BIOLOGI
LAPORAN HASIL PENELITIAN PROGRAM RESEARCH GRANT I-MHERE JURUSAN TAHUN ANGGARAN 2010
PENGARUH VARIASI SUBSTRAT TERHADAP PRODUKSI SELULOSA BAKTERIAL Oleh: Dr. Suharjono, MS. Tri Ardyati, Ph. D. Dr. Elok Zubaidah
Dibiayai Oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Kementerian Pendidikan Nasional, melalui DIPA Universitas Brawijaya berdasarkan SK Rektor Nomor : 214/SK/2010, tanggal 22 Juli 2010.
UNIVERSITAS BRAWIJAYA NOPEMBER 2010
RINGKASAN
Serat selulosa adalah biopolimer alamiah yang sebagian besar diperoleh dari tanaman dan telah diaplikasikan secara luas di berbagai industri terutama industri kertas dan tekstil. Tanaman untuk menghasilkan serat selulosa dengan jumlah yang banyak memerlukan waktu yang lama dan lahan yang luas. Pemanfaatan sumber daya tanaman di hutan yang berlebihan untuk pemenuhan produksi serat selulosa dapat menimbulkan berbagai dapak negatif terhadap lingkungan. Industri pengolah selulosa tanaman mengeluarkan polutan gas, cair, dan padat yang mencemari lingkungan. Penggunaan tanaman hutan untuk produksi serat selulosa secara kontinyu telah secara nyata menurunkan luas dan jumlah sumber daya hutan di Indonesia. Hal ini mengakibatkan kerusakan hutan, erosi tanah, bencana banjir dan tanah longsor, serta pemanasan global. Untuk mengurangi dapak negatif yang ditimbulkan oleh produksi selulosa tanaman tersebut, maka perlu ditemukan alternatif penghasil serat selulosa. Bakteri merupakan mikroorganisme alternatif sebagai penghasil selulosa. Selulosa bakterial merupakan eksopolisakarida yang dihasilkan oleh berbagai spesies bakteri terutama dari Genus Gluconacetobacter (Acetobacter). Produksi selulosa bakterial yang dapat dilakukan secara intensif merupakan alternatif selulosa tanaman, karena bakteri menghasilkan selulosa dalam waktu lebih pendek dan lahan yang lebih sempit dibandingkan tanaman. Selain itu produksi selulosa bakterial dalam skala industri dapat mengurangi kerusakan hutan dan mencegah pemanasan global. Struktur molekul selulosa bakterial (C6H10O5)n adalah sama dengan selulosa tanaman tetapi memiliki keunggulan dibandingkan selulosa tanaman. Selulosa bakterial memiliki ukuran serat/fibril lebih kecil dan lebih seragam dibandingkan serat selulosa tanaman. Selulosa bakterial lebih murni karena bebas dari lignin, pektin, dan hemiselulosa, memiliki derajat kristalinitas polimer dan derajat polimerisasi yang lebih tinggi serta kekuatan mekanik dan kapasitas menyimpan air juga lebih tinggi dibandingkan serat selulosa tanaman. Oleh karena itu selulosa bakterial memiliki prospek yang luas untuk digunakan di industri makanan, kertas, tekstil, optik, farmasi, otomotif, dan medis. Produksi selulosa bakterial dapat dilakukan dengan memanfaatkan sumber daya alam dalam bentuk limbah cair yang dipandang sebagai bahan sumber daya sekunder tetapi pada saat yang sama merupakan sumber daya yang terbaharui dan murah. Salah satu sumber daya alam di Indonesia yang banyak dibuang sebagai limbah dan dapat dimanfaatkan untuk produksi selulosa bakterial adalah air buah kelapa. Indonesia memiliki lahan perkebunan kelapa terluas di dunia yang menghasilkan air buah kelapa 900 juta liter per tahun yang terbuang sebagai limbah. Limbah air buah kelapa oleh bakteri Gluconacetobacter xylinus atau Acetobacter xylinum dapat dimetabolisme secara aerobik menjadi pelikel selulosa. Salah satu masalah dalam aplikasi selulosa bakterial di industri adalah rendahnya produktivitas dan mahalnya biaya produksi. Oleh karena tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan isolat bakteri indigenous dan formula medium dengan bahan baku air buah kelapa yang murah dan tersedia dalam jumlah banyak di Indonesia untuk menghasilkan selulosa bakterial.
Bakteri penghasil selulosa diisolasi secar pour plate dari buah nanas, air buah kelapa, dan starter nata dengan menggunakan medium nutrien Herstrin-Schramm (HS) agar dan medium CaCO3 agar. Setiap isolat murni umur 48 jam dalam medium HS agar sebanyak satu ose diinokulasikan ke dalam 15 mL medium nutrien HS cair dan diinkubasikan pada suhu 30oC selama 48 jam secara aerobik. Suspensi biakan setiap isolat dengan densitas 5,1 x 106 sel/mL diinokulasikan ke dalam 150 mL medium HS cair dan diinkubasikan dalam biakan statis pada suhu ruang selama 14 hari. Parameter yang diamati adalah pelikel selulosa yang terbentuk sebagai dasar untuk seleksi isolat. Isolat mikrobia terpilih diuji potensi produksi selulosa menurut rancangan acak kelompok faktorial dengan dua ulangan. Isolat bakteri dan khamir masing-masing sebanyak satu ose diinokulasikan dalam 15 mL medium HS cair dan diinkubasikan pada suhu 30oC sampai mencapai pertumbuhan logaritmik. Suspensi biakan dalam fase pertumbuhan logaritmik dengan densitas 2,2 x 107 sel/ml dan perbandingan bakteri 90% dan khamir 10% (starter) sebanyak 15 mL dinokulasikan ke formula medium air kelapa 150 mL dengan perlakuan konsentrasi sukrosa 0%, 2,5%, 5% dan 7,5% dan konsentrasi urea 0%, 0,25%, 0,5%, dan 0,75%. Suspensi biakan diinkubasikan pada suhu ruang secara statis selama tujuh hari. Parameter yang diamati dari biakan tersebut yaitu pH dan densitas sel bakteri dalam medium serta jumlah pelikel selulosa yang dihasilkan. Data parameter dianalisis ragam dengan tingkat kepercayaan 95%. Isolat bakteri dianalisis similaritasnya secara numerik dengan strain acuan Acetobacter xylinum berdasarkan sifat fenotip. Algoritma analisis similaritas yang dipakai adalah average linkage (UPGMA : Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Averages), sedangkan nilai similaritas ditentukan dengan metode simple matching method (SSM). Hasil penelitian menunjukkan dari 19 isolat hanya lima isolat yaitu AK1, AK2, AK3, NBL6 dan NBS2 yang mampu memproduksi selulosa bakterial dengan produktivitas yang rendah. Selulosa paling banyak dihasilkan oleh isolat AK2 sebesar 2,079 g kemudian NBL6 dengan produksi 1,089g. Penambahan konsentrasi sukrosa dan urea dalam medium air buah kelapa pada penelitian ini tidak berpengaruh signifikan pada densitas komunitas mikrobia. Densitas mikrobia pada awal inkubasi sebesar 4,3 x 107 sel/mL tumbuh menjadi 2,18 x 108 - 82.525 x 108 sel/mL. Pertumbuhan komunitas mikrobia dalam waktu inkubasi tujuh hari dapat menghasilkan pelikel selulosa dengan tebal antara 0,375 – 11,625 mm dan berat antara 0,738 – 117,773 gram. Pelikel selulosa paling tebal dihasilkan oleh perlakuan konsentrasi sukrosa 5 % dan urea 0,25 %, sukrosa 0% dan urea 0,5 % atau 0,75 %, sukrosa 2,5 % dan urea 0,75 %, serta sukrosa 7,5 % dan urea 0,25 %; sedangkan paling tipis pada perlakuan sukrosa 7,5 % dan urea 0,75 %. Berdasarkan berat pelikel basah, produktivitas tertinggi pada perlakuan sukrosa 7,5 % dan urea 0,25 % sedangkan yang terendah pada perlakuan sukrosa 7,5 % dan urea 0,75 %. Produktivitas selulosa murni tertinggi sebesar 10,849 gram pada perlakuan sukrosa 5 % dan urea 0,25 % sedangkan yang terendah 0,03 gram pada perlakuan sukrosa 7,5 % dan urea 0,75 %. Berdasarkan karakteristik fenotipik, isolat NBL6 termasuk anggota Genus Acetobacter karena memiliki nilai similaritas 73 % dengan A. xylinum. Bedasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa medium air buah kelapa dengan penambahan sukrosa 5 % dan urea 0,25 % menghasilkan selulosa paling banyak. Isolat NBL6 penghasil selulosa merupakan anggota Genus Acetobacter.
SUMMARY Cellulose fiber is a nature biopolymer that mainly derived from plants and it has been application broadly in varies of industry especially in textile and paper industries. Plants were produced cellulose in large quantities need along time and large area. Usage of plants resources in the forest excessively for cellulose fiber production was caused some negative impact to environment. The industries that processing of plant cellulose have been produced gas, liquid, and solid pollutant to the environment. Using of forest plants to cellulose producing continually has been decreased of the forest resources and caused global warming. To minimize of negative impact that caused by production of cellulose from plant, of course need to search alternative of cellulose producing Bacteria are an alternative of microorganism as cellulose producing. Bacterial cellulose is an exopolysaccharide that produce by varies of bacteria species mostly form genus of Gluconacetobacter (Acetobacter). Production of bacterial cellulose can carry out intensively as alternative of plant cellulose, since bacteria able to produce of cellulose in short time. Bacterial cellulose production in industrial scale could decrease destroying of forest and prevent of global warming. The structure of bacterial cellulose molecule (C6H10O5)n is same as with plant cellulose, but it has superior than plant cellulose. Bacterial cellulose has fiber uniform and the size is least than plant cellulose. Bacterial cellulose is more pure since it free from lignin, pectin, and hemicellulose contamination; it is having degree of polymerization, mechanical strength, and water holding capacity higher than plant cellulose. Bacterial cellulose is having future prospect to application in food, paper, textile, optic, pharmacy, automotive, and medical industries. Bacterial cellulose can be produce from agricultural wastewater especially is water of coconut fruit. Indonesia is having the highest coconut plantation in the world and produced 900 billion liter of coconut fruit water as waste water. The coconut fruit water can be use by Gluconacetobacter xylinus or Acetobacter xylinum to produce cellulose. The problem of bacterial cellulose application in industry were law productivity and expensive. The objective of the research is to get indigenous of bacteria isolate and medium formulae in basal medium of coconut fruit water which is cheap and available in large quantity in Indonesia to produce bacterial cellulose. Cellulose producing bacteria were isolated by pour plate from fruit of pine apple, coconut fruit water, and culture suspension of nata in medium nutrient HerstrinSchramm (HS) agar and CaCO3 agar. Each isolate of bacteria in 48 h old was inoculated into 15 ml HS medium nutrient and it was incubated at 30oC and 48 h aerobically. Culture suspension of isolate with density 5.1 x 106 cell/ml was inoculated into 150 ml of HS medium broth. Culture suspension was incubated in static culture at room temperature for 14 day. The parameter of cellulose productivity was used to selection of isolates.
The potency of isolate was assayed to production of cellulose according block randomized design factorial. The bacteria and yeast isolates were inoculated into dalam 15 ml of HS nutrient broth and it was incubated at 30oC until logarithmic growth as starter. The starter suspension with density 2.2 x 107 cell/ml in the 90% bacteria and 10% yeast ratio as much 15 ml as was inoculated into basal medium of coconut fruit water. The medium was consist of coconut fruit water that added sucrose 0%, 2.5%, 5.0%, 7.5% and urea 0%, 0.25%, 0.5%, 0.75%. Culture suspension was incubated at room temperature in static culture for 7 days. The parameter of pH, cell density, and cellulose productivity were examined. The Parameter was analyzed of variance with 95% significance degree. The isolates of bacteria were similarity analyzed numerically based on phenotype characteristic by algorithm of average linkage and simple matching method (SSM). Result of the research showed that five of 19 isolates (AK1, AK2, AK3, NBL6 and NBS2) were able to produced bacterial cellulose. Those isolates have low bacterial cellulose productivity. Isolate of AK2 has highest 2.079 g of cellulose production and NBL6 isolate produced 1.089g of cellulose. Increasing of sucrose and urea concentration in coconut fruit water have not affect significantly on microbe density. Initial microbe density as much 4.3 x 107 cell/ml as was growth to be 2.18. 108 82.525. 108 cell/ml. Microbe communities was produced bacterial cellulose with 0.375 – 11.625 mm thick and 0.738 – 117.773 g weight. Cellulose thickest was produced in treatment of sucrose 5 % and urea 0.25 %, sucrose 0% and urea 0.5 % or 0.75 %, sucrose 2.5 % and urea 0.75 %, and sucrose 7.5 % and urea 0.25 %. Cellulose thinnest was produced in treatment of sucrose 7.5 % and urea 0.75 %. The productivity of cellulose was highest 10.849 g in treatment of sucrose 5 % and urea 0.25 % but the lowest productivity 0.03 g in treatment of sucrose 7.5 % and urea 0.75 %. Based on phenotype characteristic, isolate of NBL6 belong in the Genus of Acetobacter do to have similarity value 73 % with A. xylinum.
DAFTAR PUSTAKA
Amano, Y., F. Ito and T. Kanda. 2005. Novel Cellulose Producing System by Microorganisms such as Acetobacter sp. J. Biol. Macromol. 5(1): 3-10. ANO
Laboratory. 2005. Production of biocellulose (bacterial cellulose). http://images.google.co.id/imgres?imgurl=http://www.res.titech.ac.jp/~junkan/eng lish/cellulose/celfig3.gif&imgrefurl
APCC. 2006. Coconut statistical yearbook 2004. Asia Pacific Coconut Community. an, Made. 2007. Nata De Coco. Departemen Teknologi Pangan dan Gizi – IPB. Astaw http://kulinerkita.multiply.com/reviews/item/137 Aydin, Y. A. and N. D. Aksoy. 2009. Isolation of Cellulose Producing Bacteria from Wastes of Vinegar Fermentation. Proceedings of the World Congress on Engineering and Computer Science Vol I, WCECS, October 22-23, 2009, San Francisco, USA. Brown, Jr. R. M. 1994. Understanding Nature’s Preference for Cellulose I Assembly: Toward a New Biotechnology Era for Cellulose. Proc. Inter. Symp. Fiber Sci. Tech. 239-437. Chawla, P. R., I. B. Bajaj, S. A. Survase and R. S. Singhal. 2009. Microbial Cellulose: Fermentative Production and Application. Food Technol. Biotechnol. 47(2): 107124. Ciechanska, D. 2004. Multifunctional Bacterial Cellulose/Chitosan Composite Material for Medical Apllications. FIBRES & TEXTILES in Eastern Europe 12(4): 69-72. Dadang, W. I., S. Riyanto, F. Faza & R. Masanto. 2008. Rayuan Kelapa yang Menggiurkan. http://www.agrina-online.com/show_article.php?rid=7&aid=1258 Dutta,
D. and R. Gachhui. 2007. Nitrogen-fixing and Cellulose-producing Gluconacebacter kombuchae sp. nov., Isolated from Kombucha Tea. IJSEM 57:353-357.
El-Saied, H., A. I. El-Diwany, A. H. Basta, N. A. Atwa and D. E. El-Ghwas. 2008. Production and Characterization of Economical Bacterial Cellulose. BioResources 3(4): 1196-1217. Faozi, M. M. 2009. Peluang Pasar Produk dari Kelapa Indonesia: Analisa Dampak dari Menipisnya Cadangan Minyak Bumi dan Perubahan Iklim http://www.mmfaozi.com/peluang-pasar-produk-dari-kelapa-indonesia-analisadampak-dari-menipisnya-cadangan-minyak-bumi-dan-perubahan-iklim.html Forng, E. R., S. M. Anderson, R. E. Cannon. 1989. Synthetic Medium for Acetobacter xylinum That Can Be Used for Isolation of Auxotrophic Mutants and Study of Cellulose Biosynthesis. Appl. Environ. Microbiol. 55(5): 1317-1319. Galli, E., S. Silver, & B. Witholt. 1992. Pseudomonas : Molecular Biology and Biotechnology. American Society for Microbiology, Washington D.C.
Heo, M.-S and H.-J. Son. 2002. Development of an Optimized, Simple Chemically Defined Medium for Bacterial Cellulose Production by Acetobacter sp. A9 in Shaking Cultures. Biotechnol. Appl. Biochem. 36:41-45. Hesse, S. and T. Kondo, 2005. Behavior of Cellulose Production of Acetobacter xylinum in 13C-enriched Cultivation Media Including Movements on Nematic Ordered Cellulose Templates. Carbohydrate Polymers 60:457-465. Hoenich, N. 2006. Cellulose for Medical Application: Past, Present, and Future. BioResources 1(2): 270-280. Hwang, J. W., Y. K. Yang , J. K. Hwang, Y. R. Pyun and Y. S. Kim. 1999. Effects of pH and dissolved oxygen on cellulose production by Acetobacter xylinum BRC5 in agitated culture. J. Biosci. Bioengineer. 88(2): 183-188. Kawano, S., K. Tajima, Y. Uemori, H. Yamashita, T. Erata, M. Munekata and M. Takai. 2002. Cloning of Cellulose Synthesis Related Genes from Acetobacter xylinum ATCC23769 dan ATCC53582: Comparison of Cellulose Synthetic Ability Between Strains. DNA Research 9: 149 – 156. Keefe, A. J. 2006. Fluid Dynamic Properties of Bacterial Cellulose and Apllication. Keshk, S. M. A. S., T. M. A. Razek, and K. Sameshima. 2006. Bacterial Cellulose Production from Beet Mollases. Afr. J. Biotechnol. 5(17): 1519-1523. Keshk, S. and K. Sameshima. 2005. Evaluation of Different Carbon Sources for Bacterial Cellulose Production. Afr. J. Biotechnol. 4(6): 478-482. Kongruang, S. 2007. Bacterial Cellulose Production by Acetobacter xylinum Strains from Agricultural Waste Products. Appl. Biochem. Biotechnol. 148: 245-256. Lee, H. C. 1999. Reduced Production of Microbial Cellulose Caused by Aggregation of Acetobacter xylinum under Shaking Culture Conditions – Observation by Scanning Electron Microscope. Applied Chemistry 3(2): 92-95. Masanto, R. 2008. Laporan pengolahan nata de coco. http://one.indoskripsi.com/judulskripsi-tugas-makalah/mikrobiologi/laporan-pengolahan-nata-de-coco Mellawati, R. dan E. Sukara. 2009. Pasta Inokulum Nata de Coco. Pusat Inovasi LIPI, www.bic.web.id Nguyen, Vu Tuan; Flanagan, Bernadine; Gidley, Michael J.; Dykes, Gary A. (2008). "Characterization of Cellulose Production by a Gluconacetobacter xylinus Strain from Kombucha". Current Microbiology 57 (5): 449–53. Pourramezan, G. Z., A. M. Roayaei and Q. R. Qezelbash. 2009. Optimization of Culture Conditions for Bacterial cellulose Production by Acetobacter sp. 4B-2. Biotechnology 8(1): 150-154. Rezaee, A., S. Solimani and M. Forozandemogadam. 2005. Role of Plasmid in Production of Acetobacter xylinum Biofilms. Am. J. Biochem. Biotechnol. 1(3): 121-124.
Saxena, I. M., T. Dandekar and R. M. Brown. 2002. Mechanism in Cellulose Biosynthesis. School of Biological Sciences, University of Texas at Austin, Austin. Sembiring, L. 2002. Petunjuk Praktikum Sistematika Mikrobia S-2. Laboratorium Mikrobiologi, fakultas Biologi, UGM, Yogyakarta. Skinner, P. O. and R. E. Cannon. 2000. Acetobacter xylinum: An Inquiry into Cellulose Biosynthesis. The American Biology Teacher 62(6): 442-444. Son, H-J, M-S. Heo, Y-G. Kim, S-J. Lee. 2001. Optimatization of Fermentation Conditions for the Production of Bacterial Cellulose by A Newly Isolated Acetobacter sp. A9 in Shaking Cultures. Biotechnol. Appl. Biochem. 33:1-5. Songklanakarin, J. 2005. The optimal condition for nata production from palm syrup by Acetobacter xylinum TISTR 107. J. Sci. Technol. 27(6): 1253-1261. Sunny. 2007. Indonesia Masih Abaikan Potensi Kelapa. SUARA PEMBARUAN DAILY. Wed, 28 Mar 2007 08:21:39 -0800. Surma-Slusarska, B., S. Presler and D. Danielewics. 2008. Characteristics of Bacterial Cellulose Obtained from Acetobacter xylinum Culture for Application in Papermaking. FIBRES & TEXTILES in Eastern Europe 16(4): 108-11. Suryanegara, L. 2009. Layar Monitor Fleksibel Berbahan Dasar Nata de Coco ? http://www.lipi.go.id/www.cgi?berita&1215693116&&2008& Toda, K., T. Asakura, M. Fukaya, E. Entani and Y. Kawamura. 1997. Cellulose production by acetic acid-resistant Acetobacter xylinum. J. Ferment. Bioengineer. 84(3): 228-231. Tsuchida, T. And F. Yoshinaga. 1997. Production of Bacterial Celluose by Agitation Culture System. Pure & Appl. Chem. 69(11): 2453 – 2458. Vanderpool, C. R. 2000. Bacterial Chemistry and Structure. http://www.zoey.med.howard.edu/2003/immuno/3-8-00%208_9.AM.htm Watanabe, K., M. Tabuchi, A. Ishikawa, H. Takemura, T. Tsuchida, Y. Morinaga and F. Yoshinaga. 1998. Acetobacter xylinum Mutant with High Cellulose Productivity and an Ordered Structure. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62: 1290-1292. Williams, W. S. and R. E. Cannon. 1989. Alternative Environmental Role for Cellulose Produced by Acetobacter xylinum. Appl. Environ. Microbiol. 55(10): 2448-2452. Wong, H. C., A. L. Fear, R. D. Calhoon, G. H. Eichinger, R. Mayer, D. Amikam, M. Benziman, D. H. Gelfand, J. H. Meade, A. W. Emerick, R. Bruner, A. Ben-Bassat and R. Tal. 1990. Genetic Organization of the Cellulolytic Synthase Operon in Acetobacter xylinum. Proc. Nati. Acad. Sci. 87: 8130-8134.
