MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA NÁRODNÍ CENTRUM PRO VÝZKUM BIOMOLEKUL

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA NÁRODNÍ CENTRUM PRO VÝZKUM BIOMOLEKUL

Disertační práce

Brno 2015

Lukáš Tichý

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Národní centrum pro výzkum biomolekul

Molekulární podstata familiární hypercholesterolémie Disertační práce

Lukáš Tichý

Školitel: RNDr. Lenka Fajkusová, CSc.

Brno 2015

Bibliografický záznam

Autor:

Mgr. Lukáš Tichý Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Národní centrum pro výzkum biomolekul

Název práce:

Molekulární podstata familiární hypercholesterolémie

Studijní program:

Biochemie

Studijní obor:

Genomika a proteomika

Vedoucí práce:

RNDr. Lenka Fajkusová, CSc.

Akademický rok:

2014/2015

Počet stran:

56

Klíčová slova:

Familiární hypercholesterolémie; LDL receptor; Ateroskleróza; LDLR; APOB; PCSK9; Cholesterol.

Bibliographic Entry Author:

MSc. Lukas Tichy Faculty of Science, Masaryk University National Centre for Biomolecular Research

Title of Dissertation:

Molecular basis of familial hypercholesterolemia

Degree Programme:

Biochemistry

Field of Study:

Genomics and Proteomics

Supervisor:

RNDr. Lenka Fajkusova, CSc.

Academic Year:

2014/2015

Number of Pages:

56

Keywords:

Familial hypercholesterolemia; LDL receptor; Atherosclerosis; LDLR; APOB; PCSK9; Cholesterol.

Abstrakt V disertační práci jsem se věnoval analýze genů spojených s fenotypovými projevy familiární hypercholesterolémie. Familiární hypercholesterolémie (FH) je autosomálně dominantní dědičné onemocnění charakterizované izolovaným zvýšením low density lipoprotein (LDL) cholesterolu v krvi pacientů. Dlouhodobě zvýšená hladina LDL cholesterolu v krvi je stěžejním krokem v patofyziologických mechanizmech vedoucích k ateroskleróze. Jednou z nejčastějších příčin FH jsou mutace v genech kódujících LDL receptor (LDLR) a apolipoprotein B (APOB). Gen pro LDL receptor se nachází na 19. chromozómu a je složen z 18 exonů. Doposud bylo popsáno 1741 sekvenčních variant genu LDLR. Na rozdíl od genu LDLR, kde jsou mutace rozprostřeny v rámci celého genu a pro diagnostické účely se provádí analýza všech exonů a přilehlých intronových oblastí, je molekulární analýza genu APOB zaměřena na detekci nejčastější mutace p.(Arg3527Gln). Frekvence heterozygotů FH je 1/500, frekvence homozygotů nebo složených heterozygotů 1/1 000 000. Celkem bylo v letech 1997 – 2014 zanalyzováno 3900 vzorků probandů suspektních pro FH. Mutace v LDLR genu byla nalezena v 833 případech (21,4%), mutace v genu APOB v 377 případech (9,7%). U 85 pacientů byla provedena analýza genu PCSK9 bez nálezu kauzální mutace. Celkem bylo nalezeno 180 typů mutací v LDLR genu. V 69,4% případů se jednalo o bodové mutace, v 19,5% o malé delece, duplikace a inzerce (<100 bp). Pomocí metody MLPA bylo nalezeno celkem 20 typů rozsáhlých genových přestaveb (11,1%), z toho se v 15 případech jednalo o delece a v 5 případech o duplikace. U 8 typů těchto přestaveb jsme identifikovali body zlomu a určili mechanizmus, kterým k přestavbě došlo. U 6 přestaveb byla jako mechanizmus vzniku určena nealelická homologní rekombinace (NAHR – Nonallelic homologous recombination) u 2 zbývajících pak nehomologní spojení konců (NHEJ Nonhomologous end joining).

Abstract In this PhD thesis I studied and analyzed the genes which are related with familial hypercholesterolemia. Familial hypercholesterolemia (FH) is autosomal dominant inherited disorder which is characterized by isolated elevation of low density lipoprotein (LDL) cholesterol in the patients. This elevated level of LDL cholesterol is crucial step in pathophysiology of atherosclerosis. Mutations in the low density lipoprotein receptor (LDLR) gene and in the apolipoprotein B (APOB) gene are the most common cause of FH. LDLR gene is located on chromosome 19 and is composed from 18 exons. More than 1740 mutations in this gene were described to date. Mutations in the LDLR gene are located along the whole sequence of the gene. All exons, intron junctions and promoter are analyzed for the diagnostics. On the contrary, only one common mutation p.(Arg3527Gln) is analyzed in the APOB gene. Frequency of FH heterozygotes is 1/500, frequency of homozygotes or compound heterozygotes is 1/1 000 000. 3900 samples of FH suspected probands were analyzed during years 1997 – 2014. Mutations in the LDLR gene were found in 833 cases (21,4%), in APOB gene in 377 cases (9,7%). Causal mutation in PCSK9 gene was not found in none of 85 patients. 180 types of mutation were found in the LDLR gene. Point mutations account of 69,4%, small deletions, insertion and duplication (<100 bp) of 19,5%. Using MLPA, 20 types of large rearrangements (11,1%) were found. Deletion was identified in 15 cases and duplication in 5 cases. In 8 types of rearrangements, we identified the breakpoints and mechanism of origin: mechanism of nonallelic homologous recombination (NAHR) was identified in 6 cases and nonhomologous end joining (NHEJ) mechanism was found in 2 cases respectively.

Poděkování Na tomto místě bych rád poděkoval mojí školitelce RNDr. Lence Fajkusové, CSc. za dlouholeté vedení, odbornou podporu a cenné rady. Zesnulému RNDr. Liboru Kozákovi patří dík za to, že mne přivedl k tématu familiární hypercholesterolémie a uvedl mne do skvělé skupiny lidí spolupracujících v rámci projektu MedPed. Díky zapojení našeho pracoviště do tohoto projektu jsme se mohli jako hlavní laboratoř podílet na analýze genu pro LDL receptor a v pozdějších letech i genu PCSK9. Já osobně jsem se díky tomuto projektu seznámil s mnoha skvělými odborníky, z nichž řada se stala i mými přáteli. MUDr. Tomáši Freibergerovi, PhD. bych rád poděkoval za jeho cenné rady při interpretaci výsledků vzhledem ke klinickým údajům pacientů. Za dlouholetou skvělou spolupráci na tématu patří velký dík Mgr. Petře Zapletalové a DiS. Ondřeji Letochovi. Děkuji všem svým kolegům, kteří se mnou na daném tématu spolupracovali a bez jejichž pomoci a výsledků by práce nebyla kompletní.

Prohlášení autora Prohlašuji, že všechny prameny použité při přípravě této disertační práce jsou uvedeny v Seznamu použité literatury.

V Brně dne

Obsah 1

ÚVOD ............................................................................................................................................. 10

1.1

Kardiovaskulární onemocnění ............................................................................................... 10

1.2

Ateroskleróza......................................................................................................................... 10 1.2.1

Vývoj aterosklerotické léze............................................................................................ 10

1.3

Familiární hypercholesterolémie........................................................................................... 12

1.4

Cholesterol ............................................................................................................................ 13

1.5

Lipoproteiny .......................................................................................................................... 13 1.5.1

1.6

Lipoprotein LDL.............................................................................................................. 15

LDL receptor .......................................................................................................................... 17 1.6.1

LDLR gen ........................................................................................................................ 17

1.6.2

LDL receptorový protein ................................................................................................ 19

1.7

Apolipoprotein B100 ............................................................................................................. 21

1.8

PCSK9 ..................................................................................................................................... 22

2

Výsledky ......................................................................................................................................... 24

2.1

Výběr pacientů ...................................................................................................................... 24

2.2

Metodika ............................................................................................................................... 25

2.3

Souhrnné výsledky................................................................................................................. 27 2.3.1

Bodové mutace.............................................................................................................. 28

2.3.2

Malé delece/inzerce ...................................................................................................... 37

2.3.3

Rozsáhlé přestavby ........................................................................................................ 38

3

Diskuze........................................................................................................................................... 42

4

Přílohy............................................................................................................................................ 45

4.1

Primery - LDLR gen ................................................................................................................ 45

4.2

Reakční podmínky pro amplifikaci genu LDLR ....................................................................... 46

4.3

Primery - PCSK9 gen .............................................................................................................. 47

4.4

Reakční podmínky pro amplifikaci genu PCSK9..................................................................... 48

4.5

Reakční podmínky pro amplifikaci cílového úseku APOB genu............................................. 49

5

Seznam použité literatury ............................................................................................................. 50

8

6

Seznam zkratek.............................................................................................................................. 55

9

1 ÚVOD 1.1 Kardiovaskulární onemocnění Kardiovaskulární onemocnění jsou v širším slova smyslu veškerá onemocnění srdce a cév (řec. kardia – srdce a lat. vas – céva); v užším smyslu se tento termín obvykle používá pro označení nemocí způsobených aterosklerotickými degenerativními změnami: ischemickou chorobu srdeční, ischemickou chorobu dolních končetin a ischemickou cévní mozkovou příhodu (1). V České republice umírá ročně přibližně 100 tisíc lidí, z toho polovina na kardiovaskulární onemocnění (2). Tyto onemocnění jsou v naprosté většině způsobena aterosklerózou. 1.2 Ateroskleróza Ateroskleróza je chronické progresivní onemocnění cévní stěny charakterizované místní akumulací lipidů a dalších komponent krve a fibrózní tkáně v intimě arterií, provázené změnami v médii cévní stěny. Ateroskleróza se vyvíjí jako chronický zánět s nadměrnou proliferativní odpovědí intimy a médie tepen na různé podněty, zejména na modifikované LDL (low density lipoproteins) (3). 1.2.1 Vývoj aterosklerotické léze Vývoj aterosklerotické léze je dlouhodobý proces, který probíhá v několika fázích (obrázek 1). Ačkoliv není striktně znám etiologický faktor primárního poškození cévního endotelu (patogeny, kouření a další), následuje po něm kaskáda procesů vedoucích ke zvýšenému pronikání LDL částic do intimy cév, které zde podléhají dalším biochemickým reakcím, jako je oxidace volnými kyslíkovými radikály, anebo glykosylace v případě hyperglykémie u metabolických onemocnění. Na takto modifikované lipidové částice reagují endoteliální buňky zánětlivou reakcí s účastí integrinů a selektinů, a tato zánětlivá reakce přitahuje do místa léze monocyty a T-lymfocyty z krevní cirkulace. Prozánětlivé působení chemokinů uvolněných z endotelií a buněk vaskulární hladké svaloviny stimuluje proliferaci monocytů a jejich diferenciaci v makrofágy schopné fagocytovat modifikované LDL za vzniku pěnových buněk – lipofágů. Intenzita fagocytární aktivity makrofágů je stimulována přítomnými cytokiny a růstovými faktory, které podporují místní zánětlivou reakci. Kumulací těchto buněk v endotelu vznikají tzv. lipoidní skvrny, charakteristické svým vzhledem připomínajícím tukové proužky. Takto se subendotelový prostor cévní stěny zvětšuje za

10

současného zvýšení permeability a usnadňuje se tak difuze LDL částic a jejich lipoperoxidace působením reaktivních forem kyslíku a dusíku. Charakter vznikajícího ateromového plátu je dán zastoupením lipoproteinových částic LDL a HDL. Progredující zánětlivý proces způsobuje poškození stěny cévy zvýšenou proliferací a migrací buněk hladké svaloviny médie směrem k povrchu vznikajícího plátu, kde se podílejí na syntéze extracelulární matrix tvořené z kolagenu I. a III. typu a elastinu. Tímto mechanizmem vzniká fibrózní plát s prokoagulačními vlastnostmi a celý proces je zakončen tvorbou ateromového plátu (ateromu). Uvnitř ateromu se kumulují molekuly lipoproteinových částic, ale také nekrotická depozita rozpadlých lipofágů. Vznikající masa postupně propaguje až do lumina cévy, která je v důsledku celého děje stenotizována, a v konečné konsekvenci může docházet k ischemizaci tkáně, jež je danou arterií zásobená (4). Riziko vzniku závažných zdravotních komplikací nastává v okamžiku narušení integrity fibrózního krytu aterosklerotického plátu. K tomuto může dojít nejčastěji z důvodu exacerbace zánětlivého procesu uvnitř ateromu vyvolané opět etiologicky ne zcela známou jednotkou, která potencuje apoptický proces makrofágů a endoteliálních buněk na povrchu plátu. V souvislosti s recidivou zánětu dochází k produkci multispektrálních cytokinů stimulujících mimo jiné makrofágy k tvorbě metaloproteinázových enzymů (kolagenáz, elastáz, stromelysinu), které poškozením extracelulární matrix vedou k nestabilitě aterosklerotického plátu s vyplavením jeho obsahu do krevního systému. Při kontaktu aterosklerotického debris bohatého na koagulační faktory s faktory plazmatickými dochází k vytvoření trombu, který se v závislosti na své velikosti a intenzitě spuštěných procesů může reorganizovat a stenotizovat, rozpustit nebo taky úplně uzavřít lumen arterie. Stabilita aterosklerotických plátů může v podstatě představovat dynamický proces. (3)

11

Obrázek 1: Hlavní fáze aterosklerotických změn. Převzato z (5).

1.3 Familiární hypercholesterolémie Familiární hypercholesterolémie (FH) se vyznačuje autozomálně dominantním typem dědičnosti a s frekvencí výskytu 1 : 500 ve většině bělošských populací se řadí k nejčastějším vrozeným poruchám metabolizmu vůbec. Je charakterizována zvýšenými koncentracemi LDL-cholesterolu v plazmě, jeho zvýšeným ukládáním ve tkáních, což se projevuje zejména šlachovými a kožními xantomy, přítomností arcus lipoides cornae (šedobílý prstenec lipidových depozit rohovky při limbu oka), xantelasmat a tvorbou ateromatózních plátů v cévách, a s tím související předčasnou klinickou manifestací aterosklerózy, především ve formě ischemické choroby srdeční (ICHS) (6).

12

Kožní a zejména šlachové xantomy patří mezi vysoce specifické fenotypové projevy FH. V detailech není celý proces vzniku xantomů a xantelazmat dokonale objasněn. Hlavním krokem při jejich tvorbě jsou extravazace nativního nebo modifikovaného lipoproteinu LDL do intersticia kůže, kde dochází k vazbě LDL na proteoglykany. Extravazální LDL je rozeznáván a fagocytován mikrofágy, přičemž dochází k formování nodulárních a plochých útvarů z makrofágů změněných v pěnové buňky naplněné lipoidním materiálem, především cholesterolem (7). Riziko fatální nebo nefatální koronární příhody přesahuje 50 % u postižených mužů ve věku 50 let a 30 % u 60letých žen (8). 1.4 Cholesterol Cholesterol tvoří součást buněčných membrán. Stabilizuje jejich strukturu vazbou hydroxylové skupiny s polárními částmi fosfolipidů a sfingolipidů a vazbou steroidní části cholesterolu s řetězci mastných kyselin. Zajišťuje permeabilitu membrán (především pro malé molekuly) oddalováním fosfolipidů, které poté nemohou krystalizovat. Je součástí membrán intracelulárních

organel

(mitochondrií,

endoplazmatického

retikula).

Podílí

se

na

mezibuněčné komunikaci (intracelulární transport, přenos nervových vzruchů, buněčných signálů) (9). Typickou vlastností cholesterolu je jeho špatná rozpustnost ve vodném prostředí. V krevní plazmě se proto vyskytuje ve formě hydrofilních lipoproteinových částic – komplexů triacylglycerolů, cholesterolu a jeho esterů s amfifilními fosfolipidy a bílkovinami (10). 1.5 Lipoproteiny Lipoproteiny jsou částice sférického tvaru tvořené jádrem a obalem. V jádře lipoproteinové částice jsou soustředěny hydrofobní triacylglyceroly a estery cholesterolu. Obal je tvořen z molekul polárnějších fosfolipidů a neesterifikovaného cholesterolu a jedné nebo více molekul specifických bílkovin označovaných jako apolipoproteiny. Vazba lipidů na proteiny je nekovalentní, takže může snadno docházet k výměně apolipoproteinů a lipidů mezi jednotlivými částicemi. Lipoproteinové částice v krvi se liší obsahem lipidové složky (tabulka 1) a druhem apolipoproteinu (tabulka 2).

13

CM

VLDL

LDL

HDL

< 0,94

0,94 – 1,006

1,006 – 1,063

1,063 – 1,21

6000 - 2000

600

250

70 - 120

Celkový obsah lipidů (hm. %)

99

91

80

44

Triacylglyceroly (hm. %*)

85

55

10

6

Estery cholesterolu (hm. %*)

3

18

50

40

Cholesterol (hm. %*)

2

7

11

7

Fosfolipidy (hm. %*)

8

20

29

46

Hustota (g/ml) Průměr (Å)

Tabulka 1: Fyzikální vlastnosti a složení hlavních tříd lipoproteinů (převzato a upraveno z (11)). CM – chylomikra, VLDL – lipoproteiny o velmi nízké hustotě, LDL – lipoproteiny o nízké hustotě, HDL – lipoproteiny o vysoké hustotě. U hlavních složek jednotlivých částic je jejich zastoupení uvedeno jako hmotnostní % z celkového obsahu lipidů v jednotlivých typech částic (v tabulce je tato jednotka označena jako: hm.%*).

Apolipoprotein – mol. hmotnost (Da)

Výskyt

Funkce Hlavní protein HDL, váže ABCA1 na makrofázích,

apoA-I - 29,016

CM, HDL

hlavní anti-oxidační protein HDL, aktivuje lecitincholesterol acyltransferázu (LCAT)

apoA-II - 17,400

CM, HDL

apoA-IV - 46,000

CM, HDL

Primárně na HDL, zvyšuje aktivitu jaterní lipázy Přítomen na triglyceridy bohatých lipoproteinech, syntetizován v intestinu Nachází se výhradně na CM, vzniká alternativním RNA

apoB-48 - 241,000

Chylomikra

sestřihem z genu pro apoB-100 v epitelu intestina, postrádá LDL receptor vazebnou doménu apoB-100

apoB-100 - 513,000

VLDL, IDL and Hlavní protein LDL, váže se na LDL receptor; jeden LDL

z největších proteinu v lidském organizmu

Chylomikra, apoC-I - 7,600

VLDL, IDL and Fakultativní aktivace LCAT HDL Chylomikra,

apoC-II - 8, 916

VLDL, IDL and Aktivace lipoproteinové lipázy HDL Chylomikra,

apoC-III - 8,750

VLDL, IDL and HDL

Inhibice lipoproteinové lipázy, narušuje vychytávání a katabolismus lipoproteinů obsahujících apoB v játrech, pravděpodobně zlepšuje katabolismus HDL částic, zlepšuje adhezi monocytů k endoteliálním buňkám cév,

14

aktivuje signální dráhy zánětu apoD, 33,000

HDL

cholesterol ester transfer protein, CETP

alely [E2, E3, E4] každá má několik izoforem)

-

-

odlišných

50,000

proteinu

v

spojen s transferem esterů cholesterolu z HDL částic do

Remnanty chylomiker, VLDL, IDL a

(β2- Negativně nabité povrchy

nejméně alel;

HDL

Vazba k LDL receptoru

HDL

glycoprotein I) apo(a)

Plazmatický glykoprotein produkovaný primárně játry; LDL a VLDL částic výměnou za triglyceridy

apoE - 34,000 (nejméně 3

apoH

Úzce asociovaný s LCAT

19

velikost rozmezí

Inhibuje uvolňování serotoninu z krevních destiček, upravuje ADP-zprostředkovanou agregaci krevních destiček Pomocí disulfidových můstků vázán k apoB-100,

LDL

300,000 - 800,000

vytváří komplex s LDL částicí označovaný jako lipoprotein(a) (Lp(a)), velmi podobný plasminogenu, může přenášet cholesterol do míst cévního poškození

Tabulka 2: Specifické bílkoviny lipoproteinových částic – apolipoproteiny (převzato a upraveno z (12)).

1.5.1 Lipoprotein LDL Lipoproteiny LDL vznikají z IDL částic (obrázek 2) po hydrolýze triacylglycerolů jaterní lipázou, část je uvolňována do cirkulace játry. Jediným apolipoproteinem na povrchu LDL částice je apolipoprotein B-100. Lipidová složka v nich tvoří téměř 80 % s převažujícím obsahem esterů cholesterolu. Bílkoviny jsou zastoupeny 21 %. Jejich hlavní funkcí je transport cholesterolu k buňkám. Odstraňování LDL z plazmy se uskutečňuje pomocí LDL receptorů, které jsou lokalizovány na všech buňkách, nejvíce však na povrchu hepatocytů.

15

Obrázek 2: Metabolizmus lipoproteinů. Obrázek převzat z (13). Metabolizmus lipoproteinů zahrnuje tři hlavní metabolické cesty. Exogenní (střevní) metabolizmus zahrnuje hlavně transport triacylglycerolů ze stravy, ale také cholesterolu původem ze stravy a ze žluče, jako jsou např. chylomikrony. Lipoproteinová lipáza hydrolyzuje triacylglyceroly z chylomikronů na volné mastné kyseliny. Zbytky chylomiker jsou navázány na LRP protein v játrech. Endogenní (jaterní) metabolizmus zahrnuje transport triacylglycerolů a cholesterolu z jater jako VLDL. V kapilárách svalů a tukové tkáně je VLDL hydrolyzován za účasti lipoproteinové lipázy a poskytuje volné mastné kyseliny pro vstup do buněk. Tímto se VLDL přeměňují na IDL, které jsou částečně odstraňovány z cirkulace jaterními LDL receptory a částečně přeměněny na LDL. LDL jsou navázány na LDL receptory řady mimojaterních tkání (kosterní svalstvo, mozek a další), kde předávají cholesterol hlavně pro syntézu membrán. Játra také přijímají LDL prostřednictvím LDL receptorů a využívají jejich cholesterol k syntéze žlučových kyselin nebo lipoproteinů. Reverzní transport cholesterolu zahrnuje uvolnění neesterifikovaného cholesterolu z buněk do plazmy s následnou vazbou na HDL, konverzi z neesterifikovaného na esterifikovaný cholesterol za účasti LCAT a přenos esterifikovaného cholesterolu prostřednictvím cholesteryl ester transfer protein do VLDL a nakonec do IDL a LDL (14).

Cholesterol v LDL částicích (LDL-cholesterol) se významně uplatňuje při vzniku aterosklerózy. V důsledku zvýšené hladiny LDL cholesterolu v krvi dochází k zvýšenému průniku LDL částic cévním endotelem do intimy arteriální stěny, kde je modifikována jejich struktura. Modifikované LDL jsou pohlcovány makrofágy, které se přeměňují na tzv. pěnové buňky. Tento děj je první fází aterosklerotického procesu. Nejvyšší aterogenitou se vyznačují malé denzní LDL, které jsou menší a hustší s průměrem pod 25,5 nm a snadno pronikají endotelem, mají sníženou afinitu k LDL receptorům a snadno podléhají oxidativním přeměnám. Výskyt malých denzních LDL je spojen se zvýšenou koncentrací triacylglycerolů (15).

16

1.6 LDL receptor Jedna z nejčastějších příčin familiární hypercholesterolémie je mutace v genu pro LDL receptor. Do dnešního dne bylo popsáno více jak 1700 sekvenčních variant tohoto genu (16). 1.6.1 LDLR gen LDLR gen patří do rozsáhlé rodiny LDL receptorových genů (17) (obrázek 3). Gen se nachází na 19. chromozómu (19p13.2). Skládá se z 18 exonů, které jsou spolu s introny, promotorem a 3ʼ nepřekládanou oblastí, rozloženy do 44469 bazí genomické DNA (18).

Obrázek 3: a | Schématické znázornění LDLR proteinu. Hvězdičky označují regiony, které jsou stabilizovány vazbou iontu Ca2+. b | Zobrazení strukturálních domén proteinů vybraných členů rodiny LDLr genů. Každý ze členů obsahuje shodné domény jako LDLR protein, nicméně u každého z nich jsou uspořádány v unikátní konformaci. Ačkoliv LDLR protein hraje exkluzivní roli v homeostáze lipoproteinů, ostatní proteiny této rodiny rozeznávají nelipidové substráty a mají rozličné fyziologické funkce jako např. progrese aterosklerózy, přenos signálů, příjem vitamínů a vychytávání toxinů a virů z cirkulačního systému (převzato z (19)).

V promotoru LDLR genu se nachází sekvenční motiv označovaný jako sterol regulatory element (SRE). Tato regulační oblast je odpovědná za aktivaci transkripce při nízké hladině intracelulárního cholesterolu. Za těchto podmínek dochází k přerušení vazby mezi proteinem INSIG (Insulin induced gene) a komplexem SREBP-SCAP, který se nachází na membráně endoplazmatického retikula (20). SCAP poté eskortuje SREBP do Golgiho aparátu, kde dochází k jeho sekvenčně specifickému proteolytickému štěpení dvěma proteázami site 1 protease (S1P) a site 2 protease (S2P) a uvolnění jeho N-terminální domény

17

(bHLH) z membrány. Tato doména je pak jako dimér transportována do jádra pomocí importinu (21). V jádře N-terminální doména SREBPu aktivuje vazbou na sterol regulatory element transkripci cílových genů, zejména genu LDLR (obrázek 4).

Obrázek 4: Regulace transkripce LDLR genu. Převzato z (22). Mechanizmus vysvětlen v textu, viz výše.

Pro chromozóm 19, na kterém se LDLR gen nachází, je charakteristický vysoký počet Alu repetic. Alu repetice jsou cca 300 bp dlouhé repetitivní sekvence, které se řadí do skupiny SINEs (short interspersed elements). Alu repetice jsou nejhojněji se vyskytujícími transposibilními elementy v lidském genomu, kde tvoří cca 10% veškeré DNA (23) (obrázek 5). Alu elementy se obvykle počítají k junk DNA (odpadní DNA bez funkce), ale v mnohých případech ve skutečnosti zřejmě hrají důležitou roli v některých buněčných pochodech. Jsou například místem pro připojení kohesinových komplexů, jež spojují zreplikované chromozomy předtím, než dojde k jejich segregaci do dceřiných buněk (24).

18

Obrázek 5:Karyotyp lidských buněk (46, XX). Chromozómy byly hybridizovány s próbou pro Alu sekvence (zelená) a invertně dobarveny pomocí TOPRO-3 (červená). Převzato z (25).

Alu elementy jsou oblastmi s častým výskytem mutací v lidském genomu, ale tyto mutace zasahují většinou nekódující regiony, kde lze jen těžko určit jejich dopad (26). Alu elementy a další retrotranspozóny hrají hlavní roli v evoluci lidského genomu (27). První případ rekombinace zprostředkované Alu elementy a vedoucí k dědičné predispozici k hereditárnímu nepolypóznímu kolorektálnímu karcinomu byl popsán v roce 1995 a jednalo se o 3,5 kb deleci v genu MLH1 (28). Mezi další choroby, které jsou kromě FH spojovány s rekombinacemi zprostředkovanými Alu elementy, patří zejména rakovina plic, Ewingův sarkom, hemofílie, neurofibromatóza a další. 1.6.2 LDL receptorový protein Low density lipoprotein receptor (LDLR) je složený glykoprotein. Jedná se o receptor umístěný na vnější straně buněčné membrány, kde pomocí vazby s apoproteinem B100 zprostředkovává endocytózu LDL částic. Jako sekundární ligand rozeznává i apoE, který se nachází na chylomikronových remnantech a částicích IDL (29). Protein je syntetizován jako 860 aminokyselin dlouhý prekurzor, který po odštěpení 21-aminokyselinové signální sekvence a postranslačních modifikacích v Golgiho aparátu vede ke vzniku maturovaného funkčního receptoru (160 kDa) (30). V roce 1985 byla Michaelu S. Brownovi a Josephu L. Goldsteinovi udělena Nobelova cena za lékařství za identifikaci LDL receptoru a jeho spojitost s metabolismem cholesterolu a familiární hypercholesterolémií (31). N-terminální doména LDL receptoru je odpovědná za vazbu ligandu. Je složena ze sedmi repetic (sekvenčních motivů, které vykazují 50% vzájemnou identitu). Tyto repetice jsou označovány jako LDL-A1 až LDL-A7 a jsou složeny z cca 40 aminokyselin, přičemž vždy 6 cysteinových zbytků vytváří tři disulfidové můstky uvnitř jednotlivých repetic. Každá z těchto repetic navíc obsahuje rezidua kyselých aminokyselin, která slouží pro nekovalentní vazbu iontu vápníku v oktahedrální mřížce. Jak vazba Ca2+ iontu, tak disulfidové můstky mezi

19

cysteinovými zbytky jsou nezbytné pro strukturální integritu domény během opakované pasáže receptoru vysoce kyselým prostředím endozómu. Konkrétní mechanizmus vzniku vazby mezi LDL-A repeticemi a ligandem není zcela znám. Pro vazbu apoB jsou vyžadovány repetice 2-7, přičemž pro vazbu apoE je nutná pouze repetice 5 (32). Po ligand binding doméně následuje EGF-like doména (epidermal growth factor). Tato doména vykazuje 30% homologii s genem pro EGF prekurzor. Je složena ze třech repetic (A, B a C). Repetice A a B se nachází ve vzájemné blízkosti, zatímco repetice C je od předchozích dvou oddělena YWTD repeat regionem (region s vysokým obsahem aminokyselinového motivu Tyr-Trp-Thr-Asp). Doména zaujímá strukturu označovanou jako β-propeller. Předpokládá se, že tento region je odpovědný za pH-dependentní konformační změnu receptoru, která vede k uvolnění navázané LDL částice v endozómu (33). Třetí doménou LDL receptoru je tzv. O-linked sugar doména, která je bohatá na posttranslačně navázané oligosacharidy. Pravděpodobně plní úlohu distanční vložky pro odsazení vazebné domény od buněčné membrány. Transmembránová doména LDL receptoru je složena z 22 většinou nepolárních aminokyselin vytvářejících jednoduchý α-helix. Její hlavní funkcí je bezpečné kotvení receptoru v buněčné membráně. Cytosolická C-terminální doména je tvořena cca 50 aminokyselinami. Obsahuje signální sekvenci potřebnou pro lokalizaci receptoru do tzv. opláštěných jamek (clathrincoated pits) a pro endocytózu receptoru po vazbě LDL částice (obrázek 6). Doména obsahuje internalizační NPVY signál. Konformace cytozolické domény u receptoru bez navázané LDL částice zabraňuje přístupu intracelulárního internalizačního proteinového aparátu k tomuto signálu. Po vazbě ligandu dojde k odkrytí signálu a endocytóze receptoru (34).

20

Obrázek 6: Model popisující endocytózu pomocí clathrin-opláštěných vezikul. Během iniciace tvorby vezikul dochází k přesunu AP-2 proteinu a clathrinu k buněčnému povrchu díky interakci s fospolipidem PI(4,5)P2 a receptory přítomnými na buněčné membráně. AP-2 protein organizuje celou řadu tzv. přídavných proteinů, které jsou rekrutovány v místě vzniku vezikuly. Tyto přídavné proteiny jsou seskupovány na základě jejich specifických rolí v deformaci membrány, odštěpení vezikuly, které vyžaduje GTPázu dynamin, a následného rozpadu opláštění. V tomto okamžiku jsou proteiny účastnící se formování vezikuly k dispozici pro další kolo internalizace. Endocytovaná vezikula vstupuje do endozomálního systému, kde dochází k rozvázání vazby ligand-receptor. Převzato z (35).

Po vazbě LDL částice a internalizaci receptoru pomocí clathrin-opláštěných vezikul je systém receptor-LDL částice dopraven do endozómu, kde vlivem nízkého pH dochází k disociaci částice a uvolnění receptoru. Samotná disociace je zprostředkována triádou histidinů v LDL-A5 a v EGF prekurzorové doméně. Tyto modulují relativní afinitu LDL-A5 k LDL částici a EGF prekurzorové doméně jako funkci pH (36). Po uvolnění LDL částice je receptor dopraven znovu na membránu, kde je připraven k dalšímu cyklu. 1.7 Apolipoprotein B100 Druhou známou nejčastější příčinou familiární hypercholesterolémie je mutace v genu pro apolipoprotein B100. Tato nosologická jednotka bývá často označována jako familiární

21

deficit apoB100 (FDB). Oproti velkému množství mutací, které lze najít v LDLR genu, se u APOB vyskytuje predilekčně mutace p.Arg3527Gln nacházející se v 26. exonu. Díky této skutečnosti je v řadě diagnostických laboratoří analýza genu pro ApoB100 omezena pouze na stanovení této mutace. Raritně se vyskytují i další mutace. Apolipoprotein B100 hraje úlohu ligandu pro LDL receptor. Se svými více jak 4500 aminokyselinami je jedním z největších lidských proteinů (obrázek 7).

Obrázek 7: A| Ortogonální projekce modelu APOB100 (znázorněn žlutě) na povrchu částice LDL. Jedná se o dva amfipatické β-listy přerušené dvěma amfipatickými α-helixy. B| Hvězdičkou je znázorněna relativní poloha středu βpropelleru LDL receptoru při jeho vazbě na ligand. Převzato a upraveno z (37)

1.8 PCSK9 V pořadí třetí nejčastější příčinou FH, jsou gain of function mutace v PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) genu. Díky mechanizmu, jakým PCSK9 v organizmu působí (viz obrázek 8), se tato konvertáza stává potenciálním terapeutickým cílem u pacientů s homozygotní FH (38). PCSK9 je serinová proteáza exprimovaná hlavně v játrech a intestinu. Enzymatická aktivita PCSK9 umožňuje vlastní intracelulární maturaci a následnou sekreci z buňky. Cirkulující PCSK9 se váže na LDL receptor na povrchu buňky a následně kointernalizuje spolu s receptorem. V lyzozómu jsou pak LDL receptory s navázanou PCSK9 degradovány a nedochází tak k jejich opakované recyklaci na buněčnou membránu (39).

22

Obrázek 8: Role PCSK9 v regulaci exprese LDL receptoru. PCSK9 je po syntéze exportována do extracelulárního prostoru, kde se váže na povrchové LDL receptory. Komplex LDL receptor-PCSK9 je spolu s navázanou LDL částicí endocytován do buňky. Bez vazby PCSK9 by došlo k recyklaci receptoru a jeho opětovnému vystavení na povrchu buňky. Komplex receptorPCSK9 je však spolu s LDL částicí rozštěpen v lysozómu a je tak účinně zabráněno jeho recyklaci. Převzato z (40).

23

2 VÝSLEDKY 2.1 Výběr pacientů V roce 1994 byl založen v Rakousku projekt MedPed (Make early diagnosis for prevent early death in medical pedigrees), který v současnosti zahrnuje odborníky z více než 30 zemí světa. Cílem projektu je dramaticky snížit počet předčasných úmrtí u lidí s geneticky determinovanými poruchami metabolizmu lipidů, které jsou léčitelné. Náplní projektu MedPed je vyhledávání co největšího počtu postižených jedinců s možností zahájení jejich léčby. Velký důraz je v projektu MedPed kladen na vyhledávání rodinných příslušníků již diagnostikovaných FH pacientů. Nedílnou součástí projektu MedPed je sestavení a pravidelná aktualizace registru pacientů a jejich lékařů. Česká republika se k tomuto projektu připojila v roce 1997 v rámci České společnosti pro aterosklerózu (41). Síť pracovišť projektu MedPed ČR pokrývá území celé republiky. Na 2 národní centra v Praze a Brně navazují regionální centra a řada dalších specializovaných pracovišť a spolupracovníků. Síť MedPed je garantována Českou společností pro aterosklerózu. Diagnostika familiární hypercholesterolémie probíhá v současnosti zejména na dvou pracovištích. Koordinačním centrem projektu MedPed je Centrum kardiovaskulární a transplantační chirurgie v Brně, kde se soustřeďují všechny odběry pacientů suspektních pro familiární hypercholesterolémii. Na tomto pracovišti současně probíhá analýza familiárního defektu apolipoproteinu B100. Po této analýze jsou vzorky transportovány na pracoviště Centra molekulární biologie a genové terapie, kde probíhá mutační analýza genu pro LDL receptor, popř. PCSK9. Do molekulárně biologické analýzy APOB a LDLR genu byly zahrnuti převážně pacienti z projektu MedPed, kteří splňovali přísná klinická kritéria (výsledky biochemických testů lipidových parametrů, pozitivní osobní či rodinná anamnéza) (tabulka 3). Cca 10% pacientů nepocházelo z výše zmíněného projektu a u těchto pacientů nebyla k dispozici klinická data.

24

Tabulka 3: Výběrová kritéria MedPed. Hodnoty celkového a LDL-cholesterolu (v závorkách) jsou uvedeny v mmol/l. Převzato a upraveno z (42).

Pro molekulárně biologickou diagnostiku byli zařazováni především pacienti, jejichž hodnoty LDL cholesterolu se nacházely nad 95% percentilem hodnot specifických pro českou populaci (tabulka4).

Tabulka 4: Hodnoty 95% percentilu hodnot celkového a LDL-cholesterolu specifické pro populaci ČR. Převzato z (43).

Od roku 1997 bylo celkově analyzováno 3900 vzorků FH suspektních pacientů. 2.2 Metodika Vzhledem

k poměrně

širokému

časovému

rozmezí,

v kterém

byly

vzorky

analyzovány, docházelo postupem času k několika změnám metodiky vyšetření vzorků pacientů (obrázek 9).

Obrázek 9: Metodiky používané pro analýzu genu LDLR v Centru molekulární biologie a genové terapie. HA – heteroduplexní analýza; RFLP – polymorfismus délky restrikčních fragmentů; DGGE – denaturační gradientová gelová elektroforéza; DHPLC - vysokoúčinná denaturační kapalinová chromatografie; MLPA – multiplex ligation-dependent probe amplification; NGS – sekvenování nové generace.

25

V roce 1997 byla rutinní analýza LDLR genu založena na heteroduplexní analýze. V případě pozitivního výsledku byl vzorek sekvenován pomocí radioaktivně značených nukleotidů. Po analýze prvního většího souboru pacientů byl získán hrubý přehled o tom, které mutace budou frekventní u pacientů v ČR a jejich identifikace pomocí RFLP byla následně zařazena jako první krok analýzy neznámého vzorku. První krok DNA diagnostiky tedy zahrnoval RFLP detekci mutace p.(Gly592Glu) (18,1% ze všech zachycených mutací) a p.(Asp266Glu) (15,1% ze všech zachycených mutací) a současně se zachytila i poměrně frekventní mutace p.(Pro424_Asn425ins32) (1,4% ze všech zachycených mutací), jejíž přítomnost bylo možné odhalit již při kontrole amplifikace pomocí elektroforézy PCR fragmentů. V roce 2002 byla v CMBGT zavedena metoda DHPLC, přičemž po krátkou dobu byla provozována spolu s metodou DGGE. Po cca dvouročním testovacím období byla nakonec jako spolehlivější metoda vybrána právě DHPLC a diagnostické schéma se na poměrně dlouhou dobu ustálilo na tříkrokovém postupu, kdy první krok byla RFLP analýza dvou nejčastějších mutací následovaná sekvenční analýzou čtyř exonů s celkově největším zachyceným procentem mutací (exony 4, 5, 8 a 12 zahrnující 58,4% všech mutací). Všechny ostatní exony byly následně screenovány pomocí DHPLC. V roce 2005 bylo toto schéma doplněno o metodu MLPA, která slouží k nalezení rozsáhlých genových přestaveb. Po krátké době se tato metoda zařadila za sekvenční analýzu čtyř predilekčních exonů, tedy před metodu DHPLC. V září 2009 byla metoda DHPLC nahrazena DNA čipy využívajícími technologie APEX (arrayed primer extension). Zavedení této metodiky umožnilo zejména více jak 10 let zkušeností s analýzou LDLR genu – byl již k dispozici rozsáhlý soubor mutací získaný na českých pacientech. Ve spolupráci se společností Genorama Ltd (Tartu, Estonsko) byl navržen DNA čip, který se v různých verzích používal v rutinní diagnostice zhruba 1,5 roku. Nevýhodou technologie APEX však byl fakt, že daný čip dokázal zachytit pouze mutace, pro jejichž detekci byly na povrchu čipu k dispozici příslušné oligonukleotidy. Vzhledem k tomu, že v době, kdy se tento DNA čip používal, se standardním sekvenováním nacházelo v průměru 10 nových mutací za rok, vyžadoval tento fakt navrhování stále nových verzí čipu doplňovaných o nově nalezené mutace. Zásadním omezením pro rychlou analýzu vzorků, kterou bylo nutné provést, byla nedostatečná kapacita jednokapilárového sekvenátoru (ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer), který byl v CMBGT k dispozici. V roce 2010 byl zakoupen nový šestnáctikapilárový sekvenátor ABI 3130xl a kapacita sekvenování tak byla navýšena do té míry, že veškeré

26

sekvenace mohli být prováděny bez zdržení přímo v CMBGT. Tím bylo základní omezení rychlé analýzy definitivní metodou odstraněno a finální diagnostické schéma se ustálilo na dvoukrokové analýze (sekvenace + MLPA). V současné době je stávající sekvenování genu LDLR založené na Sangerově metodě nahrazováno sekvenováním nové generace (NGS). Pro tento typ sekvenování je v našem případě využíván komerční kit ADH Master od společnosti Multiplicom, kdy v jednom kole analýzy probíhá sekvenace nejen LDLR genu, ale i genu PCSK9, APOE a 26. exonu genu APOB. Celkově je po sérii multiplex PCR sekvenováno 65 amplikonů. Pro sekvenování využíváme přístroj MiSeq (Illumina Inc., San Diego, USA). Jedná se o sekvenování syntézou, přičemž tato technologie je založená na použití fluorescenčně značených, reverzibilně terminovaných nukleotidů. Každá báze je detekována v momentě její inkorporace do vlákna nukleové kyseliny. Zároveň dojde k záznamu intenzity fluorescenčně značeného terminátoru. Následuje odštěpení terminátoru umožňující inkorporaci další báze. Díky přítomnosti všech 4 značených bází v každém cyklu se z důvodu přirozené komplementarity minimalizují možné chyby v inkorporaci (44). Finální výsledek je vždy potvrzen klasickým sekvenováním (Sangerova metoda). Sekvence primerů a podmínky amplifikace pro analýzu promotoru a jednotlivých exonů genu LDLR jsou uvedeny v příloze 1 a 2. Pro amplifikaci promotoru a jednotlivých exonů genu PCSK9 byly použity primery uvedené v příloze 3. Reakční podmínky pro amplifikaci jsou následně uvedeny v příloze 4. Vzhledem k tomu, že dosud nebyla u českých pacientů nalezena žádná kauzální mutace v tomto genu, není sekvenační schéma nijak upraveno. Pro identifikaci mutace p.(Arg3527Gln) ve 26.exonu genu APOB byly použity primery uvedené v příloze 5 stejně tak jako reakční podmínky pro amplifikaci. Názvy mutací a polymorfizmů reflektují pravidla pro názvosloví sekvenčních záměn postulovaných společností HGVS (Human Genom Variation Society) a jsou platné k datu vydání této práce.

2.3 Souhrnné výsledky Celkem bylo v letech 1997 – 2014 zanalyzováno 3900 vzorků probandů suspektních pro FH. Mutace v LDLR genu byla nalezena v 833 případech (21,4%), mutace v genu APOB v 377 případech (9,7%). U 85 pacientů byla provedena analýza genu PCSK9 bez nálezu kauzální mutace.

27

V případě LDLR genu bylo nalezeno celkem 180 typů mutací či přestaveb. Tento soubor tvořily z 69,4% bodové mutace, z 19,5% malé delece/inzerce a z 11,1% velké přestavby. U bodových mutací největší část z celkového souboru tvořily missense mutace (52,8%), dále zhruba stejný díl tvořily nonsense mutace (8,3%) a mutace ovlivňující sestřih (6,7%), nejméně mutací bylo nalezeno v promotoru LDLR genu (1,7%). 2.3.1 Bodové mutace 2.3.1.1

Promotorové mutace

Promotor a 5ʼ UTR oblast LDLR genu je tvořena cca 300 bp. V promotoru se nachází několik regulačních a funkčních oblastí, z nichž pravděpodobně nejdůležitější úlohu hraje oblast označovaná jako SRE (Sterol Regulatory Element), která se nachází v pozici -148 až 158 (45). Tato oblast je cílovým místem pro vazbu proteinu SREBP, který je odpovědný za iniciaci transkripce LDLR genu způsobenou nízkou intracelulární koncentrací cholesterolu. Mimo tuto oblast se v pozici -185 až -194 a -134 až -143 nachází Sp1 binding site – oblast důležitá pro podporu basální transkripce genu (46). V oblastech -101 až -107 a -110 až -116 se nachází dva TATA boxy představující standardní funkční oblasti promotorů savčích genů. Při hodnocení funkčního dopadu nalezených sekvenčních záměn v promotorech genů není k dispozici dostatečně spolehlivý predikční software. Kauzalita nalezených záměn byla v našem případě hodnocena pomocí segregační analýzy (FSA – Family Segregation Analysis), dále na základě hodnocení pozice dané záměny a v neposlední řadě provedením funkční analýzy pomocí luciferázového reportérového genu (47). Přehled mutací v promotoru LDLR genu je uveden v tabulce 5. Označení mutace Mechanizmus účinku Frekvence (%) Zasahuje do SRE 0,12 c.-153C>T Zasahuje do SRE 0,83 c.-149C>A Provedena funkční studie (47) 0,12 c.-120C>T Tabulka 5: Přehled kauzálních mutací v promotoru LDLR genu u FH pacientů v ČR. Tučně jsou uvedeny mutace, které nebyly dosud popsány v jiných populacích. Frekvence je uvedena jako frekvence mutované alely v celkovém souboru všech mutovaných alel (n=839).

2.3.1.2

Nonsense mutace

Nonsense mutace jsou mutace, při nichž se původní kodón mění na Stop kodón. Zavedení Stop kodónu vede k předčasnému ukončení translace a vzniku proteinu bez Ckoncových oblastí, eventuálně protein nevzniká vůbec z důvodu rozkladu mRNA procesem

28

nonsense-mediated mRNA decay. Přehled nonsense mutací v LDLR genu je uveden v tabulce 6.

Exon 2 2 3 4 4 6 6 6 6 7 7 10 11 14 14

Označení mutace na úrovni cDNA c.131G>A c.157C>T c.246C>A c.501C>A c.693C>A c.828C>A c.862G>T c.917C>G c.939C>A c.949G>T c.1048C>T c.1510A>T c.1672G>T c.1998G>A c.2043C>A

Označení mutace na úrovni proteinu p.(Trp44*) p.(Gln53*) p.(Cys82*) p.(Cys167*) p.(Cys231*) p.(Cys276*) p.(Glu288*) p.(Ser306*) p.(Cys313*) p.(Glu317*) p.(Arg350*) p.(Lys504*) p.(Glu558*) p.(Trp666*) p.(Cys681*)

Frekvence (%) 1.19 0.12 0.12 0.12 0.12 0.95 0.12 0.83 0.24 0.36 0.36 0.12 0.12 0.24 0.12

Tabulka 6: Přehled nonsense mutací v LDLR genu u FH pacientů v ČR. Tučně jsou uvedeny mutace, které nebyly dosud popsány v jiných populacích. Frekvence je uvedena jako frekvence mutované alely v celkovém souboru všech mutovaných alel (n=839).

2.3.1.3

Missense mutace

Missense mutace jsou mutace, v jejichž důsledku dochází k záměně aminokyseliny v proteinovém řetězci za aminokyselinu jinou. V případě LDLR genu se jedná o jednoznačně největší skupinu mutací, které byly nalezeny, viz tabulka 7.

Exon 1 1 2 2 3 3 4 4 4 4 4 4

Označení mutace na úrovni cDNA c.3G>T c.58G>A c.81C>G c.100T>G c.259T>G c.311G>A c.325T>C c.383G>C c.388T>C c.420G>C c.427T>C c.445G>T

Označení mutace na úrovni proteinu p.(Met1Ile) p.(Gly20Arg) p.(Cys27Trp) p.(Cys34Gly) p.(Trp87Gly) p.(Cys104Tyr) p.(Cys109Arg) p.(Cys128Ser) p.(Ser130Pro) p.(Glu140Asp) p.(Cys143Arg) p.(Gly149Cys)

Frekvence (%) 0.12 2.03 0.12 0.12 0.12 0.12 0.60 1.00 0.36 0.83 0.12 0.12

29

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 8 8 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9 9 9 9 9 10 10

c.515A>G c.519C>G c.527G>T c.529T>C c.530C>T c.542C>G c.611G>T c.626G>A c.662A>G c.676T>C c.681C>G c.682G>C c.682G>A c.691T>G c.761A>C c.796G>A c.798T>A c.808T>C c.815A>C c.846C>A c.910G>A c.919G>A c.947A>C c.953G>T c.977C>G c.986G>A c.1013G>A c.1019G>A c.1024G>T c.1055G>A c.1061A>C c.1061A>G c.1065C>G c.1066G>C c.1091G>A c.1091G>C c.1112T>C c.1133A>C c.1177A>C c.1217G>C c.1222G>A c.1223A>T c.1246C>T c.1247G>C c.1252G>A c.1258G>A c.1291G>A c.1394A>G c.1414G>T

p.(Asp172Gly) p.(Cys173Trp) p.(Gly176Val) p.(Ser177Pro) p.(Ser177Leu) p.(Pro181Arg) p.(Cys204Phe) p.(Cys209Tyr) p.(Asp221Gly) p.(Ser226Pro) p.(Asp227Glu) p.(Glu228Gln) p.(Glu228Lys) p.(Cys231Gly) p.(Gln254Pro) p.(Asp266Asn) p.(Asp266Glu) p.(Cys270Arg) p.(Asn272Thr) p.(Phe282Leu) p.(Asp304Asn) p.(Asp307Asn) p.(Asn316Thr) p.(Cys318Phe) p.(Ser326Cys) p.(Cys329Tyr) p.(Cys338Tyr) p.(Cys340Tyr) p.(Asp342Tyr) p.(Cys352Tyr) p.(Asp354Ala) p.(Asp354Gly) p.(Ile355Met) p.(Asp356His) p.(Cys364Tyr) p.(Cys364Ser) p.(Leu371Pro) p.(Gln378Pro) p.(Lys393Gln) p.(Arg406Pro) p.(Glu408Lys) p.(Glu408Val) p.(Arg416Trp) p.(Arg416Pro) p.(Glu418Lys) p.(Val429Met) p.(Ala431Thr) p.(Tyr465Cys) p.(Asp472Tyr)

0.36 0.12 1.43 0.12 1.31 0.24 0.12 4.17 1.79 0.24 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12 0.48 15.14 0.24 0.24 0.24 0.24 0.24 0.36 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12 0.24 0.12 3.81 0.48 0.12 0.12 0.12 0.12 0.24 0.12 0.24 0.12 0.12 0.60 3.22 0.24 0.12 0.12 0.12 0.24 1.07

30

10 10 10 10 10 10 10 11 11 11 11 12 12 12 12 12 13 13 13 13 13 14 14 14 14 14 14 14 14 14 16 17 17 17

c.1432G>A c.1444G>A c.1474G>A c.1529C>T c.1538G>A c.1552A>G c.1567G>A c.1595A>G c.1618G>A c.1646G>A c.1633G>A c.1721G>T c.1748A>G c.1775G>A c.1822C>T c.1829C>G c.1860G>C c.1864G>A c.1865A>G c.1897C>T c.1951G>A c.1999T>C c.2023G>A c.2054C>T c.2072C>T c.2093G>T c.2093G>A c.2096C>T c.2101G>A c.2132G>A c.2389G>A c.2396T>G c.2407T>C c.2479G>A

p.(Gly478Arg) p.(Asp482Asn) p.(Asp492Asn) p.(Thr510Met) p.(Arg513Lys) p.(Lys518Glu) p.(Val523Met) p.(Tyr532Cys) p.(Ala540Thr) p.(Gly549Asp) p.(Gly545Arg) p.(Arg574Leu) p.(His583Arg) p.(Gly592Glu) p.(Pro608Ser) p.(Ser610Cys) p.(Trp620Cys) p.(Asp622Asn) p.(Asp622Gly) p.(Arg633Cys) p.(Asp651Asn) p.(Cys667Arg) p.(Gly675Ser) p.(Pro685Leu) p.(Ser691Leu) p.(Cys698Phe) p.(Cys698Tyr) p.(Pro699Leu) p.(Gly701Ser) p.(Cys711Tyr) p.(Val797Met) p.(Leu799Arg) p.(Cys803Arg) p.(Val827Ile)

0.12 0.36 1.31 0.12 0.12 0.12 1.43 0.12 0.36 0.12 0.12 0.24 0.12 18.12 0.12 0.60 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12 0.48 0.48 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12 0.60 0.24 0.12 0.36

Tabulka 7: Přehled missense mutací v LDLR genu u FH pacientů v ČR. Tučně jsou uvedeny mutace, které nebyly dosud popsány v jiných populacích. Frekvence je uvedena jako frekvence mutované alely v celkovém souboru všech mutovaných alel (n=839).

Ve většině případů není u missense mutací přesně znám mechanizmus jejich účinku. V některých případech je ale možná predikce jejich kauzality na základě vlastnosti původní a mutované aminokyseliny a struktury proteinu. Příkladem mohou být mutace cysteinu, kdy většinou dochází k porušení disulfidického můstku, jehož přítomnost bývá zásadní pro strukturu a funkci proteinu a jeho zrušení bude pravděpodobně mít dopad na skládání proteinu. Dalším příkladem jsou mutace, u kterých lze dopad odhadnout na základě jejich lokalizace ve funkčních doménách receptorového proteinu nebo jejich přítomnosti

31

v intramolekulárních signalizačních sekvencích. Taková mutace je např. p.(Val827Ile), která je lokalizovaná v internalizačním signálu Asn-Pro-Val-Tyr (NPVY signál, pozice 825 – 828), kde v důsledku mutace předpokládáme neschopnost internalizace receptoru pomocí clathrin opláštěných vezikul. Predikce dopadu missense mutací na funkci receptoru je poměrně problematická. Lze použít několik přístupů, přičemž při hodnocení kauzality mutací v tabulce 7 byl použit následující algoritmus: 1) Predikční programy 2) Segregační analýza v rámci rodiny (FSA – Family segregation analysis) 3) Hodnocení na základě frekvence dané alely v naší populaci Pro hodnocení missense mutací nalezených u českých pacientů byly použity celkem 4 predikční programy. Jedná se o PolyPhen 2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), SIFT (http://sift.jcvi.org/),

SNPs3D

(http://www.snps3d.org/)

a

PONP2

(http://structure.bmc.lu.se/PON-P2/). Výsledky predikce u jednotlivých mutací jsou uvedeny v tabulce 8. U predikčního softwaru SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) je analytický algoritmus založený na posouzení konzervovanosti dané mutované aminokyseliny u příbuzných sekvencí proteinů jiných organizmů, přičemž sekvence těchto příbuzných proteinů jsou vyhledávány pomocí nástroje PSI-BLAST (Position-Specific Iterative Basic Local Alignment Search Tool). Software poté na základě tohoto posouzení predikuje, zda nová aminokyselina je v dané pozici tolerována (tolerated) nebo zda ovlivňuje funkci daného proteinu (not tolerated) (48). PolyPhen 2 (Polymorphism Phenotyping v2) hodnotí pravděpodobný dopad záměny aminokyseliny na strukturu a funkci lidských proteinů na základě přímého porovnání fyzikálních vlastností jednotlivých aminokyselin (tzv. machine-learning classification) a evoluční konzervovanosti aminokyseliny na dané pozici. Poté odhadne pravděpodobnost poškození funkce proteinu danou missense mutací (při klesající pravděpodobnosti poškození funkce: probably damaging, possibly damaging, benign) (48). SNPs3D hodnotí záměnu aminokyseliny z hlediska destabilizace struktury daného proteinu, přičemž stejně jako předchozí dva softwary zohledňuje evoluční konzervovanost aminokyselin v dané pozici. Výsledkem je číselná hodnota, přičemž hodnoty menší než -0,5 znamenají mutaci kauzální, hodnoty nad 0,5 mutace benigní a u mutací v intervalu -0,5 až 0,5 není software schopen spolehlivě rozhodnout, o jaký typ mutace se jedná (49).

32

Poslední z použitých predikčních softwarů, PON-P2, využívá stejně jako PolyPhen 2, tzv. machine-learning classification. Taktéž využívá informace o evoluční konzervovanosti v kombinaci s informacemi týkajícími se genové ontologie a tam, kde jsou informace k dispozici i s anotací funkčních míst.

Predikce

Označení mutace na úrovni proteinu p.(Met1Ile)

PolyPhen 2 Possibly damaging

SIFT (%)SNPs3D Frekvence Not tolerated Unknown

PONP2 Neutral

p.(Gly20Arg)

Benign

Not tolerated

-1,17

Neutral

p.(Cys27Trp)

Probably damaging Not tolerated

-3,61

Unknown

p.(Cys34Gly)


-3,8

Pathogenic

p.(Trp87Gly)


-1,89

Unknown

p.(Cys104Tyr)


-2,58

Pathogenic

p.(Cys109Arg)


-3,18

Pathogenic

p.(Cys128Ser)


-2,49

Pathogenic

0,19

Unknown

p.(Ser130Pro)

Benign

Tolerated

p.(Glu140Asp)


-2,79

Unknown

p.(Cys143Arg)


-2,7

Pathogenic

p.(Gly149Cys)

Probably damaging

2,49

Unknown

p.(Asp172Gly)


-2,53

Pathogenic

p.(Cys173Trp)


-3,99

Unknown

p.(Gly176Val)

Probably damaging

-0,37

Pathogenic

p.(Ser177Leu)


-1,79

Pathogenic

p.(Ser177Pro)


-0,76

Unknown

p.(Pro181Arg)

Probably damaging

1,74

Unknown

p.(Cys204Phe)


-3,06

Unknown

p.(Cys209Tyr)


-3,06

Pathogenic

p.(Asp221Gly)


-1,6

Pathogenic

p.(Ser226Pro)


-1,04

Unknown

p.(Asp227Glu)


-2,84

Unknown

p.(Glu228Gln)


-2,75

Pathogenic

p.(Glu228Lys)


-2,41

Pathogenic

p.(Cys231Gly)


-3,37

Pathogenic

p.(Gln254Pro)


0,04

Pathogenic

p.(Asp266Asn)


-2,93

Unknown

p.(Asp266Glu)


-2,93

Unknown

Tolerated

Tolerated

Tolerated

33

p.(Cys270Arg)


-2,17

Pathogenic

p.(Asn272Thr)

Benign

Tolerated

0,76

Unknown

p.(Phe282Leu)

Possibly damaging

Not tolerated

-1,73

Pathogenic

p.(Asp304Asn)


-0,62

Pathogenic

p.(Asp307Asn)


-3,18

Pathogenic

p.(Asn316Thr)


-0,63

Unknown

p.(Cys318Phe)


-0,86

Unknown

p.(Ser326Cys)


0,07

Unknown

p.(Cys329Tyr)


-4,21

Pathogenic

p.(Cys338Tyr)


-2,93

Pathogenic

p.(Cys340Tyr)


-2,93

Pathogenic

p.(Asp342Tyr)

Possibly damaging

0,45

Unknown

p.(Cys352Tyr)


-3,27

Unknown

p.(Asp354Ala)


-2,25

Neutral

p.(Asp354Gly)


-1,22

Unknown

p.(Ile355Met)


-0,96

Pathogenic

p.(Asp356His)


-1,24

Pathogenic

p.(Cys364Tyr)


-3,27

Pathogenic

p.(Cys364Ser)


-2,93

Pathogenic

p.(Leu371Pro)


p.(Gln378Pro)

Benign

Not tolerated

Not tolerated

0

Pathogenic

0,08

Unknown

p.(Lys393Gln)


-0,88

Pathogenic

p.(Arg406Pro)


-1,45

Pathogenic

p.(Glu408Lys)


-0,13

Unknown

p.(Glu408Val)

Possibly damaging

Not tolerated

-0,47

Unknown

p.(Arg416Trp)


-1,38

Pathogenic

p.(Arg416Pro)


-0,01

Pathogenic

p.(Glu418Lys)

Possibly damaging

Not tolerated

-0,18

Unknown

p.(Val429Met)


-0,14

Pathogenic

p.(Ala431Thr)


-1,99

Unknown

p.(Tyr465Cys)


-0,53

Unknown

p.(Asp472Tyr)

Possibly damaging

-0,31

Unknown

p.(Gly478Arg)


-2

Pathogenic

p.(Asp482Asn)


-2,5

Unknown

p.(Asp492Asn)


-1,37

Unknown

Not tolerated

34

p.(Thr510Met)


-0,04

Unknown

p.(Arg513Lys)

Benign

Tolerated

1,6

Neutral

p.(Lys518Glu)

Benign

Tolerated

1,35

Unknown

p.(Val523Met)


-2,13

Pathogenic

p.(Tyr532Cys)


-3,27

Pathogenic

p.(Ala540Thr)


-1,25

Pathogenic

p.(Gly545Arg)


-1,73

Unknown

p.(Gly549Asp)


-2,93

Pathogenic

p.(Arg574Leu)


-1,97

Pathogenic

p.(His583Arg)


-0,62

Pathogenic

p.(Gly592Glu)

Possibly damaging

Not tolerated

-3,61

Pathogenic

p.(Pro608Ser)


-2,75

Unknown

p.(Ser610Cys)


-2,01

Unknown

p.(Trp620Cys)


-2,56

Pathogenic

p.(Asp622Asn)


-2,50

Unknown

p.(Asp622Gly)


-3,18

Pathogenic

p.(Arg633Cys)


-3,34

Pathogenic

p.(Asp651Asn)

Possibly damaging

-1,4

Unknown

p.(Cys667Arg)


-2,66

Pathogenic

p.(Gly675Ser)


-2,15

Pathogenic

p.(Pro685Leu)


-1,66

Pathogenic

p.(Ser691Leu)


-0,54

Pathogenic

p.(Cys698Phe)


-3,9

Unknown

p.(Cys698Tyr)


-3,9

Pathogenic

p.(Pro699Leu)


-3,13

Unknown

p.(Gly701Ser)

Probably damaging

-0,71

Unknown

p.(Cys711Tyr)


-3,69

Pathogenic

Not tolerated

Tolerated

p.(Val797Met)

Benign

Tolerated

0,71

Neutral

p.(Leu799Arg)

Possibly damaging

Not tolerated

-1,28

Neutral

p.(Cys803Arg)

Benign

Not tolerated

-0,82

Unknown


-0,78

Unknown

p.(Val827Ile)

Tabulka 8: Výsledky softwarové predikce dopadu missense mutací na funkci LDL receptoru. Použitý barevný kód by měl pomoci rychlejší orientaci ve výsledcích predikcí. Červeně jsou podloženy výsledky predikčních SW, které danou nukleotidovou záměnu vyhodnotily jako kauzální, oranžově jako pravděpodobně kauzální, zeleně jako bez dopadu a žlutě jsou podloženy takové části, kde daný predikční SW nedokázal s určitostí určit, zda se jedná o záměnu kauzální či nikoliv.

35

Jak je z tabulky 8 patrné, hodnocení kauzality mutací není vždy jednoznačnou záležitostí. U frekventnějších mutací nebo v případě, že je od FH pozitivního probanda k dispozici dostatečné množství rodinných příslušníků s dostatečně kvalitními klinickobiochemickými údaji, je možné použít další nástroj – segregační analýzu v rámci rodiny. Tento přístup je založen na tom, že se sleduje segregace FH fenotypu s nalezenou mutací. Pokud všichni nosiči mutace exprimují daný fenotyp a zároveň jedinci bez fenotypových příznaků nejsou nosiči dané mutace, podporuje tento fakt předpoklad, že se jedná o mutaci kauzální. Pravděpodobně nejslabším nástrojem, který lze použít, je hodnocení kauzality mutace na základě její frekvence v dané populaci. Podstatou tohoto přístupu je předpoklad, že pokud se nějaká nukleotidová záměna vyskytuje v dané populaci s vysokou frekvencí, pak je pravděpodobnost, že se jedná o záměnu kauzální, nízká. Pokud se však jedná o variantu raritní, pak je zde určitá pravděpodobnost, že se jedná o záměnu kauzální. Kombinací všech výše zmíněných nástrojů spolu s přihlédnutím k tomu, v jaké pozici vzhledem ke struktuře proteinu se mutace nachází, rozdílným fyzikálně chemickým vlastnostem nahrazujících se aminokyselin (bazická – kyselá, polární – nepolární), či jejich participaci v různých signálních sekvencích, byla u každé jednotlivé missense záměny odhadnuta její kauzalita. 2.3.1.4

Mutace ovlivňující sestřih

Sestřihové mutace jsou mutace, v jejichž důsledku dochází k ovlivnění sestřihu. Sestřih (splicing) je postsyntetická úprava mediátorové RNA, k níž dochází v jádru eukaryotních organizmů, kdy z pre-mRNA vzniká finální mRNA. Pro hodnocení, zda daná záměna ovlivňuje sestřih lze použít opět predikční programy, např.

NNSPLICE

(http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html),

(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/),

NetGene2 GeneSplicer

(http://www.cbcb.umd.edu/software/GeneSplicer/gene_spl.shtml) či HumanSplicingFinder (http://www.umd.be/HSF/). Úspěšnost predikce u programů hodnotících dopad bodových sekvenčních záměn na sestřih je obecně poměrně nízká. V případě, že dochází k mutaci v obvyklých kryptických místech, která se nachází v poloze ±1-2 bp od začátku či konce exonu, lze prakticky se 100% jistotou říci, že daná mutace sestřih ovlivní. S vzrůstající vzdáleností od příslušného exonu klesá prudce pravděpodobnost kauzality případné bodové záměny. Přehled mutací, u nichž předpokládáme dopad na sestřih LDLR genu je uveden v tabulce 9.

36

Intron Označení mutace na úrovni cDNA Frekvence (%) 1 5 6 6 9 9 12 12 12 14 16 16

c.68-2A>T c.817+1G>A c.940_940+14del c.940+1G>C c.1358+2T>A c.1358+5G>T c.1845+1G>A c.1845+1G>T c.1846-1G>A c.2140+2T>C c.2390-1G>A c.2312-2A>C

0.24 0.24 0.12 0.12 0.83 0.12 0.12 0.12 0.12 0.24 0.24 0.12

Tabulka 9: Mutace, u nichž předpokládáme dopad na sestřih LDLR genu. Tučně jsou uvedeny mutace, které nebyly dosud popsány v jiných populacích. Frekvence je uvedena jako frekvence mutované alely v celkovém souboru všech mutovaných alel (n=839).

2.3.2 Malé delece/inzerce Za malé delece/inzerce lze považovat takové sekvenční události, které svým rozsahem nepřesahují 100 bp. V zásadě se dělí do dvou skupin. Tzv. in frame delece/inzerce (tabulka 10), kdy dochází k delecím/inzercím počtu nukleotidů dělitelným 3 a nedochází tedy k posunu čtecího rámce. Dopad takovýchto přestaveb má na strukturu proteinu většinou menší dopad, než tzv. frameshift delece/inzerce (tabulka11), u nichž dochází v důsledku posunu čtecího rámce dříve či později ke vzniku Stop kodónu.

Exon 4 4 8 9 9

Označení mutace na úrovni cDNA c.347_367del c.654_656del c.1151_1159del c.1205_1207del c.1272_1273ins96

Označení mutace na úrovni proteinu p.(Cys116_Ile121del) p.(Gly219del) p.(Gln384_Asp386del) p.(Phe403del) p.(Pro424_Asn425ins32)

Frekvence (%) 0.36 0.83 0.12 0.83 1.43

Tabulka 10: Přehled malých inframe delecí/inzercí nalezených v LDLR genu v ČR. Tučně jsou uvedeny mutace, které nebyly dosud popsány v jiných populacích. Frekvence je uvedena jako frekvence mutované alely v celkovém souboru všech mutovaných alel (n=839).

Exon 4 4 4 4

Označení mutace na úrovni cDNA c.318_319insC c.369_370del c.472del c.578del

Označení mutace na úrovni proteinu p.(Lys107Glnfs*23) p.(Ser123fs*6) p.(Ser158Profs*48) p.(Asp193Alafs*13)

Frekvence (%) 0.95 0.12 0.12 0.12

37

4 6 6 7 7 8 8 10 10 10 11 11 12 14 15 15 17

c.625_626dupTG c.880_881del c.896del c.970del c.1053_1060dup c.1085del c.1184_1185del c.1367_1376del c.1377_1380del c.1533dup c.1632_1633del c.1662_1669dup c.1751del c.2068del c.2184insTCAGG c.2256_2257insGCTG c.2416_2417insG

p.(Cys209fs*57) p.(Lys294Serfs*6) p.(Ala299Valfs*71) p.(Gly324Alafs*46) p.(Asp354fs*19) p.(Asp362Alafs*8) p.(Val395Glyfs*45) p.(Leu456Profs*48) p.(Ala459fs*47) p.(Phe512Ilefs*24) p.(Lys544fs*14) p.(Thr557Cysfs*3) p.(Ser584fs*81) p.(His690Thrfs*19) p.(Leu729Serfs*3) p.(Pro753Alafs*29) p.(Val806Glyfs*11)

0.12 0.12 0.12 0.24 0.12 0.24 0.24 0.12 0.12 0.24 0.48 0.12 0.12 1.43 0.12 0.12 0.36

Tabulka 11: Přehled malých frameshift delecí/inzercí nalezených v LDLR genu v ČR. Tučně jsou uvedeny mutace, které nebyly dosud popsány v jiných populacích. Frekvence je uvedena jako frekvence mutované alely v celkovém souboru všech mutovaných alel (n=839).

2.3.3 Rozsáhlé přestavby Rozsáhlé přestavby patří mezi speciální skupinu mutací postihující nezřídka několik tisíc bp. Z celkového počtu mutací v LDLR genu tvoří 11,1% a jsou tak kauzální událostí u poměrně velkého souboru pacientů. Vzhledem k faktu, že daný typ mutace postihuje rozsáhlé oblasti genu, nepoužívají se v tomto případě žádné predikční nástroje pro odhad dopadu mutace, ale automaticky se předpokládá, že pokud vůbec k produkci proteinu dochází, pak je zcela nefunkční. Přehled přestaveb je uveden v tabulce 12.

Delece/Duplikace

Frekvence (%)

Promoter_ex1del Promoter_ex2del Exon1_12dup Exon2_6dup Exon2_10del Exon2_15dup Exon3_12del Exon4_8dup Exon5_10del Exon7_8del Exon7_10del Exon7_12del Exon9_14del

0.12 0.12 0.12 2.74 0.12 0.12 0.12 0.24 0.60 0.12 0.60 0.12 2.15

38

Exon9_15del Exon11_17del Exon13_14del Exon13_18del Exon16_18dup Exon16_17del Exon17_3ʼUTRdel

1.31 0.12 0.12 0.12 0.72 0.12 0.12

Tabulka 12: Přehled rozsáhlých přestaveb LDLR genu nalezených u pacientů s FH v ČR. Tučně jsou uvedeny mutace, které nebyly dosud popsány v jiných populacích. Frekvence je uvedena jako frekvence mutované alely v celkovém souboru všech mutovaných alel (n=839).

V minulosti jsme u řady našich přestaveb určili mechanizmus jejich vzniku a příslušné body zlomu (50) (obrázek 10 a 11). Nealelická homologní rekombinace (NAHR - non-allelic homologous recombination) je typ rekombinace, ke které dochází mezi dvěma vysoce homologními částmi DNA. NAHR byla detekována u šesti studovaných DNA přestaveb (promotor_exon2del, exon2_6dup, exon3_12del, exon9_14del, exon9_15del, exon16_18dup). Nehomologní spojování konců (NHEJ - non-homologous end-joining) je způsob, jakým se v organizmu opravují zlomy dvouvláknové DNA. Jako „nehomologní“ je označováno proto, že v místech zlomu není vyžadována sekvenční homologie. NHEJ bylo detekováno ve dvou případech (exon5_10del a exon4_8dup).

39

Obrázek 10: Schématické znázornění přestaveb v LDLR genu s uvedením sekvence bodů zlomu DNA.A| promotor_exon2del, B| exon2_6dup, C| exon3_12del a D| exon4_8dup. Alu repetice jsou znázorněny jako červené a modré boxy; jejich monomerní podjednotky jsou odlišeny světlejším a tmavším odstínem barvy. MER83 repetice je znázorněna zeleným boxem. Šedé boxy reprezentují sekvenční překryvy mezi 5´ a 3´ koncem referenční sekvence. Převzato z (50).

Obrázek 11: Schématické znázornění přestaveb v LDLR genu s uvedením sekvence bodů zlomu DNA.A| exon5_10del, B| exon9_14del, C| exon9_15del a D| exon16_18dup. Alu repetice jsou znázorněny jako červené a modré boxy; jejich monomerní podjednotky jsou odlišeny světlejším a tmavším odstínem barvy. Šedé boxy reprezentují sekvenční překryvy mezi 5´ a 3´ koncem referenční sekvence. Převzato z (50).

3 DISKUZE Předložená dizertační práce se zabývá mutacemi celkem ve třech genech, které jsou s FH spojovány. Primárně jsou zde diskutovány mutace v genu pro LDL receptor, dále v genu pro APOB a PCSK9. Celkem bylo analyzováno 3900 vzorků probandů suspektních pro FH. Mutace v LDLR genu byla nalezena v 833 případech (21,4%), mutace v genu APOB byla nalezena v 377 případech (9,7%). Souhrnná frekvence záchytu kauzálních mutací je tedy 31,1%. V publikovaných pracích se frekvence záchytu pohybuje mezi 30 – 90 %, přičemž frekvence silně koreluje s klinickými kritérii použitými pro výběr pacientů (51) (52). V předložené práci byly pro výběr pacientů použity kritéria definovaná v kapitole 2.1. U zbývající části pacientů, u nichž nebyla kauzální mutace odhalena, lze předpokládat, že se tato mutace nachází v jiných genech spojených s metabolizmem cholesterolu, eventuálně jsou u těchto pacientů jejich vysoké hladiny celkového a LDL cholesterolu způsobené nesprávnou životosprávou. Velké naděje, které byly vkládány do genu pro PCSK9 a přítomnosti gain of function mutací jako další z frekventních příčin FH, nebyly zcela naplněny. V souboru našich pacientů dosud nebyly tyto mutace nalezeny a ani v dalších populacích nejsou frekvence mutací v tomto genu příliš vysoké (53) (54) (55). Pravděpodobně mnohem důležitější roli bude hrát PCSK9 jako nový cíl medikamentózní léčby FH (56). Analýza genu APOB je omezena na analýzu 26. exonu, resp. na stanovení mutace p.Arg3527Gln. Jedná se o mutaci v receptor-vazebné doméně, přičemž pravděpodobně dochází k zachování zbytkové aktivity alely, neboť fenotypové projevy u pacientů s FDB jsou mírnější než u klasické FH. V studovaném souboru pacientů byla zachycena i jedna pacientka s homozygotní formou FDB. Co se týká mutací v LDLR genu, je situace mnohem pestřejší. V české populaci se vyskytuje cca 5 mutací, které lze označit za časté. Některé z nich byly nalezeny v poměrně vysokých frekvencích i v sousedních zemích, např. mutace p.(Gly592Glu) je i nejčastější mutací v Polsku (57) a mutace p.(Asp266Glu) je nejčastější mutací Rakousku (58) a v Německu (59), ačkoliv tam se vyskytuje s několikanásobně nižší frekvencí (tabulka 13).

42

Stát

Celkový počet nalezených variant

Česká republika

180

Polsko

71

Německo

77

Rakousko

100

Tři nejčastější mutace (frekvence) p.(Gly592Glu) (18,1) p.(Asp266Glu) (15,1) p.(Cys209Tyr) (4,2) p.(Gly592Glu) (22,5) Exon4_8dup (9,5) p.(Asp221Gly) (5,3) p.(Asp266Glu) (3,7) p.(Glu228*) (3,1) c.313+1G>A/C (3,1) p.(Asp266Glu) (11,1) p.(Asp200Gly) (5,9) p.(Asp157Asn) (4,6) p.(Val485del47) (4,6)

Tabulka 13: Frekvence výskytu nejčastějších mutací v LDLR genu v populacích států sousedících s Českou republikou.

Z mapování frekvence jednotlivých mutací v jednotlivých populacích lze teoreticky dovodit i pravděpodobné místo vzniku dané mutace. Vzhledem k poměrně jednoznačnému rozložení frekvence alel s mutací p.(Asp266Glu) v jednotlivých státech středoevropského regionu lze uvažovat o tom, že výše zmíněná mutace vznikla u některého prapůvodního obyvatele území, na kterém se dnes nachází Česká republika a mutace p.(Asp266Glu) je tedy mutací „českou“. Bohužel pro toto tvrzení nemáme jiných důkazů, než důkazů založených na frekvenci mutované alely. U nejčastější mutace p.(Gly592Glu) se bude pravděpodobně jednat o mutaci, která vznikla u jednoho z prapůvodních předků západní větve Slovanů. Předpokládáme, že převážnou část mutací tvoří mutace ovlivňující interakci s ligandem. Nasvědčují tomu i první výsledky funkčních analýz, které jsou v současné době v CMBGT prováděny (nepublikovaná data). Díky těmto analýzám bychom měli být schopni s konečnou platností rozlišit kauzální mutace od málo frekventních polymorfizmů, což v současné době lze v řadě případů provést jen obtížně zejména tehdy, když softwarová predikce dává nejednoznačné výsledky. V naší publikované práci (60) jsme se pokusili o korelaci fenotypových projevů se stanoveným genotypem u našich pacientů. V řadě případů jsme se však potýkali s neúplnými či ne zcela spolehlivými klinickými údaji, které jsme čerpali z databáze projektu MedPed. V současné době tato databáze prochází zásadní restrukturalizací, která by měla umožňovat mnohem lepší práci s klinickými daty. I přes tyto nedostatky jsme z použitých dat získali některé statisticky významné rozdíly a gradienty (p=0,05) mezi jednotlivými skupinami pacientů u sledovaných biochemických parametrů. Např. hladiny celkového cholesterolu byly statisticky významně nejvyšší u skupiny pacientů s potvrzenou mutací v LDLR genu, přičemž

43

u pacientů s FDB a u pacientů, u nichž nebyla odhalena kauzální mutace, se hladiny celkového cholesterolu statisticky významně nelišily. Podobně tomu tak bylo i v případě LDL cholesterolu (vypočteného dle Friedewaldovy rovnice (61)) přičemž výše popsaný gradient platil pouze pro mužskou část sledovaného souboru pacientů. U žen byly statisticky významné odchylky mezi všemi skupinami pacientů, přičemž nejvyšší hodnoty LDL cholesterolu byly u pacientů s mutací v LDLR genu, následovali pacienti s FDB a nejnižší hodnoty byly nalezeny u pacientů, u nichž kauzální mutace nebyla nalezena. Nejzávažnějším důsledkem FH je předčasná manifestace aterosklerózy. V našem souboru pacientů se ve věkové skupině nad 30 let vyskytly kardiovaskulární příhody v 16,4% a u 3,8% pacientů byl pozorován výskyt šlachových xantomů. Největší incidence obou závažných příznaků byla u pacientů s potvrzenou mutací v LDL receptorovém genu, kde se vyskytovaly s frekvencí 20,8% resp. 13,1%. Vzhledem k tomu, že u této skupiny jsou i signifikantně nejvyšší hodnoty LDL-cholesterolu, lze předpokládat, že právě LDL-cholesterol hraje klíčovou úlohu v etiologii obou klinických projevů. Základním významem molekulárně genetické diagnostiky FH je potvrzení klinické diagnózy. V rodinách s nalezenou mutací pak molekulárně genetická diagnostika slouží k vyhledávání dalších jedinců s FH, u nichž zatím nemuselo dojít ke klinické manifestaci příznaků. Tito jedinci pak mohou být včas léčeni a může se tak u nich účinně předcházet negativním patofyziologickým pochodům a změnám, které sebou vysoká hladina LDL cholesterolu přináší.

44

4 PŘÍLOHY 4.1 Primery - LDLR gen Primery používané pro amplifikaci exonů a přilehlých intronových sekvencí. U primerů, v jejichž názvu je označení M13, je před templát specifickou sekvenci zařazena 5'GTAAAACGACGGCCAG. Tato společná sekvence slouží pro sekvenační reakci s využitím univerzálního sekvenačního primeru M13. Název

Sekvence

M13-LDL-SP Prom

5'GTAAAACGACGGCCAGTGGAGTGGGAATCAGAGCTTCACGG

LDL-E1C

5‘CCATTACCCCACAAGTCTCCCAG

M13-SEK 2A

5’GTAAAACGACGGCCAGTTGGCAGGAAATAGACACAGGA

SEK 2B

5’ACCAGAAATTCAAGACCAGCCT

M13-EX3-1F

5’GTAAAACGACGGCCAGGGATTGGCAAGGCCAGTGGGT

EX3-1R

5’CACGGGGATGACGACCAGCG

M13-SEK 4A

5’GTAAAACGACGGCCAGGGTTCAGAGTCCATGGCCC

SEK 4B

5’GTTGTTGGAAATCCACTTCGGC

M13-SEK 5A

5’GTAAAACGACGGCCAGGGCCCTGCTTCTTTTTCTCTG

SEK 5B

5‘CCCTCTGGCTTCACAAATCATT

M-13LDL-E6C

5’GTAAAACGACGGCCAGCATTTGCATGCGTTCTTATGTG

LDL-E6D

5’CCAAAACCCTACAGCACTCATG

M13-LDL-E7C

5’GTAAAACGACGGCCAGGAGGTTGTAATGAGCCAAGGTTG

LDL-E7D

5‘AGCACACTTAACAGATGGGGAAAC

M13-LDL-E8C

5'GTAAAACGACGGCCAGTTCGAAGGTGTGGGTTTTG

LDL-E8D

5‘TCAGGGGATATGAGTCTGTGC

M13-SEK 9A

5’GTAAAACGACGGCCAGTTTTCTGGGTGCCTCCTCTGG

SEK 9B

5‘CTGAGGCAGGAGGAGAGAAGGG

M13-SEK 10A

5’GTAAAACGACGGCCAGATGATCTGCAGGTGAGCGTCG

SEK 10B

5‘ATGCCCAGCCCACTAACCAGT

M13-LDL-E11C

5'GTAAAACGACGGCCAGTGTTTCTTCCAGAATTCGTTG

LDL-E11D

5‘AACCTTCAGGGAGCAGCTTG

M13-SEK 12A

5’GTAAAACGACGGCCAGGGTGCTTTTCTGCTAGGTCCC

SEK 12B

5’TCACAACCAGTTTTCTGCGTTC

M13-E13D

5’GTAAAACGACGGCCAGGAGGGTGGCCTGTGTCTCATC

E13E

5’CCAGAAGATTCCAGAAATTTCCAG

M13-SEK 14A

5’GTAAAACGACGGCCAGCCCCAACCTTGAAACCTCCTT

45

SEK 14B

5‘GGTACCCATTTGACAGATGAGCA

M13-LDL-E15C

5’GTAAAACGACGGCCAGGGCCTCCCAAGGTCATTTGA

LDL-E15D

5‘CTCCGTGACCAAAATGTTCGTG

LDL-E16A

5'GTAAAACGACGGCCAGCATTTCTTGGTGGCCTTCCT

LDL-E16B

5'AAAAAGTGAACAGGCCCAAC

M13-SEK 17A

5’GTAAAACGACGGCCAGCAAGGTTATGGTACGATGCCC

SEK 17B

5‘TGGTCCCTTGAGGATCATATGC

M13-SEK 18A

5’GTAAAACGACGGCCAGGTACTCACCGTCTCCCTCTGGC

SEK 18B

5‘ACAAAGCTCTGGCAGGCAATG Tabulka 14: Primery používané pro amplifikaci LDLR genu.

4.2 Reakční podmínky pro amplifikaci genu LDLR Základními amplifikačními programy pro termocyklery byly modifikace následujícího obecného teplotního schématu: Krok 1: 94 °C – 6 min. Krok 2: 94 °C – 1 min. Krok 3: Ta - 1 min. Krok 4: 72 °C – 1 min. Go to 2

33x

Krok 5: 72 °C – 6 min. Krok 6: 20 °C – 10 min kde Ta je teplota annealingu a je specifická pro konkrétní exon stejně tak jako koncentrace Mg2+. Hodnoty obou proměnných jsou pro jednotlivé exony uvedeny v tabulce 15.

Exon

Primery

Mg2+ [mM]

Ta [°C]

Produkt (bp)

Promotor + 1

M13 SP prom, E1C

1,5

60

435

2

M13 SEK2A, SEK2B

1

56

294

3

M13 EX3-1F, EX3-1R

1,5

64

802

4

M13 SEK4A, SEK4B

1

62

635

5

M13 SEK5A, SEK5B

1,5

57

268

6

M13 E6C, E6D

1,5

56

310

7

M13 E7C, E7D

1

58

302

8

M13 E8C, E8D

1,5

58

322

9

M13 SEK9A, SEK9B

1

61

380

46

10

M13 SEK10A, SEK10B

1,5

61

408

11

M13 E11C, E11D

1

57

310

12

M13 SEK12A, SEK12B

1,5

58

357

13

M13 E13D, E13E

1,5

56

294

14

M13 SEK14A, SEK14B

1,5

59

352

15

M13 E15C, E15D

1,5

58

351

16

E16A, E16B

1

57

224

17

M13 SEK17A, SEK17B

1,5

58

333

18

M13 SEK18A, SEK18B

1

59

298

Tabulka 15: Hodnoty proměnných veličin používané při amplifikaci jednotlivých exonů LDLR genu.

4.3 Primery - PCSK9 gen Primery používané pro amplifikaci exonů a přilehlých intronových sekvencí. Název

Sekvence

PCSK9-P-3A

5’CCTCAGAACACACCCACTGCA

PCSK9-P-3B

5’TCCAGAGAGCCAGTGCACAAA

PCSK9-P-4A

5’TCGATGGGGATAACTCTGACCT

PCSK9-P-4B

5’AGCTCAGCTTTCCAGAAGATTCA

PCSK9-P-5A

5’TGCTTGTCCAGTTGATTTCT

PCSK9-P-5B

5’CACCTTTTCAGTGTTTCCTG

PCSK9-P-6A

5’TCAGCAGGAGACAAGGTGGAC

PCSK9-P-6B

5’CACTCCTCCAGGCTCAGACC

PCSK9-P-7A

5’TCAAGCACCCACACCCTAGAA

PCSK9-P-7B

5‘CGAGGAGACCTAGAGGCCGT

PCSK9-1A

5’CCGTTCAGTTCAGGGTCTGAG

PCSK9-1B

5’GACTGCACTCCACTTCCTCT

PCSK9-2A

5’CTAGGGTTTGCTGGGTTTCTT

PCSK9-2B

5‘ACTTGCTGTCCCCTTCTGATT

PCSK9-3A

5'GTTGACTTTATGCTCATTCCCTCC

PCSK9-3B

5'GCAAATGGATTCAGCTCAGATG

PCSK9-4A

5'GTTGACTTTATGCTCATTCCCTCC

PCSK9-4B

5'AGGATGGGGATATGGGCAGAG

PCSK9-5A

5'GCCACCTGCTGATTTGTTATAGG

PCSK9-5B

5'TTCTTGGTTAGGAGACATTAGCTCT

PCSK9-6A

5'TCCCCAAAATTAACCATCACTCTG

PCSK9-6B

5'AGCAGCCCCAGCACCTACCT

PCSK9-7A

5'AGCTGGCAAGGCCTGAGTCTG

47

PCSK9-7B

5'CCAAAGGGGCTGTTAGCATCAC

PCSK9-8A

5'CGTGTGTGCACTGGCAGGAGTC

PCSK9-8B

5'GGGAGAAGGGAGAGACTGTCAAGGT

PCSK9-9A

5'GAGGTCCCCTCACTCCCAGCAC

PCSK9-9B

5'TCCCTGAGGGCCCAGCACTGA

PCSK9-10A

5'CTGGCAGGGACACTGATGAGG

PCSK9-10B

5'CAGTGGGTGCATAAGGAGAAAGA

PCSK9-11A

5'GACGGAGCATCCCAGCATTTC

PCSK9-11B

5'GTATGGTGGTGGCACAAACTGAC

PCSK9-12A

5'GATGTCGGAGGGAGAAATGAAGTGT

PCSK9-12B

5'ATGGAGGGCTGAGAGAGGGACAAG

Tabulka 16: Primery používané pro amplifikaci PCSK9 genu.

4.4 Reakční podmínky pro amplifikaci genu PCSK9 Základními amplifikačními programy pro termocyklery byly modifikace následujícího obecného teplotního schématu: Krok 1: 94 °C – 6 min. Krok 2: 94 °C – 1 min. Krok 3: Ta - 1 min. Krok 4: 72 °C – 1 min. Go to 2

33x

Krok 5: 72 °C – 6 min. Krok 6: 20 °C – 10 min kde Ta je teplota annealingu a je specifická pro konkrétní exon stejně tak jako koncentrace Mg2+. Hodnoty obou proměnných jsou pro jednotlivé exony uvedeny v tabulce 17.

Exon

Primery

Promotor část 3

PCSK9-P-3A, PCSK9-P-3B PCSK9-P-4A, PCSK9-P-4B PCSK9-P-5A, PCSK9-P-5B PCSK9-P-6A, PCSK9-P-6B PCSK9-P-7A, PCSK9-P-7B

Promotor část 4 Promotor část 5 Promotor část 6 Promotor část 7

Mg2+ [mM]

Ta [°C]

Produkt (bp)

1

58

401

1

55

414

1

55

403

1

60

394

1.5

60

291

48

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

PCSK9-1A, PCSK91B PCSK9-2A, PCSK92B PCSK9-3A, PCSK93B PCSK9-4A, PCSK94B PCSK9-5A, PCSK95B PCSK9-6A, PCSK96B PCSK9-7A, PCSK97B PCSK9-8A, PCSK98B PCSK9-9A, PCSK99B PCSK9-10A, PCSK910B PCSK9-11A, PCSK911B PCSK9-12A, PCSK912B

1

60

574

2

62

359

1

60

223

1.5

60

235

1.5

60

311

1

60

311

1

60

314

1.5

60

335

1

58

291

1.5

62

345

1

60

329

1

60

391

Tabulka 17: Hodnoty proměnných veličin používané při amplifikaci jednotlivých exonů PCSK9 genu.

4.5 Reakční podmínky pro amplifikaci cílového úseku APOB genu Amplifikační program pro termocyklery - teplotní schéma: Krok 1: 94 °C – 6 min. Krok 2: 94 °C – 1 min. Krok 3: 62 °C - 1 min. Krok 4: 72 °C – 1 min. Go to 2

33x

Krok 5: 72 °C – 6 min. Krok 6: 20 °C – 10 min

Exon 26

Primers F (5'GAGATGTCAAGGGTTCGGTTC) R (5'AGGGTGGCTTTGCTTGTATGT)

MgCl2 [mM] 1

Ta [°C] 62

Product (bp) 274

Tabulka 18: Hodnoty proměnných veličin a sekvence primerů používané při amplifikaci 26.exonu APOB genu.

49

5 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 1. Wikipedia. [Online] Wikimedia Foundation, Inc., 2001 - 2014. [Citace: 14. 1 2014.] http://cs.wikipedia.org/wiki/Kardiovaskul%C3%A1rn%C3%AD_onemocn%C4%9Bn%C3%AD. 2. ÚZIS ČR. [Online] Ústav zdravotnických informací a statistiky České republiky, 2010 - 2014. [Citace: 24. 2 2014.] http://www.uzis.cz/. 3. WikiSkripta. [Online] MEFANET, 2003 - 2014. [Citace: 4. 5 2014.] http://www.wikiskripta.eu/index.php/Ateroskler%C3%B3za. ISSN 1804-6517. 4. ČEŠKA, R. Cholesterol a ateroskleróza, léčba dyslipidémií. Praha : Triton, 2012. ISBN 9788073875992. 5. Wikipedia. [Online] Wikimedia Foundation, Inc., 2001 - 2014. [Citace: 24. 12 2013.] http://en.wikipedia.org/wiki/File:Endo_dysfunction_ Athero.PNG. 6. FREIBERGER, T. a M. VRABLÍK. Genetika hyperlipoproteinémií. Familiární hypercholesterolémie. Postgraduální medicína. 2007, 9(4), 409-415. ISSN 1212-4184. 7. ZADÁK, Z. Kožní projevy hyperlipidémie u diabetiků z pohledu internisty. Vnitř Lék. 2006, 52(5), 465-9. ISSN 1801-7592. 8. MARKS, D. et al. A review on the diagnosis, natural history, and treatment of familial hypercholesterolaemia. Atherosclerosis. 2003, 168(1), 1-14. ISSN 0021-9150. 9. ALBERT, B. et al. Molecular biology of the cell. New York : Garland Science, 2002. ISBN 9780815341055. 10. WikiSkripta. [Online] MEFANET, 2003 - 2014. [Citace: 27. 12 2013.] http://www.wikiskripta.eu/index.php/Lipoproteiny. ISSN 1804-6517. 11. Plasma Lipoproteins. [Online] The AOCS Lipid Library, 23. 9 2014. [Citace: 30. 12 2013.] http://lipidlibrary.aocs.org/Lipids/lipoprot/index.htm. 12. Intestinal Uptake of Lipids. [Online] The Medical Biochemistry, 1996 - 2014.[Citace: 3. 1 2014.] http://themedicalbiochemistrypage.org/lipoproteins.php#classification. 13. ALDONS, JL. et al. Genetic Basis of Atherosclerosis: Part I. Circulation. [Online] American Hearth Association, 2014. [Citace: 12. 1 2014.] http://circ.ahajournals.org/content/110/13/1868.figuresonly. ISSN 1524-4539. 14. FERNANDES, J et al. Diagnostika a léčba dědičných metabolických poruch. Praha : Triton, 2008. ISBN 978-80-7387-096-6. 15. WikiSkripta. [Online] MEFANET, 2003 - 2014. [Citace: 4. 5 2014.] http://www.wikiskripta.eu/index.php/Lipoproteiny. ISSN 1804-6517. 16. LEIGH, S. LOVD Database. [Online] British Hearth Foundation, 2004 - 2006. [Citace: 11. 2 2014.] http://www.ucl.ac.uk/ldlr/Current/index.php?select_db=LDLR.

50

17. NYKJAER, A. and T.E. WILLNOW. The low-density lipoprotein receptor gene family: a cellular Swiss army knife? Trends Cell Biol. 2002, 12(6), 273-280. ISSN 0962-8924. 18. GeneCards. [Online] Weizmann Institute of Science, 1996 - 2014. [Citace: 3. 2 2014.] http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=LDLR. 19. WASAN, KM et al. Impact of lipoproteins on the biological activity and disposition of hydrophobic drugs: implications for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 2008, 7(1), 84-99. ISSN 14741776. 20. RAWSON, RB. Control of lipid metabolism by regulated intramembrane proteolysis of sterol regulatory element binding proteins (SREBPs). Biochem Soc Symp. 2003, (70), 221-31. ISSN 00678694. 21. LEE, SJ et al. The structure of importin-beta bound to SREBP-2: nuclear import of a transcription factor. Science. 2003, 302(5650), 1571-5. ISSN 0036-8075. 22. FERNO, J et al. Lipogenic effects of psychotropic drugs: focus on the SREBP system. Front Biosci (Landmark Ed). 2011, 16, 49-60. ISSN 1093-4715. 23. LIU, GE et al. Comparative analysis of Alu repeats in primate genomes. Genome Res. 2009, 19(5), 876-85. ISSN 1088-9051. 24. HAKIMI, MA et al. A chromatin remodelling complex that loads cohesin onto human chromosomes. Nature. 2002, 418(6901), 994-8. ISSN 0028-0836. 25. BOLZER, A et al. Three-Dimensional Maps of All Chromosomes in Human Male Fibroblast Nuclei and Prometaphase Rosettes. PLoS Biol. 2005, 3(5), :e157. ISSN 1544-9173. 26. LANDER, ES et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 2001, 409(6822), 860-921. ISSN 0028-0836. 27. SHEN, S et al. Widespread establishment and regulatory impact of Alu exons in human genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011, 108(7), 2837-42. ISSN 0027-8424. 28. NYSTRÖM-LAHTI, M et al. Founding mutations and Alu-mediated recombination in hereditary colon cancer. Nat Med. 1995, 1(11), 1203-6. ISSN 1078-8956. 29. FRANCKE, U et al. Assignment of the human gene for the low density lipoprotein receptor to chromosome 19: synteny of a receptor, a ligand, and a genetic disease. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1984, 81(9), 2826-30. ISSN 0027-8424. 30. SÜDHOF, TC et al. The LDL receptor gene: a mosaic of exons shared with different proteins. Science. 1985, 228(4701), 815-22. ISSN 0036-8075. 31. BROWN, MS and JL GOLDSTEIN. How LDL Receptors Influence Cholesterol and Atherosclerosis. Scientific American. 1984, 251(5), 58-66. ISSN 0036-8733. 32. BROWN, MS et al. LDL-receptor structure: Calcium cages, acid baths and recycling receptors. Nature. 1997, 388(6643), 629-30. ISSN 0028-0836.

51

33. GENT, J and I BRAAKMAN. Low-density lipoprotein receptor structure and folding. Cell Mol Life Sci. 2004, 61(19-20), 2461-70. ISSN 1420-682X. 34. BURDEN, JJ et al. Sorting motifs in the intracellular domain of the low density lipoprotein receptor interact with a novel domain of sorting nexin-17. J Biol Chem. 2004, 279(16), 16237-45. ISSN 0021-9258. 35. RITTER, B. Biochemistry. [Online] Boston University School of Medicine. [Citace: 8. 2 2014.] http://www.bumc.bu.edu/biochemistry/files/2012/05/model-CME.jpg. 36. ARIAS-MORENO, X et al. Mechanism of Low Density Lipoprotein (LDL) Release in the Endosome: Implications of the stability and Ca2+ affinity of the fifth binding module of the LDL receptor. J Biol Chem. 2008, 283(33), 22670-9. ISSN 0021-9258. 37. REN, G et al. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on CryoEM. 2010, 107(3), 1059-64. ISSN 0027-8424. 38. RAAL, FJ et al. Reduction in lipoprotein (a) with the PCSK9 monoclonal antibody evolocumab (AMG 145): a pooled analysis of over 1300 patients in 4 phase 2 trials. J Am Coll Cardiol. 2014, 1097(14), 1278-88. ISSN 0735-1097. 39. AKRAM, ON et al. Beyond LDL Cholesterol, a New Role for PCSK9. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2010, 30(7), 1279-81. ISSN 1079-5642. 40. MCKENNEY, JM et al. Safety and efficacy of a monoclonal antibody to proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 serine protease, SAR236553/REGN727, in patients with primary hypercholesterolemia receiving ongoing stable atorvastatin therapy. J Am Coll Cardiol. 2012, 59(25):2344-53. ISSN 0735-1097. 41. ČSAT. [Online] Česká společnost pro aterosklerózu. 2012 - 2014. [Citace: 9. 5 2014.] www.athero.cz. 42. WILLIAMS, RR et al. Diagnosing heterozygous familial hypercholesterolemia using new practical criteria validated by molecular genetics. Am J Cardiol. 1993, 72(2), 171-6. ISSN 0002-9149. 43. ŠAMÁNEK, M and Z URBANOVÁ. Cholesterol and triglyceride levels and their development from 2 to 17 years of age. Cas. Lek. Cesk. 1997, 136(12), 380-5. ISSN 0008-7335. 44. MiSeq sekvenátor. [Online] GeneTiCA, s.r.o. 2013 - 2014. [Citace: 20. 5 2014.] http://www.genetica.cz/pristroje/MiSeq-sekvenator#.U3vfs_l_tqU. 45. SEKAR, N and JD VELDHUIS. Involvement of Sp1 and SREBP-1a in transcriptional activation of the LDL receptor gene by insulin and LH in cultured porcine granulosa-luteal cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2004, 287(1), 128-35. ISSN 0193-1849. 46. SÜDHOF, TC et al. Three direct repeats and a TATA-like sequence are required for regulated expression of the human low density lipoprotein receptor gene. J Biol Chem. 1987, 262(22), 10773-9. ISSN 0021-9258.

52

47. FRANCOVÁ, H et al. New promoter mutations in the low-density lipoprotein receptor gene which induce familial hypercholesterolaemia phenotype: molecular and functional analysis. J Inherit Metab Dis. 2004, 27(4), 523-8. ISSN 0141-8955. 48. FLANAGAN, SE et al. Using SIFT and PolyPhen to predict loss-of-function and gain-of-function mutations. Genet Test Mol Biomarkers. 2010, 14(4):533-7. ISSN 1945-0265. 49. YUE, P et al. SNPs3D: Candidate gene and SNP selection for association studies. BMC Bioinformatics. 2006, 7, 166. ISSN 1471-2105. 50. GOLDMANN, R et al. Genomic characterization of large rearrangements of the LDLR gene in Czech patients with familial hypercholesterolemia. BMC Med Genet. 2010, 11, 115. ISSN 1471-2350. 51. GRAHAM, AC et al. Genetic screening protocol for familial hypercholesterolemia which includes splicing defects gives an improved mutation detection rate. Atherosclerosis. 2005, 182(2), 331-40. ISSN 0021-9150. 52. HUMPHRIES, SE et al. What is the clinical utility of DNA testing in patients with familial hypercholesterolaemia? Curr Opin Lipidol. 2008, 19(4), 362-8. ISSN 0957-9672. 53. ABIFADEL, M et al. Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nat Genet. 2003, 34(2), 154-6. ISSN 1061-4036. 54. TIMMS, KM et al. A mutation in PCSK9 causing autosomal-dominant hypercholesterolemia in a Utah pedigree. Hum Genet. 2004, 114(4), 349-53. ISSN 0340-6717. 55. LEREN, TP. Mutations in the PCSK9 gene in Norwegian subjects with autosomal dominant hypercholesterolemia. Clin Genet. 2004, 65(5), 419-22. ISSN 0009-9163. 56. KOREN, MJ et al. Anti-PCSK9 Monotherapy for Hypercholesterolemia - The MENDEL-2 Randomized, Controlled Phase 3 Clinical Trial of Evolocumab. J Am Coll Cardiol. 2014, 63(23), 253140. ISSN 0735-1097. 57. CHMARA, M et al. Molecular characterization of Polish patients with familial hypercholesterolemia: novel and recurrent LDLR mutations. J Appl Genet. 2010, 51(1), 95-106. ISSN 1234-1983. 58. WIDHALM, K et al. Diagnosis of families with familial hypercholesterolaemia and/or Apo B-100 defect by means of DNA analysis of LDL-receptor gene mutations. J Inherit Metab Dis. 2007, 30(2), 239-47. ISSN 0141-8955. 59. NAUCK, MS et al. Identification of recurrent and novel mutations in the LDL receptor gene in German patients with familial hypercholesterolemia. Hum Mutat. 2001, 18(2), 165-6. ISSN 10597794. 60. TICHÝ, L et al. The molecular basis of familial hypercholesterolemia in the Czech Republic: spectrum of LDLR mutations and genotype-phenotype correlations. Atherosclerosis. 2012, 223(2), 401-8. ISSN 0021-9150.

53

61. FRIEDEWALD, WT et al. Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge. Clin Chem. 1972, 18(6). 499-502. ISSN 00099147. 62. WikiSkripta. [Online] MEFANET, 2003 - 2014. [Citace: 12. 1 2014.] http://www.wikiskripta.eu/index.php?title=Ateroskler%C3%B3za&diff=next&oldid=132977. ISSN 1804-6517.

54

6 SEZNAM ZKRATEK ABCA1

ATP-binding cassette transporter 1

ADP

Adenosin difosfát

APEX

Arrayed primer extension

cDNA

Kódující DNA

CETP

Cholesteryl ester transfer protein

CM

Chylomikra

CMBGT

Centrum molekulární biologie a genové terapie

Da

Dalton

DGGE

Denaturační gradientová gelová elektroforéza

DHPLC

Vysokoúčinná denaturační kapalinová chromatografie

DNA

Deoxyribonukleová kyselina

EGF

Endothelial grow factor

FDB

Familiární defekt apolipoproteinu B100

FH

Familiární hypercholesterolémie

FSA

Family segregation analysis

GTP

Guanosin trifosfát

HA

Heteroduplexní analýza

HDL

High-density lipoprotein

HGVS

Human Genom Variation Society

hm. %

hmotnostní %

IDL

Intermediate-density lipoprotein

INSIG

insulin-induced gene

LCAT

Lecithin-cholesterol-acyl transferáza

LDL

Low density lipoprotein

LDLR

Low density lipoprotein receptor

Lp(a)

Lipoprotein (a)

LRP

Lipoprotein receptor-related protein

mRNA

messenger RNA

nm

Nanometr

55

MLPA

Multiplex ligation-dependent probe amplification

NAHR

Non-allelic homologous recombination

NGS

Sekvenování nové generace

NHEJ

Non-homologous end joining

PCR

Polymerázová řetězová reakce

PCSK9

Proprotein convertase subtilisin-kexin type 9

RFLP

Polymorfizmus délky restrikčních fragmentů

RNA

Ribonukleová kyselina

S1P

Site-1 protease

S2P

Site-2 protease

SCAP

Sterol Regulatory Element-Binding Protein

SINE

Short interspersed nuclear elements

SRE

Sterol regulatory element

SREBP

Sterol regulatory element binding protein

UTR

Nepřekládaná oblast

VLDL

Very low density lipoprotein

56

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA NÁRODNÍ CENTRUM PRO VÝZKUM BIOMOLEKUL

Recommend Documents