Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění hospodářských zvířat
Odběr ejakulátu psů a jeho hodnocení Bakalářská práce
Vedoucí práce:
Vypracovala:
Ing. Martin Hošek, Ph.D.
Alice Bláhová Brno 2011
1
zadání Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně
Agronomická
Ústav chovu a šlechtění zvířat
fakulta
2010/2011
ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE
Autorka práce:
Alice Bláhová
Studijní program:
Zootechnika
Obor:
Zootechnika
Název tématu:
Odběr ejakulátu psů a jeho hodnocení
Rozsah práce:
30-40 stran textu a přílohy
Zásady pro vypracování:
1 Studentka se ve své BP zaměří na reprodukční soustavu psa - samce, popíše její sloţení a řízení jejích . funkcí. 2 Popíše dále metody odběru ejakulátu a metody jeho hodnocení, kdy se zaměří hlavně na . makroskopické a mikroskopické hodnocení. 3 Studentka se bude aktivně účatnit získávání a vyhodnocování dat potřebných pro navázání a úspěšné . zvládnutí vypracování DP.
Seznam odborné literatury:
1 DOSTÁL, J. Genetika a šlechtění plemen psů. České Budějovice: Dona, 2007. 261 s. ISBN 978-80. 7322-104-1. 2 DOSTÁL, J. Chov psů : Genetika v kynologické praxi. České Budějovice: DONA, 1995. 206 s. ISBN . 80-85463-58-X.
2
3 . 4 .
Cab Abstracts, 2000—2005
Kliment, J. Reprodukcia hospodárských zvierat, 1983, 396s.
5 Louda, F. Inseminace hodpodářských zvířat se základy biotechnických metod. ČZU Praha, 2001, 224s. . ISBN 80--213--0702—1 6 .
Louda, F. Reprodukce hospodářských zvířat, návody do cvičení, 1984, 270s.
Datum zadání bakalářské práce:
říjen 2009
Termín odevzdání bakalářské práce:
duben 2011
Alice Bláhová
Ing. Martin Hošek, Ph.D.
řešitelka
vedoucí práce
prof. Ing. Ladislav Máchal, DrSc. vedoucí ústavu
3
Prohlášení: Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci na téma Odběr ejakulátu psů a jeho hodnocení, vypracovala samostatně a pouţila jsem jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. Dne……………………………………………… Podpis diplomanta……………………………….
4
PODĚKOVÁNÍ Děkuji Ing. Martinu Hoškovi, Ph.D., za odborné vedení a poskytnuté konzultace při zpracování bakalářské práce. Dále děkuji za odborné konzultace Ing. Marii Vágenknechtové.
5
Abstrakt: Bakalářská práce se zabývá převáţně popisem reprodukčních orgánů psa samce, ejakulátu, laboratorních metod pouţívaných k vyšetření čerstvého ejakulátu a vybraných faktorů, které ovlivňují plodnost. Dále je nastíněna metodika, tzn. postup vyšetření ejakulátů psů. Na bakalářskou práci bude navazovat práce diplomová, ve které budou popsány výsledky a závěry sledování. Klíčová slova: reprodukční orgán, ejakulát, vyšetření
Abstract: The aim of bachelor thesis is description of male dog reproduction organs, physiology of dog reproduction include endocrinological status. Other chapters describe natural mating, semen collecting, ejaculate evaluation and arteficial insemination of dogs. The main factors influenced the semen quality parameters are discussed. The most often reproduction diseases and probleme are described too. The methods of dog semen evaluation are designed as part of consecutive diploma thesis. Key words: reproduction organs, dog semen, evaluation
6
OBSAH 1
ÚVOD ...................................................................................................................................................... 9
2
CÍL PRÁCE: ......................................................................................................................................... 10
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED ..................................................................................................................... 11 3.1
ANATOMIE POHLAVNÍCH ORGÁNŮ PSA ........................................................................................... 11
3.1.1
Varlata ................................................................................................................................. 11
3.1.2
Šourek .................................................................................................................................. 12
3.1.3
Chámovody .......................................................................................................................... 12
3.1.4
Prostata ............................................................................................................................... 12
3.1.5
Penis .................................................................................................................................... 13
3.1.6
Předkožka ............................................................................................................................ 13
3.2
FYZIOLOGIE POHLAVNÍ FUNKCE PSA .............................................................................................. 13
3.2.1
Puberta až stáří.................................................................................................................... 13
3.2.2
Vlastnosti ejakulátu ............................................................................................................. 14
3.3
KRYTÍ ............................................................................................................................................ 14
3.3.1
Určení nejvhodnější doby krytí ............................................................................................ 14
3.3.2
Průběh Krytí ........................................................................................................................ 14
3.3.2.1
Námluvy ......................................................................................................................................... 15
3.3.2.2
Vzeskok.......................................................................................................................................... 15
3.3.2.3
Zasunutí.......................................................................................................................................... 15
3.3.2.4
Počátek svázání .............................................................................................................................. 15
3.3.2.5
Rozvázání ....................................................................................................................................... 16
3.3.3 3.4
Frekvence Krytí ................................................................................................................... 16
UMĚLÁ INSEMINACE ...................................................................................................................... 16
3.4.1
Odběr semene ...................................................................................................................... 17
3.4.2
Technika umělé inseminace ................................................................................................. 18
3.4.3
Konzervace semene .............................................................................................................. 20
3.5
LABORATORNÍ VYŠETŘENÍ ............................................................................................................. 21
3.5.1 3.5.1.1
3.6
Získávání a vyšetření ejakulátu ............................................................................................ 21 Příčiny neúspěchu při odběru ejakulátu......................................................................................... 23
ZÁKLADNÍ METODY VYŠETŘENÍ EJAKULÁTU .................................................................................. 23
3.6.1
Makroskopické vyšetření...................................................................................................... 23
3.6.1.1
Barva ejakulátu .............................................................................................................................. 24
3.6.1.2
Stanovení pH .................................................................................................................................. 24
3.6.2
Mikroskopické vyšetření ejakulátu ....................................................................................... 24
3.6.2.1
Motilita spermií .............................................................................................................................. 24
3.6.2.2
Koncentrace spermií ....................................................................................................................... 25
3.6.2.3
Morfologie spermií......................................................................................................................... 26
3.6.3
Stanovení aktivity alkalické fosfatázy semenné plazmy ....................................................... 27
3.6.4
Mikrobiologické vyšetření pohlavního aparátu a ejakulátu psů .......................................... 27
3.6.4.1
Stanovení koncentrace hormonů .................................................................................................... 28
7
3.7
3.6.4.2
Endokrinologické funkční testy...................................................................................................... 29
3.6.4.3
Aspirace varlat ............................................................................................................................... 30
3.6.4.4
Aspirace nadvarlat ......................................................................................................................... 30
3.6.4.5
Biopsie varlat ................................................................................................................................. 31
3.6.4.6
Karyotypizace ................................................................................................................................ 32
FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ KVALITU EJAKUTÁLU ................................................................................ 32
3.7.1
Puberta ................................................................................................................................ 32
3.7.2
Roční období ........................................................................................................................ 32
3.7.3
Velikost prostaty a patologické stavy prostaty ..................................................................... 32
3.7.4
Velikost varlat ...................................................................................................................... 33
3.8
NEJČASTĚJŠÍ ABNORMALITY, NEMOCI A ZÁKROKY SPOJENÉ S POHLAVNÍM APARÁTEM .................. 33
3.8.1
Krvácení z penisu ................................................................................................................. 33
3.8.2
Fimóza: ................................................................................................................................ 33
3.8.3
Zánět předkožky: .................................................................................................................. 33
3.8.4
Zánět varlat a šourku: ......................................................................................................... 34
3.8.5
Zbytnění prostaty: ................................................................................................................ 34
3.8.6
Kryptorchismus: .................................................................................................................. 34
3.8.7
Kastrace psů ........................................................................................................................ 35
4
ZÁVĚR .................................................................................................................................................. 36
5
LITERATURA ...................................................................................................................................... 37
6
PŘÍLOHY ......................................................................... CHYBA! ZÁLOŢKA NENÍ DEFINOVÁNA.
8
1
ÚVOD Důvodů proč chováme psy je v dnešní době několik. Jedním z důvodů je vyuţití
společenské. V současné době je pro člověka významné uplatnění asistenčních psů pro tělesně postiţené, nebo psů canisterapeutických a záchranářských. Dále chováme psy pro pracovní vyuţití tj. na ostrahu majetku, ovládání stád, nebo ve sluţbách bezpečnostních sloţek. Chováme psy téţ pro účely myslivosti a sport. Pro produkci jedinců pro naše účely je nezbytné mít kvalitní chovný materiál, jak feny, tak i psy, u kterých je důleţitá produkce kvalitního ejakulátu. Pro produkci kvalitního ejakulátu je nezbytné kontrolovat reprodukční schopnost psa. Tuto kontrolu provádíme jednak kontrolou zabřezávání po plemeníkovi. Další moţností jak zkontrolovat reprodukční schopnost psa je laboratorní vyšetření ejakulátu psa, toto vyšetření by mělo proběhnout před zařazením psa mezi chovné jedince. A dále pak při delší reprodukční pouze, před jeho opětovným vyuţitím. Dalším důvodem odběru semeno je vyuţití plemeníka v inseminaci. Tato biotechnologická metoda si získává stále větší oblibu mezi chovateli zejména pro svoji ekonomickou výhodnost.
9
2
CÍL PRÁCE: Cílem bakalářské práce je popis reprodukčních orgánů psa – samce, dále popis
fyziologie pohlavních funkcí psa, průběhu krytí, odběru ejakulátu a laboratorních metod určených k vyšetření čerstvého ejakulátu. Zhodnoceny budou i faktory ovlivňující kvalitu ejakulátu a další vlivy působící na plodnost psů samců.
10
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1 Anatomie pohlavních orgánů psa 3.1.1 Varlata Varle je párová samčí pohlavní ţláza vejčitého tvaru, která je uloţena v šourku. Ve varlatech vznikají spermie a pohlavní hormony (androgeny, testosteron). Zárodečné buňky, ze kterých vznikají spermatozoa, stále dělí v průběhu ţivota. Součástí varlete je nadvarle, tam se spermie hromadí a dozrávají. V nadvarleti se zahušťuje sperma a zajištˇuje se výţiva pro zralé spermie, které čekají na dobu páření. V době klidu dochází k tzv. anabióze, tzn. zimnímu spánku spermií. Dojde-li ke krytí, rychle se vzbudí a jsou připraveny splnit svou úlohu, jestli ne, po 1-2 měsících zaniknou a dojde k jejich resorpci (Marvan, 2007) Velikost varlat závisí na velikosti plemene průměrně jsou velká 3 x 2 x 1,5 cm. V šourku je nízká teplota, je důleţitá pro správný vývoj spermií, je udrţována několika mechanismy (Čtyroká, 2002). Varlata jsou nejčastějším orgánem postiţeným rakovinou u psů-samců. Varle by nemělo být na pohmat ani příliš měkké, nemělo by obsahovat ani ţádné ztvrdlé shluky. Pokud se v jednom varleti objeví rakovinový nádor, stane se nefunkční a druhé varle ho plně nahradí a pes zůstává plodný. Veterinární vyšetření varlete se provádí ultrazvukem, při podezření na nádor se provádí biopsie. V ejakulátu se přítomnost nádoru nepozná, spermie leţí dlouhou dobu v nadvarleti, změny se poznají za 1 - 2 měsíce. K tvorbě poškozených, nefunkčních spermií a sníţení počtu
dochází při horečnatých
onemocnění, při vyčerpání psa, nadměrném zatíţení organismu, nebo při váţném zranění. Zdravá varlata mohou být stejně velká, obvykle bývá jedno menší neţ druhé a jedno bývá v šourku uloţeno o trochu výš. V dospělosti by se velikost, tvar a uloţení nemělo výrazně pozměnit. Zmenšené varle znamená zmenšení hmoty semenotvorných kanálků, tím je vytvořen menší prostor pro tvorbu spermií a dochází ke sníţení plodnosti psa. Zvětšování varlete je způsobeno nádorovým bujením, otoky spojenými se záněty z různých příčin. (Čtyroká, 2002).
11
3.1.2 Šourek Šourek, slouţí jako mechanická ochrana pro varlata a nadvarlata, která jsou v něm uloţena. Zajišťuje termoregulaci a je to oblast sexuálního dráţdění. Šourek je snadno zranitelný, dochází - li k jeho styku se zemí a okolním prostředím, mohou se projevit různé alergie. Dojde- li k zánětu, znamená to zvýšení teploty a dochází tak k poruše funkce varlat (Čtyroká, 2002). 3.1.3 Chámovody Chámovod je párová silnostěnná trubička tloušťky stébla aţ brku, spojující vývod nadvarlete s močovou trubicí. Slouţí k aktivnímu transportu spermií do močové trubice, spermie se v chámovodu mísí se semennou plazmou. Plazmu bez spermií místo ejakulátu získáme pokud nedojde k tvorbě správných a přirozených reflexů potřebných pro uvolnění spermií z nadvarlat do chámovodů to se můţe přihodit například při umělém odběru semene pro inseminaci, kdy vyděšený pes ani neví, co se s ním děje. Top je způsobené tzv. stresovými faktory. Nezkušenému psu můţeme pomoci přítomností feny a šetrným zacházením (Čtyroká, 2002). 3.1.4 Prostata Prostata je velmi důleţitou, napárovou a jedinou přídatnou pohlavní ţlázou psa. Nachází se v pánvi a obklopuje močovou rouru asi 1 cm za jejím vyústěním z močového měchýře. Prostata je symetrická, rozdělená na dvě poloviny. V dospělosti dosahuje velikosti 1,4 – 1,9 cm aţ 2,5 – 2,8 cm. Během ejakulace má za úkol vytvářet sekret, který vytváří příznivé prostředí v močové rouře pro spermie a v pohlavním aparátu feny. (Kvapil, Kvapilová, 2007) Sekret spermie vyţivuje, aktivuje a chrání před bakteriemi, upravuje prostředí a ředí ejakulát. U prostaty můţe dojít k zánětům, nádorovému bujení, zhoubnému, nebo nezhoubnému, mohou se zde vytvořit cysty nebo prostatické kameny. Jestliţe dojde k nějaké z těchto poruch, onemocnění, pak tato ţláza ztrácí svou funkci a neuvolní se sekret, spermie se neaktivují, zůstávají v nefunkční podobě a nejsou schopné oplodnit vajíčko. Prostata se nejčastěji vyšetřuje palpací, ultrazvukem, rentgenem a sekret se vyšetřuje cytologicky a bakteriologicky. Příznaky onemocnění se objevují obvykle v podobě s problémů s močením, krev moči a pod., s trávicími potíţemi - ztíţené kálení, tenké výkaly s krví, zácpa nebo průjem, zvracení, s
12
potíţemi pohybovými - kulhání, bolesti při zvedání a uléhání; zvýšená teplota, dušnost, apatie, nechutenství a hubnutí (Čtyroká, 2002). 3.1.5 Penis Penis psa, pyj, je kopulačním orgánem psa, kterým prochází močová trubice. Tvoří ho dlouhý ţalud a topořivé těleso, který obkruţuje zadní část pyjové kosti, která tvoří podpěru penisu, pyjová kost můţe dosahovat délky aţ 10 cm. Topořivé těleso při krytí zajišťuje svázání psa s fenou. Pyj je důleţitý pro vpravení spermatu do pochvy. Při páření jsou důleţitá dvě topořivá tělesa, uloţena na zadním konci pyjové kosti, tzv. ţaludové uzly. Pyj je uloţen v předkoţce, která chrání tento pohlavní orgán (Čtyroká, 2002). 3.1.6 Předkožka Předkoţka je ochranný koţní vak a chrání tělo penisu a vyústění močové roury. „Skládá se z vnějšího listu, který se při předkoţkovém otvoru vchlipuje dovnitř a přechází ve vnitřní list―. Vnější list je pokryt ochlupenou kůţí a vnitřní list tvoří hladká kůţe bez chlupů, která obsahuje drobné uzlíčky mízního systému (Marvan, 2007). Přechod vnitřní části předkoţky na povrch penisu tvoří prstenec ţlaznaté tkáně, která zabezpečuje zvlhčení vnitřního prostředí předkoţkového vaku. Pokud penis z předkoţky trvale vyčnívá, jedná se o genetickou vadu, penis se vysušuje, mechanicky poškozuje, je zdrojem infekce a ztrácí své funkce. Je neţádoucí s takovým psem krýt. Často dochází k zánětu předkoţky (Čtyroká, 2002).
3.2
Fyziologie pohlavní funkce psa
3.2.1 Puberta až stáří Dosaţení puberty u psů i u fen je dána dosaţením určitého stupně aktivity neurohormonální činností. U psů jde o dostatečnou sekreci hormonu testosteronu, ten se tvoří ve varlatech na základě vlivu hormonů z podvěsku mozkového. Testosteron ovlivňuje tvorbu spermií, vývoj sekundárních pohlavních znaků psa a jeho chování. Psi dosahují puberty kolem 9. měsíce, později neţ feny. V pubertě naplno začíná produkce spermií a tímto se pes stává plodným. Spermie se tvoří v průběhu celého ţivota psa (Kvapil, Kvapilová, 2007). 13
3.2.2 Vlastnosti ejakulátu Ejakulát tvoří spermie a sekret přídatných pohlavních ţláz, u psa jde o sekret prostaty. Objem ejakulátu je variabilní a kolísá podle plemene, věku, velikosti psa, frekvence krytí a stupně vydráţdění. Běţný objem ejakulátu je 1 – 40 ml. Barva závisí na hustotě a konzistenci ejakulátu pohybuje se v odstínech od šedivé aţ bílé barvy (Kvapil, Kvapilová, 2007).
3.3 Krytí Krytí je náročné jak pro psa, tak pro fenu. Organismus feny musí čelit cizorodým látkám - bakteriím, spermiím a jejich zbytkům, které se dostanou dovnitř, musí je vstřebat, vyplavit a organismus vyčistit. Kryjeme-li fenu vícekrát za sebou její organismus se můţe začít bránit a vypudit tak i oplozené vajíčko (Čtyroká, 2002). U krytí se ve většině případů spermie nesetkají s vajíčkem ve stavu schopném oplození. Spermie musí počkat na dozrání vajíčka. Proto mají spermie schopnost vyčkat na dozrání vajíčka v kapacitovaném stavu ve vejcovodech 4 aţ 6 dní. Z toho vyplývá, ţe termín krytí nelze povaţovat za termín oplození (Kvapil, Kvapilová, 2007). 3.3.1 Určení nejvhodnější doby krytí Pro určení nejvhodnější doby krytí, je nutné znát fyziologický průběh hárání. Abychom mohli stanovit, kdy bude doba krytí nejvhodnější určujeme ji pomocí laboratorních metod, tím získáme přesný termín ovulace vajíček, nebo přirozeným a nejjednoduším způsobem – zkušeným plemeníkem (Šebková, 2010). Vyšetření jsou přesná pro stanovení úspěšné doby krytí. Úspěšnost doby krytí a inseminací vedených pomocí poševní cytologie a progesteronového testu dosahuje aţ 95% (Kvapil, Kvapilová, 2007). 3.3.2 Průběh Krytí Důleţitou podmínkou pro úspěšné krytí je pro psa klidné, domácí prostředí. Při pohlavním aktu, je sperma deponováno do přední třetiny pochvy, v těsné blízkosti děloţního krčku. Zde se v malé prohlubni hromadí sperma a odtud se spermie jednak svým pohybem a pomocí nasávacích pohybů dělohy dostávají přes děloţní krček a dělohu do místa oplození vajíčka (Kvapil, Kvapilová, 2007).
14
Vlastní krytí můţeme rozdělit na fáze, které probíhají za sebou: námluvy, vzeskok, zasunutí, počátek svázání, svázání a rozvázání (Kvapil, Kvapilová, 2007). 3.3.2.1 Námluvy Po prvním kontaktu psa s fenou probíhají námluvy. Fena vylučuje feromony, které jsou nejvíce produkovány v análních ţlázkách
a v pochvě pomocí kterých je pes
stimulován. Pes fenu očichá a líţe oblast přezky. Fena se většinou staví zádí ke psovi, v této poloze ztuhne, ocas dá na stranu, tím zpřístupní přezku psovi (Kvapil, Kvapilová, 2007). 3.3.2.2 Vzeskok Po seznámení s fenou pes vyskočí na fenu, chytne ji hrudními končetinami kolem beder a začne provádět vyhledávací a kopulační pohyby (Kvapil, Kvapilová, 2007).
3.3.2.3 Zasunutí Po nalezení vchodu do pohlavních orgánů feny vsune pes svůj penis do pochvy feny. Vlastní vsunutí penisu do pochvy umoţňuje první fáze erekce. Po zasunutí penisu do pochvy feny jsou kopulační pohyby silnější a hlubší. Tato a předchozí fáze se před vlastním svázáním mohou několikrát opakovat. Také z penisu psa můţe odkapávat první frakce ejakulátu, která neobsahuje spermie, je to sekret z prostaty (Kvapil, Kvapilová, 2007). 3.3.2.4 Počátek svázání V této fázi je dosaţeno erekce. Kdyţ je penis zaveden do pochvy, vykoná pes několik frikčních pohybů, během, kterých je předkoţka staţena přes bulbus penisu (ţaludový uzel), ten se zvětší, jak se ocitne v pochvě. Tímto momentem nastává svázání. U mnoha případů v této fázi dochází k rotaci psa a feny, tzn., ţe stojí záděmi k sobě. Svázání můţe trvat 5 minut aţ jednu hodinu, průměrně to bývá kolem 20 minut. Délka svázání nemá vliv na výsledek krytí (Šebková, 2010).
15
3.3.2.5 Rozvázání Po odpadnutí zvětšení bulbus penis se fena a pes rozpojí. Není to nutné feně bránit v močení, protoţe většina semene je transportována do dělohy a vejcovodů během svázání. Pokud se psi kryjí v optimální době, první spermie jsou ve vejcovodech do 15min. po svázání, do 45 minut je zde většina spermií a do 3 hodin je ve vejcovodech všechen potřebný počet spermií pro oplodnění (Kvapil, Kvapilová, 2007). 3.3.3 Frekvence Krytí Počátek, častost a konec vyuţívání psa, nebo feny v chovu u čistokrevných plemen jsou dány předpisy klubu chovatelů daného plemene. Vyuţití psa a feny v chovu ovlivňuje několik faktorů: věk, frekvence, s jakou je pes-samec pouţíván ke krytí, u feny rozhoduje časový interval mezi březostmi (Kvapil, Kvapilová 2007).
3.4 Umělá inseminace Umělá inseminace je alternativní způsob oplodnění, který je
uplatňován
v reprodukci zvířat. U psů většinou převaţují důvody zdravotní, kdy přirozené krytí není moţné. U fen první březost po umělé inseminaci čerstvým semenem dosáhl italský vědec Lazzaro Spallanzani jiţ v roce 1780, se tato metoda dlouho nevyuţívala. Rozvoje dosáhla aţ ve druhé polovině 20. století. První březost po inseminaci fen dlouhodobě konzervovaným (mraţeným) spermatem doloţil v r.1969 S. W. J. Seager v USA. Nejčastějšími důvody, kdy se musí fena uměle inseminovat je nezkušenost psa, předčasná erekce a ejakulace (především se to stává u mladých psů). Další důvody mohou být ortopedické poruchy především na zadních končetinách a na páteři, poranění nebo zánět zevních genitálií, plachost, sníţené libido (hlavně při krytí v neznámém prostředí, při nadměrné exploataci nebo u starých psů). Nejčastější důvody ze strany feny bývá averze vůči vybranému psovi, abnormality genitálií jako zúţená vulva, nebo pochva často v hymenálním prstenci, bolestivost při vaginitidě (zánětu poševní sliznice), celková přecitlivělost nebo agresivita feny. Znemoţnit přirozené krytí můţe rovněţ hustá srst, která překrývá vulvu, výrazný rozdíl ve velikostech zvířat, kluzká podlaha a rušné, stresující prostředí. Při nepoměru ve velikosti zvířat je nutné zváţit inseminaci u nepoměrně většího psa, protoţe v tomto případě je velmi pravděpodobné, ţe velikost a porodní hmotnost štěňat bude vzhledem k feně nadměrně velká a znemoţní 16
tak přirozený průběh porodu. Umělá inseminace se také provádí za účelem prevence přenosu nakaţlivých onemocnění mezi psem a fenou (Doleţel a kol.,2001). 3.4.1 Odběr semene Úspěšné odebrání semene je základní parametr pro vykonání úspěšné inseminace. U psa je moţné semeno odebrat třemi různými způsoby - masáţí pyje (masturbací), umělou pochvou nebo elektroejakulací. Odběr semene provádíme v klidném prostředí. K vzrušení psa nedojde v některých případech z důvodů blízkosti cizího člověka nebo manipulace s pyjem. U takových psů je dobré, aby odběr semene zvládnul sám majitel psa. Odběr semene je dobré provádět v přirozeném vzrušení psa za přítomnosti hárající feny. Za přítomnosti feny se semeno odebírá po vzeskoku psa nebo na stojícím psovi těsně za fenou. Psi, kteří jsou odebírání poprvé můţeme očekávat ztíţený odběr semene. Kvalita semene se zhoršuje při nadměrné exploataci. Při prvním aţ třetím odběru po dlouhém pohlavním klidu. Při dlouhodobém odebírání je přiměřený jeden odběr za 48 hodin. Při nárazovém kaţdodenním odběru je třeba psovi umoţnit po třech dnech nejméně dva dny odpočinku. Pokud je odběr proveden dvakrát v jednom dni, rovněţ by měl následovat dvoudenní odpočinek. Masturbace se vyuţívá k odběru semene u malých plemen psů a u lehce vzrušivých psů. Zprvu se masíruje pyj přes předkoţkový vak a po erekci se pulzačně tiskne za bulbem nebo se dále masíruje rukou v gumové rukavici potřené nespermicidní mastí. Ejakulát se sbírá do široké skleněné nádoby s objemem nejméně 10 - 15 ml (např. Petriho miska) při pokojové teplotě. Není potřeba speciální ohřívání sběrače, protoţe spermie psa nejsou citlivé na chladový šok. Při inseminaci čerstvým semenem lze odebrat celý ejakulát. Pro konzervaci je však potřeba odebrat v maximální míře pouze střední semennou frakci bohatou na spermie, protoţe sekret prostaty negativně působí na přeţitelnost konzervovaných spermií. Začátek ejakulace doprovázejí kopulační (pánevní) pohyby a druhá frakce bohatá na spermie obvykle začíná zklidněním psa a trvá po několik (3 - 5) minut. Včasné zakončení odběru na začátku třetí frakce je moţné na základě průběţné adspekční kontroly odebíraného semene a zjištění přeměny hustého mléčného charakteru semene na řídký, vodnatý. Proto sběrače by měly být průhledné. U středních a velkých plemen psů se nejčastěji k odběru semene pouţívá umělá pochva. V našich podmínkách se nejčastěji vyuţívá typ dvoustěnné gumové trubice o průměru
kolem
8
10
17
cm
a
délce
15 - 20 cm, ke které se na konci připevňuje skleněný sběrač nebo sáček z umělé hmoty s objemem nejméně 10 - 15 ml. Vnitřní stěna umělé pochvy se ohřeje na teplotu 40 - 42 0C napuštěním teplé vody mezi stěny umělé pochvy a vnitřní stěna v přední části umělé pochvy se vymaţe sterilní vazelínou. Podle velikosti psa se upraví vnitřní průměr umělé pochvy nafouknutím vzduchu mezi stěny. Umělá pochva se zavádí na pyj po erekci v přítomnosti hárající feny, při vzeskoku na fenu nebo po předchozí masturbaci. Po zavedení je vhodné umělou pochvou imitovat frikční pohyby do nastoupení vlastních kopulačních pohybů psa. Obdobně jako u předcházejícího způsobu odběru je vhodné odběr zakončit při nástupu třetí semenné frakce. Elektroejakulace se běţně u psů neprovádí. Jde o pulzační dráţdění kříţobederní oblasti přes rektum elektrickým proudem o 5 - 10 V a 50 - 100 mA. Je nezbytné ji provádět v celkové anestézii. Bezprostředně po odběru se semeno nasaje do jednorázové stříkačky a makroskopicky posoudí. Vhodné je semeno vyšetřit i orientačně mikroskopicky po odkápnutí na zahřáté podloţní sklíčko. Semeno psa by mělo mít šedobílou aţ bílou barvu, nevýrazný nebo psí zápach, mléčnou aţ smetanovitou konzistenci (podle získaných frakcí) a nemělo by obsahovat ţádné příměsi. Objem můţe být od 2 do 50 ml. Mikroskopicky by mělo semeno vykazovat bohatý obsah progresivně se pohybujících spermií. Přímočarý pohyb za hlavičkou by měl být minimálně u 70 % spermií. Jestliţe je malý objem (pod 5 ml lze semeno před inseminací pomalu zředit 37 0C teplým fyziologickým roztokem do maximálního poměru 1 : 1. Vhodný objem pro umělou inseminaci čerstvým semenem je 5 - 15 ml. Nadměrně velký objem můţe fenu dráţdit a je tak vytlačován zpět z pohlavních cest. Umělá inseminace nebo další zpracování semene by mělo být provedeno do 10 minut po odběru. Orientační mikroskopické vyšetření (motilita, ţivostnost) před inseminací by mělo být vţdy provedeno i při pouţití konzervovaného semene. Motilita by neměla být niţší neţ 40-50 % u krátkodobě konzervovaného semene
a 30 % u mraţeného semene (Doleţel a
kol.,2001). 3.4.2 Technika umělé inseminace Fena ve správné době k inseminaci se postaví zádí výše a majitel drţí ocas stranou nebo si majitel sedne na ţidli a fenu stojící na předních končetinách hlavou dolů přidrţuje mezi nohama zádí nahoru. Inseminace do pochvy se provádí nejčastěji tenkým plastovým nebo pryţovým katetrem (pipetou) o délce 20 - 25 cm (případně samčím 18
nebo samičím urinárním katetrem), ke kterému se flexibilní spojkou připojí injekční stříkačka se semenem. Po otření vulvy buničitou vatou a rozevření stydkých pysků se katetr nejprve zavádí dorzokraniálním směrem (směr poševní předsíně) a po 3 - 6 cm se změní směr na vodorovný s podélnou osou feny. U středních a velkých plemen lze napřed zavést do poševní předsíně prst ve sterilní gumové rukavici a katetr zavádět po prstu. Podél dorzální stěny se katetr opatrně zavádí aţ pokud nenarazí na zábranu. Odpor k dalšímu pronikání katetru naznačuje, ţe katetr se dostal ke zúţení pochvy poblíţ zevní branky děloţního krčku. Při umělé inseminaci je třeba deponovat semeno co nejblíţe k děloţnímu krčku. Vzhledem k typickému uloţení děloţního krčku (dorzokraniální průběh, zevní branka za výraznou dorzální řasou) je deponovaní semene transcervikálním způsobem do dělohy
technicky náročné a u čerstvého, případně
krátkodobě konzervovaného semene se běţně neprovádí. Po zabránění dalšímu postupu katetru se semeno pomalu vytlačuje do pochvy. Po vytlačení semene se do stříkačky nasaje 2 - 3 ml vzduchu, kterým se vytlačí zbytek semene z katetru. Je vhodné po vyjmutí katetru ponechat fenu se zvýšenou zádí a zavést do poševní předsíně podle velikosti feny 1 - 2 prsty na 10 - 20 minut, případně dráţdit clitoris. Imituje se tak svázání a stimuluje se kontrakční (nasávací) aktivita vývodných pohlavních orgánů. Po inseminaci je vhodné 10 - 15 minut fenu provádět a nenechat ji močit. Další 1 - 2 hodiny by měla být fena v klidu. Při inseminaci mraţeným semenem je vhodné deponovat semeno do dělohy. Transcervikálně lze katetr zavést do dělohy pomocí flexibilního tenkého endoskopu (fibroskopu) nebo lze rigidní (kovový) katetr zavést přes děloţní krček s pomocí manipulace přes stěnu břišní. Je popsána moţnost vyuţití radiografického kontrastního média pro intrauterinní inseminaci. Další moţností je intrauterinní inseminace pomocí laparoskopie v celkové anestézii ve hřbetní poloze zvířete. Insuflace vzduchu se provádí punkcí v mediální linii dutiny břišní přibliţně 1 cm kraniálně od pupku, laparoskop se zavádí v linea alba 1 cm kaudálně od pupku, manipulační klíšťky přitahující děloţní tělo k ventrální břišní stěně se zavádí 2 - 3 cm laterálně od mléčné ţlázy a katetr se semenem se zavádí v linea alba mezi třetí a pátou mléčnou ţlázou. Vyuţití těchto způsobů však limituje příslušné vybavení a speciální nácvik. Úspěšnost umělé inseminace je vţdy menší neţ při přirozeném krytí. Hlavní příčinou jsou pravděpodobně rozdíly v místě deponování semene, objemu a kvalitě semene a ve stimulaci kontrakční aktivity pohlavního traktu. Při přirozeném krytí utěsněný pyj a bulbus pyje zabraňuje zpětnému výtoku velkého objemu semene, který je 19
tak protlačován děloţním krčkem do dělohy. Navíc tzv. svázání vydatně stimuluje kontrakce pochvy, dělohy i vejcovodu a tím nasávání semene do pohlavního traktu. U umělé inseminace tento mechanismus chybí. Úspěšnost umělé inseminace čerstvým semenem se pohybuje kolem 70 - 80 %, při pouţití krátkodobě konzervovaného semene 50 - 60 % a u mraţeného semene pod 40 %. Vyuţití intrauterinní inseminace konzervovaným
semenem
úspěšnost
výrazně
zvyšuje.
Úspešnost
inseminace
konzervovaným semenem (především mrazeným semenem) při deponování semene do pochvy výrazně sniţuje sníţená způsobilost spermií k průniku přes ochranné bariéry v pohlavním traktu feny, především přes děloţní krček. Jako další příčina niţší úspěšnosti inseminace při pouţití konzervovaného (především mraţeného) semene se uplatňuje výrazně kratší přeţivatelnost spermií v pohlavních orgánech feny po inseminaci. Po rozmraţení motilita spermií během hodiny klesá jiţ k nulovým hodnotám. Proto v těchto případech je nezbytné inseminaci provádět v optimálním plodném období feny, nejlépe opakovaně kaţdý den aţ do zakončení tohoto období (Doleţel a kol.,2001). 3.4.3 Konzervace semene Ředidla ke krátkodobé nebo dlouhodobé konzervaci semene obsahují především sloţky, které vykazují ochranný účinek na spermie, dodávají energii a udrţují konstantní pH, osmotický tlak i koncentraci elektrolytů. Pro mraţení jsou nezbytné látky s kryoprotektivním účinkem, které chrání spermie před poškozením zmrazováním nebo rozmrazováním. K ředění semene psa se pouţívají nejčastěji ţloutkocitrátová ředidla, případně s přídavkem bikarbonátu, glukózy nebo fruktózy (nebo laktózy především v případě mraţení), dále TRIS ředidlo se ţloutkem nebo pasterované mléko. Obsah ţloutku v uvedených ředidlech se pohybuje kolem 20 %. Pro delší přechovávání se přidávají antibiotika k zabránění mnoţení mikroflóry. Jako kryoprotektivum se pouţívá glycerol v procentuálním zastoupení 4 - 10 %. Pro ředění semene psa je třeba pouţívat pouze druhou semennou frakci bohatou na spermie. Přítomnost 1. a 3. frakce ve větším mnoţství negativně ovlivňuje přeţívání konzervovaných spermií. Seminální plazmu lze odstranit jako supernatant po odstředění. Ředění je třeba provádět pomalu vţdy způsobem přidávání ředidla do semene. Míra ředění a počet naředěných dávek závisí na kvalitě ejakulátu. Z jednoho odběru je moţné získat 1 - 20 inseminačních dávek. Pro krátkodobou konzervaci se většinou semeno ředí v poměru 1 : 5 aţ 1 : 10. Většinou se ředí tak, aby jeden mililitr 20
obsahoval 150-600 miliónů spermií s progresivním pohybem. Za minimální počet ţivých spermií v pohlavních cestách feny pro oplození se povaţuje 100 - 200 miliónů. Krátkodobá konzervace se provádí ředěním semena a sníţením jeho teploty nejlépe ve skleněných nádobách. Jako příklad sloţení ředidel lze uvést 3,025 g TRIS + 1,7 g kyselina citrónová + 1,25g fruktóza + destilovaná voda do 100 ml + 20 % ţloutek + 1 mg/ml benzylpenicilin a 1 mg/ml dihydrostreptomycin sulfát nebo pasterizované mléko s 0,1 % tuku + 20 %
ţloutek + 1 mg/ml benzylpenicilin a 1 mg/ ml
dihydrostreptomycin sulfát. Sníţení teploty má být pozvolné v průběhu 30 - 60 minut. Teplota se obvykle sniţuje na teplotu v chladničce (3-5 0C) nebo na konstantní teplotu mezi 5 – 15 0C. Takto lze semeno skladovat do pěti dnů. Při transportu by semeno mělo být v termoboxu s konstantní teplotou nepřevyšující 10 0 C. Pro dlouhodobou konzervaci se pouţívají výše uvedená ředidla s přídavkem glycerolu (nejčastěji 6-8 %). Doba ekvilibrace při teplotě 4 0C je 2 - 3 hodiny. Tradiční způsob představuje mraţení na suchém ledě ve formě pelet. Nověji se mraţení provádí v ampulích nebo 0,5 ml pejetách automaticky řízeným chlazením pomalou (0,5 0C/min. do -20 0C a dále 2 0C/min. do -70 0C nebo 1-2 0C/min. do –15 0C a dále 3-5 0C/min. do –50 0C) nebo rychlou metodou (12 - 24 0C/min. do – 70 0C). Je moţné rovněţ po ekvilibraci pejety umístit do kovového válce vychlazeného parami dusíku na -80 aţ –90 0
C na 10 minut a poté přemístit pejety do tekutého dusíku. Při srovnávání různých
rychlostí mraţení vzhledem ke kvalitě semene po rozmraţení byla za nejlepší označena rychlost 30 0C/min. Po zmraţení je semeno uloţeno do tekutého dusíku a zde skladováno do pouţití. Rozmraţení inseminačních dávek bezprostředně před inseminací se obvykle provádí při teplotě 55 0C po dobu 6 sekund, případně při 70 0C po dobu 5 sekund (Doleţel a kol.,2001).
3.5 Laboratorní vyšetření 3.5.1 Získávání a vyšetření ejakulátu Vyšetření ejakulátu je důleţitou metodou v případech subfertility nebo infertility. Provádí se v případech, kdy fena špatně zabřezává, to znamená, je-li méně neţ 75 % fen březích a nebo v případech opakovaného nezabřeznutí různých fen v krátkém časovém období, zvláště kdyţ předtím problémy nebyly zaznamenány.
21
Odběr a vyšetření ejakulátu se můţe také provádět u mladých psů před zařazením do plemenitby, jako pravidelná kontrola. U starších psů pouţívaných v plemenitbě, v průběhu umělé inseminace, před konzervací ejakulátu, po dlouhodobém onemocnění a po pouţití léků. Důkladné vyšetření se doporučuje u psů se suspektní prostatitídou, orchitídou nebo epididymitídou. Protoţe téměř ve všech ejakulátech jsou přítomné ţivé spermie, je nutné šetrné zacházení po odběru, aby nedošlo ke zkreslování výsledků. Nešetrnou manipulací se zvyšuje procento mrtvých a morfologicky poškozených spermií, sniţuje se jejich motilita a závěrečný výsledek vyšetření je pak nesprávný. Ejakulát by měl být vyšetřen bezprostředně po odběru, nemělo by při manipulaci docházet k výrazným teplotním výkyvům a semeno by se mělo skladovat při 37 oC. Při vyšetřování se musí dodrţovat zásady přísné hygieny. Všechny pomůcky, které přicházejí do kontaktu se semenem, musí být důkladně omyté, opláchnuté destilovanou vodou a vysterilizované. Pouţitý laboratorní materiál by měl být zahřátý, čistý, sklíčka neznečistěná alkoholem či jinými desinfekčními roztoky. Ejakulace u psů probíhá ve třech na sobě závislých a ne zcela zřetelně oddělených fází. 1. prespermatická frakce přestavuje 0,2 - 3,0 ml naţloutlé tekutiny z prostaty, která se vylučuje v průběhu kopulačních pohybů psa po dobu 5 - 20 sekund. Tato frakce neobsahuje spermie nebo pouze ojediněle. 2. spermatická frakce představuje 0,5 - 12,0 ml bílé aţ mléčné tekutiny. K jejímu uvolňování dochází po ukončení kopulačních pohybů a po zklidnění psa, při maximálně zduřelém pyji a vylučování trvá 30 sek - 4 minuty. Tato frakce obsahuje spermie. 3. postspermatická frakce představuje 2 -30 ml mírně zkalené tekutiny z prostaty. Vylučuje se v průběhu svázání 5 -15 min a tato frakce uţ většinou neobsahuje spermie. U citlivých jedinců můţe výjimečně docházet, a to i při zachování všech pohlavních reflexů (erekce, pulzace uretry), k částečné nebo úplné retrográdní ejakulaci směrem k močovému měchýři (Doleţel a kol.,2001).
22
3.5.1.1 Příčiny neúspěchu při odběru ejakulátu Na neúspěchu při odběru kvalitního vzorku ejakulátu se můţe podílet řada příčin. Mezi nejběţnější příčiny patří špatná technika vlastního odběru, získávání semene od neobvykle nervózního a přecitlivělého samce a abnormální zasahování majitele v průběhu odběru. Mezi běţné chyby v technice odběru patří nedostatky v předčasném vybavení pyje z předkoţky, nedostatečné přetaţení předkoţky aţ za bulbus glandis, abnormální stisk penisu, pouţívání studených pomůcek (umělá pochva) a doteky na sliznici pyje. Většinou se těmto technickým problémům dá předejít. Dalším běţným důvodem neúspěchu je odběr v neznámém prostředí, zvláště bez přítomnosti majitele a také odběr v přítomnosti agresivní feny. Opakovaná návštěva nebo několikahodinový pobyt v cizím prostředí můţe sníţit strach a následně umoţnit odběr. Odběr by se měl provádět v klidné světlé místnosti, na neklouzavé podlaze a za přítomnosti co nejmenšího počtu lidí. Někteří psi se dají odebrat pouze majitelem, jiní pouze doma a u dalších musí majitel opustit místnost. Řada přidruţených poruch a onemocnění můţe taktéţ znemoţnit odběr. Problémem bývá i odběr u psů se slabým libidem, při bolestivých stavech (chronická arthritis, orchitis) a při abnormálním chování z důvodu předchozí negativní sexuální zkušenosti (Doleţel a kol.,2001).
3.6 Základní metody vyšetření ejakulátu 3.6.1 Makroskopické vyšetření Provádí se ihned po odběru ejakulátu a hodnotí se objem, barva, konzistence a cizí příměsi. Objem ejakulátu je velmi variabilní a silně kolísá podle plemene, věku, velikosti psa, frekvencí
odběru, stupně pohlavního vydráţdění, podmínek odběru a zda se
odchytávají všechny frakce. Normální mnoţství u psa kolísá od 1 do 40 ml. Pro vyšetření je u psa nejdůleţitější zachytit druhou frakci, kterou poznáme podle zakalení. Pokud dojde ke změně vzhledu sekretu ze zakaleného na čirý, pak se jiţ jedná o postspermatickou frakci a zachytávání ejakulátu můţeme ukončit. Objem ejakulátu nemusí vţdy korelovat s plodností psa (Doleţel a kol.,2001).
23
3.6.1.1 Barva ejakulátu Závisí na konzistenci a hustotě ejakulátu a je v odstínech šedivé aţ bílé. Mezi patologické odchylky barvy ejakulátu patří bezbarvý a čirý ejakulát, který je signifikantní pro azoospermii. Ţlutá nebo špinavá barva můţe znamenat o přítomnost moči nebo hnisu. Zelené zabarvení, přítomnost shluků a vloček, doprovází záněty pohlavního aparátu. Příměs krve v ejakulátu vzniká při malých poraněních sliznice penisu, u starších psů především v poslední fázi ejakulace jako důsledek diapedézního krvácení z prostaty, nebo při onemocněních prostaty. Přítomnost krve nemusí vţdy znamenat patologický proces, u psů starších 5ti let jde o běţný nález. U psů, u kterých je dlouhodobé sexuální vzrušení před vlastní kopulací můţe dojít k přechodnému krvácení z prostaty. Při opakovaném nálezu změny barvy ejakulátu, a to i u psů, kteří nevykazují onemocnění pohlavního aparátu, je nutné důkladné vyšetření. Pokud ejakulát změní barvu způsobené příměsí např. moči, nebo krve můţe to způsobit sníţení koncentrace, motility a ţivotnosti spermií (Doleţel a kol.,2001). 3.6.1.2 Stanovení pH Normální pH ejakulátu
je v rozmezí 6,3 - 6,7 a záleţí, jestli se odebírala i
prostatická frakce, která má pH 6,0 - 7,4. Zásaditá reakce sekretu prostaty zvyšuje motilitu spermií a neutralizuje kyselé prostředí v pochvě. Ke zvýšení pH dochází v případech, kdyţ je nekompletní ejakulace a při zánětech varlat, nadvarlat a prostaty (Doleţel a kol.,2001). 3.6.2 Mikroskopické vyšetření ejakulátu 3.6.2.1 Motilita spermií Individuální
pohyblivosti spermií by se měla posoudit co nejdříve po získání
ejakulátu. Kapka ejakulátu se nanese na předehřáté čisté podloţní sklíčko, přikryje se krycím sklíčkem a hned se vyšetřuje pod mikroskopem při 100 aţ 400 násobném zvětšení. Hodnotí se fyziologický pohyb jednotlivých spermií, který je nepřerušovaný, pravidelný a spermie se pohybuje dopředu za hlavičkou. Spermie s patologickým pohybem se točí do kruhu, kývají se ze strany na stranu, točí se okolo hlavičky, nepohybují se přímo dopředu za hlavičkou, mají trhavý pohyb. U hustých ejakulátů můţe být vyhodnocení motility obtíţné. V tomto případě ejakulát naředíme teplým (37
24
o
C) citrátem sodným nebo fyziologickým roztokem v poměru 1 : 1. Kvalitní ejakulát by
měl mít motilitu spermií nad 70 %. Motilita spermií můţe být sníţená v případech, kdy ejakulát vystavíme extrémním teplotám, dostanou se do kontaktu s okyselujícími roztoky, s vodou, močí, krví nebo hnisem. U první ejakulace po dlouhodobém sexuálním klidu psa se v ejakulátu bude vyskytovat větší procento starých a mrtvých spermií, které byly skladovány v nadvarleti a proto tento ejakulát často vykazuje niţší motilitu. V tomto případě doporučujeme opakovaný odběr, ve kterém můţe být jiţ motilita v normě. U vzorků s nízkou motilitou, s výskytem velkého procenta poškozených a mrtvých spermií je nezbytně nutné provést opakované odběry a vyloučit moţný negativní vliv nesprávné techniky odběru a pouţití spermiotoxických materiálů. Přetrvávající problémy s motilitou mohou svědčit o onemocnění varlat nebo nadvarlat (Doleţel a kol.,2001).
3.6.2.2 Koncentrace spermií Hustota spermií je jedním z ukazatelů biologické plnohodnotnosti ejakulátu a vyjadřuje se počtem spermií v 1 mm3 ejakulátu nebo v 1 ml. Celkové mnoţství spermií v ejakulátu se získá vynásobením objemu ejakulátu s počtem
spermií v 1 mm3.
Koncentrace spermií v ejekulátu psa je silně variabilní, záleţí zda se při odběru získala pouze frakce spermatická nebo i postspermatická. Mezi další faktory, které mohou ovlivnit koncentraci spermií je plemenná příslušnost, stáří, velikost varlat, sexuální aktivita. Obecně velká plemena psů mají celkové mnoţství spermií v ejakulátu větší neţ plemena malá. Pro zjišťování počtu spermií je prakticky nejčastěji vyuţívána hemocytometrická metoda, kdy se spermie počítají v Bürkerové komůrce. Tato metoda je snadno dostupná, rychlá a levná. Před vlastním počítáním se semeno naředí podle potřeby 1 : 20 aţ 1 : 100 (hustější ejakulát má intenzivnější bílé zabarvení a tehdy pouţiji vyšší ředění). Koncentrace spermií u zdravého psa je 300 x 106 aţ 800 x 106 /ml, přičemţ celkový ejakulát by měl obsahovat 300 × 106 aţ 1000 × 106 spermií (Doleţel a kol.,2001).
25
3.6.2.3 Morfologie spermií Na přípravu vzorku k mikroskopické analýze se pouţívá ředěný i neředěný ejakulát. Základním předpokladem pro získání objektivních výsledků při morfologickém vyšetření je správné zhotovení nátěru vyšetřovaného ejakulátu. Nátěr má být jemný, souvislý a nepoškozený. Při zhotovení nátěru je důleţité, aby byla správně připravena podloţní sklíčka (odmaštěna). Při nesprávném postupu mohou vznikat artefakty, které by se mohla pokládat za morfologické malformace spermií. Nátěr zhotovujeme rozetřením malé kapky ejakulátu na podloţním sklíčku, aby nedošlo k poškození spermií, rozetřeme kapku za hranou sklíčka tak, aby se semeno nedostalo pod hranu sklíčka, jinak by mohlo dojí k poškození spermií. Nátěr po uschnutí následně obarvíme přípravky hemocolor, eosin – nigrosin, giemsa. Obarvený preparát se hodnotí při 1000 - 1500 násobném zvětšení pod imerzí. Je nutné posoudit minimálně 200 spermií na různých místech stěru. Při výskytu několika změn na jedné spermii se hodnotí závaţnější a pokud se současně vyskytuje primární a sekundární anomálie, pak se hodnotí pouze primární. Při vyšším výskytu anomálií je potřeba provést opakované odběry a hodnocení. Na vzniku defektních spermií se podílí celá řada faktorů - genetické, toxické, infekční. V závislosti na intenzitě
a místě účinku můţe dojít ke zvýšené tvorbě
poškozených spermií. Podle místa poškození spermie můţeme změny rozdělit na primární a sekundární . Primární změny vznikají v průběhu spermiogeneze ve varleti aţ po průnik spermií do ocasu nadvarlete. Řadíme k nim degenerativní formy hlavičky, změny tvaru hlavičky, změny na akrozómu, abaxiální nasazení bičíku, spermie s proximálně uloţenou protoplasmatickou kapkou, tvarové změny na mitochondriálním oddíle atd.. Sekundární změny jsou nespecifické a vznikají při dlouhodobém pobytu spermií v ocasu nadvarlete. Dále změny, které vznikají při průchodu vývodnými cestami při ejakulaci a artefakty vznikající při nesprávném zhotovení preparátu. Mezi tyto změny patří změny hlavičky - zduřelé, uvolněné, roztrhnutý akrozóm, na bičíku jeho torze, ulomení atd.. U zdravého psa by neměl počet morfologicky změněných spermií přesáhnout hranici 30 %. Spermií s primárními změnami by mělo být méně neţ 10 % a spermií se sekundárními změnami méně neţ 20 %. U psů bohuţel nebyla ve větší míře zjišťována korelace mezi procentem změněných spermií a koncepcí. 26
U psů s více jak 60 %
morfologicky normálními spermiemi bylo zjištěno zabřezávání v 61 % a u psů s méně neţ 60 % morfologicky normálními spermiemi bylo zabřezávání jen 13 %. Cytologiické vyšetření se provádí nátěrem, neředěného ejakulátu, který je moţno obarvit např. Methylenovou modří a vyloučit tak přítomnost zánětlivých buněk a bakterií. Příleţitostný záchyt nepoškozených zánětlivých buněk (neutrofily, lymfocyty, makrofágy, plasmatické buňky), erytrocytů a baktérií se běţně vyskytuje i v ejakulátu zdravých psů jako následek kontaminace ejakulátu v uretře. Také výskyt epiteliálních buněk je normální obzvláště u psů, kteří nebyli dlouhodobě sexuálně vyuţíváni. Při výskytu enormního mnoţství těchto typů buněk současně s výskytem baktérií v buňkách uvaţujeme o zánětlivém procesu. Na druhé straně, pokud se tyto buňky v ejakulátu nebudou vyskytovat, nedá se zcela jednoznačně zánět vyloučit. Velký výskyt mononukleárních buněk můţe svědčit o imunitní orchitídě (Doleţel a kol.,2001). 3.6.3 Stanovení aktivity alkalické fosfatázy semenné plazmy Vyšetření aktivity alkalické fosfatázy v semené plasmě se doporučuje u azoospermických psů. Vyšetřovací postup je obdobný jako při stanovování alkalické fosfatázy v séru. Alkalická fosfatáza semenné plazmy pochází z tekutiny nadvarlete a její stanovení v ejakulátu představuje hlavní ukazatel přítomnosti sekretu z nadvarlete. U normospermických psů je její aktivita v ejakutátu vyšší neţ 5000 U/l. Pokles je zjišťován při bilaterální obstrukci vývodných tubulů v nadvarleti. Sekret prostaty má nízké hladiny alkalické fosfatázy. Také při nekompletní ejakulaci mohou být zjišťovány nízké koncentrace (Doleţel a kol.,2001). 3.6.4 Mikrobiologické vyšetření pohlavního aparátu a ejakulátu psů Vyhodnocení a interpretace mikrobiologického nálezu z pohlavního apratu je velmi obtíţné, jelikoţ i u zdravých psů mají jednotlivé částí pohlavního aparátu (především prepucium a distální úsek uretry) určitou bakteriální flóru, která se můţe ze dne na den změnit. Tato flóra je většinou sloţena ze 2 aţ 5 mikroorganismů. představitele patří především
Mezi hlavní
hemolytické streptokoky, stafylokoky, E. coli a P.
multocida. U zdravých psů se při kultivaci stanovuje méně neţ 104 kolonie tvořících jednotek/ml ejakulátu.
27
Kultivace bakterií má význam především v případech, kdy jsou zjišťovány známky onemocnění pohlavního aparátu (klinické příznaky, přítomnost a větší mnoţstí leukocytů v ejakulátu, mnoţství a druhové zastoupení bakterií v ejakulátu atd.). Většina infekcí pohlavního aparátu samců je vyvolána anaerobními baktériemi. Podezření na infekci je v případech, kdy se při kultivaci zjistí více neţ 105 kolonií tvořících jednotek/ml ejakulátu, je zjišťována pouze jedna baktérie a jsou přítomné ve větším mnoţství zánětlivé buňky. Role mykoplasmat a ureoplasmat jako původců onemocnění pohlavního aparátu psů není zcela objasněna. Tyto mikroorganismy rovněţ patří k normální mikroflóře prepucia a distální části uretry. vyvolává onemocnění pohlavního aparátu u fen i psů. Podezření na brucelózu by mělo být při výskytu orchitídy, epididymitídy, testikulární atrofie, generalizované lymfadenopatie a při horečce neznámého původu. Ve většině případů se brucelóza vyskytuje subklinicky a můţe být provázena pouze subfertilitou. Falešně negativní serologické testy jsou zjišťovány u dlouhodobě nemocných psů, protoţe jsou v tomto období jiţ velmi nízké hladiny protilátek proti
antigenům B.
canis. Nejsnadněji se protilátky detekují 4. aţ 12. týden po infekci. Serologické testy jsou často negativní v prvních 4 týdnech po infekci. Všechna serologicky negativní zvířata by měla být opakovaně vyšetřena za měsíc. Serologické testy mohou být také negativní během váţného chronického onemocnění, při antibiotické terapii nebo jestliţe mikroorganismus perzistuje ve tkáni (Doleţel a kol.,2001).
3.6.4.1 Stanovení koncentrace hormonů Koncentrace testosteronu: Hladiny testosteronu se během dne velmi výrazně mění. Jeho stanovení má význam pouze na prokázání hormonální funkce varlat. Zdravý pes má koncentraci testosteronu 0,5 aţ 5 ng/ml. Kastrovaný pes má koncentraci testosteronu pod 200 pg/ml. Psi s narušenou spermiogenezí mohou mít obdobné koncentrace jako psi zdraví. Také oboustranně kryptorchidní psi obvykle mají obdobné koncentrace.
28
Koncentrace luteinizačního hormonu (LH): Hladiny LH hormonu z důvodu jeho pulzačního vylučování (po 90 min) během dne výrazně kolísají. Rozdíly mohou být aţ čtyřnásobné. U zdravých psů a psů kryptorchidních jsou koncentrace LH pod 30 ng/ml. Kastrovaný pes a psi s narušenou spermiogenezí mají koncentrace LH nad 70 ng/ml.
Koncentrace folikuly stimulujícího hormonu (FSH): Hladiny FSH hormonu také kolisají během dne, ale v menší míře neţ je tomu u LH hormonu. U zdravých psů a psů kryptorchidních jsou koncentrace FSH pod 70 ng/ml. Kastrovaný pes má koncentraci FSH nad 700 ng/ml a psi s narušenou spermiogenezí mají koncentrace FSH nad 100 ng/ml. (Doleţel a kol.,2001) 3.6.4.2 Endokrinologické funkční testy Endokrinologické funkční testy se pouţívají v případech, kdy chceme po hormonální stimulaci zjistit a potvrdit nenarušenou funkci hypofýzo - ovariální osy (stimulující test za pouţití gonadotropního releasing hormonu GnRH) nebo potvrdit přítomnost funkční testikulární tkáně (stimulující test za pouţití humánního choriového gonadotropinu hCG) (Doleţel a kol.,2001).
GnRH stimulující test:
Od psa se odebere vzorek krve pro stanovení koncentrace luteinizačního hormonu a testosteronu. Psovi se intravenózně aplikuje GnRH v dávce 0,01 g/kg a druhý vzorek krve se odebere za 60 minut po aplikaci. Signifikantní zvýšení koncentrace luteinizačního hormonu prokazuje přítomnost funkční hypofýzy. Signifikantní zvýšení koncentrace testosteronu prokazuje funkčnost hypofýzy i varlat (Doleţel a kol.,2001).
29
hCG stimulující test:
Od psa se odebere vzorek krve pro stanovení koncentrace testosteronu. Psovi se intravenózně aplikuje hCG v dávce 50 m.j./kg a druhý vzorek krve se odebere za 60 minut po aplikaci. Signifikantní zvýšení koncentrace testosteronu poukazuje na přítomnost funkčních varlat. Tyto testy se mohou pouţít u psů pro potvrzení nebo vyloučení přítomnosti varlat (oboustranný kryptorchid) (Doleţel a kol.,2001).
3.6.4.3 Aspirace varlat Cytologické vyšetření vzorku varlat získaného aspirací
tenkou jehlou je
jednoduchá, rychlá a málo expanzivní metoda vyuţívaná k vyšetření aspirátů získaných z testikuláních lézí. Dobře je vyuţitelná při diagnostice nádoru varlat. Méně se hodí jako diagnostická metoda při azoospermii a při difúzních změnách testikulární tkáně. Při této metodě můţeme identifikovat zánět varlat (přítomnost zánětlivých buněk), je moţné získat patogeny ke kultivaci a nebo vyuţít vzorek k diagnostice spermatozoí a spermií. Jejich přítomnost v aspirátu psa s azoospermií můţe naznačovat, ţe se jedná o oboustranou neprůchodnost některé z části vývodných cest. Technika odběru je obdobná jako při aspiraci např. z mízních uzlin. Není nezbytně nutná lokální anestezie a sedace se provádí pouze u nezvladatelných psů. Získaný aspirát se rozetře na sklíčko, obarví a cytologicky se vyšetří na přítomnost spermatozoí, spermií, zánětlivých buněk, baktérií a plísní (Doleţel a kol.,2001).
3.6.4.4 Aspirace nadvarlat Cytologické vyšetření aspirátu z nadvarlete je indikováno v případech, kdy palpačně zjistíme abnormálně utvářené nadvarle a také u psů s azoospermií. Technika je obdobná jako u testikulární aspirace. Získaný aspirát z ocasu nadvarlete se vyšetří na přítomnost ţivých pohyblivých spermií, zánětlivých buněk a baktérií.
30
U azoospermického psa při přítomnosti spermií můţeme vyslovit podezření na neprůchodnost chámovodů, zatímco při jejich chybění v aspirátu je podezření na neprůchodnost vývodných kanálků a destrukci spermií proximálně od místa odběru a případně i narušení spermiogeneze (Doleţel a kol.,2001).
3.6.4.5 Biopsie varlat Touto metodou se získává vzorek testikulární tkáně krvavou cestou, a to nejčastěji za účelem histologického vyšetření (posouzení histologické stavby parenchymu, úrovně spermiogeneze, mnoţství Leydigových a Sertoliho buněk, zánětlivých buněk, nádorových buněk) a mikrobiologického vyšetření. Indikace k biopsii je pro řadu rizik omezena pouze na některé případy, např. u psů s perzistentní oligospermií nebo azoospermií, u kterých méně invazivní vyšetřovací metody nepřinesly ţádné výsledky, dále v případech difúzních změn parenchymu varlat. Biopsie by nikdy neměla být provedena u psů s normálním ejakulátem. Mezi moţné komplikace při a po biopsii varlat patří: krvácení, infekce, testikulární hypertermie, fibróza varlat, adhese, testikulární atrofie, obstrukce, otok šourku atd.. Získaný vzorek tkáně se ihned po odběru fixuje. Na fixaci by se neměl pouţít formaldehyd,
který
způsobuje
smrštění
stočených
semenotvorných
kanálků,
nedostatečné obarvení jader a další artefakty. K fixaci se dá pouţít např. glutaraldehyd. K vlastnímu barvení vzorků je moţné pouţít hematoxylin - eozin nebo toluidinovou modř. Parenchym varlete je moţné odebrat metodou harpunace bioptickou jehlou. Velikost jehly se volí v závislosti na velikosti varlete. Odběr doporučujeme po sedaci nebo v celkové anestézii. Při odběru se varle fixuje a jednou rukou se komprimují cévy semenného provazce. Provede se krátký řez v kůţi na kranioventrální straně šourku. Jehla se vede dozadu ventrálně tak, aby nedošlo k poranění nadvarlete a vývodných kanálků. Po odběru provést suturu kůţe, hemostázi lokální kompresí. Další medodou odběru je odběr excizí. I přes větší riziko poškození tkáně se preferuje více neţ odběr bioptickou jehlou. Výhodou této metody je moţnost určení mnoţství tkáně na vyšetření a není problém ani odstranění celé histologické léze. Postup je obdobný jako při pouţití bioptické jehly pouze s tím rozdílem, ţe se řez provádí aţ přes tuniku albugineu. Vyhřezlá varletní tkáň se můţe odstřihnout a pouţít
31
na vyšetření. Po skončení odběru musí být tunika albuginea sešita vstřebatelným materiálem (Doleţel a kol.,2001).
3.6.4.6 Karyotypizace Určení chromozómů napomáhá identifikovat abnormální pohlavní chromozóny (XXY) u infertilních psů s hypoplastickými varlaty a penisem (Doleţel a kol.,2001).
3.7 Faktory ovlivňující kvalitu ejakutálu 3.7.1 Puberta Ejakulát od psů v období puberty obsahuje větší mnoţství abnormálních a mrtvých spermií. S následujícími ejakulacemi se koncentrace spermií zvyšuje, sniţuje se procento patologicky změněných spermií a celkový ejakulát začíná získávat normální parametry (Kvapil, Kvapilová 2007).
3.7.2 Roční období K poklesu koncentrace spermií v ejakulátu dochází v pozdním létě a na podzim a vyšší koncentrace jsou na jaře a v časném létě. Tyto změny jsou pravděpodobně vyvolány změnou světelného dne a okolní teplotou, ale v ţádném období se nesniţuje počet spermií pod 200 × 106 spermií v ejakutátu a u zdravého psa tyto vlivy nemají ţádný negativní vliv na jeho plodnost (Kvapil, Kvapilová, 2007).
3.7.3 Velikost prostaty a patologické stavy prostaty Při srovnání celkového objemu semenné plazmy u zdravé prostaty byla zjištěna určitá závislost. Objem plazmy se lineárně zvětšuje s velikostí a hmotností prostaty. Naopak u psů, kteří mají cystickou hyperplasii prostaty je objem semenné plazmy niţší i přesto, ţe velikost prostaty je podstatně větší. Velikost prostaty se pravidelně zvětšuje aţ do 6 let stáří psa, ale k poklesu objemu plazmy začíná docházet jiţ od 4 roku věku. Pokles objemu semenné plazmy je zjišťován u benigní hyperplazie prostaty a u psů s niţší hladinou androgenů (stáří) (Kvapil, Kvapilová, 2007).
32
3.7.4 Velikost varlat Velikost a váha parenchymu varlat přímo souvisí s denní produkcí spermií. Přímá souvislost je mezi váhou varlat a celkovým počtem spermií v ejakulátu. Je to dáno tím, ţe kaţdý gram varletní tkáně vyprodukuje za den určité mnoţství spermií (12 - 17 × 106 spermií/g) (Kvapil, Kvapilová, 2007).
3.8 Nejčastější abnormality, nemoci a zákroky spojené s pohlavním aparátem 3.8.1 Krvácení z penisu Nemusí být onemocnění, ale můţe to být následek poranění při pohlavním styku, nejvíce se to stává u dlouhosrstých zvířat. Nebo to můţe být příznakem u akutního zánětu močového měchýře, při onemocnění prostaty, při výhřezu a poranění močové roury. Léčba: krátkodobé krvácení, je vhodné ošetřit orgán desinfekční roztokem. V případě, kdy krvácení přetrvává nebo vzrůstá jeho intenzita, je nutné navštívit veterinárního lékaře, který vede další léčbu a doporučí vhodnou péči o pacienta (Sova, 1987 ).
3.8.2 Fimóza: Přilepení či srůst předkoţky s hlavou pyje. Následkem bývají zánětlivé stavy, které způsobují bolestivé potíţe při močení, zánět způsobující svědění a víceméně znemoţňují pohlavní akt. Fimóza se projevuje jiţ u štěňat a zhruba ve třech měsících věku lze ověřit moţnost přetaţení předkoţky přes hlavu pyje. Včasný zjištěním fimózy majitel psa předejde váţným komplikacím a moţnému poranění v dospělosti psa Léčba: Chirurgický zákrok (Naxera, 2006 ). 3.8.3 Zánět předkožky: Udrţuje hlavu penisu vlhkou, coţ je důleţité pro pohlavní styk. Na vnitřním listu předkoţky jsou ţlázky, vylučující sekret, který spolu s odloupanými buňkami epitelu snadno podléhá bakteriálnímu rozkladu a tím provokuje následný zánět předkoţky. Tento stav je velice častý, není však nebezpečný ani neohroţuje ţivot psa.
33
K příznakům patří výtok ţlutobílého hnisavého sekretu, olizování okolí penisu a otok a zbytnění kůţe přirození. Příčina zánětu je nedostatečný hygiena, nedokonalé utváření předkoţkového vaku a infekční nemoci (psinka) . Léčba: dodrţování základních pravidel hygieny, ostříhání srsti na kůţi konce přirození. Výplach předkoţkového vaku vlaţným roztokem hypermanganu. Toto onemocnění se zpravidla vrací, recidivuje, a jeho projevy jsou velmi svízelně léčitelné. Pokud není domácí léčba úspěšná, je potřeba navštívit veterinárního lékaře a provést laboratorní vyšetření a ze stěrů se stanoví další způsob léčby - pomocí antibiotických nebo sulfonamidových preparátů (Naxera, 2006 ). 3.8.4 Zánět varlat a šourku: Bývá nejčastěji následkem úrazu, uskřinutí, pohmoţdění nebo nádoru, můţe provázet i jiná infekční horečnatá onemocnění. Příznaky jsou zjevná bolestivost, zvětšení objemu varlat v šourku, neochota k pohybu a sednutí, zvýšená teplota a nechutenství. Léčba: Chladivé obklady. Je zapotřebí vyhledat lékaře (Sova, 1987). 3.8.5 Zbytnění prostaty: Prostata je nepárová přídatná pohlavní ţláza, nacházející se na krčku močového měchýře a na části močové trubice v pánevní části. Podle plemene a stáří psa se její velikost pohybuje od rozměrů lískového oříšku ke kaštanu. Vyměšuje sekret, který je podstatnou součástí ejakulátu. V důsledku zánětlivých změn na tkáni prostaty nebo nádorových bujení můţe dojít k jejímu zvětšení, zbytnění, čímţ vytváří tlak na močovou trubici a znesnadňuje močení. Příznaky jsou obtíţe při močení, bolestivost v oblasti malé pánve, časté zácpy, neochota k pohybu, zánět tkáně a nádorové bujení. Léčba: Úprava ţivotosprávy, podávání dobře stravitelné potravy s větším podílem vlákniny. Pravidelné procházky a venčení. Konsultace s veterinárním lékařem (Naxera, 2006 ). 3.8.6 Kryptorchismus: Pro správnou funkci pohlavního ústrojí je nezbytné, aby obě varlata sestoupla plně do šourku. K sestupu varlat dochází hned po narození, můţe však být zpoţděn aţ o několik týdnů či měsíců. Umístění varlat mimo tělo je fyziologicky podmíněno
34
potřebou prostředí s niţší teplotou, neţ mají ostatní vnitřní orgány. V případě, ţe jedno nebo obě varlata nesestoupí z dutiny břišní, kde prodělávají svůj vývoj, tříselním kanálem do šourkového vaku, hovoříme o monarchismu, respektive kryptorchismu. Tato nedostatečnost je geneticky podmíněna a vylučuje postiţené jedince z chovu, a to i v případě úspěšné léčby. Příznaky: - chybějící varle (varlata) v šourku po třetím měsíci věku Léčba: Konzultace s veterinárním lékařem. Speciální masáţ tříselné partie, nebo hormonální řešení jejím smyslem je napomoci sestoupení varlete. Nedostaví-li se ţádaný efekt, nebo dochází-li k zadrţení varlete v dutině břišní, nebo v tříslech poté následuje chirurgické řešení. Pokud nedojde k chirurgickému ošetření můţe k moţné nádorové bujení, vznikne neţádoucí tlak v tříslech (Svoboda, 2001). 3.8.7 Kastrace psů Kastrace je chirurgické odstranění samčích pohlavních ţláz. Důvodem je odstranění neţádoucího chování - agrese, obtěţování ostatních členů smečky a rodiny, zabránění zvyšování populace, řešení traumatických stavů, infekčních nebo nádorových onemocnění pohlavního ústrojí. Prevence neţádoucího chování se provádí před dosaţením pohlavní dospělosti (ve věku 4 týdnů aţ 30 měsíců), kdy ale dochází nedostatečnému vyvinutí sekundárních pohlavních znaků a ztrátě dominance. Druhou moţností je v době dospělosti, po 30 měsících věku, pes bude mít odpovídající pohlavní výraz a povahové vlastnosti (dominance, zloba aj.). Kastrace jako léčebný zákrok se provádí preventivně nebo při léčbě onemocnění. Chirurgicky se odebírají varlata, celý šourek, prostata nebo se upravuje celý močový aparát (Svoboda, 2001).
35
4
ZÁVĚR Ve zpracování bakalářské práce jsme se zaměřili na popis reprodukčních orgánů psa
– samce, dále popis fyziologie pohlavních funkcí psa, průběhu krytí, odběru ejakulátu a laboratorních metod určených k vyšetření čerstvého ejakulátu, pro moţnost vyuţití při umělém oplodnění. V této práci se zmiňujeme o výhodách umělého oplodňování psů a uchovávání kvalitního genetického materiálu. Pro odběr ejakulátu je velmi důleţitá psychická vyrovnanost psa, coţ znamená, ţe by se měl nejlépe uskutečnit v domácím klidném prostředí, za přítomnosti háravé feny. Získaný ejakulát lze vyuţít i pro iseminaci nebo pro uchování genetického materiálu pro doby kdy pes jiţ není pouţitelný k reprodukci. Metoda umělého oplodnění kvalitním genetickým materiálem můţe ovlivnit genetický fond jednotlivých psích ras, které jsou v součastné době jiţ značně přešlechtěné. Neopomenutelné výhody umělého odběru ejakulátu jsou ekonomické, zdravotní a širší moţnosti zahraničního krytí.
36
5
LITERATURA
Doleţel, R. - Vitásek, R. - Senior, FD.: Poruchy reprodukčního systému. In: Svoboda Senior FD, Doubek J, Klimeš J. a kol.: Nemoci psa a kočky II. Díl. Noviko a.s., 2001: 1253-1359, ISBN 80-902595-3-7 Kvapil R., Kvapilová R., 2007: Průvodce psí reprodukcí, 97s. DOSTÁL, 2007: J. Genetika a šlechtění plemen psů. České Budějovice: Dona, 261 s. ISBN 978-80-7322-104-1. DOSTÁL, J. ,1995: Chov psů : Genetika v kynologické praxi. České Budějovice: DONA,. 206 s. ISBN 80-85463-58-X. Naxera, V., 1991: Pes a domácí lékař, 251s. Svoboda, M., 2001: Nemoci psa a kočky II. Díl, Vydala ČAVLMZ, nakladatel Noviko, a.s., 1022s., ISBN 80-902595-3-7. Sova Z., 1987: Nemoci psů, Státní zemědělské nakladatelství, 365s. Gamčík P., Kozumplík J. a kol.,1992: Andrológia a umelá inseminácia hospodářských zvierat, vydavatelství Príroda, Bratislava, 568s. Marvan F. a kol., 2007: Morfologie hospodářských zvířat, 305s. Čtyroká H., 2002: Seminář pro chovatele psů na téma Krycí pes. Databáze online [cit. 2010-08-05] Dostupné na: http://www.veterina-info.cz/script/articledetail.asp?rid=131 Šebková N., 2010: Databáze online [cit. 2010-10-11] Dostupné na: http://www.ifauna.cz/clanek/psi/xii-kapitola-kynologie-reprodukce-psu/5564/ http://www.ifauna.cz/clanek/psi/reprodukce-rozmnozovani/5510/
37
