Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie

Stanovení fenolových látek a antioxidační aktivity v pravých a bylinných komerčních čajích Diplomová práce

Vedoucí práce: doc. RNDr. Ing. Pavel Stratil, Ph.D

Brno 2011

Vypracovala: Bc. Štěpánka Mrzenová

Zadání dip. práce

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem diplomovou práci na téma Stanovení fenolových látek a antioxidační aktivity v pravých a bylinných komerčních čajích vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne……………………………………… podpis diplomanta………………………

PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala vedoucímu diplomové práce doc. RNDr. Ing. Pavlovi Stratilovi, Ph.D. za odborné vedení, poskytnuté informace a rady při zpracování diplomové práce. Dále bych chtěla poděkovat rodičům za podporu při studiu.

ABSTRAKT Diplomová práce je zaměřena na stanovení fenolových látek a celkové antioxidační aktivity v různých druzích čajů. Analýza byla provedena v extraktech metanol + voda (1:1) a vodných výluzích z 30 druhů čajů, z toho 5 druhů černých, 10 druhů zelených a 15 druhů bylinných čajů. Ke stanovení obsahu fenolových látek byla pouţita metoda FCM (s Folin-Ciocalteu reagentem) a ke stanovení celkové antioxidační aktivity metoda TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). Obsah fenolových látek byl v rozmezí u černých čajů 0,297 – 0,813 mmol/g suché hmoty (SH), u zelených čajů 0,281 – 1,046 mmol/g SH, a u bylinných čajů 0,082 – 0,712 mmol/g SH (ekvivalent gallové kyseliny), celková antioxidační aktivita byla v rozmezí u černých čajů 0,984 – 2,588 mmol/g SH, u zelených čajů 0,832 – 3,669 mmol/g SH, a u bylinných čajů 0,058 – 2,487 mmol/g SH (ekvivalent Troloxu). Koncentrace fenolových látek u většiny analyzovaných druhů čajů korelují s antioxidační aktivitou. Antioxidační aktivita látek obsaţených v čajích, spolu s jinými farmakologickými účinky, je významnou vlastností z hlediska zdravotního účinku. Porovnání výsledků s dostupnými publikovanými údaji ukazuje na věrohodnost výsledků. Klíčová slova: volné radikály, antioxidanty, fenolové látky, čaj

ABSTRACT The diploma thesis is focused on determination of phenolic compounds and the total antioxidant activity in various types of tea. The analysis was carried out in extracts of methanol + water (1:1) and in aqueous extracts of thirty types of tea, namely 5 types of black tea, 10 types of green tea and 15 types of herbal tea. The FCM method (FolinCiocalteu reagent) was applied for determination of the amount of phenolic compounds and the TEAC method (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) was applied for determination of the total antioxidant activity. The amount of phenolic compounds in the types of black tea was between 0,297 – 0,813 mmol/g dry matter, between 0,281 – 1,046 mmol/g dry matter in the types of green tea, and in the types of herbal tea it was 0,082 – 0,712 mmol/g dry matter (gallic acid equivalent). The total antioxidant activity in the types of black tea was between 0,984 – 2,588 mmol/g dry matter, between 0,832 – 3,669 mmol/g in the types of green tea, and between 0,058 – 2,487 mmol/g dry matter in the types of herbal tea (Trolox equivalent). The

concentration of phenolic compounds in the most of analysed types of tea correlates with the antioxidant activity. Antioxidant activity of the substances contained in tea along with other pharmacological effects is the important property due to their health effect. The comparison of the results with available published data indicates their credibility.

Keywords: free radicals, antioxidants, phenolic compounds, tea

OBSAH 1

ÚVOD

2

CÍL PRÁCE

11

3

LITERÁRNÍ PŘEHLED

12

3.1

Volné radikály

12

3.1.1

Příčina vzniku volných radikálů v lidském organismu

13

3.1.2

Vliv radikálů na ţivý organismus

14

3.2

Antioxidanty

15

3.2.1

Klasifikace antioxidantů

15

3.2.2

Resorpce a metabolismus

18

3.2.3

Mechanismus působení

19

3.2.4

Antioxidační účinek

20

3.3

Rostlinné fenoly

21

3.3.1

Klasifikace

21

3.3.2

Fenolové sloučeniny přítomné v pravých a bylinných čajích

26

3.3.3

Farmakologický význam

29

3.4

4

9

3.3.3.1

Oběhový systém

29

3.3.3.2

Trávicí systém

30

3.3.3.3

Nádorová onemocnění

32

Jiné biologicky nebo farmakologicky působící látky v čaji

35

3.4.1

Alkaloidy

35

3.4.2

Vitaminy

37

3.4.3

Minerální látky a stopové prvky

38

3.4.4

Silice

39

3.4.5

Saponiny

39

MATERIÁL A METODY

40

4.1

Chemikálie a reagenty

41

4.2

Přístroje

41

4.3

Software

42

4.4

Analyzované vzorky

42

4.4.1

Příprava vzorků

43

4.4.2

Extrakce celkových fenolových látek z rostlinných materiálů

43

4.5

Stanovení fenolových látek

44

4.6

Stanovení antioxidační aktivity

45

5

VÝSLEDKY

47

6

DISKUZE

61

7

ZÁVĚR

63

8

POUŢITÍ LITERATURA

65

9

SEZNAM OBRÁZKŮ, TABULEK A GRAFŮ

70

10 PŘÍLOHY

72

1

ÚVOD Sloţení potravy má významný vliv na lidské zdraví. Obsahové sloţky mohou

ovlivňovat celou řadu procesů souvisejících s rychlostí stárnutí nebo vznikem nemocí. V posledních letech se dostávají stále více do podvědomí veřejnosti poznatky o moţnosti tyto procesy oddálit nebo zpomalit. V minulosti se obvykle pro dobré zdraví zjednodušeně doporučovalo „jíst česnek a pít čerstvou citronovou šťávu“. Dnes se však objevují nové vědecké poznatky o mnoha různých biologicky účinných látkách v rostlinách, které chrání proti vzniku tzv. degenerativních onemocnění a jiným zdravotním problémům (Ortembergová, 2002). Jednou ze sloţek lidské potravy s účinnými látkami na lidské zdraví jsou čaje. Historie vyuţití čaje jako léčivého prostředku se začala psát jiţ v prvních dvou století před naším letopočtem v Číně v knize čínské medicíny. Na konci dvanáctého století se opět zabývají lékaři, farmakologové a biochemici léčivými účinky čaje, hlavně se zaměřením k nádorovým onemocněním. Poznatky o prospěšnosti pití čaje mají dvojí původ. Prvním zdrojem jsou mnohaleté empirické zkušenosti s pitím čaje a jeho příznivými účinky při léčbě určitých zdravotních problémů, které vedly k zařazení čaje mezi ostatní rostlinné léky ve staré knize čínské medicíny. Druhým zdrojem poznání příznivých účinků čaje jsou moderní epidemiologické, medicínské a biochemické poznatky a metody umoţňující sledování příznivých účinků čaje a jeho obsahových látek aţ na úroveň ovlivňování metabolických dějů. Jestliţe káva převaţuje mezi nápoji v západním světě a v posledních letech i v Británii, známou velkou oblibou pití čaje, pak čaj je na prvním místě v zemích východních. Uvádí se, ţe díky milionům ctitelů čaje je po čisté vodě čaj nejrozšířenějším nápojem na světě. Pití čaje je dnes pro mnoho lidí pravidelnou součástí jejich denní činnosti (Krejčí, 2000). Čaj je obvykle mnohem více neţ pouhý nápoj. V průběhu staletí se stal nedílnou součástí ţivota a zvyků asijských zemí, a to nejen součást gastronomie, ale především jako součást prevence a léčby nemocí. Avšak stejně jako ostatní potraviny asijského původu, zůstává zelený čaj v západních zemích dosud bohuţel nedoceněn. To, podle názoru mnohých odborníků, můţe být jednou z příčin tak propastného rozdílu ve výskytu rakoviny mezi Asiaty a obyvateli západního světa. U pravého čaje se pouţívají dvě odlišné formy, zelený (nefermentovaný) a černý čaj (fermentovaný). Obě formy čaje mají sice stejný původ, ale naprosto odlišné chemické vlastnosti. Během fermentace, jedné z výrobních etap černého čaje, dochází oxidací

9

a působením enzymů k významným změnám fenolových látek obsaţených v čajových lístcích (Kadlec, 2002). Při jejich oxidaci vznikají černé pigmenty, theaflaviny. Tato chemická změna fenolových látek fermentací sniţuje protinádorový účinek čaje, protoţe právě polyfenoly při ní přicházejí prakticky o veškerý kancerostatický potenciál (Béliveau, Gingras, 2008). Čerstvé lístky čajovníku obsahují průměrně 77 % vody a 23 % sušiny. Sušinu tvoří 17 % bílkovin, 4 % sacharidů, 22 % polyfenolů, 6,5 % pektinů, tuky, aminokyseliny a 27 % vlákniny. Z vitaminů jsou zastoupeny hlavně vitaminy skupiny B (B1, B2), vitaminy C, provitamin beta-karoten a vitamin K. Z minerálních látek a stopových prvků je obsaţen fosfor, draslík, vápník, hořčík, zinek, ţelezo, měď, fluór, nikl, mangan aj. Čajové lístky obsahují také mnoho sloučenin s vysokou biologickou hodnotou např. katechiny, organické kyseliny a třísloviny (Valíček, 2007; Lübeck, 1998). Fenolové látky patří mezi významné rostlinné látky, po chemické stránce velmi heterogenní. Jejich mechanismus biochemického účinku na lidský organismus můţe být velmi různý a mnohdy je ještě neznámý. Výsledným efektem jejich biologického účinku můţe být antioxidační, protinádorové, protizánětlivé, anticholesterolemické a jiné působení. Nejvýznamnějším účinkem fenolových látek je antioxidační, který můţe být principem i ostatních uváděných účinků. Výzkumy ukazují, ţe pravidelný a dostatečný příjem látek s antioxidačním účinkem můţe významně sniţovat škodlivé působení kyslíkových radikálů a jiných reaktivních molekul vznikajících v lidském organismu a tím ovlivňovat zdraví a dlouhověkost (Packer et al., 1999). Stanovení obsahu polyfenolů v potravinách je důleţité, protoţe mají nejen vliv na chuť a barvu potravin, ale především mají klíčový význam pro hodnocení antioxidační aktivity a biologické prospěšnosti potravin (Kong et al., 2001).

10

2

CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce je shromáţdit dostupné informace o fenolových

látkách, antioxidační aktivitě a jiných biologicky nebo farmakologicky působících látkách v čajích z vědeckých publikací a jiných dostupných odborných literárních zdrojů. Provést analýzy fenolových látek a celkové antioxidační aktivity 30 druhů čajů (5 černých, 10 zelených a 15 bylinných) komerčně prodávaných v obchodní síti. Ke stanovení celkového obsahu fenolových látek byla pouţita metoda FCM (s FolinCiocalteu regentem) a ke stanovení antioxidační aktivity metoda TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). Porovnat stanovené hodnoty obsahu fenolových látek a antioxidační aktivity (číselně a graficky) u extraktů (metanol + voda, 1:1 obj.) a výluhů (horká voda) 30ti druhů čajů a zjistit rozdíly mezi pravými čaji (Camelie sinensis L) fermentovanými a nefermentovanými a bylinnými čaji. Orientačně porovnat zdravotní přínos obsaţených fenolových látek a celkové antioxidační aktivity vedle jiných obsahových látek, obvykle se specifickým farmakologickým účinkem pro jednotlivé byliny. Provést porovnání výsledků s publikovanými údaji.

11

3

LITERÁRNÍ PŘEHLED

3.1 Volné radikály Volné radikály (např. ROO ; RO ; OH ) jsou atomy nebo molekuly, které mají jeden nebo více nepárových elektronů. Vysoce reaktivními je činí snaha doplnit nepárový elektron na dvojici získáním elektronu z jiného atomů nebo sloučeniny (Murray, 1998). Radikály pocházejí z vnějšího prostředí, např. potravy (exogenní), nebo vznikají uvnitř organismu při některých metabolických reakcích (endogenní). Vznikají nejrůznějšími mechanismy (Ortembergová, 2002), např. v potravinách nejčastěji během tvorby peroxidů mastných kyselin při autooxidaci (tj. oxidaci vzdušným kyslíkem). Jedná se o soubor dějů, při kterém dochází ke vzniku radikálů na atomech uhlíku sousedících s dvojnými vazbami a následnou adice kyslíku na vzniklý radikál (Kalač, 2001). Autooxidace probíhá ve třech stupních, zjednodušený mechanismus lze vyjádřit takto: 1. Iniciace (zahájení): 2. Propagace (šíření):

R-H

R

lipid

volný radikál lipidu

tvorba peroxylového radikálu R + O2

ROO

tvorba hydroperoxidu ROO + RH

ROOH + R , atd.

3. Terminace (ukončení): ROO + ROO ROO + R R +R

ROOR + O2 ROOR

RR

Prvním stupněm reakce (iniciace) je vznik volného vodíkového radikálu (H ) a volného radikálu mastné kyseliny (R ) homolytickým štěpením kovalentní vazby C-H uhlovodíkového řetězce dodáním energie (teplem nebo světlem). Ke štěpení dochází rovněţ reakcí s jiným volným radikálem nebo reakcí s kovy s přechodnou valencí, které se redukují přijetím jednoho elektronu (Velíšek, 2002). Patří mezi ně zejména ţelezo (ionty

Fe3+,

Fe2+,

ţelezo

koordinační

vazbou

vázané

v

hemových

barvivech) (Kalač, 2001), měď, mangan, nikl, kobalt a chrom. Kovy se jako volné ionty, nedisociované soli nebo některé komplexy uplatňují jako katalyzátory přímo nebo nepřímo v iniciační, propagační i terminační fázi autooxidační reakce. 12

M(n+1)+ + R-H → Mn+ + R + H+ Vzniklý volný radikál mastné kyseliny (R ) je velmi reaktivní a snadno reaguje s molekulou kyslíku, která je biradikálem. Tím vznikne peroxylový radikál (R-O-O ), který je opět velmi reaktivní a odštěpí atom vodíku z další molekuly nenasycené mastné kyseliny. Vznikne hydroperoxid (R-O-OH) a další volný radikál mastné kyseliny (R ). Toto druhé stadium autooxidační reakce se nazývá propagace. Sled uvedených dvou reakcí se můţe opakovat mnohokrát. Byly pozorovány opakované reakce o více neţ tisících následných propagacích. Proto se autooxidaci říká řetězová reakce (Velíšek, 2002), poskytující neustálý přísun volných radikálů, vedoucích k další peroxidaci, která můţe mít ničivé účinky (Murray, 1998). Pokud je koncentrace volných radikálů v reakčním systému dosti vysoká, je pravděpodobné, ţe dva volné radikály spolu reagují za vzniku neradikálového, poměrně stabilního produktu a tím je reakční řetězec ukončen. Toto třetí stadium se nazývá terminace (Velíšek, 2002). Další moţný způsob přerušení řetězové reakce spočívá v reakci volného radikálu s molekulou, která je schopna poskytnout vodíkový radikál (H ) a přitom vytvořit stabilní radikál. Tyto sloučeniny jsou označovány jako antioxidanty. 3.1.1 Příčina vzniku volných radikálů v lidském organismu Volné radikály vznikají v lidském organismu při různých metabolických procesech: Vznik některých volných radikálů je fyziologický a pro organismus prospěšný, vznik jiných je v podstatě jen škodlivý. Jedním z největších zdrojů volných radikálů je únik volných radikálů z dýchacího řetězce lokalizovaného v membráně mitochondrií a to přibliţně z 2 – 3 % vydýchaného kyslíku. Navíc kaţdé poškození buněk (buněčných membrán) a to ať mechanické, tepelně nebo chemické, zvyšuje únik kyslíkových radikálů z mitochondrií. Dalším významným zdrojem volných radikálů je metabolismus některých látek jako trans-mastných kyselin (při jejich oxidačním metabolismu v peroxyzomech) konzumovaných ve ztuţených tucích a v menší míře v mléčném tuku, metabolismus D-aminokyselin vznikajících zejména v zakvašovaných mléčných produktech, oxidace polynenasycených mastných kyselin (a to i v krevním řečišti), metabolismus některých endosloučenin, např. estrogenu (koreluje doba a mnoţství produkce estrogenů s incidencí nádorů prsu), metabolismu některých karcinogenních látek, jako např. polycyklických uhlovodíků atd. Lokálně nejvýznamnějším zdrojem

13

kyslíkových radikálů je zánět. Krevní buňky mononukleáry a makrofágy generují při zánětlivé reakci kyslíkové radikály a reaktivní molekuly pro usmrcování patogenních mikroorganismů. To je spojeno obvykle s akutním zánětem, který je tedy prospěšný. Vyvine-li se však dlouhodobý chronický zánět, stává se dlouhodobým zdrojem produkce kyslíkových radikálů a tím škodlivý. Incidence mnoha nádorových onemocnění u člověka je spojena s chronickým zánětem, např. incidence nádorů ţaludku koreluje s incidencí ţaludečních vředů, nádorů ledvin s ledvinovými kameny, nádorů ţlučníku se ţlučníkovými kameny, nádorů jater s hepatitidou. V Egyptě jsou u muţů nejčastější nádory močového měchýře vyvolané mikroskopickým parazitem Schistosomiasou apod. (Stratil, Kubáň, 2005). Rovněţ nadváha a obezita, provázena zvýšeným ukládáním tuku zejména v břišní oblasti (viscerální tuk), který působí chronický zánět (zvýšení C-reaktivního proteinu, CRP) a je s tím spojena i zvýšená tvorba kyslíkových radikálů (Katcher et al., 2006). Dalším významným zdrojem kyslíkových radikálů můţe být UV, rentgenové a radioaktivní záření. Oxidační látky, které při chronickém zánětu (i velmi slabém) téměř nepřetrţitě produkují aktivované fagocyty, mohou zcela oslabit působení oxidačních obranných látek. Poškozené tkáně pak umoţňují vznik nejrůznějších onemocnění. Všechny tyto vlivy vedou k nadměrné tvorbě volných radikálů (Ortembergová, 2002). 3.1.2 Vliv radikálů na ţivý organismus Kaţdá buňka musí denně čelit přibliţně deseti tisícům atakům volných radikálů (Ortembergová, 2002). K nejzávaţnějším kyslíkovým radikálům patří hydroxylové (OH ), superoxidové (O2 –), peroxidové (HO2 ) a peroxylové (ROO ) radikály, které reagují s DNA (s purinovými a pyrimidinovými bázemi a deoxyribosovým zbytkem (Packer et al., 1999) i ostatními makromolekulami, coţ vede k poškození buněčných struktur, včetně membrán, strukturních bílkovin, enzymů, receptorových, regulačních a signálních bílkovin. To můţe vést ke vzniku mutací a případně způsobit i smrt buňky (Murray, 1998). Radikály hrají důleţitou roli v oxidačním stresu u lidí a při vývoji více neţ 100 patologických stavů a při vzniku desítek nejrůznějších zdravotních problémů a nemocí, a to ve všech orgánech a tkáních. I kdyţ existují v lidském organismu běţně fyziologické endogenní ochranné mechanismy, nejsou obvykle schopné dostatečně zneškodňovat zejména zvýšenou

14

tvorbu kyslíkových radikálů. Proto je potřebné přijímat antioxidanty v dostatečném mnoţství potravou (Packer et al., 1999).

3.2 Antioxidanty Antioxidanty jsou sloučeniny, které poskytnutím volného elektronu jsou schopné zneškodňovat volné radikály nebo reaktivní kyslíkaté sloučeniny vznikající v lidském organismu a tak mohou chránit biomolekuly (zejména proteiny, nukleové kyseliny, polynenasycené mastné kyseliny a sacharidy) proti oxidativní degradaci, a to jak v ţivých organismech, tak i v neţivých materiálech rostlinného a ţivočišného původu (např. v potravinách, krmivech a surovinách). Reaktivní kyslíkové radikály mohou negativně ovlivňovat jejich výţivovou, senzorickou a hygienicko-toxikologickou hodnotu).

3.2.1

Klasifikace antioxidantů

Antioxidanty je moţné klasifikovat podle několika kriterií: Podle místa účinku je můţeme rozdělit na: 

antioxidanty působící mimo organismus (chrání potravu nebo krmiva před neţádoucími oxidačními procesy),



antioxidanty působící buněčných

v organismu (chrání

makromolekul

fyziologicky

zejména proti

nebo

patologicky

poškozování vznikajícími

kyslíkovými radikály) Podle mechanismu účinku můţeme antioxidanty rozdělit na: 

primární antioxidanty, které reagují s volnými radikály (např. askorbová a erythorbová kyselina a jejich deriváty, karotenoidy, tokoferoly, fenolové sloučeniny, galláty), (Benešová, 2000)



sekundární antioxidanty, které redukují vzniklé hydroperoxidy (např. sloučeniny obsahující

síru,

jako

cystein,

peptidy obsahující

cystein

(glutathion,

fytochelatiny), methionin, lipoová kyselina, syntetický ester didodecyl-3,3´thiodipropionát), 

sloučeniny váţící do komplexu katalyticky oxidačně působící kovy (např. EDTA, vícesytné kyseliny, jako citronová, fytáty aj.),

15



sloučeniny eliminující přítomný kyslík (např. siřičitany, kyselina askorbová a erythorbová) (Velíšek, 2002).

Nejvýznamnějšími antioxidanty jsou primární antioxidanty. Jejich funkce spočívá ve schopnosti zneškodňovat reaktivní radikály poskytnutím vodíkového radikálu a vytvořením neradikálové nereaktivní molekuly a nového stabilního radikálu antioxidantu delokalizací nepárového elektronu, který je málo reaktivní. Primární antioxidanty jsou účinné ve velmi nízkých koncentracích (Benešová, 2000). Primární antioxidanty můţeme podle struktury aktivní části molekuly rozdělit na: 

endioly (např. kyselina askorbová a erythorbová a jejich soli a jiné deriváty),



sloučeniny s konjugovaným systémem dvojných vazeb, který umoţňuje delokalizaci přijatého elektronu, např. karoteny a xantofyly,



fenolové substituované sloučeniny, umoţňující delokalizaci přijatého elektronu na aromatickém jádře (např. tokoferoly, fenolové antioxidanty, galláty a řada dalších sloučenin v rostlinách),



kombinované struktury konjugovaných dvojných vazeb a substituovaných fenolů (např. kurkuma v koření, resveratrol ve víně),



jiné látky s antioxidačním účinkem (Velíšek, 2002).

Podle původu v těle můţeme antioxidanty rozdělit na: 

exogenní – přijímané potravou, např. askorbová kyselina, tokoferoly, karotenoidy, vitamin A, lipoová kyselina, fenolové a polyfenolové a jiné rostlinné sloučeniny,



endogenní – vznikající metabolicky v organismu, např. ubichinon, glutathion, močová kyselina, melatonin.

Dnes jsou známé jak přírodní, tak i syntetické sloučeniny s antioxidačním účinkem, např. 3- a 2-terc. butyl-4-hydroxyanisol (BHA) (E320), 3,5-di-terc. butyl-4hydroxytoluen (BHT) (E321), 2-terc. butylhydrochinon (TBHQ) (E319), propyl-, oktyla dodecylgalláty (Benešová, 2000). Pro potravinářské účely jsou v ČR povoleny následující antioxidanty: estery mastných kyselin (z jedlých tuků) s askorbovou kyselinou (askorbylpalmitát, askorbylstearát), přírodní extrakt s vysokým obsahem tokoferolů,

-,

-,

-tokoferol,

propyl-,

oktyl-,

dodecylgallát,

(isoaskorbová) kyselina a její sodná sůl erythorban sodný a BHA a BHT. 16

erythorbová

Při pouţití těchto antioxidantů nesmí být překročeno nejvyšší povolené mnoţství pro danou potravinu stanovené předpisy. Potravinářské pouţití TBHQ není v zemích EU povoleno (Velíšek, 2002).

H3C

OH

O

(H3C)3C

C(CH 3)3

C(CH3)3

CH3

OH terc-Butylhydroxyanisol (3-BHA)

terc-Butylhydroxytoluen (BHT)

O

OH

O

R

C(CH3)3 HO

OH OH

OH

galláty: R- propyl-, oktyl-, dodecyl

terc-Butylhydrochinon (TBHQ)

Obrázek 1. Vzorce syntetických antioxidantů (Benešová, 2000). Přírodní sloučeniny s antioxidačním účinkem (tzv. přírodní antioxidanty) jsou velmi početnou a z chemického hlediska velmi rozmanitou skupinou sloučenin. Kaţdá z těchto skupin antioxidantů má své výhody i nevýhody. Z potravinářského hlediska se většinou dává přednost syntetickým antioxidantům z ekonomických důvodů (niţší výrobní náklady, vyšší účinnost, standardní vlastnosti). V poslední době jsou však u některých syntetických antioxidantů běţně pouţívaných v potravinářských technologiích zjišťovány při dlouhodobém podávání pokusným zvířatům i negativní vlivy na jejich zdraví, takţe by mohly mít i negativní vliv na lidské zdraví při jejich častějším příjmu v potravinách. Proto jsou hledány nové syntetické i přírodní sloučeniny s antioxidačním účinkem (Ito et al., 1997). Antioxidační vlastnosti vykazuje řada rostlinných materiálů, a to jak zelenina a ovoce, tak zejména i různá koření a byliny, pouţívané po staletí k prodlouţení uchovatelnosti potravin. Látky s antioxidačním účinkem v nich obsaţené jsou většinou

17

fenolové kyseliny (a jejich estery a glykosidy), polyfenoly, flavonoidy a isoflavony, fosfolipidy, tokoferoly, diterpeny, kurkuminoidy a jejich homology, lignany, taniny a některé další sloučeniny, které jsou často specifické pro určitou rostlinu. Antioxidační aktivita těchto sloučenin závisí na jejich struktuře a pohybuje se v širokém rozmezí od velmi nízké aţ po velmi vysokou (Benešová, 2000). 3.2.2 Resorpce a metabolismus O tom, zda a v jakém mnoţství jsou rostlinné polyfenoly resorbovány z trávicího traktu člověka, jaká je jejich koncentrace v krevní plazmě, jak jsou metabolizovány a vylučovány z organismu, je však málo známo. Rovněţ znalosti o jejich mnoţství v potravinách nejsou zdaleka kompletní. Hlavním místem resorpce polyfenolů v trávicím traktu je tenké střevo. Existují však důkazy, ţe některé polyfenoly přijímané v nápojích se mohou částečně resorbovat jiţ v dutině ústní. Po vypití zeleného čaje byla zjištěná koncentrace katechinů ve slinách o dva řády vyšší neţ v plazmě. Eliminace katechinů ze slin (poločas 10 − 20 min) byla mnohem rychlejší neţ z plazmy. Původně se předpokládalo, ţe polyfenoly nemohou být resorbovány z trávicího traktu člověka ve formě relativně polárních glykosidů nebo esterů. Míra jejich resorpce byla povaţována za nízkou a závislou na schopnosti střevní mikroflóry uvolnit nepolární aglykony, coţ by mohlo být spojeno s jejich rozsáhlou mikrobiální degradací. Překvapivé výsledky však přineslo studium resorpce polyfenolů v trávicím traktu, kdy bylo zjištěno, ţe mikrobiální degradace sloučenin v tenkém střevě je minimální a byla nalezena vysoká míra resorpce některých polyfenolů (Slanina, Táborská, 2004). Některé antioxidanty, aniţ by se absorbovaly, vykazují antioxidační účinky přímo v gastrointestinálním (GI) traktu, např. v ţaludku nebo v tlustém střevě (Benešová, 2000). Polyfenoly, které nejsou resorbovány v tenkém střevě, dostávají se do tlustého střeva, kde jsou metabolizovány střevními baktériemi. Typickými přeměnami jsou redukční nebo hydrolytické reakce. Fenolové kyseliny tvoří značnou část (30 – 60 %) metabolitů flavanoidů přijatých potravou, které se resorbují ve formě glykosidů. Hydrolýza sacharidové sloţky není tedy pravděpodobně nutnou podmínkou účinné resorpce všech polyfenolů. Pro přeměnu glykosidů v tenkém střevě má největší význam enzym laktasa, štěpící

-glykosidickou vazbu. Po resorpci z trávicího traktu jsou

polyfenoly dále metabolizovány enzymy přítomnými v tkáních člověka převáţně v játrech a vyloučeny ledvinami do moče (Slanina, Táborská, 2004). Játra selektivně 18

vylučují polyfenoly do krve, např. flavonoidy (kvercetin a katechiny), kdy koncentrace dosahuje 1 µmol, coţ je mnoţství, které in vitro oddaluje proces peroxidace lipidů (např. lipoproteinů nízké hustoty, LDL) (Benešová, 2000).

Polyfenoly Dutina ústní (resorpce – sliny) Ţaludek (pro enzymy nízké pH) Tenké střevo

Játra (metabolismus)

Resorpce do krve

Tlusté střevo (střevní bakterie)

Organismus Ledviny Moč

Stolice Obrázek 2. Metabolismus antioxidantů (Slanina, Táborská, 2004). 3.2.3 Mechanismus působení

Antioxidanty mohou působit jedním nebo i několika mechanismy: inaktivují nebo redukují volné lipidové radikály (např. -tokoferol), nebo inaktivují reaktivní kyslíkové radikály (např. polyfenoly) (O´Brien, 1994). Fenolové sloučeniny (ArOH) mohou jako primární antioxidanty interferovat s oxidací lipidů (R-H) v kompetitivní reakci k propagační fázi autooxidační reakce tím, ţe reagují s radikály hydroperoxidů (ROO ) vzniklými oxidací lipidů nebo s alkoxylovými radikály (RO ) vzniklými rozkladem hydroperoxidů. Poskytují jim atom vodíku, čímţ přerušují řetězovou radikálovou reakci. Jako produkty vznikají fenoxylové (aryloxylové) radikály antioxidantu: ArOH + R-O-O → R-O-OH + ArO nebo ArOH + R-O → R-OH + ArO Tyto radikály reagují s volným hydroperoxylovým nebo alkoxylovým radikálem oxidované mastné kyseliny v terminační fázi reakce. R-O-O + ArO → R-O-Ar + O2 nebo RO + ArO → R-O-O-Ar Fenolové antioxidanty ovšem nesmí vstupovat do řetězové radikálové reakce ani iniciovat štěpení dalších molekul lipidu. K těmto reakcím můţe docházet při vysokých koncentracích antioxidantu, který potom působí jako prooxidant (Velíšek, 2002): ArO + ROOH → ArOH + ROO 19

ArO + RH → ArOH + R Antioxidanty mohou působit dalšími následnými mechanismy: zháší singletový kyslík (např. -karoten, retinol), komplexují kovy s prooxidačním účinkem jako Fe a Cu (např. flavonoidy a jiné polyfenoly), inhibují prooxidační enzymy (např. allopurinol), redukují oxidačně stresované buňky (např. ethanol, sorbitol, xylitol) (generátory NADH),

šetří

nebo

regenerují

intracelulární

antioxidanty

(např.

askorbát,

N-acetylcystein), indukují nebo zvyšují enzymovou ochranu buňky proti kyslíku nebo oxidantům (např. butylovaný hydroxyanisol), stabilizují membrány proti peroxidaci lipidů sníţením membránové fluidity (např. cholesterol) (O´Brien, 1994). 3.2.4 Antioxidační účinek Antioxidační účinek látek vyplývá z jejich specifické struktury, závisí na počtu a poloze hydroxylových skupin i typu substituentů (alkyl, alkoxyskupina, allylová skupina, glykosidická část) (Parkányiová, 2003). Funkční skupiny v molekule antioxidantu určují téţ polaritu a hydrofobní-lipofilní vlastnosti molekuly. Účinnost antioxidantů můţe být z tohoto důvodu různá (Frankel et al., 1996; Huag et al., 1996). Kromě struktury ovlivňuje antioxidační aktivitu antioxidantů i pH systému a stabilita sloučenin během zpracování suroviny (teplota, fermentace). Důleţitá je také přítomnost dalších látek v systému, které mohou působit jako synergisti, nebo jako antagonisti. Tyto strukturní faktory podmiňují snadnost odštěpení vodíku z molekuly antioxidantu a ovlivňují míru stability vzniklého radikálu antioxidantu, snadnost reakce s jiným

radikálem

nebo

schopnost

chelatovat

kovy

katalyzující

oxidaci

(Parkányiová, 2003). Některé antioxidanty podléhají oxidaci rychleji, a pokud nejsou jejich antioxidační schopnosti znovu obnoveny, rychle se vyčerpají. Oddálí oxidaci, ale nezabrání zcela jejímu následnému průběhu. Pokud dojde ke změně rovnováhy peroxidačních a antioxidačních látek v neprospěch antioxidantů, nastává tzv. „oxidační stres“. Taková nerovnováha můţe vzniknout vlivem zvýšené tvorby oxidačních látek nebo vyčerpání antioxidantů v důsledku konzumace stravy chudé na antioxidanty nebo vlivem špatného vstřebávání antioxidantů při chronických dysfunkcí střev (Ortembergová, 2002).

20

Rostlinné fenoly

3.3

3.3.1 Klasifikace Rostlinné fenolové sloučeniny tvoří velkou heterogenní skupinu sekundárních metabolitů rostlin (Benešová, 2000). Fenolové sloučeniny (pouţívaná synonyma: fenoly, polyfenoly – vztahuje se k počtu OH skupin) jsou látky, které mají jeden nebo více benzenových kruhů substituovaných jednou nebo několika hydroxylovými skupinami

a

jejich

funkční

deriváty (estery,

glykosidy apod.)

(Middteton,

Kondaswami 1992; Spilkova, Hubik, 1992). Fenolové skupiny mají polární charakter, který ovlivňuji rozpustnost ve vodě (v závislosti na počtu těchto skupin a velikosti uhlíkového skeletu) a schopnost tvorby vodíkových můstků. Fenolové skupiny umoţňují také vznik esterových a etherových vazeb. Pokud jsou navzájem v polohách ortho- nebo para-, snadno se oxidují na chinony. Mezi významné rostlinné fenoly, kterých je zatím známo asi osm tisíc, patří zejména: 

třísloviny (taniny),



lignin,



fenolové kyseliny a jejich deriváty lignany a sinapiny,



fenoly se skeletem odvozeným od flavanu – flavonoidy a anthokyaniny,



fenoly se skeletem odvozeným od isofavanu – isoflavanoidy (fytoestrogeny).

Třísloviny Třísloviny jsou sloţené fenolové sloučeniny rozpustné ve vodě, s molekulovou hmotností 500-5000 Da. Typickou vlastností tříslovin je schopnost sráţet bílkoviny, coţ je podstatou jejich svíravé (trpké, astringetní) chuti. Vymezení tříslovin (taninů) není dosud jednoznačné. Pro přesnější vyjádření by se měl pouţívat termín rostlinné polyfenoly, zatímco vţitý pojem třísloviny jen ve spojení s upřesněním chemické podstaty, tedy třísloviny hydrolyzovatelné nebo kondenzované. Třísloviny se dělí na dvě velké skupiny, jejichţ chemická podstata je odlišná (Kalač, 2001)

21

TŘÍSLOVINY

HYDROLYZOVATELNÉ (taniny)

KONDENZOVANÉ (flavanoly)

Estery sacharidů a fenolových kyselin

Polymery flavanolů Proanthokyanidiny Polymery 3-flavanolů Katechiny

Leukoanthokyanidiny Polymery 3,4-flavandiolů

Obrázek 3. Schéma třídění tříslovin (Kalač, 2001). Hydrolyzovatelné třísloviny Tento typ tříslovin dostal označení podle své charakteristické vlastnosti: kyselou hydrolýzou nebo enzymově (tanasou) se snadno štěpí esterová vazba mezi alkoholickými skupinami sacharidu a karboxylem fenolových kyselin. Uvolňují se základní stavební sloţky – centrální sacharid, kterým je nejčastěji D-glukosa (Kalač, 2001) a fenolové kyseliny zejména kyselina gallová a její deriváty (tj. jednoduché

fenoly)

(Benešová,

2000).

Hydrolyzovatelné

třísloviny

jsou

charakteristické pro řadu léčivých rostlin, v kůře (např. dubu) a jsou sloţkou alkoholických nápojů zrajících v dubových sudech, jako např. koňaku, brandy, whisky a některých vín. Pouţívají se také k odstranění neţádoucích zákalů např. vína a piva. Kondenzované třísloviny (Proanthokyanidiny) Kondenzované třísloviny jsou velmi rozmanité oligomery a polymery některých flavonoidních látek se strukturou flavanu. Jsou to oligomery vzniklé kondenzací 2 – 10 základních flavanových jednotek katalyzovanou oxidoreduktázami. Flavanolové jednotky bývají nejčastěji spojeny vazbami C4→C8, méně často C4→C6. V molekule dimeru je navíc další chirální centrum, proto existují isomery dimerů (Velíšek, 2002). Kondenzované třísloviny neobsahují sacharidovou sloţku ani fenolové kyseliny, takţe se v nich nevyskytuje esterová vazba. Neštěpí se ani působením minerálních kyselin. Kondenzované třísloviny se vyskytují častěji neţ hydrolyzovatelné (Kalač, 2001).

22

Monomerní flavany jsou bezbarvé katechiny (3-flavanoly) a leukoanthokyanidiny (3,4-flavandioly), které vznikají z katechinů enzymovou oxidací. Podle počtu a umístění OH skupin na benzenovém kruhu B se dělí na katechiny a gallokatechiny, které mají v molekule dva chirální atomy uhlíku a mohou se proto vyskytovat ve čtyřech isomerech. Tzn. (+)-katechiny, (-)-katechiny a (+)-gallokatechiny, (-)-gallokatechiny mají na uhlíku C-2 a C-3 vodíky. Běţně se vyskytují také estery všech isomerů s gallovou kyselinou vázanou na C-3 kruhu C, které se nazývají katechingalláty a gallokatechingalláty. R

3

OH HO

O

OH R

1

R2 OH

(+)-Katechin:

R1 = R3 = H, R2 = OH;

(+)-katechingallát:

R2 = OG,

(+)-Gallokatechin:

R1 = H, R2 = R3 = OH;

(+)-gallokatechingallát:

R2 = OG,

(-) -Epikatechin:

R1 = OH, R2 = R3 = H;

(-)-epikatechingallát:

R1: = OG,

(-)-Epigallokatechin: R1 = R3 = OH, R2 = H;

(-)-epigallokatechingallát: R1: = OG,

Obrázek 4. Prokyanidiny (Flavan-3-oly) (Velíšek, 2002). Proanthokyanidiny se dělí na: prokyanidiny (mají kruh B odvozený od protokatechové kyseliny), isomery B1 – B8 a prodelfinidiny (mají kruh B odvozený od gallové kyseliny (OG) – esterově vázané. Potravinářský význam mají zejména proanthokyanidiny hroznů, vín a čajových lístků. Jsou však často i v mnoha dalších potravinách rostlinného původu. Kondenzované třísloviny mají hořkou a adstringentní chuť a podílí se na chuti červených vín. Fenolové kyseliny Fenolové kyseliny vznikají hydroxylací nebo methoxylací kyseliny benzoové (C6-C1) nebo kyseliny skořicové (C6-C3). Vykazují účinky primárních antioxidantů, jejichţ aktivita závisí na počtu hydroxylových skupin v molekule (Velíšek, 2002). Deriváty hydroxybenzoové kyseliny se běţně vyskytují ve vázané formě. Jsou 23

strukturální sloţky ligninů a hydrolyzovatelných taninů. Vyskytují se také ve formě organických kyselin a cukerných derivátů. Obsah hydroxybenzoových kyselin v potravinách rostlinného původu je obecně nízký (výjimku tvoří: ostruţiny, maliny, jahody, cibule, křen). Hlavní hydroxyskořicová kyselin je kyselina kávová, která tvoří 75 % z celkových hydroxyskořicových kyselin v řadě druhů ovoce a zeleniny. Mezi další významné hydroxyskořicové kyseliny patří p-kumarová, chlorogenová, ferulová a sinapová

kyselina (Benešová, 2000).

Flavonoidy Flavonidy jsou velice rozsáhlou skupinou rostlinných fenolů. Název základních flavonoidů je tvořen z kmene flav- a slabik -on pro keto (oxo- skupinu) a -ol pro alkoholickou skupinu a zakončení -an pro nasycené uhlovodíky. Obsahují v molekule 2 benzenové kruhy spojené tříuhlíkovým řetězcem uzavírajícím kruh přes kyslík (pyranový), který spolu s kondenzovaným benzenovým jádrem tvoří sloučeninu 2H-chromen. Jedná se o uspořádání C6-C3-C6. 2´

8 7

1

O

6

8

2

7

3 5

O C

5

4

6

4

4´

1´ B

1

A

3´

2

5´

6´

3

Obrázek 5. 2H-chromen a flavan (Velíšek, 2002). Flavanový skelet se tedy skládá ze dvou benzenových kruhů (A a B) a kruhu odvozeného od 2H-pyranu (C). Kruh B je spojen s pyranovým kruhem (C) v poloze C-2. Běţně

bývají

všechny

3

kruhy

substituovány

hydroxyskupinami

nebo

methoxyskupinami a jednotlivé deriváty se liší pouze stupněm substituce a oxidace. Vyskytují se jako volné látky nebo častěji jako glykosidy. Podle stupně oxidace kruhu C se rozeznávají následující základní struktury flavonoidů: 

katechiny (flavan-3-oly),



leukoanthokyanidiny (flavan-3,4-dioly),



flavanony (4-oxo, hesperidin, naringenin),



flavanonoly (3-ol, 4-oxo), 24



flavony (4-oxo, luteolin, apigenin),



flavonoly (3-ol, 4-oxo, rutin, kvercetin, kemferol, myricetin, hyperozid),



anthokyanidiny.

Ze struktury příbuzných sloučenin (vesměs produktů biosyntézy a katabolismu flavanoidů), u kterých jsou kruhy A a B spojeny alifatickým C3 řetězcem nebo řetězcem, který je součástí furanového cyklu, se dále rozeznávají: 

chalkony a dihydrochylkony



aurony.

OH

OH

O

O

chalkony

dihyrochalkony

O

O

aurony

Obrázek 6. Struktura flavonoidů (chalkony, dihyrochalkony, aurony) (Velíšek, 2002). Méně běţné sloučeniny s kruhem B spojeným s pyranovým kruhem C v poloze C-3 se nazývají isoflavonoidy, pokud je toto spojení v poloze C-4, nazývají se příslušné sloučeniny neoflavonoidy. Některé flavonoidy jsou důleţitá přírodní rostlinná barviva. Většina flavonoidů má barvu ţlutavou avšak anthokyany mají výrazné červené aţ modré zbarvení a jsou významnými barvivy některých druhů ovoce a zeleniny. Flavonoidy se často vyskytují ve formě O-glykosidů, ve kterých je přítomna D-glukosa,

L-rhamnosa,

D-galaktosa,

L-arabinosa,

D-xylosa,

D-apiosa

nebo

D-glukuronová kyselina. Kromě O-glykosidů se poměrně často vyskytují i C-glykosidy

(odvozené hlavně od flavonů a flavonolů), ve kterých je glukosa vázána vazbou C-C, a to buď v poloze C-6, nebo v poloze C-8 molekuly flavonoidů (Velíšek, 2002). Díky velké variaci v substitučních typech a vzorech vzhledem k hydroxylaci, methoxylaci a esterifikaci organickými i anorganickými kyselinami a dále k různým moţnostem C-methylace, C-glykosylace a prenylace bylo popsáno více jak 5000 různých flavonidů a jejich počet s přesnou charakterizací a identifikací se neustále zvyšuje (Lachman, 2000).

25

Schopnost vázat kovy spolu se schopností ukončovat radikálové oxidační reakce dává flavonoidům vlastnosti antioxidantů (Velíšek, 2002). Flavanoidy působí jako primární antioxidanty, chelátory a vychytávače superoxidového aniontu (O2 ) (Benešová, 2000). Pro antioxidační aktivitu flavonoidů je důleţitý počet hydroxylových skupin

v molekule

a

jejich

Aktivními

poloha.

sloučeninami

jsou

všechny

dihydroxyderováty s hydroxyskupinami v polohách C-3´a C-4´. Přítomnost další hydroxyskupiny v kruhu B antioxidační aktivitu dále zvyšuje (např. robinetin a myricetin s další hydroxyskupinou v poloze C-5´ jsou jako antioxidanty aktivnější neţ kvercetin a fisetin). Nízkou aktivitu vykazují flavonoidy s jednou hydroxyskupinou v kruhu B (např. flavanony naringenin a hesperetin). Důleţitými funkčními skupinami jsou také oxoskupina na C-4 a hydroxyskupina na C-3 (nebo na C-5). Velmi účinné antioxidanty mají 2 hydroxyskupiny v o-poloze na jednom kruhu a 2 hydroxyskupiny v p-poloze na dalším kruhu (Velíšek, 2002). 3.3.2 Fenolové sloučeniny přítomné v pravých a bylinných čajích Třetinu hmotnosti sušiny čajových lístků tvoří polyfenoly, zvané flavonoly, nebo častěji katechiny (Béliveau, Gingras, 2008), které zahrnují flavanoly, flavandioly, flavonoidy a fenolové kyseliny. Představují hlavní skupinu antioxidantů čaje. Tento polyfenolový komplex je tvořen katechiny: epigallokatechin-3-gallát (EGCG), epigallokatechin-3-gallát

(ECG),

epigallokatechin

(EGC),

epikatechin

(EC),

gallokatechin (GC) a katechin (C) (Arcimovičová, Valíček, 2000). Zelený čaj obsahuje 17,5 % a černý čaj 14,4 % polyfenolů (vyjádřen ekvivalent gallové kyseliny). Hlavní sloţky v zeleném čaji jsou katechiny (90 % polyfenolové frakce), které představují pouze 25 % v černém čaji (Belitz , 2009; Yamamoto, 1997). Celkový obsah polyfenolů v listech je odhadován na 50 – 222 g.kg-1. Mezi polyfenolovými látkami obsaţenými v listech převaţují taniny (Hertog et al., 1993). Jejich antioxidační aktivita klesá v pořadí: epigallokatechingallát > epigallokatechin > epikatechingallát > epikatechin.

Jsou

Epigallokatechingallát

synergický

vykazuje

účinněji

něţ

účinek

BHA

a

s askorbovou

α -tokoferol. kyselinou,

α - tokoferolem, kyselinou citronovou a vinnou (Benešová, 2000). V čaji se nacházejí flavonoly a jejich glykosidy ve větším mnoţství dokonce více neţ v ovoci. Hlavními sloţkami všech čajů jsou glykosidy (zejména 3-glukosidy, 3-galaktosidy a 3-rutinosidy, u kvercetinu také 3-rhamnosid, u kvercetinu a kemferolu také 3-rhamnodiglukosidy a 3-glukorhamnogalaktosidy) (Velíšek, 2002). V nálevech černého čaje je obsaţeno 26

10 – 25 mg.l-1 kvercetinu, 7 – 17 mg.l-1, kempferolu a 2 – 5 mg.l-1 myricetinu (Hertog et al., 1993). V porovnání celkového mnoţství glykosidů v sušině černých čajů bývá přítomno 0,4 – 1,7 % a v zeleném čaji 1,5 – 1,7 %, v instantních čajích 2,6 – 3,1 %. Přítomné glykosidy významně také přispívají k trpké chuti čajových nálevů (Velíšek, 2002). Kromě toho zelený čaj obsahuje fenolové kyseliny jako je např. kyselina gallová. Fermentační proces při výrobě černého čaje způsobuje vznik dalších typů polyfenolových látek. Během fermentace dochází k enzymovému hnědnutí flavonoidů, dochází k oxidaci fenolových sloučenin některými oxidoreduktasami (kresolasa, katecholasa) za přítomnosti vzdušného kyslíku, jejichţ substrátem jsou v čaji přítomné katechiny. OH

kresolasa

OH

1/2 O2

katecholasa OH 1/2 O2

O O

-H2O R

fenol

R

o-difenol

R

o-chinon

Obrázek 7. Reakce katalyzované polyfenoloxidasami s aktivitou kresolas a katecholas (Velíšek, 2002). Produkty oxidace jsou příslušné o-chinony, které následnými enzymovými reakcemi poskytují barevné pigmenty oranţové aţ červené theaflaviny (3 – 6 %) a červeno-ţluté thearubiginy (12 – 18 %) (Almajano et al., 2008). Oxidací chlorofylů vznikají feofytiny, které se výrazně podílejí na tmavé barvě čaje (Velíšek, 2002). K reakci dochází při zpracování čaje, kdy se čajové lístky nechají povadnout, po té následuje svinování, čímţ se naruší membrány a šťávy obsahující polyfenoly se dostávají do kontaktu s enzymy, které atmosférickým kyslíkem katalyzují oxidaci polyfenolů. Činnost enzymů, společně s oxidací je ukončena sušením, ale látky vzniklé při tomto procesu zůstávají. Tvoří charakteristické aroma a barvu černých čajů a jsou obsaţeny v suchých listech, dokud se nerozpustí ve vroucí vodě během louhování (Chow, Kramerová 1998). Ve zbytcích čajových listů zůstává při přípravě nálevu asi 20 % flavonoidů, které při fermentaci přechází v nerozpustné sloučeniny (zřejmě jsou kovalentně vázány na proteiny prostřednictvím thiolových skupin) (Velíšek, 2002). Fermentací jsou méně postiţeny příbuzné flavonoly kvarcetin, kempferol a myricetin, 27

které mají rovněţ antioxidační účinky (Balentin, Harbowy, 1997). Zelený čaj obsahuje aţ o 90 % více polyfenolů neţ čaj černý. Antioxidační účinky černého čaje jsou proto méně výrazné. Právě fermentace polyfenoly z velké části rozkládá (Arcimovičová, Valíček, 2000). Obsah jednotlivých sloučenin v extraktu čaje závisí nejen na druhu čaje, ale i na způsobu sklizně, popř. na stáří čerstvých lístků, na zpracování, na dávkování čaje, na teplotě vody i době louhování (Recman, 2002). Při louhování kratším neţ 5 minut se vylouhuje pouhých 20 % katechinů. Proto se doporučuje doba louhování kolem 8 – 10 minut. Čaj průměrné kvality, a navíc jen krátce louhovaný, můţe obsahovat aţ 60krát méně polyfenolů, neţ čaj kvalitní a správně louhovaný (Béliveau, Gingras, 2008). Obsah fenolových látek závisí také na stáří sušeného čaje (Recman, 2002) a podmínkách skladování. V šálku silného čaje vypijeme asi 180 – 240 mg různých katechinů (Balentin, Harbowy, 1997).

Tabulka 1.

Obsah fenolových látek čerstvých čajových lístků

(% sušiny)

(Belitz et al., 2009) Sloučeniny

Obsah

(-)-Epikatechin

1–3

(-)-Epikatechin gagát

3–6 +a

(-)-Epikatechin digallát (-)-Epigallokatechin

3–6

(-)-Epigallokatechin gagát

9 – 13

(-)-Epigallokatechin digallát

+

(+)-Katechin

1–2

(+)-Gallokatechin

3–4

Flavonoly a flavonolové glykosidy (quercetin, kaemferol)

+

Flavony (vitexin)

+ 2–3

Leucoanthokyaniny Fenolové kyseliny a estery (kyselina gallová, chlorogenová)

25 – 35

Fenoly celkem a

~5

Kvantitativní údaje nejsou k dispozici.

28

3.3.3 Farmakologický význam Fenolové sloučeniny jsou skupinou sloučenin chemicky značně různorodou a v důsledku toho mají rozmanité vlastnosti a biologické účinky (Kalač, 2001). Katechiny, tak jako i jiné polyfenoly, jsou sloţité molekuly, velmi důleţité pro fyziologii rostliny, mají totiţ výrazné antimykotické a antibakteriální schopnosti, díky nimţ jsou schopny odolávat značnému mnoţství patogenů (Béliveau, Gingras, 2008). Polyfenolové sloučeniny představují velkou skupinu sekundárních rostlinných metabolitů (Lachman, 2000). Patrně slouţí rostlinám také jako chemická obrana proti hmyzu (Krejčí, 2000). Reprezentují velkou skupinu v přírodě se vyskytujících látek, které v poslední době vyvolávají značnou pozornost odborníků jako sloţky lidské výţivy, které jsou potenciálně důleţité pro zdraví člověka (Lachman, 2000). Výzkumy, které zjišťovaly, jaké škody působí volné radikály, ukazují, ţe nejvíce postiţenými orgány jsou plíce a srdce. Nyní je však jíţ zřejmé, ţe postiţených orgánů je více. Jíţ zde bylo zmíněno, ţe útoky volných radikálů jsou spojovány se stárnutím, se vznikem očního zákalu, Parkinsonovy nemoci a dalších onemocnění. Působení volných radikálů postihuje i další orgány – kůţi, mozek, oči a další (Ortembergová, 2002). 3.3.3.1 Oběhový systém Jak mohou antioxidanty ovlivnit stav cévní stěny? Vysvětlením je souvislost mezi cholesterolem a aterosklerózou (syn. arteriosklerosou) (Balentin, Harbowy, 1997). Kornatění tepen (ateroskleróza) vzniká poškozením stěny tepny hromaděním oxidovaných nebo u diabetiků glykovaných LDL (low density lipoproteins) částic transportujících triacylglyceroly, cholesterol a estery cholesterolu s mastnými kyselinami. Tyto oxidované nebo glykované LDL částice pronikají do stěny tepny, kde je vychytávají makrofágy. Vznikají tzv. pěnové buňky ve stěně tepny, coţ vede ke vzniku lokálního zánětu spojeného s indukcí proliferace fibroblastů a buněk hladkého svalstva. Tím vzniká patologická tkáň bohatá na tuk a cholesterol a je nazývána aterom nebo ateromatosní plát (Ortembergová, 2002; Witztum et al., 1991). Dochází k postupnému ztluštění stěny tepny a tím k zuţování vnitřního profilu aţ případně k úplnému ucpání a přerušení krevního toku. Jestliţe dojde ke krvácení s ateromu, vzniká krevní sraţenina, která můţe urychlit ucpání (obstrukci) tepny. Nejnebezpečnější je, dojde-li k poruše krevního zásobení ţivotně důleţitého orgánu, např. části srdečního svalu, plic, střeva nebo mozku. V tomto případě mluvíme o infarktu myokardu, plic (embolie), střeva nebo mozkové mrtvici (Recman, 2002). 29

Oxidace LDL částic je nejčastěji působena oxidovanými lipidy nebo cholesterolem, čemuţ mohou antioxidanty výrazně zamezovat. To znamená, ţe pokud je dostatečný příjem antioxidantů, které volné radikál neutralizují, nedojde k poškození LDL a vývoji aterosklerosy (Ortembergová, 2002). Při pokusu, kdy bylo podáváno skupině dobrovolníků po dobu 4 týdnů 500 mg katechinů na den, výsledky prokázaly 18% sníţení LDL v plazmě v porovnání s kontrolní skupinou (Yang et al., 2009). Jedním z prvních projevů zhoršování cévního systému je vývoj vysokého krevního tlaku (hypertenze). Vysoký krevní tlak bývá spojen nejčastěji s nesprávnou stravou (velký příjem soli), pokročilou aterosklerosou, nadměrnou hmotností dlouhodobým stresem a nedostatkem pohybu. Vysoký krevní tlak představuje značné ohroţení zdraví, protoţe působí poškození endotelu tepen a tím zvyšuje riziko vzniku aterosklerózy a následně vývoj kardiovaskulárních onemocnění (Lübeck, 1998). Rutin a další glykosidy flavonoidů, které vykazují antioxidační vlastnosti, mají vliv na pruţnost a permeabilitu kapilár. Rutin (dříve označovaný jako vitamin P) se proto pouţívá ve farmaceutických preparátech a potravních doplňcích (Velíšek, 2002), kde se doporučuje při krvácení očního pozadí nebo kapilárních toxikózách a můţe být účinný i při zánětech křečových ţil (Arcimovičová, Valíček, 2000). Rutin je důleţitou látkou pro biosyntézu kolagenu, který je součástí mezibuněčné matrix a pojivových tkání. Spolu s dalšími flavonoidními látkami zvanými bioflavonidy zvyšuje účinnost askorbové kyseliny ve tkáních tím, ţe ji buď chrání před oxidací katalyzovanou ionty kovů, nebo zvyšuje její utilizaci v organismu. Přirozené zdroje askorbové kyseliny obsahující flavonoidy (např. šípky, kde je značné mnoţství rutinu) jsou proto účinnější neţ syntetický vitamin C (Velíšek, 2002). 3.3.3.2 Trávicí systém Čaj je, zejména obsahem tříslovin, účinný proti poruchám trávicího traktu, jako je např. pálení ţáhy, gastritidě, podráţdění ţaludku a průjmovým onemocněním. Čaj patří k zásaditě působícím nápojům. Jiţ jeden aţ dva šálky čaje dokáţou sníţit stupeň kyselosti ţaludku (zvýšená kyselost ţaludků bývá spojena s větší konzumací masa, mléčných výrobků a jídel bohatých na cukr). Průjem vzniká často, bakteriálními infekcemi, špatnou stravou, stresem nebo některými patologickými stavy. Některá průjmová onemocnění mohou vést k váţnému zánětu tlustého střeva (Recman, 2002). Yuikihiko Hara z japonského výzkumného ústavu potravinářského publikoval výsledky svého výzkumu koncentrátu katechinů ze zeleného čaje. Při pokusech na 30

zvířatech zjistil, ţe koncentrát zlepšil sloţení střevní mikroflóry, které se projevilo ve sníţení hnilobných produktů. Příznivý účinek se projevil i u lidí, kde došlo k zlepšení funkce střev. Katechiny zvyšují podíl bakterií produkujících kyselinu mléčnou, která potlačuje

působení

hnilobných

bakterií.

Výsledky

studií

prokázaly,

ţe

100 mg EGCG / ml tlumí růst bakterií Helicobacter pylori podílejících se na vzniku ţaludečních a duodenálních vředů (Yilmaz, 2006). Někteří vědci tvrdí, ţe čaj rovněţ působí jako mírný baktericidní prostředek v zaţívacím traktu a pomáhá tak při prevenci různých otrav, cholery, tyfu a úplavice (Chow, Kramerová, 1998). Jeden z mechanismů tohoto účinku čaje můţe spočívat ve schopnosti tříslovin sráţet (denaturovat) bílkoviny. Sraţení bílkovin ve střevech silnými výluhy čaje se vyuţívá k léčení průjmu (Kalač, 2001). Ústní dutina Skupiny teaflavinů vznikající během fermentace dodávají nálevům černého čaje červeno-oranţovou barvu a jsou ceněnou sloţkou (Krejčí, 2000). Způsobují lehce hořkou a natrpklou chuť (Recman, 2002), která je důsledkem sráţení bílkovin slin. Polyfenoly reagují s bílkovinami slin, trávicích enzymů a mikroorganismů. K sráţení bílkovin tříslovinami dochází vznikem komplexů tvorbou četných vodíkových můstků fenolových skupin, které vytvářejí vazby propojující řetězce bílkovin (Kalač, 2001). S trávením a zdravím do jisté míry souvisí i poškozování chrupu (Balentine, Harbowy, 1997). Nesprávná strava, především cukr a bílá mouka, stejně jako přemíra stresu, mění sloţení ústních slin a z širšího pohledu vedou k poruchám rovnováhy minerálního hospodářství organismu (Lübeck, 1998). Enzym amyláza, který se vyskytuje v lidských slinách, během příjmu potravy štěpí polysacharid škrob v potravě na disacharidy (Recman, 2002), které jsou obecně nejvíce kariogenní. Cukry se snadno usazují v mezizubních prostorách a tvoří tím optimální podmínky pro mnoţení bakterií a tvorbu plaků ve štěrbinách, v nichţ bakterie vytváří vysokou koncentraci kyselin leptajících zubní sklovinu a tím působí vývoj zubního kazu (Lübeck, 1998). Polyfenoly čaje omezují působení amylázy a zároveň inhibují mnoţení bakterií, zejména kmenů streptokoků, které jsou primární příčinou zubního kazu (Balentine, Harbowy, 1997). Katechin, obsaţený v čaji, nebrání jen vzniku bakteriálního zubního plaku, ale dokáţe – jak studie přesvědčivě prokazují – přímo usmrcovat tyto bakterie (Lübeck, 1998). Čaj také podporuje tvorbu slin, které neutralizují a odplavují agresivní kyseliny v ústní dutině. Třísloviny působí jako 31

adstringens, tzn., stahují tkáň, zpevňují dásně a dokáţou léčit menší záněty a poranění (Recman, 2002). Tím mohou mít významnou roli v prevenci paradentosy a působit proti zápachu z úst (Arcimovičová, Valíček, 2000). Silný čajový nálev je výborný vnější léčivý prostředek. Je vhodný k obkladům, zábalům a výplachům. Chladí spáleniny způsobené nadměrným opalováním a dá se vyuţít k výplachům při zánětu očí. Jako kosmetický prostředek se čaj přikládá na povadlou a suchou pokoţku, čistí ji a zvyšuje její elastičnost (Svitko, 2002). 3.3.3.3 Nádorová onemocnění Pro laický pojem rakovina nebo také nádorová onemocnění se odborněji uţívá termín se širším významem onkologická/zhoubná (maligní) onemocnění, která jsou spojena s nadměrným nekontrolovaným mnoţením (proliferací) buněk, která obvykle vedou ke smrti jedince. V hospodářsky vyspělých státech maligní onemocnění epiteliálních tkání (typická rakovina) tvoří cca 80 % všech onkologických onemocnění. Zbývajících 20 % tvoří onkologická onemocnění pojivových tkání (kosti, svaly) a krve (leukemie, lymfomy a erytroblastomy). Onkologická onemocnění krevních buněk nemusí být spojena s tvorbou solidních nádorů. Buňky lidského těla se dělí (proliferují) a specializují se (diferencují) obvyklým kontrolovaným způsobem. Normální buňky nakonec po určité době umírají v kontrolovaném procesu zvaném apoptóza neboli samozničení buněk, při němţ buňky zanikají tím, ţe se rozpadnou na části, které jsou vstřebány (http://cs.wikipedia.org). Pokud se v buňce poruší sloţité regulační mechanismy, začnou se buňky nekontrolovatelně mnoţit. To vede k vytvoření nadměrného mnoţství neorganizované tkáně zvané tumor (Passwater, 2002). Často bývá uváděn názor, ţe podstatou vzniku nádoru je oslabení imunitního systému, který nezvládne zlikvidovat zdegenerované buňky (Recman, 2002). Proti tomu však stojí skutečnost, ţe u osob s prokazatelně oslabeným imunitním systémem, např. imunosupresivy po transplantaci nebo HIV infekcí se nezvyšuje incidence nádorových onemocnění a u AIDS se vyskytuje jen Kaposiho sarkom působený herpesvirem HHV-8, který malignizuje endoteliální buňky krevních duktů. Nádorová onemocnění jsou v ekonomicky vyspělých státech druhou nejčastější příčinou úmrtí. Podle Národního onkologického registru bylo v České republice v roce 2000 nově hlášeno přes 56 tisíc a v roce 2007 jiţ 76 tisíc (38,5 tisíc u muţů a 37,6 tisíc u ţen) nádorových onemocnění (dlouhodobější trend nárůstu). Incidence je u nás 32

přibliţně dvojnásobná neţ evropský průměr. Průměrně u nás kaţdý den na následky této diagnózy zemře okolo 76 pacientů, tj. ročně okolo 28 tisíc osob. Ze všech příčin úmrtí u nás zemřelo v roce 2008 na zhoubné nádory 28 % muţů a 27 % ţen, tj. kaţdý čtvrtý občan (http://www.uzis.cz). Vedle lidského utrpení to přináší obvykle i velkou ekonomickou ztrátu pro rodinu a v mnoha případech i pro stát. V samotných Spojených státech, které mají nejvyšší incidenci nádorů, byly odhadnuty celkové náklady vynaloţené v roce 1990 v souvislosti s nádorovými onemocněními na více neţ 100 miliard dolarů a kaţdoročně se zvyšují. Při vzniku zhoubných nádorů se uplatňují různé vnitřní a vnější faktory, které se mohou spolupodílet na vzniku aţ 90 % nádorů. Z příčin vzniku nádorových onemocnění bylo rozlišeno několik nejvýznamnějších faktorů, uvedených v tabulce 2. Tabulka 2. Faktory podílející se na incidenci nádorových onemocnění (Stratil, Kubáň, 2004). Faktor

Podíl na incidenci v %

Strava

40-60

Kouření

25-35

Alkohol

2-4

Infekce

1-10

Pracovní prostředí

2-8

Ţivotní prostředí

1-5

Ionizační záření

2-4

Geografické faktory

2-4

Genetické faktory

1-3

Je prokázáno, ţe většina nádorových onemocnění vzniká působením kyslíkových radikálů bez ohledu na jejich původ. Z toho vyplývá, ţe dostatečný příjem přírodních antioxidantů je nejúčinnější prevencí vzniku nádorových onemocnění. Jedním z přírodních zdrojů antioxidantů mohou být i čaje. Čaj nebude ţádným významným lékem proti jiţ propuknuté rakovině, ale můţe být významný jak pro prevenci onemocnění, tak můţe podpořit i léčbu. Jeho největší význam spočívá v tom, ţe na vzniklý nádor nepůsobí jednostranně, nýbrţ komplexně (Recman, 2002). Antioxidační nutriety působí několika způsoby: ničí volné radikály, posilují imunitní systém, omezují schopnost rakovinných buněk uchytit se ve vzdálených tkáních a orgánech a vytvářet 33

tak metastázy (Passwater, 2002). Polyfenoly v čaji pronikají přímo do genetické výbavy tělesných buněk a tam blokují vazbu sloučenin, které mohou vyvolat mutace. Antioxidanty omezují i růst zhoubného nádoru. Katechin EGCG v těle blokuje enzym, který produkují jiţ vzniklé rakovinné buňky a podílí se na metastazování. Díky tomuto katechinu se tento proces zastaví (Recman, 2002). Celý proces je znázorněn na následujícím obrázku.

Karcinogeny z potravy UV paprsky Cigarety Volné radikály

Iniciace (dny)

buňka normální

Propagace (1 aţ 40 let)

buňka iniciovaná

buňka prekancerózní

Progrese (1 rok a vice)

buňka zhoubný rakovinná nádor

Detoxikace Eleminace

Zablokování karcinogenů Sulforafan Diallyl disulfid Kyselina ellagová

Zablokování šíření a progrese rakovinných buněk Kurkumin Anthokyanidiny Resveratrol Kyselina ellagová EGCG Mastné kyseliny (epigallokatechingallát) omega-3

Obrázek 8. Působení protirakovinných látek (Béliveau, Gingras, 2008). Jednotlivé sloţky čaje prokázaly účinnost ve všech třech fázích vývoje u několika typů rakoviny. Výsledky pokusů na zvířatech odpovídají jen některé epidemiologické studie, v jiných příznivé účinky zjištěny nebyly. Přehled dosavadních výzkumů na pokusných zvířatech je shrnut v tabulce 3 (Kalač, 2003). Dále jsou zkoumány preventivní účinky čaje a jeho sloţek na řadě experimentálních modelů rakoviny v pokusech prováděných in vitro na jaterních buňkách. Projevil se ochranný účinek flavonoidů zeleného čaje proti škodlivým účinkům látek, jako jsou nitrosaminy, silné oxidanty vdechované v cigaretovém kouři (Balentine, Harbowy, 1997).

34

Tabulka 3. Preventivní účinky čaje vůči nádorovému bujení (Kalač, 2003). Iniciace

Promoce

Progrese

Rakovina kůže Polyfenoly zeleného čaje

Epigallokatechingallát

Epigallokatechingallát

Černý čaj

Zelený čaj

Zelený čaj

Polyfenoly černého čaje

Černý čaj

Černý čaj Polyfenoly černého čaje

Kofein Rakovina plic Zelený čaj

Zelený čaj Černý čaj

Rakovina trávicího traktu / jiné typy Epigallokatechingallát

Značné

Epigallokatechingallát

Polyfenoly zeleného čaje

Zelený čaj

Epigallokatechingallát

Černý čaj

Polyfenoly černého čaje

rozdíly ve sloţení

konzumovaných

čajů

znesnadňují

hodnocení

kancerostatických účinků za pomocí epidemiologických studií. Přesto však řada studií uskutečňovaných v posledních letech uvádí, ţe zelený čaj působí proti rakovině, zvláště pak proti rakovině močového měchýře a prostaty. Jeho účinek na rakovinu prsu a ţaludku byl rovněţ zmiňován, ale výsledky jsou zatím nejisté, protoţe některé studie si protiřečí. Je totiţ pravděpodobné, ţe ony rozdíly byly způsobeny právě výrazným kolísáním obsahu polyfenolů v zeleném čaji (Béliveau, Gingras, 2008).

3.4 Jiné biologicky nebo farmakologicky působící látky v čaji 3.4.1 Alkaloidy Čaje obsahují několik druhů alkaloidů např.: kofein, theobromin, xantin, adenin, hypoxantin, izatin aj. (Svitko, 2002). Alkaloidy je souhrnné označení pro několik skupin heterocyklických dusíkatých látek odvozených od purinu, resp. od produktu jeho oxidace xantinu, různé chemické struktury a biologických účinků (Velíšek, 2002). Většina alkaloidů jsou bezbarvé pevné, krystalické, ve vodě málo rozpustné látky. Přítomnost dusíku je příčinou zásaditosti, proto se v rostlinách nevyskytují volné, ale ve formě solí po reakci s kyselinami (Kalač, 2001). Vznikají při metabolismu aminokyselin (Mika, 1988). Alkaloidy jsou heterogenní skupinou zahrnující více neţ 35

5000 sloučenin. Vznikají jako sekundární metabolity a vyskytují se nejčastěji jako směs látek příbuzné struktury v různých částech vyšších rostlin (semenech, listech, kořenech, aj.) (Velíšek, 2002). Chemické systematické názvy jsou značně sloţité, proto se pouţívají názvy triviální, které se vytvářely zejména z kmenu latinského názvu rostliny, z níţ byly izolovány a přípony –in (Kalač, 2001). Listy čajovníku Camellie sinensis obsahují asi 3, 4 – 5, 7 % kofeinu, méně neţ 0,17 % theobrominu (směs alkaloidů se dříve nazývala thein) a theofilinu 0,002 – 0,013 % v sušině (Belitz et al., 2009). Nejmladší části větviček, tzv. fleše obsahují více kofeinu neţ káva. Mezi jednotlivými druhy čaje jsou dost velké rozdíly v obsahu kofeinu a fermentace jeho obsah nemění (Krejčí, 2000). V sušině zelené kávy Coffea arabica je obsaţeno 0,8 – 1,45 % kofeinu, kávy C. canephora aţ 2,7 % a C, robusty 1,7-4,0 %. Mnoţství kofeinu v kávovém extraktu je závislé na způsobu přípravy nálevu (teplotě vody, době extrakce aj.) (Velíšek, 2002). Obsah kofeinu v kávovém nápoji je však vyšší neţ v čaji, protoţe se konzumuje koncentrovanější nálev (5 – 7 g kávy / 150 ml proti 1 – 2 g čaje / 150 ml) (Kadlec, 2002). Navíc je kofein v čaji na rozdíl od kávy vázán na třísloviny, z nichţ se pomalu uvolňuje. Výhodou je niţší, ale dlouhodobější hladina koncentrace kofeinu v krvi a jeho mírnější a dlouhodobější účinek neţ při konzumaci kávy. Proto je čaj z tohoto důvodu mírnější a vhodnější způsob k povzbuzení, (Recman, 2002).

Metabolismus Ačkoliv je kofein poměrně špatně rozpustný ve vodě, z trávicího traktu se vstřebává rychle. Proniká snadno krví do mozku. Maximum koncentrace v krvi dosáhne během jedné aţ dvou hodin, u některých osob i později. Potom jeho hladina začne opět klesat, v průběhu 2 – 4 hodin. Proto se pro účinek kofeinu při pití kávy uvádí, ţe účinek se začíná obvykle projevovat po půl hodině a trvá 5 hodin. Kofein v trávicím ústrojí nejprve prochází ţaludeční a střevní stěnou, kde se dostává do krevních vlásečnic a s krví dál proniká do těla. Většina kofeinu se v játrech enzymaticky odbourává. Z molekuly kofeinu vzniká aţ 25 různých metabolitů bez kofeinového účinku. Ty se pak vylučují přes ledviny do moče (Krejčí, 2000). Účinky na organismus Kofein má na různé orgány různý fyziologický účinek. Důleţitý je účinek kofeinu na ţaludeční sliznici, kde zvyšuje vylučování ţaludeční kyseliny i enzymu pepsinu. 36

Povzbuzuje stahy ţlučníku a tok ţluč. To můţe mít příznivý vliv na trávení. Kofein i theofylin působí roztaţení (dilataci) cév a tím zvyšuje krátkodobě vylučování vody ledvinami (močopudný neboli diuretický účinek) (Krejčí, 2000). Kofein má v denních dávkách (< 3 mg.kg-1) mírný stimulační účinek na duševní činnost a zlepšuje náladu (Velíšek, 2002). Současně zbystřuje smysly a zvyšuje soustředění, zrychluje reakce i schopnost se učit (Recman, 2002). Totéţ platí o theofylinu. U jednotlivých osob můţe být působení kofeinu na srdce a cévy rozdílně intenzivní. Některým lidem zlepšuje nízký krevní tlak a zvyšuje fyzickou a duševní výkonnost, jiným můţe způsobit zvýšení krevního tlaku aţ bušení srdce (Krejčí, 2000). Účinek kofeinu ovlivňuje i tělesná hmotnost jednotlivce (Krejčí, 2000). Vysoké dávky kofeinu však mají různé nepříznivé neuroendokrinní účinky a velmi vysoké dávky působí i teratogenně. Theobromin a theofylin vykazují slabší stimulační účinky neţ kofein (Velíšek, 2002), V současné době se vyrábí i čaj bez kofeinu pro jednotlivce citlivé na jeho účinek. Proces odstraňování kofeinu však významněji neovlivňuje koncentraci polyfenolů v čaji (Weisburger, 1996).

3.4.2 Vitaminy V zeleném čaji jsou obsaţeny kromě polyfenolů i jiné prospěšné látky (Lübeck, 1998). Čaj obsahuje mnoho důleţitých vitamínů. Nejvýznamnější z pohledu mnoţství je vitamin C a betakarotén (Recman, 2002). I kdyţ příjem vitaminu C z čaje není nějak velký, současný příjem s fenolovými látkami významně zvyšuje jeho účinek. Vitamin C zasahuje do oxidačně-redukčních a dalších metabolických procesů organismu (Mika, 1988). Posiluje imunitní systém a zlepšuje přijímání a zhodnocení ţeleza a vápníku. Dále vitamin C pomáhá při stresu a je důleţitý pro zdraví pokoţky i sliznic. Vitamin C je rovněţ nezbytný pro metabolismus cholesterolu v játrech a tím pro sniţování jeho hladiny v krvi. Vitamin C se neničí varem, ale je velmi citlivý na oxidaci vzdušným kyslíkem. Proto při zalití čaje horkou vodou (neobsahuje rozpuštěný kyslík) nedochází ke ztrátám vitaminu C. To, ovšem platí pouze pro první nálev, u opakovaného výluhu se mnoţství značně sniţuje. V černém čaji je vitamin C fermentací listů zničen z 90 %. Také betakarotén a flavonoidy se fermentací značně ztrácejí (rozkládají) (Recman, 2002). Beta-karoten je provitamin vitaminu A, který je důleţitý pro zrakový vjem (správnou funkci rodopsinu tyčinek i čípků v očním pozadí) (Mika, 1988). Druhou

37

důleţitou funkcí vitaminu A je jeho úloha v diferenciaci všech epitelů a tím pro jejich normální funkci (Recman, 2002). Z dalších vitaminů čaj obsahuje také komplex vitaminu B, které jsou významnými sloţkami koenzymů metabolicky nejvýznamnějších enzymů, z čehoţ vyplývá, ţe jsou nezbytné pro ţivot kaţdé buňky a dobrou funkci tkání. Vitamin K je nezbytný pro sráţlivost krve (Mika, 1988). Je důleţitý pro vazbu druhé karboxylové skupiny na glutamovou kyselinu v protrombinu a fibrinogenu. V zeleném čaji je obsah vitaminů vyšší neţ v černém a část jich přechází do nálevu. Průměrný denní konzum čaje cca 3,5 šálku pokrývá částečně potřebu vitamínů a minerálů. Je to např. 16 % denní spotřeby vápníku, 10 % zinku, 10 % kyseliny listové, 9 % vitaminu B1, 25 % B2 a 6 % B6. Pět šálků čaje denně pokryje asi ¾ doporučené dávky draslíku (Arcimovičová, Valíček, 2000). 3.4.3 Minerální látky a stopové prvky Minerální látky a stopové prvky jsou nezbytnou součástí výţivy. Tělo je potřebuje pro četné metabolické reakce. Nedostatek minerálů a stopových prvků vede dříve nebo později k funkčním poruchám a později k váţným zdravotním poruchám. Čaj je potravinou s vysokým obsahem fluoru. Uţ 2 – 4 šálky zeleného čaje pokryjí denní potřebu fluoru u dospělého člověka, coţ je asi jeden miligram (Recman, 2002). Fluor stabilizuje (zpevňuje) zubní sklovinu a tím podstatně zvyšuje její odolnost proti zubnímu kazu. Potřeba fluoru se pohybuje v úzkém rozmezí cca 1 – 2 mg/den a příjem 4 – 5 mg / den začíná být potenciálně škodlivý a můţe působit u citlivějších osob fluorózu zubů (tvorbu hnědých skvrn) a zvyšovat křehkost kostí. V této souvislosti je významné, ţe flór je v čaji vázán v komplexních sloučeninách, takţe těţko můţe dojít k předávkování (vývoji fluorózy), coţ je jinak velkým nebezpečím fluoridových tablet a chemicky upravované (fluorizované) pitné vody (Lübeck, 1998). Mangan obsaţený v čaji působí také příznivě na zdraví kostí a působí tak preventivně proti řídnutí kostí (osteoporóze). Mangan je v lidském těle potřebný pro významné metabolické procesy. Zlepšuje příjem vápníku, pomáhá při výstavbě vaziva a při spalování tuků. Je také významný pro strukturu stěny cév. Jeho příjem potravou je poměrně nízký. Dále čaj obsahuje stopový prvek ţelezo, který slouţí v hemoglobinu pro přenos kyslíku. Příjem ţeleza můţe být nedostatečný v těhotenství a také při přísné vegetariánské stravě. Vitamin C zlepšuje vstřebání ţeleza, takţe v kombinaci 38

s vitaminem C by mohlo být ţelezo v zeleném čaji dobře vstřebáváno. Naproti tomu je však zjištěno, ţe pití černého čaje po jídle můţe vstřebání ţeleza významně sníţit vazbou do komplexu s fenolovými sloučeninami (katechiny aj.). Neměl by se proto pít čaj při jídle nebo do hodiny po jídle. Nejvhodnější je jeho konzumace mezi jídly. Také draslík je v čaji bohatě obsaţen. Šálek černého čaje obsahuje kolem 60 mg draslíku (Chow, Kramerová, 1998). Vzhledem k vysokému příjmu soli je příjem draslíku v potravě západního typu obecně nedostatečný. Draslík a sodík se významně podílí na přenosu nervových vzruchů a je důleţitý jejich určitý vzájemný poměr. Takţe určitý příjem draslíku z čaje je příznivý pro mozek a prospívá nervům. Z dalších příznivých účinku čaje je moţné uvést, ţe čaj odstraňuje únavu, udrţuje tonus svalů, sniţuje krevní tlak, je přirozeným diuretikem a pomáhá snášet vysoké teploty (Arcimovičová, Valíček, 2000).

3.4.4 Silice Silice (éterické oleje) jsou těkavé látky s typickým aróma, charakteristickým pro určité rostlinné druhy. Rostlinné silice tvoří 40 – 100 různých bezdusíkatých látek (Mika, 1988). V čaji je v závislosti na jeho druhu obsaţena typická kombinace aromatických látek, které tvoří dané charakteristické aroma. Vnímáním příjemné vůně čaje se člověk při jeho pití jemným způsobem povzbudí a uvolní při současném zachování schopnosti soustředění. Protoţe silice jsou snadno těkavé, nemá se čaj zalévat vařící vodou. Čím je druh čaje ušlechtilejší a čím je jemnější aroma, tím niţší má být teplota vody (60 – 90 °C) (Recman, 2002).

3.4.5 Saponiny Saponiny jsou heterozidy, které tvoří glycidová sloţka a genin (aglykon) sapogenin s triterpenovou a sterolovou strukturou. Tím, ţe saponiny emulgují tuky a sniţují povrchové napětí tekutin, napomáhají vytvářet pěnivé roztoky. Při perorálním uţívání dráţdí nervová zakončení v sliznici ţaludku, čímţ vyvolávají mírnou nevolnost a zároveň dráţděním vagového centra reflexně zvyšuje tvorbu a vylučování řídkého hlenu v průduškách. Kromě toho je dráţděno dýchací centrum, coţ se projeví častějším odkašláváním. Saponiny také zvyšují tvorbu ţluče, ţaludeční kyseliny a dalších sekretů v celém trávicím traktu. Některé triterpenové saponiny mají antibakteriální účinek (Mika, 1988).

39

4

MATERIÁL A METODY Obsah fenolových látek v rostlinném materiálu je moţné stanovit dvěma základními

způsoby: 1) pomocí metod, které rozdělí směs fenolových látek na jednotlivé sloučeniny a jsou kvantifikovány individuální sloučeniny (např. vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC), plynovou chromatografií (GC), kapilární zónovou elektroforézou (CZE), atd.) nebo 2) pomocí specifické chemické reakce stanovit skupinu chemicky podobně reagujících sloučenin. Stanovení všech fenolových látek jako sumy stanovení individuálních látek je sice velmi přesné a spolehlivé s vysokou informativní hodnotou, ale je velmi problematické určit v určitém rostlinném materiálu všechny fenolové sloučeniny za přijatelnou dobu a nízké náklady na analýzu. Stanovení celkových fenolových látek na základě jejich podobné reaktivity je obvykle metodicky velmi snadné, rychlé a levné. Nevýhodou je, ţe není známo, které fenolové sloučeniny jsou obsaţeny, coţ však mnohdy není důleţité. Obecně platí, ţe je třeba analyzovat několik vzorků, protoţe obsah fenolových látek se můţe lišit v různých odrůdách a kultivarech. Kromě toho, obsah fenolových látek je ovlivněn velkým počtem externích faktorů, jako jsou agrotechnické postupy, klimatické podmínky, zralost při sklizni, posklizňové manipulace, a technologické a kulinární úpravy. Pro stanovení celkových fenolových sloučenin se nejčastěji pouţívají tři metody, FCM

(s

Folin-Ciocalteu

činidlo),

PBM

(Price

a

Butler)

a

AAPM

(se 4-aminoantipyrinem). Metody pro posouzení celkového obsahu fenolových sloučenin a stanovení jejich antioxidační schopnosti jsou většinou zaloţeny na oxidačně-redukčních vlastnostech. Fenolové sloučeniny jako redukční činitelé mohou poskytnout vodíkový radikál nebo elektron. Folin-Ciocalteu metoda (FCM), se běţně pouţívá pro posouzení celkových fenolových látek v rostlinných extraktech (Stratil, Klejdus,

Kubáň, 2007).

Metoda

je

zaloţena

na

redukci

fosfowolframato-

fosfomolybdátového komplexu. Další dvě méně uţívané metody jsou metoda podle Price a Butlera (PBM), při níţ fenolové látky redukují trojmocné ţelezo na dvojmocné, které s ferrikyanidem draselným vytváří intenzivně modré zbarvení, a metoda s 4-aminoantipyrinem (AAPM), jehoţ reakcí s fenolovými látkami vzniká červené zbarvení. Většinu přírodních antioxidantů přijímáme jako součást sloţitých směsí přírodních sloučenin, jejichţ sloţky mohou reagovat s různými radikály různými mechanismy.

40

Pro vzájemné porovnávání antioxidačních účinků různých směsí byl zaveden pojem celková antioxidační aktivita (Total Antioxidant Activity, TAA) (Fidler, Kolářová, 2009). Metody pouţívané pro stanovení antioxidační aktivity (kapacity) jsou zaloţené na oxidačně-redukční reakci. Jednou z nejčastěji pouţívaných metod stanovení celkové antioxidační kapacity je metoda TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity), která je zaloţena na neutralizaci radikálkationtu vzniklého jednoelektronovou oxidací syntetického chromoforu (2,2´-azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonátu) na radikál. Dalšími často pouţívanými metodami stanovení antioxidační aktivity jsou metody DPPH a FRAP. Metoda DPPH je zaloţena na měření schopnosti antioxidantů předávat vodíkový radikál syntetické radikálové sloučenině s radikálem lokalizovaným na dusíku (2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylovým radikálem). Metoda FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) je zaloţena na oxidačně-redukční reakci. Měří schopnost antioxidantů inhibovat redukci ţelezitých iontů na ţeleznaté. Tyto metody jsou méně citlivé a dávají niţší hodnoty (Stratil, Klejdus, Kubáň, 2007).

4.1 Chemikálie a reagenty 2,2´-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfát, diamoniová sůl (ABTS), Sigma, čistota

98,0 %; Folin-Ciocalteův reagent (FC reagent), Fluka; Trolox (6-hydroxy-

2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylová kyselina, Fluka, purum

99,0 % (HPLC).

Methanol, chlorovodíková kyselina, chlorid sodný, hydroxyd sodný, uhličitan sodný, gallová kyselina, chlorid ţelezitý, persulfát/thiosíran draselný (K2S2O4); hydrogen fosforečnan sodný (Na2HPO4.12 H2O; dihydrogenfosforečnan sodný (NaH2PO4 . 2 H2O) byly stupně čistoty p.a.; deionizovaná voda.

4.2 Přístroje 

Analytické váhy Precisa 240 A, (přesnost 0,1 mg),



Laboratorní ultramixer,



Vortexer,



Centrifuga MLW T 23



Spektrofotometr HEλIOS ß, Spectronic Unicam



Zařízení na výrobu deionizované vody MILLI-Q-RG, ZFMQ 050 RG, Millipore, USA

41

4.3 Software 

Software VISION 32, Chromspec



Excel 2007 (Microsoft)

4.4 Analyzované vzorky Analýza byla provedena u 30 druhů čajů (5 druhů černých, 10 druhů zelených a 15 druhů bylinných komerčně prodávaných čajů), které byly zakoupeny v obchodní síti supermarketů Billa, Tesco, Interspar, Albert, Globus, Kaufland a ve specializované prodejně s bylinami Rosa Canina Brno. Tabulka 4. Analyzované druhy čaje

černé čaje

Značka

Obchodní název výrobku, výrobce

Spar

Cejlon, Mokate a.s., Polsko

Jemča

Pigi čaj, Jemnice, ČR

Pickwick

Ranní , Sara lee ČR. Vyrobeno v EU

Zlatý šálek

Classic, Sara lee ČR. Vyrobeno v EU

Lipton

Yellow Label Tea, Londýn

Tabulka 5. Analyzované druhy čaje

zelené čaje

Značka

Obchodní název výrobku, výrobce

Spar

Zelný čaj, Mokate a.s., Polsko

Jemča

Pravý zelený čaj, Jemnice, ČR

Pickwick

Green Tea Pure, Sara lee ČR. Vyrobeno v EU

Ahmad Tea

Original green Tea, Anglie

Teekanne

Green Tea. Vyrobeno v EU

Rosa canina

Zelený čaj, Rosa canina, ČR

Eurosoper

Zelný čaj, Bastek Coffe& Tea, Polsko

Clever

Zelný čaj, Mokate a.s., Polsko

Loyd Tea

Green Tea, Mokate a.s., Polsko

Grande

Green Tea, Vyrobeno pro Kaufland v EU

42

Tabulka 6. Analyzované druhy čaje

bylinné čaje (Výrobce: Rosa canina, ČR)

Rostlina

Rostlina

Bez černý

Mateřídouška

Heřmánek

Meduňka

Jahoda

Měsíček

Jitrocel

Ostruţina

Kopřiva

Řepík

Lípa

Šípek

Malina

Třapatka

Máta 4.4.1 Příprava vzorků Čaje byly pouţity v nativním stavu bez dalšího sniţování obsahu vody, která podle literatury činí 3 – 4 %, tzn., ţe absolutní sušina činní 97 – 96 % nativní hmotnosti. Vzorky byly rozpráškovány laboratorním ultramixerem na jemný prášek, který byl přesát přes silikonové sítko s průměrem ok do 0,5 mm. Poznámka: podrobná charakteristika vzorků je uvedena v příloze 1. 4.4.2 Extrakce celkových fenolových látek z rostlinných materiálů Pro porovnání obsahu fenolových látek a antioxidační aktivity jednak v surovém stavu, jednak po přípravě nápoje byly vzorky připraveny ve formě výluhu a methanolového extraktu. Příprava methanolových extraktů − pro extrakci fenolových látek bylo odváţeno 500 mg

1 % rozpráškovaného vzorku do speciální plastové lahvičky o objemu cca

125 ml. Bylo přidáno 10 ml směsi methanol/voda (50:50 obj. %) s přídavkem HCl (o výsledné koncentraci HCl, 1,2 mol.l-1). Při této koncentraci HCl dochází k hydrolýze etherových (glykosidických) vazeb fenolových látek vázaných na sacharidy. Lahvičky byly uzavřeny šroubovacím víčkem a inkubovány při teplotě 82 – 83 °C (teplota varu extrakčního roztoku) po dobu 2,5 hodiny, s vortexováním po dobu 20 vteřin kaţdých 30 minut (Vinson et al., 2001). Po vychladnutí bylo do lahviček přidáno 10 ml methanolu, lahvičky protřepány a cca za 15 minut byla provedena centrifugace extraktů po dobu 10 minut při 10 tis. otáčkách (přibliţně 6 tisíc g). Supernatanty se pouţijí pro analýzu. Je moţné je uchovávat ve skleněných lahvičkách se šroubovacím víčkem při 4 °C do analýzy několik dnů nebo při -20 °C i několik týdnů (nejlépe s dusíkovou 43

atmosférou). Před analýzou byly vzorky neutralizovány přidáním pevného NaOH (aby nedošlo ke změně objemu). Příprava výluhů − pro extrakci fenolových látek bylo odváţen 1,000 g

1 % vzorku

čaje v nativním stavu, přidáno 50 ml destilované vody o teplotě 80 °C a necháno louhovat 15 minut. Výluhy byly slity do skleněných lahviček a uzavřeny šroubovacím víčkem. Je moţné je uchovávat několik dnů při 4-5 °C.

4.5 Stanovení fenolových látek Pro stanovení celkových fenolových sloučenin v přírodních produktech na principu jejich redukční schopnosti je nejčastěji pouţívána Folin-Ciocalteuova metoda. Základem metody je oxidace fenolů molybdato-wolframáovým reagentem, při níţ se tvoří barevný produkt s absorbcí

max

745 – 750 nm. Je zaloţena na redukci

fosfowolframato-fosfomolybdátového komplexu, pravděpodobného sloţení (PMoW11O40)4 /(Na2WO4 .2H2O + Na2MoO4 . 2H2O) + H3PO4 + HCl (FCR, reagent). Předpokládá se, ţe molybden je v tomto komplexu snadněji redukován a uskuteční se elektronový transfer mezi reduktantem (fenolátový anion, Ph-O ) a Mo4+: Mo4+ (ţlutý) + e

Ph-O +H+

Ph–OH Ph-O + FCR + e/2e

Mo5+ (modrý)

(Ph-MoW11O40)4- (modrý)

FC reakce je nespecifická pro fenolové látky a FCR můţe být redukován i mnoha nefenolovými sloučeninami (vitaminem C, ionty Cu+ aj.). Fenolové sloučeniny reagují jen v alkalickém prostředí, cca pH 10. Disociací fenolového protonu vzniká fenolátový anion, který je schopný redukovat FCR. FC reakce je nezávislá na struktuře fenolové sloučeniny, coţ vylučuje moţnost tvorby koordinačního komplexu tvořeného mezi přechodnými kovy a fenolovými sloučeninami. Při kyselém pH reakce probíhá pomalu a ztrácí specificitu. Předpokládané sloţení produktu je 3 H2O–P2O5–13 WO3–5 MoO3–10 H2O a 3 H2O–P2O5–14 WO3–4 MoO3–10 H2O, Pracovní postup Do zkumavky bylo nepipetováno 500 l FCR (10x ředěného deionizovanou vodou) a 20 – 100

l vzorku, promícháno a necháno 10 minut reagovat. Pak bylo přidáno

400 l 7,5 % roztoku Na2 CO3 a podle potřeby voda do 1000 44

l a promícháno.

Po 30 minutách inkubace při laboratorní teplotě byla měřena absorbance při 760 nm proti slepému pokusu (místo vzorku přidáno 100 l vody). Jako standart byla pouţita gallová kyselina (koncentrace v kyvetě do 100 μmol.l-1). Obsah fenolových látek bývá vyjádřen v mmol nebo mg na litr nebo gram suché nebo mokré hmoty vzorku.

4.6 Stanovení antioxidační aktivity Pro stanovení antioxidační aktivity (kapacity) byla pouţita metoda TEAC, která je z pouţívaných metod pro stanovení antioxidační aktivity jedna z nejcitlivějších. Jejím principem je oxidačně-redukční reakce, kdy antioxidant poskytuje vodíkový radikál H : Aox-H + R

Aox + RH (Aox = antioxidant)

Metoda TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) je zaloţena na neutralizaci

radikálkationtu

vzniklého

jednoelektronovou

oxidací

syntetického

chromoforu ABTS, 2,2´-azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonátu) na radikál: ABTS – e–

ABTS

+

Vzniklý radikál má silnou absorbanci v rozsahu 700 – 750 nm a můţe být snadno stanoven spektrofotometricky. V nepřítomnosti donorů vodíku je radikál poměrně stálý. S donory vodíkového atomu reaguje rychle na nebarevný ABTS. Antioxidační aktivita je přímo úměrná sníţení absorbance reakčního roztoku se vzorkem. Pracovní postup Příprava pracovního roztoku: ABTS se rozpustí ve vodě na finální koncentraci 7 mmol.l-1

a roztok

smíchá

s roztokem

persulfátu

draselného

o

koncentraci

4,95 mmol.1-1 v poměru 1:1. Směs se ponechá stát při pokojové teplotě přes noc (více neţ 12 hod) ve tmě. ABTS je oxidován na barevný radikálkation ABTS

+

(radikál je

lokalizován na dusíku), který má absorpční maxima při 417, 645, 734 a 815 nm (stabilita při 4 °C ve tmě je i s postupným poklesem i několik týdnů). Roztok tohoto radikálu se naředí na absorbanci 1,000 aţ 1,500 při 734 nm pomocí PBS (Na2HPO4 .12 H2O 1,7907 g l-1 + Na2PO4 .2 H2O 0,851 g l-1 + NaCl 9 g l-1). Je nutné dodrţet stejnou počáteční absorbanci pro kalibraci i stanovení vzorků.

45

Vlastní stanovení Postup podle Re (Re et al., 1999) a Longa (Long, Haliweell, 2001) byl modifikován na celkový reakční objem 1 ml. Do zkumavek bylo napipetováno 950 l pracovního roztoku radikálkationtu ABTS

+

a podle intenzity reakce přidáno 10 – 25 l vzorku

(antioxidační sloučeniny nebo standardu), doplněno deionizovanou vodou do 1000 l, promícháno a po 30 minutách měřena absorbance při 734 nm. Jako kontrola (blank) je pouţitý 1 ml PBS (místo roztoku ABTS +.). Různé fenolové látky mohou reagovat různou rychlostí a reakce se vzorkem rostlinného extraktu má parabolický průběh s tím, ţe většina reakce proběhne za 3 – 6 minut. Absorbance má však i dále stále mírně klesající tendenci. I u samotného roztoku činidla probíhá stálý pomalý pokles absorbance, coţ ukazuje na spontánní rozklad reagentu nebo jeho oxidaci vzdušným kyslíkem. Nevýhodou metody je tedy její určitá nestabilita a stálý pomalý rozklad radikálu coţ zvyšuje stanovenou hodnotu (Stratil, Kubáň, 2005). Antioxidační kapacita se vyjadřuje ekvivalentem ke standardu Troloxu, tj. Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) v mmol.l-1 Protoţe reakce probíhá v pufrovaném prostředí a s malým objemem vzorku, není závislá na pH vzorku. Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylová kyselina): je ve vodě rozpustná forma -tokoferolu (hydrofobní isoprenový řetězec je nahrazen karboxylovou skupinou –COOH. 1 mmol/l Troloxu = 1 mmol/l polyfenolů ve vzorku. Pracovní standardy 0,5, 1,0, 1,5 a 2,0 mmol/l se připraví čerstvé před pouţitím naředěním PBS. Blank: PBS + vzorek, je-li výrazně barevný, jinak stačí PBS nebo voda. Pro zpřesnění měření je noţné dát do zkumavky 1 ml pracovního roztoku a změřit absorbanci na začátku a pak na konci pipetování a na začátku a na konci měření vzorků. Koncentraci je pak moţné vypočítat podle reakční rovnice z naměřených absorbancí po odečtu rozdílu absorbancí na začátku a na konci měření (korekce na samovolný rozklad činidla) Abs0 – Absvz Konc. = ---------------0,0235

46

5

VÝSLEDKY Stanovení fenolových látek a antioxidační aktivity bylo provedeno o 30 druhů čajů

(5 černých, 10 zelených a 15 bylinných). Čaje byly připraveny ve formě vodného výluhu a methanol/voda extraktu. Pro stanovení byly pouţity spektrofotometrické metody FCM pro stanovení obsahu fenolových látek a metoda TEAC pro stanovení antioxidační aktivity. Stanovení u kaţdého druhu čaje bylo provedeno třikrát. Průměrné hodnoty měření kaţdého druh u čaje jsou uvedeny v tabulkách 7 – 12. Pro přehlednost jsou hodnoty znázorněny v grafech 1 – 6. V grafech 7 a 8 je statisticky vyhodnocena korelace naměřených výsledků stanovení fenolových látek a stanovení antioxidační aktivity. Tabulka 7. Obsah fenolových látek ve výluhu a methanolovém extraktu černých čajů. Obsah fenolových látek (EG) FCM Výluh

Methanolový extrakt

mmol/g SH

mmol/g SH

x

sx

mg/g SH

x

sx

mg/g SH

Spar

0,650

0,015

110,662

0,328

0,001

55,831

Jemča

0,718

0,008

122,234

0,343

0,001

58,384

Pickwick

0,813

0,003

138,319

0,297

0,002

50,583

Zlatý šálek

0,577

0,004

98,187

0,355

0,005

60,460

Lipton

0,704

0,004

119,785

0,758

0,008

129,017

Legenda: x

= aritmetický průměr

sx = absolutní průměrná odchylka EG = ekvivalent gallové kyseliny SH = suché hmoty čaje Poznámka: Stanovení bylo provedeno třikrát

47

Tabulka 8. Obsah fenolových látek ve výluhu a methanolovém extraktu zelených čajů. Obsah fenolových látek (EG) FCM Výluh

Methanolový extrakt

mmol/g SH

mmol/g SH

x

sx

mg/g SH

x

sx

mg/g SH

Spar

0,865

0,015

147,249

0,767

0,014

130,487

Jemča

0,730

0,006

124,201

0,855

0,030

145,469

Pickwick

0,969

0,020

164,881

0,312

0,005

53,097

Ahmad Tea

0,997

0,003

169,684

1,046

0,012

177,936

Teekanne

0,484

0,010

82,425

0,281

0,001

47,798

Rosa canina

0,717

0,013

122,009

0,882

0,011

150,111

Eurosoper

0,830

0,018

141,349

0,940

0,016

159,962

Clever

0,624

0,005

106,278

0,380

0,006

64,728

Loyd Tea

0,698

0,001

118,818

0,660

0,012

112,384

Grande

0,709

0,008

120,719

0,646

0,009

109,96

Legenda: x

= aritmetický průměr

sx = absolutní průměrná odchylka EG = ekvivalent gallové kyseliny SH = suché hmoty čaje Poznámka: Stanovení bylo provedeno třikrát

48

Tabulka 9. Obsah fenolových látek ve výluhu a methanolovém extraktu bylinných čajů. Obsah fenolových látek (EG) FCM Výluh

Methanolový extrakt

mmol/g SH

mmol/g SH

x

sx

mg/g SH

x

sx

mg/g SH

Jitrocel

0,082

0,005

14,022

0,143

0,001

24,266

Heřmánek

0,153

0,003

26,061

0,211

0,003

35,845

Měsíček

0,108

0,001

18,374

0,159

0,001

27, 051

Šípek

0,179

0,002

30,461

0,199

0,002

33, 834

Třapatka

0,237

0,002

40,406

0,217

0,006

36,877

Máta

0,172

0,002

29,302

0,172

0,001

29, 334

Kopřiva

0,133

0,001

22,6933

0,189

0,003

32, 222

Řepík

0,193

0,004

32,879

0,224

0,001

38, 102

Bez černý

0,227

0,002

38,601

0,322

0,002

54, 799

Lípa

0,207

0,002

35,168

0,308

0,002

52, 375

Mateřídouška

0,190

0,001

32,364

0,227

0,001

38, 669

Jahoda

0,371

0,001

63,196

0,340

0,001

67,912

Meduňka

0,365

0,003

62,052

0,711

0,012

121, 074

Malina

0,471

0,006

80,119

0,617

0,026

105, 034

Ostruţina

0,491

0,004

83,569

0,712

0,028

121, 151

Legenda: x

= aritmetický průměr

sx = absolutní průměrná odchylka EG = ekvivalent gallové kyseliny SH = suché hmoty čaje Poznámka: Stanovení bylo provedeno třikrát

49

Tabulka 10. Antioxidační aktivita ve výluhu a methanolovém extraktu černých čajů. Antioxidační aktivita (ET) TEAC Výluh

Methanolový extrakt

mmol/g SH

mmol/g SH

x

sx

x

sx

Spar

1,479

0,033

1,606

0,022

Jemča

1,602

0,032

1,803

0,043

Pickwick

1,778

0,026

1,198

0,014

Zlatý šálek

0,984

0,014

1,086

0,008

Lipton

1,531

0,071

2,588

0,078

Legenda: x

= aritmetický průměr

sx = absolutní průměrná odchylka ET = ekvivalent Troloxu SH = suché hmoty čaje Poznámka: Stanovení bylo provedeno třikrát

50

Tabulka 11. Antioxidační aktivita ve výluhu a methanolovém extraktu zelených čajů. Antioxidační aktivita (ET) TEAC Výluh

Methanolový extrakt

mmol/g SH

mmol/g SH

x

sx

x

sx

Spar

1,979

0,077

2,599

0,008

Jemča

1,717

0,036

2,668

0,016

Pickwick

2,004

0,207

1,193

0,185

Ahmad Tea

1,986

0,098

3,669

0,123

Teekanne

1,485

0,036

0,832

0,027

Rosa canina

1,648

0,030

2,733

0,037

Eurosoper

2,643

0,026

3,475

0,144

Clever

1,180

0,030

1,897

0,024

Loyd Tea

1,616

0,044

1,958

0,047

Grande

1,005

0,009

2,317

0,048

Legenda: x

= aritmetický průměr

sx = absolutní průměrná odchylka ET = ekvivalent Troloxu SH = suché hmoty čaje Poznámka: Stanovení bylo provedeno třikrát

51

Tabulka 12. Antioxidační aktivita ve výluhu a methanolovém extraktu bylinných čajů Antioxidační aktivita (ET) TEAC Výluh

Methanolový extrakt

mmol/g SH

mmol/g SH

x

sx

x

sx

Jitrocel

0,058

0,005

0,380

0,029

Heřmánek

0,213

0,004

0,493

0,026

Měsíček

0,127

0,002

0,527

0,023

Šípek

0,253

0,007

0,558

0,012

Třapatka

0,271

0,002

0,583

0,013

Máta

0,235

0,002

0,601

0,018

Kopřiva

0,146

0,006

0,620

0,008

Řepík

0,318

0,005

0,746

0,015

Bez černý

0,344

0,003

0,764

0,030

Lípa

0,360

0,004

0,824

0,034

Mateřídouška

0,267

0,007

0,841

0,017

Jahoda

0,740

0,094

1,775

0,039

Meduňka

0,127

0,020

1,817

0,051

Malina

2,206

0,066

1,990

0,045

Ostruţina

1,005

0,044

2,487

0,019

Legenda: x

= aritmetický průměr

sx = absolutní průměrná odchylka ET = ekvivalent Troloxu SH = suché hmoty čaje

52

53

Koncentrace (mmol/g SH)

Spar

Jemča

Pickwick

FCM extrakt

TEAC extrakt

Zlatý šálek

FCM výluh

Graf 1. Srovnání koncentrací fenolových látek stanovených FCM metodou a antioxidační aktivity stanovené TEAC metodou v extraktech a výluzích černých čajů v mmol/g SH (x +/- sx; n = 3).

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

4,000

Druhy čaje

Lipton

TEAC výluh

54

Koncentrace (mmol/g SH)

Spar

Jemča

FCM výluh

Pickwick Ahmad Tea Teekanne Rosa canina Eurosoper

FCM extrakt

Clever

Druhy čaje

Grande

TEAC výluh

Loyd Tea

TEAC extrakt

Graf 2. Srovnání koncentrací fenolových látek stanovených FCM metodou a antioxidační aktivity stanovené TEAC metodou v extraktech a výluzích zelených čajů v mmol/g SH (x +/- sx; n = 3).

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

4,000

55

Koncentrace (mmol/g SH)

Bez černý Lípa

Mateřídouška

Jahoda

FCM extrakt

Meduňka

FCM výluh

Malina

TEAC extrakt

Graf 3. Srovnání koncentrací fenolových látek stanovených FCM metodou a antioxidační aktivity stanovené TEAC metodou v extraktech a výluzích bylinných čajů v mmol/g SH (x +/- sx; n = 3).

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

4,000

Druhy čaje

Ostružina

TEAC výluh

56

Koncentrace (mmol/g SH)

Jitrocel

Heřmánek

Měsíček

Šípek

FCM extrakt

Třapatka

FCM výluh

Máta

Kopřiva

TEAC extrakt

Graf 4. Srovnání koncentrací fenolových látek stanovených FCM metodou a antioxidační aktivity stanovené TEAC metodou v extraktech a výluzích bylinných čajů v mmol/g SH (x +/- sx; n = 3).

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

4,000

Druhy čaje

Řepík

TEAC výluh

57

FCM extrakty

Řepík

Kopřiva

Máta Třapatka Šípek Měsíček Heřmánek Jitrocel

Grande

Loyd Tea Clever

Eurosoper

Rosa canina

Teekanne

Ahmad Tea

Pickwick

Jemča

Spar

Lipton

Zlatý šálek

Pickwick

Jemča

Spar

Graf 5. Srovnání koncentrací fenolových látek stanovených FCM metodou v extraktech a výluzích (1 – 5 černých, 6 – 15 zelených; 16 – 30 bylinných čajů) v mmol/g SH (x +/- sx; n = 3).

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

FCM výluhy

Malina

Druhy čaje

Meduňka Jahoda

Mateřídouška

Bez černý

4,000

Ostružina

Lípa

Koncentrace (mgl/g SH)

58

Řepík

Kopřiva

Máta Třapatka Šípek Měsíček

Heřmánek Jitrocel

Grande

Loyd Tea Clever

Eurosoper

Rosa canina

Teekanne

Ahmad Tea

Pickwick

Jemča

Spar

Lipton

Zlatý šálek

Pickwick

Jemča

Spar

Graf 6. Srovnání antioxidační aktivity stanovené TEAC metodou v extraktech a výluzích (1 – 5 černých, 6 – 15 zelených; 16 – 30 bylinných čajů) v mmol/g SH (x +/- sx; n = 3).

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

TEAC extrakty

TEAC výluhy

Meduňka

Druhy čaje

Malina Jahoda

Mateřídouška

Lípa

Bez černý

4,000

Ostružina

Koncentrace (mmol/g SH)

59

Koncentrace (mmol/g SH)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

TEAC extrakt"

Druhy čaje

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

y = 0,0294x + 0,0002 R2 = 0,9068

y = 0,1014x - 0,0176 2 R = 0,9008

Graf 7. Srovnání koncentrací fenolových látek stanovených FCM metodou a antioxidační aktivity stanovené TEAC metodou v extraktech v mmol/g SH (x +/- sx; n = 3).

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

4,000

FCM extrakt"

60

Koncentrace (mmol/g SH)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Druhy čaje

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

y = 0,0784x - 0,1711 2 R = 0,7914

y = 0,032x - 0,0074 2 R = 0,9725

TEAC výluh

Graf 8. Srovnání koncentrací fenolových látek stanovených FCM metodou a antioxidační aktivity stanovené TEAC metodou v extraktech v mmol/g SH (x +/- sx; n = 3).

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

4,000

FCM výluh

6

DISKUZE U černých (fermentovaných) čajů se celkové mnoţství fenolových látek pohybovalo

v rozmezí 0,297 – 0,758 mmol (v extraktech) a 0,577 – 0,813 mmol (ve výluzích) na g suché hmoty (SH); hodnoty antioxidační aktivity (kapacity) byly v rozmezí 1,086 – 2,588 mmol (v extraktech) a 0,984 – 1,778 mmol (ve výluzích) na g SH. Při porovnání jednotlivých druhů černých čajů byl zjištěn nejvyšší obsah fenolových látek u druhu Lipton - 0,758 mmol/g SH (v extraktu) a 0,704 mmol/g SH (ve výluhu) i nejvyšší antioxidační aktivita 2,588 mmol/g SH (v extraktu) a 1,531 mmol/g SH (ve výluh). Nejniţší obsah byl stanoven u druhu Zlatý šálek - 0,355 mmol/g SH (v extraktu) a 0,577 mmol/g SH (ve výluhu), také ve spojení s nejniţší antioxidační aktivitou 1,086 mmol/g SH (v extraktu) a 0,984 mmol/g SH (ve výluh). Ostatní druhy černých čajů byly srovnatelné (Spar, Jemča a Pickwick) (viz. Graf 1). U analyzovaných zelených (nefermentovaných) čajů se celkové mnoţství fenolových látek pohybovalo v rozmezí 0,281 – 1,046 mmol/g SH (v extraktu) a 0,484 – 0,997 mmol/g SH (ve výluhu); naměřené hodnoty antioxidační aktivity (kapacity)

byly

v rozmezí

0,832

–

3,669

mmol/g

SH

(v

extraktu)

a 1,005 – 2,643 mmol/g SH (ve výluhu). Nejvyšší obsah fenolových látek byl zjištěn u druhu Ahmad Tea - 1,046 mmol/g SH (v extraktu) a 0,997 mmol/g SH (ve výluhu), také s nejvyšší antioxidační aktivitou 3,669 mmol/g SH (v extraktu) a 1,986 mmol/g SH (ve výluh). Nejniţší obsah fenolových látek byl překvapivě u druhu Teekanne 0,281 mmol/g SH (v extraktu) a 0,484 mmol/g SH (ve výluhu), antioxidační aktivita byla rovněţ nejniţší 0,832 mmol/g SH (v extraktu) a 1,485 mmol/g SH (ve výluhu). Mezi další druhy s poměrně vysokým obsahem fenolových látek patří: Pickwick, Spar a Eurosoper (viz. Graf 2). Při porovnání naměřených výsledků s hodnotami uvedenými v německé publikaci Lebensmittel Under Suchen und Forschung je moţné konstatovat, ţe hodnoty jsou srovnatelné. Celkové mnoţství fenolových látek stanoveno M. Libertem a jeho kolektivem ve vodném výluhu (1 g /100 ml, 10 minut var) černých čajů bylo 0,437 mmol/g SH a antioxidační aktivita 2,769 mmol/g SH. V zeleném čaji jsme stanovili celkové mnoţství fenolových látek 0,807 mmol/g SH a antioxidační aktivitu 6,923 mmol/g SH. U bylinných čajů byly naměřené hodnoty obsahu fenolových látek v rozmezí 0,143 – 0,712 mmol/g SH (v extraktu) a 0,082 – 0,491 mmol/g SH (ve výluhu)

61

a hodnoty antioxidační aktivity (kapacity) v rozmezí 0,380 – 2,487 mmol/g SH (v extraktu) a 0,058 -1,005 mmol/g SH (ve výluhu). Nejvyšší obsah fenolových látek byl zjištěn u druhu Ostruţina - 0,712 mmol/g SH (v extraktu) a 0,491 mmol/g SH (ve výluhu) s

nejvyšší antioxidační aktivitou 2,487 mmol/g SH (v extraktu)

a 1,005 mmol/g SH (ve výluh). Nejniţší obsah fenolových látek byl stanoven u druhu Jitrocel - 0,143 mmol/g SH (v extraktu) a 0,082 mmol/g SH (ve výluhu) s antioxidační aktivitou 0,380 mmol/g SH (v extraktu) a 0,058 mmol/g SH (ve výluh). Bylinné čaje Malina, Meduňka a Jahoda vykazovaly také vyšší hodnoty (viz. Graf 3 a 4). Porovnáním hodnot obsahu fenolových látek a antioxidační aktivity u téhoţ druhu čaje je patrná pro většinu druhů jejich lineární korelace (viz. Graf 7 a 8). Obsah fenolových látek v čaje závisí nejen na druhu čaje, ale i na způsobu sklizně, popř. na stáří čerstvých lístků, ale především na technologií zpracování (fermentace). Vliv degradačních procesů na fenolové látky během fermentace byl potvrzen. Obsah fenolových látek a antioxidační aktivita klesá v pořadí: zelené > černé > bylinné. To zřejmě souvisí s vysokým obsahem katechinů v pravých čajích a částečným rozkladem fenolových látek fermentací v černých čajích. Naměřené hodnoty u různých druhů čajů budou významně ovlivněny extrakční metodou

a strukturními

vlastnostmi

bylin.

Pouţitá

methanolová

extrakce

(methanol/voda, 50:50 obj. % s 1,2 mol/l HCl, teplota 82 – 83 °C po dobu 2,5 hodiny) měla větší výtěţnost analyzovaných látek neţ vodní výluhy (1g/ 100 ml vody, teplota 80 °C, 15 minut louhování). Také rozpráškování bylin pro extrakty umoţňuje lepší vyextrahování látek neţ vodný výluh z jen částečně rozdrobených bylin. Také různá tuhost rostlinných materiálů (listy, květy, stonky) významně ovlivňuje extrakční schopnost. Existuje jen malý počet prací zabývající se stanovením celkových fenolových látek v čaji a bylinách. Publikované studie jsou většinou zaměřeny na stanovení jednotlivých fenolových látek, nebo extrakce jsou provedeny za jiných podmínek a stanovení jinou metodou, takţe je obtíţné srovnání výsledků. Mnoţství fenolových látek a antioxidační aktivita můţe být ovlivněno také stářím sušeného čaje a podmínkami skladování.

62

7

ZÁVĚR Listy čajovníku (Camelie sinensis L.) a různé části mnoha druhů bylin se pouţívají

k přípravě nálevu jiţ tisíce let. Čaj se tradičně spojoval se zlepšením krevního oběhu, zvýšením odolnosti vůči nemocem a se zlepšením vylučování škodlivých látek. Teprve v nedávných letech se prokázaly jeho příznivé antioxidační účinky v prevenci degenerativních nemocí a zpomalení stárnutí. Fenolové sloučeniny obsaţené v čaji jsou skupinou sloučenin chemicky značně různorodou a v důsledku toho mají rozmanité vlastnosti a biologické účinky. Fenolové sloučeniny jsou významné především díky vysoké antioxidační aktivitě, schopnosti neutralizovat volné radikály a zabránit oxidačním procesům. To hraje významnou roli v prevenci vzniku aterosklerózy a následnému vývoji srdečně-cévním onemocnění. Rutin a další glykosidy flavonoidů mají vliv na pruţnost a permeabilitu kapilár. Dostatečný příjem přírodních antioxidantů je také významný v prevenci i podpoře léčby nádorových onemocnění. Nejúčinnější antioxidační sloţkou pravých čajů je epikatechingallát, který se vylouhuje do nálevu jen zčásti. Např. z dvougramového sáčku zeleného čaje se vylouhuje asi 70 mg. U čaje a jeho sloţek byly také zjištěny příznivé účinky na trávicí systém a zdraví chrupu. V čaji jsou obsaţeny kromě polyfenolů i jiné biologicky nebo farmakologicky působící látky. Čajové lístky obsahují 2,5 – 5,5 % kofeinu, to dopovídá asi 50 – 100 mg kofeinu při 2 g čaje na 150 ml nápoje. Kofein má příznivý vliv na prokrvení tkání a má mírný stimulační účinek na duševní činnost. Čaj obsahuje i mnoho důleţitých vitamínů, minerálních látek a stopových prvků. Látkové sloţení bylinného čaje je velmi specifické pro kaţdý druh i část byliny. Bylinné čaje mají v medicíně nezastupitelné místo díky svým farmakologickým účinkům. Jako přírodní látky jsou lidskému organismu bliţší, přirozenější oproti syntetickým farmakologickým přípravkům, které mnohdy vykazují vedlejší účinky a různé projevy nesnášenlivosti. Po vyhodnocení výsledků byl zjištěn nejvyšší obsah fenolových látek a antioxidační aktivity ve vzorcích pravých čajů. Naměřené hodnoty druhů zelených čajů byly nejvyšší a prokázaly degradační účinek fermentace, kdy dochází k významným změnám fenolových látek. Bylinné čaje, jak bylo potvrzeno, vykazují také antioxidační vlastnosti.

63

Ze znázorněných grafů byla prokázána lineární korelace mezi obsahem fenolových látek a antioxidační aktivitou a při porovnání výsledků s publikovanými údaji byla potvrzena srovnatelnost výsledků. Stanovení obsahu polyfenolů v potravinách a antioxidační aktivity je důleţité, protoţe fenolové látky mají nejen vliv na chuť a barvu potravin, ale především mají klíčový význam pro hodnocení biologické hodnoty a kvality potravin. Čaje jsou významným zdrojem antioxidantů a jako nápoj můţe být čaj součástí kaţdodenní stravy. Vhodná výţiva prokazatelně můţe sehrát významnou roli v prevenci řady civilizačních chorob, přispět k prodlouţení délky ţivota i jeho kvality a významně sníţit náklady na zdravotnictví.

64

8

POUŢITÍ LITERATURA

ALMAJANO P. M., CARBO´ R., JIME´NEZ A. J. L., GORDON H. M., 2008: Antioxidant and antimicrobial activities of tea infusions. Food Chemistry 108, 55–63 s. ARCIMOVIČOVÁ J., VALÍČEK P., 2000: Vůně čaje. Benešov, 145 s., ISBN 8086231-10-0 BÉLIVEAU R., GINGRAS D., 2008: Aliments contre le cancer. Canada, 213 s., ISBN 978-80-702-907-2

BELITZ H. D., GROSCH W., SCHIEBERLE P., 2009: Tea and Tea-Like Products. Food Chemistry. Springer-Verlag. Berlin. ISBN 978-3-540-69933-0 BENEŠOVÁ L., 2000: Potravinářství VI. Praha, 150 s., ISBN 80-7271-003-6

BALENTINE D. A., HARBOWY M. E., 1997: Tea chemismy. Critical Review in Plant Sciences, 16/5, 415 480 s. DAVIS et al., 2002: Obsah celkových polyfenolových antioxidantů v zelených, černých a polofermentovaných čajích a vliv doby louhování na jejich obsah. In: HORNA A.: Vitaminy 2002. Sborník abstraktů z konference 3 – 5. 9. 2002. Univerzita Pardubice, 271 s., ISBN 80.7194.451-3 CHOW K., KRAMEROVÁ L., 1998: Všechny čaje Číny. Praha, 284 s., ISBN 8085905-54-x

HALLIWELL B.; GUTTERIDGE J. M. C., (eds), 1999: Free Radical in Biology and Medicine. Oxford University Press, UK, 617 s. HERTOG et al., 2002: Obsah celkových polyfenolových antioxidantů v zelených, černých a polofermentovaných čajích a vliv doby louhování na jejich obsah. In: HORNA 65

A.: Vitaminy 2002. Sborník abstraktů z konference 3 – 5. 9. 2002. Univerzita Pardubice, 271 s., ISBN 80.7194.451-3 FIDLER M., KOLÁŘOVÁ L., 2009: Analýza antioxidantů v chmelu a pivu. Chemické listy 103, 232-235 s.

FRANKLE, HUANG, 2003: Plants as sources of natural antioxidants, In: HORNA A.: Vitaminy 2003. Sborník abstraktů z konference 15.– 17.9, 2003. Univerzita Pardubice 260 s., ISBN 80-7194.549-8

ITO

N.,

HIROSE

M.,

IMAIDA

K.,

1997:

Antioxidants:

Carcinogenic

and chemoprevenive properties. Encyclopedia of Cancer, Vol 1, 89-101 s., Elsevier Sci. USA KALAČ P., 2001: Organická chemie přírodních látek a kontaminant. Jihočeská univerzita, České Budějovice. 120 s., ISBN 80-7040-520-1 KALAČ P., 2003: Funkční potraviny. Dona s.r.o., České Budějovice. 130 s., ISBN 807322-029-6 KADLEC P., 2002: Technologie potravin. VŠCHT, Praha. 236 s., ISBN 80-7080-510-2

KATECHR H.I., GiILLES P.J., KRIS-ETHERTON P.M., 2006: Atherosclerotic Cardiovascular Disease, 649 s., In: Presnt Knowledge in Nutrition, 9. Ed, Vol II, Eds. B.A. Bowman; R. M. Russell, ILSI, Washington DC

KONG Y-T., IMABAYASHI S., KANO K., 2001: Am. J. Enol. Vitic. 52/4, 381-385 s. KREJČÍ I., 2000: O kávě a čaji, Praha, 100 s., ISBN 80-7169-535-1 LACHMAN J. et al 2002: Rostlinné přírodní fenolové antioxidanty – jejich role a význam v zemědělství, potravinářství a farmacii. In: HORNA A.: Vitaminy 2002. Sborník abstraktů z konference 3 – 5. 9. 2002. Univerzita Pardubice. 271 s., ISBN 80.7194.451-3

66

LIEBERT M., LICHT U., BÖHM V., BITSCH H., 1998: Antioxidant properties and total phenolics content of green and black tea under different brewing conditions. Lebensm Unters Forsch A208 :217–220 s., Q Springer-Verlag. Germany LONG L. H.; HALLIWELL B., 2001: Flavonoids and Other Polyphenol. Methods in Enzymology, vol. 335, Packer, L., (ed.), Academic Press, London, 181-190 s. LÜBECK W., 1998: Grüner Tee heilkräftiger Genuß. Germany. 141 s., ISBN 978-807336-413-7

MIDDLETON E. J.; KANDASWAMI C., 1992: Effekts of flavonoids on immune and inflamatory cell fiction. Biochem. Pharmacol. 43, 1167-1179 s.

MIKA K., 1988: Fytoterapia Osveta, Martin. 432 s.

MURRAY R., GRANNER K., MAYES P., RODWELL V. 1998: Harper s Biochemistry, 2. vydání, Praha. 872 s., ISBN 80-8578-38-5 O´BRIEN P. J., 1994: Free Radicals in Diagnostic and Medicine. Armstrong, D. (ed), Plenum Press, NY and London. ORTEMBERGOVÁ A., 2002: Mládneme s antioxidanty. Praha, ISBN 80-237-3742-2

PACKER, L.; RIMBACH, G.; VIRGILI, F., 1999: Free Rad. Biol. Med. 27, 704-724 s. PARKÁNYIOVÁ P., 2003: Plants as sources of natural antioxidants, In: HORNA A.: Vitaminy 2003. Sborník abstraktů z konference 15.– 17.9. Univerzita Pardubice. 260 s., ISBN 80-7194.549-8

PASSWATER A., 2002: All about antioxidants. Praha, ISBN 80-7205-897-5 PAULOVÁ H., BOCHOŘÁKOVÁ H., TÁBORSKÁ E., 2000: Metody stanovení antioxidační aktivity přírodních látek in vitro. Chemické listy 98, 174 – 179 s.

67

RE R., PELLEGRINI, N., PROTEGGENTE, A., PANNALA, A., YANG, M., RICEEVANS C., 1999: Free Rad. Biol. Med., Svojtka & Co. 1231-1237 s. RECMAN T., 2002: Zelený čaj. Svojtka & Co, Praha, 133s., ISBN 80-7237-651-9 SLANINA J., TÁBORSKÁ E., 2004: Příjem, biologická dostupnost a metabolismus rostlinných polyfenolů u člověka. Chemické listy 98, 239-245 s.

SPILKOVA J., HUBIK J., 1992: Biologische wirkungen von flavonoiden. II. Pharm. Unserer Zeit, 21, 174-182 s. STRATIL P., KUBÁŇ V., 2004:

Principles of Carcinogenesis and Natural

Cancerogens in Foodstuffs. Chemické Listy 98, 379−387 s. STRATIL P., KUBÁŇ V., 2005: Přírodní antioxidanty: stanovení obsahu fenolových sloučenin a jejich antioxidační aktivity v zelenině, ovoci, zrninách a alkoholických nápojích. Disertační práce. MZLU v Brně, 150 s. STRATIL P., KLEJDUS B., KUBÁŇ V., 2006 Determination of Total Content of Phenolic Compounds and Their Antioxidant Activity in Vegetabless: evaluation of Spectrophotometric Methods. J. Agric. Food Chem. 54, 607-616 s. STRATIL P., KLEJDUS B., KUBÁŇ V., 2007: Determination of phenolic compounds and their antioxidant activity in fruits and cereals. Talanta. 71, 1741-1751 s.

SVITKO J., 2002: Sekrety neuropatii. Bratislava. 135 s., ISBN 80-89115-22-5 VALÍČEK P., 2007: Pochutiny a koření. MZLU, Brno, 84 s., ISBN 978-80-7375-049-7 VELÍŠEK J., 2002: Chemie potravin 1,2,3,OSSIS Tábor. ISBN 80-86659-03-8 (soubor)

VINSON J. A.; PROCH J.; BOSE P., 2001: Flavonoids and Other Polyphenols. Methods in Enzymology. 335, 103-114 s.

68

VYHLÁŠKA č. 330/1997 Sb. ve znění vyhl. 30/2000

WITZTUM J. L.; STEINBERG D., 1991: Role of oxidized low density lipoproteins in atherogenesis. J. Clin. Invst. 88, 1785 s. WEISBURGER J. H., 1996: Handbook of antioxidants. Tea antioxidants and health. Valhalla. New York. 467-510 s. YAMAMOTO et al., 2002: Obsah celkových polyfenolových antioxidantů v zelených, černých a polofermentovaných čajích a vliv doby louhování na jejich obsah. In: HORNA A.: Vitaminy 2002. Sborník abstraktů z konference 3 – 5. 9. 2002. Univerzita Pardubice. Pardubice. 271 s., ISBN 80.7194.451-3

YANG CH. S, LAMBERT J. D., SANG S., 2009: Antioxidative and anti-carcinogenic activities of tea polyphenols. Arch. Toxicol. 83:11–21 s.

YILMAZ Y., 2006: Novel uses of catechins in foods.Trends in Food Science & Technology 17, 64–71 s. Další

internetové

zdroje

-

online

[cit.

2011-04-03].

Dostupné

http://www.uzis.cz/katalog/rocenky/zdravotnicka-rocenka-ceske-republiky http://cs.wikipedia.org/wiki/Apoptóza

69

na:

9

SEZNAM OBRÁZKŮ, TABULEK A GRAFŮ

Seznam obrázků Obr.1

Vzorce syntetických antioxidantů.

17

Obr. 2 Metabolismus antioxidantů

19

Obr. 3 Schéma třídění tříslovin

22

Obr. 4 Prokyanidiny (Flavan-3-oly)

23

Obr. 5 2H-chromen a flavan

24

Obr. 6 Struktura flavonoidů (chalkony, dihyrochalkony, aurony)

25

Obr. 7 Reakce katalyzované polyfenoloxidasami s aktivitou kresolas a katecholas 27 Obr. 8 Působení protirakovinných látek

34

Seznam tabulek Tabulka 1. Obsah fenolových látek čerstvých čajových lístků (% sušiny)

28

Tabulka 2. Faktory podílející se na incidenci nádorových onemocnění

33

Tabulka 3. Preventivní účinky čaje vůči nádorovému bujení

35

Tabulka 4. Analyzované druhy čaje

černé čaje

42

Tabulka 5. Analyzované druhy čaje

zelené čaje

42

Tabulka 6. Analyzované druhy čaje

bylinné čaje

43

Tabulka 7. Obsah fenolových látek ve výluhu a methanol. extraktu černých čaj

47

Tabulka 8. Obsah fenolových látek ve výluhu a methanol. extraktu zelených čaj

48

Tabulka 9. Obsah fenolových látek ve výluhu a methanol. extraktu bylinných čajů

49

Tabulka 10. Antioxidační aktivita ve výluhu a methanol. extraktu černých čajů

50

Tabulka 11. Antioxidační aktivita ve výluhu a methanol. extraktu zelených čajů

51

Tabulka 12. Antioxidační aktivita ve výluhu a methanol. extraktu bylinných čajů

52

Seznam grafů Graf 1 Srovnání koncentrací fenolových látek stanovených FCM metodou a antioxidační aktivity stanovené TEAC metodou v extraktech a výluzích černých čajů v mmol/g SH

53

Graf 2 Srovnání koncentrací fenolových látek stanovených FCM metodou a antioxidační aktivity stanovené TEAC metodou v extraktech a výluzích zelených čajů v mmol/g SH Graf 3 Srovnání koncentrací fenolových látek stanovených FCM 70

54

metodou a antioxidační aktivity stanovené TEAC metodou v extraktech a výluzích bylinných čajů v mmol/g SH

55

Graf 4 Srovnání koncentrací fenolových látek stanovených FCM metodou a antioxidační aktivity stanovené TEAC metodou v extraktech a výluzích bylinných čajů v mmol/g SH

56

Graf 5 Srovnání koncentrací fenolových látek stanovených FCM metodou v extraktech a výluzích (1 - 5 černých, 6 - 15 zelených; 16 30 bylinných čajů) v mmol/g SH

57

Graf 6 Srovnání antioxidační aktivity stanovené TEAC metodou v extraktech a výluzích (1 - 5 černých, 6 - 15 zelených; 16 30 bylinných čajů) v mmol/g SH

58

Graf 7 Srovnání koncentrací fenolových látek stanovených FCM metodou a antioxidační aktivity stanovené TEAC metodou v extraktech čajů

59

Graf 8 Srovnání koncentrací fenolových látek stanovených FCM metodou a antioxidační aktivity stanovené TEAC metodou ve výluzích čajů

71

60

10 PŘÍLOHY Příloha 1 Charakteristika vzorků

72

Příloha 2 Tabulka 1. Porovnání mnoţství hlavních obsahových látek

76

(% ze sušiny) v čerstvých a fermentovaných čajových lístcích a ve výluhu černého čaje Příloha 3 Tabulka 2. Obsaţené látky v čaji a jejich farmakologický význam

72

77

Příloha 1

Charakteristika vzorků Pravý čaj Čajem pravým rozumíme čaj vyrobený z listů, výhonků, pupenů a jemných částí zdřevnatělých stonků čajovníku (Camellia sinennsis (Linaeus) O. Kunze (Vyhl. č. 330/1997 Sb. ve znění vyhl. 30/2000). Sklizený čajový list je zpracováván různými technologiemi, jejichţ výsledkem jsou následující druhy: čaj zelený – nefermentovaný, čaj ţlutozelený – polofermentovaný, čaj černý – fermentovaný. Bylinný čaj Bylinný čaj se skládá z částí bylin (květů, listů, plodů, semen, atd.) nebo jejich směsí nebo směsí bylin s pravým čajem nebo s ovocem, přičemţ obsah bylin musí činit minimálně 50 % hmotnosti (Vyhl. č. 330/1997 Sb. ve znění vyhl. 30/2000). K analýze v této práci byly pouţity druhy čaje sloţené pouze z jedné byliny. Bez černý (Sambucus nigra l.) Droga: květ, plod. Obsahové látky: květy – silice (0,2 %), flavonoidy (3 % rutinu, astragalin, kvercetin, izokvercetin), aminy (cholin, etylamin, izobutylamin), organické kyseliny (valeriánová, askorbová), fenolové látky (kyselina kávová, chlorogenová), rozkladové produkty glykosidu sambunigrinu (kyselina mandlová), HCN, glukóza, sliz (9 %). Plody – antokyany, organické kyseliny (jablečná, citrónová, chinová, chlorogenová, askorbová), třísloviny (3 %), karotenoidy, vitaminy komplexu B, redukující sacharidy. Vlastnosti: květ – potopudné, močopudné, antibakteriální v dutině ústní, zvyšuje krevní tlak. Plod – projímavý účinek, potopudné, močopudné, zmírňuje, odstraňuje bolesti. Heřmánek pravý (Matricaria recutita l.) Droga: květ Obsahové látky: silice (aţ do 3 %) s modrými azulénmi (18 % chamazulénu), seskviterpen, bisabolon, farnezén a spiroetery, dále obsahuje flavonoidy (apiin, apigenin, luteolin, kvercetin, patulitin), seskviterpenové sloučeniny (uhlovodíky, alkoholy), polyiny, kumarinové látky (umbeliferon, herniarin), do 0,43 % cholinu, sliz a hořčiny.

73

Vlastnosti: má účinek protizánětlivý potopudný, proti nadýmání, uvolňuje křeče, příznivě působí na pleť a osvěţuje v koupelích. Jahodník obecný (Fragaria vesca l.) Droga: list, nať, kořen, plod. Obsahové látky: třísloviny (listy 5 %, kořen 10 %), které tvoří deriváty kyseliny elagové a galusové, z minerálních látek je to zejména draslík, dále jsou to flavanoidy (kvercitrin, kvercetin), kyselina askorbová, silice. Plod – sacharidy, pektiny, karotenoidy, vitaminy B, C, organické kyseliny, aromatické látky, antokyan (fragarin). Vlastnosti: má stahující a močopudný účinek. Kopřiva (Urtica) Droga: list, nať, kořen. Obsahové látky: chlorofyl (0,8 %), minerální látky (12,5 – 18,5 %): Ca, P, Mg, Fe; Krotenoidy: violaxantin, lykopen, flavonoidy, organické kyseliny (jablečná, askorbová, jantarová, citrónová, fumarová, glycerolová, listová), aminy (histamin, serotonin, cholin), vitaminy (laktoflavin, kyselina, pantetonová, vitamin K), aminokyseliny, methylheptenon, acetofenon, fytocidní látky, třísloviny, sacharidy. Vlastnosti: účinek močopudný, proti průjmu, antibakteriální, posiluje organismus, je zdroj vitamínů, podporuje látkovou výměnu, je antirevmatikum, můţe doplňovat léčbu cukrovky, zastavuje krvácení, příznivě působí při léčení koţních chorob a na pleť. Lípa (Tilia) Droga: květ Obsahové látky: květ – slizy, třísloviny, glykosid tilirozid, silice s farnezolem (0,04 – 0,01 %), flavonoidy (kvercetin, kvercetrin, hesperidin), organické kyseliny, saponiny, fytosteroly. Vlastnosti: ulehčuje odkašlávání, má účinek močopudný a potopudný, zvyšuje vylučování ţlučie uvolňuje křeče, podporuje chuť k jídlu, příznivě působí na pleť a osvěţuje v koupelích. Máta peprná (Mentha piperin l.) Droga: list, nať, Obsahové látky: silice (1 – 3 %); z toho představuje 50 % mentol, nejméně 5 % jeho estery s kyselinou octovou a valerovou), dále felndrén, pinén aj. Z dalších obsahových látek jsou to třísloviny (aţ 12 %), hořčiny a flavonové glykosidy. 74

Vlastnosti: podporuje chuť k jídlu, působí proti nadýmání, je aromatikum, uvolňuje křeče, podporuje tvorbu a vylučování ţluče, zmírňuje bolesti, má účinek povzbuzující, znecitlivující a antibakteriální. Mateřídouška obecná (Thymus serpyllum l.) Droga: nať. Obsahové látky: silice (1 % tymol, karvakrol, linalol, terpineol, pinen), třísloviny (do 7,5 %), saponiny, hořčiny (serpylin), flavony, minerální látky. Vlastnosti: podporuje chuť k jídlu, tlumí kašel, ulehčující odkašlávání, má účinek antibakteriální, stahující, osvěţující, do aromatických koupelí. Meduňka lékařská (Melissa oficinalis l.) Droga: list, nať. Obsahové látky: silice (0,3 – 0,5 %), v kterých je geraniol (do 45 %), citronellal (do 50 %), linalol, citral aj. Z dalších látek asi 5 % tvoří třísloviny, sliz, flavonoidy, triterpenové kyseliny (oleánová, ursolová). Vlastnosti: má účinek uklidňující, tlumivý na CNS, uvolňuje křeče, potopudný, proti nadýmání, podporuje chuť k jídlu. Měsíček lékařský (Calendula officinalis l.) Droga: květ. Obsahové látky: karotenoidy (do 3 %), silice (0,2 %), triterpenové saponiny, faradiol, arnidiol, flavonové glykosidy (aglykon, izoramnetin), hořčina kalendén, salicylováou kyselinu, vitamin C, ţivice (3,4 %), sliz (do 4 %), seskviterpen, kalendin, polyacetyleny, polyiny. Vlastnosti: má účionek protizánětlivý, povzbuzující, k léčení koţních chorob, hojení ran, příznivě působí na pleť, uvolňuje křeče, upravuje barvu. Ostruţník křovitý (Rubus fruticosus l.) Droga: list, nať, plod. Obsahové látky: Listy - třísloviny galotaninového typu (8 %), organické kyseliny, flavonoidy, inozit, barvivo, pektin. Plody obsahují antokyanové glykosidy, organické kyseliny. V semenech se nachází asi 13 % oleje. Vlastnosti: Listy – má účinek stahující, proti průjmu, antibakteriální v dutině ústní, zvyšuje tvorbu ţluče. Plod – zdroj vitamínů, účinek močopudný.

75

Ostruţník maliník (Rubus ileus l.) Droga: list, plod. Obsahové látky: Listy – třísloviny, organické kyseliny, flavony. Plody obsahují do 2 % organických kyselin, karotenoidy, vitaminy skupiny B, kyanidin, alkoholy, aldehydy. V semenech se nachází asi 13 % oleje. Vlastnosti: Listy – má účinek stahující, uvolňuje křeče; plod – potopudný, je vonné a chuťové aroma. Růţe šípková (Rosa canina l.) Droga: list, plod, semena. Obsahové látky: Květ – třísloviny (10 − 24 %) s kyselinou gallovou, flavonoidy (kvercetin), antokyany (cyanin).

Plod – kyselina

askorbová a dehydroakorbová (1,8 %, některé druhy aţ 6 %), kyselina nikotinová, vitamin P, K, riboflavin, thiamin, dále karotenoidy, flavonoidy (heterozidy kemferolu a kvercetinu), pektiny, třísloviny, silice. Semena – vitamin E, silice (0,3 %), vanilin, olej, organické kyseliny. Vlastnosti: Květ – má účinek stahující; plod – močopudný, zvyšuje tvorbu ţluči, je tonikum, zdroj vitamínů, podporuje látkovou výměnu; semeno – účinek močopudný, k léčbě revmatoidní artritidy, proti nervovým bolestem. Řepík lékařský (Agrimonia eupatoria l.) Droga: nať. Obsahové látky: katechinové třísloviny (5 aţ 8 %), glykosidicky vázaná hořčina, silice (0,2 %), kyselinu křemičitá (aţ 12 %) Vlastnosti: má účinek stahující, močopudný, protizánětlivý, podporuje chuť k jídlu, zvyšuje tvorbu ţluči. Třapatka nachová (Echinacea purpurea) Droga: květy, listy, stonky, kořeny. Obsahové látky: fenolové látky (echinakosid), nenasycené

alifatické

sloučeniny

alkylamidy,

echinocein,

izobutylamidy),

polysacharidy, kyselina chicoriková (1,2 – 3,1 %). Silice (borneol, germacren D, caryophyllen). Vlastnosti: má účinek antidepresivní, antimikrobiální proti aftám, opakovaným infekcím dýchacích a močových cest, urychluje hojení povrchových ran a koţních zánětů, stimuluje imunitní systém.

76

Příloha 2 Tabulka1. Porovnání množství hlavních obsahových látek (% ze sušiny) v čerstvých, a fermentovaných čajových lístcích a ve výluhu černého čaje (Belitz et al., 2009) Látka

Černý čaj

Čerstvý lístky

Černý čaj

Fenolové sloučeninyb

30

5

4,5

Oxidované fenolové sloučeninyc

0

25

15

Proteiny

15

15

+d

Aminokyseliny

4

4

3,5

Kofein

4

4

3,2

Hrubá vláknina

26

26

0

Jiné uhlohydráty

7

7

4

Lipidy

7

7

+

Pigmentye

2

2

+

0,1

0,1

0,1

5

5

4,5

Těkavé sloučeniny Minerální látky a

výluha

doba vaření 3 min. b Většinou flavanoly. c Převáţně thearubiginy. d stopy. e chlorofylu a karotenoidů

77

Příloha 3 Tabulka 2. Obsažené látky v čaji a jejich farmakologický význam (Recman, 2002) Obsaţená látka

Účinek vylučuje škodlivé látky, rozvádí ţiviny, rozpouštědlo při látkové výměně, udrţuje teplo

Voda

roztahuje cévy, povzbuzuje duševní schopnosti, soustředěnost, schopnost se učit, zlepšením prokrvení působí proti bolestem

Kofein

hlavy a migréně, je močopudný, ovlivňuje činnost nervů a srdce Vitamin C

antioxidační, posiluje imunitní systém, pokoţku a sliznice, sniţuje stres, hladinu cholesterolu, umoţňuje příjem ţeleza a vápníku

Vitaminy

Betakarotén posiluje zrak, kosti, nervy, rozmnoţovací orgány, chrání před volnými radikály Vitaminy B

posilují kosti, nervy, trávení, energetickou výměnu, pokoţku a vlasy,

Vitamin K

posiluje kosti, ovlivňuje sráţlivost krve

Fluor

chrání chrup a kosti

Minerální

Vápník

posiluje kosti

látky

Mangan

posiluje kosti, metabolismus vápníku, vazivo, spalování tuků, ovlivňuje sráţlivost krve

Stopové

Železo

doprava kyslíku v krvi, buněčné oxidace

prvky

Draslík

činnost mozku, nervů, detoxikace

Druhotné rostlinné látky

vliv na trávení, brání zánětům, upravují krevní tlak, hladinu cukru a cholesterolu v krvi

Třísloviny

vliv na trávení, chrání před bakteriemi

Polyfenoly EGCG

chrání před volnými radikály a viry, upravují hladinu cukru

Flavonoidy

ochrana před volnými radikály, sniţují krevní tlak, hladinu cholesterolu, chrání před alergiemi

Silice

povzbuzují, uvolňují, chrání před bakteriemi

Saponiny

chrání před ukládáním tuků a plísněmi 78