MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV FYZIKÁLNÍ ELEKTRONIKY
Diplomová práce
Brno 2012
Hana Dvořáková
MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV FYZIKÁLNÍ ELEKTRONIKY
VYUŽITÍ PLAZMATU PRO STERILIZACI Diplomová práce
Hana Dvořáková
Vedoucí práce: Mgr. Pavel Sťahel, Ph.D.
Brno 2012
Bibliografický záznam Autor:
Bc. Hana Dvořáková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav fyzikální elektroniky
Název práce:
Využití plazmatu pro sterilizaci
Studijní program:
Fyzika
Studijní obor:
Biofyzika
Vedoucí práce:
Mgr. Pavel Sťahel, Ph.D.
Akademický rok:
2011/2012
Počet stran:
60
Klíčová slova:
sterilizace, plazma, dielektrický bariérový výboj,
Bibliographic Entry Author:
Bc. Hana Dvořáková Faculty of Science, Masaryk University Department of Physical Electronics
Title of Thesis:
Plasma assisted sterilization
Degree programme:
Physics
Field of Study:
Biophysics
Supervisor:
Mgr. Pavel Sťahel, Ph.D.
Academic Year:
2011/2012
Number of Pages:
60
Keywords:
sterilization, plasma, dielectric barrier discharge
Abstrakt V této diplomové práci je zkoumán průběh sterilizace skleněného materiálu. Pro sterilizaci byl použit dielektrický bariérový výboj za atmosférického tlaku ve vzduchu. Zkoumán byl vliv délky expozice, teploty a příkonu na efektivitu sterilizace. Změny podmínek pro různá nastavení byly vyhodnoceny pomocí optické emisní spektroskopie. Jako modelový organizmus byly použity pivní kvasnice (Saccharomyces cerevisiae). Výsledky byly vyhodnoceny pomocí vitálního testu s použitím methylenové modři.
Abstract The thesis analyses a process of sterilization of a glass material. For the sterilization a dielectric barrier discharge in atmospheric pressure was used. The influence of the duration of exposition, temperature and input on the efectivity of the sterilization was analysed. Changes of conditions for different settings were evaluated with the optical emission spectroscopy.
Brewer's
yeast
was
used
were evaluated via vital test with methylene blue.
as
a
model
organism.
The
results
Poděkování Děkuji vedoucímu mé práce Mgr. Pavlu Sťahelovi, Ph.D. za rady a pomoc které mi poskytl. Také bych chtěla poděkovat doc. RNDr. Miroslavu Němcovi, CSc. za rady ohledně přípravy a zpracování vzorků a Mgr. Janu Čechovi za pomoc při měření a zpracování optické emisní spektroskopie.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.
Brno 10. května 2012
……………………………… Jméno Příjmení
Obsah 1 Použité zkratky................................................................................................. 10 2 Úvod................................................................................................................... 11 3 Teoretická část.................................................................................................. 12 3.1 Sterilizace.................................................................................................. 12 3.2 Sterilizační metody.................................................................................... 14 3.2.1 Sterilizační metody při teplotě do 50 °C ....................................... 14 3.2.1.1 Fyzikální metody............................................................ 14 3.2.1.2 Chemické metody........................................................... 16 3.2.2 Sterilizační metody při teplotě do 100 °C ..................................... 18 3.2.3 Sterilizační metody při teplotě nad 100°C .................................... 19 3.2.4 Plazmová sterilizace...................................................................... 22 3.2.4.2 Komerční plazmové sterilizátory ................................... 22 3.2.4.1 Mechanizmus účinku sterilizace plazmatem................ . 23 3.3 Kontrola sterilizace ................................................................................... 27 3.4 Inaktivační křivka...................................................................................... 28 3.5 Podmínky ovlivňující sterilizaci................................................................ 30 3.6 Plazma ....................................................................................................... 31 3.6.1 Zdroje plazmatu ............................................................................ 31 3.6.2 Typy plazmatu............................................................................... 32 3.6.3 Diagnostika plazmatu emisní optickou spektroskopií .................. 33
4 Praktická část ................................................................................................... 35 4.1 Použitý mikroorganizmus.......................................................................... 35 4.1.1 Saccharomyces cerevisiae............................................................. 35 4.2 Experimentální uspořádání........................................................................ 37 4.2.1. Experimentální aparatura ............................................................. 38 4.3 Spektrální analýza ..................................................................................... 40 4.4 Příprava vzorků ......................................................................................... 42 4.5 Opracování vzorků .................................................................................... 43
8
4.6 Vyhodnocení vzorků ................................................................................. 44 4.7 Zhodnocení výsledků ................................................................................ 47 4.7.1 Vliv teploty na účinnost sterilizace ............................................... 47 4.7.2 Vliv vysychání vzorku na účinnost sterilizace.............................. 50 4.7.3 Vliv příkonu na účinnost sterilizace.............................................. 51 5 Závěr.................................................................................................................. 54 6 Použitá literatura ............................................................................................. 56
9
1 POUŽITÉ ZKRATKY
DBD
dielektrický bariérový výboj
DNA
deoxyribonukleová kyselina
EtO
ethylenoxid
FPS
první pozitivní systém
FNS
první negativní systém
HBV
virus žloutenky typu B
HIV
virus lidské imunitní nedostatečnosti
NK
nukleové kyseliny
S. cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
SPS
druhý pozitivní systém
UV
ultrafialové světlo
10
2 ÚVOD
Při použití tradičních sterilizačních metod dochází k určitému znehodnocení sterilovaného materiálu. Může dojít ke změnám nebo kontaminaci toxickými a karcinogenními látkami. Navíc není žádná metoda univerzálně použitelná. V praxi se proto většinou používá kompromisní řešení, které umožňuje provést dostatečně kvalitní sterilizaci a zároveň neznehodnotí daný materiál. Sterilizace plazmatem má oproti běžně používaným metodám mnoho výhod. Umožňuje provést efektivní sterilizaci i za nízkých teplot a je proto použitelná i pro termolabilní látky. Oproti ostatním nízkoteplotním metodám je rychlá a nezanechává na předmětech žádná chemická rezidua. Výhodná je i možnost provést součastně i úpravu vlastností povrchu sterilovaných předmětů. Je možné variabilně měnit druh a množství reaktivních částic. Proto je plasma v současnosti zajímavou alternativou konvenčních sterilizačních metod. Pro sterilizaci je možné použít širokou škálu pracovních plynů a tlaků. Ale výboje za atmosférického tlaku a především výboje v atmosféře značně snižují náklady a urychlují celý proces. V plazmatu působí na sterilované předměty hned několik mechanizmů. Jsou to teplo, radikály, UV záření a nabité částice. Podíl vlivů těchto mechanizmů se liší v závislosti na parametrech plasmového reaktoru i napájení. Proto je v této práci studován vliv výboje v atmosféře na mikroorganizmy v závislosti na teplotě. Především zda a jaké má měnící se teplota důsledky na účinnost sterilizace a poškození vzorku.
11
3 TEORETICKÁ ČÁST
3.1 Sterilizace Sterilizace je pojem, který zahrnuje procesy vedoucí ke zničení všech životních forem mikrobů vně i uvnitř sterilovaného předmětu. Dojde tedy k likvidaci nejen vegetativních forem, ale i k usmrcení veškerých spor, virů, hub, červů, vajíček a jiných zárodků. [4,8,13] Během
sterilizace
nedochází
k odstranění
pozůstatků
zahubených
mikroorganizmů ani jejich produktů. Sterilní materiál tak může obsahovat endotoxiny a další produkty metabolizmu. [8,14] Absolutní sterilita je v běžném provozu jen těžko dosažitelná a vždy je riziko, že dojde k nějakému selhání. Proto se předměty považují za sterilní v případě, že je pravděpodobnost výskytu mikroorganizmů menší než 10-6. Tato sterilita je označována jako komerční, technická nebo praktická. [1,3] Kvalitu sterilizace ovlivňuje i předsterilizační příprava, během které dochází k odstranění nečistot. Pravidla pro předsterilizační přípravu i pro samotnou sterilizaci upravuje v České republice vyhláška č. 195/2005 Sb. [11] Sterilizace má své významné místo ve zdravotnictví, kde se používá pro ošetření nástrojů, přístrojů i nejrůznějších textilií [1]. Významné místo má i v potravinářství, průmyslu a konzervárenských oborech. Většina sterilizačních metod je fyzikální povahy. Dostatečně účinných chemických prostředků je jen málo. Některé méně účinné metody chemické sterilizace jsou označovány jako vyšší stupeň desinfekce. Tento pojem zahrnuje postupy, které sterility prakticky dosáhnou a vedou k inaktivaci bakterií, virů, mikroskopických hub i bakteriálních spor, s výjimkou těch vysoce rezistentních. Používá se v případě, že daný předmět není možné sterilizovat. [4,8] Podle potřeby je možné využít pro eliminaci mikroorganizmů i jiné než sterilizační postupy.
12
Desinfekce neslouží k odstranění všech forem mikroorganizmů, ale jen jejich vegetativních forem. Používá se v případě, že sterilizace není z různých důvodů možná nebo nezbytně nutná. Pro sterilizaci jsou používány chemické prostředky, které jsou méně agresivní než v případě sterilizace. Přesto musí mít látky používané pro desinfekci široké spektrum působení, účinkují proti mnoha virům, vegetativním
formám
bakterií
a hub,
ale spory a některé
odolnější
mikroorganizmy nelze pouhou desinfekcí zničit. [1,8,13,14] Desinfekci můžeme rozdělit na ochranou (profylaktickou) a ohniskovou (represivní). Zatímco ohnisková desinfekce usiluje o zničení původců nákazy v místě jejich původu ochranná desinfekce usiluje pouze o eliminaci rizika přenosu nákazy k fyzickým osobám, příkladem může být preventivní chlorace pitné vody. [3,4,8]
Antisepse je desinfekce živých tkání, která usiluje o destrukci nebo inhibici patogenních mikroorganizmů. Používají se málo agresivní chemické prostředky aby se zabránilo poškození okolní tkáně. [1,14]
Sanitace zahrnuje kromě desinfekce i úklid, odstranění nečistot a zbytků mikroorganizmů.
Provádí
se
jako
součást
úklidu
v potravinářských
a
zdravotnických zařízeních. [1,14]
Dekontaminace je široký pojem zahrnující nejen usmrcení mikroorganizmů, ale i odstranění všech znečišťujících látek. Během dekontaminace musí být odstraněna veškerá chemická i radioaktivní kontaminace. Narozdíl od dezinfekce nebo sterilizace zahrnuje i likvidaci případných mikrobiálních toxinů. [1,8,13]
Asanace je komplexní systém preventivních opatření, které mají zabránit přenosu nákazy na obyvatelstvo. Součástí je desinfekce, dezinsekce a deratizace. [3]
Asepse má zabránit kontaminaci sterilního prostředí a měla by vést k tomu, že se v daném prostředí bude vyskytovat jen minimální množství mikroorganizmů. [3,8]
13
3.2 Sterilizační metody Vzhledem k různorodé povaze sterilovaných materiálů neexistuje žádná univerzální metoda, proto se vždy z možných postupů vybírá ten nejvhodnější. Výběr sterilizační metody ovlivňuje povaha předmětu (materiál, tvar, velikost, poréznost), předpokládaná kontaminace i riziko přenosu a šíření infekce. [1,4]
3.2.1 Sterilizační metody při teplotě do 50 °C Pro sterilizaci za nízké teploty můžeme použít fyzikální, nebo chemické postupy. Fyzikální metody
jsou vhodné zejména pro předměty u kterých je
nežádoucí chemická kontaminace. Chemická sterilizace se používá v případě, že na daný materiál není možné aplikovat fyzikální metody. Nevýhodou těchto postupů je práce s chemickými látkami, které jsou často nestabilní, nebo zdraví škodlivé.
3.2.1.1 Fyzikální metody Ionizační záření V tomto případě se používají dva různé druhy záření γ a β. Jako zdroj γ záření se používá
60
Co a pro výrobu β záření se používají lineární urychlovače.
Nevýhodou β záření je jeho menší pronikavost, pro obsluhující osoby je ale méně nebezpečné a odpadá nutnost manipulace s radioaktivním materiálem. Pro zajištění průmyslové sterilizace stačí dávka 255 kGy. [1, 14] Mechanizmem účinku gama záření je ionizace vnitrobuněčné vody a vznik hydroxilových radikálů, které reakcí s důležitými molekulami poškozují buňku. [2, 13] Používá se pro málo kontaminované předměty, které mohou být díky pronikavosti záření již zabalené. Ideální je proto pro ošetření právě vyrobených zdravotních pomůcek na jedno použití, termolabilních vakcín, antibiotik a jiných preparátů biologického původu. Tato metoda nesmí být použita v případě, že
14
došlo ke kontaminaci virem HIV, nebo HBV. Přestože jsou polymery poškozovány degradací řetězců, je ionizační záření alternativou sterilizace plastů ethylenoxidem. [1, 4, 14] V některých zemích je možné používat ionizační záření i pro úpravu potravin. Tím dojde k prodloužení jejich trvanlivosti.
Ultrafialové záření Jedná se o elektromagnetické záření mezi viditelným a rentgenovým zářením s vlnovou délkou mezi 10 a 380 nm. Je dobře pohlcováno NK a má tedy silné mutagenní účinky. Kvůli malé pronikavosti a krátkému dosahu (30-50 cm) lze UV záření použít pouze pro sterilizaci čistých povrchů umístěných v blízkosti zdroje. UV záření způsobuje poškození genetické informace a tím podmiňuje vznik mutací. Mutace nemusí mít letální účinky, stačí když brání dalšímu množení buněk. [2, 4, 13] Komerční rtuťové zářiče mají životnost 1000-2000 hodin a často se používají ke snížení mikrobiální kontaminace pracovních ploch, vody a vzduchu.
Filtrace Používá se pro odstranění větších mikrobů jako jsou bakterie nebo mikromycety. Menší částice a viry mohou filtrem projít. Efektivita závisí na složení filtru, velikosti jeho pórů filtru i na množství a druhu přítomných mikroorganizmů. [1, 4] Filtry jsou vyráběny z porcelánu, slinutého skla, umělohmotných náhražek azbestu a jiných porézních materiálů. [4] Alternativou jsou membránové filtry vyrobené ze syntetických materiálů jako nitrocelulóza a acetátcelulóza. Ty jsou relativně chemicky inertní a málo absorbují tekutiny. [13] Filtrace má široké uplatnění. Používá se pro úpravu pitné vody i v potravinářství. Důležitá je filtrace roztoků u kterých by tepelnou úpravou došlo ke znehodnocení jako je krev, krevní sérum, antibiotika a radiofarmaka. Filtry jsou součástí vzduchové ventilace bezpečnostních boxů a sterilizačních přístrojů s nucenou cirkulací vzduchu. Pro urychlení filtrace roztoků se často používá nasávání pomocí podtlaku. [4, 13, 14]
15
3.2.1.2 Chemické metody Účinnost chemické sterilizace stoupá s dobou působení a s rostoucí koncentrací použitého činidla. Stejnou závislostí se řídí i rozsah poškození materiálu během sterilizace, proto musíme vzít v úvahu i jeho odolnost. Protože jsou velké rozdíly v citlivosti mikroorganizmů na jednotlivá činidla, může se efektivita sterilizace zvýšit, pokud víme o jaký druh mikroorganizmů se jedná. [4]
Formaldehyd Jedná se o dráždivý, ve vodě velmi dobře rozpustný plyn, který vzniká oxidací methanolu. Je to velmi silné redukční a alkylační činidlo s dobrým mikrobiocidním účinkem. Během sterilizace dochází k alkylaci NK a proteinů formaldehydem. Tím dojde k jejich inhibici a tedy i úmrtí organizmu. Pro sterilizaci je používána směs formaldehydových par s vodní párou při teplotě 60 - 80 °C. Nevýhodou je silná toxicita a malá penetrace. Penetraci lze zvýšit střídáním tlaku ve sterilizační komoře. Po ukončení sterilizace musí dojít k důkladnému
odvětrání
zbytkového
formaldehydu.
Maximální
povolené
množství reziduí je 200 mg. [4, 10] Používá se pro sterilizaci povrchů, místností, textilií a přístrojů, které by mohly vyšší teploty poškodit. [1, 4]
Ethylenoxid Je jedovatá kapalina s mutagenními a karcinogenními účinky. Mechanizmus sterilizace je stejný jako v případě formaldehydu. Díky širokému spektru účinku dobré penetraci, nekorozivitě a nízké teplotě sterilizace je tato metoda v průmyslu i ve zdravotnictví v současné době nejrozšířenější. [1, 9, 13] Pro sterilizaci se používají páry ethylenoxidu o teplotě 37 - 55 °C při tlaku vyšším než 20 kPa. Protože páry se vzduchem vybuchují používá se někdy směs s inertním plynem (CO2). Tento postup je bezpečnější ale i dražší. Po ukončení cyklu je nutné sterilovaný materiál důkladně odvětrat, to může trvat i několik dní. Po odvětrání nezůstávají žádná rezidua.
16
Díky tomu, že ethylenoxid proniká většinou umělých hmot je možné sterilovat již zabalené předměty. Metodu lze aplikovat na textil, termolabilní plasty, porézní materiály, zdravotnické pomůcky a nástroje. [4]
Glutaraldehyd Jedná se o velmi silný desinfekční prostředek. Jeho účinky se přibližují sterilizaci, ale není to příliš spolehlivá metoda. Při krátkých expozicích ničí bakterie i viry, po delší době dojde i k usmrcení spor. [1, 4] Používá se 2% roztok glutarakdehydu stabilizovaný NaHCO3. Po ukončení sterilizace je potřeba opláchnou předměty sterilní destilovanou vodou. Jedná se o vhodný prostředek pro ošetření citlivých lékařských přístrojů a nástrojů. [4]
Ozon Ozon je nestabilní molekula tvořená třemi atomy kyslíku. Vzniká při interakci kyslíku s UV zářením. Ozon uvolňuje během rozpadu atomární kyslík. Toto silné oxidační činidlo pak naruší molekulární vazby. Reaguje s SH skupinou proteinů a tím mění prostorovou konfomaci [4]. Kromě biocidních účinků oxiduje ozon i ostatní přítomné organické látky a může tak přispět k odstranění nežádoucích látek. [15] Silně účinkuje na bakterie, spory i neobalené viry, velmi dobře proniká i do porézních materiálů. Vzhledem k tomu, že účinkuje i za nízkých teplot a biocidní účinek je silně ovlivněn mírou znečištění, je tato metoda používána především pro úpravu vody a vzduchu. [4, 15]
Kyselina peroctová (peroxooctová) Mechanizmus sterilizace je obdobný jako u ozonu. Také zde dochází k inhibici důležitých buněčných struktur oxidací. Pro sterilizaci se používají páry 3% roztoku kyseliny peroctové v uzavřeném prostoru, kde se poté rozloží na netoxický peroxid vodíku a kyselinu octovou. Nevýhodou je, že v koncentrované formě je kyselina peroctová výbušná a po naředění se rychle rozkládá. Proto je nutné vždy připravit čerstvý roztok. [4]
17
Tato metoda je vhodná pro drobné nekovové předměty. To je dáno malou penetrací a silnými korozivními účinky kyseliny peroctové.
3.2.2 Sterilizační metody při teplotě do 100 °C Var Za normálního atmosférického tlaku je teplota varu vody okolo 100 °C. Tato teplota je pro většinu mikrobů ve vegetativním stádiu smrtící během několika minut, některé kmeny bakterií přesto zničí až několikahodinový var. U spor termofilních organizmů a odolných virů k inaktivaci nedochází. Z důvodů nespolehlivosti se nesmí tato metoda používat ve zdravotnických zařízeních. [4, 13]
Frakcionovaná sterilizace Základem této metody je opakované trojnásobné zahřátí na 100 °C po dobu 30 minut, prokládané 18 – 24
hodinovou inkubací při 37 °C.
Vychází se
z předpokladu, že spory které odolaly zahřátí, vyklíčí během inkubace za vhodných podmínek a budou zničeny v dalším cyklu. Jako zdroj tepla se používá pára produkovaná Arnoldovým sterilizátorem. [3, 4] Je vhodná pro ošetření sporami infikovaných termolabilních materiálů.
Tyndalizace Princip i postup je obdobný jako u frakcionované sterilizace. Rozdíl je v tom, že se vzorky zahřívají na nižší teplotu a celý cyklus se opakuje až šestkrát. Zahřívání probíhá ve vodní lázni po dobu 30 – 60 minut při teplotě kolem 60 °C. [4] Tyndalizace je vhodná především pro extrémně termolabilní roztoky bílkovin, které by byly vyšší teplotou na 60 °C znehodnoceny. [4]
18
Pasterizace Během pasterizace dochází k zahřání na teplotu nižší než 100 °C a následnému prudkému zchlazení na teplotu nižší než 10 °C. Podle povahy sterilované látky můžeme vybírat mezi pasterizací dlouhodobou, krátkodobou nebo mžitkovou. Během dlouhodobé pasterizace se vzorek zahřívá po dobu 30 minut při teplotě 62 °C. Krátkodobá pasterizace je zahřátí na 72 – 75 °C po dobu 15 – 20 vteřin. Během mžitkové pasterizace dojde k zahřátí na teplotu až 85 °C a následnému rychlému ochlazení. Používá se pro snížení mikrobiální kontaminace potravinářských výrobků. [4, 13]
3.2.3 Sterilizační metody při teplotě nad 100 °C Pára Pro sterilizaci je možné používat páru za normálního tlaku o teplotě 100 °C, nebo páru pod tlakem. V tabulce 1 je závislost teploty páry na tlaku. Tlak (Mpa)
Teplota (°C)
0,1 0,2 0,3
100 121 134
tab. 1 – Závislost teploty páry na tlaku [1]
Pára za atmosférického tlaku nemá dostatečné sterilizační účinky, protože není schopna zničit odolnější spory patogenních mikroorganizmů. Proto se používá jen ve speciálních případech, kde se přítomnost těchto spor nepředpokládá. Jako zdroj páry se používá Arnoldův přístroj nebo Kochův hrnec. [4] Pára pod tlakem je schopna uvolnit velké množství tepla během kondenzace a umožňuje tak rychlé zahřátí. Proto má lepší sterilizační účinky, než pára za normálního tlaku. Díky tomu, že mikroorganizmy jsou citlivější na vlhké teplo, než na suché, je parní sterilizace nejspolehlivějším sterilizačním postupem. V tabulce 2 jsou uvedeny parametry sterilizace. [1, 4, 14]
19
Teplota (°C)
Čas (min)
121 126 134
15 10 3
tab. 2 – Parametry parní sterilizace [1]
Mechanizmem účinku je tepelná denaturace bílkovin, narušení buněčných membrán a rozklad NK. Zvýšený tlak nemá žádné sterilizační účinky. Používají se speciální přístroje, autoklávy. Ty mohou mít různé vlastnosti podle sterilovaného materiálu (kapaliny, porézní materiály, laboratorní nástroje). Před začátkem sterilizace musí být vnitřní prostor autoklávu vakuován, protože vzduch snižuje kvalitu páry. [1, 4, 13] Právě kvalita páry má největší vliv na kvalitu sterilizace. Ideální je sytá pára jejíž teplota přesně odpovídá tlaku. Je tvořena směsí páry a kapaliny, přičemž pára tvoří 98%. Pokud je teplota vyšší než by odpovídalo tlaku mluvíme o přehřáté páře, která může uvolnit jen velmi malé množství tepla. Podobně je na tom i mokrá pára, která se vyskytuje při nižší teplotě, než je optimální. Je tvořena směsí syté kapaliny a syté páry. [2, 8, 12] Pára pod tlakem je vhodná pro sterilizaci kovů, porcelánu, skla, bavlněných a lněných tkanin, gumy a odolných plastů. U roztoků má využití jen u těch termostabilních (kultivační půdy a roztoky). Po ukončení sterilizace roztoků je nutné pomalé ochlazování, jinak může dojít k poškození nádoby a tím i ke znehodnocení média. Předměty se do sterilizátoru vkládají zabalené do obalů z papíru, netkaného textilu nebo do kontejnerů s filtry. Pára nemá velkou penetraci, proto je vhodné balit předměty po malých dávkách. [4, 14]
Horký vzduch Sterilované předměty jsou zahřívány na teplotu mezi 160 a 180 °C. K inaktivaci dochází díky oxidativní destrukci protoplazmy. Svůj podíl na tom může mít tepelná denaturace bílkovin. [1, 4, 13] Přenos tepla je velmi pomalý a závisí na tepelné kapacitě a tepelné vodivosti sterilovaných předmětů a jejich obalů. Z tohoto důvodu je možné sklo a další materiály s dobrou tepelnou vodivostí sterilovat kratší dobu.
20
Aby byl ohřev
předmětů efektivnější, musí být ve sterilizační komoře nucená cirkulace vzduchu. Podmínky sterilizace jsou v tabulce 3. [4, 12, 14] Teplota (°C)
Čas (min)
160 170 180
60 30 20
tab. 3 – Parametry horkovzdušné sterilizace [4]
Teplo se pro snížení počtu mikrobů využívalo ještě dřív, než byla jejich existence prokázána. V dnešní době se používá především pro ošetření skla, keramiky, porcelánu a kovových předmětů, u kterých není na závadu případná ztráta ostrosti a tvrdosti. Sterilovat je možné i termostabilní kapaliny bez obsahu vody jako vosk, glycerin a různé tuky. Předměty vyrobené z přírodních materiálů rostlinného původu (papír, dřevo, textil) je nutné sterilizovat při nejnižší možné teplotě, aby se omezily kvalitativní změny, vzniklé působením vysokých teplot. [1, 4, 13]
Infračervené záření Jde o elektromagnetické záření s vlnovou délkou mezi 760 nm a 1 mm. Absorpcí tohoto záření dochází k ohřevu sterilovaných předmětů. Mechanizmus účinku je jako u horkého vzduchu. Proto jsou i podmínky, parametry a využití sterilizace infračerveným zářením shodné se sterilizací horkovzdušnou.
Plamen Rychlá a spolehlivá metoda sterilizace. Základním problémem je, že většina předmětů které je zapotřebí sterilizovat by byla ohněm úplně zničena. Proto se v praxi využívá jen v mikrobiologii pro rychlou sterilizaci nástrojů při práci. K tomuto účelu se používají především plynové kahany. Neúčinné je zapalování předmětů namočených v lihu, protože teplo uvolněné hořením lihových par je nedostatečné. Další aplikace je při likvidaci patologického materiálu. Spálením se zabrání přenosu patogenních mikroorganizmů a zároveň se odstraní i dotyčný předmět.
21
3.2.4 Plazmová sterilizace Konvenční metody sterilizace jsou sice spolehlivé, ale přesto se ve většině případů jedná o kompromis mezi kvalitou sterilizace, poškozením materiálu, chemickou kontaminací a rychlostí. Sterilizace plazmatem nabízí řešení těchto problémů. Plazma nezanechává žádná chemická rezidua a teplota výboje se může pohybovat kolem 50 °C. Metody plazmové sterilizace lze rozdělit na komerčně používané metody, které sterilizačního účinku dosáhnou biocidními chemikáliemi a na metody, které pro sterilizaci používají pouze plyny, které za normálních podmínek nemají sterilizační účinky. [23] Plazma má budoucnost v oblasti sterilizace lékařských nástrojů a polymerních materiálů. Možné je i využití pro dekontaminaci biologického a chemického znečištění. [20]
3.2.4.2 Komerční plazmové sterilizátory První komerční sterilizátory využívající plazma během sterilizačního cyklu se objevují již od roku 1970. Ve skutečnosti se nejedná o plazmovou sterilizaci, ale o sterilizaci chemickou. Plazma slouží pouze pro usnadnění a urychlení dekontaminace sterilizační komory. [23] Vakuovaný prostor sterilizační komory se plní chemikáliemi, které mají samy o sobě biocidní účinek. Většinou se používá kyselina peroctová nebo peroxid vodíku. Působením vysokofrekvenčních vln pak vzniknou reaktivní částice, které působí na mikroorganizmy. Doba sterilizace je 10 min, což u kyseliny peroctové znamená zkrácení sterilizačního cyklu o 83 %. Sterilované předměty se nesmí dotýkat vnitřních stěn sterilizátoru. Tato metoda není vhodná pro vlhké předměty, kapaliny a savé materiály [4].
22
3.2.4.1 Mechanizmus účinku sterilizace plazmatem Pokud je pro sterilizaci použit plyn bez sterilizačních účinků, jsou všechny inaktivační účinky způsobeny pouze plazmatem. Mechanizmy sterilizace jsou v tomto případě fyzikální i chemické povahy. Sterilizačního účinku je dosaženo vlivem tepla, UV záření, volných radikálů a elektricky nabitých částic. Velikost vlivu jednotlivých mechanizmů je dána především parametry použitého výboje. Důležitý je především použitý plyn, tlak v komoře a velikost dodávané energie. Účinek jednotlivých mechanizmů se mění i během samotného sterilizačního procesu. [21]
Teplo Teplotní sterilizace je jednou z nejčastěji používaných sterilizačních metod, ale během plazmové sterilizace spíše jen podporuje celkový sterilizační efekt. Není problém vytvořit dostatečně teplý výboj, ale nízká teplota je jednou z hlavních výhod tohoto postupu. U nízkoteplotního plazmatu tak nemusí mít teplo takřka žádný účinek.
Radikály Radikály jsou atomy nebo molekuly s nepárovými elektrony. Díky tomu jsou velmi reaktivní a jejich přítomnost má velký vliv na efektivitu sterilizace. Výskyt jednotlivých radikálů je ovlivněn použitým plynem. [17, 24] V atmosférickém výboji mají největší účinek radikály O, OH a NO. Zde je několik reakcí které vedou k jejich vzniku. N + O + N2 → NO + N2 NO + O3 ↔ NO + O2 NO2 + O2 + hv → O3 + NO
[21]
H2O + O3 ↔ O2 +2 OH e + H2O → OH + H + e O + H2O → 2OH Tyto reaktivní částice způsobují leptání povrchových částí mikrobů, oxidaci buněčných molekul a v případě ozonu je ovlivněno i buněčné dýchání. [23]
23
Leptání je způsobeno reakcí adsorbovaných radikálů s povrchem buňky. Při této reakci se uvolňují malé těkavé molekuly jako CO2 a H2O a další volné radikály. [16] Radikály poškozují především povrchové struktury. Rozrušením ochranných obalů spor a buněčných stěn usnadňuje pronikání UV záření. Cytoplazmatickou membránu nejvíce poškozuje hydroxylový radikál OH, který napadá její základní strukturní jednotky fosfolipidy. Funkce vnořených proteinových molekul zase narušuje atomární kyslík. Přes poškozenou buněčnou stěnu mohou z buňky unikat důležité látky a ionty a tím způsobit její smrt. [21, 23]
UV záření Zdrojem UV zářením jsou excitované částice. K uvolnění fotonu dojde během přechodu elektronu z vyšší energetické hladiny na nižší. Frekvence a tedy i energie tohoto fotonu je dána rozdílem obou energetických hladin. f=
(E1 – E2) h
Podle energie fotonu se UV záření dělí na blízké (λ = 380 – 200 nm), hluboké (λ = 300 – 200 nm), daleké (λ = 200 – 10 nm) a extrémní (λ = 31 –1 nm). Oblast blízkého UV záření se rozděluje na UVA (λ = 380 – 320 nm), UVB (λ = 320 –280 nm) a UVC (λ = 280 – 200 nm). Většina UV fotonů v atmosférickém výboji je produkována přechody v molekulách N2 a NO. Nevyskytuje se záření s vlnovou délkou menší než 200 nm [25]. Intenzita dopadajícího UV záření je ovlivněna tlakem plynu. Největší intenzity dosahuje při sterilizaci za sníženého tlaku, protože je méně pohlcováno pracovním plynem. [16]
Podle vlnové délky může UV záření působit na buňku různými způsoby. DNA nejlépe pohlcuje záření s vlnovou délkou 265 nm. Vlivem tohoto záření dochází na molekule DNA ke vzniku thyminových, případně cytosinových dimerů [7]. Na obrázku 1 je vidět jak vznik takovéhoto dimeru a jeho vliv na prostorovou strukturu.
24
obr. 1 – Thyminový dimer, vznik kovalentní vazby [35]
Kovalentní vazba mezi sousedními bázemi zabraňuje expresi a transkripci genů. Citlivost mikrobů na UV záření je velmi různorodá. Ovlivněna je kvůli malé pronikavosti UV záření především strukturou a složením buněčné stěny a přítomností barviv. Některé spory si zajišťují rezistenci vůči UV pomocí proteinu, který obalí DNA a tím změní jeho strukturu. Vliv na efektivitu sterilizace má i koncentrace buněk a znečištění okolního prostředí. [14] Toto poškození genetické informace není nevratné, mikroorganizmy obsahují reparační systémy, které umožňují uvést molekulu DNA do původního stavu. Jsou to fotoreparace a reparace bez účasti viditelného světla. [2] Preferovaným opravným mechanizmem je fotoreparace. Kovalentní vazba dimeru je rozštěpena pomocí enzymu fotolysy, který je aktivován světlem z viditelné oblasti spektra. Hlavní výhodou tohoto procesu je, že během něj nedochází ke vzniku mutací. [7] Reparace bez účasti viditelného světla je možná za jakýchkoliv světelných podmínek. Probíhá pomocí různých reparačních procesů, které mají rozdílnou přesnost. To znamená, že může dojít ke vzniku mutací. Kromě poškození nukleových kyselin dochází i k fotodesorbci. Během ní absorbované fotony ničí chemické vazby makromolekul a narušují tak strukturu buňky. Fotodesorbce tak stejně jako volné radikály napomáhají snadnějšímu pronikání UV záření k vnitřním strukturám buňky. [16]
25
Nabité částice Když jsou buňky vystaveny výboji dochází na jejich povrchu ke kumulaci náboje. Tento náboj způsobuje, že je cytoplazmatická membrána vystavena účinkům odpudivé elektrostatické síly. Tato síla klesá
s druhou mocninou
poloměru křivosti povrchu a roste spolu s tzv. nabíjecím potenciálem. Nabíjecí potenciál závisí na poměru hmotnosti iontů a elektronu. Je tedy přímo úměrný atomové hmotnosti daného plynu. [23] Pokud je elektrostatická síla dostatečně velká dojde k překonání meze pevnosti v tahu a tím i k prasknutí cytoplazmatické membrány. Důsledkem protržení buněční stěny je únik protoplastu do okolního prostření. Na obrázku 2 je porovnán vzhled buněk před a po opravování.
obr. 2 – Buňky E. coli pod elektronovým mikroskopem: a – před opravováním, b – po opracování [20]
26
3.3 Kontrola sterilizace Během sterilizačního procesu může dojít k nejrůznějším chybám a odchylkám od standardního průběhu. Z tohoto důvodu je pravidelně kontrolována kvalita a průběh sterilizace. Existují tři typy testů, biologické, fyzikální a chemické.
Biologické systémy kontroly V tomto případě jsou možné dva přístupy. První spočívá ve stěrech a kultivaci vysterilovaných předmětů. Během druhého se biologický materiál úmyslně vkládá do sterilizační komory. Jako biologický indikátor slouží spory ve standardizovaném množství naočkované na zabaleném nosiči. Pro testy jsou vybírány mikroorganizmy s vysokou rezistencí vůči danému sterilizačnímu postupu. Pokud ani po 10 – 14 dnech kultivace spory nevyklíčí, je vše v pořádku. [4, 8]
Fyzikální systémy kontroly Kontrolují se fyzikální parametry sterilizace v pravidelných intervalech v průběhu každého cyklu. Jde především o teplotu a tlak uvnitř sterilizační komory. Důležitá je i kontrola vakua a ním související těsnost aparatury. [4]
Chemické systémy kontroly Podmínky v aparatuře jsou sledovány pomocí chemických indikátorů. Ty reagují specifickou změnou barvy nebo jiných vlastností na změnu podmínek v aparatuře. Je tak možné kontrolovat přítomnost sterilizačního média nebo kvalitu vakua. Pro sledování průběhu parní sterilizace se používá BowiehoDickův test, který je schopen monitorovat míru penetrace páry do zabaleného materiálu. [1, 4, 8]
27
3.4 Inaktivační křivka Během sterilizace klesá počet živých buněk většinou exponenciálně v závislosti na délce expozice [1]. Pokud tomu tak je, je pro zpracování dat nejvýhodnější použít logaritmickou stupnici. Pokud se vynese v grafu logaritmus počtu živých mikrobů v závislosti na letální dávce, vznikne tzv. inaktivační křivka nebo také křivka přežití. Tato křivka má přibližně lineární průběh a není ovlivňována velikostí výchozí populace [1]. Ideální průběh této závislosti je na obrázku 3.
obr. 3 – inaktivační křivka
Parametr
který
poskytuje informace o efektivitě sterilizace se nazývá
D-hodnota. Je roven letální dávce, které je zapotřebí k usmrcení 90 % původní populace. Protože je letální dávka závislá na čase je i D-hodnota vyjádřená v časových jednotkách. V případě, že se ve sterilizaci pokračuje i poté co teoreticky přežívá už jen jedna buňka, určuje D-hodnota pravděpodobnost jejího přežití. [1, 3] D-hodnotu je možné jednoduše spočítat pomocí směrnice inaktivační křivky. D=
t log N0 – log NS
Takovéto ideálně lineární křivky přežití se vyskytují horkovzdušných sterilizátorů, autoklávů a u sterilizace pomocí EtO. Pro plazmovou sterilizaci je
28
charakteristické, že je inaktivační křivka složena ze dvou nebo tří lineárních úseků. Každý z úseků se tedy řídí jinou kinetikou. To znamená, že se i D-hodnota bude v průběhu sterilizace měnit. Inaktivační křivka pro plazmovou sterilizaci je na obrázku 4. [16]
obr. 4 – Inaktivační křivka pro plazmovou sterilizaci [16]
Předpokládá se, že rozdělení křivky je způsobeno tím, že v různých časech mají dominantní vliv různé sterilizační mechanizmy. V první fázi je malá D-hodnota. Předpokládá se, že je to dáno rychlým nástupem účinku UV záření. V této fázi působí především na horní vrstvy a izolované jedince. Kvůli nízké pronikavosti UV se ve druhé fázi snižuje jeho účinek a dominantním se stávají volné radikály spolu s fotodesorbcí. Těmto mechanizmům trvá dlouho, než buňku dostatečně poškodí, proto je v tomto úseku D-hodnota největší. K opětovnému zrychlení sterilizačního procesu dojde ve třetí fázi. Předpokládá se, že je to způsobeno účinkem UV záření, které může nyní v narušených buňkách snadno zasáhnout genetickou informaci. [16, 23]
29
3.5 Podmínky ovlivňující sterilizaci Kromě volby sterilizačního postupu a předsterilizační přípravy ovlivňují efektivitu sterilizace i další faktory, které jsou dány vlastnostmi sterilovaného materiálu.
Povaha mikroorganizmu Hlavně při tepelné sterilizaci jsou rozdíly mezi jednotlivými druhy mikrobů velmi výrazné. Rezistence může být různá i v rámci jednoho kmene. U sporulujících druhů je riziko, že část vyskytujících se mikrobů bude ve formě spor. Pokud není znám původ mikrobiálního znečištění, musí být použité sterilizační postupy schopné zahubit i ty nejodolnější druhy. [1, 2] Další faktor prodlužující dobu sterilizace je rozsah kontaminace. Platí že, čím je větší koncentrace mikrobů, tím je větší i nezbytná letální dávka.
Fyziologický stav I identické mikrobiální kultury mohou vykazovat různou rezistenci pokud jsou před sterilizací vystaveny rozdílným podmínkám. Organizmy, které se musely přizpůsobit horším podmínkám jsou odolnější než ty, které rostly v optimálním prostředí. [2]
Okolní prostředí Očištění sterilovaných předmětů se provádí v rámci předsterilizační přípravy. Kromě mechanických nečistot může sterilizaci negativně ovlivnit i silně viskózní prostředí a přítomnost organických látek. Komplikace způsobuje i sůl, která zvyšuje rezistenci mikrobů vůči EtO. [1, 2] Citlivost mikrobů můžeme naopak zvýšit vhodnou úpravou pH nebo zvýšením teploty [2].
30
3.6 Plazma Plazma je často označováno jako čtvrté skupenství hmoty. Hmota v tomto stavu má největší energii, protože teplota daného skupenství roste spolu s volností částic. Plazma jako další skupenství byla objevena teprve nedávno, přestože se v přírodě běžně vyskytuje. V roce 1928 tímto termínem označil Irwing Langmuir výboje ve vakuu. [26, 27] Součástí plazmatu jsou volné elektrony a kladné i záporné ionty, atomy, molekuly, volné radikály a částice v excitovaném i neexcitovaném stavu [27]. Jedná se tedy o ionizovaný plyn, ale ne každý ionizovaný plyn je plazmou. Plazma je definována jako kvazineutrální ionizovaný plyn, který vykazuje kolektivní chování. [30] V kvazineutrálním ionizovaném plynu je v průběhu času výskyt kladných i záporných nábojů přibližně stejný. Díky tomu se kladné a záporné náboje vzájemně neutralizují a plyn jako celek zůstává neutrální. To je možné díky tomu, že elektricky nabité částice vznikají v plazmatu v párech. [26] V plazmatu se nemohou částice pohybovat tak volně jako v neutrálním plynu. V neutrálním plynu se částice pohybují chaoticky a jejich dráha je ovlivňována pouze vzájemnými srážkami. V plazmatu je pohyb nabitých částic kromě srážek ovlivňován také elektrickými poli, které okolo sebe vytváří ostatní ionty. Lokální změna tak může vyvolat reakci i ve vzdálených oblastech. [26, 30] Plazma tvoří většinu hmoty ve vesmíru. Příkladem jsou hvězdy ve kterých je ionizace plynu důsledkem vysoké teploty, mlhoviny a mezihvězdný plyn ionizuje UV záření. Na zemi se plazma přirozeně vyskytuje pouze za zvláštních okolností jako je polární záře nebo blesk. [26]
3.6.1 Zdroje plazmatu Ionizovat plyn je možné různými způsoby. Mezi nejdůležitější patří zahřátí plynu na dostatečně vysokou teplotu a působení elektrického pole střídavého nebo stejnosměrného proudu.
31
Teplota termické ionizace je dána použitým plynem. Nejlépe jdou ionizovat alkalické body, protože mají ve vnější slupce atomového obalu jeden jen volně vázaný elektron. Sílu, která váže valenční elektron snižuje i vzdálenost od atomového jádra. Proto se hmotnější prvky snáze ionizují. [26] K tomu aby byl plyn elektricky vodivý, stačí teplota v řádech tisíců stupňů Kelvina. Pro úplnou ionizaci jsou zapotřebí teploty v rozmezí desítek až stovek stupňů Kelvina. [26] Při buzení pomocí elektrického pole se využívá volných elektronů, které se v plynu náhodně vyskytují. Tyto elektrony jsou urychlovány směrem k anodě a cestou narážejí do okolních částic. Těm předají část své kinetické energie a pokud je tato energie dostatečná, vyrazí z atomu elektron. Pokud je kinetická energie, kterou elektron získá na střední volné dráze, dostatečná pro uvolnění jiného elektronu, dochází ke vzniku řetězové reakce a vznikne tzv. elektronová lavina. S rostoucím napětím se zvyšuje i ionizace plynu. [26, 27]
3.6.2 Typy plazmatu Vlastnosti plazmatu ovlivňuje mnoho vlivů. Je to teplota, stupeň ionizace, termodynamická rovnováha, tlak a typ zdroje. Proto ho lze rozdělit podle více kritérií. Dělí se na vysokoteplotní s teplotou vyšší než 1 MK a nízkoteplotní. V oblasti nízkoteplotního plazmatu dále rozlišujeme ještě horké plazma s teplotou větší než 1000 K a studené plazma. Nízkoteplotní a vysokoteplotní rozdělení je pouze věcí konvence. [29, 31] Podle stupně ionizace můžeme plazma rozdělit na silně a slabě ionizovanou. V případě silné ionizace jsou nabité částice ve většině. V ideálním případě se vyskytují pouze ionty a elektrony. U slabé ionizace převládají částice neutrální. [29] Podle termodynamické rovnováhy se plazma dělí na rovnovážné (izotermické) a nerovnovážné (neizotermické). V rovnovážném plazmatu mají všechny částice stejnou teplotu, zatímco v nerovnovážném mají elektrony výrazně vyšší teplotu než těžší částice. Rovnovážné plazma vzniká většinou termální ionizací. [27]
32
Tlak plynu ovlivňuje především střední volnou dráhu částic a tím i jejich energii. Podle tohoto parametru se výboje dělí na nízkotlaké a vysokotlaké. [31] Plazma může být buzeno různými způsoby. Kromě tepla i stejnosměrným nebo střídavým elektrickým polem. Střídavé elektrické pole pak můžeme podle frekvence dále dělit. Příkladem uměle vytvářených výbojů je elektrický oblouk, doutnavý výboj, koronový výboj a bariérový výboj.
3.6.3 Diagnostika plazmatu emisní optickou spektroskopií Emisní optická spektroskopie používá pro určení vlastností výboje analýzu emitovaného elektromagnetického záření. Přednosti tohoto postupu jsou především bezkontaktnost a snadná obsluha. Během bezkontaktního měření nedochází k ovlivňování plazmatu vnějšími faktory. [32, 37] Poskytuje kvalitativní i kvantitavní informace o složení vzorku. Využívá charakteristického záření, které vyzařují excitované atomy a molekuly. Spektrum tohoto záření je nejčastěji polychromatické a nespojité. Jednotlivé spektrální čáry jsou charakteristické pro daný přechod v konkrétním prvku nebo molekule. Složitost spektra je tedy ovlivněna množstvím možných přechodů v částici. Identifikací spektrálních čar získáme informace o kvalitativním složením plazmatu. Dalším zpracováním emisního spektra je možné určit i koncentraci a teplotu jednotlivých částic. [29, 32] Energie fotonu, který je uvolněn během deexcitace je dána rozdílem energií hladin mezi kterými přechod probíhá.Vztah mezi frekvencí a uvolněnou energií je ∆E = h. f ∆E je rozdíl energetických hladin, h je Planckova konstanta a f je frekvence uvolněného záření. Pro excitaci atomu mu musí být dodána energie, která je stejná nebo větší než je rozdíl energetických hladin. Tento přenos může probíhat třemi způsoby. Absorpcí fotonu, předáním excitační energie mezi atomy a nepružná srážka s jinou částicí. Délka trvání excitovaného stavu je asi 10-8 s. [32]
33
Informace koncentraci konkrétního excitovaného stavu poskytuje intenzita spektrální čáry. Čím je intenzita spektrální čáry větší, tím více probíhá pro daný stav přechodů. Kromě koncentrace částic ovlivňuje intenzitu spektrální čáry i s pravděpodobností přechodu. Pravděpodobnost výskytu povolených přechodů je velmi vysoká, proto je jejich záření nejintenzivnější. Zakázané přechody se naopak budou vyskytovat jen zřídka. Ve vybuzeném stavu nejsou nikdy všechny částice. Z relativních intenzit spektrálních čar tak můžeme určit poměrné zastoupení jednotlivých částic. [28, 32, 37]
34
4 PRAKTICKÁ ČÁST
4.1 Použitý mikroorganismus V tomto experimentu byla použita kultura Saccharomyces cerevisiae. Tento mikroorganizmus je znám především pod názvem kvasinka pivní.
Taxonomické zařazení říše: Fungi oddělení : Ascomycota řád: Saccharomycetales čeleď: Saccharomycetaceae rod: Saccharomyces
Jako zdroj Saccharomyces cerevisiae bylo použito pekařské droždí výrobce Uniferm. Pro výrobu potravinářského droždí se používá kultura Saccharomyces cerevisiae Hansen [40]. Toto droždí bylo až do začátku experimentu skladováno při teplotě 4 °C. Doba použitelnosti nebyla nikdy kratší než 14 dní. Životaschopnost buněk byla ověřována referenčním vzorkem.
4.1.1 Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae má eukaryotní typ buňky. Přesto má schopnost velmi rychlého rozmnožování typické pro buňky prokaryotní. Proto se často používá jako modelový organizmus. Buňky kulovitého nebo elipsoidního tvaru mají velikost 3 – 6 µm. Nad cytoplazmatickou membránou je pevná třívrstvá buněčná stěna tvořena především polysacharidy. [5, 39] Barva kolonií pravidelného kulatého tvaru je světlehnědé až krémové barvy. Povrch je většinou hladký a lesklý [39].
35
Neběžnějším způsobem rozmnožování je nepohlavní pučení. Během něj vyrůstá nová buňka na buňce mateřské. Po oddělení je na buněčné stěně obou buněk patrná jizva. Podle počtu jizev lze odhadnout stáří kvasinky. V případě pohlavního rozmnožování dochází ke střídání diploidní a haploidní generace. Saccharomyces cerevisiae je heterotrofní fakultativně anaerobní organizmus. Známá je především díky své schopnosti zkvašovat sacharidy na ethanol a oxid uhličitý. Tato reakce je popsána rovnicí. C6H12O6 + S. cerevisiae → 2CH3CH2OH + 2CO2 V potravinářském průmyslu je kromě výroby alkoholických nápojů také významná produkce potravinářského droždí. Nezanedbatelný je podíl kvasinek v oblasti obohacování průmyslově vyráběných krmiv. [7] Kromě pozitivního významu mají kvasinky S. cerevisiae také nežádoucí projevy. Kromě nežádoucí kontaminace potravin má i patogenní účinky [5].
obr. 5 – Buňky Saccharomyces cerevisiae pod elektronovým mikroskopem [38]
36
4.2 Experimentální uspořádání Pro sterilizaci byl použit objemový dielektrický bariérový výboj v atmosféře. U bariérového výboje je mezi vodivými elektrodami přítomna dielektrická bariéra. Ta může být vyrobena například ze skla, slídy, různých keramických materiálů nebo různých polymerů. Dielektrikum může být umístěno na jedné elektrodě, na obou elektrodách nebo v prostoru mezi nimi. [34] Pro vybuzení dielektrického bariérového výboje je nutné používat střídavé napětí s amplitudou větší než je průrazné napětí. Důvodem je právě přítomnost dielektrické bariéry. [34] Vlivem dielektrické bariéry se náboj rozloží rovnoměrně na povrchu elektrody a vznikne nerovnovážný časově omezený výboj. Bariérový dielektrický výboj je možné zapálit za sníženého i atmosférického tlaku. Pro výboj za atmosférického tlaku je typický tzv. filamentární mód. Výboj je složený z velkého počtu krátkých mikrovýbojů (filamentů). Filamenty mají přibližně válcový průřez a spojují obě elektrody. Jejich konce se u dielektrické bariéry rozšiřují (obr. 6). [34, 37]
obr. 6 – filament DBD
Druhý mód, který se může u dielektrického bariérového výboje vyskytnout označujeme jako difúzní. Typicky se vyskytuje u výbojů za sníženého tlaku, ale vhodnou volbou pracovního plynu a budícího napětí je možné vytvořit difúzní mód i za atmosférického tlaku. Pro práci je výhodná především jeho homogenita. Pro bariérový dielektrický výboj je možné uspořádat elektrody do různých konfigurací. Podle vzájemného postavení elektrod rozlišujeme výboje objemové, povrchové a koplanární (obr. 7). [34, 37]
37
obr. 7 – Možné uspořádání elektrod u dielektrického výboje: a – objemový, b – povrchový, c – koplanární
4.2.1 Experimentální aparatura Schéma použité aparatury je na obrázku 8. Výboj je buzen v prostoru mezi dvěmi kovovými elektrodami. Jako dielektrikum bylo použito 2 mm tlusté sklo na vnitřní straně elektrod.
obr. 8 – Popis použité aparatury
Horní elektrodu tvoří měděný disk o průměru 57 mm. Tato elektroda je kvůli udržení konstantní teploty umístěná v nádobě s ledem a vodou. Dno nádoby tak tvoří jednu dielektrickou vrstvu. Dolní elektroda je napojená na vodní termostat a je tedy možné její teplotu dle potřeby měnit. Termostat byl dle potřeby chlazen tekoucí vodou. Teplota vody v termostatu byla ověřována digitálním teploměrem s platinovým čidlem.
38
Objem výboje by měl být omezen plochou elektrod, ale protože je horní elektroda umístěna ve vodivém prostředí, přesahuje výboj plochu elektrody. Pro zvýšení tohoto efektu byla do vody přidána kuchyňská sůl.
obr. 9 – Rozložení filamentů výboje při pohledu seshora
Na obrázku 10 je schéma prostou pro vkládání vzorků. Vzdálenost mezi elektrodami byla 5,6 mm, dielektrikum tuto vzdálenost zmenšilo na 1,6 mm. V místě kde byl vložen vzorek byla výsledná mezera jen 0,6 mm.
obr. 10 – Prostor pro vkládání vzorků
Pro vybuzení dielektrického bariérového výboje byl použit regulovatelný zdroj stejnosměrného proudu, vysokofrekvenční zdroj a vysokofrekvenční (50 kHz) transformátor. Použitá frekvence byla 100 kHz. Jak je vidět na obrázku 11, měl výboj vzniklý za těchto podmínek filamentární povahu.
obr. 11 – Vzhled výboje
39
4.3 Spektrální analýza
Výboj byl zkoumán také pomocí optické emisní spektroskopie. Vyzařované spektrum bylo do spektrometrů přivedeno křemenným optickým vláknem. Získaná emisní spektra byla dále zpracována programem Spectrum analyzer [41]. Pro získání přehledového emisního spektra výboje a zjištění rotačních a vibračních teplot molekuly dusíku byl použit spektrometr Horiba Jobin-Yvon FHR 1000 (mřížky 2400 vrypů/mm, štěrbina 1000 µm a 3600 vrypů/mm, štěrbina 20 µm). Tento spektrometr má rozsah 200 – 750 nm a rozlišení 0,1 Å. Přehledové spektrum zobrazené na obrázku 12 bylo pro vlnový rozsah 220-550 nm snímáno s integrační dobou 0,2 s. Druhá část přehledového spektra (obr. 12), pro rozsah vlnových délek 690 – 850 nm, byla získána pomocí spektrometru Avantes AvaSpec-2048TEC-2 (mřížka 300 vrypů/mm, štěrbina 25 µm) a to při integrační době 15 s. Spektrometr Avantes má menší rozlišení (1,4 nm), ale umožňuje snímání emisního spektra i pro vlnové délky větší než 750 nm (rozsah 200 – 1100 nm). To umožnilo detekovat v emisním spektru i emisní čáry kyslíku. Přehledové emisní spektrum získané spektrometrem Horiba Jobi-Yvon je pro vlnové délky 220 – 550 nm zobrazeno na obrázku 12 spolu identifikovanými emisními pásy. Pro lepší přehlednost nebyly na tomto spektru provedeny korekce spektrální citlivosti spektrometru. Ve výřezu je zobrazeno spektrum získané za spektrometru Avantes pro vlnové délky 690 – 850 nm s identifikovanými čarami atomárního kyslíku. Ve spektru jsme identifikovali NO-γ systém, II. pozitivní systém molekuly dusíku (SPS N2), I. negativní systém dusíkového kationu N2 (FNS N2, vlnová délka 391,5 nm) a dvě emisní čáry odpovídající tripletům čar atomárního kyslíku (777,4 nm a 844,6 nm), které jsou částečně překryty pásem I. pozitivního systému N2. Součástí SPS N2 je pás 337,1 nm (hlava 0-0) a pásy odpovídající změně vibračního kvantového čísla ∆ν = -2. Pomocí programu Spectrum Analyzer byla z intenzit rotačních čar pásu 337,1 nm odhadnuta rotační teplota molekuly N2.
40
Z intenzit pásů ∆ν = -2 (hlavy 0-3, 1-3, 2-4, 3-5) byla odhadnuta vibrační teplota molekuly N2. Rotační a vibrační teplota N2 byla změřena pro tři používané výkony, přičemž teplota dolní elektrody byla nastavena na 15 °C a 60 °C. Vibrační teplotu můžeme v rámci chyby stanovení považovat pro všechna nastavení za neměnnou, a to s hodnotou 2300 400 K. Z vývoje hodnoty rotační teploty molekuly dusíku můžeme usuzovat na změny teploty neutrálního plynu ve výboji. Při zohlednění chyby stanovení rotační teploty je patrný rozdíl rotační teploty při změně teploty dolní elektrody. Pro všechny použité výkony byla při teplotě dolní elektrody 15 °C hodnota rotační teploty v intervalu (330 – 360) 10 K. V případě, že byla teplota dolní elektrody 60 °C byla pro všechny použité výkony rotační teplota v intervalu (345 – 380) 10 K. Z toho lze usuzovat, že nárůst teploty dolní elektrody ovlivňuje teplotu neutrálního plynu ve výboji. 200 60000
300
400
500
600
700
800 60000
SPS N2 690
50000
720
750
780
810
840
870 12000
50000
10000
10000
8000
intenzita (a.u.)
8000
40000
6000
40000 6000
4000 4000 2000
30000
30000
2000
0
∆ν = -2
20000
10000
720
750
780
810
840
λ (nm)
20000
FNS N2
NO-γ systém
250
0 690
10000
300
350
400
450
500
550
λ (nm)
obr. 12 – Emisní spektrum výboje buzeného v laboratorní atmosféře za atmosférického tlaku.
41
4.4 Příprava vzorků Očkovací suspenze byla nanášena na podložní sklíčka o rozměrech 76x26 mm a výšce 1 mm. Ta byla předtím zbavena všech nečistot. Mastnota a větší nečistoty byly odstraněny vařením ve vodě s detergentem po dobu dvou hodin. Poté byla sklíčka opláchnuta a umístěna na 12 h do 10% roztoku kyseliny dusičné, kde došlo k degradaci aminokyselin a likvidaci proteinů. Po opláchnutí byla přendána na 10 h do 10% kyseliny chlorovodíkové, která odstranila kontaminaci NK. Po tomto ošetření byla sklíčka skladována v roztoku 96% roztoku ethanolu s 1% příměsí kyseliny chlorovodíkové. Na vzorky byla nanášena očkovací suspenze tvořená 100 ml fyziologického roztoku ( 9g NaOH na 1000 ml) a 10 g pekařského droždí. Aby bylo zaručeno dokonalé promíchání směsi byla očkovací suspenze před nanášením 30 minut umístěna na magnetické míchačce s frekvencí 300 otáček za minutu. Roztok byl míchán po celou dobu měření, aby byla zaručena rovnoměrná hustota buněk. V takto připraveném roztoku byla průměrná koncentrace 1,4 . 109 buněk na ml. Prostor pro nanášení suspenze byl na sklíčku vymezen pomocí lepící pásky. Během lepení bylo dbáno na to aby nedošlo ke kontaktu s prostorem pro vzorek. Vzhled a rozměry takto upraveného sklíčka jsou na obrázku 13. Do tohoto prostoru o ploše 225 mm2 bylo napipetováno 20 µl očkovací suspenze.
obr. 13 – Připravený vzorek
42
4.5 Opracování vzorků Vzorky byly pokládány na skleněný kryt dolní elektrody tak, aby byla část určená pro opracování umístěna přímo pod horní elektrodou. Tím byl eliminován vliv nehomogenity výboje mimo tuto oblast. Díky tepelně vodivému spojení byl vzorek temperován na teplotu dolní elektrody. Během opracování docházelo k rychlému
zahřívání
vzorku,
proto
byla
faktická
teplota
vyšší,
než
předpokládaná. Přesto byl vliv teploty na kvalitu sterilizace velmi výrazný. Základní měření proběhlo pro příkon 102,9 W. Během něj byl měřen sterilizační účinek výboje v závislosti na délce opracování a teplotě vzorku. Vzorky byly vystaveny účinkům výboje po dobu 12 min, 10 min, 8 min, 6 min, 4 min, 2 min, 1 min a 0,5 min. Teploty, kterým byly vzorky během měření vystaveny byly 60 °C, 50 °C, 40 °C, 30 °C, 20 °C a 15 °C. Kromě vlivu teploty a doby opracování byl zkoumán i vliv příkonu zdroje. Proto byla některá měření zopakována i pro další dva příkony 161,7 W a 132,3 W. U těchto příkonů bylo měření provedeno pouze pro teploty 60 °C a 15 °C. Délka opracování byla stejná jako v předchozím případě.
43
4.6 Vyhodnocení vzorků Pro zjištění počtu živých buněk byla použita metoda vitálního barvení 0,2 % roztokem methylenové modři. Methylenová modř je heterocyklická aromatická sloučenina se sumární vzorcem C16H18N3SCl. Strukturní vzorec je na obrázku 14.
obr. 14 – Strukturní vzorec methylenové modři [36]
Methylenová modř přidaná do buněčné suspenze proniká přes buněčnou stěnu a cytoplazmatickou membránu do nitra buněk. Živé buňky mají schopnost tuto cizorodou látku odstranit z cytoplazmy pumpováním. Mrtvé buňky tuto schopnost ztratí a proto se v nich methylenová modř hromadí až do vyrovnání koncentrací. Díky tomuto jevu mají usmrcené buňky tmavomodré zbarvení. Živé mají modře zbarvenou pouze buněčnou stěnu. To se projeví jako tmavá kontura buňky (obr. 15).
obr. 15 – Preparát barvený methylenovou modří: A – živá buňka, B – mrtvá buňka
Barvení methylenovou modří tedy umožňuje spolehlivě rozlišit živé a mrtvé buňky. Preparáty byly pozorovány mikroskopem Biolux NV se zvětšením 16x40. Pro zjištění koncentrace buněk byla použita počítací Bürkerova komůrka od firmy Meopta (obr. 16).
44
obr 16 - Bürkerova komůrka
Pracovní plocha komůrky je rozdělena drážkami na obdélníky a větší a menší čtverce. Menší čtverec má plochu 1/400 mm2 a větší 1/25 mm2. Hloubka komůrky je 0,1 mm. Počítat buňky je možné v kterémkoliv ohraničeném útvaru, ale není možné během jednoho měření tuto volbu změnit. Počítají se všechny buňky uvnitř pole a ty které se dotýkají jedné ze dvou vybraných hraničních stran. Tato volba je libovolná, ale rovněž není možné ji během počítání měnit. Pokud se nějaká buňka dotýká hraniční čáry, která nebyla vybrána, není započítána ani v případě, že by byla téměř celá uvnitř pole. Vzhled a rozměry mřížky Bürkerovy komůrky je no obrázku 17. Červenou barvou jsou označeny strany na kterých byly v tomto experimentu započítávány buňky.
obr. 17 – Pracovní plocha Bürkerovy komůrky
45
Po opracování vzorku byla opatrně odstraněna lepící páska, která ohraničovala prostor pro nanášení buněčné suspenze. Poté byly buňky z podložního sklíčka spláchnuty do zkumavky jedním mililitrem fyziologického roztoku. Do zkumavky se vzorkem bylo pak přidáno 0,5 ml roztoku methylenové modře. Obarvený preparát bylo nutné okamžitě zpracovat, protože methylenová modř je toxická a časem usmrtí všechny buňky. Na komůrku bylo napipetováno 100 µl suspenze obarvených buněk. Po dvou minutách se buňky v komůrce usadily a bylo možné je spočítat. V každém vzorku bylo vyhodnoceno 10 po sobě jdoucích velkých čtverců. Schéma počítání je na obrázku 18.
obr. 18 – Schéma počítání buněk, barevně jsou označeny spočítaná pole.
46
4.7 Zhodnocení výsledků 3.7.1 Vliv teploty na účinnost sterilizace Během tohoto měření byly vzorky opracovávány dielektrickým bariérovým výbojem ve vzduchu. Měření bylo provedeno pro časy 12 min, 10 min, 8 min, 6 min, 4 min, 2 min, 1 min a 0,5 min. Aby bylo možné určit podíl zahřívání vzorku na efektivitu sterilizace byla teplota měněna pomocí temperování dolní elektrody napojené na termostat. Teplota dolní elektrody byla nastavena na 60 °C, 50 °C, 40 °C, 30 °C, 20 °C a 15 °C. Během opracování docházelo k zahřívání vzorku. Toto zahřátí nebylo možné úplně kompenzovat a proto byla teplota vzorku vyšší, než teplota temperované elektrody. Rozdíl předpokládané a skutečné teploty rostl spolu s časem opracování. V grafu na obrázku 19 je vynesena závislost počtu přežívajících buněk N na čase opracování. Počáteční koncentrace živých buněk byla 1,4 . 109 na ml. 0
2
4
6
8
10
12
10 9
15°C 20°C 30°C 40°C 50°C 60°C
1,4x10
9
1,2x10
9
1,0x10
1,40E+009 1,20E+009 8 1,00E+009 6 8,00E+008
8
N
8,0x10
8
6,00E+008 4
8
4,00E+008
6,0x10 4,0x10
2 2,00E+008
8
2,0x10
0,0
0,00E+000 0 0
2
4
6
8
t (min)
obr. 19 – Počet živých buněk v závislosti na čase a teplotě
47
10
12
K nejprudšímu poklesu počtu živých buněk dochází během prvních 30 vteřin. Během této doby je dosaženo redukce o jeden řád z 109 na 108. V této fázi probíhá sterilizace s téměř stejnou efektivitou pro všechny teploty. To je pravděpodobně způsobeno tím, že za tak krátkou dobu nedojde k takovému ohřevu vzorku, aby to na něj mělo výrazný vliv. Pozitivní vliv na efektivitu sterilizace mělo i to, že v tuto chvíli byly kvasinkové buňky ve vodním prostředí. Je to způsobeno tím, že mikroorganizmy jsou ve vodě vůči sterilizačním vlivům mnohem citlivější, než když jsou umístěny na suchém nosiči. Pokles efektivity po první fázi je pravděpodobně způsoben vysokou koncentrací kvasinek ve vzorku. Díky tomu se jednotlivé buňky překrývají a horní vrstvy chrání kvasinky uložené pod nimi před účinky málo pronikavého UV záření. Kolem šesté minuty dochází opět ke změně kinetiky sterilizačního procesu a efektivita sterilizace se zvyšuje. Podle [16] je to způsobeno tím, že horní vrstvy buněk byly poškozeny fotodesorbcí a volnými radikály. UV záření díky tomu není tolik pohlcováno a může zasáhnout i níže uložené buňky. Pro porovnání efektivity sterilizace byla použita D-hodnota. Tu je možné určit ze směrnice inaktivační křivky. Aby bylo možné zanést do grafu i hodnoty pro časy, kdy byl vzorek již sterilní a tudíž nebyly přítomny žádné živé buňky, byla k nim před logaritmováním přičtena jednička. Tato úprava byla provedena pro všechny inaktivační křivky. Na obrázku 20 je inaktivační křivka pro teplotu 60 °C.
log N
0
2
4
6
8
10
12
10
10
8
8
6
6
4
4
2
2
0
0
0
2
4
6
t (min)
obr. 20 – inaktivační křivka při t = 60°C
48
8
10
12
Časový úsek prvních třiceti vteřin měření je označený jako A. D-hodnota pro tuto část je 2,3 min. Druhý úsek je od jedné minuty do čtyř minut, D-hodnota je 6,25 min. D-hodnota pro třetí část je počítána pro úsek od šesti minut do deseti minut a je rovna 0,52 min. Poslední hodnota po 12 minutách měření nebyla započítána, protože mezi desátou a dvanáctou minutou nedošlo k úbytku živých buněk. V tabulce 5 jsou uvedeny D-hodnoty pro úseky A, B a C všech teplot. Čím je D- hodnota menší, tím efektivnější je sterilizace. Teplota (°C)
DA (min)
DB (min)
DC (min)
15 20 30 40 50 60
2,6 2,4 2,4 2,3 2,2 2,3
35,8 20,7 15,1 16 11,3 6,2
7,1 3,6 2,1 0,7 0,5 0,5
tab. 5 – D-hodnoty pro příkon 102,9 W
S rostoucí dobou opracování se začíná zvětšovat i vliv rozdílných teplot. Kromě přímého zahřívání nebo chlazení vzorku ovlivňuje nastavení termostatu také teplotu výboje. Právě spojení těchto dvou vlivů pravděpodobně způsobilo rozdíly v efektivitě sterilizace dobře viditelné v grafu na obrázku 19. Kromě efektivity sterilizace rostla s teplotou i odchylka od lineárního průběhu křivky. A to především v úseku C, kdy byl vliv teploty největší. Počet buněk zde klesá výrazně rychleji, než by odpovídalo lineárními průběhu. To může být způsobeno biocidním účinkem tepla. Na obrázku 21 je porovnání linearity inaktivačních křivek pro 60 °C a 15 °C.
log N
2
4
6
8
10
12
b
9,2
9,2
9,0
9,0
8,8
8,8
8,6
8,6
8,4
8,4
8,2
8,2
8,0
8,0
7,8
7,8 0
2
4
6
8
10
log N
0
a
0
4
6
8
8
6
6
4
4
2
2
0
0
2
4
6
8
obr. 21 – Porovnání linearity inaktivačních křivek: a – 15 °C, b – 60 °C
49
12
8
t (min)
t (min)
10
10
0
12
2
10
10
12
Z grafu i D-hodnoty je patrné, že ideální teplota pro sterilizaci je 60 °C, kdy bylo sterility dosaženo již po desíti minutách. S rostoucí teplotou ale zároveň rostlo i poškození vzorku. Z těchto důvodů se pro kvalitní a zároveň šetrnou sterilizaci jeví jako nejvhodnější teplota 30 nebo 40 °C, kdy bylo sterility dosaženo v rozumném čase a vzorek zároveň nejevil známky poškození. V obou případech bylo sterility dosaženo za dvanáct minut. V případě teplot 15 °C a 20 °C nedošlo k usmrcení všech buněk ani po dvanácti minutách.
3.7.2 Vliv vysychání vzorku na účinnost sterilizace Přítomnost vody v první fázi měla pravděpodobně pozitivní vliv na rychlost sterilizace, ale její přítomnost i v pozdější fázi mohla mít přesně opačný efekt. Na obrázku 23 je pro jednotlivé teploty vyznačený čas, kdy došlo k vysušení vzorku. U vzorků opracovávaných při 15 °C a 20 °C k úplnému vysušení nikdy nedošlo. Po vysušení vzorku dochází ke znatelnému spékání povrchu. To se projevuje jak změnou barvy ze světle krémové na hnědou tak i charakteristickým zápachem. Důsledky tohoto procesu se projevili během zpracování vzorků. V případě měření při 15 °C a 20 °C, kdy vzorky nevysychaly, byl počet buněk při počítání v Bürkerově komůrce stejný. U vzorků opracovaných při vyšší teplotě především při teplotě 60 °C, se počet buněk v Bürkerově komůrce neustále snižoval. Zbytky buněk, které byly touto cestou zničeny, pak byly v preparátu dobře patrné. Dobře viditelné byly především nabarvené trosky buněčných stěn (obr. 22).
obr. 22 – Porovnání zbytků rozpadlých buněk (v kolečku) a celé buňky
50
0
2
4
6
8
10
12 10
15°C 20°C 30°C 40°C 50°C 60°C
8
8,0x10
8
6,0x10
1,40E+009 1,20E+009 8 1,00E+009
N
6 8,00E+008 8
4,0x10
6,00E+008 4 4,00E+008
8
2,0x10
2 2,00E+008 0,0
0,00E+000 0 0
2
4
6
8
10
12
t (min)
obr. 23 – Časy vysušení vzorků jsou označeny červeným kolečkem
Na grafu je viditelná určitá změna ve strmosti křivky poté co byly vzorky již zcela vysušené. To by mohla být způsobeno právě snadnějším přístupem UV záření i volných radikálů k buněčným strukturám.
3.7.3 Vliv příkonu na účinnost sterilizace Pro teploty 15 °C a 60 °C bylo měření zopakováno i pro příkon 132,3 W a 161,3 W. Časy opracování zůstaly stejné jako v předchozím případě. V tabulce 6 jsou pro porovnání uvedeny D-hodnoty jednotlivých úseků inaktivačních křivek pro různé výkony. D-hodnota s rostoucím výkonem klesá, ale změna není příliš výrazná.
51
Teplota (°C) 15
60
Příkon (W)
DA (min)
DB (min)
DC (min)
102,9 132,3 161,3 102,9 132,3 161,3
2,6 2,5 2,3 2,3 2,3 2,3
35,8 22,9 19,2 6,2 6,5 5,7
7,1 6,4 5,7 0,4 0,3 0,2
tab. 6 – D-hodnoty pro příkon 102,9 W, 132,3 W a 161,3 W při teplotách 15 °C a 60 °C
Na obrázku 24 je porovnání průběhu sterilizace pro všechny tři použité příkony při teplotě 15 °C. Průběh křivky i výsledek celého procesu se od sebe příliš neliší. Ani v jednom případě nedošlo k vysušení vzorku a sterility nebylo dosaženo ani při měření s použitím maximálního příkonu. Maximální redukce byla o dva řády. 0
2
4
6
8
10
12
9
1,4x10
102,9 W 132,3 W 161,3 W
9
1,2x10
1,40E+009 1,20E+009
9
1,00E+009
8
8,00E+008
8
6,00E+008
8
4,00E+008
8
2,00E+008
0,0
0,00E+000
1,0x10
N
8,0x10 6,0x10 4,0x10 2,0x10
0
2
4
6
8
10
12
t (min)
obr. 24 – Porovnání počtu živých buněk v závislosti na čase a příkonu při teplotě 15 °C
52
Stejné porovnání pro měření při teplotě 60 °C je na obrázku 25. V tomto případě byl ve všech případech vzorek suchý již po dvou minutách opracování. Efektivita sterilizace se zvýšila, sterility bylo v případě nejvyššího výkonu dosaženo po osmi minutách opracování. S použitím středního výkonu byly vzorky rovněž sterilní za osm minut. Při opracování nejnižším výkonem došlo ke sterilizaci povrchu za 10 minut. 0
2
4
6
8
10
9
1,4x10
12
102,9 W 132,3 W 161,3 W
9
1,2x10
1,40E+009 1,20E+009
9
1,00E+009
8
8,00E+008
8
6,00E+008
8
4,00E+008
8
2,00E+008
0,0
0,00E+000
1,0x10
N
8,0x10 6,0x10 4,0x10 2,0x10
0
2
4
6
8
10
12
t (min)
obr. 25 – Porovnání počtu živých buněk v závislosti na čase a příkonu při teplotě 60 °C
Rozdíly v efektivitě sterilizace jsou způsobeny tím, že zvýšení výkonu dojde ke zvýšení počtu filamentů ve výboji. Díky tomu se zvýší i množství inaktivačních agens a proces sterilizace je urychlen. To, že rozdíly nejsou příliš výrazné, je pravděpodobně způsobeno tím, že ke zvýšení počtu filamentů došlo rovnoměrně v celém objemu výboje. Mnohé tak neměly na vzorek prakticky žádný účinek.
53
5 ZÁVĚR
V experimentu byl pro sterilizaci použit dielektrický bariérový výboj v atmosféře. Výboj byl buzen vysokofrekvenčním elektrickým polem. Příkon byl během měření nastaven na 102,9 W, 132,3 W a 161,7 W. Kromě vlivu proměnného výkonu byl zkoumán především vliv teploty dolní elektrody na efektivitu sterilizace. Jako modelový organizmus byla použita vřeckovýtrusná houba rodu Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae. Během měření stoupal počet usmrcených buněk spolu s dobou opracování. Kromě toho se ukázalo, že změna teploty má výrazný vliv na efektivitu sterilizace. Ta byla přímo závislá na použité teplotě. V případě teploty 60 °C byl vzorek sterilní již za 10 minut. Při použití teploty 15 °C nebylo sterility dosaženo ani po dvanácti minutách a výsledná redukce byla jen o 2 řády. Přesto se zvyšování teploty nejeví jako ideální způsob pro zlepšení efektivity sterilizace. S rostoucí teplotou totiž narůstá i poškození vzorku. Jako ideální sterilizační teplota se tedy jeví teploty mezi 30 a 40 °C. Pro porovnání kinetiky sterilizačního procesu byla použito D-hodnoty. Tato hodnota byla získána analýzou inaktivační křivky. Na každé inaktivační křivce byly identifikovány tři oblasti s rozdílnou kinetikou. To vypovídá o tom, že ačkoliv působí všechny inaktivační mechanizmy stále se stejnou intenzitou, je jejich efektivita proměnná v čase. Vliv teploty elektrody roste s dobou opracování. Po prvních 30 vteřinách je počet
usmrcených
buněk
pro
všechny
teploty téměř
stejný,
ale
po
několikaminutové expozici jsou rozdíly už velmi výrazné. Tento jev je také dobře patrný při porovnání jednotlivých inaktivačních křivek. Projevuje se tím, že se u vyšších teplot s rostoucím časem zvyšují odchylky od předpokládaného průběhu křivky. U vysokých teplot tak dochází v závěrečné fázi k urychlení procesu sterilizace.
54
Při aplikaci vyššího výkonu došlo k urychlení sterilizačního procesu. Přesto nebylo při teplotě 15 °C dosaženo sterility ani při aplikaci nejvyššího výkonu. Rozdíly způsobené změnou výkonu se jeví jako méně výrazné, než jsou rozdíly způsobené různou teplotou.
55
6 POUŽITÁ LITERATURA
[1]
Greenwood, David - Slak, Richard C. B. - Peutherer, John F. a kol. (1999): Lékařská mikrobiologie přehled infekčních onemocnění: patogeneze, imunita, laboratorní diagnostika a epidemiologie. Praha: Grada
[2]
Rosypal, Stanislav – Hoďák, Karel – Rosypalová, Alena (1972): Obecná mikrobiologie (biologie bakterií I). Praha: Státní pedagogické nakladatelství
[3]
Klaban, Vladimír (2001): Svět Mikrobů ilustrovaný lexikon mikrobiologie životního prostředí – druhé vydání. Hradec Králové: Gaudeamus
[4]
Votava, Miroslav (2005): Lékařská mikrobiologie obecná – druhé přepracované vydání. Brno: Neptun
[5]
Votava, Miroslav a kol. (2003): Lékařská mikrobiologie speciální. Brno: Neptun
[6]
Bruchanov, Martin (2005): Plazmová sterilizace. semestrální práce, Praha: Univerzita Karlova
[7]
Šilhánková,
Ludmila
(2002):
Mikrobiologie
pro
potravináře
a
biotechnology – 2. vydání. Praha: Akademia
[8]
Pracovní skupina CSS a OSS ČAS (2004): Terminologie – dezinfekce a sterilizace. Vademecum sterilizace, roč. 2004, č. 3, s. 12-15.
[9]
Hubáček, Z. (2005): Praktické uplatnění a kontrola účinnosti sterilizace etylenoxidem. Nové Vademecum sterilizace, roč. 2005, č. 3, s. 6-9.
56
[10] Hubáček, Z. (2006): Fyzikální aspekty chemické sterilizace. Nové Vademecum sterilizace, roč. 2006, č. 2, s. 10-113.
[11] Všetečková, P – Dočkalová, T. (2006): Dezinfekce a sterilizace – co by měl vědět každý zdravotník. Nové Vademecum sterilizace, roč. 2006, č. 3, s. 5-9.
[12] Muler, Lenard – Pětníčková, Soňa (2008): Parní sterilizace – chemie indikátorů. Nové Vademecum sterilizace, roč. 2008, č. 3, s. 38-47
[13] Nester, E. W. – Roberts, C. E. a kol. (1198): Microbiology: A Human perspactive. Druhé vydání. USA: McGraw-Hill
[14] McKana, Larry – Kandel, Judy (1996): Microbiology: essentials and applications. Druhé vydání. New Aster: York Graphic Services
[15] Lifetech [online]. [cit. 2012-04-15]. Dostupné na World Wide Web:
[16] Moisan, M. – Barbeeau, J a kol.(2002): Plasma sterilization. Methods and mechanisms. Pure and Applied Chemistry, roč. 2002, č. 3, s. 349-358
[17] Rød, S. – Hansen, F – Leipold, F – Knoøchel, S (2011): Cold atmospheric pressure plasma treatment of ready-to-eat meat: Inactivation of Listeria innocua and changes in product quality. Food Microbiology, roč. 2012, s. 233-238
[18] Vicoveanu, D – Popescu, S. - Ohtsu Y. – Fujita,H (2008): Competing Inactivation Agents for Bacterial Spores in Radio-Frequency Oxygen Plasmas. Plasma Processes and Polymers, roč. 2008, č. 5, s. 350-358
57
[19] Kim, B. – Yun, H. - Jung , S - Jung, Y. - Jung, H. - Choe W. - Jo, Ch. (2010): Effect of atmospheric pressure plasma on inactivation of pathogens inoculated onto bacon using two different gas compositions. Food Microbiology, roč. 2011, s. 9-13
[20] Laroussi, M – Richardson, J. P. – Dobbs, F.C. (2002): Effects of nonequilibrium atmospheric pressure plasmas on the heterotrophic pathways of bacteria and on their cell morphology. Applied physics letters, roč. 2002, č. 4, s. 772-774
[21] Laroussi, M – Leipold, F (2003): Evaluation of the roles of reactive species, heat, and UV radiation in the inactivation of bacterial cells by air plasmas
at
atmospheric
pressure.
International
Journal
of
Mass
Spectrometry, roč. 2004, s. 81-86.
[22] Hijnen, W. A. M. – Beerendonk, E, F. – Medema, G.J. (2005): Inactivation credit of UV radiation for viruses, bacteria and protozoan (oo)cysts in water: A review. Warwe research, roč. 2006, s. 3-22.
[23] Laroussi, Mounir (2004): Low Temperature Plasma-Based Sterilization: Overview and State-of-the-Art. Plama Proces and Polymers, roč. 2005, č. 2, s. 391-400.
[24] Moisan M., Barbeau J., Moreau S., Pelletier J., Tabrizian M., Yahia L. (2001): Low-Temperature Sterilization Using Gas Plasmas: a Review of the Experiments and an Analysis of the Inactivation Mechanisms. Internacional journal of pharmaceutics. roč. 2001, č. 226: 1-21.
[25] Laroussi, Mounir (2009): Low-Temperatur plasmas for medicine? IEEE transaction on plasma science, roč. 2009, č. 6, s. 714-725
[26] Frank-Kameneckuj, D. A. (1963): Plasma - štvrté skupenstvo hmoty. Bratislava: Slovenské vydavatelstvo technickej literatúry
58
[27] Knižáková, Eva (2006): Využití radiofrekvenčního a nízkofrekvenčního plazmatu pro sterilizaci, magisterská diplomová práce. Brno: Masarykova univerzita
[28] Chalupová, Lenka (2009): Využití plazmatu pro sterilizaci polymerů, magisterská diplomová práce. Brno: Masarykova univerzita
[29] Martišovitš, Viktor (2006): Základy fyziky plazmy – Učebný text pre magisterské štúdium. Bratislava: Univerzita Komenského v Bratislavě
[30] Chen, Francis. F. (1984): Úvod do fyziky plazmatu. Praha: Academia
[31] Čech, Jan (2006): Porovnávací studium vlivů parametrů výboje na vlastnosti
plazmatu
koplanárního
bariérového
výboje,
magisterská
diplomová práce. Brno: Masarykova univerzita
[32] Stužka, Václav (2000): Analytická atomová optická spektrometrie. Olomouc: Univerzita Palackého v Olomouci
[33] Hoder, Tomáš (2009): Studium filamentu koplanárního bariérového výboje, dizertační práce. Brno: Masarykova univerzita
[34] Kogelschatz, Ulrich (2002): Dielectric-barrier Discharges: Their History, Discharge Physics, and Industrial Applications. Plasma Chemistry and Plasma Processing, roč. 2003, č. 1, s. 1-46
[35] Beck, Ernst-Georg. Biokurs 2007 [online]. 2007 [cit. 2012-03-08]. Dostupné na World Wide Web: <www.ernst-beck.de/skripten/13/bs135c.htm>
59
[36] Belami [online]. [cit. 2012-04-13]. Dostupné na World Wide Web:
[37] Hanusová, Jana (2011): DCSBD ve směsích pracovních plynů, diplomová práce. Brno: Masarykova univerzita
[38] Cheng-Fu Kao Lab [online]. [cit. 2012-03-08]. Dostupné na World Wide Web:
[39] Savická,Dana. Saccharomyces cerevisiae Hansen[online].[cit. 2012-03-08]. Dostupné na World Wide Web: <www.vscht.cz/obsah/fakulty/fpbt/ostatni/miniatlas/sacch.htm>
[40] Kavka, Miloš – Smělá, Dana. Státní zemědělská a potravinářská inspekce [online]. c 2005, poslední aktualizace 26. 10. 2011 [cit. 2012-03-08]. Dostupné na World Wide Web:
[41] Navrátil, Zdeněk. Spectrum analyzer homepage [online]. c 2005, [cit. 2012-05-11]. Dostupné na World Wide Web:
60
