstu hlízy pokračuje buněčné dělení (zejména v perimedulární oblasti hlízy), zvětšování jejího objemu a hromadění škrobu (BROWN 2008). Bazální část hlízy, která v případě pěstování ve tmě představovala 1/3 délky hlízy, tvořila 2-3 mm dlouhá horní část prvního internodia, celé druhé internodium tvořilo střední část hlízy a třetí internodium tvořilo horní část hlízy (XU et al. 1997). Indukce hlízek a tuberizace jsou citlivé na podmínky prostředí. Tvorba hlíz je obvykle podporována krátkou fotoperiodou doprovázenou vysokou intenzitou osvětlení a nízkými dávkami dusíku. Tuberizace je také citlivá na teplotu, je potlačována vysokými teplotami, kdežto růst hlízek je podporován nízkými teplotami. Fotoperiodická cesta regulující krátkodenní indukci hlízek zahrnuje prvky fotoperiodické cesty kvetení, jako například proteiny fytochrom B, constans a flowering locus T. Pro tuberizaci je nutný přenos indukčního signálu z prýtu do vrcholku stolonu (BROWN 2008).

3.2. Vnější faktory ovlivňující tvorbu hlíz, jejich kvantitu a kvalitu Vnější faktory tvorby hlíz představují vlivy vnějšího prostředí na rostlinu lilku bramboru, které tuberizaci buď stimulují, nebo naopak inhibují (potlačují), přičemž jejich celkový vliv se navzájem sčítá či odečítá. Vnější faktory tuberizace společně s genetickou výbavou rostlinky bramboru regulují stav a vývoj vnitřních faktorů tuberizace. Vnějších vlivů je celá řada – teplota, vlhkost, fotoperioda, minerální výživa, agrotechnika a jiné.

3.2.1. Vliv teploty na tvorbu hlíz

NAM et al. (2005) pozoroval nejvyšší aktivitu derivátů lipooxygenázových metabolitů podporujících indukci tuberizace při teplotě 15°C a se vzrůstající teplotou se snižoval. Obsahy dalších látek podporujících tuberizaci, kyseliny jasmonové, kyseliny tuberonové a glykosidu kyseliny tuberonové reagovaly na teplotní podmínky podobně jako lipooxygenázové metabolity (NAM et al. 2008; OTROSHY et al. 2009). Teplota během in vitro pěstování může ovlivnit množství vytvořených mikrohlízek (WANG et HU 1982; AKITA et TAKAYAMA 1994). Podle OTROSHY et al. (2009) způsobovaly nižší teploty v průběhu vývoje rostliny vyšší počet hlízek, jejich vyšší hmotnost, větší 5

délku a hmotnost stolonů. Nejranější tvorba hlízek byla zaznamenána při teplotě 15°C, nicméně jejich růst probíhal nejlépe při teplotě 20-25°C (NAM et al. 2008; OTROSHY et al. 2009). Podle WANG et HU (1982) je průměrný počet mikrohlízek nižší při vyšší teplotě v in vitro kultuře (28°C ve světelné i temnostní fázi) než při nižších teplotách (20°C ve světelné i temnostní fázi). Nejoptimálnější teplota pro tuberizaci v podmínkách in vitro je podle WANG et HU (1982) 20°C, podle AKITA et TAKAYAMA (1994) je to teplota mezi 15 a 18°C. Růst a vývoj bramborových hlíz v polních podmínkách jsou silně negativně ovlivňovány vysokou teplotou půdy a vzduchu (EWING 1981). Rostlina bramboru je nejlépe adaptována na průměrnou teplotu 17°C (INGRAM et MCCLOUD 1984). Vysoká teplota zpožďuje iniciaci stolonů a hlízek (GREGORY 1956) a raný růst hlízek, pro který jsou optimální teploty 15-19°C (VAN DAM et al., 1996). Vysoká teplota rovněž zpožďuje depozici produktů sacharidového metabolismu do hlíz a tvorbu sušiny hlíz, což má za následek nízké sklizňové indexy (STRUIK et EWING, 1995). MENZEL (1985) ve své práci uvádí, že nízká teplota potlačuje růst stonků a zrychluje tvorbu sušiny hlíz. Zpoždění ve tvorbě hlízek nicméně může vést k vyšší konečné úrodě, ale to jen tehdy, pokud je vegetační doba dostatečně dlouhá k tomu, aby rostliny mohly mít prospěch z delšího fungování svých nadzemních částí (STRUIK et EWING, 1995). Nicméně STRUIK et al. (1989) při vyšších teplotách pozorovali zvýšené větvení stolonů, což může vést k většímu celkovému počtu vytvořených hlízek. Jde zde však zřejmě o interakci mnoha vnějších faktorů, jež nakonec celkovou sklizeň hlízek určí. Navíc bylo pozorováno, že pokud jsou teploty během temnostní i světelné fáze stejné, je výnos mikrohlízek vyšší, než pokud se teplota během temnostní a světelné fáze střídá (WANG et HU 1982). Naproti tomu BENNETT et al. (1991) pozorovali, že změny teplot mezi světelnou a temnostní fází jsou pro vývoj celé rostliny (včetně indukce tuberizace) výhodné.

3.2.2. Vliv vlhkosti na tvorbu hlíz

Lilek brambor je v polních podmínkách mělce kořenící plodinou, která negativně reaguje na výkyvy v dodávkách vody a vyžaduje častější zavlažování než některé jiné plodiny (DURRANT et al. 1973; FULTON 1970). Na úrodě bramborových hlíz se projevují negativně i malé chyby v managementu zavlažování. Do budoucna se může stát důležitým plánované zavlažování podle evapotranspirace plodiny a tlaku vody v půdě. Na vodním stresu působícím na rostlinu bramboru se navíc podepisuje i 6

to, že tato plodina bývá většinou pěstována na půdách s nižší a střední vododržností (SHOCK et al. 2007). Brambory zavírají svá stomata při daleko nižším vodním stresu než jiné plodiny (WRIGHT et STARK 1990). Z toho vyplývá, že vodní stres (i slabý) významně ovlivňuje fyziologické procesy v rostlinách bramboru a tudíž i kvantitu a kvalitu bramborových hlíz. Rovněž snížená dostupnost živin při vodním stresu negativně ovlivňuje úrodu brambor. Proto je rostlina bramboru citlivá na nedostatečné zavlažování. Lilek brambor začíná na podmínky závlahy reagovat ještě před iniciací hlízek (SHOCK et al. 2007). Delší doba trvání vodního stresu způsobeného suchem způsobuje snížení počtu nasazených hlízek na stonek (MACKERRON et JEFFERIES 1986). SHOCK et al. (1992) pozorovali významné snížení úrody při tlaku vody v půdě pod 60 kPa. Podle řady autorů (ELDREDGE et al. 1992; HILLER et al. 1985; HOOKER 1981; REX et MAZZA 1989; SHOCK et al. 1993) jsou s vodním stresem a prudkými změnami půdní vlhkosti spojeny fyziologické poruchy hlíz, jako například hnědý střed, duté srdéčko, sekundární růst či citlivost k otlakům. Negativně je ovlivněn rovněž obsah škrobu a sušiny (HANG et MILLER 1986; MILLER et MARTIN 1987; STARK et MCCANN 1992; WESTERMAN et al. 1994; SHOCK et al. 1993). Rovněž však příliš velká vlhkost a nadměrné zavlažování mohou negativně ovlivnit kvalitu i kvantitu hlíz, které jsou pak vodnaté, a rostlina nadměrně trpí chorobami. Negativní efekt při příliš intenzivní závlaze má rovněž vyplavování živin a nízká aerace půdy (SHOCK et al. 1998). U rostlin pěstovaných na příliš vlhkých půdách se objevuje zduření lenticel (TIMM et FLOCKNER 1966) a projevuje se u nich sekundární růst (BRADY et PRATT 1955; BUSHNELL 1956; HOLDER et CARY 1984). Úroda hlízek se snižuje s nadměrnou závlahou (SHOCK et al. 2007). Přílišná vlhkost v raných fázích vývoje hlízek může způsobit vznik hnědých skvrn dužniny bramboru (HILLER et KOLLER 1984).

3.2.3. Vliv fotoperiody na tvorbu hlíz

Tuberizace rostlin bramboru je silně ovlivňována délkou dne, přičemž krátké dny a dlouhé noci tuberizaci podporují. Tuberizační odpověď na světlo je však závislá na druhu, genotypu a prostředí (GREGORY 1965; MENDOZA et HAYNE 1976; EWING 1985;). U některých komerčních kultivarů bramboru se však tuberizace projevuje i při nepřetržitém osvětlení, pokud jsou teploty nízké nebo proměnlivé tak, 7

aby rostliny měly termoperiodu (GREGORY, 1965; WHEELER et TIBBITTS, 1986). To naznačuje, že vliv prostředí může být zrušen různými jinými stimuly prostředí, jako je ozáření intenzivním světlem či proměnlivé teploty (EWING, 1985; WHEELER et al., 1991). Zatímco kulturní brambor je na fotoperiodu relativně málo citlivý, tak plané druhy, jako například Solanum demissum Lindl. nebo Solanum tuberosum L. ssp. andigena jsou při své tuberizaci na fotoperiodu kompletně odkázány (AMADOR et al. 2001). Tyto druhy tuberizují pouze při pěstování v podmínkách krátkého dne, pěstování za dlouhého dne či přerušení noční tmy má za následek inhibici tuberizace (EWING et STRUICK

1992).

Proto

jsou

tyto

druhy

ideálním

modelem

pro

studium

fotoperiodického ovlivnění tuberizačního procesu. Je totiž možné mít u nich celé skupiny rostlin, které jsou čistě na základě fotoperiody indukovány či neindukovány k tuberizaci. Důležitější pro tyto druhy než délka dne je ale délka noci (AMADOR et al. 2001). RASUMOV (1931) pozoroval, že rostliny Solanum demissum Lindl. a Solanum acaule Bitter tuberizovaly nejlépe, když jim byly v raných fázích růstu poskytnuté dlouhé dny, následované krátkými dny, což naznačuje obligátní požadavek na krátké dny pro tuberizaci u těchto druhů. Ale například na Solanum tuberosum L. cv. Guapa měla fotoperioda z hlediska tuberizace jen minimální vliv. Největší sušinu a hmotnost měly rostliny ošetřené dlouhými dny, největší počet hlíz byl u rostlin pěstovaných na podmínkách krátkého dne (RASUMOV 1931). Nejlepší antituberizační účinek na rostliny pěstované na krátkém dni mělo dlouhé přerušení temnostní fáze červeným světlem. Tento účinek inhibující tuberizaci však může být zvrácen, a to pokud jsou rostliny ihned po ošetření tímto světlem ošetřeny dlouhovlnným červeným světlem. Zřejmě se zde uplatňuje vliv fotoreceptoru fytochromu (BATUTIS et EWING 1982). Práce AMADOR et al. (2001) ukázala, že fytochrom PHYB má zásadní vliv na tuberizaci zejména u planých druhů brambor, částečně však také u kulturního bramboru. Použitím protismyslného přístupu se u krátkodenního druhu Solanum tuberosum L. ssp. andigena se podařilo dokázat, že rostliny s redukovaným množstvím PHYB ztratily fotoperiodickou kontrolu tuberizace a tuberizovaly jak při krátkodenním, tak i dlouhodenním ošetření (JACKSON et al. 1996). Zdá se, že PHYB poskytuje negativní kontrolu, tj. inhibuje tuberizaci za světelně nepříznivých podmínek. Roubovací experimenty dokázaly, že tento fotoreceptor kontroluje syntézu roubem přenosného signálu inhibujícího tuberizaci, který se vyskytuje u dlouhodenních rostlin a chybí nebo je neaktivní u PHYB-protismyslných rostlin (JACKSON et al., 1998). Za dlouhodenních podmínek, nepříznivých pro tuberizaci, v rostlinách lilku bramboru 8

dochází ke zvýšení hladiny giberelinů, které tuberizaci inhibují (JACKSON et al. 1996). Rostliny pěstované na krátkém dni vykazovaly nižší hladinu cytokininů, ale i giberelinů (AKSENOVA et al. 2008). Na fotoperiodě závislá tuberizace se dělí do pěti chronologických stádií: percepce krátkých dnů (ůčastní se jí především listy), adaptace na krátké dny, vytvoření tuberizačního signálu v listech a jeho přenos stonkem do podzemní části rostliny, vznik hlízek a změna metabolismu související s tvorbou hlízek. U rostlin silně indukovaných k tuberizaci krátkým dnem se zejména u planých druhů vyžadujících krátkodenní podmínky k tuberizaci, mohou vytvářet hlízky přímo na hlavním stonku (MARTÍNEZ-GARCÍA et al. 2002).

3.2.4. Vliv minerální výživy na tuberizaci a zdraví lilku bramboru

Minerální výživa představuje důležitý faktor tvorby výnosu lilku bramboru, a to jak v podmínkách in vivo, tak in vitro (WANG et HU 1985). Rostliny, jež mají málo fosforu, produkují velmi malé hlízky, ukládají do hlízek více cukru, ale mají celkově o něco méně sušiny než rostliny dostatečně hnojené; navíc jsou citlivé vůči chorobám a v období sklizně jsou již často přezrálé; rostliny mají méně kořenů, méně je i stolonů a ty jsou kratší; dužnina hlíz je hnědě tečkovaná (PAVLISTA et BLUMENTHAL 2000). Dostatek fosforu v době tuberizace zvyšuje množství vytvořených hlízek (FREEMAN et al. 1998, JENKINS et ALI 2000). Celková sklizeň je při vyšších dávkách fosforu vyšší (ROSEN et BIERMAN 2008). Rovněž podporuje nárůst zelné hmoty (HASSANPANAH et al. 2009). Brambor je na počátku svého růstu náročný rovněž na příjem dostatečného množství dusíku, jeho nadbytek však tuberizaci inhibuje (STALLKNECHT et FARNSWORTH 1979; WATTIMENA et al. 1983). Význam dusíku spočívá především v tom, že rostlinám umožňuje utilizovat uhlík. Dostatečný přísun dusíku zvyšuje intenzitu růstu rostlin, vede k větším listovým povrchům a rozměrům hlízek (HASSANPANAH et al.

2009). Rostliny dostatečně zásobené

dusíkem jsou rovněž odolnější proti skvrnitosti listů (PANDEY 2002.) Avšak nadbytečný přísun dusíku, zejména v pozdějších fázích růstu, způsobuje nadměrný vývin stonků a listů na úkor růstu hlíz, což je důsledek velkého množství aminokyselin a amidů, které se nepřeměňují v proteiny. Způsobuje tedy snížení kvantity a kvality hlíz. Nižší dávka dusíku vede ke zvýšení počtu hlízek na rostlinu, ale snížení velikosti hlízek (SARKAR et NAIK 1998; MCDOLE 1978; SATYANARAYANA et ARORA 1985). Dalším z důsledků nízkého příjmu dusíku je snížená fotosyntéza, protože spodní listy za 9

takovéto situace žloutnou a opadávají. Zvýšení poměru mezi amonným a nitrátovým dusíkem v médiu vedlo ke snížení počtu a hmotnosti hlízek (GARNER et BLAKE 1989). Pro vysoké sklizně brambor je potřeba rostlinám lilku bramboru dodat dostatečnou dávku draslíku (ERREBHI et al. 1998). Dostatečné hnojení draslíkem naopak celkovou sklizeň zvyšuje (WESTERMANN et al. 1994). Nadměrné hnojení draslíkem však snižuje hmotnost hlízek (MCDOLE 1978). Sušina a velikost hlízek se při příliš vysokých dávkách draslíku rovněž snižuje (TERMAN et al. 1953; TIMM et MERKLE 1963).

3.3. Vnitřní faktory tvorby hlíz Jedná se o faktory tuberizace, jež mají svůj původ uvnitř rostliny. Odvozují se však určitým způsobem od vnějších faktorů tuberizace, závisejí na nich a jsou jimi ovlivňovány. Jedná se především o vliv fytohormonů, na němž tuberizace (stejně jako jiné životní pochody lilku bramboru a rostlin obecně) závisejí.

3.3.1. Hormonální regulace tvorby hlíz

Fytohormony většinou představují zásadní endogenní faktor tuberizace. Slouží k odstartování přeměny stolonu v hlízu, udržují její růst a po čase vyvolají její dormanci, aby nedošlo k vyrašení v podmínkách, které jsou nevhodné pro růst nadzemních částí rostliny. Některé fytohormony však naopak tvorbu hlíz inhibují či vyvolávají jejich rašení. Hormony buď vznikají přímo v hlíze bramboru, nebo jsou do ní transportovány.

Korelativní hormonální signály na dlouhou vzdálenost jsou

významnými posly v tuberizačním procesu, ale i v koordinaci růstu a vývoje rostlin, a z tohoto důvodu jsou významné z vědeckého i zemědělského hlediska. Kvantitativní analýza těchto hormonálních signálů “během transportu” je obtížná a z mnoha důvodů nejsou její výsledky v současné době příliš spolehlivé. Celkově tyto signály garantují vývoj rostliny optimálně nastavený k předurčenému habitu rostliny. Záležitost hormonální regulace je navíc ještě komplikována tím, že transportními cestami těchto látek může být xylém, floém, apoplast a symplast (BANGERTH 2008). Chování těchto signálů je velmi komplexní, zahrnuje oběh, zpětný obrat a interakce (“crosstalk”) mezi signálními molekulami stejné nebo různé povahy (JESCHKE et al. 1997; MARSCHNER et al. 1996; HARTUNG et al. 2002; DODD 2005; TREWAVAS 2005).

10

Metabolickým obratem se v těchto pracích myslí putování minerálu nebo hormonu, který je transportován z kořene do výhonku xylémem a retranslokován po nasátí do floému zpět do kořene. Zpětný obrat potom znamená přijetí toho samého hormonálního signálu do xylému a jeho opětovný transport do výhonku.

3.3.1.1. Význam auxinů pro tuberizaci lilku bramboru

Ačkoliv se věří, že auxiny jako látky podporující buněčně dělení mají příznivý vliv na tuberizaci, skutečná pozorování efektů exogenně aplikovaných auxinů mají často protichůdné výsledky. HARMEY et al. (1966) pozoroval zvětšení velikosti a ranější tvorbu indukovaných hlízek po ošetření IAA, kdežto u OBATA-SASAMOTO et SUZUKI (1979) byl obsah auxinů v rostlinách bramboru největší ve fázi před iniciací tuberizace a v jejím průběhu se snižoval. Při nízké koncentraci sacharózy v médiu (1%) zvyšovala IAA celkovou biomasu rostlin. Se zvyšující se koncentrací sacharózy v médiu se příznivý vliv IAA na celkovou biomasu snižoval a při vysokých dávkách sacharózy (8%) v médiu IAA celkovou biomasu snižovala. IAA podporovala růst kořenů a hlízek a inhibovala růst stolonů. Při vysoké koncentraci sacharózy (8% v médiu) IAA růst hlízek inhibovala (ROMANOV et al. 2000). V pokusu ZHANG et al. (2005) došlo k prodloužení délky stolonu se zvětšující se dávkou IAA. IAA zvyšovala počet a hmotnost kořenů, ale snižovala délku kořenů. Snižovala počet hlízek, ale zvyšovala jejich hmotnost a příčný průměr. SUTTLE (2003) pozoroval zvýšení produkce etylenu a inhibici růstu stolonů po ošetření auxiny. Vliv exogenních auxinů na tuberizaci závisí na použité koncentraci – nižší koncentrace (≤ 5 µM) indukuje tuberizaci, kdežto vysoká koncentrace ji inhibuje (WANG et HU, 1982). Podle MANGAT et al. (1984) nízká koncentrace 2,4-D (0,1-1 µM) podporuje počet vytvořených hlízek v in vitro kultuře. V jejich experimentu vysoká koncentrace 2,4-D (10 µM) vyústila ve zvýšenou tvorbu stolonů a inhibici vytváření hlízek. ANJUM et VILLIERS (1997) při nižší koncentraci 2,4-D pozorovali zvýšené množství vytvořených hlízek.

3.3.1.2. Význam cytokininů pro tuberizaci lilku bramboru

Podle ZAKARIA et al. (2008) byla tvorba hlízek nejranější (objevila se už po 13,3 dne) u média s obsahem 10 mg.l-1 BA, jiná koncentrace (ať už vyšší, nebo nižší) 11

tuberizaci významně oddalovala. Nejdelší doba od pasážování do vytvoření první hlízky uplynula u média bez obsahu BA (20,1 dne). Počet hlízek na nádobu se zvyšoval s obsahem cytokininu až po obsah 10 mg.l-1 BA, potom se začal s rostoucí koncentrací BA v médiu významně snižovat. Koncentrace 10 mg.l-1 BA poskytovala nejvyšší hmotnosti vytvořených mikrohlízek. Podle SHIBLI et al. (2001) cytokininy zpomalují až inhibují tvorbu kořenů a podporují přeměnu listnatých stonků ve stolony. WANG et HU (1982) uvádějí, že pro podporu a indukci tuberizace vyvolanou cytokininy je potřeba koncentrace sacharózy v médiu o velikosti alespoň 4% (ZAKARIA et al. 2008). O cytokininech je známo, že podporují dělení buněk (SKOOG et MILLER 1957), inhibují jejich prodlužování (VANDERHOEF et KEY 1968) a podporují růst jejich objemu (SCOTT et LIVERMAN 1956), což jsou všechno buněčné životní pochody nezbytné pro tuberizaci. KODA et OKAZAWA (1983) pozorovali u prodlužujících se špiček stolonů nízký obsah cytokininů, avšak poté, co došlo ke zduřování a tvorbě hlízek, se jejich koncentrace ve špičce stolonu, proměňující se v hlízku, zvýšila. Po ukončení tuberizačního procesu se obsah cytokininů v nově vzniklých hlízkách poněkud snížil. Cytokininy jsou syntetizovány v kořenech, ale rovněž v nadzemní části rostliny (NORDSTRÖM et al. 2004). V pokusu, jehož cílem bylo zjistit místo biosyntézy cytokininů, tito autoři oddělili kořeny a výhonky Arabidopsis a inkubovali je zvlášť v tekutém médiu obohaceném o 30% 2H2O. Značení deuteriem in vivo vyústilo v izotopometrický shluk pro kořen a výhonek, což jasně demonstrovalo kapacitu syntetizovat 2H-zeatinribosid-5′-monofosfát v obou typech pletiv. Toto pozorování, že nadzemní část rostliny je významným zdrojem biosyntézy cytokininů, bylo impulzem pro další experiment, kde použili tabák k objasnění místa tohoto zdroje. Analyzovali rozměr zásoby a rychlost biosyntézy

2

H-zeatinribosidu a

2

H-zeatinribosid-5′-

monofosfátu v izolovaných listech různých velikostí: velké listy, kde růst skončil, listy ve fázi růstu a malé listy s aktivním buněčným dělením a pouze limitovaným růstem. Největší kapacitu syntetizovat 2H-zeatinribosid a 2H-zeatinribosid-5′-monofosfát měly mladé vyvíjející se listy s aktivním buněčným dělením, což se také odráží v rozměru endogenní zásoby těchto fytohormonů. Kořeny zprostředkovaná syntéza cytokininů závisí na vyvinutých postranních kořenových primordiích (NORDSTRÖM et al. 2004). Tito autoři kvůli objasnění lokalizace kořeny zprostředkované syntézy cytokininů použili dvojitého mutanta axr4-2 Χ aux1-7, který nevytváří takřka žádné postranní kořeny (HOBBIE et ESTELLE 1995). Kvantifikace zásob endogenních ribotidů odhalila, že tento mutant obsahoval významně snížená množství isopentenyladenosin12

5′-monofosfátu, což ukazovalo, že snížené množství kořenových meristémů vyústilo ve snížení množství produkovaného isopentenyladenosin-5′-monofosfátu (jednostranný t test; p > 0,05), přičemž došlo pouze k menší, nevýznamné redukci zásoby 2Hzeatinribosid-5′-monofosfátu.

3.3.1.3. Význam giberelinů pro tuberizaci lilku bramboru

Gibereliny podporují tvorbu a prodlužování stolonů (SMITH et RAPPAPORT 1969). GA stříkaná na listy způsobovala velkou délku stolonů, a to jak u krátkodenního, tak u dlouhodenního ošetření (HAMMES et NEL 1975). MENZEL (1980) pozoroval inhibici tvorby hlízek při ošetření vysokými koncentracemi GA. TIZIO (1977) dokázal, že zřejmě všechny gibereliny tuberizaci inhibují, avšak podle MARKAROV (1990) se může za krátkodenního ošetření tuberizace projevit i při ošetření gibereliny, je však zpožděná, hlízky jsou menší a na rostlině jich vznikne méně. V pokusu XU et al. (1998) docházelo se zvyšující se koncentrací GA 4/7 ke zpožďování tuberizace, její redukci a snížení synchronnosti tuberizačního procesu. Při koncentraci 0,3 µM GA 4/7 se první hlízky vytvořily ve 14. dni, při koncentraci 1 µM GA 4/7 však až ve 20. dni. Se zvyšující se koncentrací GA 4/7 se snižovala šířka hlízek a zvyšovala se délka stolonů. Čím vyšší byla koncentrace GA 4/7, tím méně pravidelný měly hlízky tvar a byly menší. Při koncentraci 1 µM GA 4/7 se nevytvořily žádné hlízky a stolony byly extrémně dlouhé. Pokud byly rostliny pěstovány na médiu bez obsahu GA 4/7, na stolonech se objevily hlízky. Jestliže byly tyto rostliny s hlízkami přemístěny do média s obsahem 0,5 µM GA 4/7, došlo ke zvratu ve vývoji hlízek a z apikální oblasti těchto hlízek vyrašily opět stolony. Jejich velikost však zůstala nezměněna. Z toho plyne, že GA mají svůj význam především pro stolonizaci.

3.3.1.4. Význam kyseliny abscisové pro tuberizaci lilku bramboru

KODA et OKAZAWA (1983) pozorovali, že při pěstování rostlin bramboru v médiu, jež obsahovalo pouze sacharózu a kyselinu abscisovou docházelo se zvyšováním její koncentrace v médiu ke zvětšování počtu založených hlízek; tyto hlízky se však bez dodání ostatních hormonů jen minimálně zvětšovaly, což naznačuje, že kyselina abscisová má význam zejména pro založení hlízek, nikoliv pak už pro jejich růst. Podle

13

XU et al. (1997) ABA stimuluje tuberizaci a snižuje délku stolonů. Podstatou jejího vlivu je podle nich snížení vlivu giberelinů na tuberizaci. MENZEL (1980) objevil, že se zvyšující se koncentrací ABA dochází ke zkrácení doby od založení experimentu do objevení se první hlízky. PALMER et SMITH (1969) naopak pozorovali inhibici tuberizace pod vlivem ABA. XU et al. (1997) uvádějí, že se koncentrace ABA v průběhu vývoje pupenu ve stolon a nakonec v hlízku snižuje.

3.3.1.5. Význam etylénu pro tuberizaci lilku bramboru

Podle MINGO-CASTEL et al. (1974) etylén tuberizaci v nižších dávkách stimuluje, avšak ve vyšších inhibuje potlačením vlivu cytokininů a oxidu uhličitého. Při nadbytku etylénu jsou hlízky protáhlé a neobsahují téměř žádný škrob. Při vysokých dávkách etylénu v kultivačním médiu a nedostatečném obsahu oxidu uhličitého se na bázi stolonů rostlin bramboru vytvářely čistě bílé kalusy bez obsahu chlorofylu. Nadměrný obsah etylénu u rostlin bramboru dále způsoboval diageotropický růst, vznik tvrdého hákovitého zakončení stolonu a tenčí a kratší stolony.

3.3.1.6. Význam kyseliny jasmonové pro tuberizaci lilku bramboru

Kyselina jasmonová podporuje tuberizaci, přičemž tato stimulace je větší u ranějších kultivarů bramboru a s délkou vegetace potřebné k založení hlíz slábne. Pozitivní vliv této látky na tuberizaci je velmi silný (KODA et al. 1991). KODA et KIKUTA (2001) pozorovali rovněž vliv doby délky vegetace bramboru potřebné pro vytvoření hlíz na velikost tuberizační odpovědi na kyselinu jasmonovou – nejlépe po dodání kyseliny jasmonové tuberizovaly rané kultivary, menší hlízky, jichž se vytvořilo méně, měly středně pozdní rostliny a pozdní rostliny reagovaly na kyselinu jasmonovou jen velmi slabě. Naopak ale u extrémně pozdních kultivarů KODA et KIKUTA (2001) pozorovali silnější příznivý vliv kyseliny jasmonové na tuberizaci. Podle CENZANO et al. (2003) u hákovitých zakončení apexů stolonů kyselina jasmonová zvyšuje tloušťku meristémů a snižuje délku listových primordií. Urychluje diferenciaci vodivých pletiv v hlízce, konkrétně pak přeměnu prokambia v xylém. Způsobuje změnu tvaru průřezu buněk hlízek z mnohostěnu na přibližný ovál. Zvyšuje rovněž rozměry buněk hlízek. Způsobuje také zduřování pupenů hlíz. Rovněž byl pozorován inhibující vliv kyseliny

14

jasmonové na růst stolonů při vyšších koncentracích (7,5÷10,0 µM) u raných kultivarů. Kyselina jasmonová neměla žádný účinek na počet hlízek. U raných kultivarů kyselina jasmonová podporovala tvorbu sušiny. Jasmonová kyselina zvyšuje redukující a celkové cukry v hlízkách včetně obsahu škrobu (SARKAR et al. 2006).

3.2. Crosstalk fytohormonů při tuberizaci Crosstalk jako jeden ze základních regulačních mechanismů rostlin představuje interakci mezi jedním nebo dvěma hormonálními signály na velkou vzdálenost v reakci na hormonální signál, kterým může být buď zvýšení, nebo snížení obsahu jiného fytohormonu (ROSS et al. 2000; HAVER et al. 2003; HARTIG et BECK 2006), nebo interakce mezi signálními molekulami rozdílných skupin (např. mezi hormonálními a minerálními signály jako např. NO3- a cytokininy nebo mezi bórem a polárním auxinovým transportem (TAKEI et al. 2002; COLLIER et al. 2003; RAHAYU et al. 2005; WANG et al. 2006), nebo hormonální a cukerné signály (HAVELANGE et al. 2000; HARTIG et BECK 2006; ROLLAND et al. 2006). Zdá se, že výše uvedené interakce mezi těmito signály na dlouhou vzdálenost hrají nejvýznamnější roli, protože na rozdíl od ostatních signálních molekul jsou schopny ovlivňovat a regulovat takřka všechny vývojové procesy v rostlinách (BANGERTH 2008). Auxiny podle názoru REDMANA et al. (2004) představují aktivátor

genu

AtCKX6,

jenž

je

zodpovědný

za

tvorbu

cytokininoxidázy/dehydrogenázy, jejímž účinkem je odbourávání izoprenoidních cytokininů v rostlině. Poté, co hladina auxinů vystoupá na určitou úroveň, dojde k odstartování aktivace cytokininoxidázy/dehydrogenázy, která odbourává cytokininy typu zeatinu a izopentenyladeninu a jejich ribosidů. Podle REDMANA et al. (2004) je tento

stav

pouze

dočasný,

rostlina

se

přizpůsobí

zvýšenému

obsahu

cytokininoxidázy/dehydrogenázy a i přes tuto její hladinu začne obsah cytokininů znovu růst. Poměr auxinu a cytokininu určuje podle SKOOGA et MILLERA (1957) morfogenní odpověď; vysvětlují to tak, že odbouráváním cytokininu cytokinin oxidázou/dehydrogenázou postupně vrůstá poměr auxinu a cytokininu nad vyrovnaný poměr a tím se posílí tvorba bočních kořenů, dojde k potlačení dominance apexu hlavního kořene, posílení apikální dominance apexu prýtu a tvorbě bočních větví, lístků a pupenů. Pokud je naopak poměr auxinu a cytokininu nižší než vyrovnaný, je podporována tvorba hlavního (tj. kůlového) kořene, dochází tedy k posílení apikální

15

dominance kořene, dále k potlačení apikální dominance apexu prýtu, tvorbě bočních větví, lístků a pupenů. NORDSTRÖM et al. (2004) nepozorovali vliv cytokininů na obsah auxinů v rostlině. KEFELI et KALEVITCH (2003) popsali, že mezi růstem rostliny a obsahem IAAoxidázy existuje inverzní závislost. Obsah IAAoxidázy tedy klesá se zrychlujícím se růstem většiny rostlin. Cytokininy v rostlině jsou ovlivňovány obsahem nitrátového dusíku a ten ovlivňuje obsah cytokininů. ABROL et al. (1983) popsal zvýšení koncentrace nitrátreduktázy a tedy i nitrátového metabolismu u rostlin, jimž byl uměle dodáván benzyladenin. SAMUELSON et LARSSON (1993) pozorovali zvýšení hladiny zeatinribosidu při intenzivním nitrátovém hnojení u kořenů ječmene. U okřehku (rod Lemna) došlo ke snížení obsahu cytokininů při deficitu dusíku (THORSTEINSSON et ELIASSON 1989). I podle řady dalších autorů dochází při zvýšení obsahu dusíku v kultivačním médiu rostlin ke zvýšení obsahu cytokininů v rostlině a naopak k jejich snížení při zvýšení dusíkatého hnojení (KUIPER et al. 1988). Je již znám i mechanismus tohoto ovlivnění - (SAKAKIBARA et al. 2006) zjistili, že nitrátové ionty zvyšují produkci IPT (adenosinfosfát isopentenyltransferázy), což je enzym biosyntézy některých cytokininů; zvýšení aktivity enzymu vede ke zvýšení syntézy cytokininových produktů. Je však známo i opačné ovlivnění – exogenně dodané cytokininy zvyšují množství nitrát reduktázy v rostlině, což vede k rychlejší přeměně nitrátové formy dusíku na amoniakální a proto i k úbytku nitrátového dusíku v rostlině, zvyšujícímu se zároveň se zvyšujícím se množstvím cytokininů v rostlině (LU et al. 1990). RADIN (1984) popisuje zvýšení obsahu ABA při nedostatku dusíku u řady rostlin. U tabáku popisuje LIN et al. (1999) snížení obsahu ABA při vysokých dávkách dusíku. Podle ELIASSON (1975) auxin vyvolává a podporuje tvorbu ABA, která pak způsobuje dormanci laterálních pupenů a tak zabraňuje jejich vyrašení. U rostlin tabáku exogenně aplikovaná IAA stimuluje tvorbu etylénu indukcí a následným posílením tvorby ACC syntázy, avšak u řepy (Beta sp.) nikoliv – existují zřejmě autoinhibiční mechanismy, které tvorbu etylénu stimulovanou IAA inhibují (YU et al. 1979).

4. MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ

Základním materiálem použitým při vypracování diplomové práce byly jednonodální segmenty lodyžek lilku bramboru (Solanum tuberosum L.) odrůdy Karin.

16

Tyto lodyžky byly pěstovány metodou in vitro na MS médiu (MURASHIGE et SKOOG 1962) s obsahem 30 g.l-1 sacharózy, 8 g.l-1 agaru a pH = 5,8 při trvalém osvětlení. Nastříhané jednonodální segmenty byly pěstovány rovněž metodou in vitro, ale médium již bylo modifikováno na indukční – obsahovalo 80 g.l-1 sacharózy, 8 g.l-1 agaru, 10 ng.l-1 benzyladeninu a podle varianty pokusu 10÷12 µM anorganického dusíku (varianta se sníženým dusíkem), 40 µM anorganického dusíku (kontrolní varianta) a nebo 65÷70 µM anorganického dusíku (varianta se zvýšeným dusíkem). Segmenty byly pěstovány na fotoperiodě 8/16 – 8 hodin světla a 16 hodin tmy (důvodem je stimulace tuberizace zkráceným dnem). Z tohoto pěstebního schématu bylo odvozeno několik pokusů. V pokusu číslo 1 byl zkoumán vliv úrovně dusíkaté výživy na procento baněk s alespoň jednou vzniklou hlízkou v průběhu času, u pokusu číslo 2 byl zkoumán vliv úrovně dusíkaté výživy na dynamiku koncentrace kyseliny abscisové v jednotlivých částech a také celém jednonodálním segmentu lilku bramboru v průběhu času, pokusy číslo 3, 4, 5 byly obdobou pokusu číslo 2, v případě pokusu číslo 3 byly zkoumány cytokininy, v případě pokusu číslo 4 CO2 ,v případě pokusu číslo 5 etylen, v případě pokusu číslo 6 kyselina 1-aminocyklopropan-1-karboxylová a v případě pokusu číslo 7 jsme analyzovali vývoj hladiny dusíku. Použitými metodami byly v případě pokusu číslo 1 přímé pozorování s ohodnocením počtu baněk s alespoň jednou mikrohlízkou, v případě pokusu číslo 2 metoda RIA (radio-immuno assay), v případě pokusu číslo 3 byly vzorky nejdříve vyčištěny metodou HPLC a následně analyzovány metodou ELISA, v případě pokusu číslo 4 a 5 plynová chromatografie (GC). Kyselinu 1aminocyklopropan-1-karboxylovou jsme určili nepřímo rovněž plynovou chromatografií. Číselné výsledky získané analýzou vzorků byly následně zanalyzovány statisticky a matematicky.

4.1. Přímé pozorování a ohodnocení počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou mikrohlízkou Při založení pokusu číslo 1, byly všechny připravené baňky očíslovány s použitím polepovacích štítků. Následně byly do baněk s kultivačními médii přeneseny lodyžky lilku bramboru. Až do třetího týdne po založení pokusu byly všechny varianty pravidelně odvětrávány, aby se eliminoval inhibující vliv nepřiměřeně vysokého obsahu plynného fytohormonu etylénu nebo jiných plynů produkovaných během kultivace. Od

17

třetího týdne se začaly tvořit hlízky. Každý týden byl zaznamenán počet baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou, a ten byl po skončení pokusu využit k výpočtu.

4.2. Zkoumání vlivu úrovně dusíkaté výživy na vývoj obsahu kyseliny abscisové Při založení pokusu byly označeny jednotlivé varianty. V příslušných časových intervalech (0 h, 48 h, 168, 456 h, 672 h a 1008 h) byly odebrány vzorky z jednotlivých rostlinných orgánů. Vzorky byly skladovány při -20°C a následně lyofilizovány. Poté byla provedena extrakce ABA do vody, centrifugace vzorků a RIA analýza (viz kap. 4.3.).

Pracovní postup RIA analýzy byl následující:

-

Nejdříve jsem si připravil standardy a vzorky. Připraveny byly B0 (minimální vazba), BM (maximální vazba), standardy a vzorky do mikrozkumavek.

-

Přidal jsem 100 µl 3H-kyseliny abscisové (22000 dpm/vzorek); specifická aktivita 3,7 MBq mmol-1.

-

Přidal jsem 100 µl protilátky MAC.

-

Přidal jsem 200 µl 50% PBS.

-

Inkuboval jsem 45 minut v lednici při teplotě 4°C.

-

Přidal jsem 500 µl 100% (NH4)2SO4.

-

Inkuboval jsem 30 minut při laboratorní teplotě. Připravil jsem centrifugaci.

-

Centrifugoval jsem cca 10 minut při 12 500 ot/min a 4°C.

-

Odstranil jsem supernatant odsávačkou.

-

Přidal jsem 1 ml 50% (NH4)2SO4.

-

Vortexoval jsem (roztřepával sraženinu).

-

Centrifugoval jsem cca 8 minut při 12 500 ot/min a 4°C.

-

Odstranil jsem supernatant odsávačkou.

-

Přidal jsem 100 µl destilované H2O.

-

Vortexoval jsem.

-

Přidal jsem 1 ml dioxanového scintilátoru.

-

Pevně jsem mikrozkumavky uzavřel, vložil do měřících ampulí, měřil na Packard TRI-CARB 2900TR.

18

Získané výsledky jsem následně zpracoval. Časové intervaly odběru vzorků pro určování koncentrace byly rovnoměrně rozloženy po přechodové charakteristice od zahájení až do ukončení pokusu. Počet časových bodů musí být větší jak počet parametrů regresní funkce tj. rovnic oprav musí být více jak počet neznámých tj. parametrů regresní funkce, aby mohlo dojít ke zprostředkujícímu vyrovnání laboratorně získaných hodnot koncentrací.

4.3. Podstata metody RIA (radio-immuno assay) Principem RIA je kvantitativní stanovení, při kterém se využívá schopnost monoklonální protilátky MAC 252 (QUARRIE et al. 1988) rozpoznat molekulu ABA, a to s velmi vysokou specifitou. Principem je zde kompetice nativní nebo standardní ABA (hapten) a radioaktivně značené 3H-kyseliny abscisové (radioligand) ve vazbě na protilátku MAC 252. Pokud je množství protilátky MAC 252 a 3H-kyseliny abscisové konstantní a nativní kyselina abscisová je v přebytku, dochází k vytěsňování radioligandu z vazby s protilátkou a k vazbě haptenu s protilátkou. Komplexy haptenprotilátka a radioligand-protilátka se vytvářejí až po inkubaci při nízké teplotě (+4°C). Oddělení volných haptenů a radioligandů od komplexů protilátek s haptenem či radioligandem se provádí vysrážením v síranu amonném, odděleny jsou následně centrifugací.

3

H-aktivita sedimentu je následně změřena kapalnou scintilací na

scintilačním spektrofotometru PACKARD Tri CARB 2900 TR, výsledky jsou přepočteny na obsah kyseliny abscisové analytu v ,,pg“ pomocí programu Securia Packard. Kalibrační křivka je sestrojena za použití standardní kyseliny abscisové (+/cis, trans-kyselina abscisová, Sigma).

4.4. Vliv úrovně dusíkaté výživy na vývoj obsahu cytokininů Pro vlastní analýzu obsahu cytokininů byla použita extrakce, purifikace, HPLC separace a přímá ELISA kvantifikace cytokininů. Lyofilizovaný rostlinný materiál byl homogenizován do Bieleskiho fixáže. Poté byly odstraněny lipidy a lipofilní barviva (chlorofyl), a to centrifugací extraktu (metanol: chloroform: voda = 13 : 5 : 2) po doplnění o polovinu objemu vodou (BIELESKI 1964). Tak byl oddělen supernatant s cytokininy (vodný metanol) od chloroformu (obsahuje barviva, lipofilní látky aj.). Po odpaření metanolu do vodného zbytku byly ribotidy cytokininů štěpeny kyselou

19

fosfatázou v 0,04 M acetátamonném pufru o pH 6,5 (na ribosidy, jež lze stanovit ELISA testem), poté přišla na řadu iontoměničová chromatografie a chromatografie na reverzní fázi (MACHÁČKOVÁ et al. 1993). Iontoměničová chromatografie, za použití Pcelulózy při pH 3,00, oddělí cytokininový extrakt s kladným nábojem od látek s negativním nábojem. Cytokininy a jejich ribosidy s parciálním kladným nábojem se zachytí na P-celulóze a poté jsou z kolony P-celulózy eluovány 0,2 M amoniakem. Po úpravě pH na 6,5 pokračuje purifikace jako chromatografie na reverzní fázi na DEAEcelulóze spojené s C18 kolonou (Sep-Pak). Cytokininy se v tomto kroku čištění zachytí na C18 sorbentu a po eluci přečištěné cytokininové frakce metanolem se provádí zkoncentrování vzorků odpařením metanolu. Poté byly vzorky rozpuštěny a před nástřikem na HPLC filtrovány. HPLC separace (přístroj firmy Ecom) cytokininových bází a jejich ribosidů probíhá na koloně Nucleosil 5 s C18 sorbentem s 250 x 4,6 µm I. D. s velikostí pórů 5 µm a průtokem mobilní fáze 1000 µl/min, se složením mobilní fáze A: metanol, B: 0,05% TFA. UV signál byl detekován při 260 nm a jednotlivé frakce po sobě následujících cytokininů byly sbírány podle příslušných retenčních časů. Frakce byly odpařeny do sucha a pro ELISA kvantifikaci byly rozpuštěny v TBS pufru (900 µl). Při vlastním ELISA stanovení cytokininů byly použity polyklonální protilátky vůči jednotlivým frakcím cytokininů (STRNAD et al. 1990, STRNAD 1996). Do jamek mikrotitrační destičky byla pipetována protilátka (150 µl) v roztoku uhličitanového pufru (5 µl Ab v 15 ml uhličitanového pufru na 1 desku) a byly inkubovány přes noc při +4°C. Po promytí destičky destilovanou vodou byly stěny potaženy roztokem BSA v TBS pufru a následovala hodinová inkubace při laboratorní teplotě a po promytí destilovanou vodou byl do jamek pipetován TBS pufr (50 µl), standardy a vzorky (50 µl), dále do všech jamek s výjimkou blanku, konjugát alkalické fosfatázy a stanoveného cytokininu v BSA. Na závěr byl pipetován substrát (para-nitrofenylfosfát rozpuštěný v uhličitanovém pufru: 1mg/ml). Po hodinové inkubaci byla barevná reakce zastavena 5M KOH. ELISA test byl vyhodnocen fotometricky při vlnové délce 405 nm: obsah cytokininů byl nepřímo úměrný absorbanci naměřené v roztocích jednotlivých jamek mikrotitrační destičky v porovnání s řadou standardů, minimální a maximální vazbou protilátky, příslušné absorbance vzorků byly odečteny z kalibrační křivky.

20

4.5. Stanovení produkce etylenu a obsahu ACC metodou plynové chromatografie V diplomové práci byla použita metoda podle FIŠEROVÁ et al. 2009. Je značně obtížné stanovit přímo etylen, důvodem těchto potíží je uvolňování stresového etylenu. Proto jsou hodnocení obsahu kyseliny 1aminocyklopropan-1-karboxylové na základě její přeměny na etylen, při nichž je používána plynová chromatografie, mnohem přesnější než samotné měření etylenu (LIZADA et YANG 1979). Nádoba pro měření etylénu metodou plynové chromatografie musí mít co nejmenší objem, zároveň však musí umožňovat růstové pochody rostlin a zabraňovat úniku plynů z nádoby do okolního prostředí. Rostliny jsou proto kultivovány v buď v typicky laboratorních nádobách, nebo v nádobách od dětské výživy, tyto nádoby mohou být buď uzavřeny pomocí víčka s plastovým septem (v případě, že plyny potřebujeme odebírat opakovaně), nebo pomocí latexové membrány (v případě jednorázových odběrů). Pro odběr plynných vzorků se používá stříkačka (Braun Melsungen AG), jež má objem 2 ml a jehla (Beeton Dickinson Ltd., Irsko), jež má průměr 0,5 mm. Před analýzou se objem vzorku upravuje na 1 ml. Protože je počet opakování a variant vysoký, není možné analyzovat vzorky v plynovém chromatografu okamžitě po jejich odběru. Do svého vyhodnocení jsou vzorky skladovány ve stříkačkách zapíchnutých jehlou do gumového špuntu (Vitrum Rožnov s.r.o.) z láhve. Plynné vzorky následně procházejí po rozdělení na

koloně

plamenově

ionizujícím

detektorem

(FID,

výrobce

FISSSONS

INSTRUMENT, Itálie; součástí přístroje je i 50 m kapilární kolona Al2O3). Citlivost plynové chromatografie můžeme zvýšit, pokud místo normálního vzduchu použijeme čistý O2 (THOMPSON 1977). Za předpokladu dodržení tohoto metodického postupu je možno změřit i nízké koncentrace etylenu.

4.6. Stanovení dusičnanových iontů 4.6.1. Stanovení dusičnanových iontů v médiu za použití potenciometrie

Iontově selektivní elektrody jsou potenciometrické senzory, které využívají membránové detekce pro stanovení obsahu iontů v roztocích. Aktivní části zde byla kapalná hydrofobní elektrochemická membrána. Konkrétně se jednalo o tzv. homogenní kapalinovou membránu, kde byl jako senzor použit roztok dusičnanu krystalové violeti

21

v nitrobenzenu. Na fázovém rozhraní obou stran membrány vznikaly elektrické potenciály způsobené přechodem záporně nabitých nitrátových iontů přes fázové rozhraní měřený roztok/membrána. Elektrický potenciál byl měřen jako napětí v mV. Byly připraveny kalibrační roztoky rozpuštěním dusičnanu draselného tak, aby tyto roztoky měly koncentraci 0,075 až 30 mmol.l-1. Vzorky byly připraveny homogenizací rostlinné hmoty v 5 ml destilované vody. Pak byly změřeny hodnoty napětí pro roztoky vzorků i roztoky kalibrační, sestrojena kalibrační křivka a vypočteny hodnoty obsahu nitrátových iontů.

4.6.2. Stanovení dusičnanových iontů v rostlinné hmotě spektrofotometricky

Do 25 ml kádinky bylo napipetováno 0,5 ml vzorku a přidáno 0,25 ml 0,5 hmot. % salicylanu sodného. Vzorek byl promíchán a umístěn do sušárny s teplotou zvýšenou na 140 °C, odpařování probíhalo asi 15 minut. Po něm následovalo chladnutí vzorku. Po vychladnutí byl odpařený vzorek rozpuštěn v 0,25 ml koncentrované kyseliny sírové a opět na chvíli umístěn do sušárny. Po vytažení se vzorek nechal opět chladnout. Po vychladnutí bylo k odpařenému vzorku nepipetováno 7 ml destilované vody a 2 ml hydroxidu sodného 10M. Vše bylo důkladně promícháno a změřena absorbance na spektrofotometru Specord 205 při vlnové délce 410 nm. Hledaná koncentrace dusičnanů v analyzovaném vzorku byla vypočtena z regresní rovnice vztahující se ke kalibračnímu grafu. Kalibrační roztoky měly obsah 0,075 až 30 mmol.l-1 NO3-. Potom následoval stejný postup u vzorků. Absorbance kalibračních roztoků i vzorků byla měřena proti slepému vzorku (blanku).

4.7. Odvození regresní funkce pro indukci hlízek a možnosti jejího odvození u cytokininů Jedním z hlavních úkolů diplomové práce bylo v rámci morfologického pokusu sledovat indukci hlízek v závislosti na čase a také na faktoru „obsah anorganického dusíku v indukčním médiu“ a z výsledků pozorování potom pro jednotlivé varianty obsahu anorganického dusíku v indukčním médiu odvodit regresní funkci závislosti procentuálního počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou na týdenních ohodnoceních. Na odvozené regresní funkci indukce hlízek pak prokázat možný vliv sníženého obsahu anorganického dusíku v indukčním médiu na zvýšení tvorby hlízek a

22

také na zkrácení doby fyziologické přípravy na tvorbu hlízek, ve které rostlina bramboru dosáhne nové homeostáze fytohormonů po přepasážování do indukčního média. V dalších pokusech jsem sledoval i dynamiku změn koncentrací cytokininů zejména v jednonodálním segmentu rostliny Solanum tuberosum L. Analýzou časového průběhu byly charakterizovány zákonitosti, které by mohly vést u rostliny bramboru ke stanovení matematického modelu závislosti koncentrace cytokininů na čase, po vyvolání indukce, za kultivačních podmínek in vitro. Vzhledem k dalšímu zpracování výsledků a ve snaze určit nejvhodnější algebraický vzorec, který by pro vykonaná měření udával s dostatečnou přesností funkční závislost mezi proměnnými, byl nejprve navržen obecný tvar regresní funkce. Byly využity grafy závislosti procentuálního počtů baněk s alespoň jednou vytvořenou mikrohlízkou na týdenních ohodnoceních Z grafů č.2 - Závislost indukce mikrohlízek na týdenních ohodnoceních za kultivačních podmínek in vitro pro morfologický pokus lze vyčíst, že po vyvolání indukčních podmínek se procentuální počet baněk s alespoň jednou vyvinutou mikrohlízkou k celkovému počtu baněk po určité době ustálí na asymptotické hodnotě blízké 100 %. Tento průběh je aperiodický, statický. Mnoho autorů se zabývalo metodami experimentální identifikace přechodové charakteristiky pro statické soustavy i v jiných přírodních vědách. Podle ŠVEC et al. 1980 je možné aproximovat přechodovou charakteristiku neznámé soustavy aproximační charakteristikou 2. řádu s různě velkými časovými konstantami T1 a T2, tedy metodou, která je pojmenována podle prof. V. Strejce. Vztah pro tuto aproximační charakteristiku jsem využil jako obecný tvar regresní funkce u morfologického pokusu, který dále upravuji a potom i parametricky identifikuji MNČ.

t t − −  T T T T 1 2 y = f (t ) = K . 1 − .e 1 + .e 2  T1 − T2 T1 − T2 

Kde

  (1)  

K je proporcionální konstanta T1 a T2 jsou časové konstanty dílčích funkcí exponenciálních funkcí 23

Vztah (1) lze dále zjednodušením konstant upravit do podoby, kterou jsem využíval ve své bakalářské práci −

y = f (t) = A0− A1.e

t−TD T1

−

+ A2.e

t−TD T2

(2)

Anebo metodou variace konstanty upravit na tvar

y(t ) = A0 − A1. e

−

t T1

+ A2 . e

−

t T2

= K.T1 .T2 − A1. e

−

t T1

+ A2 . e

−

t T2

(3)

4.8. Tvar regresní funkce pro morfologický pokus s indukcí hlízek

−

t T1

−

y(t) = A0− A1.e + A2.e

t T2

−

t T1

−

t T2

= K.T1.T2 − A1.e + A2.e (3)

Kde je

y

závisle proměnná, vyjadřuje závislost procentuálního počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou z celkového počtu baněk na čase t

t

nezávisle proměnná, čas t

24

Ao = KT1T2

proporcionální konstanta regresní funkce, vyjadřuje ustálenou asymptotickou hodnotu procentuálního počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou, hodnota parametru je rovna 100

T1 a T2

hledaný parametr regresní funkce, časové konstanty dílčích funkcí y1 a y2 vyjadřují míru trvání (ustálení) přechodového jevu

A1a A2

hledané

parametry

regresní

funkce,

konstanta

úměrnosti

jednoduchých dílčích funkcí y1 = A1 . e - t / T1 a y2 = - A2 . e - t / T2 V časovém průběhu viz obr. 1 je lokální minimum regresní funkce, kam jsem posunul počátek pravoúhlé soustavy souřadnic, protože procentuální počet baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou stoupá od nulové hodnoty. Parametry TD a ymin, které jsou souřadnicemi posunutého počátku souřadné soustavy, umožňují formulovat převod mezi soustavami a jsou počátečními podmínkami. Původní souřadná soustava je vztažena k okamžiku zahájení pokusu při přepasážování jednonodálních segmentů do indukčního média a vytvoření vnějších indukčních podmínek. Posunutí pravoúhlé soustavy souřadnic a parametrické zavedení počátečních podmínek umožnilo zmenšit počet parametrů regresní funkce, určit dobu fyziologické přípravy rostliny bramboru na tvorbu hlízek TD (po přepasážování a vytvoření indukčních podmínek) a analyzovat i další z možných efektů, kterým je působení různé úrovně koncentrace dusíku v indukčním médiu. Doba fyziologické přípravy na tvorbu hlízek, je vlastně zpožděním mezi okamžikem vyvolání indukční podmínek a okamžikem odezvy, kdy procentuální počet baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou začne stoupat od nulové hodnoty. Tato doba by mohla souviset s vytvořením nové homeostáze fytohormonů, která byla narušena jednak vytvořením indukčních podmínek tuberizace (tedy prudkou změnou ve složení kultivačního média po přepasážování), ale i úpravou lodyhy na jednonodální segmenty, které zprvu nemají kořeny. Počáteční podmínky v posunutém počátku pravoúhlé soustavy souřadnic

y ( 0 ) = 0 ∧ y (′0 ) = 0 ∧ y (′′0 ) > 0 (4a ) y P2 = y( 0 ) = 0(4c)

t (0) = 0

(4b)

t P2 = t ( 0 ) = t − TD = 0 ( 4d )

25

A1 − y′ = . e T1

t −TD T1

A2 − − .e T2

t −TD T2

A − y ′′ = 22 . e T2

(5)

t −TD T2

A − − 12 . e T1

t −TD T2

( 6)

y ( 0 ) = K .T1 .T2 − A1 . e 0 + A2 . e 0 = 0 ⇒ K .T1 .T2 − A1 + A2 = 0 (7) y (′0 ) =

A1 0 A2 0 A A A A .e − .e = 1 − 2 = 0 ⇒ 1 = 2 T1 T2 T1 T2 T1 T2

(8 )

Sloučení počátečních podmínek (7) a (8) umožňuje zmenšit počet parametrů o dva v různých kombinacích. V diplomové práci jsem užil následující možnost.

A2 0 A1 0 A2 A1 A2 A1 . e − . e = − > 0 ⇒ > T 22 T1 2 T 22 T12 T 22 T12

y (′′0 ) =

(9 )

4.9.1. Odvození regresní funkce pro indukci hlízek bez parametrů A1 a A2 Ze vztahu (7) a (8) vyjádříme parametr A1 a rovnice sloučíme

A1 =

A1 = A2 + K .T1 .T2 (10)

A 2 .T1 = K .T1 .T 2 + A 2 T2

2

T .T .K A2 = 2 1 T1 − T2

/ .T2

Ze vztahu (7) a (8) vyjádříme A2 sloučíme a obdobným způsobem získáme 2

A1 =

T1 .T2 .K T1 − T2

A2 .T1 (11) T2

(13)

Vztah (12) a (13) dosadíme do (9) a obdržíme podmínky řešitelnosti

26

(12)

(K

2

2

A2 A1 T1 A1 T1 > ⇒ > ⇒ 2 2 2 T2 T2 A2 T 22 T1

.T 1 .T 2 ) .T 1 T1 − T 2 > (K .T 1 .T 2 ) .T 2 ⇒ T1 − T 2

T1 > T2 ∧ A0 ≠ 0 ∧ T1 ≠ 0 ∧ T2 ≠ 0 (14) Výsledný tvar regresní funkce s vyloučenými parametry A1 a A2 obdržíme po dosazení vztahu (12) a (13) do (3) 2

y = f (t ) = K .T1.T2 −

T1 .T2 .K T1 − T2

−

.e

t −TD T1

−  T1 y = f (t ) = K .T1 .T2 . 1 − .e − T T  1 2

2

T .T .K − + 2 1 .e T1 − T2

t −TD T1

t −TD T2

− T2 + .e T1 − T2

(15)

t −TD T2

  (16) 

Regresní funkce (16) je obdobou vztahu (1) ŠVEC et al. 1980 tam vztah není odvozen a platí pro jednotkový skok a TD = 0. Protože A0 = K.T1.T2 = 100 resp. 1, a je to ustálená asymptotická hodnota procentuálního počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou k celkovému počtu baněk (partikulární řešení) lze vztah (16) upravit do tvaru (17). Vztah (17) byl použit pro numerické řešení parametrů regresní funkce MNČ a vztah (16) resp. K.T1.T2 = 100 pro vyjádření zesílení/zeslabení indukce hlízek vlivem různých variant ve složení indukčního média. t −TD t −TD − −   T1 T2 T1 T2 y = f (t ) = 100 . 1 − .e + .e  (17) T − T T − T   1 2 1 2

Kdybychom vztah (16) chtěli využít jako regresní funkci pro koncentrace fytohormonů s průběhem jako na obr. 1, nebyla by minimální hodnota ymin nulová a museli bychom použít vztah (18)

27

t −T t −T  − D  − D T T T y = f (t) = K.T1.T2 . 1 − 1 . e 1  + 2 . e T2  + ymin (18)  T1 − T2  T1 − T2  

Při numerickém výpočtu kontrolujeme podmínku (14). Vyloučením jiných parametrů než A1 a A2 získáme alternativní tvary regresních funkcí. Jeden z těchto tvarů s vyloučením parametrů A1 a T1 a s ymin = 0 jsem využil v bakalářské práci.

4.9.2. Numerický výpočet parametrů regresní funkce MNČ

Neznámé koeficienty regresní funkce byly vypočteny metodou minimálních čtverců, pomocí doplňku „Řešitel“ k tabulkovému kalkulátoru Excel firmy Microsoft. Funkce řešitel umožňuje vypočítat neznámé koeficienty metodou minimálních čtverců bez sestavování normálních rovnic. Základní podmínka zprostředkujícího vyrovnání, aby počet rovnic oprav tj. počet týdenních ohodnocení procentuálního počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou v časové oblasti byl větší, jak počet parametrů regresní funkce byl dodržen.

4.10. Statistické zpracování výsledků morfologického pokusu, přímého pozorování a ohodnocení počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou mikrohlízkou Po kontrole souborů dat s procentuálními počty baněk s alespoň jednou vytvořenou mikrohlízkou jsem je uspořádal do přehledových tabulek podle data založení sezónního opakování pokusu a podle jednotlivých úrovní sledovaných faktorů viz tabulky č. 1, 2 a 3 - Přehledová tabulka indukce pro kontrolní variantu, snížený a zvýšený dusík v kap. 8. - Přílohy a tabulková část. Ke statistickému ověření hypotézy, že snížené množství nitrátového dusíku vede obecně k výraznější indukci tvorby hlíz u lilku (Solanum tuberosum L.) za kultivačních podmínek in vitro jsem využil dvoufaktorovou ANOVU. Nejprve jsem v tabulce č.4 - Cochranův test k ověření homogenity rozptylů výběrových souborů sezónních opakování indukce hlízek za kultivačních podmínek in vitro, zkontroloval nezbytnou podmínku pro analýzu rozptylu dvojného třídění tj. homogenitu rozptylů výběrových souborů ověřením nulové hypotézy H0 ≡ σ12 =

28

σ22=σ32=……=σk2, že rozptyly základních souborů experimentu jsou shodné. Z výpočtu v tabulce č. 4 vyplývá, že na obou hladinách významnosti α = 0,01(0,05) platí, že testovací kritérium je menší jak jeho kritická hodnota q

(vyp)


(krit)

proto nezamítáme

nulovou hypotézu, homogenita je průkazná. Nelze vyloučit, že soubory mají stejný rozptyl kolem průměru. Dále jsem v tabulce č.5a až 5q - Kolmogorovův - Smirnovův test dobré shody (normality) pro výběrové soubory sezónního opakování pokusu v Lilieforsově úpravě kritických hodnot testovací charakteristiky ověřil i normalitu těchto souborů. Testoval jsem nulovou hypotézu H0 ≡ náhodný výběrový soubor pochází ze základního souboru s normálním rozdělením N (µ,σ2) s distribuční funkcí F (X). H0 se zamítá, je-li Dn ≥ Dkrit,α. Kde Dn je maximální testovací statistika z n pozorování. Kritické hodnoty testovací statistiky Dkrit,α v Lilieforsově úpravě pro hodnoty n ≤ 40 jsou tabelovány v (Jarošová et al., 2007, tab. 2). Při výpočtu jsem testoval normalitu všech souborů uvedených v přehledových tabulkách č. 1, 2 a 3. Ve všech případech viz tabulky č.5a až 5q jsem nemohl vyloučit platnost nulové hypotézy H0, že náhodný výběr pochází ze základního souboru s normálním rozdělením. Maximální testovací statistika byla vždy menší jak její Lilieforsova kritická hodnota a to na obou hladinách významnosti α = 0,01(0,05). Po kontrole nezbytných předpokladů validity analýzy rozptylu, jsem pokračoval ověřováním hypotéz viz kap 2. Cíle práce. Ve všech schématech dat pro ANOVU dvojného třídění zkoumáme vliv dvou faktorů. Faktor A vliv týdenních ohodnocení procentuálního počtu baněk s alespoň jednou vyvinutou hlízkou se svými úrovňovými podskupinami ze 4. až 9. týdne zůstává ve všech schématech dat stejný. U faktoru B postupně měníme jeho úrovňové podskupiny tak, abychom získaly odpovědi na uvedené hypotézy. V případě posouzení efektu sezónního opakování na indukci hlízek jsem navrhl ANOVU, kde faktor B sezónní opakování má dvě úrovňové podskupiny JARO a PODZIM s devítinásobným opakováním v každé podskupině. Pro posouzení efektu ročního opakování na indukci hlízek jsem navrhl ANOVU, kde faktor B roční opakování má tři úrovňové podskupiny 2005, 2006 a 2008 se šestinásobným opakováním v každé podskupině. Do podskupiny 2008 byly přiřazeny i dva soubory z jara roku 2009, aby v každé podskupině byl shodný počet souborů. 29

Při posuzování vlivu jednotlivých souborů na indukci hlízek jsem navrhl ANOVU, kde faktor B jednotlivé soubory má celkem 18 podskupin s jedním souborem v podskupině. Nejdůležitější byla ovšem ANOVA ke statistickému ověření hypotézy, že snížené množství nitrátového dusíku vede obecně k výraznější indukci tvorby hlíz za kultivačních podmínek in vitro. V tomto případě měl faktor B varianta koncentrace dusíku v indukčním médiu tři úrovňové podskupiny kontrolní varianta, snížený a zvýšený dusík se šestinásobným opakováním v každé podskupině Jestliže ve všech předchozích případech jsme zkoumali vliv dvou faktorů na závisle proměnnou, kterou byl procentuální počet baněk s alespoň jednou vytvořenou mikrohlízkou v následujícím případě je závisle proměnná hmotnost mikrohlízek ze čtyř sezónních opakování pokusu s tím, že hmotnost hlízek byla měřena jako ustálená hodnota zralé hlízky v rozmezí 99 až 101 dní růstu. Ke statistickému ověření, zda zvýšené množství nitrátového dusíku v indukčním médiu vyvolává tvorbu hlíz o vyšší hmotnosti, jsem zvolil ANOVU, kde faktor A je opakování pokusu se 4 úrovněmi (úrovňovou podskupinu tvoří soubor opakování) a faktor B varianta koncentrace dusíku v indukčním médiu má tři úrovňové podskupiny kontrolní varianta, snížený a zvýšený dusík.

4.10.1. Analýza rozptylu dvojného třídění k posouzení efektu sezónního opakování pokusu na indukci hlízek (na % baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou k celkovému počtu baněk)

Při statistickém posouzení efektu sezónního opakování pokusu na indukci hlízek viz tabulka č.6 - Schéma dat pro analýzu rozptylu k posouzení vlivu faktoru sezóna na proces indukce, jsem ověřoval platnost následujících nulových hypotéz H04:Efekty faktoru B sezóna působí na indukci hlízek stejně H05: Efekty vzájemného působení obou faktorů se při indukci hlízek neuplatňují H06: Efekty faktoru A týdenní ohodnocení působí na indukci hlízek stejně Z výsledků vyplývá, že interakční efekty γij faktorů A, B se neuplatňují, protože testovací kritérium Fvyp (AB) bylo na hladině významnosti α = 0,01 menší jak jeho kritická hodnota Ftab (AB) z čehož vyplývá, že vliv interakce není průkazný a přikláníme se k nulové hypotéze H05. Platnost této nulové hypotézy je podmiňující pro vyhodnocení hypotéz H04 a H06. 30

Při vyhodnocování nulové hypotézy H06 jsem se přiklonil k alternativní hypotéze, že ne všechny efekty αi jednotlivých úrovní faktoru A – týdenní ohodnocení jsou stejné, testovací kritérium Fvyp (A) bylo na hladině významnosti α = 0,01 větší jak jeho kritická hodnota Ftab (A). Vliv faktoru A-týdenní ohodnocení je průkazný a je v souladu s předpokladem, že procentuální počet baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou v závislosti na čase (týdenních ohodnoceních) roste. Z vyhodnocení v tab. č.6, v této kapitole nejdůležitější nulové hypotézy H04 vyplývá, že všechny efekty βj jednotlivých úrovní (JARO a PODZIM) faktoru B - sezónní opakování pokusu se při indukci hlízek neuplatňují. Testovací kritérium Fvyp (B) bylo na hladině významnosti α = 0,01 menší jak jeho kritická hodnota Ftab (B). Vliv faktoru B sezónní opakování pokusu není průkazný. Toto ohodnocení nasvědčuje tomu, že pokus byl několikráte sezónně zopakován za přibližně stejných podmínek a se statisticky shodnými výsledky závisle proměnné tj indukce hlízek.

4.10.2. Analýza rozptylu dvojného třídění k posouzení efektu ročního opakování pokusu na indukci hlízek (na % baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou k celkovému počtu baněk)

Při statistickém posouzení efektu ročního opakování pokusu na indukci hlízek viz tabulka č.7 - Schéma dat pro analýzu rozptylu k posouzení vlivu faktoru rok založení souboru na proces indukce, jsem ověřoval následující nulové hypotézy H07: Efekty faktoru B rok založení souboru působí na indukci hlízek stejně H08: Efekty vzájemného působení obou faktorů se při indukci hlízek neuplatňují H09: Efekty faktoru A týdenní ohodnocení působí na indukci hlízek stejně Z výsledků vyplývá, že interakční efekty γij faktorů A, B se neuplatňují, protože testovací kritérium Fvyp (AB) bylo na hladině významnosti α = 0,01 menší jak jeho kritická hodnota Ftab (AB) z čehož vyplývá, že vliv interakce není průkazný a přikláníme se k nulové hypotéze H08. Platnost této nulové hypotézy je podmiňující pro vyhodnocení hypotéz H07 a H09. Při vyhodnocování nulové hypotézy H09 jsem se přiklonil k alternativní hypotéze, že ne všechny efekty αi jednotlivých úrovní faktoru A – týdenní ohodnocení jsou stejné, testovací kritérium Fvyp (A) bylo na hladině významnosti α = 0,01 větší jak jeho kritická hodnota Ftab (A). Vliv faktoru A-týdenní ohodnocení je průkazný a je 31

v souladu s předpokladem, že procentuální počet baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou v závislosti na čase (týdenních ohodnoceních) roste. Z vyhodnocení nulové hypotézy H07 v tab. č.7 vyplývá, že všechny efekty βj jednotlivých úrovní (2005, 2006 a 2008) faktoru B – rok založení souboru opakování se při indukci hlízek neuplatňují. Testovací kritérium Fvyp (B) bylo na hladině významnosti α = 0,01 menší jak jeho kritická hodnota Ftab (B). Vliv faktoru B roční opakování pokusu není průkazný. Při posuzování vlivu faktoru rok založení souboru opakování jsme dospěli ke stejným závěrům jako při posuzování vlivu faktoru sezóna. I zde vše nasvědčuje tomu, že pokus byl několikrát ročně zopakován za přibližně stejných podmínek a se statisticky shodnými výsledky závisle proměnné tj indukce hlízek.

4.10.3. Analýza rozptylu dvojného třídění k posouzení vlivu jednotlivých souborů opakování pokusu na indukci hlízek (na % baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou k celkovému počtu baněk)

Při statistickém posouzení efektu jednotlivých souborů pokusu na indukci hlízek viz tabulka č.8 - Schéma dat pro analýzu rozptylu k posouzení vlivu faktoru jednotlivých souborů opakování pokusu na proces indukce, jsem ověřoval následující nulové hypotézy

H010: Efekty faktoru B soubory opakování pokusu působí na indukci hlízek stejně H011: Efekty faktoru A týdenní ohodnocení působí na indukci hlízek stejně Při vyhodnocování nulové hypotézy H011 jsem se přiklonil k alternativní hypotéze, že ne všechny efekty αi jednotlivých úrovní faktoru A – týdenní ohodnocení jsou stejné, testovací kritérium Fvyp (A) bylo na hladině významnosti α = 0,01 větší jak jeho kritická hodnota Ftab (A). Vliv faktoru A-týdenní ohodnocení je průkazný a je v souladu s předpokladem, že procentuální počet baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou v závislosti na čase (týdenních ohodnoceních) roste. Při vyhodnocování nulové hypotézy H010 jsem se přiklonil k alternativní hypotéze, že ne všechny efekty βj jednotlivých úrovní faktoru B – soubory opakování experimentu jsou stejné, testovací kritérium Fvyp (B) bylo na hladině významnosti α = 0,01 větší jak jeho kritická hodnota Ftab (B). 32

Vliv faktoru B-soubory opakování pokusu je průkazný. O tom, mezi kterými průměry jednotlivých úrovňových skupin faktoru B (tj. mezi, kterými průměry jednotlivých souborů opakování) existují statisticky významné rozdíly v indukci, jsem určil následným testováním významnosti rozdílů podle Tukeye viz tabulka č.9 - Tukeyův test významnosti rozdílů mezi průměry jednotlivých úrovňových skupin faktoru B - soubory opakování morfologického pokusu. V souladu s předpoklady vyšla většina rozdílů. V několika málo případech při posuzování významnosti rozdílů mezi průměry jednotlivých souborů došlo k odchylkám oproti předpokladům, které přisuzuji vlivu náhody na stabilitu zachování vnějších podmínek opakování pokusu. Například v tabulce 9 jsou červeně vyznačeny soubory opakování pokusu pro shodná složení médií, kde bychom nepředpokládali vznik statisticky významných rozdílů. Přes drobné odchylky oproti předpokladům i zde vše nasvědčuje tomu, že pokus byl několikrát náhodně zopakován za přibližně stejných podmínek a se statisticky shodnými výsledky závisle proměnné tj indukce hlízek.

4.10.4. Analýza rozptylu dvojného třídění k posouzení vlivu koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu na indukci hlízek (na % baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou k celkovému počtu baněk)

Jestliže jsme v předchozích kapitolách zpracováním výsledků morfologického pokusu indukce hlízek prokázali validitu analýzy rozptylu a stabilitu zachování vnějších podmínek opakování pokusu v této kapitole budeme posuzovat nejzávažnější vliv, který je předmětem našeho zkoumání a to efekt koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu na indukci hlízek. Analýzou rozptylu dvojného třídění jsme testovali následující hypotézy

H01: Efekty faktoru B – varianta koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu působí na indukci hlízek stejně H02: Efekty vzájemného působení obou faktorů se při indukci hlízek neuplatňují H03: Efekty faktoru A týdenní ohodnocení působí na indukci hlízek stejně Z výsledků v tab.č.10 vyplývá, že interakční efekty γij faktorů A, B se neuplatňují, protože testovací kritérium Fvyp (AB) bylo na hladině významnosti α = 0,01 33

menší jak jeho kritická hodnota Ftab (AB) z čehož vyplývá, že vliv interakce není průkazný a přikláníme se k nulové hypotéze H02. Platnost této nulové hypotézy je podmiňující pro vyhodnocení hypotéz H01 a H03. Při vyhodnocování nulové hypotézy H03 jsem se přiklonil k alternativní hypotéze, že ne všechny efekty αi jednotlivých úrovní faktoru A – týdenní ohodnocení jsou stejné, testovací kritérium Fvyp (A) bylo na hladině významnosti α = 0,01 větší jak jeho kritická hodnota Ftab (A). Vliv faktoru A-týdenní ohodnocení je průkazný a je v souladu s předpokladem, že procentuální počet baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou v závislosti na čase (týdenních ohodnoceních) roste tak jako v předchozích případech. Z vyhodnocení nulové hypotézy H01 v tab. č.10 vyplývá, že ne všechny efekty βj jednotlivých úrovní (snížený dusík, kontrolní varianta a zvýšený dusík) faktoru B – varianta koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu, působí na indukci hlízek stejně. Testovací kritérium Fvyp (B) bylo na hladině významnosti α = 0,01 větší jak jeho kritická hodnota Ftab (B). Vliv faktoru B varianta koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu je průkazný.

Graf č.1 - Vícenásobné porovnávání celkových průměrů jednotlivých úrovňových skupin faktoru koncentrace anorganického dusíku v indukčním médiu

60

Varianta se sníženou koncentrací anorganického dusíku v médiu Kontrolní varianta koncentrace anorganického dusíku v médiu Varianta se zvýšenou koncentrací anorganického dusíku v médiu

55

Celkové průměry indukce hlízek [%]

50 45

40,57

40 35 29,93 30 25 25,26

20

Závěr vyhodnocení : Z vícenásobného porovnání celkových průměrů indukce hlízek jednotlivých úrovňových skupin faktoru B koncentrace anorganického dusíku v indukčním médiu podle Tukeye vyplývá, že na obou hladinách významnosti α=0,01(0,05) existuje statisticky vysoce průkazný rozdíl v indukci hlízek pouze mezi variantou se sníženým a zvýšeným dusíkem a mezi kontrolní variantou a variantou se sníženým dusíkem. Rozdíl mezi kontrolní variantou a variantou se zvýšeným dusíkem je statisticky neprůkazný. Úsečkou je znázorněna kritická hodnota rozdílu podle Tukeye.

15 10 5 0 0

5

10

15

20

O tom, mezi kterými průměry jednotlivých úrovňových skupin (snížený dusík, kontrolní varianta a zvýšený dusík) faktoru B varianta koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu existují statisticky významné rozdíly v indukci, jsem určil

34

následným testováním významnosti rozdílů podle Tukeye viz tabulka č.11 - Tukeyův test významnosti rozdílů mezi průměry jednotlivých úrovňových skupin faktoru B varianta obsahu dusíku v indukčním médiu komentář viz kap. 5 Výsledky pokusů.

4.10.5. Analýza rozptylu dvojného třídění k posouzení vlivu koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu na hmotnost hlízek

V tabulce č.12 - Přehledová tabulka ustálených hmotností mikrohlízek po 99 až 101 dnech růstu, pro jednotlivá sezónní opakování pokusu, jsou uvedeny průměrné hmotnosti mikrohlízek z jednotlivých souborů podle data založení sezónního opakování pokusu a podle jednotlivých úrovní sledovaných faktorů. Sledovanými faktory je faktor A sezónní opakování pokusu a faktor B varianta koncentrace dusíku v indukčním médiu. Ustálenou hmotností mikrohlízek rozumíme hmotnost zralé hlízky po odeznění přechodového jevu, který je způsoben přepasážováním jednotlivých segmentů rostliny bramboru z dormantního do indukčního média. V tabulce č.13 - Cochranův test homogenity pro rozptyly průměrných hmotností mikrohlízek jednotlivých souborů opakování, jsme potvrdili validitu následující analýzy rozptylu dvojného třídění pro posouzení vlivu koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu na hmotnost hlízek. Ze statistického posouzení nulové hypotézy H0 ≡ σ12 = σ22=σ32=……=σk2 o shodnosti rozptylů základních souborů experimentu vyplývá, že na obou hladinách významnosti α = 0,01(0,05) je testovací kritérium menší jak jeho kritická hodnota q

(vyp)

< q

(krit),

proto nezamítáme nulovou hypotézu

homogenita je průkazná. Nelze vyloučit, že soubory mají stejný rozptyl kolem průměru.

Analýzou rozptylu dvojného třídění jsme testovali následující hypotézy

H012: Efekty faktoru B – varianta koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu působí na hmotnost mikrohlízek stejně H013: Efekty faktoru A - sezónní opakování pokusu působí na hmotnost mikrohlízek stejně Z vyhodnocení v tab. č.14 vyplývá, že všechny efekty αi jednotlivých úrovní faktoru A - sezónní opakování souborů pokusu se při indukci hlízek neuplatňují. Testovací kritérium Fvyp (A) bylo na hladině významnosti α = 0,05 menší jak jeho

35

kritická hodnota Ftab (A). Vliv faktoru A sezónní opakování souborů pokusu není průkazný. I toto ohodnocení nasvědčuje tomu, že pokus byl několikráte sezónně zopakován za přibližně stejných podmínek a se statisticky shodnými výsledky závisle proměnné tj hmotností mikrohlízek. Z vyhodnocení nulové hypotézy H012 v tab. č.14 vyplývá, že ne všechny efekty βj jednotlivých úrovní (snížený dusík, kontrolní varianta a zvýšený dusík) faktoru B – varianta obsahu nitrátového dusíku v indukčním médiu, působí na indukci hlízek stejně. Testovací kritérium Fvyp (B) bylo na hladině významnosti α = 0,01 větší jak jeho kritická hodnota Ftab (B). Vliv faktoru B varianta koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu je průkazný. O tom, mezi kterými průměry jednotlivých úrovňových skupin (snížený dusík, kontrolní varianta a zvýšený dusík) faktoru B varianta koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu existují statisticky významné rozdíly v průměrných hmotnostech hlízek, jsem určil následným testováním významnosti rozdílů podle Tukeye viz tabulka č.15 - Tukeyův

test významnosti rozdílů mezi průměry jednotlivých úrovňových

skupin faktoru B - varianta obsahu dusíku v indukčním médiu komentář viz kap. 5 Výsledky pokusů.

5. VÝSLEDKY POKUSŮ 5.1. Vypočtené parametry regresní funkce pro indukci hlízek Parametry regresní funkce pro vyjádření závislosti % počtu baněk s alespoň jednou vyvinutou hlízkou na čase pro kontrolní variantu a varianty se sníženým a zvýšeným dusíkem jsem vypočetl v tabulkách č. 17 až 19. Součástí každé tabulky je i analýza rozptylu k posouzení průkaznosti regresní funkce. Z výsledků vyplývá, že všechny regresní funkce závislosti indukce na týdenních ohodnoceních jsou pro jednotlivé varianty obsahu anorganického dusíku v indukčním médiu průkazné. V tabulkách jsou vypočteny i pásy spolehlivosti, hodnota indexu determinace a souřadnice inflexního bodu k dalšímu vyhodnocení.

36

Regresní funkce pro kontrolní variantu, viz tabulka č. 17

y KM

t − 3,7197 t −3,7197 − −   2,9552 = 100 .1 − 3,4244. e + 2,4244. e 2,09225     

Vztah lze zjednodušit

yKM = 100 − 1205,6589.e

−

t 2,9552

+ 1434,5551.e

−

t 2,09225

Těsnost odvozené závislosti posuzuji indexem korelace, a kterou část závislosti je možné vysvětlit regresní funkcí a co zbývá na náhodu indexem determinace, viz (STÁVKOVÁ et al. 2005, str. 58).

i =6

I KV =

var y ′ var( y − y ′) = 1− = 1− var y var y

∑  y i =1 i =6

∑ (y i =1

′ − y i  

i

i

i =6

2 I KV =

var y ′ var( y − y ′) = 1− = 1− var y var y

 y − y ′  ∑ i i  i =1  i =6

∑ (y i =1

i

− y)

2

− y)

2

2

= 1−

27,93 = 0,9951 2883,39

2

= 1−

27,93 = 0,9903 2883,39

Z hodnoty indexu korelace IKV = 0,9951 vyplývá, že u regresní funkce indukce pro kontrolní variantu koncentrace anorganického dusíku v indukčním médiu se jedná o těsnost velmi vysokou přibližující se pevné závislosti. Z koeficientu determinace je možné usuzovat, že až 99,03 % závislosti je odvozeno regresní funkcí a 0,7 % je způsobeno náhodou. Z posouzení regresní funkce analýzou rozptylu vyplývá, že funkce je průkazná protože testovací statistika Fvyp = 205,8 je větší jak její kritická hodnota Fkrit(0,005;3;2) = 199,2. Pravděpodobnost, že Fvyp bude menší jak Fkrit a regresní funkce se stane neprůkaznou je 0,0048.

37

Regresní funkce pro variantu se sníženým dusíkem, viz tabulka č. 18

y SD

t − 2,9352 t − 2,9352 − −   2,4509 2,4503   = 100. 1 − 4100,8744 . e + 4099,8744 . e    

Vztah lze zjednodušit

y SD = 100 − 1358239,7468.e

−

t 2,4509

+ 1358305,2428.e

−

t 2,4503

Těsnost odvozené závislosti posuzuji indexem korelace, a kterou část závislosti je možné vysvětlit regresní funkcí a co zbývá na náhodu indexem determinace (STÁVKOVÁ et al. 2005, str. 58). Z hodnoty indexu korelace ISD = 0,9984 vyplývá, že u regresní funkce indukce pro variantu se sníženou koncentrací anorganického dusíku v indukčním médiu se jedná o těsnost velmi vysokou přibližující se pevné závislosti. Z koeficientu determinace je možné usuzovat, že až 99,68 % závislosti je odvozeno regresní funkcí a 0,32 % je způsobeno náhodou. Z posouzení regresní funkce analýzou rozptylu vyplývá, že funkce je průkazná protože testovací statistika Fvyp = 208,1 je větší jak její kritická hodnota Fkrit(0,005;3;2) = 199,2. Pravděpodobnost, že Fvyp bude menší jak Fkrit a regresní funkce se stane neprůkaznou je 0,0048.

Regresní funkce pro variantu se zvýšeným dusíkem, viz tabulka č. 19

y ZD

t −3,5070 t −3,5070 − −   3,1608 3,1607   = 100. 1 − 29802,07198 . e + 29801,07198 . e    

Vztah lze zjednodušit

y ZD = 100 − 9038736,57 41.e

−

t 3,1608

38

+ 9038769,79 89.e

−

t 3,1607

Těsnost odvozené závislosti posuzuji indexem korelace, a kterou část závislosti je možné vysvětlit regresní funkcí a co zbývá na náhodu indexem determinace (STÁVKOVÁ et al. 2005, str. 58).

i =6

I ZD =

var y ′ var( y − y ′) = 1− = 1− var y var y

∑  y i =1 i =6

′ − y i  

i

∑ (y i =1

i

− y)

2

= 1−

2

7,04 = 0,9982 1922,46

Z hodnoty indexu korelace IZD = 0,9982 vyplývá, že u regresní funkce indukce pro variantu se zvýšenou koncentrací anorganického dusíku v indukčním médiu se jedná o těsnost velmi vysokou přibližující se pevné závislosti. i =6

2 I ZD =

var y ′ var( y − y ′) = 1− = 1− var y var y

∑  y i =1 i=6

i

∑ (y i =1

′ − y i   i

− y)

2

2

= 1−

7,04 = 0,9963 1922,46

Z koeficientu determinace je možné usuzovat, že až 99,63 % závislosti je odvozeno regresní funkcí a 0,37 % je způsobeno náhodou. Z posouzení regresní funkce analýzou rozptylu vyplývá, že funkce je průkazná protože testovací statistika Fvyp = 181,3 je větší jak její kritická hodnota Fkrit(0,01;3;2) = 99,2. Pravděpodobnost, že Fvyp bude menší jak Fkrit a regresní funkce se stane neprůkaznou je 0,0055. Všechny parametry, indexy a hodnoty odvozené z regresní funkce platí jen pro

časovou oblast týdenních ohodnocení indukce.

5.2. Vyhodnocení výsledků morfologického pokusu, přímého pozorování a ohodnocení počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou mikrohlízkou Podařilo se prokázat vliv faktoru koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu jak na indukci, tak i na hmotnost hlízek. V případě indukce hlízek (% počtu baněk s alespoň jednou vyvinutou hlízkou k celkovému počtu baněk) byla zjištěna následným testováním podle Tukeye existence vysoce průkazného rozdílu mezi variantou se sníženým a zvýšeným obsahem dusíku a mezi kontrolní variantou a variantou se sníženým obsahem dusíku v indukčním médiu.

39

Rozdíl je vysoce průkazný, protože nastal pro obě hladiny významnosti α = 0,01 (0,05) a má až 99% pravděpodobnost. Rozdíl mezi kontrolní variantou a variantou se zvýšeným dusíkem je statisticky neprůkazný. Grafická podoba tohoto testování je znázorněna v grafu č. 1. Tento závěr potvrzuje i Friedmanův test s mnohonásobným porovnáváním podle Neményiho viz tabulka č.16, který je neparametrickou obdobou analýzy rozptylu dvojného třídění. U hmotností hlízek viz graf č.5a byla zjištěna následným testováním podle Tukeye existence průkazného rozdílu pouze mezi variantou se sníženou a zvýšenou koncentrací dusíku v indukčním médiu. Rozdíl je průkazný, ale existuje jen na hladině významnosti α = 0,05. Rozdíl mezi kontrolní variantou a variantou se zvýšeným nebo

Průměrná hmotnost zralých hlízek po 99 až 101 dnech růstu [mg]

sníženým dusíkem je statisticky neprůkazný.

Graf č.5a - Závislost hmotnosti zralých mikrohlízek na koncentraci anorganického dusíku v indukčním médiu za kultivačních podmínek in vitro (doba růstu 99 až 101 dní podle souborů) Zvýšený dusík 120

100

Kontrolní varianta

80

60

40

Snížený dusík 20 0

10

20

30

40

50

60

70

Koncentrace dusíku v indukčním médiu [µM]

Dále se podařilo ověřit validitu analýzy rozptylu, a také to, že k opakování pokusu došlo za přibližně stejných podmínek a se statisticky shodnými výsledky závisle proměnné tj indukce nebo hmotnosti hlízek. Statisticky a graficky prokázané rozdíly v indukci a v hmotnostech hlízek nelze přičítat náhodě při zařazování různě vitálních segmentů do souborů, ale spíše vlivu různé úrovně dusíku v indukčním médiu.

40

Ze statistického vyhodnocení vyplývá závěr, že nic nenasvědčuje tomu, že by neplatila hypotéza, že snížené množství nitrátového dusíku v indukčním médiu vede obecně k výraznější indukci, ale zároveň i snížení hmotnosti hlízek u lilku bramboru (Solanum tuberosum L.) za kultivačních podmínek in vitro. Zvýšení obsahu anorganického dusíku v indukčním médiu naopak vede ke snížení indukce tvorby hlízek, ale zároveň k jejich větší hmotnosti. Výsledky odpovídají teoretickým předpokladům, nelze vyloučit vliv koncentrace dusíku v médiu na hmotnost mikrohlízek a na jejich indukci. Všechny statisticky zpracované výsledky jsou zřetelné z grafu č. 2. V tomto grafu jsou vyneseny celkové průměry procentuálního počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou mikrohlízkou z jednotlivých týdenních ohodnocení odděleně podle úrovní faktoru koncentrace anorganického dusíku v indukčním médiu. Na všech týdenních ohodnoceních

prokazuje

anorganického dusíku

nejvyšší

indukci

varianta

se

sníženou

koncentrací

a naopak nejnižší varianta se zvýšenou koncentrací

Ohodnocení počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou [%]

anorganického dusíku.

Graf č. 2 - Závislosti indukce mikrohlízek na týdenních ohodnoceních za kultivačních podmínek in vitro

80

Závislost týdenních ohodnocení počtu hlízek u varianty se sníženou koncentrací anorganického dusku v médiu

70

71,07

Závislost týdenních ohodnocení počtu hlízek u kontrolní varianty koncentrace anorganického dusíku v médiu 60

62,81 60,17

Závislost týdenních ohodnocení počtu hlízek u varoanty se zvýšenou koncentrací anorganického dusíku v médiu

53,39 55,08

50 47,11 40

39,83 35,59

34,71 30

29,66 22,88

21,49

20

10

8,47

7,44 1,69

0 0

1

2

3

19,49

7,63

1,69 4

5

6

7

8

9

10

Čas od zahájení pokusu t [týden]

Regresní funkce byla odvozena k objasnění vlivu dusíku na proces indukce hlízek po přepasážování rostliny bramboru z média udržujícího korelativní inhibici do média indukčního. Proces indukce hlízek se podobá přechodovému jevu.

41

K indukci hlízek dojde až s určitým časovým zpožděním a setrvačností po prudkém vyvolání indukčních podmínek. Délku časového zpoždění TD je možné nazvat dobou fyziologické přípravy rostliny bramboru na tvorbu hlízek Časová setrvačnost indukce hlízek je patrná z průběhu regresní funkce indukce, kdy se procentuální počet baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou postupně přibližuje od své nulové k maximální asymptotické hodnotě 100 % po exponenciální regresní křivce. Regresní funkce umožňuje vysvětlit spojitost obsahu dusíku v indukčním médiu s dobou fyziologické přípravy a s časovou setrvačností indukce tvorby hlízek. Z průběhu regresní funkce lze vyčíst i existenci inhibujících a stimulujících vlivů. Z porovnání hodnot regresních funkcí kontrolní varianty, sníženého a zvýšeného dusíku pro jednotlivá týdenní ohodnocení vyplývá, že na všech týdenních ohodnoceních bylo nejvíce baněk s alespoň jednou vyvinutou hlízkou u varianty se sníženým dusíkem a naopak nejméně u varianty se zvýšeným dusíkem viz graf č. 3. Předpokládaný výsledek se tímto potvrdil.

Graf č. 3 - Regresní křivka závislosti indukce mikrohlízek na čase, za kultivačních podmínek in vitro y 1 = f(t) 100 70,75 62,07 51,84 80

61,18 50,89 41,56 49,38 37,69 30,29

y 1 = f(t) [%]

60

35,56 23,22 18,72 40

Regresní křivka indukce mikrohlízek s pásem spolehlivosti pro variantu se sníženou koncentrací anorganického dusíku v médiu Regresní křivka indukce mikrohlízek pro kontrolní variantu koncentrace anorganického dusíku v médiu

20,66 9,43 8,19 7,10 1,10 0,59

20

Regrsení křivka indukce mikrohlízek s pásem spolehlivosti pro variantu se zvýšenou koncentrací anorganického dusíku v médiu Poznámka: Hladina významnosti pro pás spolehlivosti regresní křivky α = 0,05

0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

Čas od zahájení pokusu t [týden]

Hodnoty vypočtené z regresní funkce korespondují s hodnotami laboratorně zjištěnými. Pro regesní křivky jednotlivých variant jsem určil pásy spolehlivosti, které jsou v grafu č. 3 vymezeny chybovými úsečkami. V pásu spolehlivosti budou s 95% spolehlivostí všechny laboratorně (empiricky) zjištěné hodnoty.

42

Pás spolehlivosti pro variantu se sníženým obsahem anorganického dusíku se nepřekrývá s pásem spolehlivosti pro variantu se zvýšeným obsahem dusíku v indukčním médiu, tím došlo ke shodě s výsledky ze statistického vyhodnocení. Pás spolehlivosti pro kontrolní variantu se překrývá, jak s pásem pro variantu se sníženým dusíkem tak i pro variantu se zvýšeným dusíkem. U těchto variant neexistují průkazné rozdíly, ten existuje s 95% pravděpodobností jen mezi variantou se sníženým a zvýšeným dusíkem. Kromě ostatních koeficientů regresní funkce jsem vypočetl i konstantu TD jako dobu fyziologické přípravy. Z porovnání jejich velikosti vyplývá, že nejkratší dobu fyziologické přípravy na tvorbu mikrohlízek potřebuje varianta se sníženým dusíkem. Kontrolní varianta a varianta se zvýšeným dusíkem potřebují dobu navzájem přibližně stejně dlouhou, ale o 5 dní delší než varianta se sníženým dusíkem. Nic nenasvědčuje tomu, že by zvětšující se délka doby fyziologické přípravy nebyla důsledkem působení různé koncentrace anorganického dusíku, protože ostatní složky média jsou shodné.

Tabulka č. 20 – Porovnání doby fyziologické přípravy

Varianta koncentrace dusíku v médiu

Doba fyziologické přípravy TD [den]

Doba fyziologické přípravy TD [týden]

Kontrolní varianta

26

3,720

Snížený dusík

21

2,935

Zvýšený dusík

25

3,507

Hodnotu TD jsme získali extrapolací tedy výpočtem hodnoty regresní funkce mimo interval empiricky získaných týdenních ohodnocení indukce hlízek. Tato extrapolace je, ale minimální. U kontrolní varianty byla nejmenší funkční hodnota regresní funkce pro 1. realizované týdenní ohodnocení 0,59 % u varianty se zvýšeným dusíkem 1,10 % a u varianty se sníženým dusíkem 7,1 %. Souřadnice inflexního bodu odvozené regresní křivky poukazují na působení stimulujících a inhibujících vlivů ovlivňujících procento baněk s alespoň jednou

43

vytvořenou hlízkou a jejich spojitost s variantou koncentrace dusíku v indukčním médiu.

Tabulka č. 21 – Inflexní bod regresní křivky Čas dosažení inflexního bodu* ti [týden]

Procento baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou v inflexním bodě yi [%]

Maximální okamžitá rychlost indukce vi [týden-1]

Kontrolní varianta

6,19 (43 dní)

26,1

14,6

Snížený dusík

5,39 (38 dní)

26,4

15,0

Zvýšený dusík

6,67 (47dní)

26,4

11,6

Varianta koncentrace dusíku v médiu

*od založení souboru jednonodálních segmentů

Z vypočtených hodnot vyplývá, že stimulující vlivy působily u varianty se sníženým dusíkem v průměru do 38. dne u kontrolní varianty do 43. dne a u varianty se zvýšeným dusíkem do 47. dne od vyvolání indukčních podmínek. Z rozboru vypočtených hodnot maximální okamžité rychlosti indukce v tabulce č.21, s kterou se baňky jednotlivých variant postupně dostávají do stavu s alespoň jednou vytvořenou hlízkou je zřejmé, že varianta se zvýšeným obsahem dusíku dosahuje nejmenší hodnoty maximální okamžité rychlosti a je tedy nejpomalejší. Varianta se sníženým dusíkem je naopak nejrychlejší v indukci mikrohlízek.

Tabulka č. 22 – Porovnání koeficientů zesílení indukce hlízek vlivem média

Varianta koncentrace dusíku v indukčním médiu

Koeficient zesílení indukce hlízek vlivem média K [-]

Snížený dusík

16,651

Kontrolní varianta

16,173

Zvýšený dusík

10,010

44

20

Graf č.4 - Závislost doby fyziologické přípravy TD, koeficientu zesílení indukce K a maximální okamžité rychlosti v i na počáteční koncentraci anorganického dusíku v indukčním médiu

18 16 14 12

K - koeficient zesílení indukce hlízek Vi - maximální okamžitá rychlost

10

TD - doba fyziologické přípravy

8 6 4 2

Varianta KV- 30,977mmoll-1

Varianta SD - 6,365 mmoll-1

Varianta ZD - 52,342mmoll-1

0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Počáteční koncentrace nitrátových inotů NO 3- indukčního média [mmol.l-1]

Z porovnání koeficientů zesílení indukce hlízek vyplývá, že nejvyšší zesílení má varianta se sníženým a naopak nejnižší varianta se zvýšeným obsahem dusíku v indukčním médiu. Závislost doby fyziologické přípravy TD, maximální okamžité rychlosti indukce vi a koeficientu zesílení indukce v závislosti na počáteční molární koncentraci nitrátových iontů NO3- v indukčním médiu je zobrazena v grafu č. 4.

5.3. Statistické zpracování výsledků morfologického pokusu, přímého pozorování a ohodnocení počtu vzniklých hlízek k celkovému počtu segmentů Cílem tohoto pokusu bylo zkoumat vliv faktoru koncentrace anorganického dusíku v indukčním médiu a faktoru týdenní ohodnocení na závisle proměnnou, kterou je nyní frekvence tuberizace. Frekvence tuberizace byla v morfologickém pokusu vyhodnocována, jako procentuální počet vzniklých hlízek k celkovému počtu segmentů viz graf č. 5.

45

Ohodnocení počtu vytvořených hlízek k celkovému počtu segmentů [%]

Graf č. 5 - Závislost frekvence tvorby hlízek na týdenních ohodnoceních za kultivačních podmínek in vitro

40

SD procentuální počty mikrohlízek vzhledem k celkovému počtu segmentů pro variantu se sníženou koncentrací dusíku v médiu 37,43

KM procentuální počty mikrohlízek vzhledem k celkovému počtu segmentů pro kontrolní variantu koncentrace dusíku v médiu

30

27,93

ZD procentuální počty mikrohlízek vzhledem k celkovému počtu segmentů pro variantu se zvýšenou koncentrací dusíku v médiu

28,17 22,80

20

19,37

22,32 15,85

12,69 12,84 10

10,27

7,31 8,03 2,26

2,23

0,45 0,43

2,15

6,25

0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Čas od zahájení pokusu t [týden]

Soubory dat jsou v tabulkách č. 23, 24 a 25. Protože testem homogenity rozptylů, viz tabulka č. 26, jsem vyhodnotil homogenitu, jako neprůkaznou musel jsem k ověření následující nulové hypotézy H014 využít Friedmanův test s následným mnohonásobným porovnáváním podle Neményiho.

H014: Efekty faktoru B – varianta koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu působí na frekvenci tuberizace mikrohlízek stejně Z tabulky č. 27 - Friedmanův test k posouzení vlivu dusíku na frekvenci tvorby hlízek in vitro (na % vytvořených mikrohlízek vzhledem k původnímu počtu jednonodálních segmentů ve variantě) vyplývá, že Friedmanův test indikuje pro naše data zamítnutí shody mediánů dílčích souborů a proto zamítáme nulovou hypotézu, že procentuální počet vzniklých hlízek k celkovému počtu segmentů nezávisí po celou dobu trvání pokusu na obsahu anorganického dusíku v indukčním médiu. Průkazný rozdíl existuje pouze u varianty mezi sníženým a zvýšeným obsahem dusíku v indukčním médiu a jen pro hladinu významnosti α = 0,01. Výsledek je v souladu s předpokladem. Nic nenasvědčuje tomu, že by snížené množství nitrátového dusíku v indukčním médiu nevedlo k výraznější frekvenci tuberizace (k výraznějšímu nárůstu procenta vzniklých hlízek k celkovému počtu segmentů) .

46

5.4. Zpracování výsledků pokusu se stanovením koncentrace cytokininů v čerstvé hmotě rostliny metodou přímá ELISA Výsledky pokusu se stanovením koncentrace cytokininů v čerstvé hmotě rostliny jsou zpracovány v tabulkách č. 28 až 36 a v grafech č. 6 až 45. Porovnáním grafů č. 6 až 9 tj. závislostí koncentrace metatopolinu na týdenních ohodnoceních v jednotlivých částech a celé rostlině bramboru, můžeme analyzovat místo syntézy, odbourávání, translokace a i změnu velikosti poměru auxinu a metatopolinu nad nebo pod vyrovnaný. Cytokininy a auxiny umožňují regeneraci za kultivačních podmínek in vitro a změnami jejích poměru v médiu lze obnovovat celou rostlinu bramboru Solanum tuberosum L. Vyrovnaný poměr způsobuje tvorbu kalusu, nadbytek IAA kořenů a nadbytek CK stonků. Protože poměr auxinu a cytokininu určuje morfogenní odpověď (SKOOG et MILLER 1965) můžeme tento poměr zjistit ze známého průběhu koncentrace metatopolinu v celé rostlině a pozorováním morfogenních odpovědí během trvání pokusu.

5.4.1. Vyhodnocení průběhu koncentrace cytokininu metatopolinu během fyziologické přípravy na tvorbu mikrohlízek

Vyhodnocení průběhu koncentrací v rozmezí 0 až 48 hodině trvání pokusu :

V čase od zahájení pokusu do 48 hodiny jeho trvání koncentrace metatopolinu v nadzemní části rostliny klesá. V tomto úseku časového průběhu je koncentrace metatopolinu nadzemní části rostliny (jeden list a pupen jednonodálního segmentu) u všech variant obsahu anorganického dusíku v indukčním médiu vyšší jak koncentrace metatopolinu stonku původního jednonodálního segmentu. Hodnota koncentrace metatopolinu v nadzemní části klesá k lokálnímu minimu, toto minimum má hodnotu koncentrace nižší jak dormantní. Pod dormantní hodnotu klesá i koncentrace metatopolinu ve stonku původního jednonodálního segmentu a u varianty se sníženým dusíkem dokonce klesne až na nulovou hodnotu nebo práh měřitelnosti. Z grafu č. 7 a č. 9 lze vyčíst, že i když je transport metatopolinu minimální nebo nulový, protože klesá jeho koncentrace ve stonku původního jednonodálního segmentu

47

pod dormantní hodnotu, vzrůstá jeho koncentrace v listu a pupenu, v těchto částech rostliny je metatopolin zřejmě lokálně syntetizován. To, že vzrůstá hladina metatopolinu v jednom listu a pupenu (jednonodální segment tvoří celou rostlinu) neznamená, že i když se v listu a pupenu postupně zmenšuje poměr auxinu a metatopolinu až klesne pod vyrovnaný a je tam tedy preferován růst, že v celé rostlině nemůže být tendence opačná tj., že nemůže být preferován růst kořenů. Nadzemní část rostliny metatopolin syntetizuje a odbourává. Koncentrace metatopolinu v nadzemní části rostliny klesá, rostlina ho více odbourává, než syntetizuje, protože chybí kořenový systém.

Vyhodnocení průběhu koncentrací v rozmezí 48 až 168 hodině trvání pokusu:

V části časového průběhu mezi 48 až 168 hodinou se koncentrace metatopolinu v nadzemní části rostliny zvyšuje. Koncentrace metatopolinu ve stonku původního jednonodálního segmentu je u varianty se sníženým a zvýšeným dusíkem nulová tj. nedochází zde k jeho transportu a zásoby jsou již vyčerpány. U kontrolní varianty může docházet k transportu maximálně na úrovni dormantní rostliny a je patrné, že určité zásoby metatopolinu rostlina ještě má, pokud nedošlo k poklesu koncentrace na nulovou hodnotu v nesledované části průběhu. Zvyšování koncentrace metatopolinu v novém prýtu potvrzuje skutečnost, že došlo k vytvoření nového prýtu s pupeny a lístky. To se projevilo zvýšením koncentrace metatopolinu

v nadzemní

části

kromě

původního

jednonodálního

segmentu.

Metatopolin byl transportován především nahoru v nově vytvořeném stonku prýtu z nových listů a pupenů. To se projevilo dalším nárůstem obsahu metatopolinu v nadzemní části rostliny a poklesem poměru auxinu a metatopolinu pod vyrovnaný. V nově vytvořené části rostliny nad jednonodálním segmentem nastalo potlačení apikální dominance apexu prýtu, byla podpořena tvorba bočních větví, a tím také lístků a pupenů. Nové lístky a pupeny zvýšily tvorbu metatopolinu a tím i jeho koncentraci v nadzemní části. Metatopolin stoupal z lístků a pupenů na horu do stonku a tím se projevil pokles koncentrace metatopolinu v pupenech a listech. V této části časového průběhu nedochází k transportu metatopolinu z kořenů do nadzemní části, protože koncentrace metatopolinu je v části stonku původního jednonodálního segmentu skoro nulová a naopak je zde maximální poměr auxinu a 48

metatopolinu. Maximální preference tvorby kořenů platí v nadzemní části rostliny jen pro spodní část, která je vymezena původním jednonodálním segmentem a rovinou

řezu. Zdrojem syntézy metatopolinu je i v této části časového průběhu pupen a list.

Vyhodnocení průběhu koncentrací v rozmezí 168 až 456 hodině trvání pokusu:

V části časového průběhu mezi 168 až 456 hodinou se koncentrace metatopolinu v části stonku původního jednonodálního segmentu zvyšuje, kdežto v nadzemní části rostliny, především v prýtu, vyrostlém z původního jednonodálního segmentu, naopak snižuje. Nárůst koncentrace metatopolinu v části stonku původního jednonodálního segmentu u všech variant koncentrace anorganického dusíku v indukčním médiu nasvědčuje tomu, že metatopolin začal již proudit touto částí stonku a byla tedy obnovena plná funkčnost kořenů, protože kořeny jsou hlavním místem syntézy cytokininů. Plná funkčnost kořenů se projeví tím, že se koncentrace metatopolinu ve stonku původně jednonodálního segmentu u variant se sníženou a zvýšenou koncentrací anorganického dusíku v indukčním médiu stane postupně výrazně vyšší, než koncentrace v listech a pupenech viz graf č. 7 a č. 9. Pouze u kontrolní varianty je koncentrace metatopolinu jak v listech tak i pupenech větší jak koncentrace ve stonku původního jednonodálního segmentu. I zde dochází k syntéze metatopolinu v kořenech, ale nadále se zesiluje jeho syntéza i v listech a pupenech. V počáteční fázi této části časového průběhu je koncentrace metatopolinu ve zbytku nadzemní části rostliny zpočátku vyšší než hodnota koncentrace ve stonku původního jednonodálního segmentu. Zhruba v polovině této vyhodnocované části

časového průběhu se hodnoty koncentrace metatopolinu změní ve prospěch části stonku původního jednonodálního segmentu. V první polovině vyhodnocovaného průběhu je koncentrace metatopolinu ve stonku původního jednonodálního segmentu nižší než ve zbývající nadzemní části rostliny. Syntéza cytokininu v kořenech je zatím menší než v listech a pupenech. Ve stonku původního jednonodálního segmentu je tedy poměr auxinu a metatopolinu stále vyšší než vyrovnaný. V původní části stonku je tedy zatím podporován prodlužovací 49

růst prýtu. Předpokládám, že poměr auxinu a cytokininu je obdobný i v kořenech, takže je podporováno vytváření bočních kořenů. Koncentrace metatopolinu ve stonku původně jednonodálního segmentu postupně roste, až se zvýší natolik, že se koncentrace této části stonku stane vyšší, než zbývající části rostliny, kde musí být cytokinin odbouráván vyšší produkcí cytokinin oxidázy/dehydrogenázy vlivem vyšší koncentrace auxinu. V této zbývající části stonku tedy převládá vliv apikální dominance a dochází k podpoře prodlužovacího růstu prýtu. Potvrzuje to i koncentrace metatopolinu v listech a pupenech viz graf č. 7 a 9, kde u varianty se sníženou a zvýšenou koncentrací anorganického dusíku v indukčním médiu se koncentrace metatopolinu

v listech

postupně

sníží

pod

úroveň

koncentrace

v původně

jednonodálním segmentu. Pouze u kontrolní varianty je koncentrace metatopolinu v listech a pupenech vyšší než ve stonku původně jednonodálního segmentu a rozdíl se neustále zvyšuje ve prospěch listů a pupenů. Neprojevuje se odbourávání metatopolinu zvýšenou tvorbou cytokinin oxidázy/dehydrogenázy. Je zde menší vliv apikální dominance, poměr auxinu a metatopolinu, je menší než vyrovnaný. To se projeví potlačením prodlužovacího růstu a apikální dominance vrcholového pupenu prýtu ve prospěch větvení, vzniku dalších lístků, pupenů a tvorby stolonů, ve kterých se postupně zvyšuje koncentrace metatopolinu. Ve druhé polovině vyhodnocovaného časového průběhu, kdy se koncentrace metatopolinu ve stonku původně jednonodálního segmentu stane postupně vyšší než koncentrace metatopolinu ve zbývající nadzemní části rostliny nasvědčuje tomu, že se syntéza metatopolinu v kořenech zvyšuje. V původně jednonodálním segmentu a kořenech se poměr auxinu a cytokininu postupně snižuje pod vyrovnaný, až již není preferován růst postraních kořenů, ale je preferován růst kulového kořene. Tím se v dalším časovém průběhu mezi 456 až 672 hodinou začne zvyšovat koncentrace metatopolinu v novém prýtu. Poměr auxinu a metatopolinu se v nově vytvořené nadzemní části rostliny zvyšuje nad vyrovnaný, vlivem snižování koncentrace metatopolinu cytokininoxidázou. Další snižování koncentrace metatopolinu v listech a pupenech u varianty se sníženým a zvýšenou koncentraci anorganického dusíku v indukčním médiu viz graf č. 7 a 9 potvrzuje vliv cytokininoxidázy/dehydrogenázy a apikální dominance apexu prýtu. Je preferován prodlužovací růst prýtu a tvorba stolonů je nyní inhibována. V celém průběhu tohoto časového intervalu dochází k tomu, že klesá obsah cytokininů v novém

50

prýtu a stoupá obsah cytokininů ve stolonu – je tam zřejmě translokován. Cytokininy mají vliv na růst stolonu, protože podporují buněčné dělení; podporují tedy růst stolonu.

Vyhodnocení průběhu koncentrací v rozmezí 456 až 672 hodině trvání pokusu:

V části časového průběhu mezi 456 až 672 hodinou se koncentrace metatopolinu v celé nadzemní části zvyšuje z nulové hodnoty koncentrace. V novém prýtu se začne snižovat poměr auxinu a cytokininu pod vyrovnaný a tak rostlina bramboru preferuje tvorbu hlavního kulového kořene, tj. dojde k posílení apikální dominace apexu kořene a v nadzemní části naopak k potlačení apikální dominance a apexu prýtu. Kořeny začnou syntetizovat více metatopolinu a jeho koncentrace v celé rostlině vzrůstá. Poměr auxinu a metatopolinu však zůstává menší jak vyrovnaný. V nadzemní části celé rostliny je koncentrace metatopolinu nejprve menší jak ve stonku původního jednonodálního segmentu. Z toho lze usuzovat, že se u syntézy metatopolinu projevuje vice vliv nadzemní části než kořenů. Zhruba v druhé polovině vyhodnocovaného časového úseku se koncentrace metatopolinu v celé rostlině stane vyšší než ve stonku původního jednonodálního segmentu a v syntéze metatopolinu převládne vliv kořene. V listech a pupenech je koncentrace metatopolinu u variant se sníženým a zvýšeným obsahem anorganického dusíku v indukčním médiu menší jako ve stonku původního jednonodálního segmentu. U kontrolní varianty je tomu naopak. Je to setrvalý trend, který se již projevil v části vyhodnocovaného časového úseku mezi 168 a 456 hodinou a tam je popsán. Z gradu č. 8 můžeme vyčíst, že se koncentrace metatopolinu stolonu u kontrolní varianty stane vyšší než koncentrace ve stonku původně jednonodálního segmentu. Naměřené hodnoty napovídají tomu, že se stolon stal zdrojem syntézy metatopolinu. U variant se sníženým a zvýšeným obsahem anorganického dusíku v indukčním médiu, je koncentrace metatopolinu ve stolonu setrvale menší než ve stonku původně jednonodálního segmentu. V tomto případě dochází spíše k translokaci metatopolinu než k jeho syntéze. První hlízka v této části časového průběhu ještě s velkou pravděpodobností vytvořena není. Na konci nyní vyhodnocované části časového průběhu se hodnota poměru auxinu a cytokininu překlopí a v časovém úseku mezi 672 až 1008 hodinou bude větší 51

jak vyrovnaná. Ke změně napomáhá preference nadzemní části a listů a vliv auxinu na tvorbu cytokinin oxidázy/dehydrogenázy.

Vyhodnocení průběhu koncentrací v rozmezí 672 až 1008 hodině trvání pokusu:

Po změně poměru auxinu a metatopolinu na hodnotu větší jak vyrovnanou, se v části časového průběhu mezi 672 až 1008 hodinou koncentrace metatopolinu v celé rostlině začne snižovat. Postupně dochází k preferenci bočních kořenů potlačením apexu kulového kořene a tím se zmenší syntéza metatopolinu. V novém prýtu dojde k posílení apikální dominance apexu prýtu a potlačení větvení. Zesílí syntéza auxinu, který způsobí postupné zvyšování aktivity cytokinin oxidázy/dehydrogenázy a tím i zvětšující se odbourávání metatopolinu. V této části časového průběhu dochází s nejvyšší pravděpodobností ke tvorbě prvních hlízek a koncentrace metatopolinu v listu, pupenu a stolonu má stejný trend jako v předchozím časovém úseku. Působení cytokinin oxidázy/dehydrogenázy je pouze dočasné. Jakmile hodnota koncentrace metatopolinu dosáhne nulové hodnoty, dojde k překlopení hodnoty poměru auxinu a metatopolinu a opět ke zvyšování koncentrace metatopolinu.

Závěr vyhodnocení průběhu koncentrace metatopolinu v závislosti na týdenních ohodnoceních:

Z celkového časového průběhu tedy ze všech sledovaných časových úseků lze zjistit, že se závislost koncentrace metatopolinu nadzemní části rostliny (tj. novém prýtu) v závislosti na čase mění, kmitá přibližně kolem výchozí hodnoty korelativní inhibice a cyklicky se opakuje podle toho, jak se v průběhu času mění poměr koncentrace auxinu a cytokininu na hodnotu vyšší nebo nižší jak vyrovnanou. Změna morfogenní odpovědi mezi dominancí apexu kořene a prýtu má velký vliv na průběh koncentrace metatopolinu a většiny cytokininů v závislosti na čase. Je zajímavé, že amplituda kladné nebo záporné odchylky koncentrace metatopolinu od výchozí dormantní hodnoty, se v námi sledovaném časovém úseku mezi 0 až 1008 hodinou neustále zvyšuje. Předpokládám, že se kladné nebo záporné odchylky koncentrace metatopolinu od výchozí hodnoty korelativní inhibice postupně ustálí na stejné absolutní hodnotě a cyklicky se opakující kmitavý průběh tak dosáhne ustálené hodnoty amplitudy koncentrace metatopolinu. Toto ustálení může být 52

způsobeno vyrovnáním účinků ve střídání dominance apexu prýtu a kořenů, tedy dosažením rovnováhy mezi růstem nadzemní částí rostliny a její kořenovou soustavou.

Tabulka č. 28a - Vyhodnocení koncentrací metatopolinu v rostlině bramboru Doba od zahájení pokusu [hod]

Vývoj koncentrace v nadzemní části rostliny

Vývoj koncentrace list/pupen/stolon

Změna poměru auxinu a metatopolinu

Apikální dominance

Vznik nového orgánu

Zdroj syntézy

0 ÷ 48

↓

↑/→/není

>

rašící pupen

-

-

cca 48

lok. min.

lok. max/→/není

změna

změna

48 ÷ 168

↑

↓/→/není

<

apex kořene

cca 168

lok. max.

lok. min/→/vznik

změna

změna

apex prýtu kořeny, list,pupen pupeny stolon

168 ÷ 456

↓

↑/↓/↑

>

apex prýtu

-

cca456

nul. min.

↑/↓/↑

změna

změna

-

456 ÷ 672

↑

↑/↓/↑

<

apex kořene

-

cca 672

lok. max.

↑/↓/↑

změna

změna

672÷1008

↓

↑/↓/↑

>

apex prýtu

cca 1008

nul. min.

↑/↓/↑

změna

změna

první hlízka

list, apex list,pupen, kořen list,pupen, kořen list,pupen, kořen list,pupen, kořen list,pupen, kořen list,pupen, kořen list,pupen, kořen list,pupen, kořen

Legenda: ↑ stoupá, ↓ klesá, → výchozí dormantní hodnota, > větší než vyrovnaný poměr auxinu a cytokininu, < menší než vyrovnaný poměr auxinu a cytokininu, lok.min lokální minimum průběhu, lok.max lokální maximum průběhu, nul. min. lokální minimum nulové hodnoty

Snižováním obsahu dusíku v rostlině v ní dochází ke snižování obsahu adenosinfosfát isopentenyltransferázy, což je enzym biosyntézy cytokininů, takže v rostlině vzniká méně metatopolinu a tak i koncentrace dusíku v rostlině může ovlivnit poměr auxinu a cytokininu. U zbývajících cytokininů (grafy č.10 až 45) byl vývoj koncentrací v rostlině i jejích jednotlivých orgánech obdobný jako u metatopolinu, a to z toho důvodu, že byl dán především počátečním odstraněním kořenů a neustálou snahou o dosažení rovnováhy mezi auxiny a cytokininy (tj. mezi nadzemní a podzemní částí rostliny).

53

Graf č. 6 - Závislost koncentrace metatopolinu na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu 3

672

Snížený dusík nadzemní část rostliny Kontrolní varianta nadzemní část rostliny Zvýšený dusík nadzemní část rostliny

Koncentrace mT [ng/g]

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu

2

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

0

168

48

1

456

1008

0 0

200

400

600

800

1000

Čas t [hod]

Graf č. 7 - Závislost koncentrace metatopolinu na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

672

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

2

Snížený dusík list

Koncentrace mT [ng/g]

Kontrolní varianta list Zvýšený dusík list

1

48 0

168

0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

54

500

600

700

Graf č. 8 - Závislost koncentrace metatopolinu na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu

2,5

Snížený dusík stolon

672

Kontrolní varianta stolon 2,0

Zvýšený dusík stolon Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Koncentrace mT [ng/g]

1,5

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu 1,0

0,5

0

48

168

0,0 0

100

200

300

400

500

600

700

Čas t [hod]

Graf č. 9 - Závislost koncentrace metatopolinu na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík pupen

6

Kontrolní varianta pupen

672

Zvýšený dusík pupen

5

Koncentrace mT [ng/g]

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu

4

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu 168

3

48 2 0 1

0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

55

500

600

700

Graf č. 10 - Závislost koncentrace metatopolinu ribbosidu na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu 672

Snížený dusík nadzemní část rostliny Kontrolní varianta nadzemní část rostliny 15

Zvýšený dusík nadzemní část rostliny Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

Koncentrace mTR [ng/g]

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

10

0

168 5

48 1008

456 0 0

200

400

600

800

1000

Čas t [hod]

Graf č. 11 - Závislost koncentrace metatopolinu ribbosidu na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu 672

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu 15

Kontrolní varianta stonek npůvodního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

Koncentrace mTR [ng/g]

Snížený dusík list Kontrolní varianta list

10

Zvýšený dusík list

5

168 0

48

0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

56

500

600

700

Graf č. 12 - Závislost koncentrace metatopolinu ribbosidu na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu 672

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu 15

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stolon

Koncentrace mTR [ng/g]

Kontrolní varianta stolon Zvýšený dusík stolon

10

5

168 0 48 0 0

100

200

300

400

500

600

700

Čas t [hod]

Graf č. 13 - Závislost koncentrace metatopolinu ribbosidu na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

672

15

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Snížený dusík pupen Koncentrace mTR [ng/g]

Kontrolní varianta pupen 10

Zvýšený dusík pupen 48 168

5

0

0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

57

500

600

700

Graf č. 14 - Závislost koncentrace izopentenyladeninu na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu

220

Snížený dusík nadzemní část rostliny 200

Kontrolní varianta nadzemní část rostliny

180

Zvýšený dusík nadzemní část rostliny Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

160

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

140

Koncentrace iP [ng/g]

672

120

168

100 80 60 40 48

20 0

1008

456

0 0

200

400

600

800

1000

Čas t [hod]

Graf č. 15 - Závislost koncentrace izopentenyladenin na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu

220

Snížený dusík stonek p ůvodního jednonodálního segmentu

200

672

Kontrolní varianta stonek p ůvodního jednonodálního segmentu 180 Zvýšený dusík stonek p ůvodního jednonodálního segmentu

Koncentrace iP [ng/g]

160

Snížený dusík list

140

Kontrolní varianta list

120

Zvýšený dusík list 168

100 80 60 40 20 0

48

0 0

100

200

300

400 Čas t [hod]

58

500

600

700

220

Graf č. 16 - Závislost koncentrace izopentenyladenin na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

200

672

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

180

Snížený dusík stolon

160

Kontrolní varianta stolon

Koncentrace iP [ng/g]

140

Zvýšený dusík stolon

120

168

100 80 60 40 20 0

48

0 0

100

200

300

400

500

600

700

Čas t [hod]

Graf č. 17 - Závislost koncentrace izopentenyladenin na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu

220

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

672

200

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu 180

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

160

Snížený dusík pupen

48

Kontrolní varianta pupen

Koncentrace iP [ng/g]

140

Zvýšený dusík pupen

120 100

168 80 60 40 20 0 0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

59

500

600

700

70

Graf č. 18 - Závislost koncentrace izopentenyladeninu ribosidu na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík nadzemní část rostliny

456

Kontrolní varianta nadzemní část rostliny

60

Zvýšený dusík nadzemní část rostliny Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

Koncentrace iPR [ng/g]

50

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu 40

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

168

672 30 1008 20

10 0

48

0 0

200

400

600

800

1000

Čas t [hod]

70

Graf č. 19 - Závislost koncentrace izopentenyladeninu ribosidu na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu

60

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Snížený dusík list

Koncentrace iPR [ng/g]

50

Kontrolní varianta list 40

672

Zvýšený dusík list 168

30

20

10 48 0 0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

60

500

600

700

70

Graf č. 20 - Závislost koncentrace izopentenyladeninu ribosidu na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu

60

Koncentrace iPR [ng/g]

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stolon

50

Kontrolní varianta stolon 672

Zvýšený dusík stolon

40

168 30

20

10 0

48

0 0

100

200

300

400

500

600

700

Čas t [hod]

70

Graf č. 21 - Závislost koncentrace izopentenyladeninu ribosidu na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu

60

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Koncentrace iPR [ng/g]

50

Snížený dusík pupen

48

Kontrolní varianta pupen 40

168

672

Zvýšený dusík pupen

30

20

10 0 0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

61

500

600

700

3

Graf č. 22 - Závislost koncentrace dyhydrozeatinu na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík nadzemní část rostliny 456

Kontrolní varianta nadzemní část rostliny

Koncentrace DHZ [ng/g]

Zvýšený dusík nadzemní část rostliny Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

2

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu 1

168 672 1008 0

48

0 0

200

400

600

800

1000

Čas t [hod]

1,0

Graf č. 23 - Závislost koncentrace dyhydrozeatinu na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu 168

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

0,8

Koncentrace DHZ [ng/g]

Snížený dusík list Kontrolní varianta list Zvýšený dusík list

0,6

672 0,4

0,2

0

48

0,0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

62

500

600

700

Graf č. 24 - Závislost koncentrace dyhydrozeatinu na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu 168

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

1,0

Koncentrace DHZ [ng/g]

Snížený dusík stolon Kontrolní varianta stolon Zvýšený dusík stolon

0,5 672

0

48

0,0 0

100

200

300

400

500

600

700

Čas t [hod]

2,7

Graf č. 25 - Závislost koncentrace dyhydrozeatinu na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu 168

2,4

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

2,1

Snížený dusík pupen

Koncentrace DHZ [ng/g]

1,8

Kontrolní varianta pupen 1,5

Zvýšený dusík pupen 1,2

48

0,9

0,6 672 0,3 0

0,0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

63

500

600

700

Graf č. 26 - Závislost koncentrace dyhydrozeatinu ribosidu na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu

0

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

Koncentrace DHZR [ng/g]

2

Snížený dusík nadzemní část rostliny

456

Kontrolní varianta nadzemní část rostliny Zvýšený dusík nadzemní část rostliny

1008

1

168

48

672

0 0

200

400

600

800

1000

Čas t [hod]

Graf č. 27 - Závislost koncentrace dyhydrozeatinu ribosidu na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu

0,08

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

672

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

Koncentrace DHZR [ng/g]

0,06

168

Snížený dusík list Kontrolní varianta list Zvýšený dusík list

0,04

0,02

0

48

0,00 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

64

500

600

700

Graf č. 28 - Závislost koncentrace dyhydrozeatinu ribosidu na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu

0,24

672

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu

0,20

Koncentrace DHZR [ng/g]

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stolon

0,16

Kontrolní varianta stolon Zvýšený dusík stolon

0,12

0,08 168 0,04

0

48

0,00 0

100

200

300

400

500

600

700

Čas t [hod]

1,5

Graf č. 29 - Závislost koncentrace dyhydrozeatinu ribosidu na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu 672

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu

Koncentrace DHZR [ng/g]

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu 1,0

Snížený dusík pupen Kontrolní varianta pupen Zvýšený dusík pupen

0,5

168

48 0 0,0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

65

500

600

700

Graf č. 30 - Závislost koncentrace benzyladeninu na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu 168

456

600

672

Koncentrace BA [ng/g]

500

Snížený dusík nadzemní část rostliny 400

Kontrolní varianta nadzemní část rostliny Zvýšený dusík nadzemní část rostliny

300

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

200

100

1008 0

48

0 0

200

400

600

800

1000

Čas t [hod]

Graf č. 31 - Závislost koncentrace benzyladeninu na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu 168

600

672

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

500

Koncentrace BA [ng/g]

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu 400

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Snížený dusík list

300

Kontrolní varianta list Zvýšený dusík list

200

100 0

48

0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

66

500

600

700

Graf č. 32 - Závislost koncentrace benzyladeninu na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu

168

600

672

Koncentrace BA [ng/g]

500

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu

400

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stolon

300

Kontrolní varianta stolon Zvýšený dusík stolon

200

100

0

48

0 0

100

200

300

400

500

600

700

Čas t [hod]

Graf č. 33 - Závislost koncentrace benzyladeninu na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu 672 168

600

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

Koncentrace BA [ng/g]

500

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

400

Snížený dusík pupen 300

Kontrolní varianta pupen Zvýšený dusík pupen

200 48 100 0 0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

67

500

600

700

Graf č. 34 - Závislost koncentrace benzyladeninu ribosidu na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík nadzemní část rostliny 50

456

Kontrolní varianta nadzemní část rostliny Zvýšený dusík nadzemní část rostliny

Koncentrace BAR [ng/g]

40

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

672

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

30

20

10

168

0

1008

48

0 0

200

400

600

800

1000

Čas t [hod]

Graf č. 35 - Závislost koncentrace benzyladeninu ribosidu na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu 25

672

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu

20

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

Koncentrace BAR [ng/g]

Snížený dusík list 15

Kontrolní varianta list Zvýšený dusík list 10 168 5

0

0 0

48 100

200

300

400

Čas t [hod]

68

500

600

700

Graf č. 36 - Závislost koncentrace benzyladeninu ribosidu na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu 25

672

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu

Koncentrace BAR [ng/g]

20

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stolon

15

Kontrolní varianta stolon Zvýšený dusík stolon 10 168 5

0

48

0 0

100

200

300

400

500

600

700

Čas t [hod]

Graf č. 37 - Závislost koncentrace benzyladeninu ribosidu na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu 48

60

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu

50

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

Koncentrace BAR [ng/g]

Snížený dusík pupen 40

Kontrolní varianta pupen Zvýšený dusík pupen

30

672

20 168 10

0 0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

69

500

600

700

Graf č. 38 - Závislost koncentrace transzeatinu na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu 2,5

Snížený dusík nadzemní část rostliny

0

Kontrolní varianta nadzemní část rostliny

Koncentrace t-Z [ng/g]

2,0

Zvýšenmý dusík nadzemní část rostliny Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

1,5

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu 456

1,0

672 48

168

0,5 1008

0,0 0

200

400

600

800

1000

Čas t [hod]

0,8

Graf č. 39 - Závislost koncentrace transzeatinu na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

672

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Snížený dusík list

Koncentrace t-Z [ng/g]

0,6

Kontrolní varianta list Zvýšený dusík list

0,4

48 168 0

0,2

0,0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

70

500

600

700

Graf č. 40 - Závislost koncentrace transzeatinu na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

0,8

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu

672

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stolon

Koncentrace t-Z [ng/g]

0,6

Kontrolní varianta stolon Zvýšený dusík stolon 0,4 168

0

48

0,2

0,0 0

100

200

300

400

500

600

700

Čas t [hod]

Graf č. 41 - Závislost koncentrace transzeatinu na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu

3,0

672 48 2,5

2,0

Koncentrace t-Z [ng/g]

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Snížený dusík pupen

168

1,5

Kontrolní varianta pupen Zvýšený dusík pupen

1,0

0,5 0

0,0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

71

500

600

700

0,8

Graf č. 42 - Závislost koncentrace transzeatinu ribosidu na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu 0

Snížený dusík nadzemní část rostliny Kontrolní varianta nadzemní část rostliny

Koncentrace t-ZR [ng/g]

0,6

Zvýšený dusík nadzemní část rostliny Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu 48

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu 672

0,4

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

0,2 1008

168

456

0,0 0

200

400

600

800

1000

Čas t [hod]

0,6

Graf č. 43 - Závislost koncentrace transzeatinu ribosidu na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu 48

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu

0

Koncentrace t-ZR [ng/g]

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu 0,4

672

Snížený dusík list Kontrolní varianta list Zvýšený dusík list

0,2

168

0,0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

72

500

600

700

Graf č. 44 - Závislost koncentrace transzeatinu ribosidu na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

672

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu

0,6

Koncentrace t-ZR [ng/g]

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu 0

Snížený dusík stolon 48

0,4

Kontrolní varianta stolon Zvýšený dusík stolon

0,2

168

0,0 0

100

200

300

400

500

600

700

Čas t [hod]

Graf č. 45 - Závislost koncentrace transzeatinu ribosidu na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu 672

Snížený dusík stonek původního jednonodálního segmentu

2,0

Kontrolní varianta stonek původního jednonodálního segmentu

Koncentrace t-ZR [ng/g]

Zvýšený dusík stonek původního jednonodálního segmentu 1,5

Snížený dusík pupen Kontrolní varianta pupen

48 1,0

0,5

Zvýšený dusík pupen

0

168

0,0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

73

500

600

700

Graf č. 46 - Kalibrační křivka závislosti koncentrace dusíku na elektrickém potenciálu membrány, indukční médium

Molární koncentrace c [mmol.l-1]

30

20

10

Kalibrační křivka Koncentrace kalibračních vzorků

0 144

164

184

204

224

244

264

Elektrický potenciál membrány E [mV]

5.5. Kontrola složení média při zahájení a po skončení pokusů Složení média bylo kontrolováno ověřením koncentrace anorganického dusíku a benzyladeninu při zahájení a po ukončení pokusů. Vzhledem k neustálému prorůstání kořenů do částí indukčního média s původní koncentrací jednotlivých složek nevyhodnocuji úbytky v koncentracích, jako kritické viz tabulka č.39 - Stanovení koncentrace anorganických dusíkatých částic, pro kontrolu vývoje změn média v závislosti na čase, tabulka č.38 - Výpočet parametrů kalibrační křivky k určení molární koncentrace dusíkatých částic média (závislost molární koncentrace dusíkatých částic na elektrickém potenciálu elektrody), graf č.46 – Kalibrační křivka závislosti koncentrace dusíku na elektrickém potenciálu membrány, indukční médium a tabulka

č.37 - Kontrola koncentrace benzyladeninu v médiu. Nic nenasvědčuje tomu, že by úbytky v koncentracích měly zásadní vliv na průběh pokusů.

5.6. Zpracování výsledků pokusu se stanovením obsahu dusičnatých iontů NO3- v čerstvé hmotě rostliny spektrofotometricky

74

Zpracování výsledků pokusu se stanovením obsahu dusičnatých iontů NO3- v

čerstvé hmotě rostliny je v tabulkách č. 40 až 55 a v grafech č. 47 až 52. Zásadním faktorem, který má vliv na vývoj koncentrací nitrátového dusíku v rostlinách bramboru v průběhu času je počáteční pasážování, díky němuž je rostlina na počátku kultivace v indukčním médiu bez kořenů, což se projeví jak na koncentraci dusíku, tak na koncentraci cytokininů v rostlinné hmotě. Zde zřejmě dojde v okamžiku postřehnutém měřením nebo i v okamžiku, který postřehnut nebyl, k poklesu obsahu nitrátových iontů v rostlině, a to z toho důvodu, že díky odstraněné kořenové soustavě má rostlina jen omezené možností příjmu nitrátových iontů. Po vytvoření kořenů dojde k postupnému zvyšování obsahu nitrátového dusíku v rostlině jeho zvýšeným příjmem až do té míry, že rostlina je indukována k jeho odbourávání, naspořený dusík začne využívat pro syntézu různých dusíkatých látek a utilizace dusíku převažuje nad jeho příjmem. Odstranění kořenů zde tedy zavádí periodicitu ve vývoji obsahu nitrátového dusíku, která se však v průběhu času snižuje, změny se postupně stávají pomalejšími a méně výraznými, přičemž se zde projevuje častá časová shoda maximálních a minimálních koncentrací dusíku a cytokininů. Koncentrace nitrátových iontů je regulována především nitrátreduktázou, jež je ovlivňována několika faktory, z nichž snad nejvýznamnější jsou koncentrace nitrátových iontů a koncentrace cytokininů v rostlině. Se zvyšující se koncentrací nitrátových iontů se zvyšuje aktivita nitrátreduktázy, uplatňují se zde tedy autoregulační mechanismy, díky kterým rostlina utilizuje nadměrný obsah nitrátových iontů, který následně poklesne a rostlina dá přednost hromadění dusíku před jeho využíváním a tím je udržována správná funkčnost metabolismu u rostlin bramboru. Odbourávání nitrátových iontů je navíc ovlivňováno koncentrací cytokininů v rostlině, kdy cytokininy aktivitu nitrátreduktázy podporují. Dochází však i k opačnému ovlivnění, koncentrace dusíku v rostlině bramboru má vliv na koncentraci cytokininů, a to pomocí zvýšení produkce IPT, která je prekurzorem cytokininů. Díky tomu dojde i ke zvýšení syntézy samotných cytokininů.

Vývoj koncentrací dusíku v časovém intervalu 0 až 48 hodin

75

V intervalu 0 až 48 hodin koncentrace dusíku v nadzemní části rostliny u kontrolní varianty klesá, kdežto u varianty zvýšený dusík a varianty snížený dusík roste, přičemž zde ale existuje reálná možnost, že i u těchto dvou variant došlo k poklesu koncentrací dusíku v nezachyceném okamžiku mezi 0 až 48 hodinou trvání pokusu (viz graf č. 48). Celkově ale u těchto dvou variant v tomto časovém intervalu převažuje příjem nad spotřebou. U varianty zvýšený dusík u části stonku původního jednonodálního segmentu došlo k nárůstu koncentrací a u pupenu a listu k poklesu, byla zde již zřejmě nastartována biosyntéza organických dusíkatých látek a činnost nitrátreduktázy, která tento pokles způsobila (grafy č. 49 a 50). Dále tento pokles mohl být způsoben translokací nitrátových iontů do stonku u varianty zvýšený dusík s cílem nastartovat tam činnost nitrátreduktázy a tvorbu organických dusíkatých látek kvůli nutnosti obnovit chybějící kořenovou soustavu. U varianty snížený dusík a kontrola u

části stonku původního jednonodálního segmentu došlo k poklesu koncentrací, z čehož usuzuji, že u těchto dvou variant není nitrátový dusík v časovém intervalu 0 až 48 hodin transportován (viz graf č. 48). U pupenu dochází u variant snížený dusík a kontrola v časovém intervalu 0 až 48 hodin k poklesu koncentrace nitrátových iontů, dusík je zde metabolizován nitrátreduktázou (viz grafy č. 49 a 50). Tento předpoklad je v souladu s vývojem koncentrací obsahů cytokininů, které v pupenu v časovém intervalu 0 až 48 hodin většinou stoupají (viz graf č. 7). V listu u variant snížený dusík a kontrola v časovém intervalu 0 až 48 hodin dochází k nárůstu koncentrace nitrátových iontů, rostlina zde zřejmě má k dispozici nitrátových iontů méně a pozná to, tak se snaží zajistit si nějakou větší zásobu z média, než se pustí do syntézy.

Vývoj koncentrací dusíku v časovém intervalu 48 až 168 hodin

V intervalu 48 až 168 hodin koncentrace dusíku v nadzemní části rostliny u kontrolní varianty roste, kdežto u varianty zvýšený dusík a varianty snížený dusík klesá. (viz graf č. 48). U varianty zvýšený dusík u části stonku původního jednonodálního segmentu došlo k poklesu koncentrací, u pupenu k dalšímu poklesu a u listu k nárůstu, v listu převažuje příjem dusíku nad biosyntézou dusíkatých látek, kdežto u pupenu je tomu opačně. U varianty snížený dusík u části stonku původního jednonodálního segmentu došlo k nárůstu koncentrací nitrátového dusíku a u kontrolní varianty rovněž. Z toho usuzuji, že u těchto dvou variant je nitrátový dusík v časovém intervalu 48 až 168 hodin transportován (viz graf č. 48). U pupenu dochází u variant snížený dusík a 76

kontrola v časovém intervalu 48 až 168 hodin k poklesu koncentrace nitrátových iontů, dusík je zde stále více metabolizován nitrátreduktázou než přijímán (viz grafy č. 49 a 50). V listu u variant snížený dusík a kontrola v časovém intervalu 48 až 168 hodin dochází k poklesu koncentrace nitrátových iontů, rostlina zde zřejmě více syntetizuje organické dusíkaté látky, než přijímá nitrátové ionty. Nitrát zde již není schopen podporovat tvorbu cytokininů, proto v listu v časovém intervalu 48 až 168 h jejich obsah klesá (viz graf

č. 7).

Vývoj koncentrací dusíku v časovém intervalu 168 až 456 hodin

V intervalu 168 až 456 hodin koncentrace dusíku v nadzemní části rostliny u kontrolní varianty a sníženého dusíku klesá, kdežto u varianty zvýšený dusík se příliš nemění (viz graf č. 48). U varianty zvýšený dusík i snížený dusík došlo k poklesu koncentrací v původní části jednonodálního segmentu, dusík zde byl odtransportován do pupenu a listu a u varianty kontrola nedošlo k žádnému velkému vývoji koncentrace, ta

40

Graf č. 47 - Kalibrační křivka závislosti koncentrace dusíku na absorbanci světelného záření, zelená hmota

Molární koncentrace c [mmol.l-1]

35

30

25

20

15

Kalibrační přímka

10

Koncentrace kalibračních vzorků

5

0 0,0

0,5

1,0

1,5

Absorbance světelného záření [-]

77

2,0

Graf č. 48 - Závislost koncentrace dusíku na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík nadzemní část rostliny Kontrolní varianta nadzemní část rostliny

Koncentrace anorganického dusíku [mg/g]

48

Zvýšený dusík nadzemní část rostliny

6

Snížený dusík část stonku původně jednonodálního segmentu Kontrolní varianta část stonku původně jednonodálního segmentu

168

Zvýšený dusík část stonku původně jednonodálního segmentu 1008

4 672

0

2 456

0 0

200

400

600

800

1000

Čas od zahájení pokusu t [hod]

Graf č. 49 - Závislost koncentrace dusíku na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu 48

12

Snížený dusík část stonku původního jednonodálního segmentu 672

Koncentrace anorganického dusíku [mg/g]

Kontrolní varianta část stonku původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík část stonku původního jednonodálního segmentu 9

Snížený dusík list Kontrolní varianta list Zvýšený dusík list

6

3 0

168

0 0

200

400

Čas od zahájení pokusu t [hod]

78

600

Graf č. 50 - Závislost koncentrace dusíku na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík část stonku původního jednonodálního segmentu

0

Koncentrace anorganického dusíku [mg/g]

12

Kontrolní varianta část stonku původního jednonodálního segmentu Zvýšený dusík část stonku původního jednonodálního segmentu

48

672

Snížený dusík pupen 8

Kontrolní varianta pupen Zvýšený dusík pupen 168 4

0 0

200

400

600

Čas od zahájení pokusu t [hod]

Graf č. 51 - Závislost koncentrace dusíku na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík část stonku původního jednonodálního segmentu 168

Koncentrace anorganického dusíku [mg/g]

Kontrolní varianta část stonku původního jednonodálního segmentu 12

Zvýšený dusík část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stolon Kontrolní varianta stolon Zvýšený dusík stolon

8 48

672

4

0

0 0

200

400

Čas od zahájení pokusu t [hod]

79

600

800

Koncentrace anorganického dusíku [mg/g] koncentrace metatopolinu [ng/g]

Graf č. 52 - Porovnání vývoje koncentrací metatopolinu a nitrátových iontu v nadzemní části rostliny

6 48

168

456

4

Koncentrace nitátových iontů u varianty se sníženým dusíkem pro celou nadzemní části rostliny Koncentrace nitrátových iontů u kontrolní varianty pro celou nadzemní část rostliny Koncentrace nitrátových iontů u varianty se zvýšeným dusíkem pro celou nadzemní část rostliny Koncentrace metatopolinu u varianty se sníženým dusíkem pro celou nadzemní část rostliny Koncentrace metatopolinu u kontrolní varianty pro celou nadzemní část rostliny Koncentrace metatopolinu u varianty se zvýšeným dusíkem pro celou nadzemní část rostliny 672

0

1008

2

0 0

200

400

600

800

1000

Čas od zahájení pokusu t [hod]

se mezi 168 až 456 hodinou příliš neměnila (viz graf č. 48). V pupenu a listu došlo k nárůstu koncentrací, dusík zde narostl na úkor obsahu dusíku ve stonku. U těchto orgánů došlo k převaze obsahu dusíku nad syntézou organických dusíkatých látek a činností nitrátreduktázy (grafy č. 49 a 50). Tato situace je v případě listu v souladu s vývojem koncentrací obsahů cytokininů, které u tohoto orgánu v časovém intervalu 0 až 48 hodin stoupají (viz graf č. 7). Dusík zde způsobuje zvýšení produkce cytokininů.

Vývoj koncentrací dusíku v časovém intervalu 456 až 672 hodin

V intervalu 456 až 672 hodin koncentrace dusíku v nadzemní části rostliny u kontrolní varianty a sníženého dusíku roste, kdežto u varianty zvýšený dusík klesá (viz graf č. 48). U varianty zvýšený dusík i snížený dusík došlo k poklesu koncentrací v původní části jednonodálního segmentu, dusík zde byl odtransportován do pupenu a listu a u varianty kontrola nedošlo k žádnému velkému vývoji koncentrace, ta se mezi 168 až 456 hodinou příliš neměnila (viz graf č. 48). V pupenu a listu došlo k nárůstu koncentrací, dusík zde narostl na úkor obsahu dusíku ve stonku. U těchto orgánů došlo k převaze obsahu dusíku nad syntézou organických dusíkatých látek a činností nitrátreduktázy (grafy č. 49 a 50). Tato situace je v případě listu v souladu s vývojem

80

koncentrací obsahů cytokininů, které u tohoto orgánu v časovém intervalu 0 až 48 hodin stoupají (viz graf č. 7). Dusík zde způsobuje zvýšení produkce cytokininů.

Vývoj koncentrací dusíku v časovém intervalu 672 až 1008 hodin

V intervalu 672 až 1008 hodin koncentrace dusíku v nově vyrostlém prýtu u kontrolní varianty a sníženého dusíku klesá, kdežto u varianty zvýšený dusík roste. Pro celkové vyhodnocení vývoje dusíku v rostlině zde však již chybějí údaje u důležitých orgánů, které nebyly měřeny.

5.7. Zpracování výsledků pokusu se stanovením vývoje koncentrace ACC u rostlin v lilku bramboru v závislosti na autoregulačních mechanismech Výsledky pokusu se stanovením vývoje koncentrace ACC jsou zpracovány v tabulkách č.56 až 60 a v grafech č.54 až 57. Tvorba ACC a potažmo etylénu v rostlině je ovlivňována především autoregulačními mechanismy a koncentrací auxinu. U rostlin se střídaly poklesy a nárůsty koncentrací ACC v souvislosti s potřebou rostlinu připravit na tuberizaci, protože etylén v nízkých koncentracích tuberizační proces podporuje, ve vysokých naopak inhibuje. V prvním časovém intervalu těsně po zahájení pokusu se navíc může projevovat stres z přepasážování, absence kořenů a úpravy nadzemní části na jednonodální segment.

Vývoj koncentrací ACC v časovém intervalu 0 až 48 hodin

V časovém intervalu 0 až 48 hodin dochází v nadzemní části rostliny u kontrolní varianty a varianty zvýšený dusík k nárůstu koncentrací ACC. U varianty snížený dusík dochází k poklesu. U části stonku původního jednonodálního segmentu dochází u všech variant k poklesu koncentrací ACC, z čehož plyne, že ACC není v tomto časovém intervalu nikam transportována (viz graf č. 54). V pupenu dochází u kontrolní varianty v časovém intervalu 0 až 48 hodin k nárůstu koncentrací ACC, což způsobuje nárůst koncentrací v celé rostlině, jelikož u listu byl u této varianty zaznamenán pokles (viz grafy č. 55 a 56). K podobné situaci došlo i u varianty zvýšený dusík, zde však 81

k nárůstu koncentrací v pupenu nedošlo. U varianty snížený dusík došlo pouze k mírnému zvýšení koncentrace ACC v pupenu (docházelo zde k slabé syntéze), jinak ACC z rostliny ubývala, nebyla ještě v tomto období u této varianty příliš syntetizována (viz grafy č. 54, 55, 56).

Vývoj koncentrací ACC v časovém intervalu 48 až 168 hodin

V časovém intervalu 48 až 168 hodin dochází v nadzemní části rostliny u kontrolní varianty a varianty zvýšený dusík k poklesu koncentrací ACC, což bylo způsobeno překonáním šoku z pasážování a snahou dosáhnout běžnou koncentraci ACC a tvorbu etylénu typickou pro rostlinu bramboru. U varianty snížený dusík dochází k nárůstu koncentrace, projevuje se zde zřejmě zpoždění stresové reakce, kterou mohl způsobit nadbytek dusíku. U části stonku původního jednonodálního segmentu dochází u všech variant k nárůstu koncentrací ACC, z čehož plyne, že ACC je tam translokován, aby příliš nebrzdil přípravu na tuberizační proces v pupenech a listech a aby byla omezena zřejmě nadměrná produkce etylénu, který v listech a pupenech vzniká; stonek může také fungovat jako zásobárna ACC (viz graf č. 54). V pupenu dochází u kontrolní varianty v časovém intervalu 48 až 168 hodin k poklesu koncentrací ACC. V listech se koncentrace u této varianty pouze minimálně vyvíjí, setrvává na nízkých hodnotách, což způsobuje nízkou produkci etylénu (viz grafy č. 55 a 56). U varianty snížený dusík došlo v časovém intervalu 48 až 168 hodin k minimálnímu vývoji koncentrací ACC u pupenu a listu, tvorba etylénu je u této varianty stále nízká. U varianty zvýšený dusík došlo ke zvýšení koncentrace ACC v pupenu a v listu (docházelo zde k intenzivní syntéze), viz grafy č. 54, 55, 56.

Vývoj koncentrací ACC v časovém intervalu 168 až 456 hodin

V časovém intervalu 168 až 456 hodin dochází v nadzemní části rostliny u kontrolní varianty a varianty zvýšený dusík k nárůstu koncentrací ACC. U varianty snížený dusík dochází pouze k minimálnímu vývoji koncentrace ACC. U části stonku původního jednonodálního segmentu dochází u variant zvýšený dusík a snížený dusík k nárůstu koncentrací ACC, z čehož vyplývá, že ACC je tam i nadále translokován, aby příliš nebrzdil přípravu na tuberizační proces v pupenech a listech a aby byla omezena zřejmě nadměrná produkce etylénu, který v listech a pupenech vzniká. (viz graf č. 54). 82

U kontrolní varianty dochází ke snižování koncentrace ACC ve stonku, je transportován do pupenu, kde je využíván pro syntézu etylénu (viz grafy č. 54, 56). V pupenu dochází u kontrolní varianty v časovém intervalu 168 až 456 hodin tedy k nárůstu koncentrací ACC, v listech se koncentrace u této varianty pozvolna zvyšuje (viz grafy č. 55 a 56). U varianty snížený dusík došlo v časovém intervalu 168 až 456 hodin k nárůstu koncentrací ACC v listu a poklesu v pupenu. U varianty zvýšený dusík došlo ke snížení koncentrace ACC v pupenu a v listu (viz grafy č. 54, 55, 56). Ve stolonu se koncentrace ACC zvyšují u variant snížený dusík a kontrola, u těchto pokusných variant ve stolonu dochází k syntéze etylénu, kdežto u varianty zvýšený dusík dochází k poklesu koncentrace ACC a etylén se netvoří.

Vývoj koncentrací ACC v časovém intervalu 456 až 672 hodin

V časovém intervalu 456 až 672 hodin dochází v novém prýtu u všech variant k poklesu koncentrací ACC. U části stonku původního jednonodálního segmentu dochází u variant zvýšený dusík a snížený dusík k nárůstu koncentrací ACC. U kontrolní varianty dochází ke snižování koncentrace ACC ve stonku, je transportována do pupenu (viz grafy č. 54, 56). V pupenu dochází u kontrolní varianty v časovém intervalu 456 až 672 hodin tedy stále k nárůstu koncentrací ACC (je zde zřejmě syntetizován etylén), v listech se koncentrace u této varianty pozvolna zvyšuje, což má zřejmě souvislost se zvyšováním tvorby etylénu i v tomto orgánu, i do listu je ACC zřejmě translokována ze stonku (viz grafy č. 55 a 56). U varianty snížený dusík došlo v časovém intervalu 456 až 672 hodin k nárůstu koncentrací ACC v listu a poklesu v pupenu. U varianty zvýšený dusík došlo ke snížení koncentrace ACC v pupenu a v listu, (viz grafy č. 54, 55, 56).

Vývoj koncentrací ACC v časovém intervalu 672 až 1008 hodin

V časovém intervalu 672 až 1008 h dochází u všech variant k mírnému nebo výraznějšímu poklesu koncentrací v nadzemní části rostliny, avšak chybějí nám údaje pro ostatní orgány, takže tento interval nemůžeme vyhodnotit.

83

Graf č. 54 - Závislost koncentrace ACC na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu

0,08

Snížený dusík nadzemní část rostliny

0,07

Kontrolní varianta nadzem ní část rostliny

168

Koncentrace ACC [nmol g-1 ]

0,06

Zvýšený dusík nadzemní část rostliny

0

Snížený dusík část stonku původního jednonodálního segmentu

0,05 Kontrolní varianta část stonku původního jednonodálního segm entu

456 48

0,04

Zvýšený dusík část stonku původního jednonodálního segmentu

672

0,03

1008

0,02

0,01

0,00 0

200

400

600

800

1000

1200

Čas t [hod]

Graf č. 55 - Závislost koncentrace ACC na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík list

0

Kontrolní varianta list 0,30

Koncentrace ACC [nmol g-1 ]

Zvýšený dusík list Snížený dusík část stonku původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta část stonku původního jednonodálního segmentu

0,20

Zvýšený dusík část stonku původního jednonodálního segmentu

168

672

0,10

48

0,00 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

84

500

600

Graf č. 56 - Závislost koncentrace ACC na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík část stonku původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta část stonku původního jednonodálního segmentu

0,30

Koncentrace ACC [nmol g-1 ]

672

Zvýšený dusík část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík pupen

48

Kontrolní varianta pupen 0,20

Zvýšený dusík pupen

168 0,10

0

0,00 0

100

200

300

400

500

600

Čas t [hod]

Graf č. 57 - Závislost koncentrace ACC na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík část stonku původního jednonodálního segmentu Kontrolní varianta část stonku původního jednonodálního segmentu 0,10

Koncentrace ACC [nmol g-1 ]

Zvýšený dusík část stonku původního jednonodálního segmentu Snížený dusík stolon

672

Kontrolní varianta stolon Zvýšený dusík stolon

0,05 0

48

168

0,00 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

85

500

600

5.8. Zpracování výsledků pokusu se stanovením vlivu úrovně dusíkaté výživy na vývoj obsahu kyseliny abscisové Výsledky pokusu se stanovením vlivu úrovně dusíkaté výživy na vývoj obsahu kyseliny abscisové jsou zpracovány v tabulkách č. 61 až 67 a v grafech č. 58 až 62.

Řada autorů předpokládá snižování obsahu ABA při zvyšování koncentrací nitrátových iontů, já jsem však pozoroval opak. Oproti těmto autorům se mé pokusy odlišuji vyšší koncentrací nitrátového dusíku v médiu.

Vývoj obsahu kyseliny abscisové v časovém intervalu 0 až 48 hodin

V časovém intervalu 0 až 48 hodin obsah kyseliny abscisové v nadzemní části rostliny u všech variant klesá (viz graf č. 58). Ve stonku se u varianty zvýšený dusík a snížený dusík koncentrace ABA zvyšuje, to je způsobeno podlimitní koncentrací dusíku u varianty snížený dusík a nadlimitní koncentrací u varianty zvýšený dusík (u varianty zvýšený dusík v tomto období koncentrace nitrátů roste, u varianty snížený dusík klesá, což v obou případech způsobuje stres a tvorbu ABA). U kontrolní varianty se i ve stonku snižuje koncentrace ABA. Koncentrace dusíku se u této varianty ve stonku rovněž snižuje, protože rostlina reaguje na vyhovující dávku dusíku a proto jej tolik neakumuluje na vyvolání či podpoření růstu, je v nízkém stresu a proto koncentrace kyseliny abscisové klesá (viz graf č. 60). V pupenu a v listu se u všech variant zvyšuje koncentrace ABA.

Vývoj obsahu kyseliny abscisové v časovém intervalu 48 až 168 hodin

V časovém intervalu 48 až 168 hodin obsah kyseliny abscisové v novém prýtu rostliny u všech variant roste (viz graf č. 58). Ve stonku původního jednonodálního segmentu se u varianty zvýšený dusík a snížený dusík koncentrace ABA snižuje. U kontrolní varianty se koncentrace ABA ve stonku zvyšuje (viz graf č. 60). V listu se u všech variant zvyšuje koncentrace ABA, kdežto v pupenu se u kontrolní varianty a varianty snížený dusík koncentrace ABA snižuje a u varianty zvýšený dusík zvyšuje. Rostlina v tomto časovém intervalu a vývojové fázi preferuje tvorbu ABA v listu oproti pupenu, a to s výjimkou varianty zvýšený dusík, kde se ABA tvoří i v pupenu (viz grafy

č. 50, 59, 62).

86

Vývoj obsahu kyseliny abscisové v časovém intervalu 168 až 456 hodin

V časovém intervalu 168 až 456 hodin obsah kyseliny abscisové v nadzemní

části rostliny u varianty snížený dusík roste, pokračuje zde trend z předchozího časového intervalu. U varianty zvýšený dusík a kontrola se koncentrace ABA v tomto časovém intervalu snižuje. U varianty zvýšený dusík se nemění ani koncentrace nitrátových iontů v nadzemní části rostliny, rostlina se přizpůsobila úrovni stresu a došlo k poklesu koncentrace ABA. U varianty kontrola došlo k poklesu koncentrace nitrátových iontů, proto se snížila úroveň stresu, kterou předtím vyvolal nadbytek nitrátových iontů, a ABA poklesla. U varianty snížený dusík koncentrace nitrátových iontů v rostlině rovněž poklesla, ale tak, že to vyvolalo stres a tvorbu ABA (viz grafy č. 48, 58). Ve stonku původního jednonodálního segmentu se u všech variant koncentrace ABA zvyšuje (viz grafy č. 59 a 60). V listu se u všech variant zvyšuje koncentrace ABA, kdežto v pupenu se u kontrolní varianty a varianty zvýšený dusík koncentrace ABA zvyšuje a u varianty snížený dusík snižuje. Rostlina v tomto časovém intervalu a vývojové fázi intenzivně tvoří ABA jak v pupenu, tak v listu. Ve stolonu se u všech variant koncentrace ABA zvyšuje (viz grafy č. 59, 61, 62). Toto zvýšení nastává až v tomto časovém intervalu, kdy podle kap. 5.2 (vyhodnocení výsledků morfologického pokusu, přímého pozorování a ohodnocení počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou mikrohlízkou) dochází postupně k zakončení doby fyziologické přípravy na tvorbu hlízek u všech variant obsahu anorganického dusíku v indukčním médiu, po jejímž zakončení existuje možnost vytvoření první hlízky.

Vývoj obsahu kyseliny abscisové v časovém intervalu 456 až 672 hodin

V časovém intervalu 456 až 672 hodin obsah kyseliny abscisové v novém prýtu u variant kontrola a zvýšený dusík roste. U varianty snížený dusík dochází v novém prýtu k poklesu koncentrace ABA (viz grafy č. 58, 48). V pupenu a v listu obou ostatních variant (tj. variant kontrola a zvýšený dusík) dochází jak v listech, tak v pupenech k nárůstu koncentrace ABA, což způsobuje nárůst koncentrace tohoto fytohormonu v celém novém prýtu (viz grafy č. 59, 62). Ve stonku koncentrace ABA rovněž stoupá. V pupenech i listech koncentrace nitrátových iontů u všech variant 87

stoupá, což způsobuje odpovídající stoupání koncentrace ABA, protože prudký nárůst dusíku způsobuje stres. Pouze u varianty snížený dusík koncentrace ABA v pupenu klesá (viz grafy č. 49, 50, 59, 62).

Vývoj obsahu kyseliny abscisové v časovém intervalu 672 až 1008 hodin

V časovém intervalu 672 až 1008 hodin koncentrace ABA u nadzemní části rostliny v případě variant kontrola a snížený dusík klesala a v případě varianty zvýšený dusík rostla, avšak vyhodnocení závislostí koncentrace ABA zde již není možné, protože již chybějí údaje pro důležité orgány rostliny, které jsem pro velkou spotřebu biologického materiálu nemohl naměřit.

Graf č.58 - Koncentrace ABA v jednonodálním segementu

250

234,9 Snížený dusík

208,9 Kontrolní varianta

200

184,4 Zvýšený dusík

Koncentrace ABA [ng.g

-1 ]

164,1 150 119,8

123,9

93,5

99,8

127,2 100

75,7

78,2

82,4 84,5

72,9 50

65,1

62,2

54,5

64,8 32,8 0 0

100

200

300

400

500

Čas t [hod]

88

600

700

800

900

1000

Graf č.59 - Koncentrace ABA v listu 350 309,4 300 303,4

Koncentrace ABA [ng.g -1]

249,3 250

230,1

200 100,4 91,2 88,4

150

146,7

147,4

135,5 127,6

100

Kontrolní varianta

137,9

Snížený dusík 69,0

50

Zvýšený dusík 0 0

100

200

300

400

500

600

Čas t [hod]

250

Graf č.60 - Koncentrace ABA ve stonku

Kontrolní varianta 200

Snížený dusík

Koncentrace ABA [ng.g -1]

Zvýšený dusík

150,9

150 132,4

100

113,0 74,3

64,4 59,8

62,4 57,3

49,5

50 56,7 47,8

29,0 5,5

0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

89

500

600

Graf č.61 - Koncentrace ABA ve stolonu, hlízce a kalusu 400

Stolon kontrolní varianta Stolon snížený dusík

350

323,2

Stolon zvýšený dusík

Koncentrace ABA [ng.g -1]

300

Hlízka kontrolní varianta 267,9

Hlízka snížený dusík 250

Hlízka zvýšený dusík Kalus kontrolní varianta

200

188,7

Kalus snížený dusík 174,4 113,3

Kalus zvýšený dusík

150

112,3 94,5

100

97,0 60,7

91,2

50

47,7

17,0

0 0

100

200

300

400

500

600

Čas [t]

Graf č.62 - Koncentrace ABA v pupenu 500

Snížený dusík

Koncentrace ABA [ng.g-1]

400

376,8

Kontrolní varianta Zvýšený dusík

300 310,1 119,6 73,5

200

67,8

60,9

109,4

38,8

101,4

58,0

83,1

34,3

100

53,4

0 0

100

200

300

400

Čas t [hod]

90

500

600

6. DISKUSE Hormonální regulace tvorby hlíz je spojena s vlivem vnějších faktoru a s alokací živin a minerálních látek. Indukce torby hlíz je regulována fotoperiodicky (WHEELER et TIBBITTS 1997, MACHÁČKOVÁ et al. 1998) především zvýšeným poměrem ABA/GA za krátkodenních podmínek. Kontrola indukce tuberizace je mnohočetná. JACKSON (1999) uvádí, ze vyjma role GA v inhibici tuberizace, je mnohokráte ověřen fakt, že vysoké dávky dusíku ve výživě a vysoké teploty inhibuji tuberizaci a to zvláště za podmínek dlouhého dne. Role kyseliny abscisové v indukci tvorby hlíz není jasná, neboť někteří autoři popisují její stimulační vliv (ABDULLAH et AHMAD 1980, MENZEL 1980) a někteří inhibiční (HUSSEY et STACEY 1984), i když pod vlivem indukčních podmínek je popsáno zvýšení endogenní ABA (KRAUSS et MARSCHNER 1982). Zdá se, že ABA vystupuje jako antagonista giberelinu. Role etylénu rovněž není jednoznačná. SUTTLE (1998) uvádí, že při indukci tuberizace in vitro explantáty produkuji etylén ve zvýšeném množství pouze první dva týdny, po té se produkce etylenu snižovala, z výsledku však bylo patrné, že role etylénu je spíše ve schopnosti navození a udržení dormantního stavu hlízek. Obdobná role je popsána i pro ABA (SUTTLE et HULSTRAND 1994, SUTTLE 1995). Jako morfogenní faktor tvorby hlíz byla pomoci in vitro kultur prokázána i sacharóza v interakci s hladinou giberelinu, jehož množství od počátku tuberizace snižuje (XU et al. 1998). Navíc sacharóza vystupuje jako hlavní karbohydrát jednak pro syntézu škrobu v rostoucí hlíze (FERNIE et WILLMITZER 2001) a jednak pro účast symplastického transportu asimilátu jak bylo prokázáno pomoci značených sloučenin a karboxyfluoresceinu v subapikální častí stolonu indukovaného ke tvorbě a růstu hlízy (VIOLA et al. 2001). Experimenty mé práce se podařilo odhalit některé závislosti týkající se tuberizace a vývoje hormonů a nitrátových iontů v rostlině bramboru. Bylo více než evidentní, že zásadní vliv, který se u in vitro kultivace rostlin bramboru uplatňuje, je počáteční odstranění kořenů a úprava nadzemní části rostliny na jednonodální segment při pasážování a následná opakovaná snaha o dosažení rovnováhy mezi nadzemní a podzemní částí rostliny, což se projevilo periodicitou a oscilací v koncentracích u všech sledovaných fytohormonů. Odstranění kořenové soustavy vedlo k částečnému znejasnění při vyhodnocování vlivu vytvoření indukčních podmínek. Metabolismus rostliny byl zřejmě silně ovlivněn interakcemi mezi auxiny a cytokininy, které jsou zásadní pro dosažení rovnováhy mezi nadzemní a podzemní částí.

91

Až do 456 hodiny kultivace jednonodálních segmentů byla největší koncentrace cytokininů u varianty snížený dusík, poté následovala kontrola a nejnižší koncentraci měl zvýšený dusík – to zřejmě souviselo s nastartováním intenzivnější tuberizace u varianty snížený dusík vyšší hladinou cytokininu. V pozdějších časových intervalech měla nejvyšší koncentrace cytokininů varianta kontrola. Minerální výživa dusíkem, respektive jeho nadbytkem, rovněž ovlivňuje nejen kvalitu sadbových hlíz, např. zvýšené dávky hnojení dusíkem nesou riziko mechanického poškození hlíz (BARITELLE et al. 2000), ale také jejich výnos, jak to uvádějí ATKINSON et al. (2003). Nezbytné je dělení dávky dusíku, avšak přihnojení vápníkem za takové situace redukovalo počet hlíz a zvyšovalo jejich hmotnost (OZGEN et PALTA 2004). Na fyziologické úrovni interakce dusíkatě výživy a hormonální homeostáze je však známo, že zvýšené množství či příjem nitrátů rostlinami vede ke zvýšení obsahu endogenních cytokininů a snížení obsahu ABA a tím k obecně zkrácení dormance, stimulaci klíčení

či zrychleni vegetativního růstu a obecně prodloužení vegetační doby rostlin (LIPS et al. 1970). RAHAYU et al. (2005) to svými výsledky potvrzují, neboť při zvýšené koncentraci nitrátů v xylémovém exudátu došlo ke zvýšení koncentrace fyziologicky aktivních cytokininů a současně stimulaci růstu listu. Naopak snížené množství nitrátů a zvýšení obsahu ABA za současného snížení obsahu cytokininu vede obecně v rostlinách k přechodu ke kvetení, indukci tvorby hlíz a zásobních orgánů, eventuelně k dormanci (CRAMER et al. 1995). Tatáž situace nastává při zvýšeném množství amidického dusíku (současně se snižuje obsah cytokininu a zvyšuje se obsah ABA), který je výsledkem redukce nitrátů. Myšlenku interakce hormonu a vlivu výživy v růstu rostlin podporuji i recentní poznatky o stimulaci AAO (ABA-aldehyd oxidázy) amoniakálními ionty s následným zvýšením obsahu ABA v rostlinách (OMAROV et al. 1999). Indukované a rostoucí hlízy představují nové významné sinky a proto hormonálněnutriční interakce vedou k přesměrování transportu fotosyntátů, ke změnám v relacích zdroj a sink a k supresi vegetativního růstu (EWING 1995).

Částečně jsem se věnoval i vztahům mezi jednotlivými fytohormony navzájem i vlivu dusíku na ně (tzv. crosstalk), viz kapitola 3.2, kde jsem je také popsal. Jedná se však pouze o předpokládaný a přibližný vývoj vzájemných vztahů těchto látek, který vycházel pouze z omezeného počtu určených koncentrací fytohormonů v časové oblasti. Doba fyziologické přípravy na tvorbu hlízek jakožto zpoždění v odezvě na vytvoření indukčních podmínek může představovat časový interval potřebný k dosažení nové fytohormonální rovnováhy (homeostázy), nutné pro vytvoření hlízek. 92

7. ZÁVĚR V diplomové práci byl studován vliv úrovně dusíkaté výživy na tuberizaci a na vývoj koncentrací fytohormonů v průběhu fyziologické přípravy na tuberizační proces, a během vlastní tuberizace s cílem odhalit vliv fytohormonů na indukci hlízek u rostliny lilku bramboru. Alespoň částečně byla zkoumána i interakce (crosstalk) mezi jednotlivými fytohormony pomocí biologické analýzy souvislostí na základě poznatků z literatury. Byla použita celá řada experimentálních metod: u cytokininů ELISA u kyseliny abscisové RIA u dusíku spektrofotometrie či iontově selektivní elektroda u ACC plynová chromatografie

U všech sledovaných fytohormonů došlo ke kmitavému průběhu vývoje koncentrací s časem. Vliv interakce mezi nadzemní částí rostliny a kořenovou soustavou za kultivačních podmínek in vitro znejasňuje působení faktoru obsah dusíku v indukčním médiu na vývoj koncentrací fytohormonů během fyziologické přípravy na tvorbu hlízek. Od zahájení pokusu cca do 168 hodiny má v novém prýtu většina cytokininů nejvyšší koncentrace u varianty se sníženým obsahem dusíku. Varianta se sníženým obsahem dusíku má díky této koncentraci cytokininů nejlepší počáteční podmínky pro rychlejší obnovu celistvosti rostliny a vyvolání stavu indukce hlízek, přihlédneme-li k výsledkům morfologického pokusu. Po 672 hodině trvání pokusu, tedy přibližně v době vzniku prvních hlízek, byla v novém prýtu u řady cytokininu nejnižší koncentrace u varianty se sníženým dusíkem (např. u metatopolinu, viz graf č. 6). Získané výsledky nasvědčují i tomu, že cytokininy ovlivňují koncentraci nitrátových iontů v rostlině, a to prostřednictvím nitrát reduktázy, jak je to uvedeno v rozličné literatuře). Rovněž koncentrace dusíku měla v nadzemní části rostliny kmitavý průběh. Střídaly se období jeho silné a slabší metabolizace při obnovování celistvosti rostliny, což bylo spojené s nárůstem nebo poklesem těchto koncentrací. Jeho vyšší koncentrace se často objevovaly v orgánech intenzivní biosyntézy, jako například v pupenech.

93

U rostlin docházelo k autoregulacím koncentrací ACC a etylénu tak, aby byly příznivé pro vývoj rostliny a tuberizaci. U kontrolní varianty se často projevovala nižší koncentrace ACC než u variant snížený dusík a zvýšený dusík, což bylo s velkou pravděpodobností způsobeno tím, že rostliny u této varianty nejsou stresovány ani zvýšenou, ani sníženou hladinou dusíku a hladina dusíku je u této varianty pro brambor optimální. Koncentrace ABA byla ovlivňována především stresem vyvolaným změnami koncentrací anorganického dusíku v rostlině. Z velkého počtu opakování morfologického pokusu se podařilo statisticky prokázat, že snížená koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu zvyšuje množství vytvořených hlízek, urychluje a zesiluje jejich tvorbu, kdežto zvýšená koncentrace dusíku tuberizaci inhibuje a množství hlízek snižuje, při tom ale působí příznivě na velikost hlízek. U varianty se sníženým dusíkem byla nejkratší doba fyziologické přípravy na tvorbu mikrohlízek a u varianty se zvýšeným dusíkem naopak nejdelší. Doba fyziologické přípravy na tvorbu hlízek vyjadřuje zpoždění (časovou setrvačnost) mezi okamžikem vytvoření indukčních podmínek a okamžikem, kdy indukce jako procentuální počet baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou stoupá od nulové hodnoty. Snížení obsahu anorganického dusíku v médiu tedy vedlo k intenzivnější tvorbě hlíz. Tato varianta měla největší počet baněk, u nichž došlo alespoň na jednom explantátu ke tvorbě hlízky, a okamžitá rychlost jejich tvorby byla u této varianty nejrychlejší. Také počet hlízek vztažený k celkovému počtu segmentů byl u této varianty největší. Tyto výsledky odpovídají výsledkům MINGO-CASTELA et al. (1976). Naopak zvýšení obsahu dusíku v indukčním médiu vedlo ke snížení tvorby hlíz. Tyto rozdíly jsou patrné na všech týdenních ohodnoceních a bylo statisticky ověřeno, že nic nenasvědčuje tomu, že by neplatila hypotéza, že snížené množství nitrátového dusíku v indukčním médiu vede k výraznější indukci tuberizace u lilku bramboru Solanum tuberosum L. Výsledky poukazují na možnost ovlivnění produkce sadbových brambor pomocí optimalizace hnojení, tento poznatek uvádí i ATKINSON et al. (2003).

8. POUŽITÉ ZKRATKY 2,4 –D – kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová

94

ABA – kyselina abscisová ACC – kyselina 1-aminocyklopropan-1-karboxylová ANOVA – analýza variance BA – benzyladenin C18 – osmnáctiuhlíkatý řetězec ELISA - enzyme-linked immunosorbent assai (enzymový imunosorbentní test) F-test – Fischerův test GA – kyselina giberelová GA 4/7 – giberelin 4/7 GC – gas chromatography (plynová chromatografie) HPLC – high pressure liquid chromatography IAA – kyselina indolyl-3-octová MAb – monoklonální protilátka MNČ – metoda nejmenších čtverců P – celulóza – fosfocelulóza pH – záporný dekadický logaritmus koncentrace noniových kationtů PHYB – fytochrom B RIA – radio-immuno assay (radioimunologický rozbor) TBS - tris-hydroxymethyl aminornethan buffer (tris-hydroxymethyl aminornethanový pufr) TFA - trifluoroctová kyselina

9. ODKAZY NA CITACE A SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

• ABDULAH, Z.N., AHMAD, R. (1980):

Effect of ABA and GA3 on

tuberization and some chemical constituent of potato. Plant Cell Physiol. 21: 1343-1346. • ABROL, Y.P., SAWHNEY, S.K., NAIK, M.S. (1983): Light and dark assimilation of nitrate in plants. Plant Cell Environ., 6: 595-599. • ADDICOTT, F.T., LYON, J.L., OHKUMA, K., THIESSEN, W. E., CARNS, H. R. (1968): Abscisic acid: a new name for abscisin II (dormin). Science 159: 1493.

95

• AGUADO-LARA, G., ETCHEVERS-BARRA, J.D., HIDALGO-MORENO, C., GALVIS-SPÍNOLA, A., AGUIRRE-GÓMEZ, A. (2002): Dynamic of potassium in agricultural soils. Agrocencia 36(1): 11-21. • AKITA, M., TAKAYAMA, S. (1994): Induction and development of potato tubers in a jar fermentor. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 36(2): 177–182. • AKSENOVA, N.P., KONSTANTINOVA, T.N., LOZHNIKOVA, V.N., GOLYANOVSKAYA, S. A., SERGEEVA, L.I. (2009): Interaction between day length and phytohormones in the control of potato tuberization in the in vitro culture. Russ. J. Plant Physiol. 56(4): 454–461. • AMADOR,

V.,

BOU,

J.,

MARTÍNEZ-GARCÍA,

J.,

MONTE,

E.,

RODRÍGUEZ-FALCON, M., RUSSO, E., PRAT, S. (2001): Regulation of potato tuberization by day length and gibberellins. Int. J. Dev. Biol. 45 (S1): S37-S38. • ANDĚL, J. (2000): Statistické metody. 2. Vyd., Matfyzpress Praha, 274 s. • ANJUM, M.A., VILLIERS, T.A. (1997): Induction of microtubers in vitro from stem segments of Solanum tuberosum L., S. commersonii Dun. and S. acaule Bitt.. Sci. Hort. 70: 231-235. • ÅSTOT, C., DOLEŽAL, K., NORDSTRÖM, A., WANG, Q., KUNKEL, T., MORITZ, T., CHUA, N. H., SANDBERG, G. (2000): An alternative cytokinin biosynthesis pathway. PNAS 97(26): 14778-14783. • ATKINSON, D., GEARY, B., STARK, J., LOVE, S., WINDERS, J. (2003): Potato varietal responses to nitrogen rate and timing. Western Nutrient Management Conference, Salt Lake City, Utah, USA, Vol. 5: 149-155. • BANGERTH, K. F. (1994): Response of cytokinin concentration in the xylem exudate of bean (Phaseolus vulgaris L.) plants to decapitation and auxin treatment, and relationship to apical dominance. Planta 194(3): 439-442. • BANGERTH, K.F. (2008): Nature and significance of correlative hormonal signals in growth and development of annual and perennial plants. Acta Hort.

774: 379-390. • BARITELLE, A.L., HYDE, G.M., THORNTON, R.E. (2000): Influence of early-season nitrogen application pattern on impact sensitivity in Russet Burbank potato tubers. Postharv. Biol. Technol. 19: 273-277. • BARTSCH, H.J.(1983): Matematické vzorce, vydání první, 830 s., Academia

96

• BATUTIS, E.J., EWING, E.E. (1982): Far-reversal of red light effect during long-night induction of potato (Solanum tuberosum L.) tuberization. Plant Physiol. 69: 672-674. • BENKOVÁ, E., MICHNIEWICZ, M., SAUER, M., TEICHMANN, T., SEIFERTOVÁ, D., JÜRGENS, G., FRIML, J. (2003): Local, efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation. Cell 115(5): 591-602. • BENNETT, S.M., TIBBITTS, T.W., CAO, W. (1991): Diurnal temperature fluctuation effects on potatoes grown with 12 hour photoperiods. Am. Potato J.

68: 81–86. • BIELESKI, R.L. (1964): The problem of halting enzyme activation when extracting plant tissue. Anal. Biochem. 9: 431 – 442. • BRADY, G.A., PRATT, A.J. (1955): The effect of different combinations of soil moisture and nitrogen levels on early plant development and tuber set of potato. Am. Potato J. 32: 254-258. • BRANDSTATTER, I., KIEBER, J. J. (1998): Two genes with similarity to bacterial response regulators are rapidly and specifically induced by cytokinin in Arabidopsis. Plant Cell 10: 1009-1020. • BROWN, P.H. (2008): The canon of potato science: 37. stolonization, tuber induction and tuberization. Potato Res. 50: 363–365. • BUSHNELL, J. (1956): Growth response from restricting the oxygen at roots of young potato plants. Am. Potato J. 33: 242-248. • CENZANO, A., VIGLIOCCO, A., KRAUS, T., ABDALA, G. (2003): Exogenously applied jasmonic acid induces changes in apical meristem morphology of potato stolons. Ann. Bot. 91: 915-919. • COLLIER,

M.D.,

FOTELLI,

M.N.,

NAHM,

M.,

KOPRIVA,

S.,

RENNENBERG, H., HANKE, D.E., GEßLER, A. (2003): Regulation of nitrogen uptake by Fagus sylvatica on whole plant level-interactions between cytokinins and soluble N compounds. Plant Cell Environ. 26: 1549-1560. • CRAMER, M.D., SCHIERHOLT, A., WANG, Z., LIPS, S. H. (1995): The influence of salinity on the utilization of root anaplerotic carbon and nitrogene metabolism in tomato seedlings. J. Exp. Bot. 46: 1569-1577.

97

• DODD, I.C. (2005): Root-to-shoot-signalling: assessing the roles of “up” in the up and down world of long-distance signalling in plant. p. 251-270. In: LAMBERS, H., COLMER, T.D. (eds.), Root physiology: from gene to function. Springer, Dordrecht. • DURRANT, M.J., LOVE, B.J.G., MESSEEN, A.B., DRAYCOT, A.P. (1973): Growth of crop roots in relation to soil moisture extraction. Ann. Appl. Biol. 74: 387-394. • ELDREDGE EP, SHOCK, C.C., STIEBER, T.D. (1992): Plot sprinklers for irrigation research. Agron. J. 84: 1981-1984. • ELIASSON, L. (1975): Effect of indoleacetic acid on the abscisic acid level in stem tissue. Physiol. Plant. 34: 117–120. • ERREBHI, M., ROSEN, C.J., GUPTA, S.C., BIRONG, D.E. (1998): Potato yield response and nitrate leaching as influenced by nitrogen management. Agron. J. 90: 10-15. • ESTELLE, M.A., SOMERVILLE, C. (1987):

Auxin-resistant mutants of

Arabidopsis thaliana with an altered morphology. Mol. Gen. Genet. 206 (2): 200-206. • EWING, E.E. (1981): Heat stress and the tuberization stimulus. Am. Potato J.

58: 31- 49. • EWING, E.E. (1985): Cuttings as simplified models of the potato plant. In: Li, P., ed. Potato physiol. Orlando, USA: Academic Press, 153-207. • EWING, E.E. (1995): The role of hormones in potato (Solanum tuberosum L.) tuberization. In: P. J. DAVIES (ed) Plant hormones and Their Role in Plant Growth and Development. Martinus Nijhoff, Dordrecht, The Netherlands, pp. 698-724. • EWING, E.E., STRUIK, P.C. (1992): Tuber formation in potato: Induction, initiation, and growth. Hortic. Rev. 14: 89–198. • FERNIE, A.R., WILLMITZER, L. (2001): Molecular and biochemical triggers of potato tuber development. Plant Physiol. 127: 1459-1464. • FETENE, M., BECK, E. (1993): Reversal of the direction of photosynthate allocation in Urtica dioica plants by increasing cytokinin import into the shoot. Botanica Acta 235-240.

98

• FIŠEROVÁ,

H.,

KULA,

E.,

KLEMŠ,

M.,

REINÖHL,

V.

(2001):

Phytohormones as indicators of the degree of damage in birch (Betula pendula L.). Biológia, 56: 405-409. • FREEMAN, K.L., FRANZ, P.R., DE JONG, R.W. (1998): Effect of phosphorus on the yield, quality, and petiolar phosphorus concentrations of potatoes (cv. Russet Burbank and Kennebec) grown in the krasnozem and duplex soils of Victoria. Austr. J. Exp. Agric. 38: 83–93. • FRIML, J., VIETEN, A., SAUER, M., WEIJERS, D., SCHWARZ, H., HAMANN, T., OFFRINGA, R., JÜRGENS, G. (2003) : Efflux-dependent auxin gradients establish the apical–basal axis of Arabidopsis. Planta 426: 147-153. • FULTON, J.M. (1970): Relationship of root extension to the soil monture level required for maximum yield of potatoes, tomatoes and corn. Can. J. Soil. Sci.

50: 92-94. • GÁLIS, I., MACAS, J., VLASÁK, J., ONDŘEJ, M., VAN ONCKELEN, H.A. (1995): The effect of elevated cytokinin level using ipt and N-6-benzyladenine on single node and intact potato plant tuberization in vitro. J. Plant Growth Regul. 14: 143-150. • GARNER, N., BLAKE, J. (1989): The induction and development of potato microtubers in vitro on media free of growth regulating substances. Ann. Bot.

63: 663-674. • GOPAL, J., CHAMAIL, A., SARKAR, D. (2004): In vitro production of microtubers for conservation of potato germplasm: Effect of genotype, abscisic acid, and sucrose. In Vitro Cell. Develop. Biol. Plant. 40: 485-490. • GREGORY, L.E. (1956): Some factors for tuberization in the potato. Ann. Bot.

43: 281-288. • GREGORY, L.E. (1965): Physiology of tuberization in plants. Enc. Plant Physiol. 15: 132-1354. • HAMMES, P.S., NEL, P.C. (1975): Control mechanisms in the tuberization process. Potato Res. 18: 262-272. • HANG, A.N., MILLER, D.E. (1986): Yield and physiological responses of potatoes to deficit, high frequency sprinkler irrigation. Agron. J. 78: 436-440.

99

• HARMEY, M.A., CROWLEY, M.P., CLINCH, P.E.M. (1966): The effect of growth regulators on tuberization of cultured stem pieces of Solanum tuberosum. Eur. Potato J. 9: 146–151. • HARTIG, K., BECK, E. (2006): Crosstalk between auxin, cytokinins, and sugars in the plant cell cycle. Plant Biol. 8: 389-396. • HARTUNG, W., SAUTER, A., HOSE, E. (2002): Abscisic acid in the xylem: where does it come from, where does it go to? J. Exp. Bot. 53: 27-32 • HASSANPANAH, D., HOSIENZADEH, A.A., DAHDAR, B., ALLAHYARI, N., IMANPARAST, L. (2009): Effects of different rates of nitrogen and phosphorus fertilizers on yield and yield components of Savalan potato cultivar mini-tubers. J. Food, Agricult. & Envir. 7 (2): 415-418. • HAVELANGE, A., LEJEUNE, P., BERNIER, G. (2000): Sucrose/cytokinin interaction in Sinapis alba at floral induction: a shoot-to-root-to-shoot physiological loop. Physiol. Plant. 109: 343-350. • HAVER, D.L., SCHUCH, U.K., LOVATT, C.J. (2003): Exposure of petunia seedlings to ethylene decreased apical dominance by reducing the ratio of auxin to cytokinin. J. Plant Growth Regul. 21: 459-486. • HENDL, J. (2004): Přehled statistických metod zpracování dat, Praha: Portál s.r.o., 584 s. • HILL, H.M. (1985): Irrigation - The option for economic development. In: Irrigation on the prairies. proceedings of the 4th annual western provincial conference, rationalization of water and soil research and management pp. 233245. • HILLER, L.K., KOLLER, D.C. (1984): Effect of early season moisture levels and growth regulator applications on internal quality of Russet Burbank potato tubers. Proc. Wash. State Potato Conf. 23: 67-73. • HILLER, L.K., KOLLER, D.C., THORNTON, R.E. (1985): Physiological disorders of potato tubers, pp. 389-455. In: LI, P.H. (ed), Potato Physiology. Academic Press Inc., Orlando. • HOBBIE, L., ESTELLE, M.A. (1995): The axr4 auxin-resistant mutants of Arabidopsis thaliana define a gene important for root gravitropism and lateral root initiation. Plant J. 7(2): 211-220.

100

• HOLDER, C.B., CARY, J.W. (1984): Soil, oxygen and moisture in relation to Russet Burbank potato yield and quality. Am. Potato J. 61: 67-75. • HOOKER, W.J. (1981): Secondary growth and jelly end rot. pp 12-13. In: HOOKER, W.J. (ed), Compendium of potato diseases. Am. Phytopathological Soc., St. Paul, MN. • HUSSEY, G., STACEY, N.J. (1984): Factors affecting the formation of in vitro tubers of potato (Solanum tuberosum L.). Ann. Bot. (53): 565-568. • INGRAM, K.T., MCCLOUD, D.E. (1984): Simulation of potato crop growth and development. Crop Sci. 24: 21-27. • JACKSON, S.D. (1999): Multiple signaling pathways control tuber induction in potato. Plant Physiol. 119:1-8. • JACKSON, S.D., JAMES, P., PRAT, S., THOMAS, B. (1998): Phytochrome B affects the levels of a graft-transmissible signal involved in tuberization. Plant Physiol. 117: 29-32. • JACKSON, S.D., PRAT, S. (1996): Control of tuberization in potato by gibberellins and phytochrome B. Physiol. Plant. 98: 407-412. • JAROŠOVÁ, E., KRÁL, J. (2007): Ověřování předpokladu normality, Národní informační středisko pro podporu jakosti, http:// www.npj.cz. • JENKINS, P.D., ALI, H. (1999): Growth of potato cultivars in response to application of phosphate fertiliser. Ann. App. Biol. 135: 431–438. • JESCHKE, W.D., PEUKE, A.D., PATE, J.S., HARTUNG, W. (1997): Transport, synthesis and catabolism of abscisic acid (ABA) in intact plants of castor bean (Ricinus communis L.) under phosphate deficiency and moderate salinity. J. Exp. Bot. 48: 1737-1747. • JOHRI, M.M., MITRA, D. (2001): Action of plant hormones. Curr. Sci. 80(2): 199-205. • KAKIMOTO, T. (1998): Cytokinin signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 1(5): 399403. • KEFELI, V.I., KALEVITCH, M.V. (2003): Natural growth inhibitors and phytohormones in plants and environment. Kluwer Academic Publishers, 340 s. • KODA, Y., KIKUTA, Y. (2001): Effect of jasmonates on in vitro tuberization in several potato cultivars that differ greatly in maturity. Plant Prod. Sci. 4(1): 6670.

101

• KODA, Y., KIKUTA, Y., TAZAKI, H., TSUJINO, Y., SAKAMURA, S., YOSHIHARA, T. (1991): Potato tuber-inducing activities of jasmonic acid and related compounds. Phytochem. 30: 1435-1438. • KODA, Y., OKAZAWA, Y. (1983): Charakcteristic changes in the levels of endogenous plant hormones in relation to the onset of potato tuberization. Japan. Jour. Crop Sci. 52(4): 592-597. • KRAUSS, A., MARSCHNER, H. (1982): Influence of nitrogen nutrition, daylenght, and temperature on contents of gibberelic and abscisic acid and on tuberization in potato plants. Potato Res. 25: 13-21. • KUIPER, D., SCHUIT, J., KUIPER, P.J.C. (1988): Effects of internal and external cytokinin concentrations on root growth and shoot to root ratio of Plantago major L. spp. pleiosperma at different nutrient conditions. Plant Soil

111: 231-236. • KUNKEL, T., NIU, Q.W., CHAN, Y.S., CHUA, N.H. (1999): Inducible isopentenyl transferase as a high-efficiency marker for plant transformation. Nature Biotech. 17(9): 916-919. • LI, C.J., GUEVARA, E., HERRERA, J., BANGERTH, K.F. (1995): Effect of apex excision and replacement by 1-naphthylacetic acid on cytokinin concentration and apical dominance in pea-plants. Physiol. Plant. 94(3): 465469. • LI, Y., ZHANG, J.S., LI, Q. (1996): Altered floral organ identity and flower bud formation in transgenic plants that overproduce cytokinins. Plant Physiol.

111(2): 159-159. • LIKEŠ, J., LAGA, J. (1978): Základní Statistické tabulky, Praha: SNTL, 491 s. • LIN, K.H., ZHAO, P., HE, Z.Z., WANG, Z.L., ZHAN, J.H., MAO, Y. (1999): Influence of N and K levels on cytokinins and abscisic acid levels in fluked tobacco. Tobacco Res. 25: 67-71. • LIPS, S. H., BEN ZIONI, A., VAADIA, Y. (1970): K+ recirculation in plants and its importance for adequate nitrate nutrition. In: R. M. SAMISH (ed) Recent Advances in Plant Nutrition. Gordon and Breach Science Publishers. New York - London - Paris. pp. 207-215. • LIZADA, M.C.C., YANG, S.F. (1979): A simple sensitive assay for 1aminocyclopropane-1-carboxylic acid. Anal. Biochem. 100: 140-145.

102

• LU, J., ERTL, J.R., CHEN, C. (1990): Cytokinin enhancement of the light induction of nitrate reductase transcript level in etiolated barley leaves. Plant Mol. Biol. 14: 585-594. • MACHACKOVA,

I.,

KONSTANTINOVA,

T.N.,

SERGEEVA,

L.I.,

LOZHNIKOVA, V.N., GOLYANOVSKAYA, S.A., DUDKO, N.D., EDER, J., AKSENOVA, N.P. (1998): Photoperiodic control of growth, development and phytohormone balance in Solanum tuberosum. Physiol. Plant. 102: 272-278. • MACHÁČKOVÁ, I., KREKULE, J., EDER, J., SEDLOVÁ, F., STRNAD, M. (1993): Cytokinins in photoperiodic induction of flowering in Chenopodium species. Physiol. Plant. 87: 160-166. • MACHÁČKOVÁ, I., SERGEEVA, L., ONDŘEJ, M., ZALTSMAN, O., KONSTANTINOVA,

T.,

EDER,

J.,

OVESNÁ,

J.,

RAKITIN,

Y.,

GOLYANOVSKAJA, S. (1997): Growth pattern, tuber formation and hormonal balance in in vitro potato plants carrying ipT gene. Plant Growth Regul. 21(1): 27-36. • MACKERRON, D.K., JEFFERIES, R.A. (1986): The influence of early soil monture stress on tuber numbers in potato. Potato Res. 29: 299-312. • MANGAT, B.S.. KERSON, G., WALLACE, D., (1984): The effect of 2,4-D on tuberization and starch content of potato tubers produced on stem segments cultured in vitro. Am. Potato J. 61: 355-361. • MARKAROV, A.M. (1990): Flowering and tuberization patterns in potato plants and effect of red and far-red light on these processes (in Russ.). In: CHAILAKHYAN, M.K., MOKRONOSOV, A.T. (Eds), Regulation of growth and development in potato plants. Nauka, Moscow, pp. 30-37. • MARSCHNER, H., KIRKBY, E.A., CAKMAK, I. (1996): Effect of mineral nutritional status on shoot-root partitioning of photoassimilates and cycling of mineral nutrients. J. Exp. Bot. 47: 1255-1263. • MARSCHNER,

H.,

KRAUSS,

A.,

MARES,

D.

J.,

ENGELS,

C.,

SATTELMACHER B. (1984): Tuberization and tuber growth in potato as affected by exogenous and endogenous factors. Berichte deutsch. botan. Gesell.

97: 269-282.

103

• MARTÍNEZ-GARCÍA, J.F., GARCÍA-MARTÍNEZ, J.L., BOU, J., PRAT, S. (2002): The interaction of gibberellins and the photoperiod in the control of the potato tuberization. J. Plant Growth Regul. 20: 377-386. • MCDOLE, R.E. (1978): Potassium fertilizer trials with potatoes on coarsetextured soils in southern-eastern Idaho. Am. Potato J. 55: 161-170. • MENDOZA, H.A., HAYNES F.L. (1976): Variability for photoperiodic reaction among diploid and tetraploid potato clones from three taxonomic groups. Am. Potato J. 53: 319-332. • MENZEL, B.M. (1980): Tuberization in potato (Solanum tuberosum) cultivar Sebago at high temperature: responses to gibberellin and growth inhibitors. Ann. Bot. 46: 259-266. • MENZEL, C.M. (1980): Tuberization in potato at high temperatures: responses to gibberellin and growth inhibitors. Ann. Bot. 46: 259-265. • MILLER, C.O., SKOOG, F., OKUMURA, F.S., VONSALTZA, M.H., STRONG, F.M. (1956):

Isolation, structure and synthesis of kinetin, a

substance promoting cell division. J. Am. Chem. Soc. 78(7): 1375-1380. • MILLER, D.E., MARTIN, M.W. (1987): The effect of irrigation regime and subsoiling on yield and quality of three potato cultivars. Am. Potato J. 64: 17-25. • MINGO-CASTEL, A. M., NEGM, F.B., SMITH, O.E. (1974): Effect of carbon dioxide and ethylene on tuberization of isolated potato stolons cultured in vitro. Plant Physiol. 53: 798-801. • MINGO-CASTEL, A. M., SMITH, O. E. and KUMAMOTO, J. (1976): Plant Physiol. 57: 480-485. • MURASHIGE, T., SKOOG, F. (1962): A revise medium for rapid and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-97. • NAM, K.H., KONG, F.J., MATSUURA, H., TAKAHASHI, K., NABETA, K., YOSHIHARA, T. (2008): Temperature regulates tuber-inducing lipoxygenasederived metabolites in potato (Solanum tuberosum L.). J. Plant Physiol. 165: 233—238. • NAM, K.H., MINAMI, C., KONG, F.J., MATSUURA, H, TAKAHASHI, K., YOSHIHARA, T. (2005): Relation between environmental factors and the LOX activities upon potato tuber formation and flower-bud formation in morning glory. Plant Growth Regul. 46(3): 253-260.

104

• NIEDERLE, J., OSIČKA, J.(1997): Matematika pro biology. 1. vyd. Masarykova Univerzita, Přírodovědecká fakulta, 95 s. • NOODÉN, L.D., SINGH, S., LETHAM, D.S. (1990): Correlation of xylem sap cytokinin levels with monocarpic senescence in soybean. Plant Physiol. 93(1): 33-39. • NORDSTRÖM, A., TARKOWSKI, P., TARKOWSKA, D., NORBAEK, R., ÅSTOT, C., DOLEŽAL, K., SANDBERG, G. (2004): Auxin regulation of cytokinin biosynthesis in Arabidopsis thaliana: A factor of potential importance for auxin-cytokinin-regulated development. PNAS 101(21): 8039-8044. • OBATA-SASAMOTO, H., SUZUKI, H. (1979): Activities of enzymes relativ to starch synthesis and endogenous levels of growth regulators in potato stolon tips during tuberization. Physiol. Plant. 45: 320–324. • OMAROV, R.T., AKABA, S., KOSHIBA, T. and LIPS, S.H. (1999): Aldehyde oxidase in roots, leaves and seeds of barley (Hordeum vulgare L.). J. Exp. Bot. 50:63-69. • OTROSHY, M., NAZARIAN, F., STRUIK, P.C. (2009): Effects of temperature fluctuation during in vitro phase on in vitro microtuber production in different cultivars of potato (Solanum tuberosum L.). Plant Cell Tiss. Organ Cult. 98: 213–218. • OZGEN, S. and PALTA, J. P. (2004): Supplemental calcium application influences potato tuber number and size. Hort. Sci. 40(1): 102-105. • PALMER, C.E., SMITH, O.E. (1969) Effect of abscisic acid on elongation and kinetin-induced tuberization of isolated stolons of Solanum tuberosum L. Plant Cell Physiol. 10: 657–664. • PANDEY, R.P. (2002): The Potato. Kalyani Publisher, New Delhi, pp. 91-111. • PAVLISTA, A.D., BLUMENTHAL, J.M. (2000): Potatoes. In: FERGUSON, R.B., DE GROOT, K.M. (eds). Nutrient Management for Agronomic Crops in Nebraska. Univ. Nebr. Coop. Ext., Lincoln, NE. • PLAKIDOU-DYMOCK, S., DYMOCK, D., HOOLEY, R. (1998): A higher plant seven-transmembrane receptor that influences sensitivity to cytokinins. Curr. Biol. 8(6): 315-324. • PROCHÁZKA, S., MACHÁČKOVÁ, I., KREKULE, J., ŠEBÁNEK, J., GLOSER, J., HAVEL, L., NÁTR, L., PRÁŠIL, I., SLADKÝ, Z.,

105

ŠANTRŮČEK, J., TESAŘOVÁ, M., VYSKOT, B. (2003): Fyziologie rostlin, Praha: ACADEMIA, 484 s. • QUARRIE, S.A., WHITFORD, P.N., APPLEFORD, N.E.J., WANG, T.L., COOK, S.K., HENSON, L.E., LOVEYS, B.R. (1988): A monoclonal antibody to (S)-abscisic acid: its characterisation and use in radioimmunoassay for measuring abscisic acid in crude extracts of cereal and lupin leaves. Planta 183: 330-339. • RÁB, M. (2004): Metody řešení obyčejných diferenciálních rovnic. 3. vyd. Masarykova Univerzita, Přírodovědecká fakulta, 102 s. • RADIN, J.W. (1984): Stomatal responses to water stress and to abscisic acid in phosphorus deficient cotton plants. Plant Physiol. 76: 392-394. • RAHAYU, Y.S., WALCH-LIU, P., NEUMANN, G., RÖMHELD, V. VON, WIREN, N., BANGERTH, F. (2005): Root-derived cytokinins as long-distance signals for NO3 induced stimulation of leaf growth. J. Exp. Bot. 56 (414): 11431152. • RAMACHANDRA R.S., RAVISHANKAR, G.A. (2002): Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotech. Adv. 20: 101-153. • RASUMOV, V. (1931): Influence of alternate day length on tuber formation. Bull. App. Bot. 27: 3-46. • REDMAN, J.C., HAAS, B.J., TANIMOTO, G., TOWN, C.D. (2004): Development and evaluation of an Arabidopsis whole genome Affymetrix probe array. Plant J. 38: 545–561. • REX, B.L., MAZZA, G. (1989): Cause, control, and detection of hollow heart in potatoes: A review. Am. Potato J. 66: 165-183. • RIOU-KHAMLICHI, C., HUNTLEY, R., JACQMARD, A., MURRAY, J.A.H. (1999): Cytokinin activation of Arabidopsis cell division through a D-type cyclin. Science 283 (5407): 1541-1544. • ROLLAND, F., BAENA-GONZALEZ, E., SHEEN, J. (2006): Sugar sensing and signalling in plants: Conserved and novel mechanisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57: 675-709. • ROMANOV,

G.A.,

AKSENOVA,

N.P.,

KONSTANTINOVA,

T.N.,

GOLYANOVSKAYA, S.A., KOSSMANN, J., WILLMITZER, L. (2000): Effect of indole-3-acetic acid and kinetin on tuberisation parameters of different

106

cultivars and transgenic lines of potato in vitro. Plant Growth Regul. 32: 245– 251. • ROSEN, C.J., BIERMAN, P.M. (2008): Potato yield and tuber set as affected by phosphorus fertilization. Am. J. Pot. Res. 85: 110–120. • ROSS, J.J., O`NEILL, D.P., SMITH, J.J., KERCKHOFFS, L.H.J., ELLIOTT, R.C. (2000): Evidence that auxin promotes gibberellin A1 biosynthesis in pea. Plant J. 21: 547-552. • SAKAKIBARA, H., TAKEI, K., HIROSE, N. (2006): Interactions between nitrogen and cytokinin in the regulation of metabolism and development. Trends Plant Sci. 11(9): 440-448. • SAMUELSON, M.E., LARSSON, C.M. (1993): Nitrate regulation of zeatinriboside levels in barley roots: effects of inhibitors of N assimilation and comparison with ammonium. Plant Sci. 93: 77-84. • SATTELMACHER, B., MARSCHNER, H. (1978): Relation between nitrogen nutrition, cytokinin activity and tuberization in Solanum tuberosum. Physiol. Plant. 44(2): 65-68. • SATYANARAYANA, V., ARORA, P.N. (1985): Effect of nitrogen and potassium on yield and yield attributes of potato (var. Kufri Bahar). Ind. J. Agron. 30: 292-295. • SCHALLER, G.E. (1997): Ethylene and cytokinin signalling in plants: The role of two-component systems. Essays Biochem. 32: 101-111. • SCOTT, P. A., LIVERMAN, J. L. (1956): Promotion of leaf expansion by kinetin and benzyl amino purine. Plant Physiol. 31: 321-322. • ŠEFROVÁ, H. (2006): Rostlinolékařská entomologie, 1. vyd., Brno: Konvoj, 2006. 257 s. • SHERR, C.J. (1994): Regulation of G1 phase progression by cyclin-dependent kinases. Faseb Journal 8(7): A1261-A1261. • SHIBLI, R.A., ABU-EIN, A.M., AJLOUNI, M. M. (2001): In vitro and in vivo multiplication of virus free ‘Spunta’ potato. Pak. J. Bot. 33: 35-41. • SHIMIZU-SATO, S., TANAKA, M., MORI, H. (2008): Auxin–cytokinin interactions in the control of shoot branching. Plant Mol. Biol. 69: 429–435.

107

• SHOCK, C.C., HOLMES, Z.A., STIEBER, T.D., ELDREDGE, E.P., ZHANG, P. (1993): The effect of timed water stress on quality, total solids and reducing sugar content of potatoes. Am. Potato J. 70: 227-241. • SHOCK, C.C., PEREIRA, A.B., ELDREDGE, E.P. (2007): Irrigation best management practices for potato. Amer. J. of Potato Res. 84: 29-37 • SHOCK, C.C., ZALEWSKI, J.D., STIEBER, T.D., BURNETT D.S. (1992): Early season water deficits on Russet Burbank plant development, yield, and quality. Am. Potato J. 69: 793-804. • SKOOG, F., MILLER, C. O. (1957): Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. In: Symp. Soc. Expt I. Bot. 11: II 8130. • SMITH, O.E., RAPPAPORT, L. (1969): Gibberellins, inhibitors, and tuber formation in the potato (Solanum tuberosum L.). Am. Potato J. 46: 185-191. • STALLKNECHT, G.F., FARNSWORTH, S. (1979): Effect of nitrogen on the coumarin-induced tuberization of potato axillary shoots cultured in vitro. Am. Potato J. 56(11): 523-530. • STARK, J.C., MCCANN, I.R. (1992): Optimal allocation of limited water supplies for Russet Burbank potatoes. Am. Potato J. 69: 413-421. • STÁVKOVÁ, J., DUFEK, J.(2000): Biometrika. 1. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 178 s. • STRNAD, M. (1996): Enzyme immunoassays on N6 –benzyladenine and N6 – (meta-hydroxybenzyl) adenine cytokinins. J. Plant Growth Regul. 15: 179-188. • STRNAD, M., VANĚK, T., BINAROVÁ, P., KAMÍNEK, M., HANUŠ, J. (1990): Enzyme immunoassays for cytokinins in alfalfa cell culture, in: KUTÁČEK, M., ELLIOTT, M. C., MACHÁČKOVÁ, J. (Eds.), Molecular aspects of hormonal regulation of plant development, SPB Academic Publ., The Hague, pp. 41-54. • STRUIK, P.C., EWING, E.E. (1995): Crop physiology of potato (Solanum tuberosum L.): responses to photoperiod and temperature relevant to crop modelling. In: HAVERKORT, A.J., MACKERRON, D.K.L. (Eds), Potato ecology and modelling of crops under conditions limiting growth. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 19-40.

108

• STRUIK, P.C., GEERTSEMA, J., CUSTERS, C.H.M.G. (1989): Effects of shoot, root and stolon temperature on the development of the potato (Solanum tuberosum L.) plant. III. Development of tubers. Potato Res. 32: 151-158. • SUTTLE, J.C. (1995): Postharvest changes in endogenous ABA levels and ABA metabolism in relation to dormancy in potato tubers. Physiol. Plant. 95: 233-240. • SUTTLE, J.C. (1998): Involvement of ethylene in potato micro tuber dormancy. Plant Physiol. 118: 843-848. • SUTTLE, J.C., HULSTRAND, J.F. (1994): Role of endogenous abscisic acid in potato micro tuber dormancy. Plant Physiol. 105: 891-896. • ŠVEC, J., ŠIŠKA, I., VAVŘIN, P. (1982) Teorie řízení I - Lineární systémy. Brno : Vysoké učení technické v Brně, 208s. • TAKEI,

K.,

TAKAHASHI,

T.,

SUGIYAMA,

T.,

YAMAYA,

T.,

SAKAKIBARA, H. (2002): Multiple routes communicating nitrogen availability from roots to shoots: a signal transduction pathway mediated by cytokinin. J. Exp. Bot. 53(370): 971-977. • TERMAN. G.L., CARPENTER, P.N., CUNNINGHAM, C.E. (1953): Relation of soil and fertilizer potassium to dry matter content and yield of potatoes. Soil Sci. 75: 449-458. • THOMPSON, B. (1977): Fundamentals of gas analysis by gas chromatography. Varian Assoc., Palo Alto: 64-71. • THORSTEINSSON, B., ELIASSON, L. (1989): Growth retardation induced by nutritional deficiency or abscisic acid in Lemna gibba: the relationship between growth rate and endogenous cytokinin content. Plant Growth Regul. 9: 171-181. • TIMM, H., FLOCKNER, W.J. (1966): Responses of potato plants to fertilization • TIMM, H., MERKLE, F.G. (1963): The influence of chloride on yield and specific gravity of potatoes. Am. Potato J. 40: 1-8. • TIZIO, R. (1971): Action et role probable de certain gibberellins (A1, A3, A4, A5, A7, A9 et A13) sur la croissance des stolons et la tuberisation de la pomme de terre (Solanum tuberosum L.). Potato Res. 14: 193-204. • TREWAVAS, A. (2003): Aspects of plant intelligence. Ann. Bot. 92: 1-20. • ULVSKOV, P., NIELSEN, T.H., SEIDEN, P., MARCUSSEN, J. (1992): Cytokinins and leaf development in sweet pepper (Capsicum annuum L.). Planta

188(1): 70-77.

109

• VAN DAM, J., KOOMAN, P.L., STRUIK, P.C. (1996): Effects of temperature and photoperiod on early growth and final number of tubers in potato (Solanum tuberosum L.). Potato Research 39: 51-62. • VANDENBERG, J.H., EWING, E.E. (1991): Jasmonates and their role in plantgrowth and development, with special reference to the control of potato tuberization - a review. Am. Potato J. 68: 781-794. • VANDERHOEF, L., KEY, J. L. (1968): Inhibition by kinetin of cell elongation and RNA synthesis in excised soybean hypocotyls. Plant Cell Physiol. 9: 343351. • VIOLA, R., ROBERTS, A.G., HAUPT, S., GAZZANI, S., HANCOCK, R.D., MARMIROLI, N., MACHRAY, G.C., OPARKA, K.J. (2001): Tuberization in potato involves a switch from apoplastic to symplastic phloem unloading. Plant Cell 13: 385-398. • VOSMANSKÁ, G. (2005): Matematika, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně. 4. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2005, 120 s. • VREUGDENHIL, D., XU, X., JUNG, C.S., VAN LAMMEREN, A.A.M., EWING, E. E. (1999): Initial anatomical changes associated with tuber formation on single-node potato (Solanum tuberosum L.) cuttings: a reevaluation. Ann. Bot. 84: 675-680. • VU, N.H., ANH, P.H., NHUT, D.T. (2006): The role of sucrose and different cytokinins in the in vitro floral morphogenesis of rose (hybrid tea) cv. ‘‘First Prize’’. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 87: 315–320. • WANG, G., RÖMHELD, V., LI, C.J., BANGERTH, F. (2006): Involvement of auxin and CKs in boron deficiency induced changes in apical dominance of pea plants (Pisum sativum L.). J. Plant Physiol. 163: 591-600. • WANG, P., HU, CH. (1982): In vitro mass tuberization and virus-free seed potato production in Taiwan. Am. Potato J. 59: 33–37. • WAREING, P.F. (1965): Dormancy in plants. Sci. Prog. 53(212): 529. • WERNER, T., MOTYKA, V., LAUCOU, V., SMETS, R., VAN ONCKELEN, H., SCHMULLING, T. (2003): Cytokinin-deficient transgenic Arabidopsis plants show multiple developmental alterations indicating opposite functions of

110

cytokinins in the regulation of shoot and root meristem activity. Plant Cell 11: 2532–2550. • WESTERMAN, D.T.,. TINDALL, T.A., JAMES, D.W., HURST, R.I. (1994): Nitrogen and potassium fertilization of potatoes: yield and specific gravity. Am. Potato J. 71: 417-432. • WHEELER, R.M., TIBBITTS, T.W. (1986): Growth and tuberization of potato (Solanum tuberosum L.) under continuous light. Plant Physiol. 80: 801-804. • WHEELER, R.M., TIBBITTS, T.W. (1997): Influence of changes in daylength and carbon dioxide on the growth of potato. Ann. Bot. 79: 529-533. • WHEELER, R.M., TIBBITTS, T.W., FITZPATRICK, A.H. (1991): Carbon dioxide effects on potato growth under different photoperiods and irradiance. Crop Sci. 31: 1209-1213. • WRIGHT, J.L., STARK, J.C. (1990): Potato. 859-888. In: STEWART, B.A., NEILSEN, D.R. (eds), Irrigation of agricultural crops. Agron. Monogr. 30. ASA-CSSA-SSSA, Madison, WI. • XU, X., VAN LAMMEREN, A.A., VERMEER, E., VREUGDENHIL, D. (1998): The role of gibberellin, abscisic acid, and sucrose in the regulation of potato tuber formation in vitro. Plant Physiol. 117: 575-584. • XU, X., VREUGDENHIL, D., VAN LAMMEREN A.A.M. (1997): Cell division and cell enlargement during potato tuber formation. J. Exp. Bot.,

49(320): 573–582. • YAKUSHKINA, N.I., PUZINA, T.I., BAKHTENKO, E.Y., KIRILLOVA, I. G. (1997): Role of hormonal status in the response of potato plants to various mineral nitrogen sources. Russ. J. Plant Physiol. 44: 801-804. • YU, Y.B., ADAMS, D.O., YANG, S.F. (1979): Regulation of auxin-induced ethylene production in mung bean hypocotyls: Role of 1-aminocyclopropane-1carboxylic acid. Plant Physiol. 63: 589-590. • ZAKARIA, M., HOSSAIN, M.M., KHALEQUE-MIAN, M.A., HOSSAIN, T., UDDIN, M.Z. (2008): In vitro tuberization of potato influenced by benzyladenine and chlorocholine chloride. Bangladesh J. Agril. Res. 33(3): 419425.

111

• ZHANG, K., LETHAM, D.S,, JOHN, P.C.L. (1996): Cytokinin controls the cell cycle at mitosis by stimulating the tyrosine dephosphorylation and activation of p34(cdc2)-like H1 histone kinase. Planta 200(1): 2-12. • ZHANG, Z., ZHOU, W., LI, H. (2005): The role of GA, IAA and BAP in the regulation of in vitro shoot growth and microtuberization in potato. Acta Physiol. Plant. 27(3B): 363-369.

10. SEZNAM TABULEK, GRAFŮ A OBRÁZKŮ 10.1. Seznam tabulek • Tabulka č.1 - Přehledová tabulka indukce u kontrolní varianty (% baněk, u nichž došlo ke tvorbě alespoň jedné hlízky k celkovému počtu baněk) viz přílohy • Tabulka č.2 - Přehledová tabulka indukce u varianty se sníženým dusíkem (% všech baněk, u nichž došlo k tvorbě alespoň jedné hlízky k celkovému počtu baněk) viz přílohy • Tabulka č.3 - Přehledová tabulka indukce u varianty se zvýšeným dusíkem (% všech baněk, u nichž došlo k tvorbě alespoň jedné hlízky k celkovému počtu baněk) viz přílohy • Tabulka č.4 - Cochranův test k ověření homogenity rozptylů výběrových souborů sezónních opakování procesu indukce hlízek za kultivačních podmínek in vitro viz přílohy • Tabulka č.5a až 5q - Kolmogorovův - Smirnovův test dobré shody (normality) pro výběrový soubor sezónního opakování pokusu v Lilieforsově úpravě kritických hodnot testovací charakteristiky viz přílohy • Tabulka č.6 - Schéma dat pro ANOVU k posouzení vlivu faktoru sezóna na proces indukce (na % baněk s alespoň jednou hlízkou k celkovému počtu baněk) viz přílohy

112

• Tabulka č.6a - Tabulka analýzy rozptylu, vliv faktoru sezóna na proces indukce (na % baněk s alespoň jednou hlízkou k celkovému počtu baněk) viz přílohy • Tabulka č.7 - Schéma dat pro ANOVU k posouzení vlivu faktoru rok na proces indukce (na % baněk s alespoň jednou hlízkou k celkovému počtu baněk) viz přílohy • Tabulka č.7a - Tabulka analýzy rozptylu, vliv faktoru rok na proces indukce (na % baněk, u nichž došlo k indukci k celkovému počtu baněk) viz přílohy

• Tabulka č.8 - Schéma dat pro ANOVU k posouzení vlivu faktoru opakování souboru experimentu na proces indukce (na % baněk s alespoň jednou hlízkou k celkovému počtu baněk) viz přílohy • Tabulka č.8a - Tabulka analýzy rozptylu, vliv faktoru soubor na procesu indukce (na % baněk, u nichž došlo k indukci k celkovému počtu baněk) viz přílohy • Tabulka č.9 - Tukeyův test významnosti rozdílů mezi průměry jednotlivých úrovňových skupin faktoru B - soubory opakování morfologického pokusu viz přílohy • Tabulka č.9a - Skutečné rozdíly mezi dílčími průměry jednotlivých úrovní faktoru B - soubory viz přílohy • Tabulka č.10 - Základní schéma dat pro ANOVU dvojného třídění k posouzení vlivu anorganického dusíku v médiu na proces indukce (na % baněk s alespoň jednou vytvořenou mikrohlízkou k celkovému počtu baněk) viz přílohy • Tabulka č.10a -

Tabulka analýzy rozptylu indukce, vliv faktoru obsah

anorganického dusíku v indukčním médiu na indukci hlízek (na % baněk, u nichž došlo k vytvoření alespoň jedné mikrohlízky k celkovému počtu baněk) viz přílohy

113

• Tabulka č.11 - Tukeyův test významnosti rozdílů mezi průměry jednotlivých úrovňových skupin faktoru B - varianta (obsahu dusíku v indukčním médiu) následné testování ANOVY viz tabulka č.10 viz přílohy • Tabulka č.11a - Skutečné rozdíly mezi průměry úrovní faktoru B – metoda viz přílohy • Tabulka č.12 - Přehledová tabulka ustálených hmotností zralých mikrohlízek po 99 až 101 dnech růstu, pro jednotlivá sezónní opakování viz přílohy • Tabulka č.13 - Cochranův test homogenity pro rozptyly průměrných hmotností mikrohlízek jednotlivých souborů opakování viz přílohy

• Tabulka č.14 - ANOVA dvojného třídění k posouzení vlivu koncentrace anorganického dusíku v indukčním médiu na hmotnost mikrohlízek viz přílohy • Tabulka č.14a - Tabulka analýzy rozptylu, vliv koncentrace anorganického dusíku v indukčním médiu na hmotnost mikrohlízek viz přílohy • Tabulka č.15 - Tukeyův test významnosti rozdílů mezi průměry jednotlivých úrovňových skupin faktoru B - varianta (obsahu dusíku v indukčním médiu) následné testování ANOVY viz tabulka č.14 viz přílohy • Tabulka č.15a - Skutečné rozdíly mezi průměry úrovní faktoru B – metoda viz přílohy • Tabulka č.16 - Friedmanův test k posouzení vlivu dusíku na indukci tvorby hlízek in vitro (na % baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou z celkového počtu baněk) viz přílohy • Tabulka č.16a - Mnohonásobné porovnání Neményiho metodou viz přílohy

114

• Tabulka č.17 - Odvození parametrů regresní funkce pro indukci in vitro (pro závislost počtů baněk s alespoň jednou vyvinutou mikrohlízkou na čase u kontrolní varianty morfologického pokusu) viz přílohy • Tabulka č.18 - Odvození parametrů regresní funkce pro indukci in vitro (pro závislost počtů baněk s alespoň jednou vyvinutou mikrohlízkou na čase u varianty se sníženým dusíkem morfologického pokusu) viz přílohy • Tabulka č.19 - Odvození parametrů regresní funkce pro indukci in vitro (pro závislost počtů baněk s alespoň jednou vyvinutou mikrohlízkou na čase u varianty se zvýšeným dusíkem morfologického pokusu) viz přílohy • Tabulka č.20 - Porovnání doby fyziologické přípravy (pozn. není v přílohách viz kap. 4.11. Vyhodnocení výsledků morfologického pokusu, přímého pozorování a ohodnocení počtu baněk s alespoň jednou vzniklou mikrohlízkou str. 43 v textu DP • Tabulka č.21 - Inflexní bod regresní křivky (pozn. není v přílohách viz kap. 4.11. Vyhodnocení výsledků morfologického pokusu, přímého pozorování a ohodnocení počtu baněk s alespoň jednou vzniklou mikrohlízkou str. 44 v textu DP • Tabulka č.22 - Porovnání koeficientů zesílení ustálených hodnot indukce hlízek (pozn. není v přílohách viz kap. 4.11. Vyhodnocení výsledků morfologického pokusu, přímého pozorování a ohodnocení počtu baněk s alespoň jednou vzniklou mikrohlízkou str. 48) nebyla zařazena do DP • Tabulka č.23 - Přehledová tabulka frekvence tvorby hlízek in vitro u kontrolní varianty (% vytvořených hlízek vzhledem k původnímu počtu jednonodálních segmentů ve variantě) viz přílohy

115

• Tabulka č.24 - Přehledová tabulka frekvence tvorby hlízek in vitro u varianty se sníženým dusíkem (% vytvořených hlízek vzhledem k původnímu počtu jednonodálních segmentů ve variantě) viz přílohy • Tabulka č.25 - Přehledová tabulka frekvence tvorby hlízek in vitro u varianty se zvýšeným dusíkem (% vytvořených hlízek vzhledem k původnímu počtu jednonodálních segmentů ve variantě) viz přílohy • Tabulka č.26 - Cochranův test homogenity dílčích souborů frekvence tvorby mikrohlízek in vitro (% vytvořených mikrohlízek vzhledem k původnímu počtu jednonodálních segmentů ve variantě) viz přílohy • Tabulka č.27 - Friedmanův test k posouzení vlivu dusíku na frekvenci tvorby hlízek in vitro (na % vytvořených mikrohlízek vzhledem k původnímu počtu jednonodálních segmentů ve variantě) viz přílohy • Tabulka č.27a - Mnohonásobné porovnání Neményiho metodou viz přílohy • Tabulka č.28 - Výpočet koncentrace metatopolinu (mT) v čerstvé hmotě jednotlivých částí rostliny str.53 v textu DP • Tabulka č.28a - Vyhodnocení koncentrací metatopolinu v rostlině bramboru (pozn. není v přílohách, viz kap. 4.13.1. Vyhodnocení průběhu koncentrace cytokininu metatopolinu během fyziologické přípravy na tvorbu mikrohlízek str. 59) viz přílohy • Tabulka č.29 - Výpočet koncentrace metatopolin ribosidu (mTR) v čerstvé hmotě jednotlivých částí rostliny viz přílohy • Tabulka č.30 - Výpočet koncentrace izopentenyladeninu (iP) v čerstvé hmotě jednotlivých částí rostliny viz přílohy

116

• Tabulka č.31 - Výpočet koncentrace izopentenyladenin ribosidu (iPR) v čerstvé hmotě jednotlivých částí rostliny viz přílohy • Tabulka č.32 - Výpočet koncentrace dihydrozeatinu (DHZ) v čerstvé hmotě jednotlivých částí rostliny viz přílohy • Tabulka č.32a - Výpočet koncentrace dihydrozeatin ribosidu (DHZR) v čerstvé hmotě jednotlivých částí rostliny viz přílohy • Tabulka č.33 - Výpočet koncentrace benzyladeninu (BA) v čerstvé jednotlivých

částí rostliny viz přílohy • Tabulka č.34 - Výpočet koncentrace benzyladeninu ribosidu (BAR) v čerstvé hmotě jednotlivých částí rostliny viz přílohy • Tabulka č.35 - Výpočet koncentrace trans-zeatinu (t-Z) v čerstvé hmotě jednotlivých částí rostliny viz přílohy • Tabulka č.36 - Výpočet koncentrace transzeatin ribosidu (t-ZR) v čerstvé hmotě jednotlivých částí rostliny viz přílohy • Tabulka č.37 - Kontrola koncentrace benzyladeninu (BA) v médiu viz přílohy • Tabulka č.38 - Výpočet parametrů kalibrační křivky k určení molární koncentrace dusíkatých částic média (závislost molární koncentrace dusíkatých

částic na elektrickém potencionálu elektrody) viz přílohy • Tabulka č.39 - Stanovení koncentrace anorganických dusíkatých částic, pro kontrolu vývoje změn média v závislosti na čase viz přílohy • Tabulka č.40 - Kalibrační křivka k určení molární koncentrace dusíkatých částic zelené hmoty (závislost molární koncentrace dusíkatých částic na absorbanci světelného záření) viz přílohy

117

• Tabulka č.41 - Určení koncentrace anorganických dusíkatých částic v nadzemní

části rostliny pro kontrolní variantu indukčního média viz přílohy • Tabulka č.42 - Určení koncentrace anorganických dusíkatých částic v nadzemní

části rostliny pro variantu se sníženým obsahem dusíku v indukčním médiu viz přílohy • Tabulka č.43 - Určení koncentrace anorganických dusíkatých částic v nadzemní

části rostliny pro variantu se zvýšeným obsahem dusíku v indukčním médiu viz přílohy

• Tabulka č.44 - Určení koncentrace anorganických dusíkatých částic v listu pro kontrolní variantu indukčního média viz přílohy • Tabulka č.45 - Určení koncentrace anorganických dusíkatých částic v listu pro variantu se sníženým obsahem dusíku v indukčním médiu viz přílohy • Tabulka č.46 - Určení koncentrace anorganických dusíkatých částic v listu pro variantu se zvýšeným obsahem dusíku v indukčním médiu viz přílohy

• Tabulka č.47 - Určení koncentrace anorganických dusíkatých částic v části stonku původního jednonodálního segmentu pro kontrolní variantu indukčního média viz přílohy • Tabulka č.48 - Určení koncentrace anorganických dusíkatých částic v části stonku původního jednonodálního segmentu pro variantu se sníženým obsahem dusíku v indukčním médiu viz přílohy • Tabulka č.49 - Určení koncentrace anorganických dusíkatých částic v části stonku původního jednonodálního segmentu pro variantu se zvýšeným obsahem dusíku v indukčním médiu viz přílohy

118

• Tabulka č.50 - Určení koncentrace anorganických dusíkatých částic v pupenu pro kontrolní variantu indukčního média viz přílohy • Tabulka č.51 - Určení koncentrace anorganických dusíkatých částic v pupenu pro variantu se sníženým obsahem dusíku v indukčním médiu viz přílohy • Tabulka č.52 - Určení koncentrace anorganických dusíkatých částic v pupenu pro variantu se zvýšeným obsahem dusíku v indukčním médiu viz přílohy • Tabulka č.53 - Určení koncentrace anorganických dusíkatých částic ve stolonu pro kontrolní variantu indukčního média viz přílohy • Tabulka č.54 - Určení koncentrace anorganických dusíkatých částic ve stolonu pro variantu se sníženým obsahem dusíku v indukčním médiu viz přílohy • Tabulka č.55 - Určení koncentrace anorganických dusíkatých částic ve stolonu pro variantu se zvýšeným obsahem dusíku v indukčním médiu viz přílohy • Tabulka č.56 - Koncentrace ACC v nadzemní části rostliny viz přílohy • Tabulka č.57 - Koncentrace ACC v listu viz přílohy

• Tabulka č.58 - Koncentrace ACC v části stonku původního jednonodálního segmentu viz přílohy • Tabulka č.59 - Koncentrace ACC v pupenu viz přílohy • Tabulka č.60 - Koncentrace ACC ve stolonu viz přílohy • Tabulka č.61 - Stanovení koncentrace ABA v jednonodálním segmentu (nadzemní části rostliny) metodou RIA viz přílohy • Tabulka č.62 - Stanovení koncentrace ABA v listu metodou RIA viz přílohy

119

• Tabulka č.63 - Stanovení koncentrace ABA ve stonku metodou RIA viz přílohy • Tabulka č.64 - Stanovení koncentrace ABA ve stolonu metodou RIA viz přílohy • Tabulka č.65 - Stanovení koncentrace ABA v hlízce metodou RIA viz přílohy • Tabulka č.66 - Stanovení koncentrace ABA v kalusu metodou RIA viz přílohy • Tabulka č.67 - Stanovení koncentrace ABA v pupenu metodou RIA viz přílohy

10.2. Seznam grafů • Graf č.1 - Vícenásobné porovnání celkových průměrů jednotlivých úrovňových skupin faktoru koncentrace anorganického dusíku v indukčním médiu, v textu DP • Graf č.2 - Závislosti indukce mikrohlízek na týdenních ohodnoceních za kultivačních podmínek in vitro, v textu DP • Graf č.3 - Regresní křivka závislosti indukce mikrohlízek na čase, za kultivačních podmínek in vitro y1 = f(t) , v textu DP • Graf č.4 - Závislost doby fyziologické přípravy TD, koeficientu zesílení indukce K a maximální okamžité rychlosti vi na počáteční koncentraci anorganického dusíku v indukčním médiu, v textu DP • Graf č.5 - Závislost frekvence tvorby hlízek na týdenních ohodnoceních za kultivačních podmínek in vitro, v textu DP • Graf č.5a - Závislost hmotnosti zralých mikrohlízek na koncentraci anorganického dusíku v indukčním médiu za kultivačních podmínek in vitro (doba růstu 99 až 101 dní podle souborů) , v textu DP

120

• Graf č.6 - Závislost koncentrace metatopolinu na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.7 - Závislost koncentrace metatopolinu na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu,v textu DP • Graf č.8 - Závislost koncentrace metatopolinu na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.9 - Závislost koncentrace metatopolinu na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.10 - Závislost koncentrace metatopolinu ribbosidu na času odběru vzorku - nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.11 - Závislost koncentrace metatopolinu ribbosidu na času odběru vzorku - list / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.12 - Závislost koncentrace metatopolinu ribbosidu na času odběru vzorku - stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.13 - Závislost koncentrace metatopolinu ribbosidu na času odběru vzorku - pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.14 - Závislost koncentrace izopentenyladeninu na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.15 - Závislost koncentrace izopentenyladenin na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.16 - Závislost koncentrace izopentenyladenin na času odběru vzorku -

121

stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.17 - Závislost koncentrace izopentenyladenin na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.18 - Závislost koncentrace izopentenyladeninu ribosidu na času odběru vzorku - nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.19 - Závislost koncentrace izopentenyladeninu ribosidu na času odběru vzorku - list / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.20 - Závislost koncentrace izopentenyladeninu ribosidu na času odběru vzorku - stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.21 - Závislost koncentrace izopentenyladeninu ribosidu na času odběru vzorku - pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.22 - Závislost koncentrace dyhydrozeatinu na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.23 - Závislost koncentrace dyhydrozeatinu na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.24 - Závislost koncentrace dyhydrozeatinu na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.25 - Závislost koncentrace dyhydrozeatinu na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP

122

• Graf č.26 - Závislost koncentrace dyhydrozeatinu ribosidu na času odběru vzorku - nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.27 - Závislost koncentrace dyhydrozeatinu ribosidu na času odběru vzorku - list / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.28 - Závislost koncentrace dyhydrozeatinu ribosidu na času odběru vzorku - stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.29 - Závislost koncentrace dyhydrozeatinu ribosidu na času odběru vzorku - pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.30 - Závislost koncentrace benzyladeninu na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.31 - Závislost koncentrace benzyladeninu na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.32 - Závislost koncentrace benzyladeninu na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.33 - Závislost koncentrace benzyladeninu na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.34 - Závislost koncentrace benzyladeninu ribosidu na času odběru vzorku - nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.35 - Závislost koncentrace benzyladeninu ribosidu na času odběru vzorku -list / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP

123

• Graf č.36 - Závislost koncentrace benzyladeninu ribosidu na času odběru vzorku - stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.37 - Závislost koncentrace benzyladeninu ribosidu na času odběru vzorku - pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.38 - Závislost koncentrace transzeatinu na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.39 - Závislost koncentrace transzeatinu na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.40 - Závislost koncentrace transzeatinu na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.41 - Závislost koncentrace transzeatinu na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.42 - Závislost koncentrace transzeatinu ribosidu na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.43 - Závislost koncentrace transzeatinu ribosidu na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.44 - Závislost koncentrace transzeatinu ribosidu na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP

• Graf č.45 - Závislost koncentrace transzeatinu ribosidu na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP

124

• Graf č.46 - Kalibrační křivka závislosti koncentrace dusíku na elektrickém potenciálu membrány, indukční médium v textu DP • Graf č.47 - Kalibrační křivka závislosti koncentrace dusíku na absorbanci světelného záření, zelená hmota v textu DP • Graf č.48 - Závislost koncentrace dusíku na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.49 - Závislost koncentrace dusíku na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.50 - Závislost koncentrace dusíku na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.51 - Závislost koncentrace dusíku na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.52 - Porovnání vývoje koncentrací metatopolinu a nitrátových iontů v nadzemní části rostliny v textu DP • Graf č.53 - nezařazen do DP • Graf č.54 - Závislost koncentrace ACC na času odběru vzorku nadzemní část rostliny / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.55 - Závislost koncentrace ACC na času odběru vzorku list / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.56 - Závislost koncentrace ACC na času odběru vzorku pupen / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP

125

• Graf č.57 - Závislost koncentrace ACC na času odběru vzorku stolon / část stonku původního jednonodálního segmentu v textu DP • Graf č.58 - Koncentrace ABA v jednonodálním segmentu v textu DP • Graf č.59 - Koncentrace ABA v listu v textu DP • Graf č.60 - Koncentrace ABA ve stonku v textu DP • Graf č.61 - Koncentrace ABA ve stolonu, hlízce a kalusu v textu DP • Graf č.62 - Koncentrace ABA v pupenu v textu DP

10.3. Seznam obrázků • obr. 1 - Odvození regresní funkce pro morfologický pokus s indukcí hlízek na str.24 v textu DP

126

11. ABSTRAKTY

MATEMATICKÁ ANALÝZA VLIVU SNÍŽENÉ DUSÍKATÉ VÝŽIVY NA ZVÝŠENÍ INDUKCE TVORBY HLÍZ IN VITRO U LILKU BRAMBORU (SOLANUM TUBEROSUM L.) MATHEMATICAL ANALYSIS OF DECREASED LEVEL OF NITROGEN NUTRITION ON INCREASING OF INDUCTION OF TUBER FORMATION IN VITRO OF POTATO (SOLANUM TUBEROSUM L.) Z. ŠTĚPÁN1, P. SOLNICKÁ2, M. KLEMŠ3, H. VÍTKOVÁ4, H. FIŠEROVÁ5, I. MOLL6 Abstrakt Tato práce se zabývá matematickou analýzou indukce utváření hlízek pod různými úrovněmi dusíkaté výživy rostlin lilku bramboru metodou in vitro. Cílem je objasnit, zda snížené množství anorganického dusíku v indukčním médiu má vliv na zvýšení indukce hlíz. Stonkové jednonodální segmenty rostlin byly kultivovány in vitro 9 týdnů na Murashige-Skoog médiu, obsahujícím modifikované úrovně anorganického dusíku (10÷12 µM, 40 µM and 65÷70 µM), 80 g.l-1 sacharózy a 10 mg.l-1 benzylaminopurinu. Rovněž byl vzat v úvahu vliv vnějších faktorů a alokace živin a minerálních látek na proces vzniku hlízek. Výsledky byly zpracovány statistickými a matematickými metodami jako například dvoufaktorovou analýzou variancí s následným testováním podle Tukeye, Friedmanovým neparametrickým testem s mnohonásobným porovnáváním podle Neményiho a k určení parametrů zvolené regresní funkce byla využita metoda minimálních čtverců. Klíčová slova Utváření hlízek, lilek brambor, abscisová kyselina, matematické a statistické metody, doba fyziologické přípravy na tvorbu hlízek

1

Bc. Zdeněk Štěpán, student N-FYTO-F, AF MZLU v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno [email protected] 2 Ing. Pavla Solnická, Ústav biologie rostlin, AF MZLU v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, [email protected] 3 Ing. RNDr. Marek Klemš, Ph.D., Ústav biologie rostlin, AF MZLU v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, [email protected] 4 Helena Vítková, prom.biol., Ústav biologie rostlin, AF MZLU v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, [email protected] 5 Dr. Ing. Helena Fišerová, Ústav biologie rostlin, AF MZLU v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, [email protected] 6 RNDr. Ivo Moll, CSc., Ústav statistiky a operačního výzkumu, PEF MZLU v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, [email protected]

127

Abstract This work deals with the mathematical analysis of induction of tuber formation under different levels of nitrogen sustenance of potato plants by method in vitro, the aim is to clear that if nitrogen in this conditions inhibits or inducts the tuber formation. Stem nodal segments of potato plants were cultivated in vitro 9 weeks on Murashige-Skoog medium containing modified level of inorganic nitrogen (10÷12 µM, 40 µM and 65 ÷70 µM), 80 g.l-1 sucrose and 10 m g.l-1 benzylaminopurine. It was also considered the influence of external factors and allocation of the nutrients and mineral substances to the process of tuber formation. Cultures with low nitrogen level in induction medium showed higher frequency of tuber formation. Results were processed by statistic method like two-factor analysis of variance, Tukey's test was used in conjunction with the ANOVA to find which means are significantly different from one another and nonparametric Friedman's test was used with multiple comparisons according to Nemenyi. For determination parameters of well taken regression function was used least squares method. These evaluations confirmed correct hypothesis about nitrogen sustenance on the induction of potato tuber formation. Results were processed by statistic and mathematical methods. Key words Tuber formation, potato plant, abscisic acid, mathematical and statistic methods, term of adjustment for tuber formation.

128

MATHEMATICAL AND STATISTICAL ANALYSIS OF THE MAGNITUDE OF NITROGEN AS ONE OF THE NUTRIENTS OF INDUCTIOANL MEDIUM BY TUBERIZATION OF POTATO IN VITRO MATEMATICKO-STATISTICKÁ ANALÝZA VÝZNAMU DUSÍKU JAKO JEDNOHO Z NUTRIENTŮ INDUKČNÍHO MÉDIA PŘI TUBERIZACI LILKU BRAMBORU IN VITRO Štěpán Zdeněk, školitel Marek Klemš Ústav biologie rostlin, Fakulta agronomická, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika E-mail: [email protected], [email protected] _____________________________________________________________________________________________ ABSTRACT This work deals with the mathematical analysis of induction of tuber formation under different levels of nitrogen sustenance of potato plants by method in vitro, the aim is to clear that if nitrogen in this conditions inhibits or inducts the tuber formation. Stem nodal segments of potato plants were cultivated in vitro 9 weeks on Murashige-Skoog medium containing modified level of inorganic nitrogen (10÷12 µM, 40 µM and 65 ÷70 µM), 80 g.l-1 sucrose and 10 m g.l-1 benzylaminopurine. It was also considered the influence of external factors and allocation of the nutrients and mineral substances to the process of tuber formation. Cultures with low nitrogen level in induction medium showed higher frequency of tuber formation. Results were processed by statistic method like two-factor analysis of variance, Tukey's test was used in conjunction with the ANOVA to find which means are significantly different from one another and non-parametric Friedman's test was used with multiple comparisons according to Nemenyi. For determination parameters of well taken regression function was used least squares method. These evaluations confirmed correct hypothesis about nitrogen sustenance on the induction of potato tuber formation. Results were processed by statistic and mathematical methods. Key words Tuber formation, potato plant, abscisic acid, mathematical and statistic methods, term of adjustment for tuber formation. Acknowledgement This research was supported by the Grant Agency of AF MUAF Brno (IGA 19/2009).

129

POUŽITÍ STATISTICKÝCH A MATEMATICKÝCH METOD PŘI ANALÝZE FAKTORŮ OVLIVŇUJÍCÍCH HOMEOSTÁZI FYTOHORMONŮ. Z. ŠTĚPÁN7, P. SOLNICKÁ8, M. KLEMŠ9, H. VÍTKOVÁ10, H. FIŠEROVÁ11, I. MOLL12

Abstrakt Tato práce se zabývá matematickou analýzou indukce utváření hlízek pod různými úrovněmi dusíkaté výživy rostlin lilku bramboru metodou in vitro. Cílem je objasnit, zda snížené množství anorganického dusíku v indukčním médiu má vliv na zvýšení indukce hlíz. Stonkové jednonodální segmenty rostlin byly kultivovány in vitro 9 týdnů na Murashige-Skoog médiu, obsahujícím modifikované úrovně anorganického dusíku (10÷12 µM, 40 µM and 65÷70 µM), 80 g.l-1 sacharózy a 10 mg.l-1 benzylaminopurinu. Rovněž byl vzat v úvahu vliv vnějších faktorů a alokace živin a minerálních látek na proces vzniku hlízek. Výsledky byly zpracovány statistickými a matematickými metodami jako například dvoufaktorovou analýzou variancí s následným testování podle Tukeye, Friedmanovým neparametrickým testem s mnohonásobným porovnáváním podle Neményiho a k určení parametrů zvolené regresní funkce byla využita metoda minimálních čtverců.

Klíčová slova Utváření hlízek, lilek brambor, abscisová kyselina, matematické a statistické metody, doba fyziologické přípravy na tvorbu hlízek

Reference ABDULAH, Z.N. and AHMAD, R. (1980): Effect of ABA and GA3 on tuberization and some chemical constituent of potato. Plant Cell Physiol. 21:1343-1346. ATKINSON, D., GEARY, B., STARK, J., LOVE, S. and WINDERS, J. (2003): Potato varietal responses to nitrogen rate and timing. Western Nutrient Management Conference, Salt Lake City, Utah, USA, Vol. 5:149-155. CRAMER, M.D., SCHIERHOLT, A., WANG, Z. and LIPS, S. H. (1995): The influence of salinity on the utilization of root anaplerotic carbon and nitrogene metabolism in tomato seedlings. J. Exp. Bot. 46:1569-1577. FISEROVA, H. and HRADILIK, J. (1994): Ethylene and ethane production during adventitious root-formation on vine stem segments. Rost. Vyr. 40 (8): 755-762. GREGORY L.E. (1956): Some factors for tuberization in the potato. Ann. Bot. 41: 281– 288. KRAUSS, A. (1981): Abscisic acid and gibberelic acid in growing potato tubers. Pot. Research 24(4):435-439. LIKEŠ J., A LAGA J. (1978): Základní Statistické tabulky, SNTL n.p., Praha Spálená 51 LIPS, S. H., BEN ZIONI, A. and VAADIA, Y. (1970): K+ recirculation in plants and its importance for adequate nitrate nutrition. In: R. M. SAMISH (Ed) Recent Advances in Plant Nutrition. Gordon and Breach Science Publishers. New York - London - Paris. pp. 207-215. MACHACKOVA, I., KONSTANTINOVA, T.N., SERGEEVA, L.I., LOZHNIKOVA, V.N., GOLYANOVSKAYA, S.A., DUDKO, N.D., EDER, J. and AKSENOVA, N.P. (1998): Photoperiodic control of growth, development and phytohormone balance in Solanum tuberosum. Physiol. Plant. 102:272-278. MINGO-CASTEL, A. M., SMITH, O. E. and KUMAMOTO, J. (1976): Plant Physiol. 57: 480-485.

7

Bc. Zdeněk Štěpán, student N-FYTO-F, AF MZLU v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno [email protected] 8 Ing. Pavla Solnická, Ústav biologie rostlin, AF MZLU v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, [email protected] 9 Ing. RNDr. Marek Klemš, Ph.D., Ústav biologie rostlin, AF MZLU v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, [email protected] 10 Helena Vítková, prom.biol., Ústav biologie rostlin, AF MZLU v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, [email protected] 11 Dr. Ing. Helena Fišerová, Ústav biologie rostlin, AF MZLU v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, [email protected] 12 RNDr. Ivo Moll, CSc., Ústav statistiky a operačního výzkumu, PEF MZLU v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, [email protected]

130

The level of abscisic acid, cytokinins and ethylene production during tuber formation of potato (Solanum tuberosum L.) in vitro Klemš, M., Štěpán, Z., Fišerová, H., Solnická, P., Vítková, H., Procházka, S. Department of Plant Biology, Mendel University of Agriculture and Forestry in Brno, Zemědělská 1, Brno 613 00, Czech Republic The aim of this study was to determine the level of abscisic acid, cytokinins, ethylene and CO2 production during potato microtubers formation in vitro. Stem nodal segments of potato plants were cultivated in vitro for 8 weeks on Murashige-Skoog medium containing modified level of inorganic nitrogen (10-12 µM or 65-70 µM), 80 g.1-1 sucrose and 10 mg.l-1 benzylaminopurine. Cultures with low nitrogen level in induction medium showed higher frequency of tuber formation, but high content of nitrogen increased the fresh weight of tubers. During induction of tuber formation (first two weeks of cultivation) nodal segments produced ethylene and increased level of cytokinins. Later ethylene production inhibited the growth of stolons and tuber formation. Higher level of abscisic acid was determined in leaves, later in stolons and tubers on nodal segments cultivated on induction medium with low level of nitrogen.

Acknowledgement This research was supported by the Grant Agency of AF MUAF Brno (IGA 19/2009).

131

THE INTERACTION OF ABSCISIC ACID AND ETHYLENE DURING TUBER FORMATION OF POTATO (Solanum tuberosum L.) IN VITRO INTERAKCE KYSELINY ABSCISOVÉ A ETYLÉNU V PROCESU TVORBY HLÍZ LILKU BRAMBORU (Solanum tuberosum L.) IN VITRO Marek KLEMŠ − Zdeněk ŠTĚPÁN − Anna BRADÁČOVÁ − Pavla SOLNICKÁ − Helena VÍTKOVÁ − Helena FIŠEROVÁ The objective of this study was to determine the level of abscisic acid, ethylene and CO2 production during potato microtubers formation in vitro. Stem nodal segments of potato plants were cultivated in vitro 8 weeks on MurashigeSkoog medium containing modified level of inorganic nitrogen (10-12 µM or 65 -70 µM), 80 g/1 sucrose and 10 mg/l benzylaminopurine. Cultures with low nitrogen level in induction medium showed higher frequency of tuber formation. During induction of tuber formation (first two weeks of cultivation) nodal segments produced ethylene. Later ethylene production inhibited the growth of stolons and tuber formation. Higher level of abscisic acid was determined in leaves, later in stolons and tubers on nodal segments cultivated on induction medium with low level of nitrogen. Key words: tuberization, abscisic acid, ethylene, potatoes

132

THE CHANGES OF ABSCISIC ACID LEVEL AND ETHYLENE PRODUCTION DURING TUBER FORMATION OF POTATO (Solanum tuberosum L.) IN VITRO Dundálková L., Štěpán Z., Bradáčová A., Klemš M., Vítková H. a Fišerová H. Ústav Biologie rostlin, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika

ABSTRACT The objective of this study was to determine the relationships between the level of abscisic acid, ethylene and CO2 production and potato microtubers formation in vitro. Stem nodal segments of potato plants were cultivated in vitro 8 weeks on MurashigeSkoog medium containing modified level of inorganic nitrogen (10-12 µM or 65 -70 µM), 80 g/1 sucrose and 10 mg/l benzylaminopurine. Cultures with low nitrogen level in induction medium showed higher frequency of tuber formation. During induction of tuber formation (first two weeks of cultivation) nodal segments produced ethylene. Later ethylene production inhibited the growth of stolons and tuber formation. Higher level of abscisic acid was determined in leaves, later in stolons and tubers on nodal segments cultivated on induction medium with low level of nitrogen.

Key words: tuber formation, abscisic acid, ethylene, potato

12. PŘÍLOHY A TABULKOVÁ ČÁST

133