MATERI DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Agustus 2002 sampai September 2005. Persiapan hewan coba meliputi perfusi jaringan yang dilakukan di Karantina Hewan, Pusat Studi Satwa Primata, Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan
Masyarakat-Institut
Pertanian
Bogor
(PSSP-LPPM
IPB).
Pewarnaan jaringan otak dan pengamatan hasil penelitian yang dilakukan di Laboratorium Biologi dan Laboratorium Patologi dan Lipid, PSSP-LPPM IPB; Bagian Anatomi, Fakultas Kedokteran Hewan-Institut Pertanian Bogor dan Fakultas Kedokteran Hewan-Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta; serta di Biostructure Technology Laboratory, Regional Primate Research CenterUniversity of Washington, Seattle. Materi Penelitian ini mempergunakan dua belas ekor MEP yang terdiri dari 10 fetus dan 2 ekor anak. Untuk keperluan pewarnaan imunohistokimia dengan teknik label tunggal dipergunakan batang otak sebelah kiri yang berasal dari fetus umur kebuntingan 40 hari (F 40), 55 hari (F 55), 70 hari (F 70), 85 hari (F 85), 100 hari (F 100), 120 hari (F 120) dan 150 hari (F 150), serta anak umur 10 hari (P 10) dan 105 hari (P 105) masing-masing satu ekor. Hewan tersebut diperoleh dari PSSP-LPPM IPB.
Untuk pewarnaan imunohistokimia dengan
teknik label ganda digunakan batang otak MEP sebanyak tiga ekor, yaitu fetus umur 55 hari (F 55), 70 hari (F 70), dan 145 hari (F 145) masing-masing satu ekor, yang diperoleh atas kebaikan Dr. Anita Hendrickson dari Regional Primate Research Center-University of Washington, Seattle, USA. Sampel fetus berasal dari induk MEP yang ditangkap dari alam, selanjutnya dikarantina untuk pemeriksaan kesehatan, kemudian dikandangkan secara individual. Agar umur fetus dapat ditentukan dengan pasti, maka semua induk dikawinkan dengan metode time mating.
Sebelum dikawinkan, induk
betina diamati siklus menstruasinya dengan menggunakan teknik usap vagina. Hanya induk-induk yang memiliki siklus estrus teratur saja yang dijadikan sebagai indukan fetus yang digunakan dalam penelitian ini. Induk betina yang
30
terpilih kemudian dipindah ke kandang kawin. Masa subur induk betina ditandai dengan lendir vagina yang encer dan bening, biasanya muncul pada hari ke-11 siklus menstruasi. Ketika betina memasuki masa subur, pejantan dimasukkan ke kandang kawin selama 3 hari. Hari ke dua pencampuran antara induk jantan dan betina ditentukan sebagai hari ke nol kebuntingan dengan simpangan baku satu hari. Metode Pengambilan fetus Fetus dikoleksi melalui laparotomi medianus, kemudian dibius secara intraumbilikal dengan pentobarbital (0,1 ml/kg bobot badan), sedangkan untuk P 10 dan P 105 dibius dengan anastetikum yang sama, tetapi secara intraperitoneal. Perfusi jaringan otak Sampel yang didapat kemudian dikorbankan dengan cara mengeluarkan darah secara intrakardial dengan teknik perfusi dalam keadaan terbius. Perfusi dilakukan dengan menggunakan 0,2% paraformaldehid dalam phosphate buffered (PB) 0,1M, pH 7,4 pada suhu 37oC, dengan kecepatan antara 15-20 ml/menit
sebagai
pre-rinse,
dilanjutkan
dengan
larutan
fiksatif
2%
o
paraformaldehid dalam PB 0,1M, pH 7,4 dengan suhu 4 C selama 20 menit pada kecepatan yang sama. Perfusi intrakardial dilakukan dengan cara membuka rongga dada, aorta torakalis dijepit dengan penjepit arteri, kemudian jarum kupu yang telah dihubungkan dengan pompa perfusi dimasukkan ke dalam ventrikel kiri. Setelah jantung membesar karena terisi larutan pre-rinse, atrium kanan kemudian disayat agar darah dan larutan perfusi dapat keluar dari tubuh.
Apabila larutan perfusi
yang keluar sudah jernih, maka larutan perfusi diganti dengan larutan fiksatif. Setelah proses perfusi selesai, hewan didekapitasi, kemudian jaringan otak sampai dengan pangkal medula spinalis diambil dan difiksasi dengan larutan 2% paraformaldehid dalam PB 0,1 M, pH 7,4 pada suhu 4oC selama 24 jam.
31
pengamatan siklus estrus induk betina
perkawinan dengan metode time mating
fetus (F) umur 40, 55, 70, 85, 100, 120, dan 150 ; anak (P) umur 10 dan 105 hari
fetus (F) umur 55, 70, dan 145 hari
perfusi
preparasi otak
pewarnaan label tunggal TH
pewarnaan label ganda TH dan DBH
Gambar 10. Skema tahap-tahap penelitian mulai dari seleksi induk, preparasi sampel sampai ke pewarnaan imunohistokimia.
Untuk keperluan pewarnaan label tunggal, medula oblongata dipotong secara longitudinal pada garis median menjadi dua bagian. Belahan kiri dipotong secara koronal dengan ketebalan 5 mm, tegak lurus terhadap garis bayangan yang ditarik dari bagian tengah commissura anterior dan commissura posterior. Masing-masing sayatan kemudian diblok dalam parafin, sedang belahan kanan medula oblongata
disimpan di larutan
fiksatif paraformaldehid 2% dalam
PB 0,1M, pH 7,4 pada suhu 4oC untuk bahan penelitian lanjutan.
32
Proses blok parafin dan imunohistokimia label tunggal
sayatan
preparat
untuk
pewarnaan
Sayatan koronal medula oblongata dengan ketebalan 5 mm dimasukkan ke dalam tissue casset, kemudian didehidrasi dalam larutan etanol bertingkat berturut-turut 50, 70, 80, dan 95%, diakhiri dengan tiga kali larutan etanol 100%, masing-masing selama 90 menit. Semua proses dehidrasi dilakukan pada suhu kamar. Setelah dehidrasi dilanjutkan proses penjernihan (clearing) dalam larutan campuran silol dan etanol 100%, dan dua kali silol masing-masing selama 45 menit pada suhu kamar. Setelah proses clearing, dilakukan proses infiltrasi dalam larutan campuran silol dan parafin, kemudian diteruskan dengan tiga kali larutan parafin, masing-masing 45 menit, dengan suhu 60oC. Terakhir jaringan diletakkan dalam cetakan blok kemudian disiram parafin cair, dan didinginkan pada suhu kamar sampai parafin membeku menjadi blok. Sayatan koronal ini dilakukan agar didapatkan area postrema dan neuron Grup A1/C1 dan A2/C2 dalam satu bidang pandang. Blok parafin jaringan otak disayat secara serial setebal 12 µm menggunakan rotary microtome, dengan interval dari satu sayatan ke sayatan berikutnya mulai sampel tertua (P 105) ke sampel termuda (F 40) berturut-turut 460, 403, 444, 387, 274, 242, 169, 137, dan 55 µm. Dari setiap interval tersebut diambil tiga serial sayatan, kemudian diletakkan di permukaan air hangat dengan suhu 45 oC sebelum ditempelkan pada superfrost slide dan dikeringkan secara vertikal pada suhu kamar. Setelah kering, sediaan diinkubasi pada suhu 37oC dengan posisi horisontal selama satu malam, selanjutnya disimpan pada suhu 4 oC sampai saatnya diwarnai. Dari tiga sayatan serial yang diperoleh, sayatan pertama diwarnai menggunakan cresyl echt violet untuk mengetahui keberadaan AP pada masingmasing sediaan dengan mencocokkan posisi tiap sediaan dengan gambar potongan otak pada Template Atlas of the Primate Brain (Martin dan Bowden 1996) dan atlas otak pada monyet Rhesus (Oertel 1969).
Sediaan yang
menunjukkan adanya AP berdasarkan pewarnaan cresyl echt violet di atas, maka sayatan ke duanya diwarnai HE untuk mengamati struktur jaringan secara detail, dan sayatan ke tiga diwarnai imunohistokimia terhadap TH untuk mengamati keberadaan neuron KA.
33
Pewarnaan cresyl echt violet dan HE Sayatan organ dari blok parafin yang akan diwarnai dengan cresyl echt violet dijajarkan dalam rak untuk diinkubasi pada suhu 60 oC selama 90 menit. Setelah inkubasi sediaan dibiarkan pada suhu ruang sampai dingin. Slide yang telah dingin selanjutnya dideparafinis asi dan direhidrasi sesuai prosedur standar. Setelah proses rehidrasi, jaringan diwarnai dengan laturan cresyl echt violet (Chroma, No.1A 396) selama 30 menit, diteruskan proses dehidrasi, rehidrasi, dehidrasi ulang, dan diakhiri dengan proses penjernihan dalam silol sebelum ditutup dengan kaca penutup menggunakan media Entelan (Merck, Cat. 107961). Tahap-tahap pewarnaan HE sama seperti pewarnaan cresyl echt violet, kecuali, setelah proses rehidrasi jaringan diwarnai dengan larutan hematoksilin selama 3 menit, kemudian dicuci dalam air mengalir selama 10 menit. Dari air mengalir, jaringan dicuci dalam akuades selama 10 celupan kemudian diwarnai dalam larutan eosin selama 5 menit. Setelah diwarnai menggunakan larutan eosin, jaringan dicuci sebanyak 10 celupan dalam akuades. Pewarnaan imunohistokimia secara label tunggal Untuk pewarnaan imunohistokimia terhadap TH, proses deparafinisasi dan rehidrasi seperti pada pewarnaan cresyl echt violet, kemudian jaringan dibilas dua kali di dalam larutan phosphate buffered saline (PBS) pada suhu ruang masing-masing selama 10 menit. Peroksidase endogen pada jaringan diblok dengan cara merendam sediaan pada 3% H2O2 dalam akuades selama 30 menit, kemudian dibilas tiga kali dalam PBS masing-masing selama 10 menit. Permukaan sediaan di sekitar jaringan dikeringkan menggunakan kertas tisu dengan tetap menjaga jaringan untuk tidak kering, kemudian dibuat lingkaran pembatas di sekitar jaringan dengan menggunakan hydrophobic marker. Sediaan selanjutnya dijajarkan secara mendatar dalam kotak yang lembab.
Jaringan pada slide yang telah dibatasi dengan hydrophobic marker,
selanjutnya ditetesi larutan Revealit Antigen (diperoleh atas kebaikan Dr. David Pow, dari Queensland University, Brisbane, Australia).
Setelah selesai
penetesan Revealit Antigen, kotak ditutup rapat dan diinkubasi pada suhu 37oC selama satu malam. Keesokan harinya jaringan dibilas empat kali dalam larutan
34
PBS, masing-masing selama 10 menit.
Permeabilitas jaringan tetap dijaga
dengan pemberian larutan 3% TritonX100 dalam PBS selama 30 menit pada suhu ruang. Untuk memblok latar belakang (background) jaringan, dipergunakan larutan 10% normal horse serum (NHS) dalam 3% TritonX100
pada PBS
selama 60 menit dengan suhu ruang. Antibodi primer rat anti-TH mouse serum (ImmunoStar, cat no. 22941) yang diencerkan 2500 kali, diteteskan pada jaringan. Jaringan kontrol (jaringan dengan sel yang mengandung TH) tidak diberi antibodi primer atau hanya diberi IgG mouse. Sediaan diletakkan secara horisontal pada kotak yang lembab dan ditutup rapat selama empat malam pada suhu 4 oC. Setelah diinkubasi dalam antibodi primer, jaringan dibilas menggunakan PBS sebanyak empat kali masing-masing selama 15 menit, kemudian ditetesi antibodi sekunder yaitu biotinylated anti-mouse IgG (H+L) horse serum (Vector, Cat. No: BA-2000) yang diencerkan 100 kali, dengan inkubasi selama 60 menit. Setelah
diberi
antibodi
sekunder,
jaringan
dibilas
menggunakan PBS masing-masing selama 15 menit.
empat
kali
Setelah dibilas,
permukaan sediaan di sekitar jaringan dikeringkan, kemudian jaringan ditetesi dengan larutan kompleks avidin biotin conjugated (Elite Vecta StainR , Vector laboratories, Cat.no: PK-6100) yang diinkubasikan
selama 60 menit.
Selanjutnya jaringan dibilas lagi dengan menggunakan PB sebanyak tiga kali masing-masing 15 menit. Pada pencucian ke tiga, larutan 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB, Sigma, Cat. No: D-5905) dan larutan 3% H2O 2 dalam DAB disiapkan. Segera setelah selesai dibilas, sediaan kemudian diinkubasi dengan larutan DAB selama 5 menit, diteruskan dengan larutan 3% H2O 2 dalam DAB selama 20 menit. Selanjutnya sediaan dicuci sebanyak 10 kali celupan dalam larutan PB.
Sediaan dikeringkan dengan meletakkannya secara vertikal.
Setelah kering, sediaan diletakkan secara horisontal pada inkubator dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama satu malam. Pada hari berikutnya, jaringan diwarnai hematoksilin sebagai counterstain selama 30 detik. Setelah proses dehidrasi dalam alkohol bertingkat, sediaan kemudian dijernihkan dalam silol, kemudian ditutup dengan kaca penutup dengan media Entelan (Merck, Cat. 107961).
35
Pewarnaan imunohistokimia dengan label ganda Teknik perfusi sampai fiksasi pewarnaan imunohistokimia label ganda sama seperti pewarnaan secara label tunggal, namun setelah proses fiksasi di dalam larutan 2% paraformaldehid otak kemudian disimpan dalam larutan 30% sukrosa. Untuk pewarnaan label ganda ini sampel disayat dalam kondisi beku secara sagital. Pada prinsipnya proses pewarnaan imunohistokimia label ganda sama dengan label tunggal dengan sedikit perbedaan. Untuk memblok background digunakan 10% ChemiBLOCKER (Chemicon, Cat. No: 2170-S) yang dilarutkan dalam PBS 0,01M yang mengandung 0,5% tritonX100 dan 0,05% sodium azide. Untuk antibodi primer langsung digunakan dua macam antibodi yaitu rat anti-TH mouse serum (ImmunoStar, cat no. 22941) 2500 kali pengenceran dan bovine anti-DBH rabbit serum (ImmunoStar, Cat. no: 22806) 1500 kali pengenceran dengan masa inkubasi satu malam, pada suhu ruang. Antibodi sekunder, yaitu Alexa488 goat anti-rabbit IgG yang
mengandung fluorocein-iso-thiocyanate
(FITC) dengan pengenceran 500 kali dan Alexa597 goat anti-mouse IgG yang mengandung rodamin (Moleculer Probes, Eugene OR) pada pengenceran 500 kali, diberikan selama satu jam, pada suhu ruang. Setelah sediaan dicuci tiga kali dalam PBS 0,01M
masing-masing selama 10 menit, sediaan kemudian
ditutup dengan kaca penutup menggunakan media Fluoromount-G (Microscopy Science, Cat. No: 17984-25). Pengamatan hasil penelitian Hasil pewarnaan label tunggal diamati dengan mikroskop yang dilengkapi dengan kamera digital. Untuk pengamatan hasil pewarnaan secara label ganda digunakan mikroskop Nikon Optiphot yang dilengkapi dengan filter fluoresen Omega dan dipotret dengan menggunakan film Kodak Extrachrom 200. Gambar yang dihasilkan diolah dengan perangkat lunak grafis Adobe Photoshop CS edition. Perkembangan bentuk neuron KA ditentukan dengan melihat bentuk sel terbanyak dalam satu bidang pandang. Migrasi neuron diamati mulai dari lapisan ependima di dorsomedial oblongata kemudian sampai ke bagian ventrolateral.
36
Ciri neuron yang sedang bermigrasi diamati terutama pada daerah intermedia medula oblongata yaitu pada nukleus retikularis sentralis. Perbedaan intensitas pew arnaan terhadap antiserum TH diamati dengan melihat perbedaan warna dalam satu bidang pandang antara daerah dorsal dengan daerah sentral di area postrema, sedang terbentuknya jalur akson (pathway) diamati dengan melihat kelompok prosesus sitoplasma yang tersusun teratur sehingga membentuk suatu jalur. Perkembangan pembuluh darah di AP diamati dengan melihat distribusi dan densitas pembuluh darah, serta keterkaitannya dengan badan sel maupun prosesus sitoplasma neuron KA. Interpretasi hasil pewarnaan imunohistokimia Untuk menampilkan neuron KA dalam penelitian ini digunakan pewarnaan
imunohistokimia
label
tunggal
TH,
dengan
mengamati
imunoreaktivitas neuron terhadap antibodi TH yang digunakan. Dengan metode ini, neuron KA yang memiliki enzim TH akan berikatan dengan antibodi terhadap TH yang digunakan. Sebagai kromogen untuk memvisualisasikan neuron KA digunakan DAB yang memperlihatkan warna coklat kekuningan untuk neuron yang imunoreaktif terhadap antibodi TH (ir-TH). Bagian neuron yang terwarnai adalah badan sel, dendrit, dan akson, tetapi inti sel tidak terwarnai karena enzim TH terdapat di sitoplasma. mikroskopik,
maka
dilakukan
Untuk mempermudah pengamatan secara counter
staining
dengan
menggunakan
hematoksilin yang menghasilkan warna ungu pada inti sel. Oleh karena neuron KA ada yang mensintesis TH, DBH, atau keduanya, maka untuk melihat secara lebih spesifik jenis neuron katekolaminergik tersebut dilakukan teknik pewarnaan secara imunofluoresen dengan label ganda menggunakan antibodi terhadap enzim TH dan DBH pada sampel F 55, F 70, dan F 145.
Kromogen untuk antibodi terhadap TH yang digunakan adalah
rodamin, sedangkan
untuk antibodi terhadap DBH adalah FITC.
Pada
pewarnaan label ganda ini neuron ir-TH tampak berwarna merah, sedangkan yang imunoreaktif terhadap DBH (ir-DBH) berwarna hijau. Dengan demikian dapat diketahui bahwa neuron yang ir-TH tetapi tidak ir-DBH adalah neuron DA, sedangkan neuron yang ir-TH dan ir-DBH merupakan neuron NA.
37
Analisis hasil Pengamatan hasil pewarnaan imunohistokimia label tunggal (TH), label ganda (TH dan DBH) dilakukan terhadap bentuk sel, proliferasi, pola migrasi, diferensiasi, maturasi, perbedaan intensitas pewarnaan, serta pembuluh darah. Data yang diperoleh ditampilkan dalam bentuk gambar dan dianalisis secara deskriptif.
38
