Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
BRNO 2011
Zuzana HRDINOVÁ
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie
Význam nanotechnologií v potravinářství Bakalářská práce
Brno 2011
Vedoucí diplomové práce:
Vypracoval/a:
Ing. Soňa Křížková, Ph.D.
Zuzana Hrdinová
Prohlášení
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma: Význam nanotechnologií v potravinářství vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.
Dne 30. Dubna 2011
Zuzana Hrdinová
Poděkování Zde bych ráda poděkovala za cenné rady a pomoc vedoucí své bakalářské práce Ing. Soně Křížkové Ph.D., dále Mgr. Olze Kryštofové, RNDr. Vojtěchu Adamovi Ph.D. Ing. Renému Kizekovi Ph.D., Ing. Jiřímu Sochorovi, celému kolektivu laboratoří metalomiky a nanotechnologií a v neposlední řadě také NanoBioTECell GA ČR P102/11/1068 za finanční podporu projektu.
Abstrakt
Nanotechnologie a nanověda jsou novými oblastmi výzkumu a lidského poznání. Jejich aplikace v zemědělství a potravinářství jsou ve srovnání s např. lékařskými a farmaceutickými aplikacemi poměrně nové. V potravinářské oblasti se otevírají možnosti uplatnění nanočástic v obalové technologii, doručování nutrientů, nanosenzorů, mikrofliudních technologií, atd. Účinky nanomateriálů na lidský organismus a životní prostředí jsou doposud nedostatečně prozkoumány. Díky jejich mnohonásobně většímu povrchu se mohou projevit toxické efekty, které u „běžných“ materiálů nejsou známy. Pro posouzení bezpečnosti nanomateriálů je proto nezbytné také studium jejich efektu na modelové organismy.
Abstract Nanotechnology and nanoscience are new areas of research and human cognition. Their application in agriculture and food are relatively new in comparison with medical and pharmaceutical applications. The food industry is opening up possibilities of nanoparticles in packaging technology, nutrient delivery, nanosensors, mikrofliudic technology, etc. The effects of nanomaterials on humans and the environment are still poorly understood. There is possibility to occur toxic effects, which are not known in “normal” materials, because of their much larger surface. It is necessary to study their effects on model organisms to assess the safety of nanomaterials.
OBSAH: ÚVOD ......................................................................................................................... 8 1. DEFINICE POJMŮ „NANOVĚDA“ A „NANOTECHNOLOGIE“............................ 9 2. NANOTECHNOLOGIE V PŘÍRODĚ .................................................................... 10 3. POTENCIÁLNÍ APLIKACE NANOTECHNOLOGIE V POTRAVINÁŘSTVÍ......... 12 3.1 NANOSENZORY PRO DETEKCI PATOGENŮ A KONTAMINANTŮ .................12 3.1.1 Nanozařízení pro ochranu identity (IP) a vysledování ................................................12 3.1.2 Nanozařízení pro inteligentní systémy zajišťování nápravy .......................................12 3.1.3 Nanomateriály, problematika životního prostředí, zemědělského odpadu a nanočástic v životním prostředí..............................................................................................................12 3.1.4 Nanolamináty. Vytváření jedlých folií a potahů. Aplikace funkčních složek.............13 4. PŘÍKLADY REALIZOVANÝCH APLIKACÍ NANOTECHNOLOGIE V POTRAVINÁŘSTVÍ .................................................................................................. 15 4.1 ANTIBAKTERIÁLNÍ ÚČINKY NANOSTŘÍBRA, NANO ZnO ...............................15 4.1.1 Nanočástice oxidu zinku..............................................................................................15 4.2 REGULOVANÉ UVOLŇOVÁNÍ FUNKČNÍCH A AKTIVNÍCH SLOŽEK ...........15 4.3 SOLUBILIZACE POTRAVINÁŘSKÝCH ADITIV/FYZIOLOGICKY AKTIVNÍCH LÁTEK............................................................................................................16 5. BEZPEČNOST NANOTECHNOLOGIE................................................................ 19 5.1.1 Expozice pokožky nanočásticím .................................................................................19 5.1.2 Inhalace nanočástic......................................................................................................19 5.1.3 Konzumace nanočástic ................................................................................................19 5.2 POTENCIÁLNÍ ZDRAVOTNÍ RIZIKO POTRAVINÁŘSKÝCH MATERIÁLŮ ZÍSKANÝCH POMOCÍ NANOTECHNOLOGIE ...................................20 6.1 Nanočástice........................................................................................................................22 6.2 Fytotoxicita nanočástic.....................................................................................................24 6.2.1 Uhlíkové nanočástice...................................................................................................24 6.2.2 Kovové nanočástice.....................................................................................................25 6.3. Příjem, translokace a akumulace nanočástic ................................................................27 6.4. Interakce nanočástic s rostlinnými buňkami ................................................................28 7. CÍL PRÁCE ........................................................................................................................29 8. MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ ............................................................... 30
8.1. Příprava vzorku ...............................................................................................................30 8.2. Použité metody .................................................................................................................33 8.2.1. Stanovení celkových proteinů ....................................................................................33 8.2.2. Stanovení aktivity enzymu glutathion S-transferázy..................................................33 8.2.3. Stanovení celkových thiolových skupin pomocí Ellmanova činidla..........................34 8.2.4. Metody stanovení antioxidační aktivity .....................................................................34 9. VÝSLEDKY A DISKUSE ...................................................................................... 37 9. 1 RŮST BUNĚK TABÁKU V ZÁVISLOSTI NA KONCENTRACI NANOČÁSTIC 37 9. 2 STANOVENÍ CELKOVÉHO POČTU BÍLKOVIN....................................................38 9.3 VÝSLEDKY HODNOT ENZYMOVÉ AKTIVITY .....................................................39 9.3.1 Ellmanova metoda .......................................................................................................39 9.3.2 Glutation transferáza....................................................................................................40 9.4.1 ABTS ...........................................................................................................................41 9.4.3 DPPH ...........................................................................................................................43 9.4 VÝSLEDKY HODNOT ANTIOXIDAČNÍ AKTIVITY STANOVENÉ POMOCÍ METOD ZALOŽENÝCH NA REAKCI KOVŮ S ANALYZOVANÝM VZORKEM ...44 9.4.1 BLUE CrO5..................................................................................................................44 9.4.2 Srovnání antioxidačních aktivit – shrnutí ....................................................................45 ZÁVĚR...................................................................................................................... 46 ZKRATKY................................................................................................................. 47 LITERATURA ........................................................................................................... 48 SEZNAM OBRÁZKŮ................................................................................................ 50
Úvod Nanotechnologie – vytváření částic nanorozměrů a manipulace s těmito nanočásticemi – se považuje za jeden z nejbouřlivěji se rozvíjejících oborů lidské činnosti. Existuje názor, že nanotechnologie představuje revoluci v agro-potravinářském sektoru. Mnoho zemí investuje do výzkumu a především pak do praktického využití nanotechnologie velké finanční prostředky a očekává, že jim tyto investice zajistí vedoucí postavení na trhu. Ačkoliv dosud není vždy zcela objasněna bezpečnost produktů získaných pomocí nanotechnologie, na trhu již existuje řada výrobků, při jejichž výrobě byla nanotechnologie použita. Některé firmy, zvláště v Asii, z reklamních důvodů zdůrazňují aplikaci nanotechnologie ve výrobě. Propagace této technologie má navozovat, že výrobky mají výjimečné pozitivní vlastnosti. To však nemusí vždy odpovídat skutečnosti jak z hlediska použité technologie, tak z hlediska vlastností výrobků. Vzhledem k chybějící legislativě řada firem aplikaci nanotechnologie ve výrobě raději neuvádí. Důvodem jsou nevyjasněné otázky bezpečnosti výrobků jak pro spotřebitele, tak i pro životní prostředí. Tato situace vede k tomu, že přibývá mezinárodních akcí, na kterých se vedle potenciálních dalších aplikací nanotechnologie v agropotravinářském sektoru diskutuje o bezpečnosti této technologie. Budoucí potřeby výzkumu Přes rychlý pokrok ve studiu fytotoxicity, vychytávání a hromadění nanočástic v posledních dvou letech, jsme stále na začátku této oblasti. Ve studiu fytotoxicity nanočástic je zřejmě nejnaléhavější potřebou vybudovat spojení mezi vlastnostmi nanočástic (např. plocha, velikost částic, činnost na povrchu) a fytotoxicitou. Stejně důležité je, že je třeba pochopit roli druhů rostlin a složení nanočástic na fytotoxicitu nanočástic. Ukazuje se, že výhody z aplikace nanotechnologie se nemusí projevit pouze v nepotravinářských oborech. Postupným vývojem se zjistilo, že nanotechnologie již našla svoje uplatnění v agropotravinářském sektoru a počet těchto aplikací se stále zvyšuje. Aby se produkty
nanotechnologie
objevily
v
praxi,
je
zapotřebí
nejprve
investovat
do výzkumu zaměřeného na technologii, ale i bezpečnost. Zůstává tak na výrobcích potravin,
aby
zvážili,
ekonomický prospěch.
zda
aplikace
nanotechnologie
jim
přinese
očekávaný
1. DEFINICE POJMŮ „NANOVĚDA“ A „NANOTECHNOLOGIE“ Mezi světem atomů a současným reálným světem leží oblast nanosvěta, území částic a struktur o rozměru od ca 1 nm do ca 100 nm. Nanostruktury, které jsou základními prvky nanomateriálů, jsou dostatečně malé na to, aby se v nich mohly uplatňovat kvantové jevy.
Zkoumání
fyziku
pevné
těchto fáze,
jevů
je
předmětem
chemii,
nanovědy,
inženýrství
a
vědní
oblasti
molekulární
zahrnující
biologii
[1].
Nanotechnologie je nová oblast soustřeďující klasické vědecké obory jako jsou fyzika, kvantová mechanika, chemie, biochemie, elektronika atd. při vývoji materiálů, zařízení a funkčních systémů s výjimečnými vlastnostmi, vyplývajícími z kvantové podstaty a schopnosti samoorganizace hmoty v rozměru nanometrů. V americkém programu “Národní nanotechnologická iniciativa (NNI)” (ve znění z března 2004) je použita tato definice: Nanotechnologie je výzkum a technologický vývoj na atomové, molekulární nebo makromolekulární úrovni, v rozměrové škále přibližně 1–100 nm. Je to též vytváření a používání struktur, zařízení a systémů, které mají v důsledku svých malých nebo intermediárních rozměrů nové vlastnosti a funkce. Je to rovněž dovednost manipulovat s objekty na atomové úrovni. [1] V rámci zpracovávání studie “The Nanotechnology Study“ v britské The Royal Society v roce 2003 byly použity tyto definice: Nanověda
je
studium
hmoty
na
atomové
a
molekulární
úrovni
(obvykle
od
0,1 do 100 nm), kde se vlastnosti výrazně liší od vlastností při větších rozměrech. Nanotechnologie
je
struktur a zařízení. [1]
aplikací
těchto
znalostí
při
vytváření
užitečných
materiálů,
2. NANOTECHNOLOGIE V PŘÍRODĚ V přírodě většina základních životních procesů probíhá v nanorozměrech a to jak v oblasti živé, tak neživé přírody. Základními stavebními prvky přírody jsou atomy a molekuly, přičemž molekula je seskupení jednoho nebo více atomů, které jsou vzájemně spojeny interakcemi po dostatečně dlouhou dobu, takže mohou být pozorovány jako existující subjekty. [1]
Obr. 1: Relativní velikosti atomů, biomolekul, bakterií a buněk. [2]
Z obrázku je zřejmé, že mnoho biologických materiálů lze klasifikovat jako nanočástice. Velikost bakterií se pohybuje v rozmezí 1 až 10 µm, virů od 10 do 200 nm. Bílkoviny se obvykle vyskytují v rozměrech od 4 do 50 nm. Stavebními bloky proteinů je 20 aminokyselin, přičemž každá aminokyselina má rozměr kolem 0,6 nm. Vznikají dlouhé řetězce polypeptidů, obsahující stovky až tisíce aminokyselin. Podobají se tak nanodrátkům. Ty jsou dále zkrucovány a stáčeny, aby se stlačily do relativně malého objemu o průměru 4–50 nm. Proto lze bílkovinu přirovnávat k nanočástici, která sestává ze stlačeného polypeptidového nanodrátku. DNA má rovněž strukturu zhuštěného nanodrátku. Molekulu DNA tedy tvoří dva nanodrátky, které jsou obtočeny jeden kolem druhého v útvaru o průměru asi 2 nm, který se opakuje každých 3,4 nm. Tento dlouhý, do dvojité šroubovice spletený nanodrátek rovněž prochází systematickým kroucením a stáčením, aby se DNA vešla do chromozomu asi 6 µm dlouhého a 1,4 µm širokého. Samotný chromozom není natolik malý, aby byl nanočásticí. [2] Biologické systémy jsou budovány hierarchicky. Příkladem je vlas.
Obr. 2: Hierarchická struktura vlasu. Vlas je tvořen šesti strukturními hierarchiemi ze základní stavební jednotky vlasů (ale i nehtů a kopyt), kterou je protein keratin. Výsledkem je vysoce pružná a relativně pevná struktura schopná samostatného růstu. [2]
Na
příkladu
biomineralizace
skořápky
u
měkkýše
abalon
(Haliotis
tuberculata,
ušeň mořská) lze demonstrovat využití nanotechnologie v praxi k vytváření nanostruktur s požadovanými vlastnostmi. Měkkýš abalon si konstruuje superpevnou skořápku s krásným, duhově zbarveným vnitřním povrchem. Provádí to tak, že uspořádává uhličitan vápenatý (křídu) do pevných nanostrukturních bloků. Jako maltu používá pružný sliz: směs proteinů a sacharidů. Trhliny, které vznikají na povrchu skořápky, jen obtížně postupují dovnitř, neboť struktura skořápky zamezuje postupu trhliny. Jak trhlina roste, malta vytváří houževnaté nanostruny, které se snaží zamezit jakémukoliv vzájemnému oddálení nanobloků. Výsledkem je liliputánská konstrukce, která odolává ostrým zobákům, zubům, případně i úderům kladiva. Chytré uspořádání měkkýšovy skořápky naznačuje jednu z nejzajímavějších možností nanotechnologie – vytvářením nanostruktur lze řídit základní vlastnosti materiálu, např. barvu, elektrickou vodivost, teplotu tání, tvrdost, odolnost proti trhlinám a pevnost, a to bez změny chemického složení materiálu. Měkká křída se změnila u měkkýše v tvrdou skořápku. [1]
3. POTENCIÁLNÍ APLIKACE NANOTECHNOLOGIE V POTRAVINÁŘSTVÍ 3.1 NANOSENZORY PRO DETEKCI PATOGENŮ A KONTAMINANTŮ
Aplikace nanotechnologií umožní konstrukci biosenzorů pro rychlejší detekci patogenů a kontaminantů v potravinářské výrobě a veterinární medicíně.
3.1.1 Nanozařízení pro ochranu identity (IP) a vysledování Identity Preservation (IP) je systém poskytování informací spotřebitelům o praktikách a aktivitách používaných k produkci určité plodiny nebo jiného zemědělského produktu. Jištění bezpečnosti zemědělských produktů lze významně zvýšit prostřednictvím IP na nanoúrovni. IP na nanoúrovni dokáže kontinuálně vysledovávat a zaznamenávat historii určitého zemědělského produktu. Jedná se například o výrobu miniaturizovaných testovacích souprav pro stanovení polních patogenů nebo miniaturizovaných monitorů pro zařízení na skladování zrnin nebo krmiv. [2]
3.1.2 Nanozařízení pro inteligentní systémy zajišťování nápravy Předpokládá se, že tato zařízení dokáží detekovat a reagovat na infekci, deficit nutrientu nebo na jiné zdravotní problémy a to dlouho předtím, než budou symptomy zřejmé na makroúrovni. Příkladem jsou zařízení pro monitorování zdravotního stavu u velkých zvířat a to využitím slin jako neinvazního indikátoru nebo neinvazní zařízení pro monitorování zdravotního stavu rostlin, pro “včasnou detekci stresu” v hydroponních systémech, která je založena na detekci změn v metabolismu rostlin, respiraci, vylučování v kořenové zóně a mikrobiální ekologii kořenové zóny. [2]
3.1.3 Nanomateriály, problematika životního prostředí, zemědělského odpadu a nanočástic v životním prostředí Materiály nového typu vyvinuté pomocí vědy a techniky jsou kritické pro zdokonalení zemědělských a potravinářských systémů. Je nutno porozumět chování přirozených nanočástic v půdě, vodě a vzduchu natolik, aby šlo jejich vlastnosti a chování regulovat. Rovněž zemědělská činnost vede k vytváření a rozšiřování nanočástic. Proto je také nutno
objasnit rozšiřování nanočástic produkovaných zemědělstvím v životním prostředí a zamezit jejich případným negativním účinkům.. [2] V potravinářské vědě a technologii existují čtyři hlavní oblasti, ve kterých se může s výhodou uplatnit nanotechnologie. Jde o: -vývoj nových funkčních materiálů, -výroba probíhající v mikro- a nanometrových rozměrech, -vývoj nových výrobků, -metody a zařízení pro dosažení vyšší bezpečnosti potravin a biologické bezpečnosti. [3]
Obr. 3: Přehled aplikací nanotechnologie v potravinářském sektoru. [2]
Obecně platí, že v rámci potravinářského sektoru existuje velký počet potenciálních aplikací nanotechnologie, avšak mnoho z nich lze využít komerčně jen obtížně, neboť jsou příliš drahé nebo není účelné je implementovat v průmyslovém měřítku. U níže uvedených aplikací je reálné, že by se v blízké budoucnosti mohly realizovat v praxi, popř. již nalezly komerční využití. [3, 4]
3.1.4 Nanolamináty. Vytváření jedlých folií a potahů. Aplikace funkčních složek Nanotechnologie nabízí řadu postupů pro vytváření laminátových fólií nového typu s yužitím v potravinářském průmyslu. Nanolaminát se skládá ze dvou nebo více vrstev materiálu
nanometrových rozměrů, které jsou navzájem spojeny fyzikálně nebo chemicky. Základní funkční vlastnosti jedlých potahů a fólií závisejí na vlastnostech materiálů použitých k jejich výrobě. V současné době jsou primárními materiály polysacharidy, bílkoviny a lipidy. Použití nanolaminátů je spíše na potahy, které těsně přiléhají na povrchy potravin než jako samostatné fólie, neboť jsou extrémně tenké, a proto lámavé. Na Obr. 4 je znázorněno, jak by mohly nanolamináty uzavírat potravinářský objekt.
Obr. 4: Ilustrace použití nanolaminátů pro potažení potraviny . [2]
K vytváření různých vrstev by se mohla využít řada různých adsorbujících se látek, např. přirozené polyelektrolyty (bílkoviny, polysacharidy), nabité lipidy (fosfolipidy, povrchově aktivní látky) a koloidní částice (micely, váčky/měchýřky, kapénky). Výběr druhu adsorbujících se látek k vytvoření jednotlivých vrstev, celkový počet vrstev začleněných do výsledné fólie, posloupnost různých vrstev a výrobní podmínky použité pro každou vrstvu budou určovat funkční vlastnosti konečných fólií, např: jejich propustnost pro plyny, organické látky, minerální látky nebo vodu, schopnost nabobtnání a smáčení, citlivost k vnějším faktorům: pH,iontové síle a teplotě. [2]
4. PŘÍKLADY REALIZOVANÝCH APLIKACÍ NANOTECHNOLOGIE V POTRAVINÁŘSTVÍ 4.1 ANTIBAKTERIÁLNÍ ÚČINKY NANOSTŘÍBRA, NANO ZnO Antimikrobiální účinky stříbra jsou známy již staletí. Předpokládá se, že nanostříbro projevuje své antimikrobiální účinky tak, že v jeho přítomnosti dochází k denaturaci disulfidových vazeb v buněčných membránách bakterií. Funguje obdobně jako peroxid vodíku, což je nejúčinnější zabíječ bakterií. V sektoru potravinářského průmyslu se dá nanostříbro aplikovat především pro zásobníky potravin: nádobky na potraviny, chladničky, mrazničky[5]. Antibakteriální aktivita stříbra závisí na velikosti, ale také na tvaru nanočástic stříbra. Výrobky se zabudovanými nanočásticemi stříbra schválila řada akreditačních orgánů, např. v USA (US FDA, US EPA), v Japonsku (SIAA), v Korei (KOTRIC-CC).
4.1.1 Nanočástice oxidu zinku Nano ZnO má vynikající antibakteriální účinky a vynikající fyzikální stabilitu. Další výhodou je, že neodbarvuje, nevyžaduje k aktivaci UV světlo. Nano ZnO nachází široké uplatnění např. v medicíně, kosmetice, při výrobě živočišných krmiv a veterinárních léčiv, v průmyslu pryže, keramiky, textilním, barev aj. Nano ZnO má vynikající schopnost chránit před oběma složkami UV světla (UVA a UVB). FDA schválila ZnO jako jednu ze dvou přísad na ochranu proti slunci první kategorie výrobků péče o pokožku. Oxid titaničitý (TiO2) má schopnost blokovat pouze UVA (vlnové délky 340 až 400 nm). ZnO je tak jediný, který chrání před oběma složkami UV světla. Nano ZnO v živočišných krmivech napomáhá vyšší absorpci nutričních látek a tím umožňuje snížení dávek krmiva. Plastový obal se zabudovanými nanočásticemi ZnO vyvinula firma SongSing Nano Technology (www.ssnano.net), která vyrábí řadu dalších nanokompozitních materiálů, např. s obsahem stříbra. [2]
4.2 REGULOVANÉ UVOLŇOVÁNÍ FUNKČNÍCH A AKTIVNÍCH SLOŽEK “Controlled Release Systems” (systémy regulovaného uvolňování, SRU) se používají k modifikaci způsobu, kterým jsou dodávány funkční a aktivní složky. Uvedené SRU jsou založeny na technologiích zapouzdřování. Hlavní výhody SRU: - uvolňování aktivní složky probíhá po dlouhou dobu (lepší využití aktivní složky v čase);
- k uvolňování aktivní složky dochází podle požadavku (působením vnějších faktorů, např. tlaku, vlhkosti a tepla nebo aktivitou spotřebitele); - aktivní složky se dodávají do požadovaného místa (uvolnění aktivní složky v požadovaném místě, např. v určitém orgánu). Existují dva tradiční typy systémů regulovaného uvolňování: 1. Matricové systémy: aktivní složka je homogenně dispergována v pevné fázi. V průběhu času aktivní složka difunduje z matrice. 2. Membránové systémy: aktivní složka je uzavřena do tuhé látky a potažena polymerním systémem. Vlastnosti materiálu, který potahuje aktivní složku, regulují její uvolňování.
4.3 SOLUBILIZACE POTRAVINÁŘSKÝCH ADITIV/FYZIOLOGICKY AKTIVNÍCH LÁTEK Ubisol-Aqua™ technology Jde o novou technologii, která umožňuje solubilizovat (rozpouštět) ve vodě nerozpustné sloučeniny, např. rybí olej. Vzniká tak jedinečná příležitost pro přísun n-3 nenasycených mastných kyselin a jiných lipofilních sloučenin do potravin, nápojů a nutričních produktů. NovaSOL® Nanosome Nanosome, která umožňuje zapouzdřování aktivních přísad pro výrobu funkčních potravin a doplňků stravy. Na rozdíl od konvenční emulze a mikroemulze (obsahují velké částice) tato technologie vede ke tvorbě micel o průměru 30 nm, do kterých se zapouzdřuje aktivní látka. To mnohonásobně zvyšuje její biologickou využitelnost. Než dojde k jejich absorpci, potřebuje lidský organismus konvertovat zvláště nutrienty rozpustné v tuku do micel. Struktury micel jsou přirozenou cestou přívodu nutrientů do organismu. Německá společnost aplikovala svoji technologii na široký okruh látek, např. askorbovou kyselinu. Patentovaný NovaSOL® C je první vitamin C na světě, který je rozpustný v tuku a přitom chemicky nemodifikovaný. Dalšími příklady jsou koenzym Q10 (NovaSOL® Q), vitamin E (NovaSOL® E) nebo isoflavony (NovaSOL® ISO). Další technologií se získávají micely o velikosti ca 30 nm, které mají schopnost zapouzdřovat široký okruh aktivních složek (koenzym Q10, lutein, lykopen, fytosterol/sitosterol, vitamin D, vitamin E). Přírodní barviva od Wild Flavors (www.wildflavors.com) se vyrábí spojením nanotechnologie se zapouzdřováním. Barviva lze tak použít i tam, kde to až dosud bylo problematické. Výrobky jsou např. kurkumini a antokyaniny. [2]
.Nanokurkumin: nová
strategie léčby rakoviny u lidí
Kurkumin je žlutá polyfenolová látka, která se extrahuje z kořenů kurkumy (Curcuma longa). Uvedená látka vykazuje u lidí i zvířat antikancerogenní účinky. [6] Tradiční kurkumin je nerozpustný, prochází střevy aniž by se dostal do krevního řečiště. Kurkumin zapouzdřený do nanočástic o velikosti 50 nm se snadněji absorbuje do krevního řečiště. Výsledný “nanocurry” má pozitivní vliv na organismus při nemocech jako je rakovina, cystická fibróza, Alzheimerova choroba. Bioral™ Technology Firma BioDelivery Science
International
(BDSI)
vyvinula
technologii
dopravy
léků/nutričních faktorů založenou na tzv. “nanokochleátech” (nanocochleates). Jde o spirálovitě stočené nanočástice (ca 50 nm v průměru) získávané ze sóji a vápníku, které mohou přivádět přímo do buněk organismu farmaceutické sloučeniny i nutrienty, např. vitaminy, lykopen a n-3 mastné kyseliny. SunActive® FE Jde o systém přívodu železa do těla. Použitím nanotechnologie se překonává řada problémů, které tradiční forma železa představuje pro průmysl. Nerozpustné železo se u výrobku SunActive® FE disperguje v tekutinách bez jakéhokoliv vysrážení. Odolává teplu, soli, pH a oxidaci a nemá vliv na barvu konečného výrobku. Přísada lze použít do výrobků typu: mléko, sýr, nápoje pro sportovce. Plasty s lepšími bariérovými vlastnostmi Používají se silikáty ve formě nanočástic do nylonu 6. Po smísení se silikát rovnoměrně rozloží v celém polyamidu. Vrstvy orientují paralelně s povrchem, což zvyšuje bariérové vlastnosti. Fólie a láhve, k jejichž výrobě byl použit nylon 6 s přídavkem Nanomers® (povrchově modifikovaných montmorilonitových minerálů) vykazují lepší vlastnosti, např. bariérové vlastnosti vůči kyslíku, oxidu uhličitému a vodní páře, UV záření, dále mají vyšší čirost, tvrdost a tepelnou stabilitu. [7] Nanokompozity MXD6 (Imperm®) MXD6 (meta-xylylene adipamide), patří k plastům s vysokými bariérovými vlastnostmi. Přídavkem nanojílů přenos vodní páry klesá na polovinu, prostupnost pro arómata je velmi nízká. Bariérové vlastnosti vůči oxidu uhličitému jsou nejvyšší ze všech komerčních pryskyřic, které jsou na trhu k dispozici [8]. Aplikace Imperm v pivních láhvích Schopnost plastu zadržovat oxid uhličitý má vliv na jeho využití pro výrobu pivních láhví a v menší míře i lahví pro sycené nealkoholické nápoje. Nápoje v jednovrstvém PET však mají
krátkou údržnost (8 týdnů). Použitím vícevrstvého PET ve spojení s Imperm (PET/Imperm/PET) se údržnost zvýší trojnásobně [9].
Existují tři základní kategorie využití nanotechnologie pro potravinářské obaly: - zlepšení bariérových účinků plastů, -
zabudování
aktivních
komponent,
které
poskytují
rámec funkčních vlastností konvenčních aktivních obalů, - snímání a signalizování relevantních informací.
funkční
vlastnosti
nad
5. BEZPEČNOST NANOTECHNOLOGIE Existují tři cesty, kterými se mohou nanočástice dostávat do těla. Je to: pokožka, inhalace, konzumace. Při posuzování toxicity nanočástic se musí brát do úvahy řada hledisek, např.: - expozice nanočásticím, - toxikologie nanočástic, - schopnost extrapolovat toxicitu nanočástic za použití existujících toxikologických databází, - osud nanočástic v životním prostředí, biologickém systému, při dopravě, stálost, transformace nanočástic, - recyklovatelnost a celková udržitelnost nanomateriálů.
Vzhledem k tomu, že je k dispozici málo informací o riziku, které existuje při manipulaci s nanomateriály, měla by být zavedena přísná kontrola, pokud jde o expozici nanočásticím a sice do té doby, než bude k dispozici více poznatků [10]. Výbor pro chemickou bezpečnost Americké chemické společnosti (Committee on Chemical Safety of the American Chemical Society) vydal manuál pro bezpečnou manipulaci s nanomateriály v laboratoři (Lab safety guidelines for handling nanomaterials) [2].
5.1.1 Expozice pokožky nanočásticím Vliv nanomateriálů na organismus závisí na jejich schopnosti pronikat skrz vnější ochranné vrstvy pokožky. V současné době existuje stále ještě málo informací o nebezpečí z nanomateriálů pro kůži a diskuse o mechanismech interakce a možných zdravotních dopadech jsou spíše spekulativní [10].
5.1.2 Inhalace nanočástic Částice o průměru menším než 10 µm se mohou dostat přes nosní dutinu do plic. U částic menších než 4 µm existuje více než 50% pravděpodobnost, že proniknou do alveolární oblasti. Čím menší částice jsou, tím hlouběji pronikají do plic. Na základě současných poznatků nelze učinit všeobecné závěry týkající se toxicity založené pouze na velikosti částic. Potenciální toxicita každého jednotlivého nanomateriálu se musí vyhodnocovat případ od případu [10].
5.1.3 Konzumace nanočástic Z toxikologického hlediska jsou důležitými vlastnostmi materiálu velikost částic a velikost povrchu částic. Posuzování bezpečnosti nanomateriálů vstupujících do těla skrz trávicí trakt je
zvláště důležité u potravinářských výrobků obsahujících nanomateriály. Nanočástice mohou značně prodloužit dobu, po kterou sloučenina zůstává v trávicím traktu (např. v důsledku velkého povrchu, který je k dispozici pro interakce). V translokačním pokusu se zjistilo, že částice o velikosti několika nanometrů procházejí skrz mukózní bariéru střev. Čím menší je částice, tím rychlejší je penetrace [10].
5.2 POTENCIÁLNÍ ZDRAVOTNÍ RIZIKO POTRAVINÁŘSKÝCH MATERIÁLŮ ZÍSKANÝCH POMOCÍ NANOTECHNOLOGIE Mnoho potravinářských látek nebo složek má nanostruktury v povaze a existuje o velikosti mikro a nano. Potravinářské proteiny, které tvoří globulární částice o velikosti desítek až stovek nanometrů, jsou pravé (true) nanočástice. Lineární polysacharidy s nanostrukturami v jednom rozměru, mají tloušťku menší než 1 nm. Škrobové polysacharidy tvořící malé trojrozměrné
nanostruktury
mají
tloušťku
pouze
několik
desítek
nanometrů.
V rámci potravinářského průmyslu bylo provedeno mnoho pokusů vyrábět potravinářské materiály o velikosti mikro a nano [11]. Z výše uvedeného vyplývá, že nanotechnologie otevírá řadu nových možností pro potravinářský průmysl, avšak začlenění vyráběných nanočástic do potravinového řetězce může vést k akumulaci toxického kontaminantu v potravinách a negativnímu vlivu na lidské zdraví. Proto existují otázky, zda by se potravinářské materiály nanometrových rozměrů neměly, ve srovnání s jejich většími protějšky, kategorizovat jako nové nebo nepřirozené materiály. Ačkoliv nanomateriály mohou být toxické a mimo očekávání působit škodlivě, výzkum rovněž odhalil, že postupy vytváření a zpracování nanočástic nemusí nezbytně vést k produktům se škodlivými účinky, např. toxicita některých látek (např. selenu) významně klesá, jestliže se jejich velikost sníží na úroveň nano. Uvádí se také, že čisté nanotrubice uhlíku aplikované do průdušnice myší mohou způsobit smrt, zatímco naplnění nanotrubic uhlíku dusíkem snížilo jejich toxicitu a riziko úmrtí. To by mohlo vést k využití této technologie u potravinářských obalů. Aby se rozptýlily pochyby o bezpečnosti nanočástic, mělo by se na základě “principu obezřetnosti” provádět více vyšetřování toxicity nanočástic obsažených v potravinářských výrobcích [10]. V souvislosti s aplikací nanotechnologie při výrobě potravin se nově objevil termín “Frankenfood” (Frankensteinovské potraviny, tento termín je používán také pro potraviny vyrobené z geneticky modifikovaných organismů (GMO), jejichž přijetí veřejností je také kontroverzní [2].
Nestlé (Švýcarsko): podporuje nanotechnologickou potravinářskou výzkumnou skupinu; veřejně dostupných informací je málo Obr. 5: Logo firmy Nestle Altria (Kraft Foods, USA): založila v r. 1999 první potravinářskou laboratoř zaměřenou na nanotechnologie; financuje a sponzoruje NanoteK Consortium – V&V “smart drinks” (inteligentních nápojů) a nanokapslí Obr. 6: Logo firmy Kraft Foods Unilever (V. Británie & Nizozemí): V & V nanokapslí; v r. 1997 Unilever vytvořil joint venture s Cambridge University – vzniklo Unilever Cambridge Center for Molecular Informatics. V roce 2002 se Unilever rozhodl investovat během tří let 30 milionů EUR do vlastního V & V v Santa Barbaře (Kalifornie) zaměřeného na nové technologie, včetně genomiky a nanotechnologie Obr. 7 :Logo firmy Univeler PepsiCo (USA): zaujímá 4. místo na seznamu top10 společností pro výrobu potravin a nápojů. Obr. 8: Logo firmy Pepsi Cargill (USA): zaujímá 7. místo na seznamu top10 společností pro výrobu potravin a nápojů; spolupracuje s EcoSynthetix na vývoji kukuřičného škrobu ve formě nanočástic pro lepenkové obaly Obr. 9: Logo firmy Cargill ConAgra (USA): zaujímá 8. místo na seznamu top10 společností pro výrobu potravin a nápojů Obr. 10: Logo firmy ConAgra General Mills: vynakládá 6–9 000 mil. USD do V & V souvisejícího s nanotechnologiemi
Obr. 11: Logo firmy General Mills
H. J. Heinz: sektor zaměřený na potraviny (zvýrazňovače chuti a vůně) využívá nanotechnologii, nanomateriály se používají v obalech
Obr. 12: Logo firmy H. J. Heinz
Campbell Soup (USA): jedním z cílů je zvýrazňovač chuti a aroma
Obr. 13: Logo firmy Cambell Soup
Maruha (Japonsko): přední producent potravin z moře v Japonsku
Obr. 14: Logo firmy Maruha
6. NANOČÁSTICE A ROSTLINY 6.1 Nanočástice Nanočástice úzce komunikují s okolím a hlavně s rostlinami, ty jsou nezbytnou základní složkou všech ekosystémů. Jako výsledek bude nanočástice v nevyhnutelné interakci s rostlinami. Nanočástice mohou vstupovat do životního prostředí pomocí člověkem vytvořených průmyslových výrobků, jako jsou farmaka, výrobky péče o zdraví, kosmetika, agrochemikálie a potraviny. Do potravního řetězce se pak dostávají konzumací masa nebo plodin kontaminovaných těmito látkami. Toxicita nanočástic není příliš prozkoumána. Je známa toxicita fullerenů a nanočástic TiO2 vůči vodním organismům a také fytotoxicita nanočástic oxidu hlinitého. Fullereny, stříbro a jiné nanočástice vykazují rovněž antibakteriální účinky, které se využívají v prostředcích na ochranu zdraví. Tam, kde nanočástice nevykazují akutní toxicitu, nejsou vyloučeny dlouhodobé účinky, bioakumulace a vliv na strukturu látek. Nanočástice mohou rovněž ovlivňovat toxicitu jiných sloučenin, protože je o nich známo, že působí jako nanonosiče pro kontaminanty. Mechanismus nanotoxicity zůstává z velké části neprozkoumán, nicméně úzce souvisí s chemickým složením, chemickou strukturou, velikostí a povrchem nanočástic. Toxicitu nanočástic lze odvodit dvěma způsoby: – z chemické toxicity na základě chemického složení, např. uvolnění toxických iontů, – ze stresu nebo podnětů způsobených povrchem, velikostí anebo tvarem částic. V přírodním prostředí přijímají rostliny nanočástice primárními nebo postranními kořeny. Nanočástice je dále dopravena do hlavního kořene a odtud do stonku a listu. Nanočástice mají na rostliny různý vliv, jsou pozorovány vlivy jak stimulující, například urychlení klíčivosti semen nebo zrychlený růst rostlin, tak inhibující, a to hlavně při vysokých
koncentracích nanočástic. Účinek nanočástic je ovlivněn jejich koncentrací ve vzorku, jejich složením a velikostí, ale účinek ovlivňuje i druh rostliny a její stádium vývoje. [12]
Obr. 15: Přehled a obecné zásady příjmu, dopravy a akumulace nanočástic rostlinami. Nanočástice jsou v přírodním prostředí pohlceny primárními kořeny nebo postranními kořeny a pak sekundárními. Nanočástice jsou pak dopravovány od kořene, přes stonek do listu. Nanočástice by také mohly být absorbovány na povrchu kořenů, kde by podporovaly příjem vody. [12]
6.2 Fytotoxicita nanočástic 6.2.1 Uhlíkové nanočástice Interakce nanočástic s rostlinami, především příjem nebo akumulace v rostlinné biomase značně ovlivní jejich osud a expanzi v životním prostředí. Většina doposud publikovaných prací je zaměřena na možnou toxicitu nanomateriálů vůči rostlinám, byly prokázány stimulační a inhibiční účinky na různé faktory (růst, aktivita enzymů, klíčivost, atd.), například nedávná práce naznačila, že MWCNTs v koncentračním rozmezí o 10-40 mg / l dramaticky vylepšila klíčivost semen a růst rostlin rajčete (Solanum lycopersicum),
Obr. 16: Znázornění, jak pozitivně ovlivňují nanočástice MWCNTs v koncentračním rozmezí o 10-40 mg / l klíčivost semen a růst rostlin rajčete. [12]
výzkumníci předpokládali, že pozitivní účinek MWCNTs vznikl kvůli schopnosti CNTs pronikat osemením díku příjmu vody nezbytné pro klíčení. Měřená vlhkost semen a detekce CNTs uvnitř semen podporují tuto hypotézu, ale konkrétní mechanismy průniku a posílení absorpce vody působením CNTs nebyly prokázány[13]. Bylo uvedeno, že
nanočástice TiO2 (2,5 g- 40 g / kg půdy) prokazatelně zlepšily růst špenátu - zvýšila se fotosyntéza a fixace dusíku v listech a kořenech. Nejnovější práce toto zjištění potvrzují, ukazuje se, že TiO2 by mohl podporovat energetické využití a účinnost konverze NADH na ATP v dýchacím řetězci. Podobně by mohla působit, směs SiO2 a TiO2 nanočástic při nízkých koncentracích a to zvýšením činnosti nitrátreduktázy v rhizosféře a následně zrychleném klíčení a růst sóji. SiO2 nanočástice také urychlují růst modřínu Changbai (Larix olgensis) a jejich vliv se zvyšuje až do koncentrace 500 mg / l. [14] Několik
studií
také
indikovalo
méně
důležité
účinky
nanočástic
na
rostliny. Například studie s řízky vrby uvedla, že TiO2 nanočástice mají omezený vliv na jejich růst v oblasti spotřeby vody a transpiraci. Studie hliníkových nanočástic neprokázala žádné toxické účinky na fazolích (Phaseolus vulgaris) a jílku vytrvalém (Lolium perrene) při koncentracích do 17 mg / l. Al2O3 nanočástice až 4000 mg / l neměla žádný zjistitelný vliv na kořen, elongaci a vývoj huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana), i když byla zjištěna mírná inhibice při klíčení semen. Nicméně, většina studií s nanočásticemi naznačila určité míry fytotoxicity, a to zejména u vysokých koncentrací nanočístic. Expozice SWCNTs významně ovlivnila elongaci kořene rajčat, zelí (Brassica oleracea), mrkve (Daucus carota)
a salátu (Lactuca sp.) , ale
podporovala růst cibule a okurky (Cucumis metuliferus) v časovém intervalu 24 - 48 h (Canas et al., 2008). Rajče (Lycopersicon esculentum) ukázalo nejvyšší stupeň citlivosti k SWCNTs mezi šesti testovanými druhy. [14] Toxicita CNTs, ale i jiných nanočástic může být ovlivněna i jejich povrchovými modifikacemi. Výzkumníci prokázali, že funkcionalizované CNTs mají různé toxické projevy, ale obecně byly méně toxické než ne-funkcionalizované CNTs. Toxické projevy funkcionalizovaných CNTs nebyly dále specifikovány. Tato práce zdůraznila význam povrchových vlastností CNTs při určování jejich fytotoxicity. [12]
6.2.2 Kovové nanočástice Kovové nanočástice oxidů (např. ZnO) se ukázaly jako inhibiční na různých vývojových stadiích rostlin, jako je klíčení semen a prodlužování kořene [15]. Pokud jde o kovové nanočástice, bylo prokázáno, že nanočástice mědi byly toxické pro dva druhy plodin - vignu zlatou (Phaseolus radiatus) a pšenici (Triticum aestivum), o čemž svědčí zpomalení tempa růstu sazenice [16]. Vigna zlatá je citlivější než pšenice, autoři tento jev připsali k rozdílům v kořenové anatomii a architektuře; fazole mungo je dvouděložná rostlina
s jedním velkým primární kořenem a několika menšími postranními kořeny, zatímco pšenice je jednoděložná s četnými malými kořeny bez hlavního kořene. Nedávná práce ukázala, že velmi nízké koncentrace AgNPs by mohl být toxické pro sazenice řeřichy (Arabidopsis thaliana), další dvouděložnou rostlinu se stejnou kořenovou strukturou, jako vigna zlatá. AgNPs o velikosti 20 nm až 80 nm způsobily zakrnělý růst. Fytotoxický efekt byl závislý na koncentraci a velikosti nanočástic.
Obr. 17: Fenotyp Arabidopsis thaliana vystavených A. Hoaglandovu roztoku, B. 340 mg / l 20 nm AgNPs a C. 340 mg / l 40 nm AgNPs. Zobrazeno pod mikroskopem (Leica S6D). [12]
Stanovení toxicity kovových nanočástic a jejich oxidů je složité, protože může dojít k rozpuštění kovových iontů těchto nanočástic. Při nedávné studii o fytotoxicitě ZnO na jílku vytrvalém (Lolium perenne), bylo uvedeno, že fytotoxicita nemůže být vysvětlena rozpuštěním nanočástic ZnO (Lin a Xing, 2008). To potvrzuje výzkum, kdy fytotoxicita ZnO na Arabidopsis byla mnohem silnější, než roztoky, které obsahují stejné koncentrace rozpustného Zn(II) [17]. Samostatná studie fytotoxicity pěti typů nanočástic (MWCNTs, Ag, Cu, ZnO a Si) na zemědělských plodinách, například cuketě (Cucurbita pepo), podpořila závěr, že rozpuštění ze sypkých materiálů samo o sobě nemůže odpovídat za pozorovanou fytotoxicitu nanočástic. [18] Dalším faktorem, který je nutno brát v úvahu, je efekt použitého rozpouštědla. Bez přidání stabilizátorů je doba trvání nanočástic v roztoku velmi krátká, ale většina komerčních produktů obsahuje určité stabilizátory. Synergické efekty nanočástic a stabilizátorů přispívají k jejich toxickému účinku. Barrena et al. (2009) uvedli, že tři druhy kovových nanočástic prokázaly nízké až nulové toxické účinky na dvou plodinách - hlávkovém salátu a okurkách a pozorování pozitivních nebo negativních dopadů by mohlo být přisuzováno přítomosti stabilizátorů. Práh toxicity je také závislý na jednotlivých druzích rostlin [16, 17]. Několik posledních prací také uvedlo, že velikost částic a specifický povrch je vhodnější ukazatel
fytotoxicity než jejich nominální koncentrace [19]. Yang a Watts (2005) také uvedli, že povrchové vlastnosti nanočástic jsou důležité pro jejich fytotoxicitu. Potažení nanočástic oxidu hlinitého fenanthrenem, způsobilo snížení jejich fytotoxicity. Fourierova transformace infračervenou spektroskopií (FTIR) byla použita pro vyhodnocení charakteristiky povrchu nanočástic. Bylo zjištěno, že na povrchu modifikovaných nanočástic byla nižší koncentrace hydroxylových radikálů. Autoři došli k závěru, že hydroxylové radikály přispěly ke snížené fytotoxicitě modifikovaných nanočástic. Tento závěr byl prokázán snížením fytotoxicity nanočástic oxidu hlinitého po přidání zhášeče hydroxylových radikálů, dimethylsulfoxidu (DMSO). Studie věnované zkoumání vlivu jiných fyzikálních vlastností nanočástic na fytotoxicitu, jako je tvar částic a povrch v současné době nejsou k dispozici. Zjevné rozdíly v toxicitě nanočástic vůči rostlinám mohou vzniknout z vlastností nanočástic, rostlinných druhů a věkových kategorií, čase expozice a koncentraci [20, 21] [22, 23]. Stejně důležitý parametr pro studium fytotoxicity je výběr ukazatele fytotoxicity. Klíčení semen a elongace kořene jsou dva standardní indikátory pro fytotoxicitu, které byly navrženy americkou Agenturou pro ochranu životního prostředí. Ale v několika výzkumech se ukázalo, že NČ vykazují fytotoxicitu, ale nemají vliv na klíčivost [18]. U stanovení rostlinné biomasy a chlorofylu bylo prokázáno, že jsou citlivější a poskytují lepší výsledky, z toho vyplývá, že je třeba standardizovat studium fytotoxicity a nanomateriálů. Nanočástice jsou nejen toxické pro sazenice rostlin, ale také pro buňky rostlin a řas. Při použití AgNPs na buňky kořenové špičky cibule (Allium cepa) výzkumníci prokázali, že AgNPs by mohly narušit postup buněčného dělení, který způsobí buněčný rozpad. [24]
6.3. Příjem, translokace a akumulace nanočástic Příjem a akumulace nanočástic v rostlinách je zkoumán nejen z důvodu jejich (fyto)toxicity, ale také možné distribuce v životním prostředí a potravním řetězci, fytoremediace a potenciálního praktického využití, například pro bioimaging nebo výrobu nanočástic v rostlinách. První zpráva byla zveřejněna v [25]. Zde se poprvé jednoznačně prokázal oxid železitý jako nanočástice (Fe3O4) v dýni (Cucurbita maxima). Hmotnostní bilance byla prováděna na konci experimentu a studie ukázala, že 45,5% nanočástic bylo nahromaděno v kořenech a přibližně 0,6% nanočástic bylo zjištěno v listech. Stejnými vědci byl testován i u dalších rostlinných druhů, (např. fazole lima (Phaseolus limensis), příjem a transport železa nanočásticemi oxidu však nebyly pozorovány. Lin et al. sledovali příjem a translokaci uhlíku z nanomateriálů na rostlinách rýže (Oryza sativa) a zjistili, že fulleren C70 se snadno dostává do kořenů a odtud se převádí do výhonků [26]. Jejich studie také ukázala, že C70 by
pravděpodobně mohly být přepravovány z listů do kořenů v případě, že C70 se do rostliny dostaly přes listy. U MWCNTs nebyly podobné výsledky pozorovány i když pokus byl prováděn stejnými vědci a koncentrace MWCNTs byla 800 mg / L. Tento rozpor by mohl být vysvětlen tím, že MWCNTs mají relativně velkou velikost oproti fullerenům, které se především adsorbují na povrchu kořene. [12]
6.4. Interakce nanočástic s rostlinnými buňkami Aby nanočástice mohly interagovat přímo s rostlinnými buňkami, musí proniknout do buněčné stěny a plazmatické membrány epidermální vrstvy v kořenech k cévním tkáním (xylem) odtud by měly být přemístěny přes stopku do listů. Buněčná stěna, jejíž prostřednictvím molekuly vody a dalších rozpuštěných látek musí projít do kořenů, je porézní síť matic polysacharidových vláken o velikosti pórů v rozsahu 3-8 nm, což je mnohem menší, než mnohé nanočástice používané k experimentům [27]. Navarro et al. předpokládají, že buněčné stěny, které mají obvykle tloušťku okolo 5 až 20 nm fungují jako přírodní síta. Předpokládá se, že nanočástice menší než největší póry projdou a dosáhnou k plazmatické membráně, na rozdíl od větších částic, které nevstoupí do rostlinných buněk. Ale autoři také připustili, že nanočástice mohou vyvolávat tvorbu nových a větších velikostí pórů, které umožňují internalizaci velkých nanočástic přes buněčné stěny [28]. Proseus a Boyer vyšetřovali pronikání Cu nanočástic různých velikostí do a přes řasové buněčné stěny pomocí konfokální laserové skenovací mikroskopie a zjistili, že zlaté nanočástice o průměru ≥ 10 nm nemohly proniknout buněčnou stěnou řas ani pod tlakem [29]. Nicméně, internalizace buněk s nanočásticemi různých velikostí a kompozic byla pozorována u různých druhů rostlin [26]
7. CÍL PRÁCE 1. Literární přehled o možnostech uplatnění nanočástic v potravinářství a jejich možných toxických efektech
2. Optimalizace metodiky pro studium toxicity nanočástic
3. Provedení experimentu na modelovém rostlinném organismu, zpracování biologického materiálu a vyhodnocení výsledků
8. MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ 8.1. Příprava vzorku Chemikálie a měření pH Běžné chemikálie, pokud není uvedeno jinak, byly zakoupeny od firmy Sigma-Aldrich (USA). pH bylo měřeno za použití pH metru firmy Maneko (Česká Republika).
Obr. 18: pH metr firmy Sigma-Aldrich Použité přístroje BS 200- spektrofotometrická analýza (metoda dle Ellmana, GST) byla prováděna na automatickém chemickém analyzátoru BS-200 (Mindray, Čína). Reagencie a vzorky jsme umístili na chlazený disk (4 °C) a dále se automaticky pipetovaly do plastikových kyvet s optickou dráhou 0,5 cm. Směs byla následně promíchána. Inkubace probíhala v kyvetovém prostoru temperovaném na 37 °C. Promývání dávkovacích jehel destilovanou vodou bylo prováděno mezi jednotlivým pipetováním. Přístroj je řízen softwarem BS-200 (Mindray, Čína). BS 400- Ostatní metody a na automatickém chemickém analyzátoru BS-400 (Mindray, China), který se skládá z kyvetového prostoru (temperovaný na 37±0.1 °C), reagenčního prostoru s karuselem pro reagencie a přípravu vzorků (temperovaný na 4±1 °C) a optického detektoru. Zdrojem světla je halogeno-wolframová žárovka. Přenos vzorků a reagencí zabezpečuje robotické rameno s dávkovací jehlou. Obsah kyvet je promíchán automatickým míchadlem ihned po přidání činidla nebo vzorku o objemu 2-45µl. Kontaminace je minimalizována díky proplachování jak dávkovací jehly, tak míchadla MilliQ vodou. Pro detekci bylo možné využít vlnových délek: 340, 412, 505, 570, 605, 650, 660 nm. Měřily se na něm metody: FRAP, DPPH, ABTS, Pyrogalová červeň.
Obr. 19: Automatické chemické analyzátory BS400 a BS200
Centrifuga- centrifugovalo se na přístroji UNIVERSAL 320 R, firmy DJB labcare (Německo).
Obr. 20: Centrifuga frmy DJB labcare
Třepačka- Vortexování bylo prováděno na třepačce firmy Scientific Industries (USA).
Obr. 21: Třepačka firmy Scientific Industries
Váhy- pro vážení byly použity analytické váhy firmy Sartorius (Německo).
Obr. 22: Váhy firmy Sartorius Homogenizátor-
homogenizace
vzorku
byla
prováděna
na
poloautomatickém
homogenizátoru Schuett homgenplus firmy Schuett-biotec (Německo).
Obr. 23: Homogenizátor firmy firmy Schuett-biotec
Použitá média Pro experiment s buněčnou kulturou tabáku bylo použito médium dle Murashige-Skooga, které obsahovalo 4,4 g MS média (Murashige-Skoog medium, Duchefa BV, Holandsko), 200 mg/l KH2PO4, 0,2 mg/l 2,4-D (kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová), a 30 g/l sacharózy.
Biologický experiment MWCTNs (průměr 50 nm): Do šesti Erlenmayerových baněk bylo odpipetováno 50 ml média a 10 ml vzorku, do dvou z těchto baněk nebyly přidány žádné nanočástice, do dalších dvou byly přidány nanočástice v koncentraci 1 µg/ml. Do posledních dvou baněk byly přidány nanočástice v koncentraci 10 µg/ml.
MNPs (40% / 60% (magnetid Fe3O4/magnetid gama Fe2O3): Do deseti Erlenmayerových baněk bylo odpipetováno 50 ml média a 10 ml vzorku, do dvou z těchto baněk nebyly přidány žádné nanočástice, do dalších dvojic byly přidány nanočástice v koncentraci 1 a 10 µg/ml. Kultivace buněk s nanočásticemi probíhala při teplotě 25°C na třepačce po dobu 7 dní. Po uplynutí této doby byly odebrány vzorky pro analýzu a zamraženy při teplotě -80°C.
Příprava vzorku Ze zamražených vzorků byla odebrána navážka přibližně 0,1g do mirozkumavek o objemu 1,5 ml. Poté bylo do mikrozkumavek přidáno 0,5 ml fosfátového pufru (pH= 7,5). Vzorek byl dezintegrován v tekutém dusíku na ledu pomocí poloautomatického homogenizátoru Schuett homgenplus od firmy Schuett-biotec (Německo) homogenizéru. Po homogenizaci byl vzorek třepán po dobu 30 min a následně zcentrifugován (16 000 rpm po dobu 30 minut). Odebraný supernatant byl zamražen při teplotě -80°C.
8.2. Použité metody
8.2.1. Stanovení celkových proteinů Obsah celkových proteinů byl stanoven pomocí pyrogalové červeně. Tato metoda je založena na vytvoření modrých komplexů proteinu s pyrogalovou červení za přítomnosti molybdenanu v kyselém prostředí. Vyhodnocení výsledků bylo provedeno pomocí kalibrační křivky. Příprava reagencií: pro stanovení byl použit kit firmy Sigma-Aldrich, složení kitu: standardní proteinový roztok, 0,5 mg / ml 1 x 5 ml. Proteinové činidlo Mikro pyrogalol pyrogalová červeň 2 x 120 ml POSTUP: Pro stanovení celkových proteinů pyrogalovou červení bylo do kyvet nepipetováno 200µl reagencie a 4 µl vzorku, po 5,3 minutách se změřila absorbance při 578 nm.
8.2.2. Stanovení aktivity enzymu glutathion S-transferázy Příprava reagencií: reagencie jsou komerčně dodávány ve formě kitů od firmy SigmaAldrich (Německo). Složení kitu: fyziologický roztok pufrovaný Dulbeccovým fosfátem 100 ml, L-Glutathion 1 g, GST (Control) 0,1 ml, pufr 5 ml, substrát (CDNB) 1,2 ml. Enzymová aktivita byla přepočítána dle vzorce: Aktivita GST = (∆A/Vkyv)/cprot,
kde ∆A je pokles absorbance při 340 nm během 3 min, Vkyv je objem kyvety (0,0316 l) a cprot je koncentrace celkových proteinů (g/l). POSTUP: Pro stanovení GST bylo do kyvet nepipetováno 180 µl reagencie číslo 1 a 30 µl reagencie číslo 2 a 5 µl vzorku, po 10,7 minutách se změřila absorbance při 340 nm.
8.2.3. Stanovení celkových thiolových skupin pomocí Ellmanova činidla Thiolové (SH) skupiny byly detekovány pomocí Ellmanova činidla (kyselina 5, 5´-dithiobis(2-nitrobenzoová), DTNB)..[30]. Absorbance barevného produktu je měřena při vlnové délce 412 nm. Vyhodnocení bylo provedeno s pomocí kalibrační křivky. Jako kalibrátor byla použita kyselina galová o koncentraci 0- 30 µg/ml Příprava reagencií: Reagencie č. 1: 2mM DTNB v 50mM CH3COONa.3 H2O. Reagencie č.2: 1M Tris-pufr, pH = 8. POSTUP: Pro stanovení Ellmanovy metody bylo do kyvet nepipetováno 277µl reagencie číslo 1, 33 µl reagencie číslo 2 a 10 µl vzorku, po 5,07 minutách se změřila absorbance při 427 nm.
8.2.4. Metody stanovení antioxidační aktivity Stanovení antioxidační aktivity pomocí DPPH• testu. Příprava reagencií: 9.5 · 10-5 molární radikál DPPH• (2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl). Navážka na 100 ml, m = 0.00374 g. Nejprve rozpustit v methanolu, pak přidat 45 ml DMSO (dimethylsulfoxid), poté doplnit na 100 ml ACS vodou. Takto připravená reagencie je použitelná týden za teploty 4 °C, uskladněná v temném prostředí. 150 µl činidla DPPH bylo inkubováno s 15 µl vzorku při teplotě 25°C. Absorbance byla měřena při λ = 505 nm. Pro výpočet antioxidační aktivity, byl použit rozdíl absorbancí v době, aplikace vzorku a absorbance vzrorku s reagencií po 15 min inkubace. Vyhodnocení bylo provedeno s pomocí kalibrační křivky. Jako kalibrátor byla použita kyselina galová o koncentraci 0- 8 µg/ml.
Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody ABTS. Je také označována jako metoda TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity, vzhledem k tomu, že výsledná antiradikálová aktivita vzorku je srovnávána s antiradikálovou aktivitou syntetické látky Troloxu (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2- karboxylová kyselina). Zhášení radikálu ABTS•+ antioxidanty, které se chovají jako donory vodíku, se sleduje spektrofotometricky na základě změn absorpčního spektra ABTS•+. Metoda stanovení TAA
vzorků pomocí ABTS je jednoduchá, rychlá v provedení a má široké uplatnění, od hodnocení antioxidační aktivity látek různého původu až po směsné vzorky. [31] Příprava reagencií: 7 mmol·l-1 ABTS• (2,2´-azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonová kyselina) (navážka na 10 ml, m = 0.03841 g, nejprve rozpustit v malém množství methanolu) a 4.95 mmol·l-1 peroxodisíran draselný (navážka na 10 ml, m = 0.01338 g) se smíchají a rozpustí v ACS vodě. Roztok se naředí ACS vodou v poměru 1 : 9 (10 ml se přelije do 100 ml baňky a zředí ACS vodou). Roztok se ponechá 12 hodin ve tmě. Reagencie je použitelná týden za teploty 4 °C, uskladněná v temném prostředí. 150 µl činidla ABTS bylo napipetováno do kyvety s následným přidáním 3 µl vzorku. Absorbance se měří při λ = 660 nm po 12 minutách. Pro výpočet antioxidační aktivity, byl použit rozdíl absorbancí v době, aplikace vzorku a absorbance vzrorku s reagencií po 15 min inkubace. Vyhodnocení bylo provedeno s pomocí kalibrační křivky. Jako kalibrátor byla použita kyselina galová o koncentraci 0- 30 µg/ml.
Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody DMPD. Standardem je kyselina gallová, na její ekvivalentní množství se antioxidační aktivita vzorku přepočítává pomocí ekvivalentního množsŃství standardu [32]. Příprava reagencií: 1. roztok (acetátový pufr o pH 5.25): 1a) 2.17 g octanu sodného doplnit po rysku ACS vodou (100 ml). 1b) 300 µl koncentrované kyseliny octové (>99.5 %, v/v) doplnit do této baňky, promíchat! 2. roztok chloridu železitého: 1 mg FeCl3 doplnit po rysku ACS vodou (5 ml). 3. roztok DMPD: 25 mg DMPD rozpustit v metylalkoholu a doplnit na 5 ml ACS vodou. Tyto tři roztoky se smíchají v poměru: 100 ml pufru : 5 ml roztoku chloridu železitého : 5 ml roztoku DMPD, vznikne reagencie pro stanovení antioxidační aktivity. Upozornění: 3. roztok – roztok DMPD musí být vždy čerstvý, jeho stabilita je 12 hodin. 160 µl činidla DMPD bylo napipetováno do kyvety s následným přidáním 4 µl vzorku. Absorbance byla měřena při λ = 505 nm po dobu 12 minut. Pro výpočet antioxidační aktivity, byl použit rozdíl absorbancí v době, aplikace vzorku a absorbance vzrorku s reagencií po 12 min inkubace. Vyhodnocení bylo provedeno s pomocí kalibrační křivky. Jako kalibrátor byla použita kyselina galová o koncentraci 0- 30 µg/ml.
Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody Blue CrO5. Chrom
peroxid (CrO (5)) je produkován dichromanem amonným v kyselém prostředí
za přítomnosti peroxidu vodíku. Příprava reagencií: 1 roztok: 1a) 10 ml roztoku 0,025 M kyseliny sírové: 13,4 µl 98,8 % kyseliny sírové zředit ACS vodou na 10 ml. 1b) 10 ml roztoku 0,02 M dichromanu amonného: 0,0504 g dichromanu amonného doplnit ACS vodou. 1c) 30 ml 99,5 % DMSO. Tyto tři roztoky se smíchají v poměru 1 (roztoku kyseliny sírové) : 1 (roztok dichromanu amonného) : 3 (DMSO). 2 roztok: 1.6 M peroxid vodíku. POSTUP: Do kyvet je nepipetováno 200 µl reagencie číslo 1, po 7,5 minutách byla přidána reagencie č. 2. Po dalších 7,5 minutách byla změřena absorbance při 570 nm. Jako kalibrátor byl použit tokoferol o koncentraci 0- 30 µg/ml.
9. VÝSLEDKY A DISKUSE 9. 1 RŮST BUNĚK TABÁKU V ZÁVISLOSTI NA KONCENTRACI NANOČÁSTIC Po sedmidenní kultivaci v živném médiu s koncentrací nanočástic 0, 1 a 10 µg/ml byla zvážena hmotnost narostlých buněk (Obr. 24). Růstová křivka byla vypočítána z hmotnosti pelety (tedy buněk bez supernatantu) a koncentrací. Z obrázku je patrné, že růst buněk byl MWCNTS nanočásticemi stimulován. Ve srovnání s kontrolními buňkami byla hmotnost buněk 2 × vyšší v případě koncentrace 1 µg/ml a 3 × vyšší v případě koncentrace 10 µg/ml. V případě kovových nanočástic MNPs růst buněk nebyl ovlivněn. Podobné výsledky byly dosaženy také v práci [12], kdy autoři kultivovali rostliny rajčete (Solanum lycopersicum)
relativní hmotnost buněk (% kontroly)
v přítomnosti 10-40 µg/l MWCNTs.
350 300 250 200 MWCNTS
150
MNPs
100 50 0 0
1 koncentrace nanočástic [µg/ml]
Obr. 24: Graf růstové křivky buněk tabáku
10
9. 2 STANOVENÍ CELKOVÉHO POČTU BÍLKOVIN Ve vzorcích byl stanoven obsah celkových bílkovin pomocí pyrogalové červeně. U MWCNTs bylo zjištěno, že obsah bílkovin v buňkách je zvýšený oproti kontrole, a to 2,5 × v případě koncentrace 1 µg/ml a 4,5 × v případě koncentrace 10 µg/ml. Tyto výsledky mohou být způsobeny tím, že MWCNTs mění genovou expresi tak, že dochází k nárůstu celkových bílkovin, jak bylo ukázáno v práci [33] kde autoři v rostlinách rajčete vystavených MWCNTs zjistili zvýšenou expresi genů spojených s oxidačním stresem a obranou proti patogenům. Zatímco u MNPs byla hmotnost buněk téměř konstantní, se zvyšující se koncentrací nanočástic byl zaznamenán mírný pokles obsahu celkových bílkovin.
relativní obsah proteinu [% kontroly]
500 450 400 350 300 250 MWCNTS
200
MNPs
150 100 50 0 0
1
10
koncentrace nanočástic [µg/ml]
Obr. 25: Graf stanovení celkového obsahu bílkovin pyrogalovou červení
9.3 VÝSLEDKY HODNOT ENZYMOVÉ AKTIVITY 9.3.1 Ellmanova metoda Ellmanova metoda je ukazatelem množství SH skupin, které pocházejí ze stresových sloučenin (GSH, fytochelatiny, cystein, (stresové) proteiny). Rovnice kalibrační křivky v rozmezí koncentrace kyseliny galové 0-30 µg/ml byla y= 0,092x + 0,79 R2= 0,9995. Na obrázku vidíme, že, u MWCNTs je snížený obsah SH skupin v buňkách oproti kontrole, a to 0,5 x v případě koncentrace 1 µg/ml a mírně v případě koncentrace 10 µg/ml. U MNPs byla zaznamenána zvýšená syntéza SH skupin, což může být vysvětleno tím, že jsou z kovu ( Fe3O4 ) a tedy jde o obecnou rostlinnou detoxikaci těžkých
relativní obsah SH skupin [% kontroly]
kovů, kdy thiolové sloučeniny hrají roli antioxidantů a detoxikačních [34] .
160 140 120 100 80 MW CNTS
60
MNPs
40 20 0 0
1
10
koncentrace nanočástic [µg/ml]
Obr. 26: Stanovení obsahu thiolových skupin pomocí Ellmanovy metody.
9.3.2 Glutation transferáza Glutathion S-transferáza (GST) je enzym potřebný k detoxikaci široké škály sloučenin a účastní se eliminace poškození buněk volnými radikály. GST detoxikuje poškozené sloučeniny (peroxidované lipidy), které jsou dále degradovány. Stanovení aktivity GST bylo provedeno enzymatickou metodou. Aktivita GST je stanovena jako množství vzniklého konjugátu glutathionu a syntetického substrátu GST (1-chlor-2,4-dinitrobenzen, CDNB), jehož absorbance je měřena spektrofotometricky při vlnové délce 340 nm. Zjistili jsme, že u MWCNTs je snížený obsah GST v buňkách oproti kontrole, a to 3 x v případě koncentrace 1 µg/ml a 6 x v případě koncentrace 10 µg/ml. Tyto výsledky ukazují na to, že u uhlíkatých nanočástic
buď dochází k inhibici GST nebo jsou aktivovány další způsoby detoxikace
sloučenin poškozených působením ROS. U MNPs byl naopak nárůst GST. Tyto výsledky ukazují na to, že se zvyšující se koncentrací nanočástic narůstá i oxidační stres buněk, což vede k navýšení aktivity GST a to nejvíc u koncentrace 1 µg/ml.
relativní aktivita GST [% kontroly]
300 250 200 150
MW CNTS MNPs
100 50 0 0
1 koncentrace nanočástic [µg/m l]
Obr. 27: Stanovení enzymové aktivity GST.
10
9.4 VÝSLEDKY HODNOT ANTIOXIDAČNÍ AKTIVITY STANOVENÉ POMOCÍ METOD ZALOŽENÝCH NA ZHÁŠENÍ VOLNÝCH RADIKÁLŮ 9.4.1 ABTS Je jednou ze základních a nejpoužívanějších metod pro stanovení celkové antioxidační aktivity. Testuje schopnost vzorku či látek zhášet kation-radikál ABTS•+ (2,2.-azinobis (3ethyl-2,3-dihydrobenzothiazol-6-sulfonát)). Rovnice kalibrační křivky v rozmezí koncentrace kyseliny galové 0-30 µg/ml byla y= 49,18x + 8,8366, R2= 0,9979 Zjistili jsme, že u MWCNTs je obsah antioxidačních látek v buňkách nepatrně zvýšený oproti kontrole v případě koncentrace 1 µg/ml a v případě koncentrace 10 µg/ml je hodnota antioxidačních látek snížená než u kontroly a to 5 ×. U MNPs se se zvyšující koncentrací zvyšuje i antioxidační aktivita, u koncentrace 10 µg/ml je nárůst 1 × vyšší než u kontroly. Interpretace tohoto jevu je nejednoznačná, může jít o toxické působení, které vedlo k selhání antioxidačních mechanismů.
relativní antioxidační aktivita [% kontroly]
180 160 140 120 100 80
MW CNTS
60
MNPs
40 20 0 0
1
10
koncentrace nanočástic [µg/m l]
Obr. 28: Graf stanovení antioxidační aktivity pomocí metody ABTS.
9.4.2 DMPD Sloučenina DMPD (dimethylfenylendiamin) je působením železité soli převedena na svou radikálovou formu, která je relativně stabilní a zároveň barevná, Po přidání vzorku se v přítomnosti redukčních faktorů radikál zháší, a tím odbarvuje. Tato změna je hodnocena spektrofotometricky. Rovnice kalibrační křivky v rozmezí koncentrace kyseliny galové 0-30 µg/ml y= 0,0598x + 0,1801 R2= 0,984. Zjistili jsme, že obsah antioxidačních látek je u MWCNTs v buňkách snížený oproti kontrole 1 × v případě koncentrace 1 µg/ml a 0,5 × zvýšený v případě koncentrace 10 µg/ml. U MNPs se obsah antioxidačních látek mírně
relativní antioxidační aktivita [% kontroly]
zvyšuje v závislosti na zvyšující se koncentraci nanočástic.
140 120 100 80 MW CNTS
60
MNPs
40 20 0 0
1 koncentrace nanočástic [µg/ml]
Obr. 29: Graf stanovení antioxidační aktivity pomocí DMPD
10
9.4.3 DPPH Tato metoda je považována za jednu ze základních metodik pro posouzení antiradikálové aktivity čistých látek i různých směsných vzorků. Spočívá v reakci testované látky se stabilním radikálem difenylpikrylhydrazylem - DPPH• (1,1-difenyl-2-(2,4,6- trinitrofenyl) hydrazyl). Při reakci dochází k redukci radikálu za vzniku DPPH-H (difenylpikrylhydrazin). Rovnice
kalibrační
křivky
v rozmezí
koncentrace
kyseliny
galové
0-8
µg/ml
y= 36,297ln(x) + 111,59 R2= 0,9974. U MWCNTs jsme zjistili, že obsah antioxidačních látek v buňkách je mírně zvýšený oproti kontrole v případě koncentrace 1 µg/ml i v případě koncentrace 10 µg/ml. U MNPs se obsah antioxidačních látek zvyšuje v závislosti na
relativní antioxidační aktivita [% kontroly]
zvyšující se koncentraci nanočástic.
160 140 120 100 80
MWCNTS
60
MNPs
40 20 0 0
1 koncentrace nanočástic [µg/ml]
Obr. 30: Graf stanovení antioxidační aktivity pomocí DPPH.
10
9.4 VÝSLEDKY HODNOT ANTIOXIDAČNÍ AKTIVITY STANOVENÉ POMOCÍ METOD ZALOŽENÝCH NA REAKCI KOVŮ S ANALYZOVANÝM VZORKEM 9.4.1 BLUE CrO5 Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody Blue CrO5. Chrom peroxid (CrO(5)) je produkován dichromanem amonným v kyselém prostředí za přítomnosti peroxidu vodíku. Je to temně modrá silně oxidační sloučenina, mísitelná a relativně stabilní v polárních organických rozpouštědlech, které lze snadno měřit spektrofotometricky. Jeho snížení známými antioxidanty, jako voda nebo rozpustný lipid, je měřeno spektrometricky jako snížení absorbce a může sloužit jako měřítko antioxidační kapacity určité látky. Metoda se vyznačuje významnou citlivostí, stabilitou, linearitou, přesností a opakovatelností. Rovnice kalibrační křivky v rozmezí koncentrace tokoferolu 0 - 60 µmol/l byla y= 2,4374x + 0,329, R2= 0,9927. U MWCNTs jsme zjistili, že obsah antioxidačních látek je v buňkách srovnatelný s kontrolou. U MNPs se obsah antioxidačních látek mírně zvyšuje v závislosti na zvyšující se
relativní antioxidační aktivita [% kontroly]
koncentraci nanočástic.
140 120 100 80
MWCNTS
60
MNPs
40 20 0 0
Obr.
31:
Graf
stanovení
1 koncentrace nanočástic [µg/ml]
antioxidační
aktivity
pomocí
10
metody
BLUE
CrO5
9.4.2 Srovnání antioxidačních aktivit – shrnutí Z výsledků stanovení antioxidačních aktivit v buňkách tabáku plyne, že v případě expozice MNPs je ve všech případech zvýšený obsah antioxidačních sloučenin ve srovnání
Celková antioxidační aktivita [%kontroly]
s kontrolními hodnotami, zatímco v případě MWCNTs byl pozorován mírný pokles.
160 140 120 100
MW CNTs
80 MNPs
60 40 20 0 0
1
10
koncentrace nanočástic [µg/ml]
Obr. 32: Srovnání antioxidačních aktivit – shrnutí Je známo, že jak MWCNTs [35] , tak i MNPs indukují volné [36] , v případě MNPs bylo zjištěno, že celková antioxidační aktivita v buňkách je o 30 % zvýšená ve spojení se zvýšeným obsahem thiolových skupina a zvýšenou aktivitou GST. V případě MWCNTs byl výrazně stimulován růst buněk, což se projevilo jak vyšší hmotností buněčné pelety, tak vyšším obsahem celkových proteinů. Oba typy nanočástic tedy mají vliv na metabolismus rostlinných buněk, což může mít v případě nekontrolovaného používání a uvolňování nanočástic a nanomateriálů do životního prostředí za následek změnu obsahu nutričních látek v potravinách nejen rostlinného původu s dopadem na lidské zdraví.
ZÁVĚR Jak bylo ukázáno v rešeržní části, vzhledem k tomu, že nanotechnologie jsou stále více používané v potravinářství, a to především v obalové technologii, potravinářských aditivech a pro prodloužení trvanlivosti potravin. Vzhledem k tomu, že se jedná o velmi atraktivní témata uplatnitelná v průmyslu, lze v budoucnosti předpokládat jejich masovou aplikaci. Z tohoto důvodu je nezbytné získat data o jejich účinku na živé organismy a sledovat možný dopad jejich používání nejen na člověka, ale i na životní prostředí a případně distribuci v potravním řetězci. Získaná data mohou sloužit jako podklady při vývoji nových aplikací nanotechnologií. Jedním ze způsobů, jak zkoumat vstup nanočástic do potravního řetězce, je sledovat jejich působení na modelové rostliny. V této práci byl sledován vliv nanočástic uhlíku (mnohostěnných uhlíkatých nanotrubic, MWCNTs) a železa (magnetic nanoparticles, MNPs) na suspenzní kulturu tabáku. Bylo zjištěno, že nanočástice železa a uhlíku mají odlišný vliv na růst buněk. V případě MWCNTs nanočástice stimulují růst buněk, což je patrné na růstové křivce a obsahu celkových bílkovin, zatímco u MNPs byl růst buněk srovnatelný s kontrolou. Dále byly v buňkách sledovány aktivita enzymu Glutathion-transferázy, obsah thiolových sloučenin a antioxidační aktivita. U Glutathion transferázy byl zaznamenán výrazný pokles její aktivity, a to až 6 × oproti kontrole u koncentrace 10 µg/ml. U MNPs byl zaznamenán mírný nárůst GST v závislosti na koncentraci nanočástic. U thiolových sloučenin byl v případě MNPs také pozorován jejich nárůst. Celková antioxidační aktivita byla u MNPs o 30 % vyšší než u kontrol, v případě MWCNTS byl pozorován její mírný pokles. Z obdržených výsledků tedy plyne, že NTS mají toxický efekt na tabák, ale každé jiným mechanismem působení. V případě MWCNTs byl výrazně stimulován růst buněk, což se projevilo jak vyšší hmotností buněčné pelety, tak vyšším obsahem celkových proteinů. Oba typy nanočástic tedy mají vliv na metabolismus rostlinných buněk, což může mít v případě nekontrolovaného používání a uvolňování nanočástic a nanomateriálů do životního prostředí za následek změnu obsahu nutričních látek v potravinách nejen rostlinného původu s dopadem na lidské zdraví.
ZKRATKY 2,4-D - kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová MWCNTs- Multi Wall Carbon nanotubes= mnohovrstvé uhlíkové nanotrubičky MNPs- Magnetic nanoparticlesCNTs- Carbon nanotubes= uhlíkové nanotrubičky SWCNTs- Single wall carbon nanotubes= jednovrstvé uhlíkové nanotrubičky SRU- systémy regulovaného uvolňování NNI- Vychází z výpočtu poměru mezi pozorovanou a očekávanou střední hodnotou minimální vzdálenosti mezi událostmi NNI (near neigbour index). GMO- geneticky modifikované organismy CAC- komise Kodex Alimentarius FAO- Food and Agriculture Organization= Organizace pro výživu a zemědělství WHO- World Health Organisation= Světová zdravotnická organizace DPPH- 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ABTS- (2,2.-azinobis(3-ethyl-2,3-dihydrobenzothiazol-6-sulfonát)) FRAP- ferric reduction ability of plasma AST – L-aspartát(2-oxoglutarát)aminotransferáza MDH – malátdehydrogenáza ALT – L-alanin(2-oxoglutarát) aminotransferáza LDH – laktátdehydrogenáza NADH- dehydrogenáza (NADH reduktáza, přesněji NADH ubichinon-reduktáza) IFCC- The International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine HEDTA- N-(hydroxyethyl)ethylenediaminetriacetic acid, C10H18N2O7 ALP- Alkalická fosfatáza DMPD – N,N-dimethyl-1,4-fenylendiamin-dihydrazyl IP – Identity Preservation
LITERATURA 1. 2. 3. 4. 5. 6.
7.
8. 9. 10. 11. 12.
13.
14. 15. 16.
17. 18. 19. 20.
21. 22.
Prnka , T.Š., K., Nanotechnologie. Česká společnost pro nové materiály a technologie. 2004. Kvasničková, A., Aplikace nanotechnologie v potravinářství. 2007. Weiss, J., D.J. McClements, and P. Takhistov, Functional materials in food nanotechnology. Food Australia, 2007. 59(6): p. 274-275. Tanthapanichakoon, W., Roles of Nanoencapsulation in Food Innovation. . 2007. Troy, M., Nanoparticle Silver Released into Water from Commercially Available Sock Fabrics. 2008. Kim, J.Y., J. Park, and O. Kwon, Development of a Database for Government-Funded Health/Functional Food Research. Journal of Medicinal Food, 2009. 12(6): p. 11851189. Akbari, Z., T. Ghomashchi, and S. Moghadam, Improvement in Food Packaging Industry with Biobased Nanocomposites. International Journal of Food Engineering, 2007. 3(4). Brody , A.L., Nanocomposite Technology in Food Packaging. 2007. Maul , P., Barrier Enhancement Using Additives. Fillers, Pigments and Additives for Plastics in Packaging Applications. 2005. Chau , C.-F.W., S.-H. – Yen , G.-C., The development of regulations for food nanotechnology. 2007. Sanguansri , P.A., M. A., Nanoscale materials development – a food industry perspective. 2006. Xingmao, M.-G.-L., J. - Yang Deng, C. - Kolmakov, A., Interactions between engineered nanoparticles (ENPs) and plants: Phytotoxicity, uptake and accumulation. 2010. Gonzalez-Melendi, P., et al., Nanoparticles as smart treatment-delivery systems in plants: Assessment of different techniques of microscopy for their visualization in plant tissues. Annals of Botany, 2008. 101(1): p. 187-195. Garcia, M., T. Forbe, and E. Gonzalez, Potential applications of nanotechnology in the agro-food sector. Ciencia E Tecnologia De Alimentos, 2010. 30(3): p. 573-581. Yang L, W.D., Particle surface characteristics may play an important role in phytotoxicity of alumina nanoparticles. 2007. Lee W, A.Y., Yoon H, Kweon H., Toxicity and bioavailability of copper nanoparticles to the terrestrial plants mung bean (Phaseolus radiatus) and wheat (Triticum awstivum): plant uptake for water insoluble nanoparticles. 2008. Lin D, X.B., Root uptake and phytotoxicity of ZnO nanoparticles. 2008. Stampoulis D, S.S., White JC., Assay-dependent phytotoxicity of nanoparticles to plants. 2009. Barrena R, C.E., Colan J, Font X, Sanchez A, Puntes V., Evaluation of the ecotoxicology of model nanoparticles. 2009. Nurmi JT, T.P., Sarathy V, Bear DR, Amonette JE, Pecher K, et al., Characterizationand properties of metallic iron nanoparticles: spectroscopy, electrochemistry and kinetics. 2005. Lovern SB, K.R., Daphnia magna mortality when exposed to titanium dioxide and fullerene (C60) nanoparticles. 2006. Zhu S, O.E., Haasch ML., Toxicity of engineered nanoparticles (fullerene, C60) in two aquatic species, Daphania and fathead minnow. 2006.
23.
24. 25. 26. 27.
28. 29. 30. 31. 32. 33.
34.
35. 36.
Oberdorster E, Z.S., Blickley TM, McClellan-Green P, Haasch ML., Ecotoxicology of carbon-based engineered nanoparticles: effects of fullerene (C60) on aquaticorganisms. 2006. Kumari M, M.A., Chandrasekaran N., Genotoxicity of silver nanoparticles in Allium cepa. 2010. Zhu H, H.J., Xiao JQ, Jin Y., Uptake, translocation and accumulation of manufactured iron oxide nanoparticles by pumpkin plants. 2008. Lin S, R.J., Hu Q, Hunson JS, Reid ML, Ratnikova T, et al., Uptake, translocation and transmission of carbon nanomaterials in rice plants. 2009. Carpita NC, G.D., Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular-structure with the physical properties of walls during growth. 1993. Navarro E, P.F., Wagner B, Marconi F, Kaegi R, Odzak N, et al., Toxicity of silver nanoparticles to Chlamydomonas reinhardtii. 2008. Proseus TE, B.J., Turgor pressure moves polysaccharides into growing cell walls of Chara corallinia. 2005. Kuča, K.-B., J., Užití Ellmanovy metody pro stanovení aktivit Cholinesteras při In vivo hodnocení účinků reaktivátorů. 1993. CANO, A., ACOSTA, M., ARNAO, M. B. , A Method to Measure Antioxidant Activity in organic media: Application to lipophilie viamins. . 2000. ZLOCH, Z., ČELAKOVSKÝ, J., AUJEZSKÁ, A. , Stanovení obsahu polyfenolů a celkové antioxidační kapacity v potravinách rostlinného původu. 2004. Khodakovskaya, M.V., et al., Complex genetic, photothermal, and photoacoustic analysis of nanoparticle-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2010. El Beltagi, H.S.a.A.A.M., Changes in non Protein Thiols, some Antioxidant Enzymes Activity and Ultrastructural Alteration in Radish Plant (Raphanus sativus L) Grown under Lead Toxicity. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca. 2010. Tan, X., C. Lin, and B. Fugetsu, Studies on toxicity of multi-walled carbon nanotubes on suspension rice cells. Carbon. 2009. Wang, H.H., et al., Physiological effects of magnetite (Fe3O4) nanoparticles on perennial ryegrass (Lolium perenne L.) and pumpkin (Cucurbita mixta) plants. Nanotoxicology. 2010.
SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1: Relativní velikosti atomů, biomolekul, bakterií a buněk. [2] Obr. 2: Hierarchická struktura vlasu. Vlas je tvořen šesti strukturními hierarchiemi ze základní stavební jednotky vlasů (ale i nehtů a kopyt), kterou je protein keratin. Výsledkem je vysoce pružná a relativně pevná struktura schopná samostatného růstu. [2] Obr. 3: Přehled aplikací nanotechnologie v potravinářském sektoru. [2] Obr. 4: Ilustrace použití nanolaminátů pro potažení potraviny . [2] Obr. 5: Logo firmy Nestle Obr. 6: Logo firmy Kraft Foods Obr. 7 :Logo firmy Univeler Obr. 8: Logo firmy Pepsi Obr. 9: Logo firmy Cargill Obr. 10: Logo firmy ConAgra Obr. 11: Logo firmy General Mills Obr. 12: Logo firmy H. J. Heinz Obr. 13: Logo firmy Cambell Soup Obr. 14: Logo firmy Maruha Obr. 15: Přehled a obecné zásady příjmu, dopravy a akumulace nanočástic rostlinami. Nanočástice jsou v přírodním prostředí pohlceny primárními kořeny nebo postranními kořeny a pak sekundárními. Nanočástice jsou pak dopravovány od kořene, přes stonek do listu. Nanočástice by také mohly být absorbovány na povrchu kořenů, kde by podporovaly příjem vody. [12] Obr. 16: Znázornění, jak pozitivně ovlivňují nanočástice MWCNTs v koncentračním rozmezí o 10-40 mg / l klíčivost semen a růst rostlin rajčete. [12] Obr. 17: Fenotyp Arabidopsis thaliana vystavených A. Hoaglandovu roztoku, B. 340 mg / l 20 nm AgNPs a C. 340 mg / l 40 nm AgNPs. Zobrazeno pod mikroskopem (Leica S6D). [12] Obr. 18: pH metr firmy Sigma-Aldrich Obr. 19: Automatické chemické analyzátory BS400 a BS200 Obr. 20: Centrifuga frmy DJB labcare Obr. 21: Třepačka firmy Scientific Industries Obr. 22: Váhy firmy Sartorius Obr. 23: Homogenizátor firmy firmy Schuett-biotec Obr. 24: Graf růstové křivky Obr. 25: Graf stanovení celkového počtu bílkovin pyrogalovou červení
Obr. 26: Stanovení enzymové aktivity pomocí Ellmanovy metody Obr. 27: Stanovení enzymové aktivity pomocí GST Obr. 28: Graf stanovení antioxidační aktivity pomocí metody ABTS Obr. 29: Graf stanovení antioxidační aktivity pomocí DPMD Obr. 30: Graf stanovení antioxidační aktivity pomocí DPPH Obr. 31: Graf stanovení antioxidační aktivity pomocí metody BLUE CrO5 Obr. 32: Srovnání antioxidačních aktivit – shrnutí
