MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE
Nematofágní houby a jejich interakce s nematodami Bakalářská práce
Brno 2008
Eva Mőllerová
Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatně, jen s využitím níže uvedené literatury.
Eva Mőllerová
2
Obsah Seznam zkratek ............................................................................................................. 5
Úvod................................................................................................................................... 6
1.
Nematofágní houby ................................................................................................ 7 1.1.
Definice ........................................................................................................ 7
1.2.
Rozmanitost infekčních struktur .................................................................. 8 1.2.1. Houby chytající nematody do pastí................................................... 8 1.2.2. Endoparazitické houby...................................................................... 9 1.2.3. Houby parazitující na vajíčkách a cystách nematod ......................... 10
2.
Ekologie nematofágních hub ................................................................................ 11 2.1.
Výskyt ......................................................................................................... 11
2.2.
Interakce s jinými houbami a rostlinami ...................................................... 11
2.3.
Biologická kontrola...................................................................................... 12 2.3.1. In vitro studie ..................................................................................... 12 2.3.2. Zkoušky nematofágních hub v terénu ................................................ 13 2.3.3. Ovlivnění pre-penetračních jevů na vajíčkách nematod ....................14
2.4.
3.
Některé druhy nematofágních hub ............................................................... 16
Mechanismus interakce nematofágní houba – nematoda .................................. 18 3.1.
Rozpoznání hostitele .................................................................................... 18
3.2.
Přitažlivost ................................................................................................... 18
3.3.
Adheze ......................................................................................................... 18
3.4.
Penetrace ......................................................................................................20
3.5.
Trávení a ukládání živin............................................................................... 20
3.6.
Škrtící oka .................................................................................................... 20
3
4.
Extracelulární enzymy a lektiny........................................................................... 22 4.1.
Lektiny ......................................................................................................... 22 4.1.1. Lektin Arthrobotrys oligospora a jemu podobné lektiny.................23
4.2.
Serinové proteasy ......................................................................................... 24 4.2.1. Proteasy VCP1 a Ver112 ................................................................... 25
4.3.
Chitinasy ...................................................................................................... 26 4.3.1. Lecanicillium psalliotae a chitinasový gen Lpchi1 ..........................27
4.4.
Xylanasy ...................................................................................................... 28
4.5.
Kolagenasy a další hydrolytické enzymy .................................................... 29
Závěr .................................................................................................................................30
Literatura ........................................................................................................................32
4
Seznam zkratek
ABL
Agaricus bisporus lektin
AOL
Arthrobotrys oligospora lektin
DFP
diisopropylfluorofosfát
ECM
extracelulární materiál
FITC
isothiokyanát fluoresceinu
GalNAc
N-acetyl-D-galaktosamin
PCR
polymerasová řetězová reakce (polymerase chain reaction)
PMSF
fenylmethylsulfonyl fluorid
PVC
polyvinylchlorid
5
Úvod Nematofágní houby jsou půdní mikroorganismy se schopnostmi parazitovat na všech stádiích nematod (hlístic). Jsou schopny je chytit, zabít a strávit. Infekce nematod může probíhat třemi způsoby: pomocí pastí, endoparaziticky nebo může houba parazitovat na vajíčkách a cystách nematod. Jedním z důležitých hledisek nematofágních hub je možnost jejich využití pro biologickou likvidaci rostlinných a živočišných parazitických nematod. Mechanismus interakce nematofágní houba – nematoda není jednoduchý a může se mezi různými zástupci lišit. Nejprve musí nematofágní houba nematodu rozpoznat a přilákat ji, aby se mohla na její povrch následně navázat (adherovat). Při této interakci se mohou uplatňovat lektiny, které vážou sacharidy na povrchu nematod. Při penetraci nematofágní houby kutikulou nematody se uplatňují extracelulární hydrolytické enzymy, a to proteasy, chitinasy, xylanasy, kolagenasy a další. Tyto enzymy rozruší kutikulu nematody a napomohou nematofágní houbě k infekci nematody. Cílem práce je přiblížit mechanismus interakce nematofágní houba – nematoda, najít nejvhodnější druhy hub pro biologickou kontrolu nematod a charakterizovat význam lektinů a extracelulárních hydrolytických enzymů.
6
1. Nematofágní houby
1.1. Definice (1,2,3,4) Nematofágní houby jsou houby mikroskopických rozměrů, které dovedou chytit, zabít a strávit nematody (hlístice). Nematody parazitují na rostlinách i zvířatech, a tím způsobují poškození hospodářsky významných rostlin a dobytka. K chytání červovitých nematod používají nematofágní houby speciální myceliální struktury, tzv. pasti, nebo spory. K napadení vajíček a cyst nematod používají hyfovité výběžky. Následně pronikají kutikulou do nematod a likvidují je tím, že je začnou zevnitř trávit. Z toho důvodu se nematofágní houby považují za přirozené nepřátele nematod. Podle způsobu infikování nematod se houby rozdělují do tří hlavních skupin: houby, které chytají nematody do pastí, endoparazitické houby a houby parazitující na vajíčkách a cystách nematod. Nematofágní houby zahrnují více než 200 druhů taxonomicky rozlišných hub. Nacházejí se mezi všemi hlavními skupinami hub, včetně nižších (oomycety, chytridiomycety, zygomycety) a vyšších hub (askomycety, basidiomycety a deuteromycety). Nejvíce nematofágních hub, včetně druhů chytajících nematody do pastí a endoparazitických, jsou deuteromycety, tedy nepohlavní houby (viz tabulka č. 1). Všechny mají schopnost napadnout živé nematody (mladé, dospělé i vajíčka) a využít je jako zdroj živin. Houby se liší v saprofytických a parazitických schopnostech. Zatímco houby tvořící pasti a houby napadající vajíčka přežívají saprofyticky v půdě, endoparazitické houby jsou většinou závislé na nematodách jako na živinách, jsou tedy obligátní parazité. (5) I mrtvé nematody mohou být napadeny nematofágní houbou. Houba ale do nematody vstupuje přirozenými otvory (ústa, řitní otvor, atd.) a nikdy do ní neproniká kutikulou. Představují saprofytická růstová stádia hub, která ani nemohou být považována za opravdové nematofágní houby. Stává se to i při velmi nepříznivých podmínkách, kdy mrtvé nematody představují prostředky pro přežití nematofágních hub v půdě. Endoparazitické houby napadají nematody pomocí spor, které buď přilnou na povrch nematod, nebo jsou jimi polknuta. Bez ohledu na způsob infekce, výsledek je vždy stejný: smrt nematod.
7
Tabulka č. 1 (1) Typické infekční struktury některých nematofágních hub infekční struktury
lepivé sítě
lepivé větve lepivé knoflíky škrtící oka lepivé knoflíky a lepivé spory lepivé spory přijímané spory zoospory lepivé hyfy toxické kapénky appressoria
druhy Arthrobotrys oligospora A. conoides A. musiformis A. superba Duddingtonia flagrans Monacrosporium gephyropagum M. ellipsosporum M. haptotylum A. dactyloides A. brochpaga
taxonomie
Deuteromycety
Deuteromycety Deuteromycety Deuteromycety
Nematoctonus concurrens
Basidiomycety
N. leiosporus Drechmeria coniospora Hirsutella rhossoliensis Harposporium anguillulae Catenaria anguillulae Haptoglossa dickii Stylopage hadra Cystopage cladospora Pleurotus ostreatus Pochonia chlamydospora
Basidiomycety Deuteromycety Deuteromycety Chytridiomycety Oomycety Zygomycety Basidiomycety Deuteromycety
1.2. Rozmanitost infekčních struktur (1,3,4,5)
1.2.1. Houby chytající nematody do pastí Schopnost chytit nematodu do pastí je spojena se specifickou strukturou houbového mycelia (viz tabulka č. 1). Chytající houby mají vyvinuté důmyslné hyfovité struktury, jako např. hyfovité sítě, knoflíky, větve nebo oka, do kterých jsou nematody chyceny adhezí nebo mechanicky (viz obrázek č. 1). Typ struktur pastí závisí nejen na druhu houby, ale i na přírodních podmínkách, jak biotických, tak i abiotických. Nejdůležitějšími biotickými faktory jsou žijící nematody, které způsobí nejen utvoření chytací struktury myceliem, ale slouží i jako zdroj potravy pro houby poté, co jsou napadeny houbou.
8
(f)
(a)
(b)
(d)
(g)
(c)
(e)
(h)
rostoucí saprofytická schopnost
rostoucí parazitická schopnost
Obrázek č. 1 (1) Rozmanitost chytacích struktur. (a) Nematoda chycená nematofágní houbou Arthrobotrys oligospora. Pruh = 100 µm. (b) Lepivá síť Arthrobotrys oligospora se strávenou nematodou. Pruh = 20 µm. (c) Lepivé větve Monacrosporium gephyropagum. Pruh = 10 µm. (d) Lepivé knoflíky Monacrosporium haptotylum. Pruh = 10 µm. (e) Škrtící oko Arthrobotrys brochopaga. Pruh = 5 µm. (f) Nematoda infikovaná konidiosporami Drechmeria coniospora. Pruh = 5 µm. (g) Spory s lepivými pupeny (šipky) Drechmeria coniospora. Pruh = 10 µm. (h) Zoospory Catenaria anguillulae. Pruh = 10 µm.
1.2.2. Endoparazitické houby Podobná rozmanitost existuje i mezi endoparazitickými houbami. Drechmeria coniospora tvoří velké množství spor ve srovnání s produkcí hyfovitého materiálu. V jedné infikované nematodě může tato houba vytvořit až 10 000 spor, zatímco Hirsutella rhossoliensis vytvoří 100-1000 spor na jednu infikovanou nematodu. Obě houby vytváří na svých sporách lepivé pupeny (viz obrázek č. 1g). Catenaria anguillulae infikuje nematody 9
svými pohyblivými zoosporami, které se zacystují a přilepí se na nematodu. Rod Harposporium obsahuje houby produkujících spory určitých tvarů, které jsou přijaty nematodou a dostanou se do jícnu, odkud nematodu infikují.
1.2.3. Houby parazitující na vajíčkách a cystách nematod (6) Houby parazitující na nepohyblivých stádiích nematod, např. vajíčkách, používají jinou strategii infikování. Hyfy nematofágní houby Pochonia chlamydospora a dalších hub rostou poblíž vajíček a appressoria jsou utvářena na vršcích hyf, které prostupují vaječnou skořápkou. Houby poté stráví obsah vajíček, jak nezralých, tak i zralých obsahujících již mladé nematody. Appressoria lze definovat jako hyfovité struktury utvořené houbovými patogeny pro adhezi na povrch hostitele. Tyto struktury jsou přizpůsobeny k tomu, aby soustředily mechanickou sílu a enzymovou degradaci v malém prostoru a tak usnadnily penetraci hostitele.
Obrázek č. 2 (2) Appressorium utvořené na konci klíční hyfy nematofágní houby Pochonia rubescens na povrchu vajíčka nematody Heterodera schachtii. Pruh = 4 µm.
10
2. Ekologie nematofágních hub
2.1. Výskyt (1,2,3) Nematofágní houby se vyskytují ve všech oblastech světa, od tropických až po Antarktidu. Byly nalezeny v zemědělských, zahradních i lesních půdách. Nejhojněji se vyskytují v půdách bohatých na organický materiál. Nejméně se vyskytují ve vodných, zvláště mořských prostředích. (4) Jednoduchou metodou pro získání nematofágních hub je tzv. půdní posypová metoda, kdy asi 1 g půdy je nasypaný na zvlhčený agar společně se suspenzí nematod sloužících jako návnady. Plotny jsou pozorované po 5 až 6 týdnech pod mikroskopem při malém zvětšení a zkoumají se chycené nematody, chytací orgány a spory nematofágních hub. Mnoho půd obsahuje 10 až 15 rozdílných druhů nematofágních hub. Arthrobotrys se jeví jako běžný druh většiny půd. Arthrobotrys oligospora se nejčastěji nachází v mírném podnebí a Arthrobotrys musiformis v tropických oblastech. Mezi nižšími houbami jsou nejčastější zygomycety Stylopage a Cystopage a z chytridiomycet endoparazit Catenaria anguillulae. V zemědělských půdách mírného podnebí je výskyt nematofágních hub závislý na sezónních podmínkách. Největší hustoty a počty druhů hub bývají na konci léta a na podzim. Nejspíše je to zapříčiněno vyšší teplotou půdy a zvětšeným přísunem organických zbytků. Nejhojněji se nacházejí v horních 20 cm půdy, zato téměř vůbec se nevyskytují pod 40 cm půdy.
2.2. Interakce s jinými houbami a rostlinami (1,2) Kromě schopnosti infikovat nematody mohou nematofágní houby infikovat i další houby, tzn. být mykoparazity, nebo osídlit rostlinné kořeny, např. Arthrobotrys oligospora, Pochonia chlamydospora a další nematofágní houby. Arthrobotrys oligospora může napadnout další houbu, např. Rhizoctonia solani. Toto mykoparazitické chování vede k obtáčení hyf nematofágní houby kolem hyf hostitele a má za následek rozpad buněčné cytoplazmy hostitele bez penetrace. Ačkoliv tento jev nebyl nikdy v půdě pozorován, může zvýšit tělesnou zdatnost nematofágní houby v půdě např. poskytnutím živin. Navíc může 11
rozšířit biokontrolní schopnost nematofágních hub jako biokontrolních agens houbových parazitů stejně jako nematod.
2.3. Biologická kontrola (1,2) Jedním z důležitých hledisek nematofágních hub je možnost jejich využití pro biologickou kontrolu rostlinných a živočišných parazitických nematod. Nematody parazitující na rostlinách, např. na kořenových svazcích, jsou celosvětoví škůdci v zemědělství i zahradnictví způsobující ohromné ztráty ve výnosech rostlin. Pro likvidaci nematod parazitujících na rostlinách se používají chemikálie zvané nematocidy, např. methylbromid. Tyto mnohdy toxické sloučeniny způsobují jak přírodní, tak zdravotní problémy, a právě proto byly některé zakázány. Novou alternativou pro regulaci nematod by se mohla stát biologická ochrana rostlin pomocí nematofágních hub. Existují dva hlavní způsoby použití nematofágních hub pro biologickou kontrolu nematod. Jednou z nich je příměs velkého množství hub do půdy, druhou stimulace aktivity dosavadních hub použitím různých příměsí. Zájem je především o houby chytající nematody do pastí, jednak kvůli dobré znalosti těchto hub, a jednak kvůli lepším metodám utváření a použití houbových biokontrolních faktorů v půdách oproti jiným druhům. Jednou z cest, jak zlepšit kontrolní potenciál nematofágních hub by mohlo být využití genového inženýrství pro zvětšení patogenity a přežití hub. Nematody parazitující na zvířatech způsobují onemocnění a ohromné váhové úbytky dobytka po celém světě. Na chemikálie běžně používané pro likvidaci nematod, anthelmintika, si nematody vytvořily odolnost, čímž se snížila účinná kontrola. Naději představuje krmení pasoucích se zvířat houbovým myceliem obsahujícím chlamydospory nematofágních hub, např. Duddingtonia flagrans. Spory by prošly zažívacím traktem ven z těla, rostly by a produkovaly pasti ve fekáliích a okolní trávě. Houby by následně chytaly nově vylíhlé nematody, a tím by redukovaly počet těchto parazitů na poli.
2.3.1. In vitro studie (7) Navzdory tomu, že bylo již identifikováno mnoho druhů nematofágních hub schopných zlikvidovat nematody, nejčastěji se vědci zaměřují na rod Arthrobotrys, specificky pak na Arthrobotrys oligospora. 12
U Arthrobotrys je zjištěno, že pokud je kultivovaná jako monokultura na standardizovaných, obvykle na živiny chudých médiích na Petriho miskách a jsou jí dodány nematody, které nemohou uniknout, stane se dobrým predátorem. Avšak takové studie mnoho neřeknou o tom, jak se bude chovat houba na poli. Bylo zjištěno, že tradiční izolační procedury, kdy jsou živná media pokryta tenkými vzorky půdy nebo organické hmoty, preferovaly ty houby, které jsou agresivními kolonizátory a snadno se kultivují in vitro, ale jsou fakultativními predátory nebo mají nízké nematofágní schopnosti.
2.3.2. Zkoušky nematofágních hub v terénu (8) Vědci zkouší provádět kontrolu nematod pomocí nematofágních hub nejen v laboratorních podmínkách, ale snaží se i o terénní experimenty. Jedním z příkladů je zkoumání efektivity krmení koz pasoucích se první sezonu chlamydosporami Duddingtonia flagrans ve Francii. Gastrointestinální infekce nematodami totiž může způsobit i snížení produkce mléka. Dříve bylo pro kontrolu nematod využíváno různých anthelmintik, ale kmeny nematod se postupně stávaly proti nim odolné, hlavně proti benzimidazolům, a začaly se rychle šířit. To vedlo ke zvýšenému zájmu najít alternativní způsob pro kontrolu parazitních nematod. Jednou z možností byla právě biologická kontrola, kde se využívá jednoho organismu ke kontrole druhého cílového organismu. Zkouška v terénu byla prováděna ve dvou po sobě jdoucích letech (roky 2003 a 2004) a směřovala k hodnocení účinnosti podávání spor nematofágní houby Duddingtonia flagrans mladým kozám pro kontrolu infekce parazitními hlísticemi. Po oba roky byla kůzlata pasoucí se prvním rokem rozdělena na dvě podobně obhospodařované skupiny („houbová“ a kontrolní skupina). V roce 2003 činila denní dávka spor v „houbové“ skupině 5x105 spor na kilogram váhy zvířete a v dalším roce byla zvýšena na 106 spor na kilogram váhy zvířete. Druhá polovina kůzlat sloužící jako kontrolní skupina nedostávala žádné spory. Parametry měřené každé tři týdny zahrnovaly exkreci vajíček nematod, larvální vývoj ve fekální kultuře a počty larev na pastvině. Na začátku, uprostřed a na konci každého pastevního období byly kozy zváženy a byly jim odebrány vzorky krve. V roce 2003 byly výsledky všech měřených parametrů v kontrolní a „houbové“ skupině podobné. Oproti tomu v roce 2004 kůzlata, která přijímala spory, vykazovala nižší počet vajíček ve fekáliích na konci sezóny a vyšší tempo růstu ve srovnání s kůzlaty kontrolní skupiny. Z výsledků tedy plyne, že podávání spor 13
Duddingtonia flagrans může zlepšit přírůstek živé hmoty mladých koz v jejich první pastevní sezoně. Gastrointestinální hlístice ovcí a koz představují závažný problém po celém světě. Jejich kontrola by mohla značně zvýšit jejich produkci. V Íránu na ovčích farmách vědci otestovali sto vzorků kompostu na přítomnost nematofágních hub. Arthrobotrys cladodes, na kterou se zaměřili, byla izolovaná ze 3% zkoumaných vzorků. Její nematofágní aktivita byla prokázána po přidání 1000, 8000, 20000 a 100000 spor na gram fekálií ovcí. Významně se snížil počet larev Haemonchus contortus ve fekáliích o 41,7%, 63,3%, 73,5% a 95,0%. Tyto výsledky dokazují, že Arthrobotrys cladodes je slibným kandidátem pro biologickou kontrolu Haemonchus contortus. (9) Podobná studie se stejnou nematodou byla provedena s houbou Harposporium anguillulae taktéž ve fekáliích ovcí, ale tentokrát v Brazílii. Přidání 300000 spor na gram fekálií snížilo počet larev nematod o 99,5% oproti kontrolní skupině ovcí. I zde bylo dokázáno, že Harposporium anguillulae je slibným kandidátem pro kontrolu Haemonchus contortus. (10) Vědci už zkoumali reálnými pokusy mnoho nematofágních hub, zda by mohly působit jako biokontrolní prostředky nematod u ovcí, koz, dobytka a dalších zvířat. Ne u všech zkoušek ale došli k pozitivním závěrům, i když v in vitro studiích vycházely pozitivně. Mnohdy byly totiž výsledky ovlivněny nepřízní počasí nebo jinými neovlivnitelnými podmínkami. Z těch studií, které se dají klasifikovat jako pozitivní, vyšly jako vhodné houby např. již zmíněná Duddingtonia flagrans, Arthrobotrys cladodes nebo Harposporium anguillulae.
2.3.3. Ovlivnění pre-penetračních jevů na vajíčkách nematod (6) Houboví parazité vajíček nematod hrají ohromnou roli jako biokontrolní prostředky, protože mohou infikovat samičky „přisedlých“ nematod a zničí vajíčka, která obsahují. Před penetrací musí houboví parazité vajíček adherovat na vaječnou skořápku pomocí spor nebo appressorií, pak může proběhnout penetrace skrz bariéru, kterou je právě skořápka vajíčka. Vědci se snažili zjistit, jak by se daly ovlivnit pre-penetrační jevy v houbovém parazitismu na vajíčkách nematod. Studovali vliv hydrofobicity povrchu na tvorbu appressorií u zárodků Pochonia rubescens, Pochonia chlamydospora a Lecanicillium lecanii. Appressoria se nejčastěji tvořila na hydrofobních površích jako je polyvinylchlorid (PVC) nebo polystyren a méně často se utvořila na hydrofilních materiálech jako je sklo nebo hliníková folie. 14
Samozřejmě je to druhově specifické. Pochonia chlamydospora byla nejefektivnější houba, která tvořila appressoria na všech površích (kromě PVC) nejvíce.
Celofán
Hliník
Sklo Polystyren
PVC
Teflon
Povrch (rostoucí hydrofobicita) Graf č. 1 (6) Efekt povrchové hydrofobicity různých materiálů na tvorbu appressorií zárodků Pochonia rubescens (prázdný pruh), Pochonia chlamydospora (šrafovaný pruh) a Lecanicillium lecanii (plný pruh) v YEM médiu, 24 hodin po inkubaci při 25 °C ve tmě. Hodnoty jsou průměry tří stejných měření.
Pro výzkum spor a hyf houbových patogenů byly použity lektiny jako diagnostické nástroje pro lokalizaci sacharidových částí, které by se mohly účastnit adheze. Infikovaná vajíčka byla inkubována s lektinem konkanavalinem A značeným isothiokyanátem fluoresceinu (FITC) a vykazovala intenzivní značení stěn spor a hyf. Proteolytická aktivita byla objevena v extraktech ze spor a zárodků houbových parazitů, hlavně Pochonia chlamydospora, za nepřítomnosti vajíček hlístic. Přidání inhibitorů serinových proteinas fenylmethylsulfonylfluoridu (PMSF) nebo diisopropylfluorofosfátu (DFP) do extraktů redukovalo jejich proteolytickou aktivitu. PMSF byl nejefektivnější inhibitor. Aplikace PMSF a DFP do očkovací látky redukovala penetraci studovaných hub do vajíček. PMSF způsobil největší redukci infekce vajíček u Lecanicillium lecanii, zatímco DFP významně redukoval infekci u Pochonia chlamydospora a Lecanicillium lecanii. Výsledky studie ukázaly
15
hydrofobicitu, tvorbu appressorií a produkci proteas jako faktory spojené s infekcí vajíček nematod.
2.4. Některé druhy nematofágních hub (11) Arthrobotrys
oligospora
patří
k nejběžnějším,
nejvíce
rozšířeným
a
nejprozkoumanějším druhům nematofágních hub. Houbu lze izolovat z různých substrátů, nejčastěji z kompostů, ztrouchnivělého dřeva a zvířecích exkrementů. Ve svém způsobu chování, růstu a chytacím orgánu, kterým je trojrozměrná síť, se podobá Arthrobotrys superba. Vzpřímené konidiofory nesou 20-30 přeslenů s 5-20 dvoubuněčnými, 16-30 µm dlouhými a 8-16 µm širokými sporami. Distální buňky jsou asi dvakrát větší než proximální buňky. Arthrobotrys superba patří k nejvíce rozšířeným druhům nematofágních hub, které lze najít v listové hrabance, ztrouchnivělém dřevě a kůře a shnilém listí a jehličí. Vyznačuje se obzvláště rychlým růstem hyf s malým rozvětvením. Vzpřímené a 50-500 µm dlouhé konidiofory vytváří přesleny s asi 10 dvoubuněčnými sporami. Distální buňky jsou téměř stejně velké jako proximální buňky. Starší kultury vytváří chlamydospory. Jako chytací orgány vytváří trojrozměrné lepivé sítě. Za přítomnosti nematod vyklíčí ihned spory s lepivými hyfami, na kterých se kořist přilepí. Arthrobotrys dactyloides vykazuje značně pomalejší a hustší růst hyf než jiné houby z rodu Arthrobotrys. Na vrcholku jejích přímých, nerozvětvených a 200-400 µm dlouhých konidiofor se tvoří přeslen se 4-10 dvoubuněčnými podélně elipsoidními a lehce zakřivenými 32-45 µm dlouhými sporami. Starší kultury vytváří jednotlivé, žluté a kulaté chlamydospory. Společně s Arthrobotrys anchonia tvoří záchytná škrtící oka s vnějším průměrem kolem 2023 µm. Škrtící oka jsou přichycena dvoubuněčnými stonky 7-14 µm dlouhými. Dactylaria candida je ve své rychlosti růstu a hustotě podobná s Arthrobotrys dactyloides, má ale zřejmě jemnější mycelium. Na vrcholku konidiofory se vytváří přeslen. Střední buňky jsou větší než distální a proximální buňky. Jako chytací orgány používají tyto druhy 15-23 µm velké nestahující oka, sedící na 10-35 µm dlouhých stvolech, společně s lepivými uzly, 4-7 µm velkými. Uzly a oka se skloní ke kořisti a následně ji infikují.
16
Obrázek č. 3 (12) Mikroskopická krajina s Arthrobotrys oligospora a chycenými nematodami v lepkavých sítích a konidioforami se sporami.
17
3. Mechanismus interakce nematofágní houba – nematoda
3.1. Rozpoznání hostitele (1,2,3,4) Odpověď na otázku, jak nematofágní houba rozpozná svoji kořist, není vůbec jednoduchá. Nebyla objevena žádná jednotná hostitelská specifita mezi žádnými druhy nematofágních hub. U experimentu s endoparazitem Drechmeria coniospora byla odhalena poněkud vyšší hostitelská specifita. Nicméně se zdá, že v komunikaci buňka – buňka mezi interakcí houba – nematoda je zahrnuto více kroků, které by mohly vyvolat konečnou biochemickou, fyziologickou nebo morfologickou odezvu. Nematody jsou přitahovány k myceliu houby, ve kterém mohou navodit tvorbu pasti a jsou přitahovány ještě více k plně vyvinutým pastem a sporám. Poté následuje „krátkodosahové“ nebo kontaktní spojení – adheze. Rozpoznání hostitele je pravděpodobně důležité pro následující infikování, včetně penetrace kutikuly nematody.
3.2. Přitažlivost (1,2) Nematody
jsou
přitahovány
sloučeninami
uvolněnými
z mycelia
a
pastí
nematofágních hub chytajících nematody do pastí a ze spor endoparazitických hub. Jak morfologie, tak následkem toho saprofytická nebo parazitická schopnost silně ovlivňuje přitažlivost hub. Houby, které jsou více parazitické, se jeví, že mají silnější přitažlivost než houby, které jsou více saprofytické. Tedy endoparazitické houby infikující nematody sporami jsou úspěšnější v přitažlivosti nematod než druhy s různými typy chytacích zařízení. Na Catenaria anguillulae zoosporách bylo testováno 64 různých organických a anorganických látek, 18 z nich bylo významnými atraktanty. Nejsilnější přitažlivost byla dosažena aminokyselinou serin a lektinem konkanavalin A. (4)
3.3. Adheze (1,2) Trojrozměrná síť nematofágní houby Arthrobotrys oligospora je obklopena vrstvou extracelulárních vláken ještě před interakcí s nematodou. Po kontaktu se vlákna napřímí kolmo na povrch hostitele, pravděpodobně pro usnadnění uchycení a další invaze houby do nematody. Endoparazit Drechmeria coniospora má úplně odlišný způsob adheze. Zdá se, že 18
je složený z paprskových fibril bez ohledu na to, zda spojení s nematodou bylo nebo nebylo dokončené. Mimo to se spory tohoto organismu specificky drží smyslových orgánů na vršku hlavy nematody, čímž blokují přilnavost nematody (viz obrázek č. 1f). Chemické složení povrchových fibril není dosud přesně známo, ale budou obsahovat jak proteiny, tak i polymery obsahující sacharidy.
Obrázek č. 4 (1) Chycení nematody nematofágní houbou Arthrobotrys oligospora. (a) Peptidem indukovaná lepivá síť. Pruh = 10 µm. (b) Vegetativní hyfa (horní část) a buňka pasti. Pruh = 1 µm. (c) Lepivá Arthrobotrys oligospora. Po chycení nematody se lepivé fibrily (F) napřimují od pasti (T) směrem ke kutikule nematody (NC). Pruh = 1 µm. (d) Penetrace Arthrobotrys oligospora kutikulou nematody. Elektrondenzní tělíska (DB), vrstva lepidla (A), kutikula nematody (NC), infekční bulbus (IB). Pruh = 1 µm.
19
3.4. Penetrace (1,2) Po přilnutí pasti na nematodu nastává krok, kdy např. u Arthrobotrys oligospora se vytvoří penetrační trubička a provrtá kutikulu nematody. Tento krok vyžaduje hydrolytické enzymy, které rozpustí makromolekuly v kutikule nematody, a mechanický tlak vytvořený rostoucí penetrující houbou. Kutikula nematod je složena hlavně z proteinů včetně kolagenu. Z nematofágních hub bylo izolováno několik proteas, které mohou hydrolyzovat proteiny v kutikule nematod. Tyto proteasy patří do skupiny serinových proteas a mají vysokou homologii k subtilisinovým typům serinových proteas. U endoparazita Drechmeria coniospora jsou do penetrace pravděpodobně zapojeny chymotrypsinové proteasy.
3.5. Trávení a ukládání živin (1,2) Po penetraci je nematoda trávena infekční houbou. Jakmile vnikne Arthrobotrys oligospora svojí penetrační trubičkou do kutikuly nematody, zvětší se na rozlehlý infekční bulbus (viz obrázek č. 4d), ze kterého rostou ven trofické hyfy a tráví obsah nematody. Vývoj bulbusu a trofických hyf doprovází dramatické změny ultrastruktury a fyziologie houby. Cytosolické organely (elektrondenzní tělíska) jsou degradovány v buňkách pasti a v bulbusu a uvolňují právě hydrolytické enzymy, které rozrušují kutikulu nematody. Bulbus a trofické hyfy obsahují také běžné buněčné organely, endoplazmatické retikulum je obzvláště dobře vyvinuté. V posledním stádiu jsou v trofických hyfách nahromaděny lipidové kapičky, které jsou patrně zapojeny do asimilace a uložení živin získaných z infikovaných nematod. Naproti tomu endoparazit Drechmeria coniospora netvoří žádný infekční bulbus při penetraci a nemá elektrondenzní tělíska, která jsou tak typické pro houby tvořící pasti. Druhou možností pro Arthrobotrys oligospora, jak uložit živiny získané z nematody, je produkce velkého množství lektinu v cytoplazmě. Lektin je později transportován do jiných částí mycelia, kde je rozložen a využit pro růst houby.
3.6. Škrtící oka (1) Chytací mechanizmus škrtících ok je naprosto odlišný od mechanizmu jiných chytacích pastí využívajících lepivou vrstvu, např. sítě, hyfy nebo knoflíky. Jakmile vleze 20
nematoda do pasti, tři buňky, ze kterých je oko složeno, se začnou rapidně zvětšovat. Uzavřou se kolem nematody, čímž ji znehybní. Další podněty, jako styk s hrotem vnitřní strany oka nebo teplo, mohou také spustit uzavření pasti. Reakce je rychlá (0,1 s), nevratná a doprovázená velkým zvětšením objemu buněk vedoucím ke skoro úplnému uzavření otvoru škrtícího oka. Poté houba vytvoří penetrační trubičku, která provrtá kutikulu nematody. Přesný mechanizmus uzavírání škrtícího oka není znám, ale ví se, že během rozpínání buněk oka se vnější buňky stěny roztrhnou podél určité linie na vnitřní straně oka. Toto uvolnění stěny vede ke zvýšené absorpci vody, následované rozpínáním elastické vnitřní stěny buněk škrtícího oka.
Obrázek č. 5 (1) Chytací mechanizmus škrtícího oka Arthrobotrys brochpaga. (a-c) Uzavření oka spuštěné tepelným podnětem. Pruhy = 5 µm. (d) Nematoda pevně chycená do škrtícího oka. Pruh = 10 µm.
21
4. Extracelulární enzymy a lektiny Do penetrace nematofágních hub skrz kutikulu nematod a následného trávení hostitelských buněk je zahrnuto mnoho extracelulárních hydrolytických enzymů, včetně proteas, kolagenas a chitinas (5). U nematofágních hub chytajících nematoda do pastí bylo pozorováno několik společných rysů, ačkoliv měly rozdílné typy pastí. Jedním z nich byla přítomnost rozsáhlých vrstev extracelulárních polymerů. Právě tyto polymery jsou považovány za důležité pro připojení pastí k povrchu hostitele (nematody). (13)
4.1. Lektiny (2,4,13) Předpokládá se, že rozpoznání hostitele a následná adheze vyžaduje interakci mezi sacharid-vázajícím proteinem (lektinem) v houbě a sacharidovým receptorem, např. N-acetylD-galaktosaminem (GalNAc), na nematodě. Lektiny byly izolovány z více než 60 hub, včetně saprofytických, parazitických a symbiotických druhů. Lektin, u Arthrobotrys oligospora označovaný jako AOL (Arthrobotrys oligospora lectin), se uplatňuje i při penetraci nematody a v následném trávení obsahu nematody. Po proniknutí houby do nematody se rychle nasyntetizuje AOL v Arthrobotrys oligospora. Velké množství AOL se hromadí v trofických hyfách rostoucích uvnitř těla nematody.
Obrázek č. 6 (14) N-acetyl-D-galaktosamin.
U nematofágních hub parazitujících na vajíčkách se na povrchu appressorií vyskytuje extracelulární materiál (ECM), který má lepivou funkci a zároveň zalepí otvor způsobený 22
penetrační hyfou. Tento ECM může být značen lektinem konkanavalinem A, což signalizuje, že ECM obsahuje mannosové nebo glukosové jednotky na postranních řetězcích glykoproteinů. Endoparazitická nematofágní houba Drechmeria coniospora infikuje nematody svými sporami, které se přilepí k chemosenzorickým orgánům hlístice (viz obrázek č. 1f). Přilnavost spor je způsobena interakcí sialové kyseliny a lektinu limulin. Ošetření spor sialovou kyselinou sníží jejich přilnavost. Volná sialová kyselina se naváže na lektin a ten je inaktivován a už nefunguje jako adhezivní molekula.
4.1.1. Lektin Arthrobotrys oligospora a jemu podobné lektiny (15) Nedávno bylo identifikováno několik genů kódujících lektiny. Analýza jejich sekvencí ukázala, že proteiny mohou být seskupeny do různých skupin s podobnou primární strukturou a sacharid-vázajícími vlastnostmi. Arthrobotrys oligospora patří mezi půdní houby. Svoji kořist (nematodu) chytá a infikuje pomocí trojrozměrné sítě. Produkuje vysoké množství nízkomolekulárního lektinu, označovaného jako AOL. Sekvence aminokyselin genu AOL vykazuje vysokou sekvenční podobnost (shodnost 46,3%) s lektinem ABL z houby Agaricus bisporus (basidiomycety). AOL a ABL mají stejnou vazebnou specifitu. Oba proteiny jsou multispecifickými lektiny vázající se k N- a O-spojeným oligosacharidovým řetězcům glykoproteinů, sulfátovaných glykokonjugátů a některých fosfolipidů. Geny vykazující vysokou sekvenční podobnost (4372%) k AOL a ABL lektinům byly objeveny v několika dalších houbách. Jiní vědci tvrdí, že AOL není pravděpodobně zapojen přímo do chytání nematod, protože protein se vyskytuje v cytoplazmě a ne na povrchu chytacích buněk (15). Podle vzorových expresí bylo navrženo, že AOL může fungovat jako skladovací protein během saprofytického a parazitického růstu. Další možností je, že AOL je složkou systému obrany proti různým zvířecím požíračům hub. Několik studií dokázalo, že rostlinné lektiny hrají dvojí roli, a to jako skladovací a obranné proteiny. V půdě žijící houby jsou poškozené množstvím různých malých členovců a u mnoho hub je známo, že obsahují chemický obranný systém proti poškození, který může buď snížit stravitelnost (chutnost), nebo výživnou hodnotu houbové tkáně. Funkce jiných lektinů, patřících do skupiny AOL/ABL nejsou známy. Lektiny PLCF-1 a 2 (shodnost primární sekvence 96%) izolované z Pleurotus cornucopiae jsou vývojově regulované, lektiny jsou vytvářeny během zakládání orgánů a tvorby plodnic. Lektin 23
galektin izolovaný z Xerocomus chrysenteron má insekticidní vlastnosti. Funkce ABL z Agaricus bisporus není známá. Nicméně studie ukázaly, že ABL inhibuje buněčnou proliferaci v širokém okruhu epiteliálních typů buněk včetně maligních střevních buněk (15).
Obrázek č. 7 (15) Srovnání primární struktury lektinů patřících do skupiny AOL/ABL. Paxillus označuje přeloženou EST sekvenci z Paxillus involutus (klon T143B02944F), Xerocomus je insekticidní galektin z Xerocomus chrysenteron, Gibberella je přeložená EST sekvence z Gibberella zeae (BU065364), PCL-F je lektin z plodnice Pleurotus cornucopiae (BAB63922), AOL je lektin z Arthrobotrys oligospora (S68959), ABL je lektin z Agaricus bisporus (AAA85813). Identické zbytky jsou označeny symbolem (*), konzervativní změny jsou označeny symboly (:) a (.). Zarovnání sekvencí bylo provedeno pomocí Clustal W programu.
4.2. Serinové proteasy (13) Proteasy jsou enzymy, které katalyzují hydrolýzu peptidové vazby a často jsou využívány v biotechnologiích, průmyslu a zemědělství jako biokontrolní prostředky proti parazitům. Serinové proteasy jsou přítomné prakticky ve všech organismech a vyskytují se jako dvě hlavní skupiny, trypsinová a subtilisinová. Tyto dvě skupiny mají podobný katalytický mechanismus. Serin funguje jako primární nukleofil a histidin hraje dvojí roli, a to jako donor a akceptor protonů v závislosti na kroku reakce. (16) Serinové proteasy patří do skupiny proteas, které využívají aktivovaný serinový zbytek v substrát-vázající kapse k hydrolýze vazeb. Jejich hlavní funkcí je rozrušit kutikulu nematody. Serinové proteasy fungují jako patogenní faktory v bakteriálních a houbových 24
patogenech proti hmyzu, hlísticím a dokonce lidem. Serinové proteasy jsou hlavní extracelulární enzymy produkované ve velkém množství virulentními izoláty Verticillium lecanii a Metarhizium anisopliae. První patogenicita související se serinovou proteasou P32 (32 kDa) byla identifikována u Pochonia rubescens. Následně byly objeveny další podobné proteasy v jiných nematofágních houbách. V roce 1994 byly identifikovány další dvě patogenní proteasy, PII v Arthrobotrys oligospora a VCP1 v Pochonia chlamydosporia. Dalšími byly pSP-3 u nematofágní houby Paecilomyces lilacinus, Aoz1 u Arthrobotrys oligospora, Ver112 u Lecanicillium psalliotae, Mlx u Monacrosporium microscaphoides, PrC u Clonostachys rosea a Ds1 u Dactylella shizishanna. Tyto patogenní proteasy z nematofágních hub jsou velmi citlivé na inhibitor fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Mají podobné molekulové hmotnosti v rozsahu 32 až 39 kDa a sdílí širokou škálu proteinových substrátů včetně kaseinu, želatiny, pokožky nematod, vaječné skořápky a dalších. Navíc biochemické vlastnosti proteas PII, Aoz1, Mlx a Ds1 jsou podobné a mají nižší hodnoty izoelektrických bodů ze všech těch, které byly izolovány z nematofágních hub. Biochemické vlastnosti proteas P32, VCP1, pSP-3, Ver112 a PrC jsou také navzájem podobné, ale mají vyšší hodnoty izoelektrických bodů. Tyto enzymy byly izolovány z parazitických hub.
Obrázek č. 8 (17) Fenylmethylsulfonylfluorid.
4.2.1. Proteasy VCP1 a Ver112 (16) Proteasa VCP1 hraje důležitou roli v infekci vajíček nematod. Alkalická serinová proteasa Ver112 vykazuje kutikulu-degradující a nematocidní aktivitu. Klonované a sekvenované geny kódujících tyto proteasy vykazují vysoký stupeň podobnosti sekvencí a patří do skupiny subtilisinové serinové proteasy proteinasy K (subtilinasy). Strukturně sdílejí disulfidické můstky a podobná vazebná místa pro vápenaté ionty. Sdílejí také fyzikálně chemické vlastnosti, optimální reakční podmínky a vysokou sekvenční podobnost. Proměnné 25
zbytky uvnitř míst vázajících substrát a různá konformační přizpůsobivost v S2-kličce mohou pravděpodobně způsobit změnu substrátové specifity stejně jako katalytické aktivity.
Obrázek č. 9 (16) Kutikulu degradující proteasy. Vlevo VCP1, vpravo Ver112.
4.3. Chitinasy (13,18) Chitin je důležitým strukturním lineárním polymerem nacházejícím se v buněčné stěně
hub
a v exoskeletu
bezobratlých.
Je
tvořen
ze
spojených
ß-1,4-N-
acetylglukosaminových zbytků. Je také důležitou složkou střední vrstvy vaječných skořápek nematod, kde vytváří mikrofibrilární a amorfní struktury vložené do proteinové matrice (2). Chitinová vrstva je nejtlustší ze tří vrstev (žloutková, chitinová a lipidová vrstva) vajíčka nematod parazitujících na rostlinách, a proto tvoří pravděpodobně nejdůležitější bariéru v ochraně před infekcí (4). Nematofágní houby parazitující na vajíčkách nematod, jako např. Pochonia rubescens a Pochonia chlamydosporia, musí nejprve proniknout právě vaječnou skořápkou, aby mohly poté obsah vajíčka infikovat. Důkaz produkce chitinas houbami během infekce byl založen na ultrastrukturních studiích. Nedávno byla z nematofágních hub Pochonia rubescens a Pochonia chlamydosporia identifikována extracelulární chitinasa CHI43, tento enzym slouží jako nematocidní faktor v infekci vajíček nematod. Po ošetření vaječné skořápky nematod chitinasou CHI43, objevily se na skořápce vady (skvrny). Chitinasová aktivita byla pozorována i v kultuře supernatantu 26
nematofágní houby Paecilomyces lilacinus. Po separaci izoelektrickou fokusací bylo detekováno 6 proteinů, které vykazovaly chitinolytickou aktivitu. Studie na extracelulárních enzymech Paecilomyces lilacinus odhalily, že použití proteas a chitinas drasticky pozmění strukturu vaječné skořápky, pokud jsou aplikovány jednotlivě nebo v kombinaci.
Obrázek č. 10 (19) Struktura chitinové molekuly se dvěma N-acetylglukosaminovými jednotkami, které se opakují, aby vytvořily dlouhý řetězec spojený β-1,4 vazbami.
4.3.1. Lecanicillium psalliotae a chitinasový gen Lpchi1 (20) Nematofágní houba Lecanicillium psalliotae (Verticillium psalliotae) je známý biokontrolní prostředek (agens) a efektivní parazit nematod parazitujících na rostlinách. Zhongwei Gan et al. izolovali chitinasový gen Lpchi1 z Lecanicillium psalliotae pomocí degenerovaných primerů a DNA-walking metody. Klonovaný gen Lpchi1 kódoval 423 aminokyselinových zbytků a sdílel vysoký stupeň homologie s jinými chitinasami souvisejícími s patogenitou entomopatogenních a mykoparazitických hub. Komplementární DNA sekvence chitinasy byla amplifikována reverzní transkripcí a polymerasovou řetězovou reakcí (polymerase chain reaction - PCR) a exprese proběhla v Pichia pastoris GS115. Rekombinantní chitinasa byla purifikována gelovou filtrací jako protein o 45 kDa s optimální aktivitou při pH 7,0 a 37,6 ºC. Purifikovaná chitinasa LPCHI1 byla nalezena degradujícími chitinovými složkami vajíček nematody Meloidogyne incognita a významně ovlivnila její vývoj. Po ošetření vajíček purifikovanou chitinasou byla nezralá vajíčka anamorfní a v chitinové vrstvě se objevily velké vakuoly. Výsledky studie ukázaly, že proteasa Ver112 a chitinasa LPCHI1 ze stejné houby spolupůsobí na vajíčka. Po ošetření vajíček chitinasou se asi 38,2% nezralých vajíček nevyvinulo do zralých vajíček nebo časných stádií. Při ošetření 27
purifikovanou
proteasou
Ver112
se
přestalo
vyvíjet
45,9%
vajíček
nematody.
Při kombinovaném ošetření chitinasou a proteasou byla redukce 56,5%.
4.4. Xylanasy (21) Endo-β-1,4-xylanasy patří do skupiny enzymů široce rozšířených mezi různými mikroorganismy. Xylanasy mohou katalyzovat hydrolýzu xylanu za vzniku oligosacharidů, které mohou být postupně přeměněny pomocí β-xylosidasy na xylosu.
Obrázek č. 11 (22) Hydrolýza xylanu na xylosu.
Vědci se snažili zlepšit efektivitu degradace xylanu pro produkci etanolu jako biopaliva. Izolovali množství hub, které vykazovaly xylanasovou aktivitu. Popsali klonování a charakterizovali novou xylanasu (XYNZG) a její gen nazvaný xynZG z nematofágní houby Plectosphaerella cucumerina, která byla využita jako biologický prostředek proti cystám nematod parazitujících na bramborách (21).
28
Obrázek č. 12 (23) Endo-β-1,4-xylanasa. PDB kód: xylanasa z Penicillium simplicissimum, PDB 1bg4.
4.5. Kolagenasy a další hydrolytické enzymy (4,5,13) Povrch nematody se skládá z kutikuly, která tvoří tenký a flexibilní exoskelet, složený převážně z proteinů se stopovým množstvím lipidů a sacharidů. Ačkoliv se může struktura kutikuly lišit mezi různými druhy a mezi vývojovými stádii uvnitř druhů, celkové složení kutikuly nematod je stejné. Kolagenasy jsou enzymy, které mohou katalyzovat hydrolýzu kolagenu a želatiny. Kolagen je hlavní složkou kutikuly nematod, proto kolagenasy nematofágních hub mohou hrát důležitou roli v infikování nematod. Další hydrolytické enzymy (lipasy, amylasy, pektinasy) jsou také zapojeny do infekce nematod. Např. u vajíček Heterodera schachtii infikovaných houbou v porovnání s neinfikovanými byly jejich vnitřní lipidové vrstvy rozrušeny, což bylo přisouzeno lipolytické aktivitě hub. Fosfatasy by mohly být zapojeny do adheze a signální transdukce, proto ani jejich roli v infikování nematod nelze přehlížet.
29
Závěr Nematofágní houby zahrnují více než 200 druhů taxonomicky rozlišných hub mikroskopických rozměrů. Nejvíce nematofágních hub, včetně druhů chytajících nematody do pastí a endoparazitických, jsou deuteromycety. Všechny mají schopnost napadnout živé nematody a využít je jako zdroj živin. (1) Houby se liší v saprofytických a parazitických schopnostech. Zatímco houby tvořící pasti a houby napadající vajíčka se živí saprofyticky, endoparazitické houby jsou většinou závislé na nematodách jako na živinách, jsou tedy obligátní parazité. (5) Nematofágní houby chytající nematody do pastí vytvářejí na svých hyfách zvláštní pasti v podobě trojrozměrných sítí, lepkavých výběžků, škrtících i neškrtících ok, do kterých se nematoda chytne a houba ji infikuje a stráví. Oproti tomu endoparazitické houby produkují spory, které se přilepí na nematodu nebo jsou jí polknuta a infikují ji podle toho z vnějšku nebo vnitřku. (4) Do samotné interakce nematofágní houba – nematoda je zapojeno mnoho sloučenin. Předpokládá se, že rozpoznání hostitele a následná adheze vyžaduje interakci mezi sacharidvázajícím proteinem (lektinem) v houbě a sacharidovým receptorem na nematodě (13). Jiní vědci tvrdí, že AOL není pravděpodobně zapojen přímo do chytání nematod, protože protein se vyskytuje v cytoplazmě a ne na povrchu chytacích buněk (15). Bylo navrženo více možností funkce AOL. Jednak může fungovat jako skladovací protein během saprofytického a parazitického růstu. Další možností je, že AOL je složkou systému obrany proti různým zvířecím požíračům hub. Několik studií dokázalo, že rostlinné lektiny hrají dvojí roli, a to jako skladovací a obranné proteiny, a proto se dá očekávat, že i lektiny nematofágních hub mohou být zapojeny do více aktivit. U ABL byla objevena inhibice buněčné proliferace v širokém okruhu epiteliálních typů buněk včetně maligních střevních buněk (15). Serinové proteasy patří do skupiny proteas, které využívají aktivovaný serinový zbytek v substrát-vázající kapse k hydrolýze vazeb. Jejich hlavní funkcí je rozrušit kutikulu nematody (13). Proteasa VCP1 hraje důležitou roli v infekci vajíček nematod. Alkalická serinová proteasa Ver112 vykazuje kutikulu-degradující a nematocidní aktivitu (16). Chitin je důležitou složkou střední vrstvy vaječných skořápek nematod (13). Extracelulární chitinasa CHI43 slouží jako nematocidní faktor v infekci vajíček nematod. Při kombinovaném ošetření vajíček chitinasou a proteasou Ver112 se redukce vylíhnutých vajíček nematod zvýší oproti samostatnému ošetření chitinasou nebo proteasou (20). 30
Novou xylanasu (XYNZG) a její gen xynZG z nematofágní houby Plectosphaerella cucumerina lze využít jako biologický prostředek proti cystám nematod parazitujících na bramborách (21). O využití nematofágních hub k biokontrole nematod se dá uvažovat, zatím ale spíše jen v laboratorních podmínkách. Bylo sice již provedeno mnoho terénních studií, ale většina byla bez pozitivního výsledku. Aby se studie zdařila, je potřeba zajistit přežití hub nejen v trávicím traktu zvířat, ale i mimo něj. Bylo by dobré, aby houba byla přítomna u rostliny v době jejího růstu a vykazovala aktivitu. Je taktéž nutné, aby houba zareagovala v okamžiku přemnožení nematod. Nicméně z provedených reálných studií vyšly jako vhodné houby např. Duddingtonia flagrans, Arthrobotrys cladodes nebo Harposporium anguillulae. (8,9,10)
31
Literatura 1
B. Nordbring-Hertz, H.B. Jansson, A. Tunlid (2006). Nematophagous Fungi. Encyclopedia of Life Sciences. John Wiley & Sons, Ltd.
2
H.B. Jansson, L.V. Lopez-Llorca (2004). Control of Nematodes by Fungi. In Fungal Biotechnology in Agriculture, Food and Environmental Applications. New York: Marcel Dekker.
3
G.L. Barron (1977). The Nematode-destroying Fungi. Guelph, Ontario: Canadian Biological Publications.
4
H.B. Jansson, L.V. Lopez-Llorca (2001). Biology of Nematophagous Fungi. In Trichomycetes and Other Fungal Groups. Science Publishers.
5
B. Nordbring-Hertz, H.B. Jansson, A. Tunlid (1997). Nematodes. In Fungal Biotechnology. Weinheim: Chapman & Hall
6
L.V. Lopez-Llorca, C. Olivares-Bernabeu, J. Salinas, H.B. Jansson, P. E. Kolattukudy (2002). Pre-penetration events in fungal parasitism of nematode eggs. Mycological Research 106 (4), 499-506.
7
P.J.Waller (1993). Nematophagous Fungi: Prospective Biological Control Agents of Animal Parasitic Nematodes? Parasitology Today 9, 429-431.
8
C. Paraud, I. Pors, C. Chartier (2007). Efficiency of feeding Duddingtonia flagrans chlamydospores to control nematode parasites of first-season grazing goats in France. Veterinary Research Communications 31, 305-315.
9
A. Eslami, S. Ranjbar-Bahadori, R. Zare, M. Razzaghi-Abyaneh (2005). The predatory capability of Arthrobotrys cladodes var. macroides in the control of Haemonchus contortus infective larvae. Veterinary Parasitology 130, 263-266. 32
10
T. P. Charles, M. V. C. Roque, C. de P. Santos (1996). Reduction of Haemonchus contortus Infective Larvae by Harposporium anguillulae in Sheep Faecal Cultures. International Journal for Parasitology 26, 509-510.
11
http://www.nematophage-pilze.de/index.htm. Webové stránky diplomovaného biologa Philipa Jacobse (2001).
12
G. Barron (2001). The Nematode-Destroying Fungi. In The Fifth Kingdom. Sidney, Vancouver Island, British Columbia, Canada: Mycologue Publications.
13
J. Yang, B. Tian, L. Liang, K.Q. Zhang (2007). Extracellular enzymes and the pathogenesis of nematophagous fungi. Applied Microbiology and Biotechnology 75, 21-31.
14
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/SIGMA/A2795. Webové stránky (katalog) firmy Sigma-Aldrich (2008)
15
J. Balogh, A. Tunlid, S. Rosén (2003). Deletion of a lectin gene does not affect the phenotype of the nematode-trapping fungus Arthrobotrys oligospora. Fungal Genetics and Biology 39, 128-135.
16
S.Q. Liu, Z.H. Meng, J.K. Yang, Y.X. Fu, K.Q. Zhang (2007). Characterizing structural features of cuticle-degrading proteases from fungi by molecular modeling. BMC Structural Biology 7, 33.
17
http://www.piercenet.com/products/. Webové stránky Thermo Fisher Scientific Inc. (2008).
18
A.F. Bird, P.G. Self (1995). Chitin in Meloidogyne javanica. Fundamental and Applied Nematology 18, 235-239.
19
http://cs.wikipedia.org/wiki/Chitin.
Webové
encyklopedie (2008). 33
stránky
Wikipedie,
Otevřené
20
Z. Gan, J. Yang, N. Tao, L. Liang, Q. Mi, J. Li, K.Q. Zhang (2007). Cloning of the gene Lecanicillium psalliotae chitinase Lpchi1 and identification of its potential role in the biocontrol of root-knot nematode Meloidogyne incognita. Applied Microbiology and Biotechnology 76, 1309-1317.
21
G. M. Zhang, J. Huang, G. R. Huang, L. X. Ma, X. E. Zhang (2007). Molecular cloning and heterologous expression of a new xylanase gene from Plectosphaerella cucumerina. Applied Microbiology and Biotechnology 74, 339-346.
22
http://www.scientificpsychic.com/fitness/xylan1.gif a http://food.oregonstate.edu/ images/learni/haw/39.gif. Webové stránky Scientific Psychic (2005) a Food Resource (2007).
23
http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/genomes/date/1bg4.gif. Webové stránky Protein Data Bank, Information Portal to Biological Macromolecular Structures (2008).
34
