VERSLAG SKML, sectie ICD (Leukemie/lymfoom typering), KWALITEITSCONTROLE NAJAAR 2009
Aan de 45e rondzending namen 60 laboratoria deel. In willekeurige volgorde betrof dit de volgende instituten: Isala, Sophia, Zwolle; UMC, Utrecht; SKION, Den Haag; Streeklab Zeeland, Goes; AMC, A’dam; Leyenburg, Den Haag; UMC St Radboud, Nijmegen; Catharina ZH, Eindhoven; GZG, Den Bosch; Erasmus MC, Immunologie, R'dam; ErasmusMC, DdHK, R’dam; Meander mc, Amersfoort; Albert Schweitzer ZH, Dordrecht; CLB, A’dam; Twenteborg ZH, Almelo; St. Lucas, A'dam; AZM, Maastricht; St. Antonius, Nieuwegein; LUMC, Leiden; UZ, Leuven; KCL, Leeuwarden; AZG, Groningen; MS Twente, Enschede; Med. Centr, Alkmaar; VUmc Hematologie, A’dam; AvL, A’dam; KG Haarlem; CWZ, Nijmegen; Verbeeten Inst, Tilburg; H.Hart, Roeselaare Belgie; AZ. Zust. Barmhartigh., Ronse, Belgie; Maasland ZH, Sittard; Laurentius ZH, Roermond; Cyt. ZH, Deventer; St.Franciscus, Roosendaal; Atrium, Heerlen; St. Joseph ZH, Veldhoven; St. Franciscus, Rotterdam; AZ Middelheim, Antwerpen; AZ Stuivenberg, Antwerpen; Univ. ZH, Antwerpen; Rijnstate ZH, Arnhem; Univ. ZH, Gent; CHU St.Pierre, Brussel; AZ-VUB, Brussel; Amphia, Breda; O.L. Vrouweziekenhuis, Aalst; Virga Jesse, Hasselt; UCL, Brussel; St. Augustinus, Antwerpen; OLVG, A’dam; Slingeland, Doetinchem; Gelre, Apeldoorn; St. Jan, Brugge; AZ Groeninge; Slotervaart, A'dam; Maasstad, Rotterdam. WOORD VOORAF: 1. Verzending van de monsters: De verzending van de testmonsters wordt vanaf januari 2009 niet meer verzorgd door R. Brooimans, DDHK, maar door E. Marijt, LUMC. 2. Deadline v.w.b. terugrapportage: Met ingang van monster 5/2009 (sample 53.98.758) dient gebruik gemaakt te worden van Qbase voor de rapportage van de uitslagen door de deelnemers. Dit houdt in dat, naast een automatisering van de uitslagverwerking, de terugrapportage binnen de gestelde deadline verricht moet zijn. Indien dit niet het geval is wordt de uitslag niet in de beoordeling van de nomenclatuurcommissie (NC-cie) meegenomen en wordt de postanalytische fase met een “D” beoordeeld. Vanwege de overgang naar Qbase is in deze rondzendingsronde nog de mogelijkheid geboden om de terugrapportage op de voorheen gebruikelijke wijze te doen. De deelnemers die niet door middel van Qbase gerapporteerd hebben zullen er echter rekening mee moeten houden dat zij zo spoedig mogelijk Qbase installeren omdat in de volgende ronde alleen via die weg gerapporteerd kan worden en de dead line strikt gehanteerd zal worden. 3. Beoordeling van de resultaten: a. Niet alleen de analyse van de afwijkende populatie(s) wordt beoordeeld maar ook de evaluatie van de volledige celpopulatie waarin de afwijkende populatie zich bevindt. b. De WHO-klassificering is leidend in de beoordeling vanaf najaar 2007. De NC-cie heeft nieuwe richtlijnen gepubliceerd voor deze beoordeling die gebaseerd zijn op de WHO-klassificering 2008. De deelnemers krijgen twee maanden, na plaatsing op de website (20-10-2009), de gelegenheid commentaar te geven op deze richtlijnen. Daarna zullen de richtlijnen vigerend zijn. Deze zullen te vinden zijn op de website (www.cytometrie.nl). c. Een afwijkende populatie kan ook voor een bepaalde merker deels positief zijn. Voorheen werd een positiviteit van <20% als negatief beoordeeld. Echter subpopulaties die <20% positief zijn kunnen goed geanalyseerd worden met de moderne flowcytometers, analyse technieken en reagentia. Daarom worden de gevallen waar evident een subpopulatie van <20% aanwezig is als positief beoordeeld.
d. In principe is het resultaat van de deelnemers groep maatgevend voor de expressie van een bepaalde marker. Hierbij wordt een resultaat als foutief beoordeeld indien deze afwijkt van >2x de SD-waarde van de groep van deelnemers. e. De NCcie behoudt zich het recht voor om in specifieke gevallen van deze regels af te wijken, met duidelijke vermelding van de daarvoor gebruikte argumenten. 4. Rapportageformulier: Alle items van het rapportageformulier, behalve de fluorescentie-intensiteit, worden meegenomen in de beoordeling van de analyses. De fluorescentie intensiteit wordt echter in toenemende mate belangrijk voor de interpretatie van de flowcytometrische analyse. Daarom heeft de NC-cie aanvullende richtlijnen opgesteld voor de panels van MoAbs die minimaal toegepast dienen te worden voor het aantonen van bepaalde rijpingsstadia. Hierin zijn de intensiteiten, die gerapporteerd dienen te worden, gemerkt. Deze staan ter inzage en om commentaar te leveren gedurende twee maanden op de website (www.cytometrie.nl). Vanwege de beperkte mogelijkheid van het vermelden van de conclusie in het conclusieveld wordt bij twijfel ook de tekstuele toelichting van de conclusie meegewogen in de beoordeling. 5. Richtlijn voor de bepaling van de samenstelling van het testmonster: Er wordt beoordeeld 1. of de samenstelling totaal ±100% is, 2. of de juiste MoAbs gebruikt zijn, 3. of de percentages van de subpopulaties juist zijn en 4. of de normale en afwijkende populaties juist zijn weergegeven. Dit geschiedt aan de hand van de richtlijnen van de NC-cie (zie www.cytometrie.nl). Omdat in Qbase een pop-up menu met beperkte keuze mogelijkheden gegeven is, is de optie “anders” niet fout gerekend omdat door de beperking een uitgebreidere typering allen met “anders” gerapporteerd kon worden. 6. Richtlijn voor de bepaling van de afwijkende celpopulatie(s) in het testmonster: De panels van MoAbs die minimaal toegepast dienen te worden voor het aantonen van bepaalde rijpingsstadia (zie www.Cytometrie.nl) worden bij de beoordeling als leidraad gehanteerd. 7. Richtlijn voor de Conclusie en het Scoringssysteem: Het “SIHON” scoringssysteem (zie www.Cytometrie.nl) omvat de pre-analytische, analytische en post-analytische fase. Bij 1 of 2 afwijkingen worden de pre-analytische en analytische fase met een “B” beoordeeld en bij meer dan 2 afwijkingen met een “C”. In de beoordeling van de postanalytische fase moet de conclusie gefundeerd zijn. In die gevallen waarin de deelnemer duidelijk op onjuiste gronden een conclusie gegeven heeft wordt dit fout gerekend. De NC-cie hanteert een extra categorie in de post-analytische fase. Wanneer een deelnemer wel rondzendingsmateriaal heeft ontvangen maar geen resultaten rapporteert, wordt een D-score toegekend. 8. Nabespreking van de resultaten van de rondzendingen: De SKML sectie ICD heeft de met ingang van 30 juni 2007 geïntroduceerde vorm van de nabesprekingen van de rondzendingen geïntroduceerd wederom aangepast. Voor een optimale en interactieve participatie van de deelnemers worden een aantal specifieke probleemstellingen, die geformuleerd bij de beoordeling van de rondzendingen of die van algemene aard (6 vragen) zijn, nu in een negental groepen ter discussie gesteld voorafgaande aan de uitreiking van de resultaten van de rondzendingen. Iedere groep heeft één algemene vraag en de vragen over één of meerdere cases voorgelegd gekregen. Omdat de deelnemers tijdens deze discussie nog niet bekend zijn met de resultaten van de rondzendingen is eveneens additionele informatie over de rondzendingen uitgereikt. Voor de discussie op 17 november j.l. heeft de NC-cie de volgende onderwerpen opgesteld:
Discussiepunten voor Nabespreking SKML sectie ICD Leukemie/lymfoom rondzending, najaar 2009 ALGEMEEN 1. Dienen de niet-verplichte markers buiten de beoordeling gehouden te worden? 2. In Qbase is een keuzemenu van de MoAbs voor de samenstelling gegeven. Is “anders” in de samenstelling fout omdat de juiste mogelijkheden volgens de NCcie gegeven zijn in het pop-up menu? 3. Wanneer moet een uitslag van een marker als heterogeen beoordeeld worden? 4. Bent U akkoord met het invullen van naam en deelnemers nummer op de rapportage? 5. Wat vindt U van het achtereenvolgend rondzenden van een aantal verschillende T-celmaligniteiten? 6. Wat vind U in het algemeen van de rapportage in Qbase? Discussiepunten casus 1: sample 53.97829 1. De variatie in het percentage afwijkende cellen is groot. Waarom? 2. Conclusie is B-NHL (FCL). Moet alleen FCL fout gerekend worden vanwege een de pathologie? 3. Moet de conclusie MCL met CD5- met C beoordeeld worden? 4. Waarom scoren veel deelnemers CD10, CD22, CD38 negatief? 5. Waarom is CD23 zo heterogeen verdeeld in de groep? 6. Zijn er additionele (verplicht te benoemen) markers voor het karakteriseren van de B-NHL (FCL)? Discussiepunten casus 2: sample 53.98606 1. Er is hier sprake van een secundaire AML ontstaan uit een MPD. Is de conclusie AML M0 dan gerechtigd? 2. Waarom hebben veel deelnemers positiviteit voor CD4 gevonden? 3. Waarom is de expressie van TdT en MPO zo wisselend binnen de groep? Kloon, techniek, gating? Discussiepunten casus 3: sample 53.98758 1. Zijn er normale T-cellen aantoonbaar? Zo ja, hoe? 2. Moet vermelden van de afwijkende populatie bij de T-cellen fout gerekend worden? 3. In de voorgeschiedenis komt een cutaan T-lymfoom voor. Is hier nu sprake van een lymfocytose of van een TNHL? SPLTL? 4. Er is sprake van een gat in het Vbeta panel, dus clonaliteit is niet aantoonbaar. Mag er dan T-NHL geconcludeerd worden? 5. Waarom is reactief onjuist? 6. Waarom is de expressie van CD38, HLA-DR en TCRab wisselend binnen de groep? 7. Is het correct dat cyCD3 negatief bevonden wordt? Discussiepunten casus 4: sample 53.98872 1. Moet de CD34- en CD1a-uitslag positief met < 20% fout gerekend worden? 2. Hoeveel % normale T-cellen waren er aanwezig in het sample en hadden deze weergegeven moeten worden? 3. CD8 en TdT waren zwak positief. Is het rapporteren “negatief” een gatingfout, een technische fout of een clone verschil? 4. Moet de conclusie rijp T maligniteit met CD1+ en TdT+ met een C beoordeeld worden? 5. Moet de conclusie rijp T maligniteit met CD1- en TdT- met een B beoordeeld worden? 5. Is een C-score bij T-PLL terecht? 6. Is cyCD3 negatief ten onrechte met “B” beoordeeld?
Toelichting bij de vragen Sample: 53.97829 / 2009-3 Vrouw, naar huisarts met lichte lymfadenopathie in hals, liezen en oksel. In enkele weken ontstaan. Lichte lymfocytose. Daarom naar internist gestuurd. WBC 15,5 x 109/L; Hb 7,7 mmol/L; Thrombo 143 x 109/L; Neutro 35%; Lymfo 62%; Mono 2%; Eosinofielen 0% ; basofielen 1%. - Typering: CD10+, CD11c-, CD19+, CD20+, CD22+, CD23+, CD25-, CD38+, CD45+/SS-, CD103-, FMC7+, lambda+, IgM+, IgD+, HLA-DR+. - Conclusie: B-NHL (FCL). - Afwijkende cellen: 43 ±11. - Heterogene markers: CD23 en IgD. Sample: 53.98606 / 2009.4 Man, bekend met myeloproliferatieve ziekte, t(5,12)+. Hiervoor behandeld met Imatinib sinds 2 jaar. Bij poli-controle dalend aantal leuko’s met onrijpe cellen. Geen klachten en geen lichamelijke afwijkingen te vinden. WBC 12,4 x 109/L; Hb 8,2 mmol/L; Thrombo 90 x 109/L; Neutro 3%; Lymfo 12%; Mono 14%; Eosinofielen 0%; overige 69%
- Typering: CD4-, CD7-, CD11b-, CD11c+, CD13+, CD14-, CD15-, CD16-, CD19-, CD33+, CD34+, CD41/61-, CD45+/SS-, CD56-, CD235a-, HLA-DR+, MPO-. - Conclusie: myeloproliferatief proces: AML. - CD4 is negatief. 17 deelnemers rapporteren positief. - TdT: 11x positief gerapporteerd, 25x negatief. - MPO: 21 x positief, 37x negatief. Sample: 53.98758 / 2009.5 Man, 20 jaar, bij internist op bezoek. Vanaf 4de jaar bekend met bultjes op de huid. In 2007 diagnose cutaan lymfoom. Hiervoor behandeld met PUVA en licht met goed, tijdelijk effect. I.v.m. progessieve huidafwijkingen verwezen naar de internist met de vraag of er indicatie is voor chemotherapie. - Typering: CD1-, CD2+, CD3+, CD4-, CD5+, CD7+, CD8+, CD16-, CD25+, CD45+/SS-, CD56-, CD57-, TCRαβ+, TdT-, HLA-DR+. - Conclusie: T-NHL. - % T-cellen zijn variabel door rapportage van normale T-cellen en/of afwijkende T-cellen. - Vbeta is niet aantoonbaar: Vbeta gat in het panel. - CD38 negatief (7 deelnmrs); TCRab negatief (12 deelnmrs); HLA-DR negatief (13 deelnmrs). - cCD3 is bij een aantal deelnemers negatief terwijl CD3 positief is. Sample: 53.98872 / 2009.6 Man, sinds enkele weken last van maliase. 4kg gewichtsverlies. Sinds een week botpijn in bovenbeen. Lichamelijk onderzoek toont enkele vergrote lymfklieren in hals. X-thorax toont verbreed mediastium. Leukocytose en een trombopenie. LDH 1700 U/L. WBC 27 x 109/L; Hb 7,3 mmol/L; Thrombo 47 x 109/L; Neutro 8%; Lymfo 7%; Mono spd; 85% overige cellen; 3% eryblasten. - Typering: CD1+, CD2+, CD3+, CD4+, CD5+, CD7+, CD8+, CD34-, CD45+/SS-, CD117-, HLA-DR-, TdT+ CD45+/SS-. - CD1: Naast 100% en 0% bij velen deels positief (<20%). Mediaan is 30%. - samenstelling: T-cellen: normale en afwijkende cellen weergegeven. - Indien sCD3 positief dan is ook cyCD3 positief. Enkele deelnmrs geven cyCD3 negatief.
METHODIEK VAN BEPALINGEN / SAMENSTELLING VAN DE GEHELE POPULATIE IN HET MONSTER: De volgende analyse data worden gevraagd weer te geven op het formulier: 1. De wijze van voorbewerking en methode waarmee de analyses uitgevoerd zijn. 2. De relatieve omvang van de aanwezige normale subpopulaties. Blasten en plasmacellen hoeven alleen te worden vermeld indien het percentage groter is dan 1%. Indien een afwijkende populatie aantoonbaar is dient deze te worden vermeld. Een afwijkende populatie in de vorm van blasten, dient vermeld te worden onder “blasten”. Wanneer er geen sprake is van blasten dan dient de afwijkende populatie in de rubriek “overige cellen” weergegeven te worden. De totale immunologische differentiatie moet nl. 100% zijn. 3. De cellijn waarin de afwijkende populatie zich bevindt als ook het percentage afwijkende cellen. Het vermelden van de gating procedure is niet beoordeeld. Het niet of foutief melden van de afwijkende cellijn of een sterk afwijkend percentage van de afwijkende celpopulatie resulteert in een B-score in de analytische fase. 4. De afwijkende populatie moet gekarakteriseerd worden door middel van alle voor de afwijking belangrijke merkers waarbij minimaal de “SIHON MoAb panels” ingezet dienen te zijn. Afwijkingen in de percentages van positieve cellen worden beoordeeld t.o.v. de mediaan van de deelnemersgroep (>2x SD). 5. De conclusie van de analyse dient verslagen te worden door een korte, eenduidige beschrijving in 16 karakters al dan niet vergezeld van een bondige omschrijving van bevindingen. In Qbase wordt tevens wordt gevraagd om van de gebruikte MoAbs ook de kloonnaam en de fluorochroom te vermelden zodat eventuele verschillen in expressie of positiviteit hieraan gerelateerd kunnen worden. Daarnaast kan in de toekomst een overzicht gegeven worden van de verschillende klonen en hun werkzaamheid.
Resultaten van de groepsdiscussies betreffende de algemene vragen: 1.
2.
3. 4.
5. 6.
Dienen de niet-verplichte markers buiten de beoordeling gehouden te worden? Groep A-B-C Antwoord: Twee van de drie groepen vinden dat de niet-verplichte markers wel beoordeeld moeten worden. Op deze wijze vindt een controle plaats van niet alleen de verplichte maar van alle markers. Dit is van educatief belang voor de deelnemers. In Qbase is een keuzemenu van de MoAbs voor de samenstelling gegeven. Is “anders” in de samenstelling fout omdat de juiste mogelijkheden volgens de NCcie gegeven zijn in het pop-up menu? Groep D-E-F Antwoord: Niet fout rekenen. Er dient een extra veld opgenomen te worden in Qbase om “anders” te kunnen definiëren. Wanneer moet een uitslag van een marker als heterogeen beoordeeld worden? Groep G-H-I Antwoord: Indien >10% van de deelnemers een afwijkende waarde rapporteert. Bent U akkoord met het invullen van naam en deelnemers nummer op de rapportage? Groep A-B-C Antwoord: Alleen akkoord met rapportage van “naam van instituut”; niet met rapportage van deelnemersnummer omdat dit ook gekoppeld is aan rapportages van andere rondzendingen. Deze gegevens mogen nooit in de openbaarheid komen. Wat vindt U van het achtereenvolgend rondzenden van een aantal verschillende T-celmaligniteiten? Groep D-EF Antwoord: Geen probleem, goed om ervaring op te doen. Wat vind U in het algemeen van de rapportage in Qbase? Groep G-H-I Antwoord: Het is goed dat het minimale panel is aangegeven. De expressiepatronen kunnen niet weer gegeven worden. Er dient een extra veld opgenomen te worden in Qbase om “anders” te kunnen definiëren. De handleiding wordt als ontoereikend beschouwd.
CASESBESPREKING: Score-systeem en resultaatoverzichten: Van de 60 deelnemers hebben respectievelijk 60, 60, 59 en 57 de vier achtereenvolgende rondzendingen teruggerapporteerd. De vier cases zijn beoordeeld door de NC-cie aan de hand van de gerapporteerde data van de deelnemers. De ontbrekende en afwijkende MoAbs, etc. zijn gemerkt. De score van de drie fasen van ieder testmonster komt tot stand door het middelen van de beoordeling van telkens 6 panelleden van de NC-cie per casus (C. Homburg, E. Marijt, A. Mulder, P. De Schouwer en F. Preijers, V. van der Velden) en door onderlinge afstemming van de resultaten van de individuele NC-cie-leden. Daarnaast vindt naar aanleiding van de opmerkingen en discussies tijdens de nabespreking en schriftelijke opmerkingen van deelnemers hierna, een heroverweging plaats. Naar aanleiding van deze discussie zijn de resultaatoverzichten, zoals gepresenteerd tijdens de SKMLvergadering van 17 november 2009, bijgesteld. Introductie Achtereenvolgens zijn vier verse ongestabiliseerde bloedmonsters rondgestuurd, een in het voorjaar 2009 en drie in het najaar. Het aantal A-scores voor de conclusie (post-analytische fase) was redelijk (resp. 72%, 95%, 68% en 82%). De eerste patiënt (vrouw) ging naar de huisarts met lichte lymfadenopathie in hals, liezen en oksel. Deze was in enkele weken ontstaan. Haar bloed toonde een lichte lymfocytose, waardoor de huisarts haar naar de internist gestuurde. De vraagstelling was “is er sprake van een lymfatische maligniteit”. Deze patiënt bleek een B-NHL (FCL) te hebben. Van de deelnemers gaf 72% deze conclusie. De tweede patiënt (man) was reeds bekend met myeloproliferatieve ziekte, t(5,12)+. Hiervoor werd hij sinds 2 jaar behandeld met Imatinib (Glivec). Bij een poli-controle werd een dalend aantal leukocyten met onrijpe cellen gevonden. Hij had geen klachten en er waren geen lichamelijke afwijkingen te vinden. De vraagstelling was “is er een transformatie naar leukemie en, zo ja, is deze myeloid of lymfoid”. De patiënt bleek een secundaire AML te hebben. Deze conclusie werd door 95% van de deelnemers gegeven.
De derde patiënt (man, 20 jaar) kwam bij de internist op bezoek. Hij was vanaf zijn 4de jaar bekend met bultjes op de huid. In 2007 werd de diagnose cutaan lymfoom gesteld. Hiervoor werd hij behandeld met PUVA en licht met goed, maar tijdelijk effect. In verband met progessieve huidafwijkingen werd hij daarom doorverwezen naar de internist met de vraag of er indicatie was voor chemotherapie. De vraagstelling was “zijn er maligne cellen aantoonbaar, en, zo ja, wat is de diagnose”. De patiënt bleek een T-NHL te hebben. Deze conclusie werd door 68% van de deelnemers gegeven. De vierde patiënt (man) had sinds enkele weken last van malaise met 4 kg gewichtsverlies. Sinds een week had hij ook botpijn in bovenbeen. Lichamelijk onderzoek toonde enkele vergrote lymfklieren in hals. X-thorax toonde een verbreed mediastium. De vraagstelling was “is er sprake van een acute leukemie”. De patiënt bleek een T-ALL te hebben. Deze conclusie werd door 82% van de deelnemers gegeven.
Patient 1: Sample 53.97829 / 2009.3 (60 deelnemers) De eerste patiënt (vrouw) ging naar de huisarts met lichte lymfadenopathie in hals, liezen en oksel. Deze was in enkele weken ontstaan. Bloed toonde een lichte lymfocytose, waardoor de huisarts haar naar de internist gestuurde. De bloedwaarden waren: WBC 15,5x109/L en Hb 7,7 mmol/L, het thrombocytenaantal 143x109/L. In de morfologische differentiatie werden 35% neutrofielen, 2% monocyten, 62% lymfocyten en 0% eosinofielen aangetroffen. De vraagstelling was “is er sprake van een lymfatische maligniteit”. Deze patiënt bleek een B-NHL (FCL) te hebben. Van de deelnemers gaf 72% deze conclusie. Samenstelling populatie: De B-NHL vormde mediaan 43% (spreiding binnen de deelnemers: 20-59%) van de totale celpopulatie. Indien de afwijking van de mediaan van ≥2 SD was, resulteert dit in een B-score in de analytische fase. De spreiding in de verschillende cellijnen in de immunologische differentiatie was relatief gering. T 5
B 40
NK 1
Mono 3
Myelo 43
Blast 0
Totaal ±100
Tabel 1: Immunologische differentiatie per cellijn weergegeven als mediaan van de groep deelnemers in %. Toelichting bij score-beoordeling Patiënt 1. Pre-analytische fase: Resultaat: A=82%, B=13%, C=5% (20% van de deelnemers heeft een B- of C-score!) Voor het beantwoorden van de vraagstelling is het noodzakelijk dat alle merkers uit het “minimale panel van MoAbs” voor het analyseren van rijpe B-cellen bepaald zijn. Er ontbreken weinig verplichte markers. Bij het ontbreken van 1 of 2 merkers resulteert dit in een B-score, bij meer dan 2 in een C-score. Analytische fase: Resultaat: A=42%, B=52%, C=7% (58% van de deelnemers heeft een B- of een C-score!) De typering was als volgt: CD10+, CD11c-, CD19+, CD20+, CD22+, CD23+, CD25-, CD38+, CD45+/SS-, CD103-, FMC7+, lambda+, IgM+, IgD+, HLA-DR+.
Bij afwijkingen in 1 of 2 merkers krijgt men een “B”, bij meer dan 2 een “C”. De expressie van CD10 (8 deelnemers), CD22 (7 deelnemers), CD38 (16 deelnemers), IgM (5 deelnemers) en FMC7 (5 deelnemers) is vaak fout geanalyseerd. CD23 en IgD zijn heterogeen verdeeld binnen de groep. Post-analytische fase: Resultaat: A=72%, B=28%, C=0% De juiste conclusie moet volgens de NC-cie zijn: B-NHL (FCL) (mediaan 43%). FCL (CD10+) heeft, hoewel in de groepsdiscussies naar voren kwam dat dit met een B beoordeeld zou moeten worden, van de NC-cie toch een A-score gekregen. B-NHL is te vaag en is met een Bscore beoordeeld. MCL, dat volgens een deel van de groepsdiscussies zelfs met een C beoordeeld zou moeten worden vanwege de klinische consequenties, heeft een B-score gekregen. Monoclonale B-lymfocytose is te vaag en kreeg een B. Resultaten van de groepsdiscussies betreffende casus 1: 1.
2. 3. 4. 5. 6.
De variatie in het percentage afwijkende cellen is groot. Waarom? Antwoord: De variatie wordt veroorzaakt door een zwakke CD19 expressie en als zodanig ontstaat er een groter verschil in de gating tussen de deelnemers. DE afwijkende populatie kon beter op basis van CD20 vastgesteld worden. Conclusie is B-NHL (FCL). Moet alleen FCL fout gerekend worden vanwege een de pathologie? Antwoord: De meerderheid van de deelnemers vindt dat alleen FCL met een B beoordeeld moet worden. Moet de conclusie MCL met CD5- met C beoordeeld worden? Antwoord: MCL dient met “B” beoordeeld te worden, ook als CD10 positief gerapporteerd wordt. Daarnaast vindt de andere groep dat de conclusie MCL een C verdiend. Waarom scoren veel deelnemers CD10, CD22, CD38 negatief? Antwoord: Dit lijkt afhankelijk te zijn van kloon en fluorochroom. Waarom is CD23 zo heterogeen verdeeld in de groep? Antwoord: CD23 komt zwak tot expressie op een deel van de populatie. Hierdoor ontstaat er een groter verschil in de gating tussen de deelnemers. Zijn er additionele (verplicht te benoemen) markers voor het karakteriseren van de B-NHL (FCL)? Antwoord: Er zijn geen essentiële additionele markers naar voren gekomen. Een enkeling neemt BCL2 mee.
Patient 2: Sample: 53.98606 / 2009.4 (60 deelnemers) Het tweede testmonster (bloed) was vers en ongestabiliseerd. Het was afkomstig van een man, leeftijd onbekend, die reeds bekend was met myeloproliferatieve ziekte met een t(5,12). Hiervoor werd hij sinds 2 jaar behandeld met Imatinib (Glevec). Bij een poli-controle werd een dalend aantal leukocyten met onrijpe cellen gevonden. Hij had geen klachten en er waren geen lichamelijke afwijkingen te vinden. De leukocyten waren 12,4x109/L en het Hb 8,2 mmol/L. De thrombocyten waren 90x109/L. De morfologische differentiatie was: neutrofielen 3%, lymfocyten 12%, monocyten 14% en overige cellen 6%. De vraagstelling was “is er een transformatie naar leukemie en, zo ja, is deze myeloid of lymfoid”. De patiënt bleek een secundaire AML te hebben. Deze conclusie werd door 95% van de deelnemers gegeven. Er werden geen D-scores gegeven. Samenstelling populatie: De spreidingen binnen de meeste populaties is relatief laag. De afwijkende populatie omvat mediaan 60% (spreiding 34-76%) van de totale populatie. Afwijkingen van de mediaan van ≥ 2x SD (1 deelnemer) zijn fout gerekend resulterend in een Bscore in de analytische fase. T-cel
B-cel
NK-cel
Plasmacel
Monocyt
Myeloid
Overig
Totaal
10
2
1
0
11
13
60
±100
Tabel 2: Medianen van de verschillende populaties in procenten. Toelichting bij score-beoordeling Patiënt 2. Pre-analytische fase: Resultaat: A=63%, B=25%, C=12% Voor het beantwoorden van de vraagstelling is het noodzakelijk dat alle merkers voor het analyseren van AML bepaald zijn. Bij het ontbreken van 1 of 2 van de overige merkers resulteert dit in een B-score, bij meer dan 2 in een C-score. Bij afwezigheid van een MoAb in de immunologische dif of in de typering van de afwijkende populatie resulteert dit in een B-score. Vaak ontbrekende merkers, die een B-score opleveren, zijn CD16 (5x), CD36 (8x), CD45 (4x), CD41/61 (7x), CD235a (6x) en HLA-DR (4x). Analytische fase: Resultaat: A=45%, B=50%, C=5% De spreiding van percentages van subpopulaties in de immunologische differentiatie is relatief laag. Er zijn dan ook in deze categorie weinig B-scores uitgedeeld. De meeste fouten zijn gemaakt in de categorie “T-cellen” en “Myeloid”. Een afwijking van meer dan 2x SD is fout gerekend. Het fenotype van de afwijkende populatie is als volgt: CD4-, CD7-, CD11b-, CD11c+, CD13+, CD14-, CD15-, CD16-, CD19-, CD33+, CD34+, CD41/61-, CD45+/SS-, CD56-, CD235a-, HLA-DR+, MPO-. CD24, MPO en TdT zijn heterogeen verdeeld binnen de groep en daarom niet beoordeeld. MPO heeft echter een mediaan van 0% en lijkt dus als negatief beschouwd te moeten worden. CD4 (17 deelnemers) en CD11c (7 deelnemers) bleken frequent fout geanalyseerd te zijn. Post-analytische fase: Resultaat: A=95%, B=5%, C=0% (slechts 5% van de deelnemers heeft een B-score en geen deelnemer heeft een C-score!) Als juiste conclusie is beoordeeld een secundaire AML. Er is geen uitrijping geconstateerd. AML M0, AML NOS en AML (transformatie) zijn beoordeeld met een A-score. AML met uitrijping en AML, MDS gerelateerd zijn beoordeeld met een B-score. De conclusie myeloide blastencrise/MPD heeft ook een B-score gekregen. Resultaten van de groepsdiscussies betreffende casus 2: 1. 2. 3.
Er is hier sprake van een secundaire AML ontstaan uit een MPD. Is de conclusie AML M0 dan gerechtigd? Antwoord: Hier is sprake van een secundaire AML. Het fenotype kan passen bij een AML M0. Waarom hebben veel deelnemers positiviteit voor CD4 gevonden? Antwoord: De expressie van CD4 was in geval van positiviteit zeer zwak. Daarom zal de afgrenzing van de gating de oorzaak zijn van een positieve rapportage. De CD4 leek enigszins aspecifiek te reageren. Waarom is de expressie van TdT en MPO zo wisselend binnen de groep? Kloon, techniek, gating? Antwoord: Bepaling van TdT blijft een lastige bepaling waardoor een groot aantal deelnemers deze marker negatief rapporteren. Het verschil lijkt niet veroorzaakt te worden door kloon of fluorochroom verschillen. De gating, veelal op basis van de granulocyten die aspecifiek reageren, kan de oorzaak zijn dat TdT negatief gerapporteerd wordt.
Patient 3: Sample 53.98758 / 2009.5 (59 deelnemers) Voor de rapportage van deze casus is voor het eerst gebruik gemaakt van Qbase. Indien er problemen waren met downloaden van of rapportage in Qbase dan is een rapportage op de oude wijze ook geaccepteerd. De derde patiënt was een man van 20 jaar die bij internist op een controle bezoek ging. Vanaf zijn 4de jaar was hij bekend met bultjes op de huid. In 2007 is de diagnose cutaan lymfoom gesteld. Hiervoor is hij behandeld met PUVA en licht met een goed, maar tijdelijk effect. In verband met
progessieve huidafwijkingen werd hij verwezen naar de internist met de vraag of er een indicatie was voor chemotherapie. De bloedwaarden waren onbekend. De vraagstelling was “zijn er maligne cellen aantoonbaar en, zo ja, wat is de diagnose”. Deze patiënt bleek een T-NHL te hebben. Daarnaast is CD8-lymfocytose ook goed gerekend. Van de deelnemers gaf 68% deze conclusie. Er werd 1 D-score gegeven. Samenstelling populatie: De T-NHL vormde mediaan 43% (spreiding 10-76%) van de totale celpopulatie. Indien de afwijking van de mediaan ≥2 SD was, resulteert dit in een B-score in de analytische fase. Er was een grote spreiding binnen de T-cellen doordat de afwijkende populatie door een groot aantal deelnemers vermeld werd bij de normale T-cellen. Deze afwijkende populatie behoort echter bij “Overige” gemeld te worden (niet fout beoordeeld). T 49
B 3
NK 1
Mono 8
Myelo 33
Blast 0
Totaal ±100
Tabel 1: Immunologische differentiatie per cellijn weergegeven als mediaan van de groep deelnemers in %. Toelichting bij score-beoordeling Patiënt 3. Pre-analytische fase: Resultaat: A=73%, B=17%, C=18% Voor het beantwoorden van de vraagstelling is het noodzakelijk dat alle merkers uit het “minimale panel van MoAbs” voor het analyseren van rijpe T-cellen bepaald zijn. CD1 (6x), CD57 (9x) en TdT (6x) ontbreken relatief vaak binnen de groep van deelnemers. Bij het ontbreken van 1 of 2 merkers resulteert dit in een B-score, bij meer dan 2 in een C-score. Analytische fase: Resultaat: A=42%, B=55%, C=2%! De typering was als volgt: CD1-, CD2+, CD3+, CD4-, CD5+, CD7+, CD8+, CD16-, CD25+, CD45+/SS-, CD56-, CD57-, TCRαβ+, TdT-, HLA-DR+. Met het panel van anti-Vbeta markers, die flowcytometrisch bepaald kunnen worden, kan niet het gehele spectrum gedekt worden. In de bepaling van de Vbeta’s van deze patiënt is een gat aanwezig door de expressie van een specifieke TCR-Vbeta waarvoor de MoAbs ontbreken. Frequent foute analyses betroffen CD38 (7 deelnemers), TCRab (12 deelnemers) en HLA-DR (13 deelnemers). Bij afwijkingen in 1 of 2 merkers krijgt men een “B”, bij meer dan 2 een “C”. Post-analytische fase: Resultaat: A=68%, B=23%, C=7%, D=2%. De juiste conclusie moet volgens de NC-cie op basis van de immuunfenotypering zijn: T-NHL (mediaan 68%). Drie deelnemers concludeerden aanvullend “SPTCL (subcutaan panniculitis-like T-cellymfoom). De typering van deze casus past hier zeer goed bij. ATLL (CD7- en CD4+) en clonale T-cellen zijn met een B-score beoordeeld. Reactief en virale infectie resulteren in een C-score. Resultaten van de groepsdiscussies betreffende casus 3: 1.
Zijn er normale T-cellen aantoonbaar? Zo ja, hoe?
2. 3.
4. 5. 6. 7.
Antwoord: Er zijn normale T-cellen aantoonbaar. Dit is d.m.v. verschil in TCRab, CD4 en CD8 expressies aantoonbaar. Moet vermelden van de afwijkende populatie bij de T-cellen fout gerekend worden? Antwoord: Dit is fout en in het vervolg in de beoordeling meenemen. De afwijkende populatie moet in het veld “overige” ingevuld worden. In de voorgeschiedenis komt een cutane T-lymfoom voor. Is hier nu sprake van een lymfocytose of van een TNHL? SPLTL? Antwoord: Kliniek en typering past bij T-NHL met een aanwijzing naar SPLTL (CD25+, CD4-, CD8+. Echter met de IFT mag deze subtypering niet geconcludeerd worden. Er is sprake van een gat in het Vbeta panel, dus clonaliteit is niet aantoonbaar. Mag er dan T-NHL geconcludeerd worden? Antwoord: Ja, T-NHL mag geconcludeerd worden. Het Vbeta gat is verdacht voor T-NHL. Waarom is reactief onjuist? Antwoord: CD57 is negatief, HLA-DR is zwakker dan normaal. De afwezigheid van polyclonaliteit is niet compatibel met de conclusie “reactief”. Waarom is de expressie van CD38, HLA-DR en TCRab wisselend binnen de groep? Antwoord: CD38 en HLA-DR zijn heterogeen verdeeld. TCRab is zwak en door de afgrenzing van de gate wisselend in percentages. Is het correct dat cyCD3 negatief bevonden wordt? Antwoord: Nee, cyCD3 is altijd positief als sCD3 positief is. Daarom is cyCD3 geen verplichte marker als sCD3 positief is.
Patient 4: Sample 53.98872 / 2009.6 (57 deelnemers) De vierde patiënt (man) had sinds enkele weken last van malaise met 4 kg gewichtsverlies. Sinds een week had hij ook botpijn in bovenbeen. Lichamelijk onderzoek toonde enkele vergrote lymfklieren in hals. X-thorax toonde een verbreed mediastium. De patiënt had een leukocytose en een thrombopenie. het LDH was 1700 U/L. De bloedwaarden waren: WBC 27x109/L en Hb 7,3 mmol/L, het thrombocytenaantal 47x109/L. In de morfologische differentiatie werden 8% neutrofielen, 0% monocyten, 7% lymfocyten en overige cellen 85% aangetroffen. De vraagstelling was “wat is de oorzaak van de lymfocytose”. Deze patiënt bleek een T-ALL te hebben. Van de deelnemers gaf 82% deze conclusie. Er werden 3 D-scores gegeven. Samenstelling populatie: De T-ALL vormde mediaan 79% (SD:14%) van de totale celpopulatie. Indien de afwijking van de mediaan ≥2 SD was, resulteert dit in een B-score in de analytische fase (5 deelnemers). Er was een grote spreiding binnen de afwijkende populatie (32-86%). Door een groot aantal deelnemers werd de afwijkende populatie cellen vermeld bij de normale T-cellen. Deze afwijkende populatie behoort echter bij “Overige” gemeld te worden (niet fout beoordeeld). T 67
B 0
NK 1
Mono 1
Myelo 13
Blast 0
Totaal ±100
Tabel 1: Immunologische differentiatie per cellijn weergegeven als mediaan van de groep deelnemers in %. Toelichting bij score-beoordeling Patiënt 4. Pre-analytische fase: Resultaat: A=67%, B=25%, C=3% Voor het beantwoorden van de vraagstelling is het noodzakelijk dat alle merkers uit het “minimale panel van MoAbs” voor het analyseren van onrijpe T-cellen bepaald zijn. CD34 (5x) en CD117
(6x) ontbreken relatief vaak binnen de groep van deelnemers. Bij het ontbreken van 1 of 2 merkers resulteert dit in een B-score, bij meer dan 2 in een C-score. Analytische fase: Resultaat: A=43%, B=50%, C=2%! De typering was als volgt: CD1+, CD2+, CD3+, CD4+, CD5+, CD7+, CD8+, CD34-, CD45+/SS-, CD117-, HLA-DR-, TdT+ CD45+/SS-. De frequent fout geanalyseerde markers zijn CD8 (7x), CD34 94x), TCRab (5x), cCD3 (8x) en TdT (8x). Bij afwijkingen in 1 of 2 merkers krijgt men een “B”, bij meer dan 2 een “C”. CD1 en CD10 zijn heterogeen verdeeld binnen de groep en zijn daarom niet beoordeeld. De mediaan voor het percentage positieve cellen voor CD1 in de groep is echter 30%. Dit is suggestief voor een positiviteit van CD1 op minimaal een deel van de cellen van de afwijkende populatie. Post-analytische fase: Resultaat: A=82%, B=3%, C=10%, D= 5%. De juiste conclusie moet volgens de NC-cie op basis van de immuunfenotypering zijn: T-ALL (mediaan 79%). Precursor T-NHL (te vaag) is met een B-score beoordeeld en T-PLL en T-NHL resulteren in een C-score. Resultaten van de groepsdiscussies betreffende casus 4: 1.
2. 3. 4. 5. 6. 7.
Moet de CD34- en CD1a-uitslag positief met < 20% fout gerekend worden? Antwoord: In het monster bleek 1% onrijp myeloid aanwezig te zijn. De maligne populatie was CD34 negatief. Voorstel: Indien de populatie bijvoorbeeld 15% sterk positief is dient dit gerapporteerd te worden als zodanig. Indien bijvoorbeeld 4% zwak positief is dient dit als negatief beschouwd te worden. Per marker kan dit variëren. Dit betekent dat de NCcie dit dient te beoordelen. Hoeveel % normale T-cellen waren er aanwezig in het sample en hadden deze weergegeven moeten worden? Antwoord: Er waren ±1% normale T-cellen aanwezig. Het belang van rapporteren hiervan is discutabel. CD8 en TdT waren zwak positief. Is het rapporteren “negatief” een gating fout, een technische fout of een kloon verschil? Antwoord: CD8 en TdT rapporteren als negatief is fout. Dit wordt veroorzaakt door de gating. Moet de conclusie rijp T maligniteit met CD1+ en TdT+ met een C beoordeeld worden? Antwoord: Het klinisch beloop is zeer ongunstig. Daarom moeten deze fouten met een C beoordeeld worden. Moet de conclusie rijp T maligniteit met CD1- en TdT- met een B beoordeeld worden? Antwoord: Door een analytische fout zal een verkeerde conclusie volgen. Dit zal klinische consequenties hebben. Het voorstel is om een aparte catagorie hiervoor in te lassen. Is een C-score bij T-PLL terecht? Antwoord: Ja Is cyCD3 negatief ten onrechte met “B” beoordeeld? Antwoord: CyCD3 is positief bij een sCD3 expressie. Dit betekent dat bij een negatieve rapportage van cyCD3 in dat geval een “B” score gegeven dient te worden. De deelnemers menen dat er sprake is van een spraakverwarring v.w.b. de positiviteit van cyCD3.
Samenvatting: Casus1 pre A 49 B 8 C 3 %A %B %C
82 13 5
ana 25 31 4
post 43 17 0
Casus 2 pre 38 15 7
ana 27 30 3
post 57 3 0
Casus 3 pre 44 10 5
ana 25 33 1
post 41 14 4
Casus 4 pre 40 15 2
ana 26 30 1
post 49 2 6
42 52 7
72 28 0
63 25 12
45 50 5
95 5 0
73 17 8
42 55 2
68 23 7
67 25 3
43 50 2
82 3 10
Namens de nomenclatuurcommissie van de SKML sectie Immunologische Celdiagnostiek (leukemie/lymfoom typering), Dr. Frank Preijers, Radboud Universiteit Nijmegen Medisch Centrum, December 2009.
Referenties: 1. Kluin-Nelemans JC, van Wering ER, van der Schoot CE, Adriaansen HJ, van ’t Veer MB, van Dongen JJM and Gratama JW on behalf of the Dutch Co-operative Study Group on Immunophenotyping of Haematological Malignancies (SIHON). SIHONSCORE: a scoring system for external quality control of leukaemia/lymphoma immunophenotyping measuring all analytical phases of laboratory performance. Br. J. Haemaol. 2001: 112, 337-343. 2. WHO Classification of Tumours: Pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. Ed by Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW. IARC Press, Lyon 2001. 3. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues, Fourth Edition. Volume 2. Ed by Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe ES, Pileri SA, Stein H, Thiele J, Vardiman JW. WHO Press, Geneve 2008. 4. www.Cytometrie.nl of www.SIHON.nl Verslagen voor- en najaar 2005 en voorjaar 2006 en 2007.
