Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie
Detekce prionových proteinů a jejich interakce s kovy a metalothioneinem Diplomová práce
Vedoucí práce: doc. RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D.
Brno 2014
Vypracovala: Bc. Alžběta Cardová
@
Ústav chemie a biochemie Akademický rok: 2073 / 20 14
Agronomická
ÍaKulta
srr,
ZADANI DIPLOMOVE PRACE Zpracovatelka:
Bc. Alžběta Cardová
Studijní program:
Zootechnika
Obor:
Živočíšné biotechnolo$ie
Konzultant:
lns. Pavlína Šobrová
Název tématu;
Detekce prionorných proteinů a jejich interakce s kovy a metalothioneinem
Rozsah práce:
50-60 stran
Zásady pro vypracování:
1. Až donedávna se všeobecně soudilo, že jakékoli infekčníonemocnění můžebýt způsobeno pouze takovým a$ens, které obsahuje nukleovou kyselinu, podle které můžev hostitelském orsanismu vytvářet své vlastní kopie' Profesor Stanley B. Prusiner však v roce 1982 zformuloval tzv. prionovou teorii' za kterou dostal v roce 1997 Nobelovu cenu' Tato teorie předpokládá, že patogenní agens zde představuje prion, tedy infekčníbílkovina, která se pravděpodobně množíbez účastinukleové kyseliny. lnfekčnípriony způsobujířadu neurode$enatívních onemocnění z nichž nejvýznamnější u zvířat je BSE neboli ,,nemoc šílenýchkrav" a u člověka již výše zmiňovaná Creutzfeldt-Jakobova choroba. od doby, kdy prionová onemocnění vstoupila do podvědomí lidí, vyvstává otázka, jak tyto vysoce infekčníproteiny detekovat. Cílem diplomovó práce bude sumarizovat doposud dostupné informace z literatury. V experimentální části bude pak kladen důraz na charakterizaci prionových proteinů za pomocí moderních analytických metod, jako je elektrochemie' Dále budou sledovány jejich interakce s kovy zejména s mědí a zinkem, u kteých byla popsána jejich významná role v průběhu neurode$enerativních onemocnění z hlediska prionové struktury a oxidačníhostresu u buněk. Kromě kovů bude práce zaměřena i na sledování interakcí s metalothioneinem, což je kov-vázající protein, kteý je s velkou pravděpodobností taktéžzapojen do procesu neurode$enerace. Vazba kovů do prionového proteinu můžebýt důležitýmfaktorem pro celý proces poškození mozku a následnou pro$resivní de$eneraci. 2. Literární přehled o metodách detekce prionových proteinů. Listopad 20Iz - Březen 2013 3. optimatizace vybraných bioanalytických metod. Duben 2013 - Červen 2013 4. Studium interakcí prionových proteínů s kovy a metalothioneinem. Čer.ren 2a73 - Prosinec 2013 5. Zpracování a vyhodnocení výsledků. Prosinec 2013 - Březen 2014 6. Odevzdání diplomové práce' Duben 2014 Mendelova
univerzita v
Brně
Ia
a
a
Seznam odborné literatury:
1. COLLINGE, J. Prion diseases of humans and animals: Their causes and molecular basis. Annual Review of Neuroscience, 2001, roč' 24. č', s. 519.550. lsS 0147-006X. 2. COYLE, P.; PHILCOX, J. C.; CAREY l-. C.; ROFE, A. M. Metallothionein: The multipurpose protein. Cellular and Molecular Life Sciences, 2002, roč. 59. č.4, s.627-647.lss 1420682X.
3. EGHIAIAN, F.; GROSCLAUDE, J.; LESCEU, S.; DEBEY P.; DOUBLFI-, B.; TREGUER, E.; REZAEI, H.; KNOSSOW M. lnsight into the PrPC -> PrPSc conversion from the structures of antibodybound ovine prion scrapie-susceptibility variants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, roč. 101. č. 28, s. 10254-10259. lss 0027-
8424.
{
4. Gavier-Widen D, Stack MJ, Baron T, Balachandran A, Simmons M. Diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies in animals: a review. Journal of Veterinary Diagnostic lnvesti gation. 2005; 17:509-27
.
5. Kozlowski, H., Luczkowski, M., Remelli, M. and Valensin, D. Q01A Copper, zinc and iron in neurodegenerative diseases (Alzheimer's, Parkinson's and prion diseases). Coordination Chemistry Reviews, ?56, 2729-2747.
Datum zadání diplomové práce:
březen 2014
Termín odevzdání diplomové práce:
duben 2014
L. S.
j
!-)
,.
,:
i li
/.- .ýu.
*r__i \ doc. RNDr..Vojtěch Adam, Ph.D.
Bc. Alžběta Cardová
Vedoucí práce
Autorka práce
'
t ,!
\ , !
,'.'
1.,
/_>
,llll {,
(-x)-
.'
_
doc. RNDr, Vojtěch Adam, Ph.D. Vedoucí ústavu
i,
,1
t;;-.t_1.\,-2-, ^
prof. Ing. ladislav Zeman, CSc. Děkan AF MENDELU
Čestné prohlášení
Prohlašuji, že jsem práci Detekce prionových proteinů a jejich interakce s kovy a metalothioneinem
vypracovala
samostatně
a
veškeré
použité
prameny
a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací.
Jsem si vědoma, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona.
Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše.
V Brně dne:………………………..
…………………………………………………….. podpis
Tato práce vznikla v rámci CEITEC - Středoevropského technologického institutu s pomocí výzkumné infrastruktury financované projektem CZ.1.05/1.1.00/02.0068 z Evropského fondu regionálního rozvoje.
Na tomto místě bych ráda poděkovala svojí konzultantce diplomové práce Ing. Pavlíně Šobrové, Ph.D. za objasnění elektrochemických metod a trpělivé vedení mých prvních pokusů s elektrochemií. Dále bych chtěla poděkovat svému školiteli doc. RNDr. Vojtěchu Adamovi, Ph.D., který mě vždy motivoval k lepším výkonům a jemuž tímto děkuji i za příležitost výjezdu na zahraniční stáž na Univerzitu v Cambridge, kde jsem získala velkou část svých výsledků. Moje poslední poděkování bude patřit celému kolektivu Laboratoře Metalomiky a Nanotechnologií za pomoc s mými experimenty a za příjemnou atmosféru, díky které mi šla práce lépe od ruky.
ABSTRAKT Detekce prionových proteinů a jejich interakce s kovy a metalothioneinem Prionová onemocnění vznikají konformační změnou buněčného prionového proteinu (PrPC) struktury α-helixu na jeho patologickou isoformu (PrPSc), která nabývá konformace β-skládaného listu. Vlastnosti PrPC v mozku stále nejsou dostatečně prozkoumány, ale předpokládá se jeho afinita k iontům kovů. Dalším proteinem, který má kov-vázající vlastnosti je i metalothionein (MT). Mozkově specifická isoforma MT se nazývá MT-III a předpokládá se její účast na udržování koncentrace kovových iontů v mozku. Cílem této práce byla příprava rekombinantního buněčného prionového proteinu v E. coli. Dále využití tohoto proteinu k odhalení interakcí mezi ionty kovů (Cu, Zn), MT a PrPC pomocí metody diferenční pulzní voltametrie. Poslední část pak byla věnována stanovení hladiny MT-III v prion-infekčních a neinfekčních myších mozkových tkáních různých genotypů. Klíčová slova: elektrochemie, kovy, metalothionein, metalothionein-III, měď, MT, MTIII, prion, prionová onemocnění, PrPC, PrPSc, zinek
ABSTRACT Detection of prion proteins and its interaction with metals (Cu, Zn) and metallothionein Prion diseases are formed by a conformational change of prion-like protein (PrPC) with α-helix structure to the pathological isoform - prion (PrPSc) which acquires β-sheet structure. PrPC physiological properties in the brain are insufficiently described but there is an assumption of its affinity to metal ions. Another protein with metal-binding ability is metallothionein (MT). Brain specific isoform of MT is called MT-III and it is assumed to participate in maintenance of metal ions concentration in the brain. Aim of this study was to prepare recombinant human PrPC in E. coli. Furthermore, this protein was used to detect interactions between metal ions (Cu, Zn), MT and PrPC by differential pulse voltammetry method. The final part was devoted to the MT-III determination in different genotypes of prion-infected and non-infectious mouse brain tissues. Key words: copper, electrochemistry, metallothionein, metallothionein-III, MT, MT-III, prion, prion diseases, PrPC, PrPSc, zinc
Obsah 1
Úvod ................................................................................................................. 10
2
Literární přehled ............................................................................................... 11 2.1
Priony ........................................................................................................ 11
2.1.1
Molekulární podstata přirozeného prionového proteinu PrPC .............. 12
2.1.2
Molekulární podstata infekčního prionového proteinu PrPSc................ 14
2.1.3
Podstata přeměny PrPC na PrPSc ........................................................... 14
2.2
Prionová onemocnění ............................................................................... 16
2.2.1
Historie prionových onemocnění .......................................................... 18
2.2.2
Prionová onemocnění u zvířat ............................................................... 19
2.2.3
Prionová onemocnění člověka .............................................................. 23 Onemocnění prionům podobná ................................................................. 28
2.3 2.3.1
Alzheimerova choroba (AD) ................................................................. 28
2.3.2
Parkinsonova choroba (PD) .................................................................. 29
2.3.3
Huntigtonova choroba (HD) ................................................................. 31
2.4
Metalothionein (MT) ................................................................................ 31
2.4.1 2.5
Esenciální kovy (Cu, Zn) a vznik prionových onemocnění ...................... 33
2.6
Elektrochemické metody detekce proteinů ............................................... 35
2.6.1
Voltametrie ............................................................................................ 36
2.6.2
Diferenční pulzní voltametrie ............................................................... 36
2.6.3
Adsorptivní přenosová technika (AdTS) .............................................. 37 Imunochemické stanovení proteinů pomocí western blotu ...................... 37
2.7
3
MT-III a vznik prionových onemocnění ............................................... 32
2.7.1
SDS-PAGE ............................................................................................ 38
2.7.2
Western blot .......................................................................................... 38
2.7.3
Dot-blot ................................................................................................. 39
Cíle práce ......................................................................................................... 40
4
Materiál a metody ............................................................................................ 41 4.1
Materiál ..................................................................................................... 41
4.2
Příprava rekombinantního lidského prionového proteinu v E. coli .......... 42
4.3
Elektrochemická detekce prionových proteinů a jejich interakce s kovy a
metalothioneinem........................................................................................................ 43 4.3.1
Měření rekombinantního lidského prionového proteinu (PrPC)............ 43
4.3.2
Měření esenciálních kovů (Cu a Zn) ..................................................... 44
4.3.3
Měření interakce PrPC a esenciálních kovů (Cu a Zn) .......................... 44
4.3.4
Měření metalothioneinu (MT)............................................................... 44
4.3.5
Měření interakce PrPC a metalothioneinu (MT).................................... 44 Sledování změn hladiny MT-III v průběhu prionových onemocnění
4.4
pomocí molekulárně biologických metod................................................................... 45 4.4.1
Příprava prion-infekčních a neinfekčních transgenních myší ............... 45
4.4.2
Příprava myších mozkových homogenátů ............................................ 45
4.4.3
SDS-PAGE ............................................................................................ 45
4.4.4
Western blot .......................................................................................... 46
4.4.5
Dot-blot ................................................................................................. 47
5
Výsledky a diskuse ........................................................................................... 48 5.1
Příprava rekombinantního lidského prionového proteinu v E. coli .......... 48
5.2
Elektrochemická detekce prionových proteinů a jejich interakce s kovy a
metalothioneinem........................................................................................................ 50 5.2.1
Stanovení PrPC v acetátovém pufru metodou DPV .............................. 51
5.2.2
Stanovení interakcí PrPC a Cu metodou DPV ....................................... 51
5.2.3
Stanovení interakcí PrPC a Zn metodou DPV ....................................... 52
5.2.4
Stanovení PrPC, MT a jejich interakcí metodou DPV........................... 53
5.3 5.3.1
Sledování změn hladiny MT-III v průběhu prionových onemocnění ....... 57 Ověření identity vzorků neinfekčních myších mozkových tkání .......... 57
5.3.2
Sledování hladiny MT-III v neinfekčních mozkových tkáních (dot-blot) 58
5.3.3 blot) 5.3.4 tkáních 5.3.5
Sledování hladiny MT-III v neinfekčních mozkových tkáních (western 58 Sledování hladiny MT-III v prion-infikovaných myších mozkových 59 Sledování genotypově specifických změn hladiny MT-III v prion-
infikovaných myších mozkových tkáních .............................................................. 60 6
Závěr ................................................................................................................ 63
7
Literatura .......................................................................................................... 65
8
Seznam obrázků ............................................................................................... 77
9
Seznam zkratek ................................................................................................ 82
1
ÚVOD
Prionovým proteinům se v době svého odhalení podařilo změnit veškeré představy týkající se infekčních chorob. Všechna známá infekční agens přenáší svou informaci prostřednictvím nukleových kyselin. V případě prionů má však tuto funkci bílkovina, která s sebou žádnou genetickou informaci nenese a i její replikace probíhá zcela bez účasti nukleových kyselin. Po změně prostorové struktury přestanou prionové proteiny plnit svou fyziologickou funkci a začnou páchat škody na nervových buňkách. Unikátním jevem je také jejich šíření. Po změně konformace prionového proteinu na jeho patologickou formu se tato změna může přenášet na další prionové proteiny řetězovou reakcí. Za nejjednodušší úroveň života byly vždy považovány viry. Bylo však zjištěno, že Darwinovu evoluční teorii je možné univerzálně aplikovat nejen na viry, ale i na prionové proteiny. U virů byly mutační procesy omezeny na změny ve struktuře nukleových kyselin. Nyní se však posunuly možnosti adaptace o jeden stupeň níže, a to na částice, které k mutacím nepotřebují ani účast nukleových kyselin. Prionové proteiny tak jejich prvenství nyní přebírají. Existují domněnky, že šíření patologické přeměny mezi proteiny není omezeno jen na priony. U dalších proteinů, které způsobují neurodegenerativní onemocnění, se objevují velmi podobné vzorce chování těchto proteinů. Takzvaná prionům podobná onemocnění, jako je například Alzheimerova či Parkinsonova choroba, by mohla mít velmi podobný mechanismus šíření infekčních agens ve tkáních. Ve všech případech neurodegenerativních onemocnění totiž dochází ke špatnému sbalování proteinů, které se tím stávají infekčními a mohou se velmi rychle šířit. Pokud by byl mechanismus šíření pozměněných proteinů v mozku stejný či podobný jako v případě prionových onemocnění, postavilo by to tyto choroby do úplně nového světla.
S postupným
stárnutím
evropské
populace
se
riziko
výskytu
neurodegenerativních chorob razantně zvyšuje. Sociálně-ekonomický dopad těchto chorob je velmi závažný a jejich prevalence je již teď velmi vysoká. Jednou z neurodegenerativních chorob trpí po 65. roce života každý 20. člověk v ČR. Celosvětově je to pak minimálně 40 milionů nemocných. Výzkum zaměřený na tato onemocnění a mechanismy jejich vzniku bude v budoucnu zcela jistě nejvyšší prioritou.
10
2
LITERÁRNÍ PŘEHLED
2.1 Priony Prionový protein (PrPC) je protein přirozeně přítomný ve všech savčích buňkách. Jeho exprese
je
nejvyšší
v nervových
buňkách
a
buňkách
imunitního
systému.
Fyziologická funkce tohoto proteinu není prozatím zcela objasněna, ale pravděpodobně se podílí na diferenciaci buněk a synaptickém přenosu. Pomocí neobjasněného mechanismu se tento protein může stát infekčním. Přirozená a infekční forma proteinu se od sebe liší pouze změněnou konformací (Legname et al., 2004). Ve struktuře přirozeného proteinu (PrPC, Obrázek 1A) převládá konformace alfa-šroubovice a při patologické přeměně na infekční prion (PrPSc, Obrázek 1B) se tato konformace mění na strukturu beta-skládaného listu (Caughey et al., 1991; Pan et al., 1993; Kong et al., 2013). PrPSc je velice odolný vůči degradačním buněčným procesům a po vazbě na PrPC u něj vyvolává změnu konformace na PrPSc. Toxicita tohoto obtížně degradovatelného proteinu a nedostatek fyziologického PrPC pak zapříčiňují vznik progresivních neurodegenerativních chorob, známých jako transmisivní spongiformní encefalopatie (TSE), které jsou klinicky heterogenní a současně neléčitelné (Ji a Zhang, 2010; Tiraboschi a Tagliavini, 2013). Tato onemocnění, jak lidská tak živočišná, zahrnují například tyto choroby: Creutzfeldt-Jakobovu nemoc (CJD) či GertsmanůvStrausslerův-Schenkerův syndrom u člověka, scrapii (klusavku) u ovcí a koz a bovinní spongiformní encefalopatii (BSE) u krav (Prusiner, 1991; Dodelet a Cashman, 1998; Kretzschmar a Tatzelt, 2013).
A
B
Obrázek 1: A) Schéma struktury přirozeného buněčného prionového proteinu (PrPC); B) struktury pozměněného infekčního prionu (PrPSc). Převzato z (Huang et al., 1996).
11
2.1.1
Molekulární podstata přirozeného prionového proteinu PrPC
PrPC je povrchový buněčný glykoprotein, který je exprimován především v mozku, kde je jeho množství asi padesátkrát vyšší než v případě jiných tkání (Dormont, 2002). Mezi hlavní místa jeho exprese patří například neurony, gliové buňky, leukocyty ale také okolní tkáně zahrnující jednojaderné periferní krevní buňky (Cashman et al., 1990; Dodelet a Cashman, 1998). Co se týče genetického hlediska, prionový protein je u člověka kódován vysoce konzervovaným genem PRNP, jež je lokalizován na chromozomu 20 (Parchi a Gambetti, 1995). Tento protein je tvořen 253 aminokyselinami a jeho molekulová hmotnost se pohybuje od 35 do 36 kDa (Dormont, 2002). Lidský PrPC je složen z dlouhé flexibilní N-terminální domény obsahující oktapeptidové repetice glycinu a histidinu, která tvoří vazebná místa pro měďnaté ionty s nízkou mikromolární afinitou (Dormont, 2002; Varela-Nallar et al., 2006). Cterminální doména je tvořena dvěma β-skládanými listy typu β1 a β2 a třemi αšroubovicemi typu α1, α2 a α3 (Zahn et al., 2000; Passet et al., 2013). Sekundární struktura PrPC je tvořena ze 42 % konformací α-šroubovice a z 3 % konformací βskládaného listu (Harris, 1999). Terciární struktura proteinu tvoří na svém Cterminálním konci globulární doménu tvořenou třemi α-šroubovicemi a 2 malými βskládanými listy. PrPC pak vytváří několik domén, které zahrnují N-terminální signální peptid a řadu pěti okta-peptidových repeticí. Tyto repetice jsou bohaté na prolin a glycin. Další část prionového proteinu tvoří centrální hydrofobní segment a Cterminální
hydrofobní
oblast.
Tato
oblast
pak
slouží
k napojení
glykosylfosfatidylinositolu (GPI), který pak slouží jako kotva tohoto proteinu v buněčné membráně (Harris, 1999). Syntéza PrPC probíhá stejně jako u ostatních membránových proteinů na membráně drsného endoplazmatického retikula (ER) a protein je posléze transportován přes Golgiho aparát na buněčný povrch. Před transportem je však podroben ještě řadě posttranslačních úprav. Prvním krokem je odstranění N-terminálního signálního peptidu, dále jsou připojeny dva oligosacharidové řetězce N-glykosidovou vazbou v pozicích 181 a 197 a v konečné fázi je vytvořena disulfidická vazba mezi cysteiny v pozicích 179 a 214 (Yuan et al., 2005). Při transportu PrPC na povrch buňky je protein kotven na plazmatickou membránu lipidového raftu pomocí GPI a později je posunut mimo raft, kde je neustále zpětně pohlcován do buňky prostřednictvím klathrinové jamky (Obrázek 2). Do této jamky je PrPC přichycen transmembránovým proteinem. 12
Extracelulární doména receptoru je vázána na N-terminální část PrPC, která je nezbytná pro účinnou endocytózu (Harris, 1999). Pohlcený PrPC se dostává přes raný endozom zpět na cytoplazmatickou membránu nebo postupuje přes pozdní endozom do lyzozomu, kde je degradován (Shyng et al., 1993). Prionový protein lze najít na všech biosyntetických a endocytických transportních membránových strukturách a u neuronů hipokampu a thalamu také v cytosolu (Campana et al., 2005). Součástí normálního metabolismu PrPC může být i posttranslační štěpení na povrchu buňky v GPI sekvenci, které uvolňuje polypeptidový řetězec do mimobuněčného prostoru. Další štěpení může za určitých podmínek probíhat také v blízkosti pozice 90 (Mange et al., 2004). Tohle štěpné místo je za přítomnosti kovů citlivé k působení peroxidu vodíku a jeho produktem je fragment schopný zahájit polymerizaci PrPC. Předpokladem je, že díky této polymerizaci vznikají prionová onemocnění (Abdelraheim et al., 2006). Pro studium funkce PrPC byly využity myši, u nichž byla vyřazena funkce genu PRNP (Bueler et al., 1993). Tyto takzvaně PrP knock-out myši byly odolné proti prionovým onemocněním, což svědčí o klíčové roli PrPC při vývoji TSE.
Lipidový raft
Oblast bez lipidového raftu
Klathrinem pokrytá jamka
Protein nebo lipid vázaný k raftu Transmembránový protein - adaptor
Internalizace
Obrázek 2: Schéma přirozeného internalizačního mechanismu buněčného prionového proteinu (PrPC). Upraveno dle (Taylor et al., 2005). V první fázi je PrPC ukotven v plazmatické membráně lipidového raftu pomocí glykosylfosfatidylinositolové kotvy (GPI-kotvy) a současně se váže na protein či lipid vázaný k raftu svým N-koncem (aminokyselinové zbytky 23-90, označeny červeně). Na Cu2+-vazebné oktapeptidové repetice (označeny modře) se v další fázi vážou ionty mědi, čímž je změněna konformace PrPC a ten uvolňuje svou vazbu s proteinem či lipidem na raftu a začne 13
se bočně posouvat do oblasti mimo lipidový raft. PrPC se dále posunuje po plazmatické membráně, až do místa klathrinové jamky, kde se jeho N-konec naváže na transmembránový protein, který je spojen s adaptorovým proteinem AP-2. Tímto začíná endocytický cyklus pohlcování PrPC skrz klathrinovou jamku. 2.1.2
Molekulární podstata infekčního prionového proteinu PrPSc
PrPSc je protein o velikosti asi 27 – 30 kDa, vzniklý posttranslační modifikací PrPC. Je to termostabilní konformační isomer PrPC, který se od něj liší ve své sekundární i terciární struktuře. Jeho sekundární struktura obsahuje 45 % β-skládaného listu a 30 % α-šroubovice (Caughey et al., 1991; Kong et al., 2013). Na vzniku isomeru se pravděpodobně podílí úsek mezi aminokyselinovými zbytky 144 a 154, který je u PrPSc tvořen strukturou β-skládaného listu a u PrPC je naopak tvořen α-šroubovicí (Yuan et al., 2005). Dalším rozdílem PrPSc oproti PrPC je jeho rezistence k proteináze K, fosfolipáze C, metabolická stálost, nerozpustnost v detergentech a jeho tendence k agregaci a polymerizaci (Dormont, 2002). Přesné stanovení distribuce PrPSc v buňce je obtížné, z důvodu neexistence spolehlivých protilátek specifických pro PrPSc. Experimenty v této oblasti prokázaly jeho přítomnost na plazmatické membráně, v endolyzozomálních strukturách, cytosolu a exozomech infikované buňky (Campana et al., 2005). Posttranslační štěpení PrPSc má za následek odstranění části N-terminální oblasti a nenarušuje amyloidogenní a neurotoxickou oblast polypeptidového řetězce (Chen et al., 1995). PrPSc existuje v několika variantách - prionových kmenech (Collinge, 2001). Tyto prionové kmeny jsou od sebe odlišeny podílem glykosylace a přesnou konformací PrP molekuly. PrPSc tvoří čtyři odlišné typy. U všech typů CJD je přítomen typ 4 a v případech sporadické CJD se navíc vyskytují typy 1, 2 a 3. 2.1.3
Podstata přeměny PrPC na PrPSc
V současné době není objasněn přesný způsob přeměny PrPC na jeho infekční formu PrPSc ani přesná lokalizace tohoto procesu. V případě familiárních forem prionových onemocnění dochází k mutaci v aminokyselinové sekvenci proteinu a PrPSc je tvořen klasickým způsobem v ER (Prusiner, 1998; Harris, 1999). V případě infekčních typů choroby je pro vznik prionů (PrPSc) nutné, aby došlo ke kontaktu mezi endogenním PrPC a exogenním PrPSc (Prusiner, 1998). Podle všeho k tomuto prvnímu kontaktu dochází na cytoplazmatické membráně a další transformace mohou probíhat také na plazmatické membráně nebo v endolyzozomálních strukturách či ER. Podle jiných názorů může přeměna PrPC na infekční PrPSc nastat až poté, co nově vzniklý protein 14
dosáhne buněčného povrchu (Campana et al., 2005). Existují dva teoretické modely konverze PrPC na PrPSc. První model se nazývá matricový model (Obrázek 3A) a předpokládá, že vzájemné působení mezi exogenním PrPSc a endogenním PrPC může vyvolat přeměnu na PrPSc díky překonání energetické bariéry, která jinak brání jejich spontánní konverzi. PrPSc zde slouží jako matrice, která určuje budoucí podobu PrPC. Druhým existujícím modelem přeměny je nukleačně-polymerizační model (Obrázek 3B). Tento model je postaven na existenci reverzibilní termodynamické rovnováhy mezi PrPC a PrPSc a konverze probíhá přes rozloženou strukturu PrPSc, kdy jsou molekuly PrPSc organizovány do infekčních jader, která mohou přibírat další PrPSc a eventuálně tvořit amyloid (Collinge, 2001; Campana et al., 2005). Tento amyloid se může dále štěpit a tvořit velké množství infekčních jader. A Matricový model
PrPC
PrPSc
Energetická bariéra brání přirozené konverzi
Heterodimer
Homodimer
Amyloid
B Nukleačně – polymerizační model
PrPC
PrPSc
Rovnováha mezi oběma formami
Formace jader
Přidávání monomerních Infekční PrPSc
jádro
Amyloid
Dělení na více infekčních jader
Obrázek 3: Modely vzniku infekčních prionů. Převzato a upraveno dle (Aguzzi et al., 2001). A) Matricový model předpokládá, že přirozené změně buněčného prionového proteinu (PrPC) na patologickou formu prionového proteinu (PrPSc) brání energetická bariéra. Pokud je však tato bariéra překonána, dochází k tvorbě heterodimerů PrPC + PrPSc. Tyto heterodimery se pak přeměňují v homodimery PrPSc. Tyto homodimery pak agregují a tvoří amyloid. B) Nukleačně-polymerizační model je postaven na existenci termodynamické rovnováhy mezi oběma formami (PrPC a PrPSc). V tomto případě se při změně termodynamické rovnováhy tvoří jádra PrPSc, ke kterým se přidávají další monomerní PrPSc a vznikají infekční jádra. Shlukováním těchto jader k sobě vzniká amyloid, který se pak může znovu dělit na více infekčních jader. 15
Velmi důležitou roli při těchto konformačních restrukturalizacích hrají i lipidové membránové domény zvané lipidové rafty. Tyto lipidové domény pravděpodobně působí jako transportéry prionových proteinů do nitrobuněčných struktur, ve kterých pak proběhne změna konformace (Campana et al., 2005). Za normálních okolností se lipidové rafty podílejí na zrání, skládání a stabilizaci normální PrPC molekuly. Pokud se však molekula PrPC odpojí od lipidového raftu, může snadno dojít k patologické změně její konformace (Sanghera a Pinheiro, 2002). V otázce role lipidových raftů však nepanuje jednota a existují i další teorie o jejich funkci. Jedna z nich tvrdí, že tyto lipidové membránové domény působí jako plošiny, na nichž se mohou PrP C hromadit, čímž zvyšují riziko setkání s patogenní formou a následnou konverzi na PrP Sc. Na lipidových raftech je často přítomný i takzvaný protein X, který usnadňuje přeměnu PrPC na PrPSc. Po shromáždění několika monomerů PrPSc do uspořádaného jádra se přidávají další monomery PrPC a mění se v PrPSc. Pokud se intermolekulární interakce takto pozměněných infekčních agregátů stanou silnými a tím pádem nevratnými, odolávají mechanismům buněčné smrti a šíří se z jedné buňky do druhé, kde k sobě váží další monomery, nazývají se tyto částice priony (Prusiner, 1982; Prusiner, 1998; Brundin et al., 2010). Patogenní priony jsou v jádře stabilizovány a vytvářejí amyloid, což je patologická fibrilární forma proteinu struktury β-skládaného listu. Amyloid vzniká agregací původně solubilní formy proteinu s výrazně zastoupenou β-strukturou do formy fibrilární, která je rezistentní k degradaci proteázami. Pokud tento agregát fragmentuje, navyšuje se počet jader, která mohou přeměňovat další PrPSc (Campana et al., 2005).
2.2 Prionová onemocnění Infekční forma prionů může vyvolat celé spektrum neurodegenerativních onemocnění nazývaných také transmisivní spongiformní encefalopatie (TSE). Tato onemocnění mohou postihnout jak člověka, tak zvířata a v současné době jich existuje 16 druhů. U zvířat jich bylo popsáno již sedm (Tabulka 1) a u lidí devět (Tabulka 2) (Imran a Mahmood, 2011a; Imran a Mahmood, 2011b). Tato onemocnění je možné rozpoznat podle charakteristické změny morfologie mozkové tkáně. Tyto nevratné změny zahrnují tvorbu buněčných vakuol, odumírání neuronů a hromadění shluků proteázou neštěpitelných PrPSc. Veškerá tato onemocnění mají velmi dlouhou inkubační dobu, která znesnadňuje jejich výzkum, jsou fatální a prozatím také ireverzibilní. V poslední době existují i hypotézy o tom, že prionová onemocnění mohou mít společné 16
mechanismy vzniku s dalšími neurodegenerativními chorobami, jako je Alzheimerova, Parkinsonova nebo Huntingtonova choroba (Yokoyama a Mohri, 2008). Tyto hypotézy samozřejmě podnítily velký vědecký zájem o toto téma a společné znaky těchto chorob jsou nyní intenzivně studovány. Tabulka 1: Prionová onemocnění zvířat. Upraveno dle (Imran a Mahmood, 2011a). Přenosná encefalopatie norků (TME), Chronické chřadnutí jelenovitých (CWD), Bovinní spongiformní encefalopatie (BSE), Exotická spongiformní encefalopatie kopytnatců
(EUE),
Spongiformní
encefalopatie
koček
(FSE),
Onemocnění
nehumánních primátů (NHP). Prionová onemocnění zvířat Onemocnění Hostitel Ovce, kozy, mufloni Scrapie TME
Norci
CWD
Jelenovití
BSE
Skot
EUE FSE TSE u NHP
Nyala, Kudu Kočky Lemur
Původ Infekce priony neznámého původu Infekce priony původem z ovcí či skotu Infekce priony neznámého původu Infekce priony neznámého původu Infekce priony původem BSE Infekce priony původem BSE Infekce priony původem BSE
Rok objevení 1732 1947 1967 1986 1986 1990 1995
Tabulka 2: Prionová onemocnění člověka. Upraveno dle (Imran a Mahmood, 2011b). Sporadická Creutzfeld-Jakobova nemoc (sCJD), Familiární/genetická CJD (f/gCJD), Gerstmann-Straussler syndrom (GSS), Iatrogenní CJD (iCJD), Fatální familiární insomnie (FFI), Variantní CJD (vCJD), Sporadická fatální insomnie (sFI), Variabilní proteáza-senzitivní prionpatie (VPSPr). Prionová onemocnění člověka Nemoc Kuru sCJD f/gCJD GSS iCJD FFI vCJD sFI VPSPr
Původ Rituální kanibalismus Spontánní konverze PrPc na PrPSc nebo buněčná mutace Mutace v PRNP Mutace v PRNP Infekce priony lidského původu PRNP haplotyp 178N-129M Infekce priony původem BSE Spontánní konverze PrPC na PrPSc nebo buněčná mutace Spontánní konverze PrPC na PrPSc nebo buněčná mutace
17
Rok objevení 1957 1920 1924 1936 1974 1986 1996 1999 2008
2.2.1
Historie prionových onemocnění
Již na začátku 19. století se objevily první zmínky o neznámém onemocnění ovcí a koz, které se ukázalo být smrtelné (Obrázek 4). Jeho název scrapie (klusavka) byl později odvozen od chování touto nemocí postižených zvířat. Lékař Hans Gerhard Creutzfeldt a vědec Alfons Maria Jakob v roce 1920 objevili nové fatální onemocnění člověka, u kterého byl hlavní charakteristikou zvláštní vzhled mozkové tkáně, připomínající strukturu houby. Na počest svých objevitelů byl později název onemocnění změněn na Creutzfeldt-Jakobovu nemoc. V padesátých letech 20. století objevil profesor Gajdušek další podobnou verzi tohoto onemocnění u kmenu Fore v Papua Nová Guinea, jehož členové konzumovali mozky lidských obětí při rituálním kanibalismu (Gajdusek a Zigas, 1957). Nejčastěji skloňovaným prionovým onemocněním je však v poslední době bovinní spongiformní encefalopatie (BSE), nazývaná také „nemoc šílených krav“. Tato choroba byla popsána v roce 1986. Epidemie tohoto onemocnění způsobila a bohužel stále ještě může způsobit velké ekonomické ztráty v chovech hovězího dobytka. Dalším neméně důležitým faktorem je možná přenosnost tohoto onemocnění na člověka ve formě variantní Creutzfeldt-Jakobovy nemoci. 1982
CWD
? 1965
TME
?
1936
Scrapie
? ? 1988
BSE
1959 vCJD
CJD
1968
GSS
1981
FFI
1997
1995
? Kuru
1959
Obrázek 4: Chronologie TSE. Upraveno dle (Brown et al., 1987). CWD - Chronické chřadnutí jelenovitých, TME - Přenosná encefalopatie norků, BSE - Bovinní spongiformní encefalopatie, vCJD -
Variantní Creutzfeld-Jakobova nemoc, CJD -
Creutzfeld-Jakobova nemoc, GSS - Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrom, FFI 18
Fatální familiární insomnie. Šipky ukazují spojení (či předpokládaná spojení) mezi jednotlivými chorobami, přičemž velmi důležitý je rok 1959, kdy bylo odhaleno spojení mezi Kuru, scrapií a CJD. 2.2.2
Prionová onemocnění u zvířat
2.2.2.1 Scrapie Scrapie neboli klusavka je známá a velice dobře prozkoumaná prionová choroba. Tato nemoc se může objevit jak u ovcí a koz, tak i u muflonů (Jeffrey a Gonzalez, 2007). Typickým a nejčastějším příznakem tohoto onemocnění je intenzivní svědění srsti, které vede vlivem škrábání se ke ztrátě vlny. Mezi klinické příznaky scrapie řadíme změny chování, slepotu, poruchy koordinace, podrážděnost a třes. Inkubační doba scrapie bývá dlouhá 2 roky až 5 let a zvíře umírá většinou mezi 2 týdny až 6 měsíci po rozpoznání prvních příznaků. Co se týče změn v tkáních, je patrná houbovitá vakuolizace mozkové tkáně, astroglióza a přítomnost amyloidních plaků v centrální nervové soustavě. Je známo, že ve vzorku scrapie z jedné tkáně může být zastoupeno více typů prionů (Yokoyama et al., 2010; Thackray et al., 2011).
PrPSc byl detekován v centrální
nervové soustavě, slezině, lymfatických uzlinách, v membránách, svalech, placentě a ileu. Infekční prion PrPSc byl rovněž rozpoznán v sekretech a exkrementech, což umožňuje přenos mezi jednotlivými zvířaty. V nakaženém stádě zemře průměrně 3-5 % zvířat, byly však zaznamenány i případy 20% úhynu v nakaženém stádu (Novakofski et al., 2005; Jeffrey a Gonzalez, 2007; van Keulen et al., 2008; Maddison et al., 2010; O'Rourke et al., 2011). Z genetického hlediska je citlivost vůči scrapii spojována s polymorfismem některých aminokyselin u obou ovčích i kozích kódujících genů (PRNP). Ovce vystavené infekci PrPSc jsou rezistentní v přítomnosti polymorfismu Q171R a maximálně citlivé ke scrapii v přítomnosti polymorfismu A136V. S použitím těchto pěti alel: ARQ, VRQ, AHQ, ARR a ARH byl vyvinut tříkodonový systém založený na A136V, R154H a Q171R/H polymorfismu (Eghiaian et al., 2004). Těchto pět alel může tvořit celkem 15 genotypů (např. VRQ/ARQ), které mohou být podle pořadí rozděleny do skupin podle citlivosti vůči onemocnění. Nejméně senzitivním genotypem je například ARR/ARR. Naopak nejcitlivější jsou genotypy skupiny VRQ/VRQ, VRQ/ARQ, VRQ/ARH a VRQ/AHQ. Podle tohoto systému se v současnosti šlechtí ovce s rezistencí proti scrapii (Dawson et al., 2008; Sweeney a Hanrahan, 2008). 19
2.2.2.2 Bovinní spongiformní encefalopatie (BSE) BSE
můžeme
charakterizovat
přítomností
dobře
pozorovatelných
proteázou
neštěpitelných shluků PrPSc a vakuolizace mozkové tkáně (Hope et al., 1988; Prusiner et al., 1993; Novakofski et al., 2005). Mezi typické příznaky BSE skotu patří nesprávné držení těla a klopýtání, třes, ztráta tělesné hmotnosti, agrese, tření se, nebo lízání se. Skot byl BSE nakažen většinou stravou obsahující kontaminovanou složku. Touto složkou byla dříve běžně používaná masokostní moučka (MBM) obsahující mozky zvířat postižených BSE. Až po zákazu používání MBM v krmivu přežvýkavců se podařilo snížit výskyt této choroby (Ducrot et al., 2008). Nákaza BSE byla zdokumentována u ovcí a koz. Skot může být také dodatečným zdrojem přenosu BSE na člověka (Houston et al., 2000; Vulin et al., 2011). V terminálním stádiu nemoci mohou být PrPSc přítomny také v míše, sítnici, ileu, nadledvinkách, mandlích, kostní dření, periferních nervech, hřbetních kořenových uzlinách a hrudních gangliích (Imran a Mahmood, 2011a). Epidemiologické a přenosové studie nepotvrdily žádné důkazy o výskytu BSE infekčních PrPSc v mléce, spermatu ani u embryí. Inkubační perioda BSE se pohybuje mezi dvěma až osmi lety (Sigurdson a Miller, 2003; Imran a Mahmood, 2011a; Imran a Mahmood, 2011b). Kromě klasického kmene způsobujícího BSE existují ještě další dva kmeny (H-typ a Ltyp) způsobující atypické formy BSE. U atypického L-kmene BSE lze pozorovat amyloidní plaky, ačkoli nejsou pro klasické BSE typické (Sigurdson a Miller, 2003; Imran a Mahmood, 2011a). Bylo zaznamenáno, že v oblasti mezi kodony 96 a 167 je bovinní PrP více homologní k lidskému PrP než k ovčímu (Krakauer et al., 1996). 2.2.2.3 Chronické chřadnutí jelenovitých (CWD) Název této choroby - chronické chřadnutí - vznikl na základě postupného oslabování skeletu a úbytku hmotnosti u postižených jelenovitých. Příznaky CWD zahrnují únavu, skloněnou hlavu, svěšené uši a změny chování, ochablost obličejových svalů, nadměrné slinění, polyurie a aspirační pneumonie, přičemž dalším příznakem bývá náhlá smrt. Toto onemocnění může napadat tyto druhy jelenovitých: jelenec ušatý, jelenec běloocasý, jelenec černoocasý, skalní jelen wapiti a los obecný. Další jelenovití, jako je jelen a sob polární, jsou náchylní k CWD po intracerebrálním a orálním přenosu (Martin et al., 2009; Balachandran et al., 2010). Původce CWD je stále neznámý. Zvířata mohou získat infekční PrP CWD i požitím trávy nebo pitné vody, která je kontaminovaná exkrementy CWD napadených jelenovitých. Dalšími zdroji této 20
choroby mohou být sliny, krev či mrtvá těla nemocných zvířat či asymptomatických nosičů choroby (Safar et al., 1998; Sigurdson a Miller, 2003; Sigurdson, 2008; Nichols et al., 2009). Původce TSE se také může vázat na částice zeminy a tak přetrvávat infekční po dlouhou dobu (roky) (Johnson et al., 2006; Johnson et al., 2007; Seidel et al., 2007). PRNP polymorfismy spojované s resistencí k CWD u jelenovitých jsou S96G, M132L a S225F a v případě zvířat žijících v zajetí skýtají možnost použití selektivního chovu (O'Rourke et al., 2007; Green et al., 2008; Sigurdson, 2008; Spraker et al., 2010; White et al., 2010). Doposud nebyl v přírodě prokázán přenos CWD na člověka ani na hospodářská zvířata (Sigurdson a Miller, 2003; Imran a Mahmood, 2011a). Inkubační období u CWD leží v rozmezí od 16 měsíců do 5 let. Smrt obvykle nastává do 1 roku po nástupu klinických příznaků (Sigurdson a Miller, 2003; Imran a Mahmood, 2011a). Infekční PrP CWD může být detekováno v nervovém systému, lymforetikulárním systému, krvetvorném systému, kosterní a srdeční svalovině, slinivce, sítnici a ve slinných žlázách infikovaných zvířat (Sigurdson a Miller, 2003; Sigurdson, 2008; Race et al., 2009; Spraker et al., 2010). Při histopatologickém vyšetření u CWD postižených jelenovitých byla pozorována mezineuronální vakuolizace, ztráta neuronů, rozsáhlá spongióza a příležitostná tvorba amyloidních plaků. 2.2.2.4 Přenosná encefalopatie norků (TME) Přenosná encefalopatie norků (TME) je vzácné onemocnění, které napadá norky chované na farmách (Liberski a Brown, 2009). Původ TME je stále neznámý, ale za hlavní zdroj infekce jsou pokládána kontaminovaná krmiva. TME pravděpodobně způsobuje L-kmen BSE (Sigurdson a Miller, 2003; Baron et al., 2007). TME je snadno přenosná na mývaly a intracerebrálně může být přenosná na skunky, fretky, soboly, kuny, křečky, ovce, kozy, skot a některé opice (např. makak). Mezi klinické příznaky onemocnění patří změny chování, jako zvýšená agresivita, deprese, zanedbávání péče o srst. Pozdějšími příznaky jsou poruchy chůze a koordinace, třes, zakřivení ocasu jako u veverek a kousání nebo zmrzačování se v okolí ocasu. Ke konci průběhu nemoci se mohou objevovat křeče, ospalost a apatie. Doba inkubace TME může být v rozmezí 6 až 12 měsíců, s tím, že ke smrti obvykle dochází během 2-8 týdnů (Sigurdson a Miller, 2003; Imran a Mahmood, 2011a). Mezi degenerační změny u TME patří rozsáhlé 21
spongiformní degenerace na mozku a astrocytóza. Spongiformní změny jsou velmi intenzivní především v mozkové kůře a většinou nejsou viditelné v mozečku a míše. 2.2.2.5 Spongiformní encefalopatie koček (FSE) FSE je TSE domácích koček a v zajetí žijících divokých koček čeledi kočkovitých. K většině případů FSE došlo paralelně s epidemií BSE, takže je předpoklad expozice koček stravě kontaminované PrPSc. Studie kmenů infikovaných myší odhalily podobnost mezi kmeny FSE a BSE (Bencsik et al., 2009; Eiden et al., 2010). Epidemie FSE rapidně poklesla díky zákazu použití krmiv pro domácí zvířata obsahujících hovězí slezinu a tkáně CNS. Klinické příznaky onemocnění se projevují depresemi, neklidem, zanedbáváním srsti, strachem, agresivitou nebo bázlivostí. Ke konci onemocnění může docházet ke křečím. Smrt nastává po 3 až 8 týdnech po prvním klinickém projevu choroby (Sigurdson a Miller, 2003; Imran a Mahmood, 2011a). Změny ve tkáních zahrnují spongiformní degeneraci mozku a míchy. Priony byly imunohistochemicky detekovány v centrální a periferní nervové soustavě, sítnici, lymforetikulárním systému, ledvinách a nadledvinách (Sigurdson a Miller, 2003; Eiden et al., 2010; Imran a Mahmood, 2011a). 2.2.2.6 Exotická spongiformní encefalopatie kopytnatců (EUE) EUE (Exotic Ungulate Spongiform Encephalopathy) je prionové onemocnění exotických přežvýkavců patřících do čeledi turovití a často se vyskytuje u zvířat chovaných v zoologických zahradách. Tato choroba je datována shodně s epidemií BSE. Byla diagnostikována u kudu velkého, antilopy koňské, přímorožce arabského, dlouhorohého skotu ankole, přímorožce jihoafrického, antilopy nyaly, přímorožce šavlorohého a bizona (Kirkwood et al., 1993; Sigurdson a Miller, 2003). Postižená zvířata byla krmena masokostní moučkou pocházející z přežvýkavců. Existuje hypotéza, že EUE je způsobena infekcí PrP z BSE. Průběh EUE a klinické příznaky se liší v závislosti na druhu a jsou odlišné od BSE a klusavky. 2.2.2.7 Nákaza nehumánních primátů (NHP) V zoo a chovech primátů ve Francii byla diagnostikována nová TSE u lemurů a makaků rhesus. Tato zvířata byla krmena stravou s kontaminovaným masem z Velké Británie. Velký počet nehumánních primátů je citlivý na experimentální expozici různých kmenů TSE, avšak do té doby nebyly hlášeny přirozené případy nákazy TSE. U lemurů naočkovaných homogenátem z BSE hovězích mozků byl prokázán vývoj TSE 22
s podobným průběhem jako u přirozeně infikovaných lemurů. Imunologické vyšetření ukázalo přítomnost PrPSc v mozku, míše, slezině, různých úsecích střeva a v lymfatických tkáních (Bons et al., 1999). 2.2.3
Prionová onemocnění člověka
2.2.3.1 Kuru Lidské onemocnění Kuru bylo označeno transmisivní spongiformní encefalopatií jako jedno z prvních neurodegenerativních onemocnění (Gajdusek a Zigas, 1957; Gajdusek a Zigas, 1959; Gajdusek et al., 1961). Toto onemocnění se oblastně váže k Papui Nové Guineji, kde se vyskytuje mezi příslušníky kmene Fore. Je známo, že rozšiřování onemocnění
probíhalo
jako
důsledek
rituálního
kanibalismu
tohoto
kmene
(kanibalismus = požívání těl zemřelých). Hlavním prvkem rozšíření této choroby bylo však požívání mozků zemřelých osob. Je zajímavé, že v dalších oblastech, kde probíhal rituální kanibalismus, se Kuru nevyskytuje. Náchylnost k tomuto onemocnění je geneticky podmíněná homozygotností genu pro prionový protein v kodonu 127 a 129 a heterozygotnost naopak značí rezistenci vůči této chorobě (Mastrianni et al., 1999; Imran a Mahmood, 2011b). Upuštěním od kanibalismu a také vyčerpáním náchylného genotypu v populaci bylo rozšiřování choroby pozastaveno. I díky odhalení této nemoci byl rozšířen zájem o prionová onemocnění a vyústěním tohoto zájmu bylo i udělení dvou Nobelových cen pro profesora Gajduška a Stanleyho Prusinera. Kuru má tři jasně oddělené klinické fáze. První je ambulantní fáze, při které je zachována schopnost chůze. Druhá je sedavá fáze, při které postižená osoba pouze sedí a již nedokáže chodit. A poslední je fáze konečná, kdy dojde k neschopnosti samostatného posazení se. V období prvotních projevů nemoci se obvykle objevuje bolest hlavy a nohou. Terminálními příznaky jsou nekontrolovatelné škubavé pohyby, silný třes a chlad. Co se týče změn ve tkáních, je u Kuru typická spongióza mozku, ztráta neuronů a astrocytická mikroglióza. (Imran a Mahmood, 2011b). 2.2.3.2 Creutzfeldt-Jakobova nemoc (CJD) Sporadická Creutzfeldt-Jakobova nemoc (sCJD) Sporadická Creutzfeldt-Jakobova nemoc (sCJD) je nejčastějším typem všech CJD (Mead et al., 2003). Choroba se projevuje nejčastěji mezi 55. a 75. rokem života. Projevy sCJD zahrnují progresivní demenci, poruchy svalové koordinace, poruchy řeči 23
a vidění. V poslední fázi nemoci pacient přejde do stavu chorobné němoty a přestane reagovat
na
vnější
podněty
(Belay,
1999;
Imran
a
Mahmood,
2011b).
Neuropatologickým znakem sCJD je přítomnost spongiformních změn a distribuce PrPSc v CNS, ale v 5-10 % případů byla zjištěna i přítomnost amyloidních plaků (Belay, 1999; Mead et al., 2003). Existuje několik variant sCJD. U amaurotické neboli Heindenhainovy varianty se vyvíjí progresivní demence s poruchami zraku a halucinacemi a její průběh bývá krátký. Další variantou je Brownellemova-Oppenheimerova varianta, při které se demence vyvíjí celkem pozdě a rozhodující je ataxie mozečku. Další je thalamická varianta, kterou je možné charakterizovat poruchami hybnosti a demencí. Poslední variantou je panencefalická japonská varianta, která je rozpoznatelná pomocí vysokého obsahu buněk v mozkomíšním moku a má velmi pomalý průběh (Belay, 1999; Cornelius et al., 2009; Parchi et al., 2011; Imran a Mahmood, 2011b). Pomocí velmi komplexního vyšetření je možné sCJD diagnostikovat a na základě nálezů mohou být tyto případy rozděleny do tří skupin: možné (rychlá progresivní demence, symptomy na mozečku, průběh kratší než 2 roky), pravděpodobné (specifický 14-3-3 protein v mozkomíšním moku) a definitivní (spongiformní změny či PrPSc v mozku). Z genetického hlediska je rizikovým faktorem pro rozvoj sCJD homozygotnost v polymorfismu M129V a v Japonsku je to specifický homozygotní polymorfismus E219K na genu PRNP (Palmer et al., 1991; Shibuya et al., 1998). Klinická fenotypová heterogenita případů sCJD může být vyvolána různými kmeny prionů. Existují tři genotypy PRNP, a to M129M, M129V a V129V. Dále existují 2 kmeny: typ 1 a typ 2. Tyto genotypy a kmeny se mohou spojovat do 6 kombinací: MM1, MV1, VV1, MM2, MV2 a VV2, které zároveň odpovídají různým klinickým fenotypům choroby (Brandner, 2011; Gambetti et al., 2011; Wadsworth a Collinge, 2011; Imran a Mahmood, 2011b). Familiární (genetická) Creutzfeldt-Jakobova nemoc (f/gCJD) U familiární CJD (fCJD) se objevují dominantně dědičné bodové mutace v genu PRNP. Název familiární CJD je však mírně zavádějící, protože ve více než 50 % případů nebyla u této choroby nalezena pozitivní rodinná anamnéza. Z tohoto důvodu byl název familiární CJD (fCJD) nahrazen termínem genetická CJD (gCJD). Familiární charakter gCJD je znám od roku 1920, ale mutace způsobující toto onemocnění byly popsány až 24
v roce 1989 (Kretzschmar et al., 1986; Liao et al., 1986; Belay, 1999; Gambetti et al., 2003; Gambetti et al., 2011). Mutace spojované s případy gCJD jsou E200K, I210V, D178N a V180I a jejich četnost se liší po celém světě (Nozaki et al., 2010; Gambetti et al., 2011). Z genetického hlediska je v případě gCJD v genu pro PrP přítomna pětkrát opakující se oblast obsahující od 51 do 91 zbytků tvořených nonapeptidy PQGGGGWGQ a čtyřmi tandemovými oktapeptidovými repeticemi PHGGGWGQ. Existují i další místa spojovaná s gCJD, je to například inzerce 2-9 oktapeptidových repeticí (2-9-OPRI) a delece 2 oktapeptidových repetic (2-OPRD) v genu PRNP. Mutace přítomné u gCJD mají různou penetranci, takže se pak onemocnění nemusí projevit ve všech generacích. Klinické fenotypy gCJD se překrývají s těmi u sCJD, ale klinický fenotyp gCJD nese haplotyp T183A-129M a je mírně odlišný (Gambetti et al., 2011). Příznaky gCJD sestávají ze změn osobnosti, rapidní progresivní demence, agresivity a parkinsonovských příznaků (Nitrini et al., 1997). Mutace PRNP mohou hrát svou roli v patogenezi gCJD a při zvýšení náchylnosti PrPC a mutantního PrP k agregaci. Může být také zvýšena pravděpodobnost zadržování agregovaných PrP molekul v sekrečních drahách a i interakce solných můstků a vodíkových vazeb mohou být modifikovány, čímž změní protein na nerozpustný (Capellari et al., 2011). S přidáním každé další oktapeptidové repetice je zvýšena i schopnost mutanta PrP vázat dvojmocné ionty (např. Cu), čímž vzrůstá také závažnost onemocnění. Iatrogenní Creutzfeldt-Jakobova nemoc (iCJD) Iatrogenní CJD (iCJD) je choroba způsobena zásahem lékaře při léčbě jiné choroby. Její první výskyt je datován do roku 1974, kde se objevila u pacienta po transplantaci rohovky. Tato rohovka byla shodou okolností odebrána zemřelému člověku trpícímu CJD (Lugaresi et al., 1986). V pozdější době se objevily další případy, kdy byla tato choroba přenesena pomocí chirurgického náčiní. Nejvíce případů iCJD však vzniklo při léčbě nedostatečné syntézy lidského růstového hormonu (hGH), kde se v léčené populaci vyskytoval 1 případ nakažení na 100 léčených jedinců (Belay, 1999; Will, 2003; Nozaki et al., 2010; Imran a Mahmood, 2011b). Pravděpodobné rozšíření této infekce je získání hGH z hypofýzy zemřelého pacienta s CJD. V současné době je dostupný rekombinantní hGH, takže pravděpodobnost dalšího výskytu tohoto případu je velmi nízká. Některé případy iCJD s dlouhou inkubační dobou se však mohou teprve projevit (Belay, 1999; Will, 2003; Imran a Mahmood, 2011b). Příznaky iCJD vzniklé z důvodu léčby hGH připomínají příznaky Kuru, zatímco rysy iCJD přenesené přes 25
chirurgické nástroje připomínají sCJD. Více náchylní k iatrogennímu přenosu CJD jsou lidé homozygotní v M129M v PRNP (Collinge et al., 1991; Belay, 1999; Will, 2003; Imran a Mahmood, 2011b). Variantní Creutzfeld-Jakobova nemoc V roce 1996 se objevila nová varianta CJD, později nazvaná variantní CJD (vCJD) (Will et al., 1996; Will, 2003). Věk napadených pacientů byl výrazně nižší než u ostatních TSE a místo klasické progresivní demence se u nich objevily psychiatrické poruchy (Will, 2003). Průběh tohoto onemocnění je srovnatelný s Kuru (Belay, 1999; Will, 2003; Imran a Mahmood, 2011b). Napadení vCJD se projevuje neklidem, agresivitou, depresemi nebo paranoidními bludy. U většiny pacientů se vyskytují dokonce kombinace těchto příznaků. Ve fázi po nástupu psychiatrických symptomů se objevují kognitivní poruchy a mimovolné pohyby připomínající Tanec svatého Víta. Ve většině případů je zpomalena elektroencefalopatická aktivita a zvyšuje se hladina specifického proteinu 14-3-3 v CNS (Lukic et al., 2010; Brandner, 2011). Typickým znakem vCJD je také přítomnost amyloidních plaků v mozku, které jsou podobné plakům přítomným u klusavky a Kuru (Belay, 1999; Will, 2003; Imran a Mahmood, 2011b). Spongiformní změny jsou lokalizovány nejčastěji v bazálních gangliích a thalamu. Pro diagnostiku vCJD i u klinicky zdravých nosičů tohoto onemocnění je využívána detekce rezistentního PrP v lymforetikulárním systému (Ironside, 2010). Všichni vCJD pacienti se ukázali být homozygoty v M129M (Bishop et al., 2009). Rezistence k vCJD u lidí je zase podložena heterozygotností v E219K, ale tato stejná heterozygotnost je rizikovým faktorem pro přenos BSE na člověka (Ironside, 2010). 2.2.3.3 Gertsmannův-Strausslerův-Scheinkerův syndrom Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrom (GSS) je dědičné autozomálně dominantní onemocnění vzniklé mutací genu PRNP. Pravděpodobnost výskytu tohoto onemocnění je 1:100 milionů obyvatel ročně (Belay, 1999). V případě GSS je nástup choroby celkem časný (30 až 60 let), avšak onemocnění má pomalý postup. Nejčastější neuropatologické projevy GSS zahrnují tvorbu amyloidních plaků, spongiformní změny na mozku, ztrátu neuronů, astrocytickou mikrogliózu a tvorbu neurofibrilárních změtí (Belay, 1999; Liberski a Brown, 2009). Příznaky této choroby zahrnují poruchy chůze, demenci, parkinsonské projevy, změny spánkového rytmu, teplotního profilu a areflexii 26
nohou (Belay, 1999; Provini et al., 2009; Imran a Mahmood, 2011b). V případě, že pacienti nesou mutaci P102L v PRNP, je možné v raném stádiu nemoci naopak pozorovat hyperreflexie nohou. Z genetického hlediska jsou v případě GSS přítomny následující mutace v genu PRNP: P102L, P105L, A117V, Y145X, Q160X, F198S, Q217R, Y218N, Y226X a Q227X (Belay, 1999; Jansen et al., 2010). Zajímavou mutací je Y218N, která při onemocnění GSS vykazuje podobné klinické příznaky jako Alzheimerova choroba (Alzualde et al., 2010). Nejčastěji je však příčina rozvoje GSS způsobena spojením alel V129 a P102L, které způsobují psychiatrické příznaky jako je apatie či deprese (Bianca et al., 2003). 2.2.3.4 Fatální familiární insomnie (FFI) Toto autosomálně dominantní onemocnění bylo původně nazýváno demence thalamu a teprve později bylo přejmenováno na svůj současný název Fatální familiární insomnie (FFI). Hlavní příznaky FFI jsou nespavost, další specifické poruchy spánku, ataxie, dysartrie, dysfagie a myoklonie. Projev onemocnění nastává mezi 20. a 72. rokem života a průměrná doba dožití se pohybuje okolo 18 měsíců. Incidence FFI je stejná u mužů i u žen a to nezávisle na genotypu. Diagnostika FFI probíhá pomocí metody zobrazování průběhu spánku, zvané polysomnografie. Při diagnóze FFI pomocí polysomnografie jsou sledovány přechody mezi fázemi spánku. Vznik FFI je genotypově podmíněn mutací polymorfismu methioninu D178N v genu PRNP. Spojení methioninu a valinu v kodonu 129 může způsobit kromě FFI i vznik gCJD (Lugaresi et al., 1986; Montagna et al., 2003). Mezi genotypy M129M a V129N je však rozdíl v závažnosti choroby i v jejím průběhu. U genotypu M129M se vyskytuje nejčastěji myoklonie a nespavost a genotyp V129N je zase spojován s ataxií a dysartrií (Belay, 1999; Gambetti et al., 2003; Montagna et al., 2003; Capellari et al., 2011). 2.2.3.5 Sporadická fatální insomnie (sFI) Sporadická forma fatální insomnie (sFI) je velice podobná FFI, avšak bez rodinné anamnézy. Pacienti sFI mají shodný genetický profil polymorfismu genu PRNP a to homozygotnost M129M. Jediným rozdílem mezi FFI a sFI je rozdílnost kmenů PrP Sc. V případě sFI je totiž u homozygotů M129M více zastoupen neglykosylovaný fragment PrPSc typu 2 (Montagna et al., 2003; Priano et al., 2009; Parchi et al., 2011; Imran 27
a Mahmood, 2011b). Sporadická fatální insomnie je velmi podobná sCJD MM2, ale kvůli jejím odlišným příznakům je někdy nazývaná sCJD MM2 thalamu. U sCJD MM2 je nejvíce napadena mozková kůra a v případě SCJD MM2 thalamu je poškozen thalamus a tím pádem i kontrola cyklů spánku (Gambetti et al., 2011).
2.3 Onemocnění prionům podobná Prionová onemocnění sdílí mnoho podobných vlastností s dalšími chorobami (jak familiárními, tak sporadickými), vznikajícími mechanismem nesprávného sbalování proteinů a projevujícími se ztrátou neuronů. V současnosti je již skoro jisté, že šíření těchto nemocí z buňky na buňku probíhá podobným mechanismem sbalování proteinů jako v případě prionových onemocnění (Collinge a Clarke, 2007; Brundin et al., 2010; Lloyd et al., 2013). Každá z těchto chorob je charakterizována nesprávným sbalováním proteinu specifického právě pro toto onemocnění. V případě Parkinsonovy choroby jde o nesprávné sbalování proteinu α-synukleinu, u Alzheimerovy choroby jde o amyloid β a protein Tau a u Huntingtonovy choroby je to protein huntingtin (Brundin et al., 2010). 2.3.1
Alzheimerova choroba (AD)
Alzheimerova choroba (AD) je neurodegenerativní onemocnění mozku, při kterém dochází k postupné demenci. Čtvrtina lidí starších 85 let trpí demencí a se stále stárnoucí populací bude prevalence výskytu AD jen narůstat (Mount a Downton, 2006; Haass a Selkoe, 2007). Pro AD je charakteristický vznik amyloidních plaků, které obsahují peptidy amyloidu β (Aβ) a neurofibrilární uzly hyperfosforylovaného proteinu Tau (Obrázek 5). Depozice amyloidních plaků je hlavním prekurzorem progrese Aβ (Hardy a Allsop, 1991). Cesta vývoje Aβ plaků zahrnuje proteolýzu amyloidního prekurzorového proteinu (APP). V první fázi je APP štěpen β-sekretázou (BACE1). Další fáze je štěpení zbytku v membráně pomocí γ-sekretázy, což způsobí vznik Aβ a amyloidní intracelulární domény (AICD). Po tomto štěpení APP je vytvořen velký počet Aβ isoforem. Nejčastěji přítomné isoformy jsou Aβ40 a Aβ42. V senilních placích se vyskytuje nejvíce Aβ42, který je i nejvíce amyloidní. Aβ mohou tvořit rozpustné oligomery nebo dlouhé fibrily. Monomerické Aβ nejsou toxické, ale se vzrůstajícím počtem těchto oligomerů mohou způsobovat synaptické dysfunkce (Walsh et al., 2002; Lacor et al., 2004; Cleary et al., 2005). Je známo, že Aβ jsou považovány za původce AD, ale na druhé straně existují i studie, kde je zkoumána jejich fyziologická role, 28
například při regulaci vápníkových a draslíkových kanálů (Ramsden et al., 2001; Plant et al., 2006). Jednou z možností vysvětlení tohoto fenoménu je toxicita Aβ pouze ve vyšší koncentraci jako výsledek nerovnováhy mezi produkcí a degradací (Kellett a Hooper, 2009). Za normálních okolností jsou Aβ v mozku degradovány pomocí neprilysinu, endothelin-konvertujícího enzymu nebo inzulín-degradujícího enzymu (Carson a Turner, 2002). Jako rizikový faktor pro časný počátek AD byl určen polymorfismus M129V u PRNP (Dermaut et al., 2003; Riemenschneider et al., 2004; Del Bo et al., 2006).
β-sekretáza
Imunologická a neurotoxická kaskáda vedoucí ke ztrátě neuronů a demenci
Agregace
γ-sekretáza
Senilní plaky
Obrázek 5: Produkce β-amyloidu a patogeneze Alzheimerovy choroby. Upraveno dle (Skovronsky a Lee, 2000). β- a γ- sekretáza štěpí prekurzorový protein amyloidu (APP) a tvoří se amyloid- β (Aβ), který může v mozku agregovat a tvořit senilní plaky. Senilní plaky poté spustí neobjasněnou kaskádu patologických změn, která ústí ve ztrátu neuronů a demenci. Alzheimerova choroba se v mnoha ohledech podobá prionovým onemocněním (Checler a Vincent, 2002). Mnoho společných patologických znaků má zejména s CJD (Hainfellner et al., 1998). Genetická korelace mezi PrPC a AD je taktéž velmi vysoká a existují i domněnky, že PrPC může podporovat samotnou formaci Aβ plaků. Plaky Aβ jsou navíc lokalizovány velmi podobně jako v případě PrPC a u většiny pacientů s CJD je přítomen komplex PrPC-Aβ (Voigtlander et al., 2001). Podle velkého množství metaanalýz je gen PRNP dokonce potenciálně AD-citlivý. Jasné důkazy o spojitosti AD a PrPSc stále ještě neexistují, ale jejich interakce je předpokládána. Ve studiích věnujících se tomuto problému byla popsána interakce mezi PrPC a enzymem βsekretázou (BACE1), ze kterých vyplývá, že PrPC je receptorem Aβ oligomerů a jeho exprese je řízena pomocí AICD (Parkin et al., 2007; Kellett a Hooper, 2009; Lauren et al., 2009; Vincent et al., 2009; Benilova a De Strooper, 2010). 2.3.2
Parkinsonova choroba (PD)
Parkinsonova choroba (PD) je neurodegenerativní onemocnění CNS, při kterém je jasně pozorovatelný úbytek neuronů produkujících dopamin. Nedostatek dopaminu, který je 29
důležitým neurotransmiterem, pak způsobuje ztrátu kontroly nad volními pohyby. Nedostatek dopaminu je způsoben agregací proteinů v axonech a dendritech dopaminových nervů. Tyto agregáty se pak nazývají Lewiho tělíska a Lewiho neurity (Olanow a Brundin, 2013). Při vzniku PD se objevuje takzvaná Lewiho patologie, ve které figuruje protein α-synuklein (Obrázek 6). Bodové mutace genu pro α-synuklein způsobují familiární formy PD, které jsou vzácné. Hladinu α-synukleinu u pacientů PD naopak zvyšují duplikace nebo triplikace genu pro α-synuklein. U pacientů, kde je přítomná triplikovaná forma α-synukleinu, je počáteční fáze více patologická než u pacientů s duplikovanou formou. Hladina α-synukleinu se zvyšuje i přirozeně, a to se stárnutím lidského mozku. Normální stav
Parkinsonova choroba
Poruchy pohybu Buněčná smrt
Dopaminergní neurony
Fibrily
Monomery
Oligomery
Protofibrily
Obrázek 6: Formování α-synukleinových fibril při Parkinsonově chorobě (PD). Upraveno dle (Ruiperez et al., 2010). Výskyt α-synukleinu v mozku za normálních podmínek a tvorba fibril při PD. Přirozená role α-synukleinu v těle stále není, stejně jako v případě PrP, zcela objasněna. Alfa-synuklein se vyskytuje v oblasti synapsí a tím pádem existuje předpoklad, že se účastní uvolňování dopaminu a vezikulárního transportu (Norris et al., 2004). Prionové proteiny sdílí s α-synukleinem velké množství společných znaků, tudíž je i PD z velké části podobná prionovým onemocněním. Mezi podobnosti těchto dvou proteinů patří například jejich přirozená α-helix konformace a to, že oba proteiny mohou svou konformaci změnit v přítomnosti vysoké koncentrace své mutantní formy na strukturu β-skládaného listu (Bartels et al., 2011). Nativní PrP i α-synuklein mají schopnost vzdorovat agregaci, ale jakmile je protein přeměněný, stane se náchylný ke tvorbě fibril, agregátů a amyloidních plaků. Na pacientech v pokročilém stádiu PD, kterým byly transplantovány fetální mesencefalické buňky, bylo prokázáno, že Lewiho patologie je přenositelná i na zdravé 30
neurony (Kordower et al., 1995). Je jisté, že patologická forma α-synukleinu může migrovat z postižených neuronů do zdravých, přičemž pozměněný protein působí jako templát pro přeměnu zdravého proteinu. I po intracerebrální inokulaci pozměněného αsynukleinu se může vyvinout Lewiho patologie a navíc bylo zjištěno, že v mladých mozcích transgenních zvířat je progrese choroby rychlejší (Luk et al., 2012). 2.3.3
Huntigtonova choroba (HD)
Huntingtonova choroba
(HD) je
autozomálně dominantní
neurodegenerativní
onemocnění, které se typicky projevuje okolo 35. roku života. HD je charakterizovaná progresivní demencí, choreou a rigiditou. V současnosti je tato choroba bohužel neléčitelná a k úmrtí dochází po 10 – 15 letech od prvních příznaků. HD je způsobena mutací v genu IT15 (kódující protein huntingtin), která způsobí vznik velkého počtu glutaminových CAG repetic. (Kremer et al., 1994; Arrasate a Finkbeiner, 2012). Normální gen pro huntingtin obsahuje od 6 do 34 repeticí CAG; u jedinců nesoucích gen se 40 repeticemi se však rozvine HD. Věk počátku onemocnění dokonce koreluje s počtem CAG repetic. Existují i další neurodegenerativní onemocnění, která jsou podobně závislá na délce polyQ repetic, mezi něž patří například spinocerebrální ataxie (Moore et al., 2001; Orr a Zoghbi, 2007). Existují i případy HD, u kterých není (CAG)n huntingtinu vůbec přítomno, z čehož vyplývá, že HD může být způsobena i jinými mutacemi (Andrew et al., 1994; Moore et al., 2001; Arrasate a Finkbeiner, 2012). Cílem posledních výzkumů je z tohoto důvodu právě objevení genů, které způsobují tuto alternativní formu HD, neboli fenokopii HD (Moore et al., 2001). Pomocí rodokmenů rodin s fenokopií HD byla odhalena mutace uvnitř prionového genu PRNP, což nasvědčuje tomu, že fenokopie HD by mohly patřit mezi familiární prionová onemocnění.
2.4 Metalothionein (MT) Zástupci proteinů ze skupiny metalothioneinů (MT) jsou přítomni téměř u všech žijících organismů (Coyle et al., 2002). Molekulární hmotnost MT se pohybuje okolo 7 kDa. Tyto nízkomolekulární kovy-vázající proteiny jsou složeny z 60 aminokyselin, z nichž 20 je vysoce konzervovaných cysteinových zbytků bez obsahu aromatických nebo histidinových částí. Geny pro rodinu MT jsou u hlodavců umístěny na chromozomu 8, zatímco u člověka je jich většina lokalizována na chromozomu 16 (Palmiter et al., 1992). Studie struktur a biologických funkcí ukázaly, že MT mohou vázat esenciální 31
kovy (Zn, Cu) a toxické kovy (Cd, Hg), a také odhalily existenci 4 hlavních isoforem MT (Aschner et al., 1997; Takahashi, 2012). Různé isoformy MT jsou strukturně identické, mají stejný počet cysteinových reziduí a vysokou afinitu ke kovům. Rozdílem mezi isoformami MT je pak celkový náboj jednotlivých isoforem. Změna náboje je způsobená rozdíly v ostatních sekvencích aminokyselin kromě cysteinu. MT-I a -II jsou exprimovány ve všech savčích tkáních. V mozku jsou MT-I a -II lokalizovány zejména v astrocytech, dále však i v epiteliálních buňkách choroidního plexu, endoteliu a meningeálních buňkách (Hidalgo et al., 2001; Penkowa et al., 2001). Úroveň exprese MT-I a MT-II v neuronech není vždy stejná (Campagne et al., 1999). MT-III je exprimován v mozku a původně byl pojmenován jako „inhibiční faktor růstu“ (Uchida et al., 1991), jako MT-III byl pojmenován až později (Palmiter et al., 1992). MT-III obsahuje oproti jiným MT sedm přídatných aminokyselin a celkově je složen z 68 aminokyselin. V C-terminální oblasti je přidáno 6 aminokyselin skládajících se z kyseliny glutamové a alaninu a v N-terminální oblasti je připojen threonin. Na rozdíl od jiných isoforem má MT-III schopnost inhibice růstových vlastností neuronových kultur (Uchida et al., 1991). MT-IV je exprimován ve tkáních obsahujících buňky vrstevnatého dlaždicového epitelu, kde hraje roli při specifické diferenciaci tohoto epitelu (Quaife et al., 1994). 2.4.1
MT-III a vznik prionových onemocnění
Metalothionein-III plní unikátní biologickou roli v centrálním nervovém systému (Kawashima et al., 2000). Při snížení hladiny MT-III dochází k formaci neurofibrilárních shluků charakteristických pro Alzheimerovu chorobu (Uchida et al., 1991). Toto zjištění vyprovokovalo mnoho snah o odhalení potenciální role MT-III při vzniku neurodegenerativních onemocnění (Kawashima et al., 2000). Existují důkazy o tom, že MT a obzvláště MT-III má spojitost s neurodegenerativními chorobami. MTIII i PrP hrají významnou roli při udržování rovnováhy kovových iontů v buňce, přičemž tento společný rys mimo jiné poukazuje na jejich možnou kooperaci při konformační změně PrPC na PrPSc a při zrodu prionového onemocnění. Prionová onemocnění sdílejí s ostatními familiárními i sporadickými neurodegenerativními onemocněními mnoho společných faktorů jako agregaci konformačně změněných proteinů či ztrátu velkého množství neuronů (Collinge a Clarke, 2007; Brundin et al., 2010; Lloyd et al., 2013). 32
2.5 Esenciální kovy (Cu, Zn) a vznik prionových onemocnění Mezi esenciální kovy řadíme měď, zinek nebo například železo. Esenciální kovy hrají v organismech velmi důležitou roli, protože se zapojují téměř do všech dějů, které v těle probíhají (Lehmann, 2002). Jejich ionty jsou často přímou součástí biomolekul. PrPC se účastní buněčné signalizace a může vázat či transportovat ionty mědi či zinku (Obrázek 7) (Gavier-Widen et al., 2005; Kozlowski et al., 2012). Pro správnou fyziologii mozku je nutná přísná regulace rovnováhy těchto iontů (Cai et al., 2005). Z našeho pohledu je velice důležité zapojení kovů do procesů neurodegenerace a vývoje neurodegenerativních onemocnění (Bush, 2000). V průběhu TSE hrají kovy roli při tvorbě oxidativních poškození mozku, akumulaci proteinových agregátů a při ztrátě neuronů. Mechanismus, kterým se ionty kovů stávají toxickými, je spojen s jejich oxidačními ději a jejich asociací s metaloenzymy (např. super oxid dismutáza – SOD). Fyziologická funkce PrPC spočívá pravděpodobně ve spojení se SOD a ochranou proti oxidativnímu stresu. Tato hypotéza je podložena experimentem, ve kterém byly do buněčné kultury přidány ionty Cu a Zn, které způsobili rychlou endocytózu PrPC (Pauly a Harris, 1998). Zároveň je zajímavé, že po přidání zinku do buněčné kultury je endocytóza stejně účinná jako v případě přidání mědi, ačkoliv vazebná schopnost zinku na PrPC je mnohem menší (Jackson et al., 2001). Díky afinitě oktapeptidových repetic PHGGGWGQ k mědi je možná i izolace prionů ze vzorku (Pan et al., 1992). Kromě PHGGGWGQ vazebného místa pro měď byla odhalena i vysoce afinitní oblast mezi histidinem 96 a Histidinem 111, kam se mohou vázat Cu ionty velice specificky (Hasnain et al., 2001).
Plazmatická membrána
Obrázek 7: Schéma vazby esenciálních kovů lidským buněčným prionovým proteinem (PrPC). Převzato a upraveno dle (Lehmann, 2002). Polypeptidový řetězec PrPC (zelená) 33
je zakotven do plazmatické membrány pomocí glykosylfosfatidylinositolové (GPI) kotvy (hnědá). N-konec molekuly váže ionty kovů, přičemž měď je vázána, pokud je Ckonec molekuly globulární a jsou k němu připojeny dva N-glykany (fialová). Konverze PrPC na PrPSc je klíčovým dějem při vzniku TSE, ale ani tato přeměna není v současnosti dokonale objasněna. Již v sedmdesátých letech bylo objeveno první spojení mezi priony a mědí. Po podání cuprizonu (chelátor mědi) myším se u nich vyvinulo onemocnění podobné scrapii. Toto onemocnění nebylo přenosné a bylo charakterizováno demyelinizací (Pattison a Jebbett, 1971; Prusiner, 1982). Dalším signálem významnosti mědi je i celkové snížení jejího obsahu v mozku infikovaném priony (Wong et al., 2001). Zdá se, že ionty kovů a jejich chelátory mohou ovlivnit i biochemické vlastnosti PrPSc a tím i jeho migraci při denaturační elektroforéze (Wadsworth et al., 1999). Tato vlastnost umožňuje i odlišení různých kmenů prionů a obecně odlišení PrPC od PrPSc (Shaked et al., 2001). Velkým rozdílem mezi PrPC a PrPSc je i jejich preference vazeb s kovy (Obrázek 8). Zatímco PrPC má největší afinitu k mědi, v případě PrPSc je preferována vazba se zinkem či manganem (Wong et al., 2001). Dalším zajímavým zjištěním bylo, že právě po inkubaci PrPC s manganem či zinkem může protein získat částečnou rezistenci k proteázám (Brown et al., 2000). Role zinku ani manganu v etiologii TSE není prozatím, oproti roli mědi, tolik objasněna. Je však vysoce pravděpodobné, že esenciální kovy se budou přeměny PrPC na PrPSc nějakým způsobem účastnit.
34
PrPC Cu
A
B
PrPC°
PrPSc
Cu/Mn/Zn
Cu
D
C PrPSc Cu/Mn/Zn
Obrázek 8: Vztahy mezi buněčným prionovým proteinem (PrPC), patologickou formou prionového proteinu (PrPSc) a kovovými ionty. Upraveno dle (Lehmann, 2002). Fyziologická forma PrPC – zde označená jako PrPC-Cu je protein obsahující měď. Tento protein je senzitivní k proteázám a je rozpustný v nedenaturačních detergentech. A: Po kontaktu s kovy (měď, mangan, zinek) vzniká abnormální molekula PrP C°-Cu/Mn/Zn. Tato molekula získává vlastnosti PrPSc, jako je nerozpustnost či částečná rezistence k proteázám, ale zdá se, že není infekční. B:Klasická molekula PrPSc může být vytvořena přímou cestou z PrPC-Cu a zde je pojmenována PrPSc-Cu. C: Změna konformace pravděpodobně mění i afinitu ke kovovým iontům, což vede k tvorbě molekul s různým obsahem kovů PrPSc-Cu/Mn/Zn. D: Alternativní cesta vzniku PrPScCu/Mn/Zn přes abnormální molekulu PrPC°-Cu/Mn/Zn tvořící střední článek přeměny.
2.6 Elektrochemické metody detekce proteinů Elektrochemické metody slouží pro senzitivní detekci anorganických a organických látek ve směsích biologických látek. Tyto metody jsou rychlé, jednoduché a selektivní. Jejich základem je sledování závislosti elektrochemického chování roztoků na jejich složení a koncentraci. Měření probíhá pomocí kontaktu analyzovaného roztoku s elektrodami, které jej propojují s přístrojem pro vyhodnocení. Tyto metody jsou čím dál častěji využívány i při výzkumu a diagnostice neurodegenerativních
chorob
(Veloso
a
Kerman,
2013).
Konkrétně
byly
elektrochemicky determinovány proteiny účastnící se vzniku Parkinsonovy choroby 35
(Lopes et al., 2014), Alzheimerovy choroby (Zhou et al., 2013) a samozřejmě i transmisivních spongiformních encefalopatií (Sobrova et al., 2013). Jednou z prvních skupin, která se věnovala přímému elektrochemickému studiu agregujících proteinů při neurodegenerativních onemocněních, byla skupina kolem profesora Palečka (Masarik et al., 2004; Veloso a Kerman, 2013). 2.6.1
Voltametrie
Voltametrie je elektrochemická metoda, pomocí které můžeme sledovat závislost intenzity proudu na velikosti proměnlivého vloženého napětí. Toto napětí je měřeno mezi pracovní elektrodou (visící kapková rtuťová elektroda), která je polarizovatelná a referentní elektrodou, která je nepolarizovatelná. Další používanou elektrodou, která napomáhá snížení rušivých vlivů na měření, je elektroda pomocná. Pokud zkoumaný vzorek obsahuje elektroaktivní látku, dochází k oxidaci nebo redukci a tím pádem může roztokem procházet proud. Měření probíhá pouze v těsné blízkosti pracovní elektrody. Transport elektroaktivní látky k elektrodě může být umožněn třemi pochody. Difúzí neboli koncentračním spádem. Migrací v elektrickém poli mezi elektrodami. Konvekcí, která může být vyvolána mícháním roztoku. Při elektrochemickém měření je žádaná především difúze, přičemž druhé dva jevy jsou potlačovány. Z elektrolytu je nutné odstranit i veškerý kyslík, protože má tendenci se hojně vylučovat na elektrodě. Odstranění probíhá pomocí probublávání argonem. 2.6.2
Diferenční pulzní voltametrie
Při diferenční pulzní voltametrii (DPV) je sledován rozdíl proudů (ΔI), které jsou měřeny v krátkých intervalech. Rozdíl proudů je možno měřit díky aplikaci frekvence pulsů s konstantní amplitudou. Při DPV sledujeme závislost proudu na napětí, která je přístrojem zobrazována ve formě takzvaných píků (Obrázek 9).
Pík
nA
[V] Obrázek 9: Záznam elektrochemického signálu, který tvoří pík zobrazující závislost proudu (nA) na napětí (V).
36
2.6.3
Adsorptivní přenosová technika (AdTS)
Tato technika umožňuje akumulaci, přenos a měření velmi malého objemu vzorku, většinou v řádech mikrolitrů. Na elektrodu je akumulována kapka roztoku vzorku a měření poté probíhá v čistém elektrolytu (Obrázek 10). Po
R
Pr
Obrázek 10: Postup adsorptivní přenosové techniky. R- referentní elektroda, Pr – pracovní elektroda, Po – pomocná elektroda. Zleva – na sklíčko je nanesen vzorek o objemu 5 μl, poté je do něj ponořena pracovní elektroda a dochází k akumulaci vzorku na rtuťovou kapku. V dalším kroku je elektroda omyta v destilované vodě pro odplavení nenavázaných molekul a poslední fází je ponoření elektrod do elektrolytu v měřící nádobce a samotné měření.
2.7 Imunochemické stanovení proteinů pomocí western blotu Western blot je technika, díky které můžeme ve směsi různých proteinů identifikovat pouze jeden cílový protein. Jeho prvním krokem je SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfátová polyakrylamidová elektroforéza). Principem western blotu je přenos proteinů z elektroforetického gelu pomocí blotovacího přístroje na nitrocelulózovou či PVDF (polyvinyliden fluoridovou) membránu, kde později dochází k detekci vybraného proteinu pomocí specifických protilátek. Aplikace této metody ve výzkumu neurodegenerativních onemocnění jsou velmi četné. Díky využití specifických protilátek je vizualizace proteinu velmi přesná a jednoduchá (Brown et al., 1986). Metodou western blot byla zkoumána například agregace proteinů u Parkinsonovy choroby (Baba et al., 1998), Alzheimerovy choroby (de Calignon et al., 2012) nebo prionových onemocnění (Thackray et al., 2012).
37
2.7.1
SDS-PAGE
SDS-PAGE slouží k separaci proteinů na základě jejich molekulové hmotnosti a je prvním krokem stanovení proteinů pomocí Western blotu. Pomocí zahřátí vzorku za denaturačních a redukčních podmínek dochází k denaturaci proteinů a navázání SDS, který udělí molekule proteinu vysoký záporný náboj. Tento náboj je úměrný k jeho molekulové hmotnosti. Vazba SDS na proteiny probíhá v poměru 1,4 g SDS na 1 g bílkoviny. Vzorek proteinu je nanesen na gel, který je poté připojen ke stejnosměrnému elektrickému poli. Záporně nabité proteiny pak migrují ke kladné elektrodě (anodě). Separace proteinů podle velikosti probíhá na principu molekulového síta, kdy menší molekuly prochází gelem rychleji, zatímco větší pomaleji. Po dokončení migrace se přistoupí k vizualizaci oddělených proužků proteinů na gelu. Tato vizualizace může být provedena pomocí různých druhů barvení. Časté je využití barvení stříbrem či barvení Coomassie brilliant blue. Po vizualizaci separovaných proteinů je možné určit jejich relativní molekulovou hmotnost pomocí srovnání vzdálenosti migrace se standardem. Standardem neboli markerem může být protein či směs proteinů se známou molekulovou hmotností. Koncentrace akrylamidu, který používáme pro přípravu gelu, se odvozuje od velikosti separovaných molekul. Nízká koncentrace gelu se používá v případě separace proteinů o velké molekulové hmotnosti a naopak vysoká koncentrace gelu při separaci menších molekul. 2.7.2
Western blot
Přenos proteinů z gelu na membránu probíhá také působením stejnosměrného elektrického proudu. Dolní část blotovacího přístroje tvoří anoda, zatímco horní část tvoří katoda. Mezi tyto desky je vložen takzvaný sendvič z filtračních papírů namočených v blotovacím pufru, mezi kterými je vložena membrána s proteiny a na ní je umístěn gel. Působením proudu začínají všechny proteiny (záporně nabité) z gelu migrovat směrem k anodě, čímž se přesunou z gelu na membránu, na které se zachytí. Uskupení proteinů do proužků (bandů) však zůstává neměnné i na membráně. Dále je nutné na povrchu membrány takzvaně zablokovat vazebná místa, aby se na ně později nemohly nespecificky vázat protilátky. Blokování se provádí pomocí proteinu, např. bovinního sérového albuminu (BSA) s přídavkem detergentu. Detekce proteinů na membráně probíhá pomocí specifické protilátky proti tomuto proteinu. Detekce může být jednokroková, což znamená, že protilátka je konjugovaná přímo s reportérovým enzymem. Dalším typem detekce je metoda dvou kroková, kde je protilátka primární 38
(specifická k proteinu) a následně sekundární (specifická k primární protilátce), která je konjugovaná s reportérovým enzymem. Vyvolání barevné reakce protilátek je prováděno buď kolorimetricky, nebo chemiluminiscenčně. Kolorimetrický způsob zahrnuje například značení enzymem peroxidázou. Peroxidáza přeměňuje přidaný chromogenní substrát z bezbarvého na barevný a tím zviditelňuje proteiny na membráně. Chemiluminiscenční způsob pak využívá přeměny chemiluminiscenčních substrátů na světelné záření. Množství světla je přímo úměrné množství reportérového enzymu a tím pádem i daného proteinu. Detekce uvolněného světla pak probíhá přiložením na světlocitlivý film nebo pomocí kamery. Proteiny lze podle intenzity zbarvení nebo úrovně vyzářeného světla i kvantifikovat metodou denzitometrie. Tato metoda umožňuje diagnostiku velkého množství různých lidských či zvířecích onemocnění. 2.7.3
Dot-blot
Tato metoda byla použita pouze pro doplnění metody western blot, přičemž využívá pouze jednu část jeho postupu. Díky dot-blotu je možné stanovit přítomnost specifického proteinu ve vzorku, ale není možné určit jeho molekulovou hmotnost. Metoda dot-blotu je rychlejší než western blot, protože je vynechán proces přenosu proteinů na membránu. Kvantifikace je u této metody možná, ale je obtížnější než v případě
western
blotu.
Vzorek
je
nakapán
v určitém
objemu
přímo
na nitrocelulózovou (či PVDF) membránu a nechán zaschnout. Membrána je stejně jako membrány western blotu blokována, poté inkubována s primární protilátkou, promyta a inkubována se sekundární protilátkou. Vizualizace probíhá taktéž stejně jako u western blotu.
39
3
CÍLE PRÁCE
Cílem této diplomové práce byla optimalizace elektrochemických metod pro stanovení proteinů, konkrétně elektrochemické stanovení prionového proteinu a sledování jeho interakcí s kovy a metalothioneinem pomocí diferenční pulzní voltametrie. Dalším dílčím cílem této diplomové práce bylo imunochemické stanovení hladiny metalothioneinu-III (MT-III) ve zdravých a prion-infikovaných myších mozkových tkáních. První fází byla příprava rekombinantního lidského prionového proteinu (PrPC) v transformované E. coli. Tento protein byl z bakterií E. coli izolován a purifikován. Dalším krokem bylo využití rekombinantního lidského PrPC pro elektrochemická stanovení. Kromě samotné detekce PrPC byly elektrochemicky zkoumány i interakce PrPC s esenciálními kovy, konkrétně s mědí a zinkem, a také s kov-vázajícím proteinem metalothioneinem. Tato měření probíhala pomocí metody diferenční pulzní voltametrie. V poslední části práce byla sledována hladina mozkově specifického MT-III v myších mozkových tkáních pomocí imunochemické metody western blot. Tato stanovení proběhla v neinfekčních a prion-infikovaných myších mozkových tkáních různých genotypů.
40
4
MATERIÁL A METODY
4.1 Materiál Klonovací kit pRSET B byl zakoupen od firmy Invitrogen (Německo). SOB médium, ampicilin, chloramfenikol a isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) byly zakoupeny od firmy Sigma Aldrich (USA). Primární myší anti-PrP monoklonální protilátka (Monoclonal Anti-Prion Protein Clone 8H4) byla zakoupena taktéž od firmy Sigma Aldrich a sekundární anti-myší protilátka (Polyclonal Goat Anti-Mouse Immunoglobulins /HRP) byla zakoupena od firmy Dako (Agilent Technologies, ČR). Izolační kolona HisTrap excel 1 ml column byla zakoupena od GE Healthcare (Švédsko) a centrifugační filtry pro cut-off filtraci Amicon Ultra 3K-0,5 mL od firmy Merck (Německo). Pro všechna elektrochemická měření byl využit námi připravený rekombinantní lidský prionový protein (PrPC) izolovaný z E. coli. Jako standard mědi byl využit Cu(NO3)2 . 3 H2O (FW = 241,60) a jako standard zinku byl využit Zn(NO3)2 . 6 H2O (FW = 297,49) od firmy Sigma Aldrich (USA). Standard metalothioneinu (Zinc Metallothionein) byl zakoupen od firmy Ikzus Proteomics (Itálie). Všechny ostatní chemikálie použité pro elektrochemii byly získány od firmy Sigma Aldrich (USA). Elektrochemická měření probíhala na přístroji AUTOLAB Analyser (EcoChemie, Nizozemsko) připojenému k 747 VA Stand ve spojení se 746 VA Trace analyzérem a 695 Autosamplerem (Metrohm, Švýcarsko). Pro zaznamenání a vyhodnocení dat byl využit program GPES 4.9 (EcoChemie, Nizozemsko). Pro stanovení hladiny MT-III ve tkáních byl použit homogenizátor TeSeE™ PRECESS 24™ od firmy BIO-RAD (Velká Británie). SDS-ELFO probíhala na přístroji PowerPac 300 od firmy BIO-RAD (Velká Británie). Western blot probíhal na přístroji Electrophoresis Power Supply EPS 601 (Amersham Biosciences, Velká Británie). Barvivo Ponceau S bylo získáno od firmy Fluka Biochemika (Španělsko) a sušené mléko od firmy Marvel (Velká Británie). Primární protilátka Sha31 (Prion Protein Monoclonal Antibody Clone Sha31) byla dodána firmou Cambridge Bioscience (Velká Británie) a sekundární protilátka avidin peroxidáza (anti-mouse IgG-horseradish peroxidase A3673 firmou Sigma Aldrich (USA). Primární protilátka anti-MT-III (polyclonal rabbit anti-MT-III antibody) nám byla poskytnuta Dr. Scottem Garretem (Oddělení patologie, Universita v Severní Dakotě). Sekundární protilátka (anti-rabbit 41
IgG) byla zakoupena u firmy Sigma Aldrich (USA). Přístroj pro vizualizaci proteinů Versadoc (Imaging System BIO-RAD, Model 3000) kombinovaný s programem Quantity one 5.4.1 byl pořízen od firmy BIO-RAD (Velká Británie). Všechny ostatní použité chemikálie pocházely od firmy Sigma Aldrich (USA). Experimenty byly prováděny za laboratorní teploty (24 °C). Hodnoty pH všech použitých pufrů byly stanoveny za použití elektrody SenTix- H (pH 0–14/3M KCl), přístroje WTW inoLab Level 3 a programu MultiLab Pilot (Weilheim, Německo). Elektroda byla pravidelně kalibrována pomocí kalibračních roztoků (Weilheim, Německo).
4.2 Příprava rekombinantního lidského prionového proteinu v E. coli Pro klonování lidského prionového proteinu v E. coli byl využit komerční klonovací kit pRSET B. Tento kit využívá vlastností silného promotoru fága T7, který umožňuje produkci proteinů v E. coli v nadměrném množství. Exprese proteinů je pak indukována činidlem IPTG. Transformované bakterie pro naše účely připravil Dr. Vladimír Pekařík (Středoevropský technologický institut, Kamenice 753/5, 625 00, Brno, Česká republika). Transformace bakterií proběhla pomocí genu pro lidský prionový protein (23-230 AMK) bez signálních sekvencí o velikosti 632 bp (referenční číslo: P04156-2, UniProtKB). Sekvence genu hPrP: ATGaagaagcgcccgaagcctggaggatggaacactgggggcagccgatacccggggcagggcagccctggaggca accgctacccacctcagggcggtggtggctgggggcagcctcatggtggtggctgggggcagcctcatggtggtggctgg gggcagccccatggtggtggctggggacagcctcatggtggtggctggggtcaaggaggtggcacccacagtcagtggaa caagccgagtaagccaaaaaccaacatgaagcacatggctggtgctgcagcagctggggcagtggtggggggccttggcg gctacatgctgggaagtgccatgagcaggcccatcatacatttcggcagtgactatgaggaccgttactatcgtgaaaacatgc accgttaccccaaccaagtgtactacaggcccatggatgagtacagcaaccagaacaactttgtgcacgactgcgtcaatatc acaatcaagcagcacacggtcaccacaaccaccaagggggagaacttcaccgagaccgacgttaagatgatggagcgcgt ggttgagcagatgtgtatcacccagtacgagagggaatctcaggcctattaccagagaggatcgTAA Kultivace
transformovaných
bakterií
byla
prováděna
podle
návodu
ke
klonovací sadě pRSET B. Bakterie byly kultivovány při 37 °C na SOB médiu s přídavkem antibiotik chloramfenikolu a ampicilinu. Ke stimulaci produkce proteinů v bakterii byl využit IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid). Exprese prionového proteinu byla následně ověřena pomocí western-blotu s myší anti-PrP monoklonální protilátkou ředěnou 1:847 a sekundární anti-myší protilátkou ředěnou 1:1000. Po 42
sklizení a lýzi buněk byly proteiny v naší laboratoři vyizolovány pomocí kolony HisTrap excel 1 ml column, která využívá afinitu histidinových kotev rekombinantního PrPC k niklu. Při průchodu kolonou se částice prionových proteinů specificky vážou na niklové částice v koloně, zatímco ostatní proteiny kolonou prochází. S průchodem elučního roztoku se pak v poslední fázi uvolňují jen čisté prionové proteiny. Přečištění izolovaných prionových proteinů poté proběhlo cut-off filtrací pomocí Amicon Ultra 3K-0,5 mL 3K centrifugačních
filtrů. Posledním krokem bylo ověření identity
prionových proteinů na MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight). Tato metoda je založena na ionizaci vzorku laserem, kde vznikají odštěpem elektronů volné radikály. Tyto částice pak dopadají na detektor, kde je měřena doba jejich letu. Z doby letu je pak vypočten poměr molekulové hmotnosti a náboje této částice. Metodu MALDI-TOF u prionového proteinu pro naše účely laskavě provedl Miguel Angel Merlos Rodrigo, DEA (Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií, Zemědělská 1, Brno, 613 00).
4.3 Elektrochemická detekce prionových proteinů a jejich interakce s kovy a metalothioneinem Pro elektrochemická měření prionových proteinů byl využit námi připravený rekombinantní lidský prionový protein (dále značený jen PrPC). Elektrochemická stanovení probíhala pomocí metody diferenční pulzní voltametrie (DPV) na AUTOLAB analyzéru v klasickém zapojení tří elektrod. Jako pracovní elektroda byla použita visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm2. Referenční elektrodou byla Ag/AgCl/3M KCl. Pomocnou elektrodou byla zvolena grafitová elektroda. 4.3.1
Měření rekombinantního lidského prionového proteinu (PrPC)
Pro měření PrPC byla využita adsorptivní přenosová technika (AdTS) s 5 μl vzorku v 5 ml elektrolytu, přičemž doba adsorpce byla 120 s. Analyzované vzorky byly zbaveny kyslíku pomocí probublávání argonem po dobu 120 s. PrPC byl měřen ve dvou různých elektrolytech. Pro následné měření interakcí PrPC s kovy byl PrPC měřen v acetátovém pufru pH 5 a pro účely měření v kombinaci s metalothioneinem byl prionový protein měřen ve fosfátovém pufru pH 7. Parametry DPV při měření PrPC v obou pufrech: počáteční potenciál -1,5 V, koncový potenciál 0 V, potenciálový krok 160 mV/s.
43
4.3.2
Měření esenciálních kovů (Cu a Zn)
Pro měření kovů bylo využito klasického měření v nádobce. K 1980 μl elektrolytu bylo přidáno vždy 20 μl vzorku. Analyzované vzorky byly zbaveny kyslíku pomocí probublávání argonem po dobu 120 s. Měření probíhalo v acetátovém pufru pH 5. Parametry DPV u měření mědi: počáteční potenciál -0,3 V, koncový potenciál 0,1 V, potenciálový krok 160 mV/s. Parametry DPV u měření zinku: počáteční potenciál -1,2 V, koncový potenciál -0,2 V, potenciálový krok 160 mV/s. 4.3.3
Měření interakce PrPC a esenciálních kovů (Cu a Zn)
Pro měření interakce PrPC a kovů byla využita AdTS s akumulací 5 μl vzorku PrPC po dobu 120 s. Měření poté probíhalo v nádobce s 1980 μl elektrolytu a 20 μl vzorku kovu. Měření probíhalo v acetátovém pufru pH 5. Analyzované vzorky byly zbaveny kyslíku pomocí probublávání argonem po dobu 120 s. Parametry DPV u měření interakce PrPC a mědi: počáteční potenciál -0,3 V, koncový potenciál 0,1 V, potenciálový krok 160 mV/s. Parametry DPV u měření interakce PrPC a zinku: počáteční potenciál -1,2 V, koncový potenciál -0,2 V, potenciálový krok 160 mV/s. 4.3.4
Měření metalothioneinu (MT)
Pro měření MT byla využita AdTS s 5 μl vzorku v 5 ml elektrolytu, přičemž doba adsorpce byla 120 s. Měřeno ve fosfátovém pufru pH 7. Analyzované vzorky byly zbaveny kyslíku pomocí probublávání argonem po dobu 120 s. Parametry DPV: počáteční potenciál -1,5 V, koncový potenciál 0 V, potenciálový krok 160 mV/s. 4.3.5
Měření interakce PrPC a metalothioneinu (MT)
Pro měření interakce PrPC a MT byla využita dvojitá AdTS. Tento typ AdTS probíhal adsorpcí 5 μl prvního vzorku s adsorpcí 120 s, oplachem elektrody v destilované vodě a adsorpcí 5 μl druhého vzorku po dobu 120 s. Měření pak proběhlo v 5 ml fosfátového pufru pH 7. Analyzované vzorky byly zbaveny kyslíku pomocí probublávání argonem po dobu 120 s. Parametry DPV: počáteční potenciál -1,5 V, koncový potenciál 0 V, potenciálový krok 160 mV/s.
44
4.4 Sledování
změn
hladiny
MT-III
v průběhu
prionových
onemocnění pomocí molekulárně biologických metod 4.4.1
Příprava prion-infekčních a neinfekčních transgenních myší
Neinfekční genotypy transgenních myší byly získány od prof. Charlese Weissmanna (MRC Prion Unit, Neurogenetics, Imperial College School of Medicine, Londýn, U. K.). Mezi těmito genotypy byly PrP-/- myši. Tyto myši mají vyřazenou funkci genu PRNP a z tohoto důvodu netvoří prionové proteiny (Brown et al., 2000). Dalším genotypem byl Tga20, tzn. myši, které produkují prionové proteiny v nadbytku. Tato zvýšená produkce proteinů je způsobena zmnožením genu PRNP na 50 kopií (Fischer et al., 1996). Prion-infekční genotypy myší byly připraveny následujícím způsobem. Z mozků ovcí napadených klusavkou byly odebrány 2 g mozkové kůry. Tyto vzorky byly homogenizovány a dále naředěny na 10% roztok fyziologickým roztokem. Jednotlivé izoláty pak byly injektovány do laboratorních myší typu C57BL/6 (divoký typ), přičemž byla kombinována intrakraniální a intraperitoneální aplikace. Tyto myši byly poté monitorovány a usmrceny ihned po výskytu terminálních příznaků prionového onemocnění. 4.4.2
Příprava myších mozkových homogenátů
Usmrceným myším byly poté vyjmuty mozky. Každý mozek byl vždy rozdělen sagitálním řezem a k jedné jeho polovině byl přidán lyzační pufr (50mM Tris pH 7,5, 100mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40, 1mM AEBSF ) pro získání 10% roztoku. Objem přidaného lyzačního roztoku byl volen podle hmotnosti mozku pro dosažení přesně 10% koncentrace
mozkové
tkáně
v
roztoku.
Homogenizace
poté
probíhala
na
homogenizátoru TeSeE™ PRECESS 24™. Vzorek byl po homogenizaci resuspendován špičkou pipety pro získání absolutně homogenního roztoku. 4.4.3
SDS-PAGE
Homogenáty mozků byly poté smíchány 1:1 s 2x Laemmli nanášecím pufrem, 10 minut povařeny, schlazeny na ledu a naneseny na SDS-PAGE 16% rozdělovací gel, překrytý 5% zaostřovacím gelem (příprava gelu viz Tabulka 3).
45
Tabulka 3: Příprava gelů pro SDS-PAGE
Složky pro 2 gely dH2O Akrylamid/bisakrylamid 1,5 M Tris, pH 8.8 1,5 M Tris, pH 6.8 10% SDS TEMED 10% APS
16% rozdělovací gel 3,3 ml 4 ml 2,5 ml 100 µl 8 µl 100 µl
5% zaostřovací gel 2,87 ml 500 µl 500 µl 40 µl 8 µl 40 µl
SDS-PAGE poté probíhala v elektroforetickém pufru (5x koncentrovaný pufr = 15,1 g Tris base, 94 g glycinu, 50 ml 10% SDS do 1 l dH2O) při 180V po dobu 50 - 75 minut na přístroji PowerPac 300. 4.4.4
Western blot
Vizualizace proteinů poté probíhala pomocí metody western blot. Na nitrocelulózovou membránu ekvilibrovanou v blotovacím pufru (5,81 g Tris base, 2,93 g glycinu, 0,375 g SDS, 200 ml metanolu do 1 l dH2O) byl shora položen SDS-PAGE gel. Proteiny byly poté přeneseny z gelu na membránu při 45 mA po dobu 90 minut (pro 2 membrány) nebo 60 minut (pro 1 membránu) pomocí přístroje Electrophoresis Power Supply EPS 601. Po vyjmutí z přístroje byly membrány 5 minut barveny pomocí Ponceau S. Viditelné proužky (bandy) standardu byly obtaženy měkkou tužkou. Pro blokování membrány byl přidán 5% roztok sušeného mléka v TBST (10mM Tris/HCl pH 8, 0,15 M NaCl, 0,5% Tween 20). Dalším krokem byla inkubace membrány s primární protilátkou. V případě vizualizace prionových proteinů pro ověření jejich přítomnosti byla použita primární protilátka Sha31. Jako sekundární protilátka byla použita avidinperoxidáza. V dalších experimentech byla sledována hladina metalothioneinu-III pomocí primární protilátky anti-MT-III a jako sekundární protilátka byla použita antirabbit IgG. Protilátky byly vždy ředěny 1% roztokem sušeného mléka v TBST a inkubovány s membránou po dobu 1 hodiny při 18°C. Vizualizace proteinů proběhla reakcí s ECL (enhanced chemiluminiscence) roztoky. Roztoky A a B byly připraveny podle tabulky 4 a smíchány v poměru 1:1 do konečného objemu 2 ml. Směsí roztoků 46
byla poté převrstvena membrána po dobu 1 minuty při 18°C. Vizualizace proteinů byla provedena přístrojem Versadoc s využitím programu Quantity one 5.4.1. Tabulka 4: Příprava ECL (enhanced chemiluminiscence) roztoků A a B (nutno skladovat ve tmě) Reagencie dH2O Tris, pH 8,5 90 mM p-kumarová kyselina v DMSO 250 mM luminol 30% H2O2
4.4.5
ECL roztok A 4,4 ml 0,5 ml 22 µl 50 µl -
ECL roztok B 4,5 ml 0,5 ml 3 µl
Dot-blot
Alternativním postupem pak bylo zhotovení dot-blotu. Na nitrocelulózové membrány byly přímo nakapány homogenizované vzorky o určitém objemu (1 a 3 µl). Po zaschnutí byly membrány přeneseny do blokovacího roztoku 5% sušeného mléka v TBST. Dále byla každá membrána inkubována s primární protilátkou anti-MT-III v různých koncentracích (1:2000, 1:1000, 1:500). Dalším krokem byla inkubace membrán se sekundární protilátkou anti-rabbit IgG. Protilátky byly vždy ředěny 1% roztokem sušeného mléka v TBST a inkubovány s membránou po dobu 1 hodiny při 18°C. Vizualizace proteinů proběhla reakcí s ECL roztoky stejným postupem jako v případě western blotu.
47
5
VÝSLEDKY A DISKUSE
5.1 Příprava rekombinantního lidského prionového proteinu v E. coli Transformace bakterií E. coli lidským prionovým proteinem (PrPC) proběhla podle protokolu klonovacího kitu pRSET B. Kultivace transformantů probíhala v médiu SOB při 37 °C s přídavkem selektivních antibiotik a činidla IPTG, které stimuluje bakterie k produkci proteinů. Pro stanovení optimálního výtěžku PrPC byly po přidání činidla IPTG k bakteriální kultuře odebírány v hodinovém intervalu (0 až 6 hodin) vzorky. Tyto vzorky byly posléze podrobeny SDS-PAGE (Obrázek 11). Molekulární hmotnost PrPC je přibližně 20 kDa a z tohoto důvodu se zaměřujeme na sledování intenzity proužků v této oblasti. Z důvodu dostatečné produkce PrPC a zároveň únosného času kultivace byla pro další experimenty vybrána optimální doba kultivace 4 hodiny. Označená část na tomto obrázku ukazuje vybranou dobu kultivace.
150 V, 60 minut, Barveno Coomassie blue, Standard: Precision Plus Protein Dual Xtra Standarts
Obrázek 11: Optimalizace doby kultivace transformovaných bakterií s IPTG (isopropyl-thio-beta-galaktosidázou) pomocí SDS-PAGE (sodiumdodecylsulfátové polyakrylamidové elektroforézy). Červená elipsa značí výskyt optimálního množství prionového proteinu o velikosti cca 20 kDa. Barvení gelu Coomassie brilliant blue. Standard: Precision Plus Protein Dual Xtra Standards (BIO-RAD). Následné ověření identity izolovaného proteinu proběhlo přenosem proteinů na membránu pomocí metody western-blot a dot-blot se specifickou anti-PrP protilátkou (Obrázek 12). Na tomto obrázku je možno pozorovat produkci PrPC ve stejných vzorcích jako v předchozí části experimentu. Ve stanoveném čase 4 hodiny je podle western blotu i dot-blotu produkce proteinu dostatečná pro další pokračování
48
experimentu a podle specifické barevné reakce protilátky se opravdu jedná o prionový protein.
Obrázek 12: Ověření přítomnosti prionového proteinu v transformovaných buňkách E. coli pomocí western blotu a dot-blotu. Izolace prionových proteinů z E. coli proběhla pomocí metody iontové afinitní chromatografie na niklové koloně. Vazba prionových proteinů na kolonu byla umožněna histidinovými kotvami v jejich struktuře. Pro izolaci proteinů z E. coli byla kolona promývána třemi promývacími kroky (W1, W2, W3) a dále čtyřmi elučními kroky (E1-E4), ve kterých by se z kolony měly uvolňovat prionové proteiny. Jednotlivé izolované frakce pak byly podrobeny SDS-PAGE, western blotu a dot-blotu s anti-PrP protilátkou. Jak vyplývá z obrázku 13, nejvíce prionových proteinů vychází z kolony spolu s eluční frakcí č. 2. (E2). Z této frakce byl protein později izolován až do získání kýženého množství.
Obrázek 13: Přítomnost buněčného prionového proteinu (PrPC) v izolovaných frakcích. Červené elipsy značí výskyt prionového proteinu (velikost cca 20 kDa). Barvení gelu
49
Coomassie brilliant blue a barvení stříbrem. Standard: Precision Plus Protein Dual Xtra Standards (BIO-RAD). Z důvodu dalšího ověření identity izolovaného proteinu byl izolovaný prionový protein z eluční frakce (E2) analyzován i pomocí metody MALDI-TOF (Obrázek 14). Výsledek této analýzy byl taktéž pozitivní. Byly detekovány fragmenty o velikosti 20 kDa, což odpovídá prionovému proteinu.
Obrázek 14: Spektrum MALDI-TOF pro izolovaný lidský prionový protein (PrPC). Metoda přípravy rekombinantního prionového proteinu pomocí komerčního kitu pRSET B byla zvolena pro svoji jednoduchost, přesnost a velkou výtěžnost. Získaný prionový protein byl poté využit pro elektrochemickou detekci pomocí diferenční pulzní voltametrie. Existuje velké spektrum metod přípravy rekombinantních proteinů. Velmi podobnou metodu pro izolaci lidského prionového proteinu zvolila i skupina kolem Zahna (Zahn et al., 2000). Jiné vědecké skupiny využily k produkci prionových proteinů v bakteriích sekreční vektory jiných typů (Mehlhorn et al., 1996). Další možností získání prionových proteinů pro výzkum, je jejich izolace z mozkové tkáně. Tento postup je popsán například v publikaci skupiny kolem Borgese-Alvareze (Borges-Alvarez et al., 2014).
5.2 Elektrochemická detekce prionových proteinů a jejich interakce s kovy a metalothioneinem Pro všechna následná elektrochemická měření byl využit rekombinantní lidský prionový protein (značený pouze PrPC) izolovaný z E. coli.
50
5.2.1
Stanovení PrPC v acetátovém pufru metodou DPV
Prionový protein měřený pomocí DPV vytvářel dva charakteristické píky (Obrázek 15). První pík byl pozorován při potenciálu -0,480 V (Pík I) a druhý při potenciálu -0,620 (Pík II). Elektrochemický signál odpovídal měřené koncentraci PrPC (koncentrace: 250, 125, 62, 31 a 15 μg/ml). Závislost obou píků byla lineární (R2 vyšší než 0,9).
Obrázek 15: Voltamogram elektrochemické detekce lidského buněčného prionového proteinu (PrPC). Měřeno metodou diferenční pulzní voltametrie v acetátovém pufru pH 5. Elektrochemický signál odpovídá měřené koncentraci PrPC (koncentrace: 250, 125, 62, 31 a 15 μg/ml) a závislost píků je lineární (R2 vyšší než 0,9). 5.2.2
Stanovení interakcí PrPC a Cu metodou DPV
Výsledkem měření mědi bylo vytvoření jednoho píku při potenciálu -0,090 V (Obrázek 16A). Elektrochemický signál byl přímo úměrný koncentraci mědi (koncentrace Cu: 100, 50, 25, 12, 6 a 3 μg/ml) a R2 bylo vyšší než 0,9. Měření interakce PrPC a mědi ukázalo splynutí a posun píků do nových poloh, což naznačuje probíhající interakci mezi těmito dvěma látkami (Obrázek 16B). Koncentrace PrPC byla stabilní (100 μg/ml), zatímco koncentrace mědi byla proměnlivá (koncentrace Cu: 100, 50, 25, 12, 6, 3 μg/ml). První pík (Pík Cu) byl lokalizován v potenciálu -0,075 V a připomíná pík samostatné mědi (Obrázek 16C). Druhý a třetí pík na tomto voltamogramu už reprezentují interakci. Pík Cu+PrP I byl vytvořen při potenciálu 0 V a pík Cu+PrP II vznikl při potenciálu 0,050 V. Velikost obou píků roste se zvyšující se koncentrací mědi (Obrázek 17). Elektrochemický signál v obou případech koresponduje se změnou koncentrace (R2 vyšší než 0,9).
51
Obrázek 16: A) Voltamogram mědi, koncentrace Cu: 100, 50, 25, 12, 6 a 3 μg/ml; B) voltamogram interakce mědi a buněčného prionového proteinu (PrPC), koncentrace PrPC: 100 μg/ml, koncentrace Cu: 100, 50, 25, 12, 6, 3 μg/ml; C) graf srovnání velikosti píku mědi a píku interakce PrPC a mědi (Cu+PrP). Elektrochemická detekce probíhala pomocí diferenční pulzní voltametrie (DPV) v acetátovém pufru pH 5.
Obrázek 17: Graf závislosti výšky píku [nA] interakcí buněčného prionového proteinu (PrPC), mědi a zinku. Zleva: interakce PrPC a zinku (Pík Zn+PrP I), interakce PrPC a mědi (Pík Cu+PrP I a Cu+PrP II). 5.2.3
Stanovení interakcí PrPC a Zn metodou DPV
Voltamogram zinku ukazuje charakteristický pík při potenciálu -1.075 V (Obrázek 18A). Závislost výšky píku na koncentraci byla lineární (R2 vyšší než 0,9). Použité koncentrace zinku byly 100, 50, 25, 12, 6 a 3 μg/ml. Interakce PrPC a zinku ukazuje změny v počtu píků a jejich posun. Tyto změny demonstrují interakci mezi Zn a PrPC. Koncentrace PrPC byla stálá (100 μg/ml)
52
a koncentrace zinku byla proměnlivá (koncentrace Zn: 100, 50, 25, 12, 6 a 3 μg/ml) (Obrázek 18B). První pík (Pík Zn) byl vytvořen při potenciálu -1,075 V a připomínal pík samotného zinku (Obrázek 18C). Druhý pík na tomto voltamogramu (Pík Zn+PrP) reprezentuje interakci Zn a PrPC. Tento pík vznikl při potenciálu -0,940 V a jeho velikost se zmenšuje se zvětšující se koncentrací zinku (Obrázek 17). Elektrochemický signál ve všech případech koresponduje se změnami koncentrace (R2 vyšší než 0,9).
Obrázek 18: A) Voltamogram zinku, koncentrace Zn: 100, 50, 25, 12, 6 a 3 μg/ml; B) voltamogram interakce zinku a buněčného prionového proteinu (PrPC), koncentrace PrPC: 100 μg/ml, koncentrace Zn: 100, 50, 25, 12, 6, 3 μg/ml; C) graf srovnání velikosti píku zinku a píku interakce PrPC a zinku (Zn+PrP). Elektrochemická detekce probíhala pomocí diferenční pulzní voltametrie (DPV) v acetátovém pufru pH 5. 5.2.4
Stanovení PrPC, MT a jejich interakcí metodou DPV
Elektrochemická měření metalothioneinu (MT) v kombinaci s PrPC probíhala ve fosfátovém pufru pH 7 a s použitím AdTS DPV. PrPC tvořil dva píky při potenciálu -0,360 V (Pík PrP I) a -0,575 V (Pík PrP II) (Obrázek 19A). Elektrochemický signál koresponduje s koncentrací PrPC (250, 125, 62, 31 a 15 μg/ml). Závislost obou píků je lineární (R2 vyšší než 0,9). V případě MT byl vytvořen jeden pík při potenciálu -0,650 V (Obrázek 19B). Elektrochemický signál lineárně vzrůstá s koncentrací MT (koncentrace MT: 16, 8, 4, 2 a 1 μg/ml) (R2 vyšší než 0,9). 53
Interakce PrPC (100 μg/ml) s MT vzrůstající koncentrace (16, 8, 4, 2, 1, 0,5 a 0,25 μg/ml) byla jasně viditelná, protože došlo ke splynutí píků a jejich posunu do nových pozic (Obrázek 19C). Nově vytvořený pík (Pík PrP+MT) reprezentuje interakci PrPC a MT a jeho výška se snižuje se vzrůstající koncentrací MT. Druhý pík (Pík MT) se naopak zvětšuje se vzrůstající koncentrací MT. Elektrochemický signál je závislý na koncentraci MT (R2 vyšší než 0,9). Opačná interakce MT (8 μg/ml) se vzrůstající koncentrací PrPC (250, 125, 62,5, 31,25, 15,125 μg/ml) ukazovala ve svém průběhu úplně jiný trend (Obrázek 19D). Spolu s klesající koncentrací PrPC můžeme pozorovat masivní změnu struktury. Při vysoké koncentraci PrPC jsou tvořeny dva píky, které se pak při přechodu mezi koncentracemi 62,5 a 32,5 μg/ml posouvají do nových pozic. První pík (Pík I) při potenciálu -0,400 V je posunut do nové pozice při potenciálu -0.650 V (Posunutý pík I). Kalibrační křivka těchto píků je lineární (R2 vyšší než 0,9). V případě druhého píku (Pík II) při potenciálu -0,500 V dochází k posunu do pozice -0.800 V (Posunutý pík II). Kalibrační křivka je lineární pouze v případě píku II (R2 vyšší než 0,9), ale společně s posunutým píkem II netvoří lineární trend. Tato masivní konverze může být vysvětlena pomocí tvorby MT tetramerů. Každý tetramer MT, může totiž do svého středu vázat jednu PrPC molekulu (Obrázek 20). V nadbytku PrPC může molekula MT formovat tetramery a tím blokovat molekuly PrPC, přičemž reakce na rtuťové elektrodě je pak intenzivnější.
54
Obrázek 19: Elektrochemická detekce a kalibrační křivky: A) buněčného prionového proteinu (PrPC), koncentrace: 250, 125, 62, 31 a 15 μg/ml; B) metalothioneinu (MT), koncentrace: 16, 8, 4, 2 a 1 μg/ml; C) interakce PrPC (koncentrace100 μg/ml) a MT (16, 8, 4, 2, 1, 0,5 a 0,25 μg/ml); D) interakce MT (8 μg/ml) a PrPC (250, 125, 62,5, 31,25, 15,125 μg/ml). Měřeno pomocí metody diferenční pulzní voltametrie ve fosfátovém pufru pH 7.
55
Obrázek 20: Nákres předpokládaných interakcí mezi buněčným prionovým proteinem (PrPC) a metalothioneinem (MT) na povrchu rtuťové elektrody. Na levé straně obrázku můžeme vidět schéma interakce konstantní koncentrace PrPC se vzrůstající koncentrací MT na povrchu rtuťové kapkové elektrody. Na pravé straně obrázku jen pak možné pozorovat schéma interakce MT o konstantní koncentraci se vzrůstající koncentrací PrPC. Při vysoké koncentraci PrPC tvoří MT tetramery, které do sebe molekulu PrPC uzavírají a charakter elektrochemického signálu se výrazně mění. Detekce různých druhů proteinů pomocí moderních analytických metod je v současnosti velmi rozšířená. Námi vybraná metoda diferenční pulzní voltametrie se pro detekci prionových proteinů velmi osvědčila. Pro detekci látek pomocí DPV stačí velmi malé množství vzorku a metoda je velmi rychlá a přesná. V případě detekce interakcí kovů a metalothioneinu s prionovým proteinem se nám podařilo tyto interakce jednoduše pozorovat. Kooperaci mědi a PrPC dokazuje například publikace (Meloni et al., 2012) nebo (Tortosa et al., 2008). O interakcích se zinkem a metalothioneinem se zmiňuje zase (Meloni a Vasak, 2009). Jak v případě PrPC a kovů, tak v případě PrPC a metalothioneinu k těmto interakcím při našem měření docházelo, což svědčí o kooperaci těchto látek ve fyziologických procesech.
56
5.3 Sledování
změn
hladiny
MT-III
v průběhu
prionových
onemocnění 5.3.1
Ověření identity vzorků neinfekčních myších mozkových tkání
Prvním krokem experimentu byla verifikace hladiny prionových proteinů (PrPC) v myších mozkových tkáních různých genotypů. Za tímto účelem byla využita imunochemická metoda western blot s anti-PrP monoklonální protilátkou Sha31, která rozpoznává myší prionový protein. Pro tuto část experimentu byly využity neinfekční myší genotypy Tga20 (myš se zvýšenou expresí PrPC), C57BL/6 (myš divokého typu) a PrP-/- (myš s vyřazenou funkcí genu pro produkci PrPC). Z obrázku je patrné, že různé myší genotypy mají různou hladinu exprese PrPC (Obrázek 21). V případě myší Tga20 je hladina PrPC v mozkové tkáni výrazně vyšší, což odpovídá našemu předpokladu o zvýšené expresi PrPC v této tkáni. U myší divokého typu C57BL/6 je hladiny exprese PrPC normální. U mozkové tkáně PrP-/-, která by měla být prostá prionových proteinů, není vizualizován žádný protein, což je způsobeno absencí PrPC ve vzorku. Tato skutečnost potvrzuje všechny naše předpoklady o identitě vzorků myších mozkových tkání. Tyto tkáně je tedy možné použít pro nadcházející části experimentu.
Obrázek 21: Ověření identity vzorků pomocí western blotu. Dráha č. 1 – hmotnostní standard, dráha č. 2, 3, 4 – vzorky genotypu Tga20 (myš exprimující PrP v nadbytku), dráha č. 5, 6, 7 – vzorky genotypu C57BL/6 (myš divokého typu, normální exprese PrP), dráha 8, 9, 10 – vzorky genotypu PrP-/- (myš postrádající prionový protein). Parametry SDS-ELFO: 180V/75 minut. Parametry western blotu: 45mA/60 minut.
57
Primární protilátka Sha31, ředění 1:2000, 60 min. Sekundární protilátka avidinperoxidáza, ředění 1:2000, 60 min. Vizualizace pomocí ECL: čas expozice 87 sekund. 5.3.2
Sledování hladiny MT-III v neinfekčních mozkových tkáních (dot-blot)
Metoda dot-blot byla využita pro předběžné ověření funkčnosti anti-MT-III protilátky a pro optimalizaci ředění této protilátky. Protilátka byla aplikována na vzorky neinfekčních myších mozkových homogenátů Tga20, C57BL/6 a PrP-/-. Na obrázku 22 je možné pozorovat výrazně sníženou hladinu MT-III v případě myšího genotypu PrP-/-. Toto zjištění je však nutno ověřit pomocí přesnějšího western blotu. Co se týče genotypů Tga20 a C57BL/6, není zde viditelné žádné zvýšení či snížení hladiny MT-III mezi těmito dvěma genotypy. Dalším nutným krokem je z tohoto důvodu použití western blotu se stejnou protilátkou na stejné vzorky myších mozkových tkání.
Obrázek 22: Sledování hladiny metalothioneinu-III (MT-III) v neinfekčních myších mozkových tkáních (dot-blot). Vzorky na každé z membrán zleva: Tga20 (myš exprimující PrP v nadbytku), C57BL/6 (myš s normální expresí PrP), PrP-/- (myš postrádající prionový protein). Objem vzorků: horní linie 1 µl a spodní linie 3 µl. Parametry dot-blot: primární protilátka anti-MT-III, ředění 1:2000, 1:1000 a 1:500; 60 min. Sekundární protilátka anti–rabbit IgG, ředění 1:2000; 60 min. Vizualizace pomocí ECL: čas expozice 120 sekund. 5.3.3
Sledování hladiny MT-III v neinfekčních mozkových tkáních (western blot)
Vzorky neinfekčních myších genotypů Tga20, C57BL/6 (divoký typ) a PrP -/- byly v této části experimentu využity pro ověření výsledků předchozího dot-blotu. Z obrázku je patrné (Obrázek 23), že různé myší genotypy mají různou hladinu exprese MT-III a získaná data korespondují s předchozím dot-blotem. Hladina MT-III je výrazně 58
snížena v případě mozkové tkáně PrP-/-. V případě tkání Tga20 a C57BL/6 však stále není viditelné zvýšení či snížení hladiny MT-III mezi těmito dvěma genotypy. Předpokládaná molekulární hmotnost MT-III je asi 7 kDa, avšak na membráně je přítomný produkt o přibližné velikosti 31 kDa. Z tohoto důvodu předpokládáme, že MT-III tvoří tetramery či pentamery.
Obrázek 23: Sledování hladiny MT-III v neinfekčních mozkových tkáních (western blot). Dráha č. 1 – hmotnostní standard, dráha č. 2, 3, 4 – vzorky genotypu Tga20 (myš exprimující PrP v nadbytku), dráha č. 5, 6, 7 – vzorky genotypu C57BL/6 (myš divokého typu, normální exprese PrP), dráha 8, 9, 10 – vzorky genotypu PrP-/- (myš postrádající prionový protein). Parametry SDS-ELFO: 180V/75 minut. Parametry western blotu: 45mA/60 minut. Primární protilátka anti-MT-III, ředění 1:1000, 60 min. Sekundární protilátka anti-rabbit IgG, ředění 1:2000, 60 min. Vizualizace pomocí ECL: čas expozice 83 sekund. 5.3.4
Sledování hladiny MT-III v prion-infikovaných myších mozkových tkáních
V této části experimentu byly použity neinfekční genotypy myších mozkových tkání CD1 a C57. Tyto vzorky myší divokého typu slouží jako kontrola pro srovnání relativní exprese MT-III v prion-infikovaných myších mozkových tkáních. Z prion-infikovaných genotypů byly použity myší mozkové tkáně RML a ME7. Výsledky experimentu (Obrázek 24) ukazují, že hladina MT-III je signifikantně zvýšena pouze v případě infekčního genotypu RML. V případě ME7 je naopak hladina MT-III srovnatelná s kontrolními tkáněmi myší CD1 a C57. Tato skutečnost může vypovídat o genotypové specifitě hladiny exprese MT-III u prion-infikovaných tkání. Není možné jednoznačně prohlásit, že se hladina MT-III buď signifikantně zvyšuje, nebo snižuje v případě prionového onemocnění. 59
Obrázek 24: Sledování hladiny metalothioneinu-III (MT-III) v prion-infikovaných myších mozkových tkáních. Dráha č. 1 – hmotnostní standard, dráha č. 2, 3 – vzorky genotypu CD1 (myš divokého typu, normální exprese PrP), dráha č. 4, 5 – vzorky genotypu C57 (myš divokého typu, normální exprese PrP), dráha 6, 7 – vzorky genotypu RML (prion-infekční genotyp myši), dráha č. 8, 9 – vzorky genotypu ME7 (prion-infekční genotyp myši). Parametry SDS-ELFO: 180V/57 minut. Parametry western blotu: 45mA/60 minut. Primární protilátka anti-MT-III, ředění 1:1000, 60 min. Sekundární protilátka anti-rabbit IgG, ředění 1:2000, 60 min. Vizualizace pomocí ECL: čas expozice 120 sekund. 5.3.5
Sledování genotypově specifických změn hladiny MT-III v prioninfikovaných myších mozkových tkáních
V této části experimentu byly použity myší prion-infekční genotypy RML, 470-87A, 28-ME7, 37-221C, 46-ME7, 475-87A, 65-221C a 634-221C-variant. Jako neinfekční kontrola exprese MT-III byla zvolena myší mozková tkáň genotypu CD1. Na obrázku 25 je možné sledovat rozdíly v expresi MT-III mezi různými genotypy prioninfikovaných myších mozkových tkání a neinfekčním vzorkem CD1. Srovnáním hladiny exprese MT-III u různých prion-infikovaných genotypů bylo zjištěno, že mezi různými genotypy těchto tkání není pozorovatelný žádný signifikantní rozdíl. Původním předpokladem tohoto experimentu byla zvýšená exprese genotypu RML. Na tomto obrázku však nejsou viditelné žádné rozdíly v expresi MT-III mezi genotypy. Domněnka, že zvýšení či snížení hladiny MT-III u prion-infekčních tkání by mohlo být genotypově specifické, byla tímto experimentem vyvrácena.
60
Obrázek 25: Sledování genotypově specifických změn hladiny metalothioneinu-III (MT-III) v prion-infikovaných myších mozkových tkáních. Horní část: Dráha č. 1 – hmotnostní standard, dráha č. 2 – vzorek genotypu CD1 (myš divokého typu, normální exprese PrP), dráha č. 3, 4 – vzorky genotypu RML (prion-infekční genotyp myši), dráha č. 5, 6 – vzorky genotypu 470-87A (prion-infekční genotyp myši), dráha č. 7, 8 – vzorky genotypu 28-ME7 (prion-infekční genotyp myši), dráha č. 9, 10 – vzorky genotypu 37-221C (prion-infekční genotyp myši). Dolní část: Dráha č. 1 – hmotnostní standard, dráha č. 2 – vzorek genotypu CD1 (myš divokého typu, normální exprese PrP), dráha č. 3, 4 – vzorky genotypu 46-ME7 (prion-infekční genotyp myši), dráha č. 5, 6 – vzorky genotypu 475-87A (prion-infekční genotyp myši), dráha č. 7, 8 – vzorky genotypu 65-221C (prion-infekční genotyp myši), dráha č. 9, 10 – vzorky genotypu 634-221C-variant (prion-infekční genotyp myši). Parametry SDS-ELFO: 180V/55 minut. Parametry western blotu: 45mA/60 minut. Primární protilátka anti-MTIII, ředění 1:1000, 60 min. Sekundární protilátka anti-rabbit IgG, ředění 1:2000, 60 min. Vizualizace pomocí ECL: čas expozice 120 sekund. Pomocí metody western blot jsme sledovali rozdíly v hladinách MT-III u různých prion-infekčních i neinfekčních genotypů myší. Náš prvotní předpoklad týkající se změny hladiny MT-III u prion-infekčních tkání oproti neinfekčním tkáním se nepotvrdil. Rozdíly mezi hladinou MT-III mezi těmito tkáněmi nebyly dostatečně průkazné, což bylo pravděpodobně způsobeno i nepřesností zvolené metody.
61
U neinfekčních myších genotypů jsme pozorovali snížení exprese MT-III u tkáně PrP-/-, což byl nový a dosud nepozorovaný fenomén. Ovlivnění hladiny MT-III chybějícím prionovým proteinem u PrP-/- genotypu myši je velmi zajímavé a v současné době těžko vysvětlitelné. Již dříve byly studovány vztahy mezi prionovými chorobami a proteinem metalothioneinem (Tortosa et al., 2008). Konkrétně spojitostmi mezi metalothioneinem-III a prionovým proteinem se zabývá kolektiv kolem Gabriele Meloni (Meloni a Vasak, 2009). Zřejmá spolupráce těchto dvou proteinů může mít vliv i na procesy neurodegenerace tkání (Kawashima et al., 2000).
62
6
ZÁVĚR
I přesto, že se výzkumu prionových proteinů věnuje velký počet vědeckých skupin, nejsou prozatím objasněny ani základní mechanismy jejich přeměny na patologickou formu. Výzkum na tomto poli má i z tohoto důvodu velký potenciál. Pokud by existovalo spojení mezi priony a ostatními neurodegenerativními onemocněními, mohly by tyto poznatky usnadnit zacílení léčby těchto chorob. Neurodegenerativní choroby včetně těch prionových mají velmi dlouhou inkubační dobu a příznaky jsou proto zřejmé až ve finálních stádiích. Včasnou detekcí, případně i léčbou těchto chorob, by bylo možné zamezit postupující neurodegeneraci. Problémem v této oblasti je i nedostatečné portfolio metod pro odhalení těchto nemocí a jejich nedostatečná citlivost. Námi použitá metoda diferenční pulzní voltametrie by mohla být v budoucnu jednou z možností detekce těchto chorob. V této práci se nám podařilo připravit rekombinantní lidský prionový protein (PrP C) pro účely stanovení jeho elektrochemických vlastností. Tento protein byl poté analyzován pomocí diferenční pulzní voltametrie jak samotný, tak i v interakci s mědí, zinkem a metalothioneinem (MT). Ve všech případech docházelo k jeho interakcím s těmito látkami, což poukazuje na jejich možnou kooperaci ve fyziologických či patofyziologických procesech. V poslední části této práce jsme se věnovali stanovení hladiny metalothioneinu-III (MT-III) v mozkové tkáni různých genotypů prioninfekčních i neinfekčních myší. Nejzajímavějším výsledkem této části bylo odhalení snížené exprese MT-III u neinfekčního genotypu PrP-/-, který postrádá prionové proteiny. Navzdory našemu předpokladu o zvýšení či snížení exprese MT-III v prioninfikovaných myších mozkových tkáních se nám nepodařilo prokázat žádný specifický rozdíl v expresi mezi zdravou a infekční myší mozkovou tkání. Z našich výsledků je evidentní, že měď, zinek, MT i jeho mozkově specifická isoforma
MT-III reagují s PrPC. Prionový protein by mohl hrát roli v udržování
rovnováhy těchto látek v mozku či v jejich transportu. Inkorporace těchto látek do struktury
prionového
proteinu
by
mohla
naopak
způsobovat
ireverzibilní
neurodegenerativní změny mozkové tkáně. Fyziologická role přirozených buněčných proteinů v mozku není prozatím příliš prozkoumána. Odhalení látek, se kterými prionové proteiny interagují, by mohlo
63
pozitivně přispět k dalším krokům jejich výzkumu. Samotná patologická přeměna prionových proteinů by mohla být usnadněna jakoukoli jinou částicí. Otázka, která z nich to je, však bohužel zůstává nadále velkou hádankou.
64
7
LITERATURA
Abdelraheim, S. R., S. Kralovicova a D. R. Brown (2006). "Hydrogen peroxide cleavage of the prion protein generates a fragment able to initiate polymerisation of full length prion protein." The international journal of biochemistry & cell biology 38(8): 1429-1440. Aguzzi, A., F. Montrasio a P. S. Kaeser (2001). "Prions: Health scare and biological challenge." Nature Reviews Molecular Cell Biology 2(2): 118-126. Alzualde, A., B. Indakoetxea, I. Ferrer, F. Moreno, M. Barandiaran, A. Gorostidi, A. Estanga, I. Ruiz, M. Calero, F. W. van Leeuwen, B. Atares, R. Juste, A. B. Rodriguez-Martinez a A. Lopez de Munain (2010). "A novel PRNP Y218N mutation in Gerstmann-Straussler-Scheinker disease with neurofibrillary degeneration." Journal of neuropathology and experimental neurology 69(8): 789-800. Andrew, S. E., Y. P. Goldberg, B. Kremer, F. Squitieri, J. Theilmann, J. Zeisler, H. Telenius, S. Adam, E. Almquist, M. Anvret, G. Lucotte, A. J. Stoess, G. Campanella a M. R. Hayden (1994). "Huntington Disease without Cag Expansion - Phenocopies or Errors in Assignment." American Journal of Human Genetics 54(5): 852-863. Arrasate, M. a S. Finkbeiner (2012). "Protein aggregates in Huntington's disease." Experimental Neurology 238(1): 1-11. Aschner, M., M. G. Cherian, C. D. Klaassen, R. D. Palmiter, J. C. Erickson a A. I. Bush (1997). "Metallothioneins in brain - The role in physiology and pathology." Toxicology and Applied Pharmacology 142(2): 229-242. Baba, M., S. Nakajo, P. H. Tu, T. Tomita, K. Nakaya, V. M. Y. Lee, J. Q. Trojanowski a T. Iwatsubo (1998). "Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with lewy bodies." American Journal of Pathology 152(4): 879-884. Balachandran, A., N. P. Harrington, J. Algire, A. Soutyrine, T. R. Spraker, M. Jeffrey, L. Gonzalez a K. I. O'Rourke (2010). "Experimental oral transmission of chronic wasting disease to red deer (Cervus elaphus elaphus): early detection and late stage distribution of protease-resistant prion protein." The Canadian veterinary journal. La revue veterinaire canadienne 51(2): 169-178. Baron, T., A. Bencsik, A. G. Biacabe, E. Morignat a R. A. Bessen (2007). "Phenotypic similarity of transmissible mink encephalopathy in cattle and L-type bovine spongiform encephalopathy in a mouse model." Emerging infectious diseases 13(12): 1887-1894. Bartels, T., J. G. Choi a D. J. Selkoe (2011). "alpha-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation." Nature 477(7362): 107U123. Belay, E. D. (1999). "Transmissible spongiform encephalopathies in humans." Annual review of microbiology 53: 283-314. Bencsik, A., S. Debeer, T. Petit a T. Baron (2009). "Possible Case of Maternal Transmission of Feline Spongiform Encephalopathy in a Captive Cheetah." PloS one 4(9): e6929. Benilova, I. a B. De Strooper (2010). "Prion protein in Alzheimer's pathogenesis: a hot and controversial issue." EMBO molecular medicine 2(8): 289-290. Bianca, M., S. Bianca, I. Vecchio, R. Raffaele, C. Ingegnosi a F. Nicoletti (2003). "Gerstmann-Straussler-Scheinker disease with P102L-V129 mutation: a case with psychiatric manifestations at onset." Annales De Genetique 46(4): 467-469. 65
Bishop, M. T., C. Pennington, C. A. Heath, R. G. Will a R. S. Knight (2009). "PRNP variation in UK sporadic and variant Creutzfeldt Jakob disease highlights genetic risk factors and a novel non-synonymous polymorphism." BMC medical genetics 10: 146. Bons, N., N. Mestre-Frances, P. Belli, F. Cathala, D. C. Gajdusek a P. Brown (1999). "Natural and experimental oral infection of nonhuman primates by bovine spongiform encephalopathy agents." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96(7): 4046-4051. Borges-Alvarez, M., F. Benavente, M. Marquez, J. Barbosa a V. Sanz-Nebot (2014). "Evaluation of non-immunoaffinity methods for isolation of cellular prion protein from bovine brain." Analytical biochemistry 451: 10-17. Brandner, S. (2011). "Diversity of prion diseases: (no) strains attached?" Acta neuropathologica 121(1): 1-4. Brown, D. R., F. Hafiz, L. L. Glasssmith, B. S. Wong, I. M. Jones, C. Clive a S. J. Haswell (2000). "Consequences of manganese replacement of copper for prion protein function and proteinase resistance." The EMBO journal 19(6): 11801186. Brown, P., F. Cathala, R. F. Raubertas, D. C. Gajdusek a P. Castaigne (1987). "The epidemiology of Creutzfeldt-Jakob disease: conclusion of a 15-year investigation in France and review of the world literature." Neurology 37(6): 895-904. Brown, P., M. Cokervann, K. Pomeroy, M. Franko, D. M. Asher, C. J. Gibbs a D. C. Gajdusek (1986). "Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease by Western-Blot Identification of Marker Protein in Human-Brain Tissue." New England Journal of Medicine 314(9): 547-551. Brundin, P., R. Melki a R. Kopito (2010). "Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases." Nature reviews. Molecular cell biology 11(4): 301-307. Bueler, H., A. Aguzzi, A. Sailer, R. A. Greiner, P. Autenried, M. Aguet a C. Weissmann (1993). "Mice devoid of PrP are resistant to scrapie." Cell 73(7): 1339-1347. Bush, A. I. (2000). "Metals and neuroscience." Current Opinion in Chemical Biology 4(2): 184-191. Cai, L., X. K. Li, Y. Song a M. G. Cherian (2005). "Essentiality, toxicology and chelation therapy of zinc and copper." Current medicinal chemistry 12(23): 2753-2763. Campagne, M. V., H. Thibodeaux, N. van Bruggen, B. Cairns, R. Gerlai, J. T. Palmer, S. P. Williams a D. G. Lowe (1999). "Evidence for a protective role of metallothionein-1 in focal cerebral ischemia." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96(22): 12870-12875. Campana, V., D. Sarnataro a C. Zurzolo (2005). "The highways and byways of prion protein trafficking." Trends in Cell Biology 15(2): 102-111. Capellari, S., R. Strammiello, D. Saverioni, H. Kretzschmar a P. Parchi (2011). "Genetic Creutzfeldt-Jakob disease and fatal familial insomnia: insights into phenotypic variability and disease pathogenesis." Acta neuropathologica 121(1): 21-37. Carson, J. A. a A. J. Turner (2002). "Beta-amyloid catabolism: roles for neprilysin (NEP) and other metallopeptidases?" Journal of Neurochemistry 81(1): 1-8. Cashman, N. R., R. Loertscher, J. Nalbantoglu, I. Shaw, R. J. Kascsak, D. C. Bolton a P. E. Bendheim (1990). "Cellular Isoform of the Scrapie Agent Protein Participates in Lymphocyte-Activation." Cell 61(1): 185-192. 66
Caughey, B. W., A. Dong, K. S. Bhat, D. Ernst, S. F. Hayes a W. S. Caughey (1991). "Secondary structure analysis of the scrapie-associated protein PrP 27-30 in water by infrared spectroscopy." Biochemistry 30(31): 7672-7680. Cleary, J. P., D. M. Walsh, J. J. Hofmeister, G. M. Shankar, M. A. Kuskowski, D. J. Selkoe a K. H. Ashe (2005). "Natural oligomers of the amyloid-protein specifically disrupt cognitive function." Nature Neuroscience 8(1): 79-84. Collinge, J. (2001). "Prion diseases of humans and animals: Their causes and molecular basis." Annual Review of Neuroscience 24: 519-550. Collinge, J. a A. R. Clarke (2007). "A general model of prion strains and their pathogenicity." Science 318(5852): 930-936. Collinge, J., M. S. Palmer a A. J. Dryden (1991). "Genetic predisposition to iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease." Lancet 337(8755): 1441-1442. Cornelius, J. R., C. J. Boes, G. Ghearing, J. A. Leavitt a N. Kumar (2009). "Visual symptoms in the Heidenhain variant of Creutzfeldt-Jakob Disease." Journal of neuroimaging : official journal of the American Society of Neuroimaging 19(3): 283-287. Coyle, P., J. C. Philcox, L. C. Carey a A. M. Rofe (2002). "Metallothionein: The multipurpose protein." Cellular and Molecular Life Sciences 59(4): 627-647. Dawson, M., R. C. Moore a S. C. Bishop (2008). "Progress and limits of PrP gene selection policy." Veterinary Research 39(4): 312-316. de Calignon, A., M. Polydoro, M. Suarez-Calvet, C. William, D. H. Adamowicz, K. J. Kopeikina, R. Pitstick, N. Sahara, K. H. Ashe, G. A. Carlson, T. L. Spires-Jones a B. T. Hyman (2012). "Propagation of tau pathology in a model of early Alzheimer's disease." Neuron 73(4): 685-697. Del Bo, R., M. Scarlato, S. Ghezzi, F. Martinelli-Boneschi, C. Fenoglio, G. Galimberti, S. Galbiati, R. Virgilio, D. Galimberti, C. Ferrarese, E. Scarpini, N. Bresolin a G. P. Comi (2006). "Is M129V of PRNP gene associated with Alzheimer's disease? A case-control study and a meta-analysis." Neurobiology of aging 27(5): 770 e771-770 e775. Dermaut, B., E. A. Croes, R. Rademakers, M. Van den Broeck, M. Cruts, A. Hofman, C. M. van Duijn a C. Van Broeckhoven (2003). "PRNP Val129 homozygosity increases risk for early-onset Alzheimer's disease." Annals of neurology 53(3): 409-412. Dodelet, V. C. a N. R. Cashman (1998). "Prion protein expression in human leukocyte differentiation." Blood 91(5): 1556-1561. Dormont, D. (2002). "Prion diseases: pathogenesis and public health concerns." FEBS letters 529(1): 17-21. Ducrot, C., M. Arnold, A. de Koeijer, D. Heim a D. Calavas (2008). "Review on the epidemiology and dynamics of BSE epidemics." Veterinary Research 39(4): 15. Eghiaian, F., J. Grosclaude, S. Lesceu, P. Debey, B. Doublet, E. Treguer, H. Rezaei a M. Knossow (2004). "Insight into the PrPC -> PrPSc conversion from the structures of antibody-bound ovine prion scrapie-susceptibility variants." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101(28): 10254-10259. Eiden, M., C. Hoffmann, A. Balkema-Buschmann, M. Muller, K. Baumgartner a M. H. Groschup (2010). "Biochemical and immunohistochemical characterization of feline spongiform encephalopathy in a German captive cheetah." Journal of General Virology 91: 2874-2883.
67
Fischer, M., T. Rulicke, A. Raeber, A. Sailer, M. Moser, B. Oesch, S. Brandner, A. Aguzzi a C. Weissmann (1996). "Prion protein (PrP) with amino-proximal deletions restoring susceptibility of PrP knockout mice to scrapie." Embo Journal 15(6): 1255-1264. Gajdusek, D. C. a V. Zigas (1957). "Degenerative disease of the central nervous system in New Guinea; the endemic occurrence of kuru in the native population." The New England journal of medicine 257(20): 974-978. Gajdusek, D. C. a V. Zigas (1959). "Kuru; clinical, pathological and epidemiological study of an acute progressive degenerative disease of the central nervous system among natives of the Eastern Highlands of New Guinea." The American journal of medicine 26(3): 442-469. Gajdusek, D. C., V. Zigas a J. Baker (1961). "Studies on kuru. III. Patterns of kuru incidence: demographic and geographic epidemiological analysis." The American journal of tropical medicine and hygiene 10: 599-627. Gambetti, P., I. Cali, S. Notari, Q. Kong, W. Q. Zou a W. K. Surewicz (2011). "Molecular biology and pathology of prion strains in sporadic human prion diseases." Acta neuropathologica 121(1): 79-90. Gambetti, P., Q. Kong, W. Zou, P. Parchi a S. G. Chen (2003). "Sporadic and familial CJD: classification and characterisation." British medical bulletin 66: 213-239. Gavier-Widen, D., M. J. Stack, T. Baron, A. Balachandran a M. Simmons (2005). "Diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies in animals: a review." Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc 17(6): 509527. Green, K. M., J. Castilla, T. S. Seward, D. L. Napier, J. E. Jewell, C. Soto a G. C. Telling (2008). "Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers." PLoS pathogens 4(8): e301256. Haass, C. a D. J. Selkoe (2007). "Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide." Nature reviews. Molecular cell biology 8(2): 101-112. Hainfellner, J. A., J. Wanschitz, K. Jellinger, P. P. Liberski, F. Gullotta a H. Budka (1998). "Coexistence of Alzheimer-type neuropathology in Creutzfeldt-Jakob disease." Acta neuropathologica 96(2): 116-122. Hardy, J. a D. Allsop (1991). "Amyloid Deposition as the Central Event in the Etiology of Alzheimers-Disease." Trends in Pharmacological Sciences 12(10): 383-388. Harris, D. A. (1999). "Cellular biology of prion diseases." Clinical microbiology reviews 12(3): 429-444. Hasnain, S. S., L. M. Murphy, R. W. Strange, J. G. Grossmann, A. R. Clarke, G. S. Jackson a J. Collinge (2001). "XAFS study of the high-affinity copper-binding site of human PrP(91-231) and its low-resolution structure in solution." Journal of molecular biology 311(3): 467-473. Hidalgo, J., M. Aschner, P. Zatta a M. Vasak (2001). "Roles of the metallothionein family of proteins in the central nervous system." Brain research bulletin 55(2): 133-145. Hope, J., L. J. Reekie, N. Hunter, G. Multhaup, K. Beyreuther, H. White, A. C. Scott, M. J. Stack, M. Dawson a G. A. Wells (1988). "Fibrils from brains of cows with new cattle disease contain scrapie-associated protein." Nature 336(6197): 390392. Houston, F., J. D. Foster, A. Chong, N. Hunter a C. J. Bostock (2000). "Transmission of BSE by blood transfusion in sheep." Lancet 356(9234): 999-1000. 68
Huang, Z., S. B. Prusiner a F. E. Cohen (1996). "Structures of prion proteins and conformational models for prion diseases." Current topics in microbiology and immunology 207: 49-67. Checler, F. a B. Vincent (2002). "Alzheimer's and prion diseases: distinct pathologies, common proteolytic denominators." Trends in neurosciences 25(12): 616-620. Chen, S. G., D. B. Teplow, P. Parchi, J. K. Teller, P. Gambetti a L. Autilio-Gambetti (1995). "Truncated forms of the human prion protein in normal brain and in prion diseases." The Journal of biological chemistry 270(32): 19173-19180. Imran, M. a S. Mahmood (2011a). "An overview of animal prion diseases." Virology journal 8: 493. Imran, M. a S. Mahmood (2011b). "An overview of human prion diseases." Virology journal 8: 561-562. Ironside, J. W. (2010). "Variant Creutzfeldt-Jakob disease." Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia 16 Suppl 5: 175-180. Jackson, G. S., I. Murray, L. L. P. Hosszu, N. Gibbs, J. P. Waltho, A. R. Clarke a J. Collinge (2001). "Location and properties of metal-binding sites on the human prion protein." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98(15): 8531-8535. Jansen, C., P. Parchi, S. Capellari, A. J. Vermeij, P. Corrado, F. Baas, R. Strammiello, W. A. van Gool, J. C. van Swieten a A. J. Rozemuller (2010). "Prion protein amyloidosis with divergent phenotype associated with two novel nonsense mutations in PRNP." Acta neuropathologica 119(2): 189-197. Jeffrey, M. a L. Gonzalez (2007). "Classical sheep transmissible spongiform encephalopathies: pathogenesis, pathological phenotypes and clinical disease." Neuropathology and applied neurobiology 33(4): 373-394. Ji, H. F. a H. Y. Zhang (2010). "beta-sheet constitution of prion proteins." Trends in Biochemical Sciences 35(3): 129-134. Johnson, C. J., J. A. Pedersen, R. J. Chappell, D. McKenzie a J. M. Aiken (2007). "Oral transmissibility of prion disease is enhanced by binding to soil particles." PLoS pathogens 3(7): 874-881. Johnson, C. J., K. E. Phillips, P. T. Schramm, D. McKenzie, J. M. Aiken a J. A. Pedersen (2006). "Prions adhere to soil minerals and remain infectious." PLoS pathogens 2(4): 296-302. Kawashima, T., K. Doh-ura, M. Torisu, Y. Uchida, A. Furuta a T. Iwaki (2000). "Differential expression of metallothioneins in human prion diseases." Dementia and Geriatric Cognitive Disorders 11(5): 251-262. Kellett, K. A. a N. M. Hooper (2009). "Prion protein and Alzheimer disease." Prion 3(4): 190-194. Kirkwood, J. K., A. A. Cunningham, G. A. H. Wells, J. W. Wilesmith a J. E. F. Barnett (1993). "Spongiform Encephalopathy in a Herd of Greater Kudu (TragelaphusStrepsiceros) - Epidemiologic Observations." Veterinary Record 133(15): 360364. Kong, Q. Z., J. L. Mills, B. Kundu, X. Y. Li, L. T. Qing, K. Surewicz, I. Cali, S. H. Huang, M. J. Zheng, W. Swietnicki, F. D. Sonnichsen, P. Gambetti a W. K. Surewicz (2013). "Thermodynamic Stabilization of the Folded Domain of Prion Protein Inhibits Prion Infection in Vivo." Cell Reports 4(2): 248-254.
69
Kordower, J. H., T. B. Freeman, B. J. Snow, F. J. G. Vingerhoets, E. J. Mufson, P. R. Sanberg, R. A. Hauser, D. A. Smith, G. M. Nauert, D. P. Perl a C. W. Olanow (1995). "Neuropathological Evidence of Graft-Survival and Striatal Reinnervation after the Transplantation of Fetal Mesencephalic Tissue in a Patient with Parkinsons-Disease." New England Journal of Medicine 332(17): 1118-1124. Kozlowski, H., M. Luczkowski, M. Remelli a D. Valensin (2012). "Copper, zinc and iron in neurodegenerative diseases (Alzheimer's, Parkinson's and prion diseases)." Coordination Chemistry Reviews 256(19-20): 2129-2141. Krakauer, D. C., M. Pagel, T. R. Southwood a P. M. Zanotto (1996). "Phylogenesis of prion protein." Nature 380(6576): 675. Kremer, B., P. Goldberg, S. E. Andrew, J. Theilmann, H. Telenius, J. Zeisler, F. Squitieri, B. Y. Lin, A. Bassett, E. Almqvist, T. D. Bird a M. R. Hayden (1994). "A Worldwide Study of the Huntingtons-Disease Mutation - the Sensitivity and Specificity of Measuring Cag Repeats." New England Journal of Medicine 330(20): 1401-1406. Kretzschmar, H. a J. Tatzelt (2013). "Prion Disease: A Tale of Folds and Strains." Brain pathology 23(3): 321-332. Kretzschmar, H. A., L. E. Stowring, D. Westaway, W. H. Stubblebine, S. B. Prusiner a S. J. Dearmond (1986). "Molecular cloning of a human prion protein cDNA." DNA 5(4): 315-324. Lacor, P. N., M. C. Buniel, L. Chang, S. J. Fernandez, Y. S. Gong, K. L. Viola, M. P. Lambert, P. T. Velasco, E. H. Bigio, C. E. Finch, G. A. Krafft a W. L. Klein (2004). "Synaptic targeting by Alzheimer's-related amyloid beta oligomers." Journal of Neuroscience 24(45): 10191-10200. Lauren, J., D. A. Gimbel, H. B. Nygaard, J. W. Gilbert a S. M. Strittmatter (2009). "Cellular prion protein mediates impairment of synaptic plasticity by amyloidbeta oligomers." Nature 457(7233): 1128-U1184. Legname, G., I. V. Baskakov, H. O. Nguyen, D. Riesner, F. E. Cohen, S. J. DeArmond a S. B. Prusiner (2004). "Synthetic mammalian prions." Science 305(5684): 673676. Lehmann, S. (2002). "Metal ions and prion diseases." Current Opinion in Chemical Biology 6(2): 187-192. Liao, Y. C., R. V. Lebo, G. A. Clawson a E. A. Smuckler (1986). "Human prion protein cDNA: molecular cloning, chromosomal mapping, and biological implications." Science 233(4761): 364-367. Liberski, P. P. a P. Brown (2009). "Kuru: its ramifications after fifty years." Experimental gerontology 44(1-2): 63-69. Lloyd, S. E., S. Mead a J. Collinge (2013). "Genetics of prion diseases." Current opinion in genetics & development 23(3): 345-351. Lopes, P., H. Dyrnesli, N. Lorenzen, D. Otzen a E. E. Ferapontova (2014). "Electrochemical analysis of the fibrillation of Parkinson's disease alphasynuclein." The Analyst 139(4): 749-756. Lugaresi, E., R. Medori, P. Montagna, A. Baruzzi, P. Cortelli, A. Lugaresi, P. Tinuper, M. Zucconi a P. Gambetti (1986). "Fatal familial insomnia and dysautonomia with selective degeneration of thalamic nuclei." The New England journal of medicine 315(16): 997-1003. Luk, K. C., V. Kehm, J. Carroll, B. Zhang, P. O'Brien, J. Q. Trojanowski a V. M. Y. Lee (2012). "Pathological alpha-Synuclein Transmission Initiates Parkinson-like Neurodegeneration in Nontransgenic Mice." Science 338(6109): 949-953. 70
Lukic, A., J. Beck, S. Joiner, J. Fearnley, S. Sturman, S. Brandner, J. D. F. Wadsworth, J. Collinge a S. Mead (2010). "Heterozygosity at Polymorphic Codon 219 in Variant Creutzfeldt-Jakob Disease." Archives of Neurology 67(8): 1021-1023. Maddison, B. C., H. C. Rees, C. A. Baker, M. Taema, S. J. Bellworthy, L. Thorne, L. A. Terry a K. C. Gough (2010). "Prions Are Secreted into the Oral Cavity in Sheep with Preclinical Scrapie." Journal of Infectious Diseases 201(11): 1672-1676. Mange, A., F. Beranger, K. Peoc'h, T. Onodera, Y. Frobert a S. Lehmann (2004). "Alpha- and beta- cleavages of the amino-terminus of the cellular prion protein." Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization 96(2): 125-132. Martin, S., M. Jeffrey, L. Gonzalez, S. Siso, H. W. Reid, P. Steele, M. P. Dagleish, M. J. Stack, M. J. Chaplin a A. Balachandran (2009). "Immunohistochemical and biochemical characteristics of BSE and CWD in experimentally infected European red deer (Cervus elaphus elaphus)." Bmc Veterinary Research 5: 26. Masarik, M., A. Stobiecka, R. Kizek, F. Jelen, Z. Pechan, W. Hoyer, T. M. Jovin, V. Subramaniam a E. Palecek (2004). "Sensitive electrochemical detection of native and aggregated alpha-synuclein protein involved in Parkinson's disease." Electroanalysis 16(13-14): 1172-1181. Mastrianni, J. A., R. Nixon, R. Layzer, G. C. Telling, D. Han, S. J. DeArmond a S. B. Prusiner (1999). "Prion protein conformation in a patient with sporadic fatal insomnia." The New England journal of medicine 340(21): 1630-1638. Mead, S., M. P. H. Stumpf, J. Whitfield, J. A. Beck, M. Poulter, T. Campbell, J. B. Uphill, D. Goldstein, M. Alpers, E. M. C. Fisher a J. Collinge (2003). "Balancing selection at the prion protein gene consistent with prehistoric kurulike epidemics." Science 300(5619): 640-643. Mehlhorn, I., D. Groth, J. Stockel, B. Moffat, D. Reilly, D. Yansura, W. S. Willett, M. Baldwin, R. Fletterick, F. E. Cohen, R. Vandlen, D. Henner a S. B. Prusiner (1996). "High-level expression and characterization of a purified 142-residue polypeptide of the prion protein." Biochemistry 35(17): 5528-5537. Meloni, G., A. Crameri, G. Fritz, P. Davies, D. R. Brown, P. M. Kroneck a M. Vasak (2012). "The catalytic redox activity of prion protein-Cu(II) is controlled by metal exchange with the Zn(II) -thiolate clusters of Zn(7) metallothionein-3." Chembiochem : a European journal of chemical biology 13(9): 1261-1265. Meloni, G. a M. Vasak (2009). "Control of Abnormal Metal-Protein Interactions in Neurodegenerative Disorders by Metallothionein-3." Chimia 63(4): 211-213. Montagna, P., P. Gambetti, P. Cortelli a E. Lugaresi (2003). "Familial and sporadic fatal insomnia." Lancet Neurology 2(3): 167-176. Moore, R. C., F. Q. Xiang, J. Monaghan, D. Han, Z. P. Zhang, L. Edstrom, M. Anvret a S. B. Prusiner (2001). "Huntington disease phenocopy is a familial prion disease." American Journal of Human Genetics 69(6): 1385-1388. Mount, C. a C. Downton (2006). "Alzheimer disease: progress or profit?" Nature Medicine 12(7): 780-784. Nichols, T. A., B. Pulford, A. C. Wyckoff, C. Meyerett, B. Michel, K. Gertig, E. A. Hoover, J. E. Jewell, G. C. Telling a M. D. Zabel (2009). "Detection of proteaseresistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area." Prion 3(3): 171-183. Nitrini, R., S. Rosemberg, M. R. Passos-Bueno, L. S. da Silva, P. Iughetti, M. Papadopoulos, P. M. Carrilho, P. Caramelli, S. Albrecht, M. Zatz a A. LeBlanc (1997). "Familial spongiform encephalopathy associated with a novel prion protein gene mutation." Annals of neurology 42(2): 138-146. 71
Norris, E. H., B. I. Giasson a V. M. Y. Lee (2004). "alpha-Synuclein: Normal function and role in neurodegenerative diseases." Stem Cells in Development and Disease 60: 17-54. Novakofski, J., M. S. Brewer, N. Mateus-Pinilla, J. Killefer a R. H. McCusker (2005). "Prion biology relevant to bovine spongiform encephalopathy." Journal of Animal Science 83(6): 1455-1476. Nozaki, I., T. Hamaguchi, N. Sanjo, M. Noguchi-Shinohara, K. Sakai, Y. Nakamura, T. Sato, T. Kitamoto, H. Mizusawa, F. Moriwaka, Y. Shiga, Y. Kuroiwa, M. Nishizawa, S. Kuzuhara, T. Inuzuka, M. Takeda, S. Kuroda, K. Abe, H. Murai, S. Murayama, J. Tateishi, I. Takumi, S. Shirabe, M. Harada, A. Sadakane a M. Yamada (2010). "Prospective 10-year surveillance of human prion diseases in Japan." Brain : a journal of neurology 133(10): 3043-3057. O'Rourke, K. I., T. R. Spraker, D. Zhuang, J. J. Greenlee, T. E. Gidlewski a A. N. Hamir (2007). "Elk with a long incubation prion disease phenotype have a unique PrPd profile." Neuroreport 18(18): 1935-1938. O'Rourke, K. I., D. Y. Zhuang, T. C. Truscott, H. J. Yan a D. A. Schneider (2011). "Sparse PrPSc accumulation in the placentas of goats with naturally acquired scrapie." Bmc Veterinary Research 7: 216-225. Olanow, C. W. a P. Brundin (2013). "Parkinson's Disease and Alpha Synuclein: Is Parkinson's Disease a Prion-Like Disorder?" Movement Disorders 28(1): 31-40. Orr, H. T. a H. Y. Zoghbi (2007). "Trinucleotide repeat disorders." Annual Review of Neuroscience 30: 575-621. Palmer, M. S., A. J. Dryden, J. T. Hughes a J. Collinge (1991). "Homozygous prion protein genotype predisposes to sporadic Creutzfeldt-Jakob disease." Nature 352(6333): 340-342. Palmiter, R. D., S. D. Findley, T. E. Whitmore a D. M. Durnam (1992). "Mt-Iii, a BrainSpecific Member of the Metallothionein Gene Family." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89(14): 63336337. Pan, K. M., M. Baldwin, J. Nguyen, M. Gasset, A. Serban, D. Groth, I. Mehlhorn, Z. W. Huang, R. J. Fletterick, F. E. Cohen a S. B. Prusiner (1993). "Conversion of Alpha-Helices into Beta-Sheets Features in the Formation of the Scrapie Prion Proteins." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90(23): 10962-10966. Pan, K. M., N. Stahl a S. B. Prusiner (1992). "Purification and Properties of the Cellular Prion Protein from Syrian-Hamster Brain." Protein Science 1(10): 1343-1352. Parchi, P. a P. Gambetti (1995). "Human prion diseases." Current opinion in neurology 8(4): 286-293. Parchi, P., R. Strammiello, A. Giese a H. Kretzschmar (2011). "Phenotypic variability of sporadic human prion disease and its molecular basis: past, present, and future." Acta neuropathologica 121(1): 91-112. Parkin, E. T., N. T. Watt, I. Hussain, E. A. Eckman, C. B. Eckman, J. C. Manson, H. N. Baybutt, A. J. Turner a N. M. Hooper (2007). "Cellular prion protein regulates beta-secretase cleavage of the Alzheimer's amyloid precursor protein." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104(26): 11062-11067. Passet, B., S. Halliez, V. Beringue, H. Laude a J. L. Vilotte (2013). "The prion protein family Looking outside the central nervous system." Prion 7(2): 127-130. Pattison, I. H. a J. N. Jebbett (1971). "Histopathological Similarities between Scrapie and Cuprizone Toxicity in Mice." Nature 230(5289): 115-120. 72
Pauly, P. C. a D. A. Harris (1998). "Copper stimulates endocytosis of the prion protein." Journal of Biological Chemistry 273(50): 33107-33110. Penkowa, M., M. Giralt, P. S. Thomsen, J. Carrasco a J. Hidalgo (2001). "Zinc or copper deficiency-induced impaired inflammatory response to brain trauma may be caused by the concomitant metallothionein changes." Journal of Neurotrauma 18(4): 447-463. Plant, L. D., N. J. Webster, J. P. Boyle, M. Ramsden, D. B. Freir, C. Peers a H. A. Pearson (2006). "Amyloid beta peptide as a physiological modulator of neuronal 'A'-type K+ current." Neurobiology of aging 27(11): 1673-1683. Priano, L., G. Giaccone, M. Mangieri, G. Albani, L. Limido, A. Brioschi, L. Pradotto, L. Orsi, P. Mortara, P. Fociani, A. Mauro a F. Tagliavini (2009). "An atypical case of sporadic fatal insomnia." Journal of Neurology Neurosurgery and Psychiatry 80(8): 924-927. Provini, F., R. Vetrugno, G. Pierangeli, P. Cortelli, G. Rizzo, A. Filla, C. Strisciuglio, R. Gallassi a P. Montagna (2009). "Sleep and temperature rhythms in two sisters with P102L Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) disease." Sleep medicine 10(3): 374-377. Prusiner, S. B. (1982). "Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie." Science 216(4542): 136-144. Prusiner, S. B. (1991). "Molecular biology of prion diseases." Science 252(5012): 15151522. Prusiner, S. B. (1998). "Prions." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95(23): 13363-13383. Prusiner, S. B., M. Fuzi, M. Scott, D. Serban, H. Serban, A. Taraboulos, J. M. Gabriel, G. A. H. Wells, J. W. Wilesmith, R. Bradley, S. J. Dearmond a K. Kristensson (1993). "Immunological and Molecular Biologic Studies of Prion Proteins in Bovine Spongiform Encephalopathy." Journal of Infectious Diseases 167(3): 602-613. Quaife, C. J., S. D. Findley, J. C. Erickson, G. J. Froelick, E. J. Kelly, B. P. Zambrowicz a R. D. Palmiter (1994). "Induction of a New Metallothionein Isoform (Mt-Iv) Occurs during Differentiation of Stratified Squamous Epithelia." Biochemistry 33(23): 7250-7259. Race, B., K. Meade-White, R. Race a B. Chesebro (2009). "Prion infectivity in fat of deer with chronic wasting disease." Journal of virology 83(18): 9608-9610. Ramsden, M., L. D. Plant, N. J. Webster, P. F. T. Vaughan, Z. Henderson a H. A. Pearson (2001). "Differential effects of unaggregated and aggregated amyloid beta protein (1-40) on K+ channel currents in primary cultures of rat cerebellar granule and cortical neurones." Journal of Neurochemistry 79(3): 699-712. Riemenschneider, M., N. Klopp, W. Xiang, S. Wagenpfeil, C. Vollmert, U. Muller, H. Forstl, T. Illig, H. Kretzschmar a A. Kurz (2004). "Prion protein codon 129 polymorphism and risk of Alzheimer disease." Neurology 63(2): 364-366. Ruiperez, V., F. Darios a B. Davletov (2010). "Alpha-synuclein, lipids and Parkinson's disease." Progress in lipid research 49(4): 420-428. Safar, J., H. Wille, V. Itrri, D. Groth, H. Serban, M. Torchia, F. E. Cohen a S. B. Prusiner (1998). "Eight prion strains have PrPSc molecules with different conformations." Nature Medicine 4(10): 1157-1165. Sanghera, N. a T. J. Pinheiro (2002). "Binding of prion protein to lipid membranes and implications for prion conversion." Journal of molecular biology 315(5): 12411256.
73
Seidel, B., A. Thomzig, A. Buschmann, M. H. Groschup, R. Peters, M. Beekes a K. Terytze (2007). "Scrapie Agent (Strain 263K) Can Transmit Disease via the Oral Route after Persistence in Soil over Years." PloS one 2(5): e560123. Shaked, Y., H. Rosenmann, N. Hijazi, M. Halimi a R. Gabizon (2001). "Copper binding to the PrP isoforms: a putative marker of their conformation and function." Journal of virology 75(17): 7872-7874. Shibuya, S., J. Higuchi, R. W. Shin, J. Tateishi a T. Kitamoto (1998). "Protective prion protein polymorphisms against sporadic Creutzfeldt-Jakob disease." Lancet 351(9100): 419. Shyng, S. L., M. T. Huber a D. A. Harris (1993). "A Prion Protein Cycles between the Cell-Surface and an Endocytic Compartment in Cultured Neuroblastoma-Cells." Journal of Biological Chemistry 268(21): 15922-15928. Sigurdson, C. J. (2008). "A prion disease of cervids: chronic wasting disease." Veterinary Research 39(4): 41. Sigurdson, C. J. a M. W. Miller (2003). "Other animal prion diseases." British medical bulletin 66: 199-212. Skovronsky, D. M. a V. M. Lee (2000). "Beta-secretase revealed: starting gate for race to novel therapies for Alzheimer's disease." Trends in Pharmacological Sciences 21(5): 161-163. Sobrova, P., M. Ryvolova, V. Pekarik, J. Hubalek, V. Adam a R. Kizek (2013). "Femtogram Electrochemical Sensing of Prion Proteins Using Quantum Dots." International Journal of Electrochemical Science 8(12): 12466-12475. Spraker, T. R., K. I. O'Rourke, T. Gidlewski, J. G. Powers, J. J. Greenlee a M. A. Wild (2010). "Detection of the Abnormal Isoform of the Prion Protein Associated With Chronic Wasting Disease in the Optic Pathways of the Brain and Retina of Rocky Mountain Elk (Cervus elaphus nelsoni)." Veterinary Pathology 47(3): 536-546. Sweeney, T. a J. P. Hanrahan (2008). "The evidence of associations between prion protein genotype and production, reproduction, and health traits in sheep." Veterinary Research 39(4): 561-570. Takahashi, S. (2012). "Molecular functions of metallothionein and its role in hematological malignancies." Journal of Hematology & Oncology 5: 315-324. Taylor, D. R., N. T. Watt, W. S. S. Perera a N. M. Hooper (2005). "Assigning functions to distinct regions of the N-terminus of the prion protein that are involved in its copper-stimulated, clathrin-dependent endocytosis." Journal of Cell Science 118(21): 5141-5153. Thackray, A. M., L. Hopkins, R. Lockey, J. Spiropoulos a R. Bujdoso (2011). "Emergence of multiple prion strains from single isolates of ovine scrapie." The Journal of general virology 92(Pt 6): 1482-1491. Thackray, A. M., L. Hopkins, R. Lockey, J. Spiropoulos a R. Bujdoso (2012). "Propagation of ovine prions from "poor" transmitter scrapie isolates in ovine PrP transgenic mice." Experimental and molecular pathology 92(1): 167-174. Tiraboschi, P. a F. Tagliavini (2013). "Prion disease: a promising rating scale for prion disease clinical research." Nature reviews. Neurology 9(7): 366-367. Tortosa, R., E. Vidal, C. Costa, E. Alamillo, J. M. Torres, I. Ferrer a M. Pumarola (2008). "Stress response in the central nervous system of a transgenic mouse model of bovine spongiform encephalopathy." Veterinary journal 178(1): 126129.
74
Uchida, Y., K. Takio, K. Titani, Y. Ihara a M. Tomonaga (1991). "The Growth Inhibitory Factor That Is Deficient in the Alzheimers-Disease Brain Is a 68Amino Acid Metallothionein-Like Protein." Neuron 7(2): 337-347. van Keulen, L. J. M., A. Bossers a F. van Zijderveld (2008). "TSE pathogenesis in cattle and sheep." Veterinary Research 39(4): 123-128. Varela-Nallar, L., E. M. Toledo, M. A. Chacon a N. C. Inestrosa (2006). "The functional links between prion protein and copper." Biological Research 39(1): 39-44. Veloso, A. a K. Kerman (2013). "Advances in electrochemical detection for study of neurodegenerative disorders." Analytical and Bioanalytical Chemistry 405(17): 5725-5741. Vincent, B., C. Sunyach, H. D. Orzechowski, P. St George-Hyslop a F. Checler (2009). "p53-Dependent Transcriptional Control of Cellular Prion by Presenilins." Journal of Neuroscience 29(20): 6752-6760. Voigtlander, T., S. Kloppel, P. Birner, C. Jarius, H. Flicker, S. Verghese-Nikolakaki, T. Sklaviadis, M. Guentchev a H. Budka (2001). "Marked increase of neuronal prion protein immunoreactivity in Alzheimer's disease and human prion diseases." Acta neuropathologica 101(5): 417-423. Vulin, J., A. G. Biacabe, G. Cazeau, D. Calavas a T. Baron (2011). "Molecular typing of protease-resistant prion protein in transmissible spongiform encephalopathies of small ruminants, France, 2002-2009." Emerging infectious diseases 17(1): 5563. Wadsworth, J. D. a J. Collinge (2011). "Molecular pathology of human prion disease." Acta neuropathologica 121(1): 69-77. Wadsworth, J. D., A. F. Hill, S. Joiner, G. S. Jackson, A. R. Clarke a J. Collinge (1999). "Strain-specific prion-protein conformation determined by metal ions." Nature cell biology 1(1): 55-59. Walsh, D. M., I. Klyubin, J. V. Fadeeva, W. K. Cullen, R. Anwyl, M. S. Wolfe, M. J. Rowan a D. J. Selkoe (2002). "Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo." Nature 416(6880): 535-539. White, S. N., K. I. O'Rourke, T. Gidlewski, K. C. VerCauteren, M. R. Mousel, G. E. Phillips a T. R. Spraker (2010). "Increased risk of chronic wasting disease in Rocky Mountain elk associated with decreased magnesium and increased manganese in brain tissue." Canadian Journal of Veterinary Research-Revue Canadienne De Recherche Veterinaire 74(1): 50-53. Will, R. G. (2003). "Acquired prion disease: iatrogenic CJD, variant CJD, kuru." British medical bulletin 66: 255-265. Will, R. G., J. W. Ironside, M. Zeidler, S. N. Cousens, K. Estibeiro, A. Alperovitch, S. Poser, M. Pocchiari, A. Hofman a P. G. Smith (1996). "A new variant of Creutzfeldt-Jakob disease in the UK." Lancet 347(9006): 921-925. Wong, B. S., S. G. Chen, M. Colucci, Z. L. Xie, T. Pan, T. Liu, R. L. Li, P. Gambetti, M. S. Sy a D. R. Brown (2001). "Aberrant metal binding by prion protein in human prion disease." Journal of Neurochemistry 78(6): 1400-1408. Yokoyama, T., K. Masujin, M. J. Schmerr, Y. Shu, H. Okada, Y. Iwamaru, M. Imamura, Y. Matsuura, Y. Murayama a S. Mohri (2010). "Intraspecies prion transmission results in selection of sheep scrapie strains." PloS one 5(11): e15450. Yokoyama, T. a S. Mohri (2008). "Prion diseases and emerging prion diseases." Current medicinal chemistry 15(9): 912-916. 75
Yuan, J., M. Kinter, J. McGeehan, G. Perry, G. Kneale, P. Gambetti a W. Q. Zou (2005). "Concealment of epitope by reduction and alkylation in prion protein." Biochemical and biophysical research communications 326(3): 652-659. Zahn, R., A. Z. Liu, T. Luhrs, R. Riek, C. von Schroetter, F. L. Garcia, M. Billeter, L. Calzolai, G. Wider a K. Wuthrich (2000). "NMR solution structure of the human prion protein." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97(1): 145-150. Zhou, Y. L., J. Wang, L. T. Liu, R. R. Wang, X. H. Lai a M. T. Xu (2013). "Interaction between Amyloid-beta Peptide and Heme Probed by Electrochemistry and Atomic Force Microscopy." Acs Chemical Neuroscience 4(4): 535-539.
76
8
SEZNAM OBRÁZKŮ
Obrázek 1: A) Schéma struktury přirozeného buněčného prionového proteinu (PrPC); B) struktury pozměněného infekčního prionu (PrPSc). Převzato z (Huang et al., 1996). Obrázek 2: Schéma přirozeného internalizačního mechanismu buněčného prionového proteinu (PrPC). Upraveno dle (Taylor et al., 2005). V první fázi je PrPC ukotven v plazmatické membráně lipidového raftu pomocí glykosylfosfatidylinositolové kotvy (GPI-kotvy) a současně se váže na protein či lipid vázaný k raftu svým N-koncem (aminokyselinové zbytky 23-90, označeny červeně). Na Cu2+-vazebné oktapeptidové repetice (označeny modře) se v další fázi vážou ionty mědi, čímž je změněna konformace PrPC a ten uvolňuje svou vazbu s proteinem či lipidem na raftu a začne se bočně posouvat do oblasti mimo lipidový raft. PrPC se dále posunuje po plazmatické membráně, až do místa klathrinové jamky, kde se jeho N-konec naváže na transmembránový protein, který je spojen s adaptorovým proteinem AP-2. Tímto začíná endocytický cyklus pohlcování PrPC skrz klathrinovou jamku. Obrázek 3: Modely vzniku infekčních prionů. Převzato a upraveno dle (Aguzzi et al., 2001). A) Matricový model předpokládá, že přirozené změně buněčného prionového proteinu (PrPC) na patologickou formu prionového proteinu (PrPSc) brání energetická bariéra. Pokud je však tato bariéra překonána, dochází k tvorbě heterodimerů PrPC + PrPSc. Tyto heterodimery se pak přeměňují v homodimery PrPSc. Tyto homodimery pak agregují a tvoří amyloid. B) Nukleačně-polymerizační model je postaven na existenci termodynamické rovnováhy mezi oběma formami (PrPC a PrPSc). V tomto případě se při změně termodynamické rovnováhy tvoří jádra PrPSc, ke kterým se přidávají další monomerní PrPSc a vznikají infekční jádra. Shlukováním těchto jader k sobě vzniká amyloid, který se pak může znovu dělit na více infekčních jader. Obrázek 4: Chronologie TSE. Upraveno dle (Brown et al., 1987). CWD - Chronické chřadnutí jelenovitých, TME - Přenosná encefalopatie norků, BSE - Bovinní spongiformní encefalopatie, vCJD -
Variantní Creutzfeld-Jakobova nemoc, CJD -
Creutzfeld-Jakobova nemoc, GSS - Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrom, FFI Fatální familiární insomnie. Šipky ukazují spojení (či předpokládaná spojení) mezi jednotlivými chorobami, přičemž velmi důležitý je rok 1959, kdy bylo odhaleno spojení mezi Kuru, scrapií a CJD.
77
Obrázek 5: Produkce β-amyloidu a patogeneze Alzheimerovy choroby. Upraveno dle (Skovronsky a Lee, 2000). β- a γ- sekretáza štěpí prekurzorový protein amyloidu (APP) a tvoří se amyloid- β (Aβ), který může v mozku agregovat a tvořit senilní plaky. Senilní plaky poté spustí neobjasněnou kaskádu patologických změn, která ústí ve ztrátu neuronů a demenci. Obrázek 6: Formování α-synukleinových fibril při Parkinsonově chorobě (PD). Upraveno dle (Ruiperez et al., 2010). Výskyt α-synukleinu v mozku za normálních podmínek a tvorba fibril při PD. Obrázek 7: Schéma vazby esenciálních kovů lidským buněčným prionovým proteinem (PrPC). Převzato a upraveno dle (Lehmann, 2002). Polypeptidový řetězec PrPC (zelená) je zakotven do plazmatické membrány pomocí glykosylfosfatidylinositolové (GPI) kotvy (hnědá). N-konec molekuly váže ionty kovů, přičemž měď je vázána, pokud je Ckonec molekuly globulární a jsou k němu připojeny dva N-glykany (fialová). Obrázek 8: Vztahy mezi buněčným prionovým proteinem (PrPC), patologickou formou prionového proteinu (PrPSc) a kovovými ionty. Upraveno dle (Lehmann, 2002). Fyziologická forma PrPC – zde označená jako PrPC-Cu je protein obsahující měď. Tento protein je senzitivní k proteázám a je rozpustný v nedenaturačních detergentech. A: Po kontaktu s kovy (měď, mangan, zinek) vzniká abnormální molekula PrP C°-Cu/Mn/Zn. Tato molekula získává vlastnosti PrPSc, jako je nerozpustnost či částečná rezistence k proteázám, ale zdá se, že není infekční. B:Klasická molekula PrPSc může být vytvořena přímou cestou z PrPC-Cu a zde je pojmenována PrPSc-Cu. C: Změna konformace pravděpodobně mění i afinitu ke kovovým iontům, což vede k tvorbě molekul s různým obsahem kovů PrPSc-Cu/Mn/Zn. D: Alternativní cesta vzniku PrPScCu/Mn/Zn přes abnormální molekulu PrPC°-Cu/Mn/Zn tvořící střední článek přeměny. Obrázek 9: Záznam elektrochemického signálu, který tvoří pík zobrazující závislost proudu (nA) na napětí (V). Obrázek 10: Postup adsorptivní přenosové techniky. R- referentní elektroda, Pr – pracovní elektroda, Po – pomocná elektroda. Zleva – na sklíčko je nanesen vzorek o objemu 5 μl, poté je do něj ponořena pracovní elektroda a dochází k akumulaci vzorku na rtuťovou kapku. V dalším kroku je elektroda omyta v destilované vodě pro odplavení
78
nenavázaných molekul a poslední fází je ponoření elektrod do elektrolytu v měřící nádobce a samotné měření. Obrázek 11: Optimalizace doby kultivace transformovaných bakterií s IPTG (isopropyl-thio-beta-galaktosidázou) pomocí SDS-PAGE (sodiumdodecylsulfátové polyakrylamidové elektroforézy). Červená elipsa značí výskyt optimálního množství prionového proteinu o velikosti cca 20 kDa. Barvení gelu Coomassie brilliant blue. Standart: Precision Plus Protein Dual Xtra Standarts (BIO-RAD). Obrázek 12: Ověření přítomnosti prionového proteinu v transformovaných buňkách E. coli pomocí western blotu a dot-blotu. Obrázek 13: Přítomnost buněčného prionového proteinu (PrPC) v izolovaných frakcích. Červené elipsy značí výskyt prionového proteinu (velikost cca 20 kDa). Barvení gelu Coomassie brilliant blue a barvení stříbrem. Standard: Precision Plus Protein Dual Xtra Standarts (BIO-RAD). Obrázek 14: Spektrum MALDI-TOF pro izolovaný lidský prionový protein (PrPC). Obrázek 15: Voltamogram elektrochemické detekce lidského buněčného prionového proteinu (PrPC). Měřeno metodou diferenční pulzní voltametrie v acetátovém pufru pH 5. Elektrochemický signál odpovídá měřené koncentraci PrPC (koncentrace: 250, 125, 62, 31 a 15 μg/ml) a závislost píků je lineární (R2 vyšší než 0,9). Obrázek 16: A) Voltamogram mědi, koncentrace Cu: 100, 50, 25, 12, 6 a 3 μg/ml; B) voltamogram interakce mědi a buněčného prionového proteinu (PrPC), koncentrace PrPC: 100 μg/ml, koncentrace Cu: 100, 50, 25, 12, 6, 3 μg/ml; C) graf srovnání velikosti píku mědi a píku interakce PrPC a mědi (Cu+PrP). Elektrochemická detekce probíhala pomocí diferenční pulzní voltametrie (DPV) v acetátovém pufru pH 5. Obrázek 17: Graf závislosti výšky píku [nA] interakcí buněčného prionového proteinu (PrPC), mědi a zinku. Zleva: interakce PrPC a zinku (Pík Zn+PrP I), interakce PrPC a mědi (Pík Cu+PrP I a Cu+PrP II). Obrázek 18: A) Voltamogram zinku, koncentrace Zn: 100, 50, 25, 12, 6 a 3 μg/ml; B) voltamogram interakce zinku a buněčného prionového proteinu (PrPC), koncentrace PrPC: 100 μg/ml, koncentrace Zn: 100, 50, 25, 12, 6, 3 μg/ml; C) graf srovnání velikosti
79
píku zinku a píku interakce PrPC a zinku (Zn+PrP). Elektrochemická detekce probíhala pomocí diferenční pulzní voltametrie (DPV) v acetátovém pufru pH 5. Obrázek 19: Elektrochemická detekce a kalibrační křivky: A) buněčného prionového proteinu (PrPC), koncentrace: 250, 125, 62, 31 a 15 μg/ml; B) metalothioneinu (MT), koncentrace: 16, 8, 4, 2 a 1 μg/ml; C) interakce PrPC (koncentrace100 μg/ml) a MT (16, 8, 4, 2, 1, 0,5 a 0,25 μg/ml); D) interakce MT (8 μg/ml) a PrPC (250, 125, 62,5, 31,25, 15,125 μg/ml). Měřeno pomocí metody diferenční pulzní voltametrie ve fosfátovém pufru pH 7. Obrázek 20: Nákres předpokládaných interakcí mezi buněčným prionovým proteinem (PrPC) a metalothioneinem (MT) na povrchu rtuťové elektrody. Na levé straně obrázku můžeme vidět schéma interakce konstantní koncentrace PrPC se vzrůstající koncentrací MT na povrchu rtuťové kapkové elektrody. Na pravé straně obrázku jen pak možné pozorovat schéma interakce MT o konstantní koncentraci se vzrůstající koncentrací PrPC. Při vysoké koncentraci PrPC tvoří MT tetramery, které do sebe molekulu PrPC uzavírají a charakter elektrochemického signálu se výrazně mění. Obrázek 21: Ověření identity vzorků pomocí western blotu. Dráha č. 1 – hmotnostní standard, dráha č. 2, 3, 4 – vzorky genotypu Tga20 (myš exprimující PrP v nadbytku), dráha č. 5, 6, 7 – vzorky genotypu C57BL/6 (myš divokého typu, normální exprese PrP), dráha 8, 9, 10 – vzorky genotypu PrP-/- (myš postrádající prionový protein). Parametry SDS-ELFO: 180V/75 minut. Parametry western blotu: 45mA/60 minut. Primární protilátka Sha31, ředění 1:2000, 60 min. Sekundární protilátka avidinperoxidáza, ředění 1:2000, 60 min. Vizualizace pomocí ECL: čas expozice 87 sekund. Obrázek 22: Sledování hladiny metalothioneinu-III (MT-III) v neinfekčních myších mozkových tkáních (dot-blot). Vzorky na každé z membrán zleva: Tga20 (myš exprimující PrP v nadbytku), C57BL/6 (myš s normální expresí PrP), PrP-/- (myš postrádající prionový protein). Objem vzorků: horní linie 1 µl a spodní linie 3 µl. Parametry dot-blot: primární protilátka anti-MT-III, ředění 1:2000, 1:1000 a 1:500; 60 min. Sekundární protilátka anti–rabbit IgG, ředění 1:2000; 60 min. Vizualizace pomocí ECL: čas expozice 120 sekund. Obrázek 23: Sledování hladiny MT-III v neinfekčních mozkových tkáních (western blot). Dráha č. 1 – hmotnostní standard, dráha č. 2, 3, 4 – vzorky genotypu Tga20 (myš 80
exprimující PrP v nadbytku), dráha č. 5, 6, 7 – vzorky genotypu C57BL/6 (myš divokého typu, normální exprese PrP), dráha 8, 9, 10 – vzorky genotypu PrP-/- (myš postrádající prionový protein). Parametry SDS-ELFO: 180V/75 minut. Parametry western blotu: 45mA/60 minut. Primární protilátka anti-MT-III, ředění 1:1000, 60 min. Sekundární protilátka anti-rabbit IgG, ředění 1:2000, 60 min. Vizualizace pomocí ECL: čas expozice 83 sekund. Obrázek 24: Sledování hladiny metalothioneinu-III (MT-III) v prion-infikovaných myších mozkových tkáních. Dráha č. 1 – hmotnostní standard, dráha č. 2, 3 – vzorky genotypu CD1 (myš divokého typu, normální exprese PrP), dráha č. 4, 5 – vzorky genotypu C57 (myš divokého typu, normální exprese PrP), dráha 6, 7 – vzorky genotypu RML (prion-infekční genotyp myši), dráha č. 8, 9 – vzorky genotypu ME7 (prion-infekční genotyp myši). Parametry SDS-ELFO: 180V/57 minut. Parametry western blotu: 45mA/60 minut. Primární protilátka anti-MT-III, ředění 1:1000, 60 min. Sekundární protilátka anti-rabbit IgG, ředění 1:2000, 60 min. Vizualizace pomocí ECL: čas expozice 120 sekund. Obrázek 25: Sledování genotypově specifických změn hladiny metalothioneinu-III (MT-III) v prion-infikovaných myších mozkových tkáních. Horní část: Dráha č. 1 – hmotnostní standard, dráha č. 2 – vzorek genotypu CD1 (myš divokého typu, normální exprese PrP), dráha č. 3, 4 – vzorky genotypu RML (prion-infekční genotyp myši), dráha č. 5, 6 – vzorky genotypu 470-87A (prion-infekční genotyp myši), dráha č. 7, 8 – vzorky genotypu 28-ME7 (prion-infekční genotyp myši), dráha č. 9, 10 – vzorky genotypu 37-221C (prion-infekční genotyp myši). Dolní část: Dráha č. 1 – hmotnostní standard, dráha č. 2 – vzorek genotypu CD1 (myš divokého typu, normální exprese PrP), dráha č. 3, 4 – vzorky genotypu 46-ME7 (prion-infekční genotyp myši), dráha č. 5, 6 – vzorky genotypu 475-87A (prion-infekční genotyp myši), dráha č. 7, 8 – vzorky genotypu 65-221C (prion-infekční genotyp myši), dráha č. 9, 10 – vzorky genotypu 634-221C-variant (prion-infekční genotyp myši). Parametry SDS-ELFO: 180V/55 minut. Parametry western blotu: 45mA/60 minut. Primární protilátka anti-MTIII, ředění 1:1000, 60 min. Sekundární protilátka anti-rabbit IgG, ředění 1:2000, 60 min. Vizualizace pomocí ECL: čas expozice 120 sekund.
81
9
SEZNAM ZKRATEK AD
Alzheimerova choroba
AdTS
adsorptivní přenosová technika
Aβ
amyloid beta
AICD
amyloidní intracelulární doména
APP
amyloidní prekurzorový protein
BACE1
β-sekretáza
BSA
bovinní sérový albumin
BSE
bovinní spongiformní encefalopatie
CJD
Creutzfeldt-Jakobova choroba
CNS
centrální nervová soustava
CWD
chronické chřadnutí jelenovitých
DPV
diferenční pulzní voltametrie
E. coli
Escherichia coli
ECL
zesílená chemiluminiscence
ER
endoplazmatické retikulum
EUE
exotická spongiformní encefalopatie kopytnatců
fCJD
familiární Creutzfeldt-Jakobova nemoc
FFI
fatální familiární insomnie
FSE
spongiformní encefalopatie koček
gCJD
genetická Creutzfeldt-Jakobova nemoc
GPI
glykosylfosfatidylinositol
GSS
Gertsmann-Straussler-Scheinker syndrom 82
HD
Huntingtonova choroba
hGH
lidský růstový hormon
HMDE
rtuťová kapková elektroda
hPrP
lidský prionový protein
HRP
avidin peroxidáza
iCJD
iatrogenní Creutzfeldt-Jakobova nemoc
IPTG
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid
MALDI-TOF
ionizace laserem za přítomnosti matrice s detektorem doby letu
MBM
masokostní moučka
MT
metalothionein
NHP
onemocnění nehumánních primátů
PD
Parkinsonova choroba
PRNP
gen kódující prionový protein
PrP
prionový protein (obecně)
PrPC
buněčný prionový protein
PrPSc
patologická (infekční) forma prionového proteinu
PVDF
polyvinyliden fluorid
sCJD
sporadická Creutzfeldt-Jakobova nemoc
SDS
sodium dodecyl sulfát
SDS-PAGE
sodium dodecyl sulfátová polyakrylamidová gelová elektroforéza
sFI
sporadická fatální insomnie
SOB
super optimální médium
SOD
superoxid dismutáza 83
TME
přenosná encefalopatie norků
TSE
transmisivní spongiformní encefalopatie
vCJD
variantní Creutzfeldt-Jakobova nemoc
VPSPr
variabilní proteáza-senzitivní prionpatie
84
