LAPORAN AKHIR PELAKSANAAN KEGIATAN RISET PEMBINAAN IPTEKDOK TAHUN ANGGARAN 2012

1612, UMU

LAPORAN AKHIR PELAKSANAAN KEGIATAN RISET PEMBINAAN IPTEKDOK TAHUN ANGGARAN 2012

RESPON IMUN S-IgA MOLEKUL ADHESIN SIDGELLA DYSENTERIAE 49,8 KDA DAN 7,9 KDA TERHADAP SEKRESI CAIRAN USUS MENCIT

Disusun Oleh : Yulian Wiji Utami, SKp.,MKes Ns. Wiwik Agustina, SKep Ns. Dwi Setyorini, SKep

BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN KEMENTERIAN KESEHATAN R.I •

t

)

R DYS1

•

-;...¥:> .

'

�0l,

---�

l

...

:- tb r� -l:JM-u-- -

•

t

LAPORAN AKHIR PELAKSANAAN KEG lATAN RISET PEMBINAAN JPTEKDOK TAHUN ANGGARAN 2012

RESPON IMUN S-IgA MOLEKUL ADHESIN SHIGELLA DYSENTERIAE 49,8 KDA DAN 7,9 KDA TERHADAP SEKRESI CAIRAN USUS MENCTT

Disusun Oleh : Yulian Wiji Utami, SKp.,MKes Ns. Wiwik Agustina, SKep Ns. Dwi Setyorini, SKep

BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN KEMENTERIAN KESEHATAN R.I 2012

•

,

SUSUNAN PENELITI

NAMA

ASAL INSTITUSl

KETUA/ ANGGOTA

Yulian Wiji Utami

Ketua

FK Universitas Brawijaya Malang

Wiwik Agustina

Anggota

Stikes Maharani Malang

Dwi Setyorini

Anggota

STIKES Karya Husada Kediri

•

t

-

-

KF!\1ENTERIAN KESEIIATAN

!\,\I>·V\1

I'I·�I'IITI!\N l>i\1'- I'I.N
kkpnn

Ul.� 1 , -��(, tox:-; t

.���unih:; P•-� t' -l �--H'' � '

I. muil · '"' "bau ·u ltlh.LHJ..!.d..:p�....·.-. i:!�' �tt. 11�-/"JI•· ltllp

.,, "\\ htP;•"!!·•kpl..l'' J!" td

5. Keputusan

Nomor Kesehatan Menteri Koordinasi tentang 791JMenkesfSKNI I/1999 Pengembangan dan Penelitian Penyelenggaraan Keseha\an;

Nomor Kesehatan Menteri 6. Peraturan 1144/Menkes/PerNIII/2010 tentang Organisasi dan Tala Kerja Kementerian Kesehatan Rl: MEMUTUSKAN :

Menetapkan

KESATU

KEOUA

KETIGA

DAN PENELITIAN KEPUTUSAN BADAN KEPALA PENGEMBANGAN KESEHATAN TENTANG TIM PELAKSANA RISET PEMBINAAN ILMU PENGETAHUAN DAN TEKNOLOGI KEDOKTERAN TAHUN 2012: Tim Pelaksana Riset Pembinaan llmu Pengetahuan dan Teknologi Kedokteran Tahun 2012 (selanjutnya d1sebul Risbin lptekdok 2012) sebagaimana tercantum dalam lampiran keputusan ini bertugas: 1 Melaksanakan penelitian sesuai kaidah itmiah dan etika dengan waktu yang telah ditetapkan: 2. Mempertanggungjawabkan penggunaan anggaran sesuai peraturan yang berlaku: 3. Membuat dan menyampalkan laporan kemajuan dan laporan akhir penelilian: 4. Membuat ringkasan eksekulif berdasarkan hasil penelitian sebagar bahan masukan kepada pengambilan keputusan dan pengetola program yang terkait dengan hasil penelitian. Tim Pelaksana Risbin lptekdok Tahun 2012 sebagaimana dimaksud pada diktum kesatu diberikan honor sesuai dengan ketentuan yang bertaku: Oa�am melaksanakan tugasnya, Tim Pelaksana Risbin lptekdok Tahun 2012 berpedoman pada peraturan perundang-undangan yang bertaku;

KEEMPAT

Dalam melaksanakan tugasnya. Tim Pelaksana Risbin lptekdok Tahun 2012 dapal berkonsultasi dan berkoordinasi dengan Tim Panel Pakar dan Tim Pengelota Administrasi Risbin lptekdok:

KELIMA

Biaya kegiatan Tim Pelaksana Risbin lptekdok Tahun 2012 dibebankan pada DIPA Sekretariat Badan Litbangkes tahun anggaran 2012 Nomor : 0682/024-11 1.01100/2012 Tanggal 9 Oesember 2011;

•

t

KEMENTEIUAN KESEIIATAN B/\IJA� I'U\LI.JTI!\N DAN I'I ·N(iJ:I\.1B,\N(i/\N KI:SJ:IIi\Ti\N .labn l•�rn..·l;tl..;111 _,.....fara �\,, ��J .l..1kou1a IU_'if,(l J\.,11;1� l't"' I�.:!(, 'ld.:l'"'" 110:�11 �21olll�ii l":ohoooult- 1!1 .' II ��-1 HJ ll

1·:.,. til · �·,h:�tt ,, ltlh.••'�··h.:p&.....·.. �·' ut. ,1,·1•\;,,·: lu1p·

. "'�' \\

.ltth.u1� .t.h,:rkcs .J:.'I.Id

KEPUTUSAN KEPALA BADAN PENEUTIAN DAN PENG EMBANGAN KESEHATAN NOMOR: HK.03.05/211273/2012 TEN TANG PEHETAPAN TIM PELAKSANA RISET PEMBINAAN ILMU PENGETAHUAN DAN TEKNOLOGI KEDOKTERAN TAHUN 2012 KE!"ALABADAN PENEUTIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN, Menimbang

:

a. bahwa

untuk

meningkatkan

pengembangan

di

bidang

kapasitas kesehatan

penetitian perlu

dan

dilakukan

pembinaan kepada para penelili muda: b. bahwa dalam peneliti

rangka

muda

perlu

menggali potensi

pembinaan Clan dilakukan

Riset

Pembinaan

flmu

Pengetahuan dan Teknologi Kedokteran:

c. bahwa berdasarilan pertimbangan sebagaimana dimaksud pada huruf a dan b perlu ditetapkan Keputusan Kepala Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan tentang Pembentukan

Tim

Pelaksana

Riset

Pembinaan

Pengetahuan dan Teknolog i Kedokteran Tahun 2012;

Menglngat

:

1

Undang-Undang

llmu

18 Tahun 2002 tentang Sistem

Nomor

Nasional Penelitian, Pengembangan dan

Penerapan llmu

Pengetahuan dan Tekno logi (lembaran Negara Republik Indonesia Talmn 2002 Nomor 84, T am bahan Lembaran Negara Republik Indonesia Nomor 4219):

2.

Undang-Undang Nomor 36 Tahun 2009 tentang Kesehatan

(lembaran Negara Tahun 2009 Nomor lembaran Negara Nomor

3. Peratu ra n Penelitian Negara

Pemerintah dan

Nomor

39

Pengembangan

Republil<

144. Tambahan

5063):

Indonesia

Tahun

1995

Kesehatan

Tahun

1995

tentang

(lembaron

Nomor

67.

Tambahan Lembaran Negara Repubtik Indonesia Nomor

3609): 4. Peratliran Presiden Nomor 76 T ahun 2011 Perubahan alas P eraturan Presiden Nomor 47 Tahun 2009 T entang Pembentukan dan Organisasi Kementerlan Negara;

•

KEMENTERIAN KESEUATAN

BAIJAN 1'1 1\.1 I I'IIA." I>AS

f'l �
.J;d�u• p.....��,..·,·l�l l...ul 'l �.1f;• t\.11, ��tl .b�:•r1;• lll'c,o K••tal Ptl:- I ��h

/·

·1,;1-.· pttTt

IIL"ll l -L�hiUS)I. I .ll-••dllllk- (O�IJ-L14\•H I

1111111 ..,,.,hall H �i lh;t llJ.!.,kpb ·, :,:o

Ht ll.·h�a\·

hll11

"' \'"

htl�.w�.tl"'·ph·, .co HI

KEENAM

Dengan berlakunya Keputusan mi. maka Keputusan Kepala Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Nomor HK.03.05111393/2011 Tanggal 19 Januari 2011 tentang Penetapan Tim Pelaksana Rise! Pembinaan llmu Pengetalluan d a n Tekuologi Kedokteran Tahun 2011 dinyatakan tidak berlaku lagi:

KETUJUH

Keputusan im berlaku !'>P.jak tanggal ditetapkan.

•

,

�ttV'""-"'�l�•t'M!IioloT._.. ..otii('Jfl ·H��tUo&rJt'"IJfltlOI7

.

....LNLi�.�OAJ
t.- ....,� ... "fllltt•,..�'.l!'fl 3') ": ,lo�W!Ix-e "' l,o� I•JI-cMC.1,.. :2·

fit.. ""h'....... 'S!Oo�

.

............ ,...., .........

t.n.r'"'lf'r¥·•

,.P/]

t' r '9"',..

.� .... llolt-·�... .,..

.... ....,.•�, ,... :il>t..l .... �- �-���I,•W

'�"·····.....,... ... \!�·

�-·��� 1-#l.fA'

......,............� ... ..........,. . .. ...,....,.

To,._,.,.,. .. ""'•"

tyv,.....,,,. �

....il�"�""*' . ...... -l...... f;.o.<. ...Cl .. �,.�l ....1-
�"'�""':.:'�"p...,

=•�let'.W,

.........,...,.�"'lf""l.. "'-""'•Mrol»-•-... ....,...., to:-.. �-.. P:t(IJHIV(fl"t.. Af..._,AVA..l.U!NifA :).... ......... L(!!flt'" .... ,. �"""'

.,._...,..l'o'I•J'.a-o�w..-...

•11.UI'OIIV (tltn.u MA""'JA�A. ...,l.UoO

,,. ••�.a�

..... ""'''

Vlr,..l�:o<�aS�Nol"""$

.,.....�

�""" ll'o.... Qot.o,�.. ,�.,.,.,.,..,tS. ...,.... .. �.He·�·""""' ........ ...,. ......,_.._...,,,_{" ...,"'rM.-<

·�4.1� j("f."

Mtq;� M•Mirll.:laO..,.&. Ot•· �- ....·��

�NMfl¥':'91'- """.."-""�� illa

.,.....,. �""'�""""�1"'

�).·Jt�l�!r•��

.,. h'l�s

:tt........... ... 79•0..!J¥ ..1oo6•��'1.-!l;o OOjl.. ' tt.-f... ... ... .... .......

u...,..r.r......,. Ar.ot

\)Ofr'lfl..,.,..,..,..lt�Moew�• S� C.P1'M5e�-... II'..W,...,11'--n Orw.I�S�-y�

•- r•w....,....o.o.l... �o�.. ,.,.�

•

·J.�.�••:,"

...,....,..,.,....o._,.,.,:.l'll•U..,. �.,.�IICI-""'"PCII

,

·:.t�Cfi,Zr.

�·� •IIU"'&'· �

W��J

.,��,y,-,.ri�N!\VM• ...-1 • . ... �....-·,....,__ .,.,�tl • ���e,,,,...,rWflt'.,..,...,,�

�'I,_.I1.1.. ,._.,.,_� 1o'!l·..-N,.

,lll IMvt•IIT.&t OO'Of.IEOOI'O,&I!MAIVJole • �;�fl·:o<•O•.-."'..,. t.rJ> """'""����-"' !i'Jt ""'!.>

,......,..�··'--"'.,_.,...,.... . c,...,.._..,.roOr•'II;I.IP.v-.o�.n

A,·W"'IJOI�'W'J' . .... I)M- c....,lto. ...,.,,,..,.ftol....
�t•fii.M-tr!fl• r,..t��•1!f"'r 1 a.�<; ,..,., :W.c-4

•.,.,.�VIi!;.vi\•A:.,:II.:OI'II"IIIIfl'lfl

�,.��- ...-...�.... �"''l'"""'',."_..,,.,...,..w�• ':t•do"V"..'IIlfi"COo

!'(.rY�

., �"'l-.,... :.< ''":)�� ....

1"1..:• �·· .'1•�" �·

·�A,..J""'�•··�--uw"l-�·�+­ c"'<a.-."'iJ"IO>I'-1>!..,,.....� 0 ...

o,.� ..........�·...-: . :·•""' !.r

s�--

.._..,_. P'·a��·� '' "�..1 oi' ...�

_... ...Ar.IJ-':1" , V'I'M '>&'I•� 1(1

·tt�jiiJIIIAtQAt)�AH.ADA ¥()G•�KN'tTA • -· "' l-'1-Yr� .. , . , ....,... .,.,.......-n:�...,.... . . �·So(. "'v.l• � •_.4'.,._1l,.T

,...,...,., ,.tXJt o-tt.•••�'W s� M��t.:t·..-.��

�'"lW.I>

Jt \4.,.3 """..1""'��=

�

c,.rdoi 'IO,oo t�t""""

,...,.Hto,. S..ao>.. ""'''"•"$' )�•� ,_._.. .-c�w• ....,��*'�• f'I""'t<'....r_....,, ...�"Yin

·--� ...... .. I'•�• r-...,.,

�-�"'fl� �Rlt� «--< ''"" .&"ltnJ ':ooti'_,..,,'*'",._•.,.,'W t.•.Ko<-Lt.IP • .....cCPOII"'••"'•'""".c,.o"""'of .,,..� �ftlll!)v. lko!ioll•'lfol""''"'

. ............�...... .�,. ..,ii,,_W.C'•

I' !>.•flo' ,��·

ID�·�·"""'""":o:ftlG...., to•

��•wm�r. CA:•+ \M"

�··-t!-io"'"-

... � dot'o�o. ..,_I....,·IO!W!HtiV�., ·��,,.�.�-To.w-w:� \.
..�'"'CI'.a . • lc;.;..J) "'·��, �� · _,�

l�.,...� . ....,.�DI'•·,. �t,US'oOI!Gft"&C4CII V"J>Ion

•

t

·,:·J �l', 't;;..

""""'._'-'-'r
"'11o"" ••-...� .. V.,,. loi:O. "" �

····¥'1�\.loo':

•.,.Qir•l...,.�..,_..,..,.• .,..,,,..,..,,<:., lol "'ttt' ..- � •,... • • :. u ..._ '"" ., .,. . ..,...-.�•••f>..,W-,e'�j�t.... .........")"..:0(.�. _._.J......... ,._,..... .... .......��·�...... .. ..,.. ....v,•·J"-t� ..

"""""•..-o-�•·• ,...,, ...,. w",.c l-... , � . ,..

... .�. ,. �.., ,....�

..-�- ' �

...., .. . "!.�'!..... '_.<'lA "ii,f(

llv tf,r Hb'"' :.L.o

�>f

.J C. :I' I$'.1

-·-""'ilol'� ,

��y,�.....,..... 11(�, ..._...<1. ....!i."'-" . . .. ."-.*''-"......'.bttl�1 ............,..

,..,J'"\I'IF'f�ll-'ll.,.r'lQ�\1\ �...t""

..,. ··� t�'l -�41fl ...

�lllo..I H•v• wt>...,.-,fl ,...�

"f"Q¥1"1prnCAoi-I!II"'CCI.._,IVIf:l0

.......__,.L)o.�l.��;.,...,....,'" •·• ltr ..

.,.,.,....,.__ . ,..,,rtw•vP...,_<�•• -�....��.. ,;..ow:��

fl:lil c,o,..,.r...,,....., �u· �.....

"u

F�·-...,r:-.,..•, o- �!Dt:o

.-�"'"1'-l'�-- ')�n

)�

t-tv_ ...,!m;:r�-cf"A I(.

"'�......-........ �:;.

'�<""•�:...

Y. .,_,.,.),_,.,� A:• VI....,�,.,�.,.� V r.o$•

.

l"�� .......... ,.... ,,..r. ....�L#oll... l(ad.�toW.·���·�• ,._,..,,_�,.....,,""o�sl.!l.l -·

,_._...,,...-v

.,...IW•JH•W.-Sorl�.._.c:...,• 01<'016iv.<-AUI�0!1o"TI!I�ri�l'� �....;S.,.:,,�-.......1!... .. ....... . 1� ����•..,.,.•.,.,.�,.M_.,\4">0 Olln'tll-.o.l
, p!"r;) ...,

�����ao-�. ... -�-...,.,, 'f.""-•41.,..-t HV-oaa Oloo"OI... III:r�l:lfM1 ...........0'�.. �i'I'O""t'CM�UU -"'

�·-,._...,.,,

··�e�vn

I,.....U.....,. M..._,

�·:too• ,.,.......�..,.

flklo.o�k """t'Ylll.;tf - -·

�.... -..._ . ............. �........ .,..,.�.. .......:..�-.. �-�lo<'Jnl-,.....�

f'kUIIWV$111.tlolr.a�.JIIl...ul 1

,.,_.,�---�

c..-....�.... �o�:.;.

��·-..-o(..tO'b�� �·�···M«·­ o.�ooro-�.-.s..s...--. �.,., • .,..... _.,.t�, .....,....-� _.,.... �tn,....,_,.r"'r r;;

.

.

"'IOJ,.v...... ,. ... ,

,.....,....-".,8w"*'••Uollc;oo-•J.u

�..... J•......_,.....__...,t_ �DII'Iol"ll�<-1. 111do �..._,..

,,.,"""',th

Ttl.,.'folottt
:n.

..... e-.--.��·

-

,K\IN'Vtiii...,.MlAIM/.*O�l.� '

,,,._.-o-s-.�

rto;�s,.,.. "'""... o., ..,..

WIMIIr/I�"'P"�"'lt"'f()olll (.•,

..... ....�-l"ro.&. ·'*'·-­

,.�,.,..AOJ�� ,

,,

$........,n 0...• .:'1" $,1'0o
u. o�: ....�!)- �"� �"0

10011()0@

f'-(t..w•!a'IO>•ICI'I'II

.. ow..... 01 t(l .� b�

,.,,�o,r.-.�....,

u---....._:1"\__ ,� ,... .....,_, l'lr\vjlo ..... .... ... �.,.l¥

�,,.,.¥

............... ,� '""· -� 11'"--tt IVI)r.to � � ""........._,,.....,.�,,..,.WII;

:::...����""r.--��::f

�".W.�tr••$A�•'r4

��•"""".."�C,•�t<....,,•

'" � � C(oC

nc.�-..lMKIC:I.Aiw.NU: J,IUIWU«f A 1 .r..,.........,_f'looln.-� ·� ................ s..-o:o ·�

f'I(UJWI[MfT.Ut'tiAH.W ....... .a.c:ltt • ?•,.l��oto:.,rrlf t1rlill$o

IOU•JIII'''>•.,...•,.,VS

f'K�ITIII$UOiol''AIA I ,Of:*' AIIAII: .,.

I

l-.. �.,... Al4'.

�""''"��

""""'..,..,..._ "'-'...... �-� ·

1401i'4 "-� "­

..--....-�r. ,..,.._.._,.., �· .,....,, ..,,,.#A'tnp 0> Soof> .....

.. �._.,.. ...�

.,_Of..._

.s.�s-.- •,.....,.,

:}4(11•00'.1

��O�·�• ••,_

���/lJfiK.•

""""-�...... . .-...... � ��{� .....

&er\llfiM':Wltl'llll!t-Aufl

�--��--�'·

"h,oWI ..II,.,.iltwtVw.O •.......:•-. 4:

� )'IMMt!G.Io;J81 tl•,..

.._,..,._ ........ o-.. 1;...... 1

,� .....�·--....:-� l--...

f\10�-� . .........-..._._ . ���--.... ­ _...,.ft'..-.oi,'-"A,...�,...... '-'

�9�"'\f���(;.foi�••'I(•A,Ifo'.

...._

I"IIJtIO�OrltMNt,l"'lliii'WWM:lJff(l 1 �""t·��"",eO...Ot•"t•d ..,_ .....,....,.,.,

�� ..... .,.... , ..� ..._......"'to,......t,.g.w.- ._

l:b(AJ(fAic

��'�·� ,..._10<1• Vwil�ll'CI'TU) ra:...... ...aOotowto ..�rflOtdr."-"'�l.-d1·

'.O.JftJloil'

......<11�'11-.� .,. D-a.A!N'I

t..,.r..."'...,!.P

�'r"'t�,..,_.,J ....Iftblf . llt.;,r;:.....,lt)l)MI�Wf-2

l•�-G""",..,.-:diJo!Of -

r.:·"''� wa

�t'toC*,,.......... �.......�tv,�, . ...,�

,_..,.,....,...._....

,.,--;..JUr-64���

•tent�

....,.UMtrtltlnAI��t• 1 .-. w..w.. u.... c1o r.... ""'"""",.,....<�....,.., S$o -.. v-·1(,

LN'IIf'iJiflfll'lt_lfWPa.eftllf!J.!,IIW'I'I.""',kllitAJI»tfA _,�&..-, U,J,d.

$v;-Oo �

t.�w-cw.._..,.,._,...,..r.s... .,...., ..........."""'- ""........�....... ,.,�.llr'l� ·\�-<0-!

�·�,..,..-� ..... -��

�-"'- ---0,...� ... a...r�_.,v�_ ...,..,._��...

L..,.�""'.... "'�

IU1JilUII...O

S..,F,..-UNJ

,.,_�-· -� ._... .. .. ... ..,.,. · jHkf V�A.....-t...:.0.• ;•'t �.............,. ......IM"'1<• ... ""''

,._..,.-....vo-llllll•.,�

,.....,.,.... (lll,o- il'f - · . �.. �

-�0,."��----..-� � TLJU tii)IU NIWrl' 11J.� ,,_. !W"{Ifol IMI.w-,......,_ti� .......,. ..,,_

•.,l....t

•

•

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA Jalan Veteran- Kampus Universitas Brawijaya Malang- 65145 Tip. ( 0341) 569117, 567192, 580993- Fax. ( 0341 ) 564755 E-Mail: [email protected]_id

LEMBAR PENGESAHAN PENELITIAN

Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya dengan ini mengesahkan penelitian:

Nama Peneliti

Yulian Wiji Utami, SKp.,MKes

NIP 197707222002122002

Ns. Wiwik Agustin a, SKep Ns. Dwi Setyorini, SKep Judul Penelitian

"Respon imun s-lgA molekul adhesin Shigefla dysenteriae 49,8 kDa dan 7,9 kOa terhadap sekresi cairan usus mencit"

Unit Ke�a

Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya

Tempat

Laboratorium Mikrobiologi FKUB Laboratorium Biomedik FKUB

Waktu

Bulan Februari- November 2012

Oemikian, lembar pengesahan ini dibuat untuk digunakan sebagaimana mestinya.

Dikeluarkan di

: M aIang : 18 Desember 2012

Or. dr. Karyono Mintaroem, SpPA NIP. 195011161980021001

•

Kata Peogantar

Laporan akhir ini merupakan laporan hasil pelaksanaan kegiatan riset pembinaan IPTEKDOK tahun anggaran 2012. Penelitian yang kami lakukan mengenai " Respon imun s-lgA molekul adhesi Shigella dysenteriae 49,8 kDa dan 7,9 kDa terhadap sekresi cairan usus mencit" bertujuan untuk mengetahui daya protektivitas molekul adhesin S. dyseteriae 49,8 kDa dan 7,9 kDa terhadap pengeluaran cairan ke Iwnen usus melalui peningkatan respon imun s-IgA. Dengan selesainya penelitian ini, kami mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1.

Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Kementerian Kesehatan RI, yang telah membiayai penelitian ini

2.

Rektor Universitas Brawijaya, yang telah memberikan ijin dan kesempatan. kepada kami untuk melaksanakan penelitian ini

3.

Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya , yang telah memberikan dukungan dan Fasilitas kepada kami dalam melaksanakan penelitian ini.

4.

Semua pihak yang telah membantu hingga selesainya laporan ini. Hasil

penelitian

ini

diharapkan

dapat memberikan kontribusi dalam

pengembangan vaksin shigellosis yang aman dan efektif bagi manusia.

Hormat kami Peneliti

•

t

ABSTRAK

RESPON IMUN s-IgA MOLEKUL ADHESIN SHIGELLA DYSENTERIAE 49,8 KDA DAN 7,9 KDA TERHADAP SEKRESI CAIRAN USUS MEN CIT 1 2 3 Yulian Wiji Utami , Wiwik Agustina , Dwi Setyorini

I. 2. 3.

Program Studi S I llmu Keperawatan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Program Studi S 1 Ilmu Keperawatan STJKES Maharani Malang Program Studi S 1 llmu Keperawatan STIKES Karya Husada Kediri

Shigella dysenteriae mempakan bakteri penyebab disentri basiler, memiliki patogenesis yang sangat kompleks. Langkah awal dalam berkembangnya kolonisasi oleh Shigella dysenteriae adalah kemampuan mereka untuk melekat pada pennukaan mukosa dengan fimbriae atau pili. Tujuan penelitian ini adalah membuktikan rnolekul adhesi S. dyseteriae 49,8 kDa dan 7,9 kDa terhadap adhesi S. dysenteriae pada enterosit mencit serta untuk mengetahui daya protektivitas molekul adhesin S. dyseteriae 49,8 kDa dan

7,9

kDa

terhadap pengeluaran cairan ke

lumen

usus.

Penelitian ini

menggunakan hewan coba mencit Balb/C yang diimunisasi dengan protein sub unit pili 49,8 kDa, 7,9 kDa dan ISCOM, diberikan pada hari ke 0, 7 dan 28. Pada hari ke 35 men cit dimatikan dan dilihat kadar S-IgA usus hal us dengan metode ELISA dan ·

dilakukan uji protektifitas dengan metode mice ligated ileal loop selama 3 jam, evaluasi berat usus dilakukan tiap 30 menit yang menggambarkan peningkatan ekskresi cairan di lumen usus. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Protein adhesi sub unit pili S.

Dysenteria 49,8 kDa dan 7,9 kDa adalah molekul adhesi dan dapat menghambat sekresi cairan usus mencit melalui peningkatan respon imun s-IgA

Kata Kunci : Protein pili, Shigella dysenteriae, s-IgA

iii

t

Ri ngkasa n Ese kutif

RESPON IMUN s-lgA MOLEKUL ADHESIN SHIGELLA DYSENTERIAE 49,8 KDA DAN 7,9 KDA TERHADAP SEKRESI CAIRAN USUS MENCIT

Yulian Wiji Utami1, Wiwik Agustina2, Dwi Setyorine 1. Program 2. 3.

Brawijaya

Studi

S1

Ilmu

Keperawatan

Fakultas

Kedokteran

Universitas

Program Studi S1 Ilmu Keperawatan STIKES Maharani Malang

Program Studi S1llmu Keperawatan STIKES Karya Husada Kediri

Shigellosis (diare yang disebabkan oleh Shigella spp.) merupakan penyakit endemis yang terutama terjadi dinegara berkembang dan penyebab tersering

dari

penyakit

diare yang berdarah. Di seluruh dunia paling sedikit ditemukan 80 juta kasus diare dengan perdarahan.Dari

angka

tersebut

diperkirakan

700.000 menyebabkan

kematian.Kasus

kematian tersebut yang terbanyak sekitar 60% diderita oleh anak di bawah usia lima tahun (WHO 2011). D i Indonesia, diare adalah penyebab ketiga morbiditas dan penyebab utama kematian bayi (Nazir et al. 1985). Patogenesa penyakit ini sangat kompleks, langkah awal dalam berkembangnya kolonisasi oleh S. Dysenteriae adalah kemampuan mereka untuk melestarikan kedekatan dengan permukaan mukosa dengan fimbriae atau pili, yang merupakan

·salah satu

kelompok utama adhesion bakteri (Fuchs, 1998). Langkah ini merupakan langkah yang utama dalam proses timbulnya infeksi, tanpa langkah ini tidak ada kolonisasi atau infeksi yang disebabkan oleh S. dysenteriae. Penggunaan vaksin untuk mencegah perlekatan merupakan salah satu cara preventif menanggulangi penyakit ini.Hasi1 penelitian kami terakhir menemukan protein sub unit pili S. dysenteriae berat molekul 7,9 kDa dan protein 49,8 kDa adalah molekul yang merupakan molekula adhesin S. dysenteriae. Tujuan dari penelitian ini membuktikan molekul adhesi S. dyseteriae 7,9 k:Da dan 49,8 k:Da terhadap

adhesi S . dysenteriae

pada enterosit mencit, mengetahui daya

protektivitas molekul adhesin S. dysenteriae

7,9 kDa dan 49,8 kDa terhadap pengeluaran

cairan ke lumen usus dan slg A Metode yang dipergunakan adalah dengan cara memberikan imunisasi secara peroral, pada hewan coba mencit balb/c. Sediaan untuk imunisasi berisi molekul adhesion S. dyseteriae berupa

7,9 kDa dan 49,8 kDa, lalu ditinjau daya protektivitas dan respon imun

sigA yang telah diisolasi dari mucus lumen usus mencit. Hasil isolasi sigA

dianalisa menggunakan metode ELISA untuk mengetahui kadamya. Hewan coba mencit Balb/C yang diimunisasi dengan protein sub unit pili diberikan pada hari ke

49,8 kDa, 7,9 kDa dan ISCOM,

0, 7 dan 28. Pada hari ke 35 mencit dimatikan dan dilihat kadar S­

IgA usus halos dengan metode ELISA dan dilakukan uji protektifitas dengan metode mice ligated ileal loop selama

3 jam, evaJuasi berat usus dilakukan tiap 30 menit yang

menggambarkan peningkatan ekskresi cairan di lumen usus. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Protein adhesi sub unit pili S. Dysenteria

49,8 kDa dan 7,9 kDa adalah molekul adhesi dan dapat menghambat sekresi cairan usus mencit melalui peningkatan respon imun s-IgA. SigA berperan dalam perlindungan utama pada mukosa terhadap mikroorganisme patogen (Brandtzaeg, SigA

bersama-sama dengan

2007; Boullier eta/, 2009).

mekanisme pertahanan mukosa innate dapat menghambat

kolonisasi dan invasi patogen dengan cara menghambat adhesi bakteri ke sel enterosit. (Everett et al,

2004).

Selanjutnya perlu dilakukan penelitian mengenai pengaruh protein adhesi lersebut terhadap respon imun seluler serta daya protektivitasnya terhadap kerusakan mukosa usus. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menunjang ditemukannya vaksin yang handal untuk mengatasi shigellosis.

t

DAFTAR lSI

HAL AMAN JUDUL

....

.

......

.

.....

.

...........

. .. . . .

.. .

......

� ...

.

....

.. .

.......

...

.

.

...... ...

.......

.. . .

..

.. . .i

....

.. ..

LEMBAR PENGESAHAN ............ ........................ ....................................................... ii ABSTRAK

.iii

...................................................................................................................

DAFTAR lSI ................................................... .................................. ............................ iv DAFTAR TABEL ............................................................... .......................................... vi DAFTAR GAMBAR ............................................. ..................................................... vii DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................................. viii I.

. . . .. . . . . . ....... 1 1.1. LATAR BELAKANG PENELITIAN .......................................................... !

BAB I PENDAHUL UAN

............

1.2. TUJUAN PENELITIAN

.

.

......

...

..

............ . ...

..

.

...

..

..

....

...........

.........

..

..........

.

....... .

.. . . ...

.....

............

.. . . . . ..

.

...

2

1.3. MANFAAT PENELITIAN ............................................................................ 2 II.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1. SIIIGELLOSIS .

.....

........

.

.

..... .....

.. .

. ..........................

2.2. PATOGENESIS SHIGELLOSIS

.

. ... ..

.

......

........................

..............

.. .

. ..

....

..

.

.............

........

. . .. ..

.. . . ..

...

. 3 3 .

...........

. .. . . . .4 2.2.1. lnisiasi Shigella pada Sel Epitel ............................................................... 5 2.2.2. Mekanisme lnvasi Shigella ke dalam sel Epitel .. .. .. 7 2.3. S-IgA SEBAGAI IMUNITAS MUKOSA . . . . . .. . . .9 2.4. AJUVAN MUKOSA . . .. . . . . . . 12 .

...................

.

..

.....

.... ..........................

....................

.

.

III. BAB ill

.

....

.....

..

..

.......

..

. .

. .

....

................

..

. ... . ........

.............................

....................................

METODE PENELITIAN

3.1. DESAIN PENELITIA,N . . . . . .. . .. 14 3.1.1. \Vaktu dan Tempat penelitian ...............................................................14 3.1.2. Bahan dan Alat Penelitian . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....... 14 ......

3.1.3.

3.1.3.1. 3.1.3.2. 3.1.3.3. 3 .1.3.4. 3.1.3.5. 3 .. 1.3.6. 3.1.3.7.

... .....................

Metode kultur dan Metode isolasi

....

.

................... .......

. . . .

.........

.

.

..

....

.

..

....

.

....

.....

..

. . ..

..

15

.....

Metode kultur S. dysenteriae .................................................................... 15 Metode isolasi pili S. Dydenteriae ........................................................... 15 Metode isolas. i protein pili S. Dysenteriae ......... . .... ... .. ..

. ................ 16 Sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis............. ... .... 17 Prosedur pengganbungan protein adhesi dengan iscom ... .. .............. . ..... 17 Uji adhesi bakteri terhadap enterosit ..... ............ . ...... ... .................. ... .. !? Metode preparasi mukus ... ................. . . .. ... . ... ................. ... .... .... ... .. . 1 7 Bahan imunisasi . . .. . .. . . . . 18 .

.

.

..

...

.

.

.

.

.

.

..

.

.

.

.

.

..

.

.

.

.

.

3.1.4. Metode pemberian imunisasi . . . . 18 3.1.5. 3.2. RANCANGAN PENELITIAN . . . . . . . . . . . . . . . . . ............ .. . .. .. . .... 18 ..................

.

...

.

...............

.

.

.

.

3.2.1. Pemeriksaan kadar s-IgA (metode ELISA) 3.2.2. Uji Protektivitas

..............

.

.. .

........

. .........

3.3. VARIABEL PENELITIAN . ... 3.4. ANALISIS DATA . . . . . .. . 3.5. KERANGKA OPEIUSIONAL . . ........

......

..

..

..

.. ....... .

.

.

..

........

...

. .

.......

. . ..

..

.

....

...

.

.....

.

.

.

.

..... ..........

................

.

...

.

.

.

.

..

.

..

.

.

....................

.. . ..

19

. 20

.......

..

. 20

.......................... . .

..................................

.. . .

.

.... ...

........ ....... ....

......

.

. .. . ..

21

. 22

.. .................... ...

...... ..............................

.................

...... .....

.

.........

.

3.7. BAGAN RANCANGAN UJI PROTEKTIVITAS 3.9. PERSETUJUAN ETIK

..... ....... .

.....................

......

....

...........

..

3.6. BAGAN RANCANGAN PENGUKURAN S-lgA . 3.8. HIPOTESIS PENELIT IAN

........

.

. .

. ............ ...

..

. ..

.

........

.......................

........

...

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....

.....

.... ...........

.

.

......

.

...

.

....

.................

.

.

23 24 25

......

........

25

IV

IV. BAB IV HASI L PENELITIAN .........................................................................26 4. l .HASfL KONFIRMASI UJI ADHESI ..... ......................................... 28 4.2.HASIL PENGUKURAN s-lgA ....................................................... 29 4.3.HASIL UJI PROTEKTIVITAS .......................................................31 V. PEMBAHASAN .................................................................................................35 VI. KESIMPULAN DAN SARAN 6.1. KESIMPULAN . .. . . . 38 6.2. SARAN 38 ................................

..... . ............................

.............. ...

....

.........................................................................................................

UCAPAN TERIMA KASlll ......................................................................................39 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 40 LAMPIRA.N-LAMl>IRAN .. . . . . . . . . ..41 ............ .

.........

......

....

..........

.....................

...

.......

...

..

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Pili tipe I pada Bakteri gram negatif Gambar 2.2. Struktur T3SS

····

: · · · · · · · · · · · ·························· ········ · · · · · · · ·

7

................. . . . . . .......... . .......... . ... . .......... . . ... . . . . . . . . . . . .... . . ..... ... .. .. . .

8

Gambar 2.3. Efektor T3SS Shigella ................... ................ ............. ................. .............. 9 Gambar 2.4. Struktur s-lgA ... ............... .............. ............... .......... .......... ......... .............. ... 9 Gambar 2.5. Modulasi s-l gA pada Mencit dan Manusia

.

. . . . ......... . . . . . . . . .

.

...... . . . . . . . . . . . .

.

. !! . .

Gambar 4. 1 . Profit fraksinasi pili S.dysenteriae hasil elektroforesis SDS-PAGE . . ..... 17 Gambar 4.2. Protein pili BM 49,8 kDa S.dysenteriae hasil elektroforesis ........ . . . . . .. 1 8 Gambar 4.3. Adhesi bakteri terhadap sel enterosit

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ._. .

.

.

...............

.........

.

. .

19

Gambar 4.4. Kadar s-IgA usus halus mencit (ELISA) ................................................. 2 1 Gambar 4.5. Potongan usus halus mencit ..... ................ .. ......................................... ......22 Gambar 4.6. Berat usus mencit pada setiap 30 menit penimbangan .............................23 Gambar 4.7. Rata-rata hasil penimbangan usus mencit ......... .... ....................... ............ .24

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1. Kadar s-IgA pada masing-masing kelompok

. . . ......... ........................... . . . . . . .

19

Tabel 4.2. Hasil uji tukey s-lgA antar ke lompok perlakuan ........... ....................... ........20 Tabel4.3. Berat usus mencit pada masing-masing kelompok

.. . ... . .

..........

..

..

.

.

.

22

..... . . . . . . . . .

Tabel4.4. Hasil uji tukey berat usu s mencit antar kelompok perlakuan ........ ...............23

v ii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran I Pcrsetujuan Etik Penelitian Lampiran 2 Data Sheet Lampiran 3 Hasil Analisis Statistik Lampiran 4 Dokumentasi Penelitian Lampiran 5 Format Jumat

BAB I PENDAHULUAN

1.1.

LATAR BELAKANG PENELITIAN

Shigellosis (diare yang disebabkan oleh Shigella spp.) merupakan penyakit endemis yang terutama terjadi di negara berkembang dan penyebab tersering penyakit diare yang berdarah. Di seluruh dunia paling sedikit ditemukan 80 juta kasus diare dengan perdarahan. Dari angka tersebut diperkirakan 700.000 menyebabkan kematian. Kasus kematian tersebut yang terbanyak sekitar 60% diderita oleh anak dibawah usia lima tahun (WHO 2011). Di Indonesia, diare adalah penyebab ketiga morbiditas dan penyebab utama kematian bayi (Nazir et al. 1985).

Shigella dysenteriae merupakan bakteri yang menimbulkan disentri basiler, memiliki patogenesis yang sangat kompleks. Terdapat beberapa langkah utama untuk itu untuk mendapatkan patogenitasnya. Langkah awai dalam berkembangnya kolonisasi oleh Shigella dysenteriae adalah kemampuan mereka untuk melestarikan kedekatan dengan permukaan mukosa

dengan fimbriae atau pili, yang merupakan salah satu

kelompok utama adhesin bakteri (Fuchs, 1998). Tanpa langkah ini, tidak ada kolonisasi atau infeksi yang disebabkan oleh Shigella dysenteriae. Banyak protein adhesin telah terbukti menjadi hemaglutinin, yaitu

sebagai reseptor untuk adhesin dalam berbagai

jenis sel (terrnasuk enterosit) yang sifatnya sangat mirip dengan reseptor dalam eritrosit. Hasil penelitian kami sebelumnya menemukan bahwa molekul adhesin

Shigella dyseteriae pad a bagian pilinya merupakan

protein

yang

dapat

yang mempunyai berat molekul 7,9 kDa

menghambat

aglutinasi

erythrocyte

mencit

hila

direaksikan dengan asal protein yang sama dengan berat molekul yang berbeda yaitu

49,8 kDa. Protein 49,8 kDa ini adalah molekul hemaglutinin yang juga merupakan molekul adhesin Shigella dyseteriae (Avanita, 2011). Pemberian protein tersebut diharapkan mampu meningkatan respon imun humoral pada mukosa usus halus yaitu s­ lgA, sehingga menarik untuk dilakukan penelitian selanjutnya mengenai respon imun terutama daya proktektivitasnya dalam hal menghambat pengeluaran cairan ke lumen usus halus.

1

,

Dari hasil penelitian sebelumnya juga ditemukan bahwa pemberian susu kuda Sumbawa terfermentasi dapat meningkatkan imunitas protein adhesi sub unit pili be rat molekul 3 7,7 kDa Vcholerae 01 yang dikonjugasi dengan CTB apabila diberikan peroral mampu menginduksi respon mukosal dengan terbentuknya s-IgA secara bermakna

(Faisal, 20 l 0). Vaksin Shigellosis yang terak.hir diujicobakan adalah: Parenteral conjugate

vaccines yang berasa! dari hasil purifikasi Shigella lipopolysaccharide (LPS) yang

dikonjugasikan dengan

tetanus toxoid, recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin

A (Ps.-\) dan CRM9 mutant diphtheria toxin. Vaksin ini menunjukkan daya lindungnya sekitar

74% (WHO 2011). Jenis vaccine lain adalah live attenuated vaccines yaitu

substansi hidup dari strain Shigella yang telah dilemahkan yang mengekspresikan baik

S. jlexneri 2a dan 0-antigen S. sonnei telah dikembangkan sebagai vaksin. Setelah diujikan, daya proteksinya di China menunjukkan 61-65% untuk S.jlexneri 2a dan 5772%

untuk S. sonnei (WHO 2011). Kandidat vaksin

Shigella yang lain adalah: A

formalin-inactivated S sonnei vaccine (SsWC) yang dikembangkan dalam bentuk oral, tergolong jenis killed, whole-cell vaccine oleh Johns Hopkins University in Baltimore,

MD, USA, sampai phase I tetapi hasilnya belum ada Japoran (WHO, 2011). Caton vaksin untuk Shigellosis yang

ingin kami kembangkan

adalah

berbasis molekul adhesin. Berdasarkan hasil penelusuran pustaka diatas temyata masih belum ditemukan mengenai vaksin yang akan kami kembangkan tersebut, terutarna jenis vaksin yang dikonjugasikan dengan sub unit B shigatoxin.

1.2.

TUJUAN PENELITIAN a)

Membuktikan molekul adhesi S. dyseteriae 49,8 kDa dan 7,9 kDa terhadap adhesi S. dyseteriae pada enterosit mencit.

b) Mengetahui daya protektivitas molekul adhesin S. dyseteriae 49,8 kDa dan 7,9 kDa terhadap pengeluaran cairan ke lumen usus.

1.3.

MANFAAT PENELITIAN Penelitian ini diharapkan dapat memberikan kontribusi dalam pengembangan vaksin shigellosis yang aman dan efektif bagi manusia.

2

,

BABII TINJAUAN PUSTAKA

2.1

SHIGELLOSIS

Shigellosis adalah infeksi intestinal akut, disebabkan oleh bakteri Shigella dengan gejala dari diare ringan sampai dengan disenlri basiler inflamasi beral

yang

dikarakteristikkan oleh kram perut, panas, dan tinja yang mengandung lendir dan darah (Schroeder and Hilbi. 2008) Shigellosis merupakan penyakit endemik terutama di Negara berkembang dan yang paling penting merupakan diare berdarah di seluruh dunia. Hal ini diperkirakan menyebabkan setidaknya 80 juta kasus d iare berdarah dan 700.000 kematian tiap tahun. 99% infeksi disebabkan oleh Shigella yang sebagian besar kasus (-70%) terjadi d i negara berkembang, dan (-60%) kematian terjadi pada anak-anak berusia kurang dari 5 tahun. Mungkin kurang dari satu persen kasus diobati di Rumah Sakit (WHO, 2005). Sekitar I , I juta penduduk diperkirakan meninggal akibat infeksi shigella tiap tahunnya, dengan 60% kematian terjadi pada anak-anak dibawah usia 5 tahun. Bahkan sekitar 500.000 kasus shigellosis dilaporkan tiap tahun pada personil m i liter dan pelancong dari Negara industri (WHO 2009) Shigella adalah bakteri gram negatif, non-motile, fakultatif intraseluler, anggota family Enterobacteriaceae. Genus Shigella terdiri dari empat spesies: Shigella

dysenteriae (S.dysenteriae}, Shigella jlexneri (Sjlexneri), Shigella boydii (S.boydii), dan Shigella sonei (S.sonei), juga disebut sebaga group A, B, C, dan D. Tiga spesies pertama masuk dalam multiple serotype. S.sonei dan S.boydii biasanya menyebabkan penyakit yang relatif ringan yaitu terjadi diare yang mengandung air dan darah. Sjlexneri merupakan penyebab utama endemik shigellosis di negara berkembang

(WHO, 2005). Shigella memproduksi 3 enterotoksin : (i) Shigella enterotoksin

I

(SHET I ) yang terdapat pada Shigella Flexneri 2a (Yauzori et a/, 2002; Niyogi, 2004), (ii)Shigella enterotoksin 2 (SHET2) yang berlokasi d i plasmid yang berhubungan dengan virulensi Shigella, (iii) Shiga toksin yang dikeluarkan oleh S.dysenteriae. S.dysenteriae serotipe 1 (Sd

I), juga disebut basil Shiga, berbeda dari Shigella lainnya 3

dalam empat hal yaitu : mcmproduksi sitotoksin (Shiga Toksin); dapat menyebabkan penyakit lebih berat, lebih lama dan sering fatal daripada yang diakibatkan oleh Shigella lainnya; resisten pada antirnikroba leb.ih sering terjadi daripada Shigella lainnya; dapat menyebar luas, sering regional, epidemik, dengan angka serangan dan angka kasus fatal yang tinggi (Sansonetti, 2001; Philpott, 2000; WHO, 2005). Shiga

toksin

bersifat

neurotoksik,

sitotoksik

dan

enterotoksik

yang

struktumya mirip Shiga-like wxin enterohemoragi infeksi E.coli. Efek dari Shiga toksin tersebut adalah sebagai berikut : (i) Efek enterotoksik, Shiga toksin adhesi ke reseptor usus halus dan menghambat penyerapan elektro!it, glukosa dan asam amino dari lumen usus (ii) Efek sitotoksik. Sub Unit B Shiga toksin mengikat glikolipid sel hospes pada usus besar, domain menyebabkan

A dan intemalisasi melalui endositosis yang dimediasi reseptor dan

inaktivasi

irreversibel

menghambat sintesis protein.

dari

sub

unit

ribosomal

60S,

yang

Proses tersebut rnengakibatkan kematian

sel

dapat dan

kerusakan mikrovaskuler dan perdarahan usus (terdapat darah dan leukosit dalam feses) (iii) Efek neurotoksik, mengakibtakan gejala panas dan krarn abdomen (Niyogi, 2005). 8 6 Tinja diare rnengandung I 0 - I 0 Shigella per gram. Sekali diekskresikan, organism ini sangat sensitif pada kondisi lingkungan dan akan segera mati, k.hususnya ketika kekeringan atau terpapar sinar matahari

langsung (WHO, 2005). Shigella

resisten pada pH rendah, sehingga dapat melewati barier lambung,oleh karena itu dengan sedikit inokulasi (sedikitnya I 00 CFU) cukup untuk menyebabkan infeksi (Longo and Fauci, 20 I 0). Manifestasi klinis Shigellosis digambarkan dengan inflamasi akut diare berdarah, yang dikarak.-teristikkan sebagai sindrorna disentri dengan tiga tanda klinis yaitu kram abdomen, nyeri saat defekasi (tenesmus), dan defekasi dengan frekuensi sering, volume sedikit terdapat lendir dan darah. Penyakit biasanya diawali dengan panas dan manifestasi sistemik seperti malaise, anoreksia, kadang-kadang myalgia (Niyogi, 2005).

2.2

PATOGENESIS SHIGELLOSIS Infeksi diawali oleh masuknya Shigella melalui kontaminasi oral-fekal dan

melalui makanan dan minuman yang terkontaminasi (Todar, 201 1). Masa inkubasi 1-3 hari, dapat I minggu untuk S.dysenteriae type l (WHO, 2006). Shigella secara genetik

4

,

bertahan terhadap perubahan pH yang rendah, sehingga dapat melewati barrier asam lam bung. Setelah melewati asam lam bung, bakteri akan berkembang biak di usus hatus. Oleh karena itu pada awal gejala akan terjadi diare, kemungkinan ditimbulkan oleh cnterotoksin dan atau sitotoksin saat melewati usus halus (Hale and Keusch,

1996).

Akan tetapi tempat utama yang akan diserang shigella adalah kolon, dimana bakteri akan menginvasi sel mukosa usus sehingga menimbulkan manifestasi klinis shigellosis (Tortora,

20 I 0). Patogenesis shigella merupakan mekanisme yang komplek, melibatkan

enterotoksik dan sitotoksik yang berperan dalam terjadinya diare, sitokin yang berperan dalam proses inflamasi usus serta nekrosis pada epitelium kolon. Pada tingkat seluler, invasi dan penyebaran infeksi dapat dibagi dalam empat tahap yaitu (i) invasi sel; (ii) multiplikasi

intraseluler;

penghancuran

sel

inang

(iii)

Penyebaran

(Sansonetti,

intraseluler

2001).

dan

Mekanisme

interseluler dan m1

tergantung

(iv) pada

kemampuan adhesi bakteri terhadap sel dan kemampuan bakteri metintasi mukosa kolOn melalui set M. Kemampuan bakteri melintasi mukosa kolon dan berkolonisasi di epitel usus adalah kunci penyakit ini. Sebagian besar pengetahuan terkini mengenai mekanisme patogenesis Shigella berasal dari penelitian Shigella flexneri (Sansonetti,

2004).

2.2.1

Inisiasi

Shigella

pada sel

ep itel

Kemampuan bal-.1:eri pathogen adhesi ke sel hospes merupakan tangkah yang penting dalam terjadinya infeksi. Salah satu otganel bakteri untuk adhesi adatah pili/fimbra. Pili adalah organel seperti rambut/serabut, kaku, lurus yang melekat pada permukaan bakteri, dengan diameter pili antara 4-7nm dan panjang

0,2-20 nm. Satu

bakteri biasanya terdiri dari beberapa ratus hingga ribuan pili (An and Friedman, Cerda and Cossart,

2000;

2006).

Struktur utama pili disebut "fimbriae rod" atau "pilus shaft'' dengan berat molekul

15 -25 kDa. Pili dikode oleh kelompok gen fim (fimA-fimH) (Cerda dan

Cossart,

2006). Fimbriae rod dihubungkan metalui FimF ke tip jibrillum s ebuah

batang pendek tinier dengan Iebar 3 nm yang terdiri dari FimG dan adhesion spesifik FimH (Jones et al,

1 995; Hahn et a!, 2002). Shigella adhesi ke usus besar set hospes 5

membuat bakteri ini mampu untuk kolonisasi dan mcncegah klirens dari pergerakan usus. lkatan yang spesiftk ke sel hospes diperankan oleh adhesi spesiftk FimH pada ujung struktur pili (Gambar 2.1 ). Pili tipe I ditemukan pada £.coli dan juga family enterobactericeae salah satunya adalah Shigella. Pili I dikarakteristikkan oleh kemampuannya mengaglutinasi eritrosit (Clegg and Gerlach, 1987; Duguid dan Campbell, 1968; Snellings et al, 1 997). Hemaglutinin merupakan protein adhesion ubiquitous dengan perlengkapan adhesi dan aglutinasi sel, yang telah diketahui berperan penting dalam inisiasi dan perkembangan gejala klinis dan komplikasi Shigellosis (Gbarah et al, 1993; Snelling et al, 1997; lwalokun, 2003). Hemaglutinin atau adhesin dapat dideteksi dengan melihat adanya penggumpalan eritrosit atau fimbrae bak.'teri, dan bakteri S.dysenteriae dilaporkan mempunyai sifat hemaglutinin (Guhathakurta et a!, 1996). Penelitian yang dilakukan oleh Prabowo, 201 1 menyatakan bahwa protein

pili S.dysenteriae dengan berat molekul 49,8 kDa telah diketahui memiliki sifat hemaglutinin yang dapat berfungsi sebagai molekul adhesin. Protein tersebut juga telah dibuktikan mampu menghambat adhesi S.dysenteriae ke enterosit

mencit dengan

konsentrasi protein lOOJlg (Prabowo, 201 1).

6

(J �

n·; t

. . .· · .··. · .. " � �

' : •. J. \"' ,-- .

...

. ..

:-M· :•"'"f-

tip fib
OM

�$;); �IM

Gambar 2.1 Pili tipe I pada bakteri gram negatif. Struktur pili tersusun ataspillus rod yang terdiri dari polimerisasi subunit FimA (kuning) dan tipfibrillum dengan FimF (abu-abu), FimG (hijau) dan ujung adhesin FimH (merah) (Proft et

al, 2009).

2.2.2

Mekanisme invasi Shigella ke dalam sel epitel Shigella di lumen dapat invasi ke epitel kolon melalui tiga mekanisme: (i)

Shigella dapat memanipulasi protein tight junction yang diekspresikan oleh sel epitel, mengakibatkan pergerakan paraseluler bakteri kedalam sub mukosa, (ii) Set PMN mengaktivasi diproduksinya

IL-8 dan IL- l P yang mengakibatkan adanya celah antar

set epitel, sehingga shigella dapat masuk ke sub mukosa, (iii) Bakteri masuk melalui sel M dengan mekanisme endositosis (Jennison dan Verma,

2004). Dari ketiga mekanisme

tersebut, bakteri masuk melalui set M adalah yang paling efektif (Sansoneti, 2001). Patogenesis Shigella ditentukan oleh virulensi plasmid

2 1 4 kb berisikan

-100 gen (Sansonetti, 2001; Longo and Fauci, 201 0). Pada �egio 3 1 kb dari plasmid tersebut diketahui berfungsi untuk mengkode protein-protein untuk invasi.

·

shigella yang penting

25 gen diantaranya menyandikan type III secretion system (T3SS) yang

masuk ke dalam membran set hospes untuk mensekresikan efektornya dari sitoplasma bakteri ke sitoplasma set hospes (Longo and Fauci,

2010).

Berdasarkan fungsinya gen-gen tersebut dibagi dalam empat kelompok : (i) Kelompok terdiri dari protein yang disekresi oleh T3SS bertindak sebagai efektor

7

,

yang memanipulasi sel hospes {lpaA, IpaB, IpaC, dan !paD). Fungsi efektor tersebut adalah berperan dalam invasi ke sel hospes, bertahan hidup di intraseluler, juga mengontrol sekresi dan translokasi protein efektor yang Jain ke dalam sel hospes, (ii) Gen yang mengkode komponen T3SS. Gen tersebut adalah membran expression /pa (mxi) dan surface presentation /pa (spa), (iii) Gen VirB merupakan gen yang mengkode protein untuk gen mxi, Spa, dan lpa, (iv) Gen yang mengkode chaperon (ipgA, lpgC, lpgE dan Spal5). Chaperon tersebut menstabilkan substrat T3SS pada sitoplasma bakteri (Sasakawa, 20 I 0). T3SS mensekresikan protein

lpaB dan IpaC

yang akan melubangi membran sitoplasma sel epitel (Gambar 2.2). IpaB berinteraksi

dengan

CD44 dan o.5�1

integrin, sedangkan

lpaC

berinteraksi dengan o.5�1 integrin. Kedua efektor tersebut bersama-sama menginduksi cascade sinyal seluler yang menghasilkan polimerisasi aktin dan intemalisasi bakteri Shigella (Gambar 2.3) (Reis, 2010; Sasakawa, 2010).

�

Target eel[

-

. · �� ""'"--. - · • Shigellac.. ·

.

··

··

. · . ... · ·. � . ··· .·

Gamba r 2.2 Struktur T3SS. T3SS terdiri dari 4 bagian utama. Basal body atau basis tersusun atas tujuh cincin yang melingkari, inner membran (IM), periplasma dan outer membran (OM) bakteri. Jarum berongga menonjol keluar dari basal body ke permukaan bakteri. Kontak dengan membran sel hospes (HM) memicu lpaD insersi ke membran yang dibantu translocon lpaB-IpaC pada ujung jarum. T3SS dilengkapi oleh cincin C sitoplasma, yang terdiri dari protein yang memberi energi untuk proses transportasi, pengaturan pengeluaran substrat dan pengeluaran chaperon (Schroeder and Hilbi,2008).

8

Gambar 2.3 Efektor T3SS Shigella pada sci bospes. Efektor yang disekresi Mxi-Spa Shigella yaitu lpaC, lpgB 1 dan VirA menginduksi Rac/Cdc42dependent actin polymerization dan membentuk membrane rujjles. IpaB berikatan dengan reseptor CD44 dan aktivitas IpgB2 juga memicu remodelling sitoskeleton membrane ruffling. PIP2 lpgD meningkatkan diskoneksi aktin sitoskeleton dari membran sitoplasma, kemudian memfasilitasi reorganisasi struktur tempat masuk. lpaA memediasi depolimerisasi aktin, yang diperlukan untuk menutup fagosit PIP2, phosphatidylinositol-4,5-biphosphate; PIP, phosphatidylinositol-5-phosphate (Schroeder and Hilbi,2008).

2.3

SlgA SEBAGAI IMUNITAS MUKOSA Peran penting dari mukosa adalah memproduksi antibodi yang disebut

Secretory

Immunoglobullin A (SlgA). SlgA berperan dalam perlindungan utama pada

mukosa terhadap mikroorganisme patogen (Brandtzaeg, 2007; Boullier SigA terdiri dari 2 unit lgA dan 2 polipeptida, J chain dan

Secretory

et

al, 2009).

Componen (SC)

(Kaetzel, 2007) (Gambar 2.4).

Gambar 2.4 Struktur SigA SlgA merupakan molekul yang stabil oleh karena berbentuk dimer/polimer (polymeric IgAiplgA) dan diikat oleh J chain (Johansen et a!, 2000). Transport plgA ke permukaan mukosa berikatan dengan Polymeric /g Receptor (plgR) yang diekspresikan oleh set epitel pada membran basolateral (Kaetzel, 2005). SigA dilepaskan pada permukaan mukosa berikatan dengan SC (Phalipon et a/, 2002).

9

•

Pada model tikus modulasi respon imun IgA di intestinal dimulai dengan bakteri masuk melalui sel M pada sel epitel dengan mekanisme endositosis kemudian ditangkap oleh Dendritic Cells (DCs) yang ada di subepithelial dome patch Peyer. DCs migrasi ke lnterfolikular Region (IFR) Patch Peyer untuk mempresentasikan antigen ke sel T CD4. Sel T CD4 yang teraktivasi oleh antigen tersebut melepaskan IgA class switcing oleh stimulasi lgM dan IgD sel B oleh aktivasi CD40L dan TGF. Adanya retinoic acid

(R.:\)

menyebabkan lgA sel B mengekspresikan CCR9 dan a.4P7 dan

kemudian m igrasi ke lamina propria, dimana terjadi diferensiasi dalam sel plasma yang melepas antibodi lgA dimer (plgA) (Cerruti, 2008). plgA kemudian berikatan dengan plgR. (disebut juga membran Secretory ComponenlmSC), selanjutnya lgA dilepaskan kedalam lumen dalam bentuk SigA (Corthesy, 2007). IgA juga dapat dimodulasi melalui T-cell dependent pathway untuk bakteri patogen dan toksin yang rnenghasilkan IgA innate dan T-cell independent pathway untuk bakteri kornensal. Pada manusia mekanisme modulasi SlgA tidak jauh dari rnekanisme pada model tikus. Setelah CD4 sel T melepaskan IgAI class switching oleh aktivasi lgM, IgD sel B di Patch Peyer melalui CD40L dan TGF�. lgA I sel B tersebut kemudian migrasi ke lamina propria melalui mekanisme yang mirip dengan pada tikus. Pada lamina propria, IgAl sel B switch ke lgA2 akibat respon a proliferation-inducing ligand (APRIL) epitel.

DCs

dan IL-10 yang di!epaskan oleh Toll-like receptors (TLRs) di sel

juga

dapat

melepaskan

sitokin

dalam

merespon

thymic

stromal

lymphopoietin (TSLP) yang diproduksi oleh sel epitel. Pada lamina propria, IgM, IgD sel dapat Iangsung switching dari IgM ke lgA1/IgA2 akibat respon dari B cell­ activating facwr of the TNF family (BAFF), APRIL dan IL-l 0. lgA2 lebih resisten terhadap protease bakteri daripada lgA 1 dan memiliki waktu paruh lebih panjang pada lumen usus distal (Cerruti dan Rescigno, 2008). Mekanisme modulasi lgA pada intestinal dapat dilihat pada Gambar 2.5.

10

•

,

Gambar 2.5

Modulasi IgA pada intestinal mencit (kiri) dan manusia (kanan)(Ceruti and Rescigno, 2008)

Tujuan utama SlgA adalah bersama-sama dengan

mekanisme pertahanan

mukosa innate untuk menghambat kolonisasi dan invasi patogen (Everett et al,

2004).

Mekanisme SlgA dalam pertahanan mukosa dengan cara mencegah adhesi bakteri ke permukaan mukosa dan selanjutnya akan dikeluarkan dengan pergerakan mukosiliar dan peristaltik yang disebut immune exclution (Ogra,

2005; Due, 2009).

SigA yang telah diproduksi oleh sel plasma dalam bentuk plgA dan ditransport ke lumen oleh plgR (mSC). Reseptor yang tidak berikatan dengan lgA disebut f-SC (free seretory componen) sedangkan yang terikat IgA disebut SlgA

(Secretory lmunoglobulin A). Antibodi sekretori yang bekerja pada garis pertahanan pertama dengan cara mengeluarkan antigen ke permukaan mukosa (immune exclution). Antigen yang menembus barier epitel akan diikat oleh IgG serum di lamina propria yang membentuk komplek imun. Komplek imun tersebut kemudian mengaktivasi komplemen,.

yang

menghasilkan

pengeluaran

mediator

inflamasi

sehingga

menyebabkan dikeluarkannya lebih banyak IgG. Pada saat terjadi inflamasi, normalnya dapat dihambat oleh antibodi di lamina propria baik yang berasal dari serum ataupun IgA yang diproduksi secara lokal dan antiinflamasi set T reg. Kornplek IgA juga dapat menghambat pelepasan mediator proinflamasi ('INFa) dari aktivitas sel fagosit seperti makrofag, sehingga antigen yang berikatan dengan plgA menjadi tidak menyebabkan inflamasi (Brandtzaeg, 2010).

11

2.4

AJUVAN MUKOSAL Ajuvan adalah substansi yang dapat merangsang respon imun lebih besar

dari pada antigen diberikan sendiri . Peran ajuvan dalam pengembangan vaksin adalah : (i) meningkatkan titer antibodi total, (ii) menurunkan dosis antigen yang diperlukan, (iii) mengatasi persaingan pada vaksin kombinasi, (iv) meningkatkan respon imun pada usia muda maupun tua, (v) meningkatkan kecepatan dan durasi respon protektif yang spesifik dari vaksin, (vi) menginduksi potensi imunitas seluler, (vii) menginduksi imunitas mukosa, (viii) menginduk.si respon imun yang lebih luas (cross-protection) (Dekker et al, 2008) Ajuvan mukosal ada beberapa jenis, diantaranya adalah non living mucosal

delivery system

dan inert vaccine delivery system. CTB (Cholera Toxin B), LTB

(Labile Toxin B) dari Escherichia coli ada lah contoh non living mucosal delivery system untuk protein antigen yang diberikan secara oral, intranasal dan parenteral. CTB dan LTB merupakan aj uvan mukosal yang paten, karena memiliki reseptor pada usus (Elson and Dertzbaugh, 1999). Mekanlsme ajuvan CTB masih belurnjelas, tetapi berhubungan dengan; (i) meningkatkan pengambilan

permiabilitas antigen,

epitel

intestinal

yang

menyebabkan

(ii) meningkatkan presentasi antigen

peningkatan

berbagai APC,

(iii)

meningkatkan diferensiasi isotipe sel B yang menyebabkan peningkatan pembentukan lgA, dan (iv) mencegah efek proliferasi sel T dim produksi sitokin (Sanchez and Holmgren, 201 1). Aj uvan

CTB

dapat

menginduksi

imunitas mukosal

dibuktikan

oleh

Tokuhara et a/ (201 0), dengan pemberian imunisasi Mucorice yang dikonjugasi CTB secara oral terbukti dapat meningkatkan SigA yang protektifterhadap diare oleh Vibrio cholera dan Enterotoxigenic Echerechia coli (ETEC). Faisal (2010) juga membuktikan bahwa dengan pemberian susu kuda sumbawa terfermentasi dan protein adhesi 37,8 kDa Vibrio cholera 0 I yang dikonjugasi CTB secara oral dapat meningkatkan respon imun SlgA yang signifikan melindungi dan mencegah sekresi cairan intestinal mencit. Ajuvan yang termasuk inert vaccine delivery system adalah carboxymethyl

cellulose (CMC), mikropartikel, liposom dan matriks ISCOM. ajuvan golongan inert vaccine delivery yang membuat antigen terlarut dalam bentuk partikel. Antigen partikel lebih efektif sebagai imunogen oral dikarenakan (i) lebih tahan terhadap pengaruh pH

12

•

di lambung, asam empedu dan enzim proteolitik di saluran cema, (ii) partikel diabsorbsi melalui sel M ke dalam Peyer Palches lebih efisien, sehingga menghasilkan konsentrasi antigen yang tinggi di tempat tersebut (iii) tidak mcnimbulkan toleransi mukosal (McGhee, 1999). Sehingga dengan pemberian antigen yang dikonj ugasi ISCOM dapat melindungi antigen

dari degradasi dalam

traktus gastrointestinal,

disamping itu ISCOM mengandung saponin yang dapat meningkatkan efektifitas vaksin oral melalui peningkatan penniabilitas mukosa usus (Mowat, 200 1 ; Cheeke, 1998; Winarsih, 2005). ISCOM merupakan partikel berbasis lemak dengan diameter 30-40 yang mengandung

imunostimulator glikosid

dari

tumbuhan

nrn

Quillaja saponaria

(QuilA). Imunostimulator alami ISCOM dapat dimanfaatkan dengan penggabungan antigen vaksin untuk meningkatkan respon sel T dan penangkapan antigen oleh APCs. Aktivitas ajuvan mukosal ISCOM dengan antigen sebagai vaksin telah dievaluasi kemampuatmya dalam menginduksi respon imun seluler dan antibodi dengan hasil yang menjanjikan ( Ogra et a!, 200 1 ; Giri and Khuller, 200&) Beberapa penelitian telah membuktikan juga bahwa penggunaan aj uvan ISCOM dapat menginduksi imunitas mukosal yang sama dengan CTB. Hal tersebut dibuktikan oleh Pandey & Dixit (2010), dengan pemberian imunisasi HbsAg yang dikonjugasi ISCOM secara subcutan dapat meningkatkan respon imunitas seluler (peningkatan level sitokin limpa), dan pemberian HbsAg yang dikonjugasi ISCOM secara intranasal temyata signifikan meningkatkan respon imun SlgA pada sekresi mukosa. Winarsih (2005) juga telah membuktikan bahwa dengan pemberian Adh036 yang dikonjugasi ISCOM yang d iimunisasikan per oral juga terbukti signifikan meningkatkan SlgA usus halus yang protektif terhadap invasi bakteri Salmonella typhi usus halus.

13

•

,

Hipotesis Penelitian

a) Prote in pili S. dyseteriae 49,8 kDa dan 7,9 kDa adalah molekul adhesin b) Protein pili

S.

dyseteriae

49,8 kDa dan

7,9

kDadapat menghambat

pengeluaran cairan ke lumen usus melalui peningkatan respon imun s-IgA

B.-\B III

METODE PENELITIAN

3.1.

DESAIN PENEL ITIAN Desain

yang

digunakan

da!am

penelitian

ini

adalah

eksperimental

laboratorium. Penelitian bertujuan untuk membuktikan protein sub unit pili Shigella dysenteriae

dengan berat molekul 49,8 kDa dan 7.9 kDa adalah protein adhesi, untuk

mengetahui daya proteh.-tifitas protein sub unit pili Shigella dysenteriae dengan berat molekul 49,8 kDa dan 7,9 kDa terhadap pengel uaran cairan ke lumen usus.

3. l . l . Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini di laksanakan pada bulan Februari 2012 sampai Desember 20 1 2 di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya malang, Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran dan laboratorium B iologi Molekuler Fakultas MIPA Universitas Brawijaya Malang.

3.1.2.

Bahan dan Alat Penctitian

1) Bakteri Shigella dysenteriae 2) Medium pembiakan bakteri: Carbonate Glutamate

(TCG)

medium

Mc.Conkey, medium

Thiaproline

agar, Bismuth sulfite agar (BSA) dan Brain

Heart Infusion (BHI) broth.

3) Hewan coba: mencit galur Balb/C jantan usia 6-8 minggu dengan berat badan

±25 g

4) Reagen Kimia: a. TCA (Trichloroacetic acid), ammonium sulfat, NaCitrat, EDTA (Ethylene diamine tetra-acetatic acid), EGTA _(Ethylene glycol tetra-acetic acid), dithitreitol, NaCL, Na2HP04, KH2P04, ethanol, acrylamid, bis acrylamid, glisin, tris-HCL, tris base, SDS, temed, ammonium persulfat, commassie blue, methanol, asam asetat glacial, gliserol, brompenol, brompenol blue, Tween 20. b. Protease inhibitor: protease inhibitor cocktail c. Adjuvant: Cholera toxin B (S igma Ultra), Freund's complete adjuvant

14

•

,

d.

RPMI ( Roswell Pack Medium Institute)

e.

ELISA kit

5) Alat-alat: a.

Lempeng mikrototer bentuk U dan bentuk V, membrane dialysis, membrane elcktroelusi, tips, tabung sentrifus 1 , 5 ml

(eppendorf),

I S ml, pi pet mikro

5

- 2 0 111, 50 - 200 f1[, 200 - 1000 J.d, jarum suntik. b.

Alat-alat gelas

c.

Omni-mixer modifikasi, magnetic stirrer. incub210r. otoklaf, ELISA reader, pili cutter, alat untuk melil itkan usus saat uji protek.-rifitas (Desain Sumamo)

3.1.3.

Metode Kultur dan Metode lsolasi

3.1.3.1. Metode Kultur Shigella dysenteriae Bakteri

yang

digunakan

adaiah

Shigella

dyseteriae.

Medium

yang

digunakan adalah TCG yang dapat memperkaya pertumbuhan pili S. dysentriae. Medium ini mengandung 0,02% thioproline; 0,3% NaHC03; 0,1% mono sodium 1-

glutamat, I % baktotryptone; 0,2% yeast extract; 0,5% NaCI; 2% bacto agar dan l mM {)-amino ethyl ether -N,N,N"n",-tetra acid (EGT A) (Ehara et a/. , 1988) . Medium dibuat dengan memakai dalam botol ukuran 250 ml yang dibuat secara miring banyaknya I 5 botol. Dalam setiap botol tersebut akan diisi medium TCG yang masing­ masing sebanyak 50 mi. S. dysentriae yang dipilih tersebut diatas biakan pada cawan petri yang mengandung media Mc.Conkey yang diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Hasil biakan pada media Mc.Conkey tersebut dipanen dengan menggunakan kerokan kemudian dimasukkan dalam botol yang mengandung I 000 ml larutan brain

heart infusion broth (BHI). Botol kemudian dikocok kuat selama 30 menit pada penangas air dengan suhu 37°C. Selanjutnya dari botol tersebut suspensi bakteri sebanyak

I 0 ml dimasukkan dalam masing-masing botol yang telah mengandung

medium TCG dan kemudian akhimya media TCG tersebut di lakukan inkubasi pada suhu 37°C selama 2x24 jam.

3.1.3.2. Metode lsolasi Pili S. dyseteriae Isolasi yang akan dikerjakan merujuk seperti penelitian Ehara ( I 988). Pili yang dipanen dan yang akan dikoleksi berasal dari biakan bakteri yang tumbuh pada

15

•

,

setiap botol medium TCG yang telah di inkubasi. Hasil koleksi bakteri di kumpulkan dalam satu botol steril yang kemudian di tambahkan tricloracetic acid (TCA) sampai konsentrasinya mencapai 3%. Setelah dikocok rata rnaka koleksi bakteri diletakkan pada

suhu

kamar

selama

1

jam.

Selanjutnya

dilakukan

sentrifugasi

dengan

menggunakan kecepatan sebcsar 6.000 rpm selama 30 rnenit pada suhu 4°C. Pellet hasil sentrifugasi diambil dan disuspensikan rnernakai cairan PBS pH 7,4 dengan berbandingan

I : I 0. suspensi bakteri tersebut dicukur dengan menggunakan

pili cutter desain Sumamo (2000) yang dibuat oleh laboratorium politeknik Universitas Brawijaya Malang. Kecepatan mencukur bakteri 5000 rpm selama 30 detik pada potongan ke-satu. Sedangkan potongan ke-dua dan sctrusnya deng:an kecepatan 1 0.000 rpm selama

I menit dan masing-masing hasil cukuran dilakukan sentrifugasi selama 30

menit dengan kecepatan 12.000 rpm mernakai suhu 4°C. Supematans hasil sentrifugasi yang mengandung bagian pili bakteri di simpan pada suhu 4°C, sedangkan pada bagian endapannya ditambahkan cairan PBS pH 7,4 dengan jumlah volume yang sama seperti tersebut di atas. Cara isolasi bagian pili bakteri yang masih ada pada bagian endapan ini dikerjakan dengan cara perband ingan yang sarna sepcrti diatas dan akan diakhiri apabila pada isolasi bagian supematannya kelihatan bening dengan menggunakan cairan PBS pH 7,4 sebagai cairan pembanding.

3. 1.3.3.

Metode Isolasi Protein Pili S.dysenteri ae

Petunjuk isolasi protein hernaglutinin pili seperti Ehara dengan modifikasi (Sumamo dkk. ,

1991 dan Winarsih dkk., 1 998). Hasil koleksi pili tersebut dilakukan

elektroforesis dengan menggunakan metode SDS-PAGE. Hasil elek'troforesis yang terbentuk gel dipotong tegak lurus sehingga tiap potongnya akan mengandung tiga pita protein. Hasil potongan pita tersebut diatas dikumpulkan yang kemudian dimasukkan ke da!am tabung membrane dianalisis memakai cairan penyangga elektroforesis running

buffer.

Selanjutnya

dilakukan elektroelition

menggunakan elektroforesis

horizontal apparatus at iran listrik 120 rnV selama 90 men it. Hasil dari elektroelusi kemudian dilakukan dialisis dengan cairan penyangga PBS pH 7,4 sebanyak 2 liter selama 2x24 jam. Cairan dianalisis diganti sebanyak tiga kali.

16

3.1 .3.4.

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamid Gel E/ectrophorosis (SDS-PAGE)

Monitoring berat molek ul molekul dikerjakan dengan SDS-PAGE metode Laemli, ( 1970). Sample protein dipanaskan I 00°C selama 5 menit dalam larutan penyangga yang mengandung 5 mM Tris pH 6,8; 5% 2-mercapto elhanol; 2,5% w/v sodium dodecyl sulfate, I 0% vlv glycerol dengan menggunakan warna pelacak bromophenol blue. Dipilih I 2,5 mini slab gel dengan tracking gel 4%. Voltase aliran listrik yang digunakan adalah I20 m V. Sebagai bahan wama yang digunakan adalah coomassie brilliant blue dan molekul standar sigma lo11· range marker. Setelah dilakukan perhitungan berat molekul maka dilakukan perbanyak an protein dengan berat molekul 49,8 kDa dan 7,9 kDa molekul kemudian dilakukan permumian protein yaitu elektro elusi.

3.1.3.5.

Prosedur Penggabungan Protein adbesi (49,8 kDa dan 7,9 kDa +

Iscom )

Imunisasi protein pili Shigella dysenteriae 49,8 k.Da I 00!1g/100J.ll dan 7,9 k.Da 1OOf..l g/1 OOJ.tl dikonjugasi dengan ISCOM 12!1g/25 J.ll sebagai adjuvan.

3.1.3.6.

Uji adhesi

b akt er i terbadap ent erosit

Shigella dysenteriae ditumbuhkan dalam BHI broth selama 24 jam pada 37°C dipanen dan disuspensikan dalam PBS yang mengandung I % BSA sampai 8 konsentrasi sekitar l 0 / mi. Seratus mikroliter dari suspensi bakteri dicampur dengan I 00 mi suspensi dari 106 enterosit mencit per ml dalam PBS yang mengandung I % BSA. Campuran dibiarkan untuk dii nkubasi pada 3rC selama 30 menit goyang dengan Jembut, selanjutnya bakteri yang tidak adhesi (melekat) dibuang melalui pencucian berul ang dengan PBS yang mengandung l % BSA. Enterosit dikumpulkan dengan sentrifugasi 1500 rpm selama 2 menit dan disuspensikan dalam 300 mikroiiter PBS. Ekstrak 20 mikroliter dari suspensi dan letak kan pada slide kaca membentuk sebuah smear. Smear diwamai dengan Gram dan indeks adhesi dihitung dengan pengamatan mik roskopis (Kobayashi et a! 1993.).

3.1.3.7. Metode Preparasi Mukus

Preparasi mukus adal ah sebagai berikut: potongan usus dicuci dengan PBS dingin yang mengandung protease inhibitor (25 11g/ml inhibitor cocktail) dan I ,0 mM 17

EDTA. Kemudian usus dibuka sehingga terlihat bagian mukosa usus hal us. Lapisan mukus diambil dengan cara scraping secara longitudinal menggunakan spate! dan ditampung didalam tabung yang berisi PBS steril dan protease inhibitor. Suspensi

12,000 rpm pada 4°C selama 10 menit. Supematan

dikocok, kemudian disentrifus diambil

dilakukan

pemumian,

disuspensi

dengan

PBS

dan

dilakukan

dialisis

menggunakan PBS dan digunakan sebagai sample untuk pemeriksaan s-IgA dengan metode ELISA (Hernandez

et a!., dalam Santoso., 2002).

3.1.4. Bahan imunisasi Bahan terdiri atas Iscom, molekul adhesi subunit pili berat molekul 7,9 kDa dan 49,8 + lscom yang diberikan secara perorai pada mencit Balb/c.

3.1.5. Metode Pemberiao Imunisasi Imunisasi diberikan

secara oral pada mencit dengan menggunakan sonde.

Imunisasi diberikan 3 kali pada hari ke-0, 7 dan 28.

3.2.

RANCANGAN PENELITIAN Dalam penelitian

ini menggunakan hewan coba mencit Balb/c, yang

diberikan imunisasi secara oral berupa molekul adhesi subunit pili dan Iscom. Dasar pemakaian mencit Balb/c karena mencit Balb/c memiliki komponen mirip manusia

sistem imun yang

(Clark, 1 983). Sedangkan penggunaan Iscom sebagai adjuvant karena

Iscom memiliki reseptor pada usus dan merupakan adjuvant mukosal yang poteu (Elson, 1 996). Kelompok perlakuan di bagi atas 4 kelompok dengan 5 .mencit tiap perlakuan. Dengan demikian semua mencit yang digunakan dalam percobaan ini berjumlah a.

24 ekor mencit, yaitu:

Kelompok A Merupakan kelompok yang tidak dikenai perlakuan atau sebagai kontrol.

b.

Kelompok B

18

,

Merupakan kelompok yang dikenai perlakuan vaitu pemberian vaksin p.-otein molekul adhesi dengan berat molekul 49,8 k.Da dari sub unit pili S dysenteriae + Iscom c. Kelompok C Merupakan kelompok yang dikenai perlakuan yaitu pernberian vaksin protein molekul adhesi dengan berat molekul 7,9 kDa dari sub unit pili S dysenteriae + Iscom d. Kelompok D Merupakan kelompok yang dikenai perlakuan yaitu pemberian vaksin protein molekul adhesi subunit pili berat molekul 49,8 k.Da dan 7,9 kDa S dysenteriae

..,..

lscom.

Setelah selesai pemberian imunisasi, pada minggu berikutnya mencit dimatikan untuk diambil usus halusnya. Kami mehgambil 2 potongan usus masing­ masing sepanjang 10 em. Potongan usus pertama digunakan untuk uji diare sedangkan potongan usus kedua diambil mukusnya untuk pengukuran s-IgA menggunakan metode ELISA.

3.2.1.

Pemeriksaan Kadar s-IgA (Metode ELISA)

Pemeriksaan SlgA dengan metode ELISA menggunakan Mo use Secretory Immunoglobulin A, SigA ELISA kit dari NovaTeinBio dengan catalog number NB­

E204 16. Prosedur yang dilakukan mengikuti petunjuk dari distributor, sebagai berikut : Kit dikeluarkan dari suhu 2-80C dan dibiarkan pada suhu ruang selama 30 menit sebelum digunakan. Disiapkan terlebih dahulu wash solution yang diencerkan dengan distilled water l : 20. Kemudian well disusun ke dalam plate/strip. Sampel diluem dimasukkan ke well pertama sebagai blanko sebanyak 50 J!l, dan ke semua

standort

well dan sampel sebanyak masing-masing 50J!l. Ditambahkan standart masing-masing

50J1l ke dalam keenam standort well dan 50 Jll sampel ke dalam sample well. Kemudian ditambahkan HRP-conjugated antibody 1 OOJll pada tiap well, selanjutnya dishaker, ditutup dan diinkubasi pada suhu 37DC selama I jam. Setelah itu dilakukan washing dengan washing solution yang telah disiapkan sebanyak 5 kali. Kemudian ditambahkan chromogenic substrat A 50 111 dan Substrat B 50J!I pada tiap-tiap well, 19

•

selanjutnya dishaker dan diinkubasi pada suhu cahaya. Kemudian

ditambahkan

37CJ

stop solution

selama 1 5 menit, lindungi dari

. 50 f.tl

pada tiap-tiap

well untuk

menghentikan reaksi (wama biru berubah menjadi wama kuning). Kemudian diukur optical density (OD) pada

450

nm dalam waktu

1 5 menit pada ELISA reader.

Kemudian hasil absorbansinya dihitung dengan regresi tinier dan menunjukkan

konsentrasi

SigA

{Manufactured

by:

basil

penghitungan x

immunology

Consultants

Laboratory, inc.USA).

3.2.2. Uji Protektivitas

Metode ini kami kembangkan di laboratorium sentral biomedik FKUB. Penguj ian Protektivitas menggunakan percobaan dengan usus halus mencit kelompok perlakuan dan kelompok kontrol. Perlakuan sama seperti pada perlakuan untuk uji kadar s-IgA, yaitu Imunisasi diberikan peroral pada mencit dengan menggunakan jarum suntik khusus. Imunisasi diberikan pada minggu ke-0,

7

dan

28,

dan pada m inggu

berikutnya mencit dimatikan, diambil ususnya. Usus halus sepanj ang ujung lambung hingga ujung usus besar dipotong sepanjang dengan benang

10

em, kemudian kedua ujungnya diikat

(MLIL!Mice Ligated Illeal Loop) (Desain Sumamo, 2007). Masing­

masing usus yang d iikat tersebut disuntikkan

S.dysenteriae sebanyak l OOfll kemudian

ditimbang sebagai berat awal usus. Setelah ditimbang usus dililitkan kedalam alat khusus (desain Sumamo) dan kemudian dimasukkan kedalam media Roswell Pack Medium Institute (RPMI) dan d iputar diatas stirer dengan suhu setiap

37°C.

Usus ditimbang

30 menit sekali sampai 3 jam.

3.3. VARIABEL PENELITIAN

a. Variabel bebas: - Protein molekul adhesi subunit pili S.

dysenteriae berat molekul kDa 49,8 dan

7,9 kDa - !scorn

- Shigella dysenteriae b. Variabel tergantung: - Kadar s-Ig A usus halus yang terbentuk setelah vaksinasi - Volume cairan dalam usus halus (berat usus halus)

20

•

c. Variabel kendali: - Mencitjantan yang berumur ± 8 minggu dengan berat badan ± - Usus halus dengan panjang

25 g.

10 em

3.4. ANALISIS DATA Data diana! isis menggunakan uji statistik ANOV A, dan apabila terdapat perbedaan yang signifikan maka dilanjutkan analisis untuk mengetahu i kelompok mana saja yang

Post Hoc dengan uji Tukey

menunjukkan

perbedaan

yang

signifikan. Apabila data tidak memenuhi syarat nonnalitas dan homogenitasnya maka digunakan uji Kruskall Walis. Penelitian ini bennakna bila p < 0,05.

21

3.5.

KERANGKA OPERASIONAL

Shigella dyseteriae

l

Dibiakkan dalam medium yang memperkaya pili

!

Pemotongan bertingkat dengan Pili cutter

l

Fraksi pili ( Potongan

1-6 )

l

SOS-PAGE

!

Perhitungan Berat Molekul

Protein pili berat molekul 7,9 kDa dan 49,8 kOa

I

!

Uji Adhesi

3.6. BAGAN RANCANGAN PEMERIKSAAN s-lgA

Kontrol

Protein pili

Prote in pili 7,9

49,8

kDa dan 49,8

kDa+lscom

kDa + I scorn

Protein pili 7,9 kOa+lscom

I

PerOs

I Mencit BALB/c

lsolasi antibodi mucus usus

l

Pemeriksaan Kadar s-lgA

(ELISA)

23

3.7.

BAGAN RANCANGA N UJI PROTEKTI\'ITAS ..

Usus halus mencit setelah imunisasi dipotong {10 em)

!

Usus halus

Usus halus mencit

mencit Kontrol

protein adhesi 7,9 kDa+lscom

Usus ha!us mencit imunisasi protein

imunisasi

Usus halus mencit imunisasi protein adhesi

7,9 kD� dan 49,8 kDa Is com

adhesi 49,8 kDa + lscom

I Disuntikan S. dyseteriaelOO �I (10 5/ml)

Berat Potongan Usus awal

Dimasukkan dalam media RPMI dan diputar dengan suhu 37°C

l

Berat Potongan Usus ditimbang setiap 30 me nit selam 3 jam

Keterangan:

Usus balus mencit dipotong sepanjang 10 em, kedua ujungnya diikat d eoga n

benang.

Kemudian

bakteri

dimasukkan

S.

dysenteri ae

sebanyak 100 J.ll pada mas i ng masing usus hal us da n diamati selama 3 -

jam, setelab ilt1 ditimbang untuk m en geub u i volume akhir cairan dalam usus balus. Semakin berat potongan usus artinya semakio banyak pengeluaran cairan ke lumen usus.

24

•

t

+

3.8.

IOPOTESIS PENELITIAN a)

Protein sub unit pili Shigella Dysenteria 49.8 kDa dan

7,9

kDa merupakan

molckul adhesi. b) Protein adhesi sub unit pili S. Dysenteria 49,8 k.Da dan

7,9

kDa dapat

menghambat sekresi cairan usus mencit melalui peningkatan respon imun s­ [gA.

3.9.

PERSETUJUAN ETIK Penelitian ini menggunakan hewan coba bcrupa mencit galur Balb/c. Semua kegiatan penelitian di lakukan di laboratorium. lmplikasi pengunaan hewan coba dengan mengisolasi organ usus mencit yang sebelumnya hewan coba tersebut di matikan. Dengan demikian tidak akan menimbulkan dampak penularan penyakit pada hewan lain atau pada lingkungan.

25

•

I

BAB IV HASIL PENELITIAN

Penelitian

ini

merupakan

penelitian

ekperimental

dengan

subyek

penelitian mencit Balb/C sebanyak 20 ekor yang dibagi menjadi 4 kelompok, masi11g­ masing kelompok terdiri dari 5 ekor mencit. Aklimatisasi hewan dan pemeliharaan

MIPA

Universitas

Pelaksanaan penelitian di mulai pada akhir bulan Februari

20 1 2 . Dari

hewan coba d ilakukan di laboratorium biologi molekuler fakultas Brawijaya malang.

penelitian sebelumnya kami masih menyimpan protein pili Shigella d y semeriae dengan berat molekul 7,9 k.Da yang telah terbukti sebagai molekul adhesin. Karena

bahan­

bahan penelitian belum yang kami pesan belum datang maka protein tersebut kami pergunakan

sebagai

bahan

imunisasi,

sedangkan

untuk

ajuvan

mukosa

kami

pergunakan Iscom yang kami pinjam dari laboratorium fisiologi molekuler FKUB .. Pada penelitian tahap pertama ini kami memberi perlakuan pada 2 kelompok yaitu kelompok A merupakan kelompok kontrol yang hanya diberikan Iscom dan kelompok C merupakan kelompok perlakuan dengan pemberian imunisasi protein pili Shigella

dysenteriae dengan berat molekul 7,9 kDa. Perlakuan diberikan sebanyak 3 kali pada minggu ke-0 7 dan 28. ,

Pada

minggu berikutnya kami melakukan pembedahan untuk

dilakukan uj i diare dan isolasi mukus, mukus kemudian di simpan untuk dilakukan pengukuran kadar s-lgA bersama dengan kelompok berikutnya. Penelitian berikutnya di lanjutkan pada bulan September sampai dengan Desember

2012, untuk 2 kelorripok yaitu kelompok B merupakan kelompok per!akuan

dengan pemberian imunisasi protein pili Shigella dysenteriae dengan berat molekul 49,8 kDa dan kelompok D

merupakan

kelompok perlakuan dengan pemberian

imunisasi protein pili S�igella dysenteriae dengan berat molekul 7,9 k.Da + protein pili Shigella dysenteriae dengan berat moleku l 48,9 kDa. Pelaksanaan dimulai dengan produksi

vaksin

protein pili Shigella dysenteriae 49,8 kDa dan

7,9 kDa yang

berdasarkan Prabowo, 20 I I telah d iketahui merupakan molekul adhesin. Bahan vaksin berupa protein pili Shigella dysenteriae 49,8 kDa yang diisolasi dengan cara yang sama dengan metode yang dilakukan prabowo, 2010. Protein tersebut seperti yang ditunjuk pada Gambar 4.1 .

26

t

Pili I

Pifi ll

Pili Ill

Pili 1'/

1:3 5 •35 72

kDa

17 kD:+-

'

:"\ .

Gambar 4.1. Profil Fraksinasi Pili S.dysenteriae Hasil Elektroforesis SDS PAGE

Selanjutnya dilakukan produksi protein pili, dan dilakukan isolasi protein pili 49,8 kDa seperti yang ditunjuk pada Gambar

3 . 1 . Untuk lebih meyakinkan bahwa

yang diisolasi benar-benar protein pili 49,8 kDa maka protein yang telah diisolasi tersebut dilakukan elektroforesis dengan SDS PAGE. Hasil seperti tampak pada Gambar 4.2.

27

.,.,.; �:-:\>\ , •.• ,,•

....,;:::::-,....;..::.�'1:.:.:� �· 2 6 0 kD a 1 3 5 kDa 95 kDa 72 �:Da 52 �:Da

49,8 kDa ., .

42 kD a 34 kDa 2 6 kDa

17 kDa

Gambar 4.2 Profil Protein Pili BM 49,8 kDa S.dysenteriae Hasil Elektroforesis SDS PAGE Ket

: 1

(protein 49,8), 2(kosong), 3(marker Fermentas- Spectra Multicolor

Broad Range Protein Ladder)

Protein pili

Shigella dysenteriae 49,8 k.Da tersebut kernudian dipakai

sebagai bahan untuk irnunisasi, sedangkan protein pili

Shigella dysenteriae 1,9 k.Da

menggunakan bahan yang sebelurnnya sudah diproduksi. Imun isasi protein pili Shigella

dysenteriae 100�g/100J.tl tersebut

dikonjugasi dengan ISCOM l 2 f.lg/25f.ll sebagai

adjuvan yang diberikan melalui oral dengan sonde seperti jarum berujung bulat. Imunisasi diberikan 3 kali pada hari ke 0, 7 dan 28. Pada hari ke 35 mencit dimatikan dan dilakukan uj i protektivitas dan pengukuran kadar s-IgA. Hasil pengukuran tersebut dibandingkan antar keempat kelompok.

4.1.

HASIL KONFIRMASI UJI ADHESI Hasil konfirmasi uj i adhesi bakteri terhadap sel enterosit menunjukkan

bahwa molek:ul adhesin sub unit pili

Shigella dysenteriae 49,8 k.Da dan 7,9 k.Da adalah

molekul adhesi. Berik:ut ini adalah gambar hasil uj i adhesi bakteri terhadap sel enterosit.

28

•

Gam bar 4.3. Adhesi bakteri terbadap sel enterosit

Keterangan gambar A

=

Kelompok kontrol

8 = Kelompok perlakuan protein 7,9 leDa

C = Kelompok perlakuan protein 49,8 kDa

4.2.

HASIL PENGUKURAN s-IgA Untuk mengetahui pengaruh induksi molekul adhesin sub unit pili Shigella

dysenteriae 49,8 kDa dan 7,9 kDa dalam meningkatkan s-lgA, maka terlebih dahulu dilakukan uji normalitas dan bomogenitas data. Berdasarkan basil uji bomogenitas dan normalitas data menunjukkan babwa asumsi homogenitas tidak terpenuhi,

normalitas data juga tidak terpenubi

sebingga pengujian dilanjutkan dengan menggunakan uji kruskall Wallis. Hasil

analisis

statistik

dengan

Kruskall

Wallis

didapatkan

basil

signifikansi 0,04, karena nilai signifikansi < a (0,04 < 0,05), maka dapat di nyatakan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan antar keempat kelompok perlakuan.

29

Tabcl 4 . 1 . Kadar s-lgA pada masing-masing kelompok Rerata

Stan dart

(Jig/ml)

Deviasi

A (kelompok kontrol)

1,415

±0,26 1

B (kel. Perlakuan imunisasi protein 49,8

3,3 1 3

±1,368

1,913

±0,067

4,623

±1,535

NO

Kelompok

2

kDa) 3

C (kel. Perlakuan im unisasi protein 7, 9 kDa

4

D (kel. Perlakuan imunisasi protein 49,8 kDa + 7,9 kDa)

Uj i Kruska l l Wallis sig 0,04 (p<0,05)

Untuk mengetahui kelompok mana saja yang terdapat per�daan maka dilanjutkan dengan uji Tukey. Berikut ini adalah tabel hasil uji 'fukey

Tabel 4.2. Hasil uji Tukey s-IgA antar kelompok perlakuan Kelompok

Kelompok

Sig.

Kesimpulan

A

B

0,047

Ada beda

A

c

0,873

Tidak ada beda

A

D

0,001

Ada beda

B

c

0,184

Tidak ada beda

B

D

0,23 1

Tidak ada beda

c

D

0,004

ada beda

Hasil uji tukey rnenunjukkan ada perbedaan antara ke1ompok A dan B, tidak ada perbedaan antara kelompok A dan kelompok

C, ada perbedaan antara

kelornpok A dan ke1ompok D, tidak ada perbedaan antara kelompok B dan kelompok C, tidak ada perbedaan antara kelompok B dan kelompok D, ada perbedaan antara kelompok C dan kelompok D. Hal

ini mernbtiktikan bahwa pemberian imunisasi

30

•

t

protein adhesin 49,8 kDa dan 7,9 kDa yang dikonjugasi ISCOM dapat meningkatkan kadar s-lgA mukus usus. Perbedaan kadar s-lgA masing-masing kelompok dapat dilihat pada gambar berikut: 7.000

-··8 --

6.000

e

1l

i v;

.. "' '0 "' :.::

5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 0.000

A

B

c

D

Kelompok Perlakuan

Gam bar 4.4. Kadar

s-lgA usus balus mencit (ELISA)

Keterangan gambar : A = kelompok kontrol B = kelompok perlakuan dengan protein 49,8 kDa C = kelompok perlakuan dengan protein 7,9 kDa D = kelompok perlakuan dengan protein 49,8 kDa + 7,9 kDa

Gambar 4.4. menunjukkan bahwa kadar s-IgA usus halus paling rendah ada pada kelompok A (kelompok yang hanya diberikan Iscom).

Sedangkan kelompok D

(kelompok perlakuan imunisasi protein adhesin 49,8 kDa + 7,9 kDa + !scorn) merupakan kelompok dengan kadar s-IgA tertinggi.

4.3.HASIL UJI PROTEKTIVITAS Uj i protektivitas dilakukan dengan cara menimbang berat usus mencit, yang sebelumnya sudah diberikan perlakuan imunisasi dan di injeksi dengan bakteri Shigella

31

dysenteriae.

Gambar 4.5. menunjukkan potongan usus halus mencit masing-masing

kelompok perlakuan.

Gambar 4.5.

Potongan usus halus mencit

Keterangan gambar : A = kelompok kontrol B = kelompok perlakuan dengan protein 49,8 kDa C = kelompok perlakuan dengan protein 7,9 kDa D = kelompok perlakuan dengan protein 49,8 kDa + 7,9 kDa

Berdasarkan hasil uji homogenitas dan normalitas data menunjukkan bahwa homogenitas

terpenuhi dan

normalitas

data juga terpenuhi

sehingga pengujian

dilanjutkan dengan menggunakan uji Anova. Hasil analisis statistik dengan Anova didapatkan hasil signifikansi 0,000 (p < 0,05), maka dapat di nyatakan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan antar keempat kelompok perlakuan

32

•

I

Tabel 4.3. B erat usus mcncit pada masing-masing kelornpok Rcrata

Stan dart

(�tg/m l)

Deviasi

A {kelompok kontrol)

1,000

± 0,452

B (kel. Perlakuan imunisasi protein 49,8

0,877

±0, 5 1 6

0,900

±0,459

0,839

±0,425

Kelompok

NO

2

kDa) 3

C (kel. Perlakuan imunisasi protein 7,9

kDa 4

D {kel. Perlakuan imunisasi protein 49,8 kDa + 7,9 kDa)

Uj i Anova sig 0,00 {p<0,05)

Untuk mengetahui kelompok mana saja yang terdapat perbedaan maka dilanjutkan dengan uj i Tukey. Berikut ini adalah tabel basil uji Tukey:

Tabel 4.4. Hasil Uji Tukey Berat usus mencit antar kelompok perlakuan Kelompok

Kelompok

Sig.

Kesimpulan

A

B

0,000

Ada beda

A

c

0,003

Ada beda

A

D

0,000

Ada beda

B

c

0,784

Tidak ada beda

B

D

0,435

Tidak ada beda

c

D

0,090

Tidak ada beda

Hasil uji tukey menunjukkan ada perbedaan antara kelompok A dan B, ada perbedaan antara kelompok A dan kelompok C, ada perbedaan antara kelompok A dan kelompok D, tidak ada perbedaan antara kelompok B dan kelompok C, tidak ada perbedaan antara kelompok B dan kelompok D, tidak ada perbedaan antara kelompok C dan kelompok D.

Penimbangan berat usus mencit dilakukan tiap 30 menit, berikut ini hasil penimbangan sampai menit ke 180. 33

•

I

!' '

II

-- -

----- ---

1.2000

-

--

----- ·-·-··-------- ----

1,0000

-

D Kontrol

0,8000

11 49,8 kDa

0.6000

·t

ISCOM

7.9 kDa -t· lSCOM

0,4000 •

0,2000

l

--

-

- .. -

0.0000

Awal

..uft0�-·AOftftO---

••·----·-<

30

mnt

�----

60

mnt

000-�"'""""'''"' ''-""

90

mnt

'''''-''_'_'

120

mnt

150

mnt

49,8 kDa ISCOM

+

7,9 kDa ·•

180

mnt

,,,,, _ft_..ft______ft_Oo0·"-ftft0-'''

Gambar 4.6. Berat Usus mencit pada setia p

30

menit peoimbangao

Rata -rata basil penimbangan usus mencit pada masing-masing kelompok dapat dilihat pada gambar berikut : 1.0SOO 10J00 0.9!00 .. ::J ..

�

I!

&Z

0.90X1

.'

j.

O.a510

Kor1rd

49.8 kO • +ISCOW

7,H>e • ISCOM

Kelom pok

.

' .

0.81Dl 0.1Sl0

.

49,8 kOe + 7.9 kO. • ISCO"

Gambar 4.7. Rata-rata basil penimbangan usus mencit

34

•

BAB V PEMBAHASAN

Penelitian

ini merupakan penelitian

vaksinasi Shigella dysenleriae

berbasis molekul adhesin. Penelitian ini menggunakan protein 49,8 kDa dan protein 7,9 kDa Shigella dysenteriae yang telah dibuktikan Prabowo (20 I I ) sebagai prrotein adhesin. Pemberian vaksin imunisasi dengan antigen protein per oral secara teori kebanyakan tidak imunogenik, sehingga diperlukan ajuvan yang dapat merangsang respon imun yang lebih besar daripada apabila antigen diberikan send iri. Dalam penelitian ini ajuvan yang dipakai adalah ISCOM (Immunostimulating Complex) yaitu AbiSCO dari ISCONOVA ISCOM merupakan ajuvan golongan inert vaccine delivery yang membuat antigen terlarut dalam bentuk partikel. Antigen partikel lebih efektif sebagai imunogen oral dikarenakan (i) Jebih tahan terhadap pengaruh pH di lambung, asam

empedu dan enzim proteolitik d i saluran cema (ii) partikel diabsorbsi melalui sel

M ke dalam Peyer Patches lebih efisien, sehingga menghasilkan konsentrasi antigen yang tinggi di tempat tersebut (iii) tidak menimbulkan toleransi mukosal (McGhee,

1999). Sehingga dengan pemberian antigen yang dikonjugasi ISCOM dapat melindungi antigen dari degradasi dalam

traktus gastrointestinal,

disamping

itu

ISCOM

mengandung saponin yang dapat meningkatkan efektifitas vaksin oral melalui peningkatan permiabilitas mukosa usus (Mowat, 200 1 ; Cheeke, 1998; Winarsih, 2005). Untuk

mengetahui

potensi

im unogenik

protein

tersebut

dalam

menginduksi respon imun mukosa (SigA) maka dilakukan pemberikan imunisasi protein adhesin 49,8 kDa dan 7,9 kDa dengan dosis pemberian l OOJ.Lg/IOOJ.ll. Dosis protein adhesin tersebut berdasarkan penelitian Prabowo (20 1 1 ) bahwa dengan pemberian protein 49,8 kDa dan 7,9 -kDa dengan konsentrasi lOOJ-lg dapat menghambat adhesi bakteri pada enterosit mencit dibanding kontrol (p<0,05). Hal ini sesuai dengan hasil konfirmasi uji adhesi yang kami lakukan. Hasil penelitian ini menyatakan bahwa terdapat perbedaan kadar s-lgA yang signifikan antar kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dengan nilai signifikansi 0,04. Nilai signiflkansi tersebut < a (0,04 < 0,05), maka dapat di nyatakan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan antar keempat kelompok perlakuan. Hasil 35

analisa Kruskal Wallis menunjukkan ada perbedaan antara kelompok A dan kelompok B (p=0,047), tetapi tidak ada perbedaan antara kelornpok A dan kelompok C (p=0,8 73). Kelompok B merupakan kelompok perlakuan dengan pcmberian imunisasi bcrupa protein 49,8 k.Da dan kelompok C mcrupakan k e lompok pcrlakuan dengan pembcrian imunisasi berupa protein 7,9 kDa. Menurut Parslow (200 I ), dikatakan bahwa protein dengan

berat rnolekul lebih dari

l 0 k.Da sampai dengan I00 kDa memiliki sifat

imunogenik. Apabila kurang dari 1 0 kDa biasanya tidak bersifat imunogenik Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa kadar s-IgA usus halus paling rendah ada pada kelompok A (kelompok yang hanya diberikan

lscom).

Sedangkan kelompok D (kelompok perlakuan imunisasi protein adhesin 49,8 kDa + 7,9 k.Da + Iscom) merupakan kelompok dengan kadar s-IgA tertinggi tetapi tidak ada perbedaan yang signifikan antara kelompok B (imunisasi dengan protein 49,8 kDa) dan kelompok D (Imunisasi dengan protein 49,8 kDa + protein 7,9 k.Da). Dari hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa protein sub unit pili Shigella dysenteriae 49,8 k.Da dapat meningkatkan respon imun s-lgA. SlgA berperan

dalam

perlindungan

utama

pada

mukosa terhadap

mikroorganisme patogen (Brandtzaeg, 2007; Boullier et al, 2009). SlgA bersama-sama dengan mekanisme pertahanan mukosa innate dapat mengharnbat kolonisasi dan invasi patogen (Everett et al, 2004). Mekanisme SlgA dalam pertahanan mukosa dengan cara mencegah adhesi bakteri ke pennukaan mukosa dan selanjutnya akan dikeluarkan dengan pergerakan mukosiliar dan peristaltik yang disebut immune exclution (Ogra, 2005: Due, 2009). Adhesi bakteri merupakan tahap terpenting dalam patogenesis Shigella, tanpa melewati tahap ini, bakteri tidak dapat invasi ke dalam sel enterosit sehingga inflamasi dan sekresi cairan ke lumen usus dapat dihambat.

Hal ini sesuai

dengan hasil penelitian yang menunjukkan bahwa pada kelompok dengan kadar s-lgA tertinggi yaitu kelompok D, berat usus lebih ringan di banding kelompok lainnya. Pada kelompok D, pemberian protein 49,8 k.Da + protein 7,9 kDa mampu meningkatkan respon imun s-lgA. Uj i adhesi juga menunjukk.an bahwa protein tersebut mampu menghambat adhesi bakteri tetap i masih ada bakteri yang berhasil menempel pada sel enterosit yang kemungkinan masih dapat menyebabkan inflamasi. Oleh karena itu perlu penelitian lebih lanjut mengenai pengaruh protein sub unit pili

36

Shigella J:.·5en!eriae terhadap respon imun seluler. Peningkatan rcspon imun seluler diharapkan dapat menghambat proses inflamasi akibat invasi bakteri patogen. Pemberian vaksin dcngan materi molekul

adhesin

ini

mempunyai

keuntungan selain memberikan antibodi terhadap adhesin yang dapat menghambat perlekatan bakteri juga antibodi yang terbcntuk akan meningkatkan eliminasi rnelalui peristaltik at3.u pergerakan mukosiliari yang disebut sebagai immune exclusion (Ogra,

2005; Due. 2009). Selain itu vaksin berbasis molekul adhesin memiliki efek samping reaksi lokal dan sistemik yang lebih ringan dari pada vaksin whole-cell (Centers for

Disease Conrrol and Prevention, 2006). Pemberian vaksin melalui oral

berdasarkan pada patogenesis Shigella

dysenteriae adalah melalui oral. Selain itu pemberian vaksin melalui oral juga lebih efektif dibandingkan melalui parenteral karena tidak perlu steril, mudah pemberiannya, dan tidak iritatif.

37

•

t

BAB VI KESIMI)ULAN DAN SARAN

6.1.

KESIMPULAN

Protein sub unit pili Shigella Dysenteria 49,8 kDa dan 7,9 kDa merupakan molekul adhesi. Protein adhesi sub unit pili S Dysenteria 49,8 kDa dan 7,9 lcDa dapat menghambat sekresi cairan usus rnencit rnelalui peningkatan respon irnun s-lgA. SlgA berperan dalam perlindungan utama pada mukosa terhadap m ikroorganisme patogen. SlgA bersama-sama dengan mekanisme pertahanan mukosa innate dapat menghambat kolonisasi dan invasi patogen dengan cara menghambat adhesi bakteri ke sel enterosit.

6.2. SARAN

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pengaruh protein adhesi tersebut terhadap respon imun seluler serta daya protektivitasnya terhadap kerukan mukosa usus.

38

•

,

'\' TERIMA KASIH l"CA . PA .:

Dengan selesainya penelitian ini, kami mengucapkan terima kasih yang sebesar-besamya kepada : I.

Badan Penclitian dan Pengembangan Kesehatan, Kementerian Kesehatan RI, yang telah membiayai penelitian ini

2.

Rektor Universitas Bra\\ ijaya, yang telah memberikan ijin dan kesempatan kepada kami untuk melaksanakzn penelitian ini

3.

Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya , yang telah memberikan dukungan dan Fasilitas kepada kami dalam melaksanakan penelitian ini.

4.

Semua pihak yang telah membantu hingga selesainya penelitian ini.

39

•

DAFTAR PUSTAKA

Ashkenazi S., J.H. Passwell. E. Harlev. D. miron, R. Dagan, N. Farzan, R. Ramon, F. Majadly, D.A. Bryla, A.B. Karpas J.B. Robbins and R. Schneerson. 1999. Safety

and

immunogenicity

of Shigellasonnei

and

Shigellajlexneri2a

O�specific

polysaccharide conjugate in children. J Infec Dis 179 (3): 325-45.

A van ita P., E.H. Tinny and R.P. Sumarno. 20 l l . Partial characterization of

adhesionspili on Shigelladysemriae( Lnpublished). Boullier, S., M. Tanguy, K.A. Kadaoui, C. Caubet, P. Sansonetti, B. Corthesy and Annelle, Phalipon, 2009. Prevents Intestinal Tissue Destruction by Se�retory JgA­

Mediated Neutralization of Shigella jlexneri Prevents Intestinal Tissue Destruction by Down-Regulating Inflammatory Circuits, JImmunol, 1 83;5879-5885.

Brandtzaeg, P., 20 1 0 Update on mucosal immunoglobulin A in gastrointestinal

disease, Current Opinion in Gastroenterology 26:554-563.

Boquet, P., P.J. Sansonettiand G. Trans Van

Nhieu . 1 999. Rho GTP-binding

protein as targetsfor microbial pathogens. PogMoiSubcell Bioi. 22:

m 1 83-99.

Coker A.O, R.D, Isokpehi, B.N. Thomas, K.O. Amisu and C.L. Obi. Human

Campylobacteriosis in developing countries.Emerg Infect Dis. 8 (3): 23 7-44. Everett, M.L., D. Palestranta. S.E. �1illerb,c, R.R. Bollingera,d, W. Parkera, 2004.

Immune exclusion and immune inclusion: A new model of host-bacterial interactions in the gut, Clinical and Applied Immunology Reviews 4 : 321-332.

Hanh E., P. Wild, U. Hermans, P. Sebbel, R . Glockshuber, M. Haner, N . Taschner, P.

Burkhard,

U.

Aebi

and

S.A.

Muller.

Exploring

2002.

the

3D

moleculerarchitechture of Escherichiae coli type 1 pili. J Mo!Biol 323 (5): 845-57.

40

•

I

Kosek M., C. Bern and L.R Guerrant. 2003. I11e global burden of diarrhoeal disease, as estimated from studies between 1992 and 2000. Bull World Health

Organ. 8 1 (3): 197-204

Lee Lerner K and B.W. Lerner. 2003. World of Microbiology and Immunology. Ed. Gale Thomson

Levine O.S and M.M. Levine. 1 99 1 . Hcn.�..seflies r_\fuscadomestica) as mechanical vectors of shigellosis. Rev Infect Dis. 1 3

(� ): 688-96.

Nazir M., N. Pardede and R. Ismail. (1985). The incidence diarrhoeal diseases and diarrhoeal related mortality in rural saupy low-land area of South Sumatra Indonesia. J Trap Pediatr. 3 1 (5): 268-72.

Niyogi, S.K .2005. Shigellosis. J. Microbiol 43(2):m 1 33-43.

Nhieu G.T. and P.J. Sansonetti. 1999. Mechanism of Shigella entry into epithelial cells. CurrOpinMicrobiol 2 (1 ): 5 1 -5.

Oyofo B.A., D. Subekti, P. Chaniadi, N . Machfud, S. Komalarini., B. Setiawan, C. Simanjuntak, N. Punjabi, A.L. Corwin, M . Wasfy, J.R. Cambell and M. Lesmana. 2002. Enteropathogens associated with acwe diarrhea in community and hospital patient in Jakarta, Indonesia. fEMS lmmunol Med Microbio\ 34 (4): 1 39-46.

Phalipon A., M. Tanguy, C. Granjean. C. Guerriro, F. Belot, D. Cohen, P.J. Sansonetti and L.A. Mulard. 2009. A synthetic carbohydrate-protein-conjugate vaccine candidate aganst Shigellajlexneri 2a infection. J Immuno1 182 (4): 2241-7.

Philpott D.J., J.D. Edgeworth and P.J. Sansonetti. 2000. The pathogenesis of Shigellajlexneri infection: lesion on in \'itro and in vivo studies. Philos Trans R

SocLond B Bioi Sci. 355(1 397): 2241-57.

41

•

,

Pozgay V .. C. Chu, L. Panel!, J. Wolfe. J.B. Robbins and R. Schneerson. 1 999. Protein conjugate of synthethic saccharides elicit higher levels of serum IgG lipopolysaccharide

antibodies

in mice

rhan

do

!hose

of the

0-specific

polysaccharide from Shigelladyseteriae type1 .

Sansonetti PJ., C. Egile . 1 9 9 8 . Moleculer basic of epithelial cell invasion by Shigellajlexneri.Antonie Van Leeuwenhoek 74 (4): 1 9 1 -7.

Santoso S., 2002. Protein Adhesi Salmonella l)phi sebagai virulensi berpotensi imunogenik terhadap produksi slgA protektif. Disertasi Program PascaSarjana Univ. Airlangga Surabaya

Sadorge C., A . Ndiaye, N. Beverdge, S. Frazer, R. Giemza, N. Jolly, J. Johnson, H. Liddy. C.A. Cosgrove, P. Allavena, A. Mantovani, S. Bechet, A. Fontaine­ Thomson, G.E. Griffm, F. Dupont. P.J. Sansonetti and D.J. Lewis. 2008. Phase 1 clinical

trial

of

live

attenuated

Shigelladyseteriae

type-]

DeltaicsADeltaentDeltaftpDeltastxA:HgR oral vaccine SC599 in healthy human adult volunteers. Vaccine. 26 (7): 978-87.

Sasakawa C. 201 0. A new paradigm of bacteria-gut interplay brought through the study ofShigel/a.ProcJpnAcadSer B PhysBiol Sci. 86 (3): 229-43.

Sumamo., Noorhamdani A., Samsul 1., Sjoekoer �L, dan Ichinose Y., 1 992. Purifikasi Protein Hambatan Aglutinasi Vibriocholerae El Tor 179-6. Majalah Kedokteran Univ. Brawijaya Malang 8: 1 1 - 1 4 .

Sumamo., 2000. Karakterisasi Molekuler Protein Adhesi Vibriocholerae O J dan Protein Reseptornya Pada Sel Epitel Usus Halus Tikus Putih (Wistar), studi patogenitas Vibriocholerae OJ . Disertasi Program Pasca Sarjana Univ. Airlangga Surabaya.

42

•

t

Sur D, T. Ramamurthy, J. Deen and S.K. Bhartacharya (2004). Shigellosis. chalenges and management issues. Indian J Med Res. 120 (5): 454-62

Torres

A.G.

2004.Currents

aspects

of

Shigella

pathogenesis.

Rev

LatinoamMicrobiol. 46 (34): 89-97.

WHO. 20 I I . Diarrhoeal Diseases (Updated February 2009)

43

..

I

...

LAMPIRAN-LAMPIRAN

II

• t

Lampiran Realisasi Anggaran Penelitian Tahun

Judul Penelitian

2012

: Respon imun s-lgA molekul adhesin Shigella dysenteriae 49,8 kDa dan 7,9 kDa terhadap sekresi cairan usus mencit

Ketua Peneliti

: Yulian Wiji Utami

Pagu Penelitian

: Rp. 138 .400.000

Uraian No

1

Realisasi Total (Rp)

1 2 1 .824.210

Realisasi �

Honor Tetap

Belanja Bahan 1

Belanja Bahan 2

Sew a

Pos

22.920.000

89.743.000

2.666.150

6.448.200

46.860

•

t

LAMPIRAN 1 P E RSETUJUAN ETIK PENELITIAN

II

• I

Lampiran 5.1

KEMENTERIAN PENDIOIKAN NASIONAL MINISTRY OF NA nONAL EDUCA TION FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MEDICAL FACUL TY BRA WIJA YA UNIVERSITY KOMISI ETIK PENELITIAN KESEHATAN

mE ETHICAL COMMITTEE OF MEDICA L RESEARCH Jalan Veteran Malang - 65145 · Telp. (034 1 ) 551611 Pes. 213.214; 569 1 1 7 , 567192 - Fax. (62) (034 1 ) 564755 e-mail : kepk.H
http://fk.brawijaya.ac. id

KETERANGAN KELAIKAN ETIK ("ETHICAL CLEARANCE") No. 0255 1 EC I KEPK - S2- JK / 1 0 1 20 1 1 KOMISI ETIK PENELITIAN KESEHATAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA, SETELAH MEMPELAJARI DENGAN SEKSAMA RANCANGAN PENELITIAN YANG OIUSULKAN, DENGAN INI MENYt-TAKAN BAHWA PENEUTIAN DENGAN JVD-UL : RESPON IMUN slgA MOLEKUL ADHESIN SHIGELLA DYSENTERIAE 7,9 kDa dan 49,8 kDa TERHADAP SEKRESI CAIRAN USU� MENCIT PENELITI UTAMA : YULIAN WIJI UTAMl, SKp., M.Kes UNIT/ LEMBAGA I TEMPAT PENELITIAN :

-

LABORATORIUM M I KROBIOLOGI FAKULTAS KEDOKTERAN BRAWIJAYA MALANG LABORATORIUM BIOMEDIK FAKULTAS KEDOKTERAN BRAWIJAYA MALANG LABORATORIUM BIOLOGI MOLEKULER FAKU LTAS MIPA BRAWIJAYA MALANG

U NIVERSITAS UNIVERSITAS U NIVERSITAS

DI NYATAKAN LAIK ETIK

och. lstiadjid ES, SpS, SpBS, M.Hum

•

t

LAMPIRAN 2 DATA SHEET

II

• t

BERAT BADAN MENCIT SEBELUM PERLAKUAN Rata-

Sam pel

rata

Kelompok

1

2

3

4

5

6

A

18

26

19

22

25

24

22

B

20

25

20

21

27

17

22

c

20

25

18

22

22

19

21

D

25

14

14

19

24

22

20

HASIL PENIM BANGAN USUS HALUS MENCIT

RATA-RATA BERAT USUS HALUS KELOM POK

Kontro1 49,8 kDa +

ISCOM

Awal

30 mnt

60 mnt

90 mnt

120 mnt

150 mot

180 mnt

1.0146

1 .0332

0.8594

0.8712

0.9060

0.9268

0.9470

0.8944

0.93 1 8

0.9422

0.9632

0.8434

0.8684

0.8798

0.8798

0.9322

0.9438

1.0016

0.8178

0.8142

7,9 kDa + ISCOM 49,8 kDa + 7,9 kDa +

0.8482

0.8486

0.8772

ISCOM

0.7716

0.7930

0.8400

,

1.04 1 6

1 .0382

HASIL UJl S-lgA

1

2

3

4

5

MEAN

A

1.255

1.344

1.312

1 .287

1 .4 1 5

0.26!

B

3.8 1 5 1 .939 5.553

3.791

1 .961

5.098 1 .794

1 .879 1 .902 1 .926

3.313 1 .9 1 3 4.623

1.368

KEL

c D

1.943

5.292

1.961 1 62

5.

1 .890

5.219

SD

0.067 1 .535

LAMPIRM� 3 HASIL ANALISIS DATA

II

•

t

Tests of Nonnality a

Shapiro-Wilk

Kolmooorov-Smirnov Statistic

Kelompok Berat Usus

Sig.

df

Statistic

Sig.

,222

7

,200"

,836

7

,091

49,8 kOa +ISCOM

, 1 62

7

,200"

,935

7

,594

7,9 kOa + ISCOM

,179

7

,200"

,917

7

,445

,220

7

.zoo·

,879

7

,220

49,8 kDa + 7,9 kOa + ISCOM •.

df

Kontrol

This is a lower bound of the true significance.

a . Lilliefors Significance Correction

Descriptlves Berat Usus 95"1. Confidence Interval for N

Kontrol 49,8

kOa +ISCOM

7,9 1
kDa + 7,9

kDa + 1SCOM Total

Mean

Maxin.um

,925261

.8142

,9470

,858320

,943280

,8482

,9632

,800061

,878796

,7716

,8798

,875570

,933659

,7716

1,0416

1.042547

,829710

,0452017

,0170846

7

,877486

,0516580

,0195249

7

,900800

,0459315

,0173605

7

,839429

,0425666

,0160886

,0749031

M.nomum

Upper Bound

,958938

1 ,000743

,904614

Mean

lower Bound

7

28

Std.

Etr()(

Std. Oelliation

,01411554

.9n2

Test of Hgmogeneity of Variances Berat Usus

Levene Statistic

df1

Sig.

df2

,215

24

3

,885

ANOVA

Berat Usus Sum of Between Groups

Squares , 1 00

3

,033 ,002

Within Groups

,052

24

Total

'151

27

Post Hoc Tests

•

Mean Square

df

F

15,395

Sig. ,000

1,0416

Multiple Comparisons Dependent Variable: Berat Usus

Tukey HSD

Mean

(I}Kelompok Kontrol

(J) Kelompok

7.9 kDa + ISCOM

,0999429*

,0248328

,003

,031439

,168447

, 1 6 1 3 143*

,0248328

,000

,092810

,2298 1 8

-,1232571*

,0248328

,000

-,191761

-,054753

Kontrol 7,9 kDa + ISCOM 49,8 kDa + 7,9 kDa + ISCOM Kontrol

49,8 kDa +ISCOM

49,8 kDa + 7,9

kDa + ISCOM 49,8 kDa + 7,9

kDa + ISCOM

Upper Bound

,0248328

Sig. ,000

Lower Bound

,1232571*

kDa + ISCOM

7.9 kDa + ISCOM

(1-J)

49,8 kDa +ISCOM

49,8 kDa + 7,9 49.8 kDa +ISCOM

95% Confidence Inte rval

Difference

Std. Error

,054753

.191761

,045 1 9 0

-,0233143

,0248328

,784

-,09 1 8 1 8

,0380571

,0248328

,435

-,030447

,106561

-,0999429*

,0248328

,003

-,1 68447

-,031439

,0233143

,0248328

,784

-,045190

,091818

,0613714

,0248328

,090

-,007133

,129875

Kontrol

- , 1 6 1 3 1 43*

,0248328

,000

-,22981 8

-,092810

49,8 kDa +ISCOM

-,0380571

,0248328

,435

-,106561

,030447

7,9 kDa + IS COM

-,0613714

,0248328

,090

-,1 29875

,007133

·. The mean difference is significant at the .05 level

.

-

�

49.8t.D
I OI 11Col

��-�o: �-=-� i

!

1.0000 o.sooo

------

- -

·-- 1

i i

-·--· ----

+

I i

11 Kontrol

'

i

·,

• 49,8 kDa i ISCOM

0,5000

iW 7,9 kDa _. ISCOM

v...:ooo

•·4�.8 kDa

0.2000

ISCOM

0.0000

mnt

60

90

120

mnt

mot

mnt

150

mnt

180

mnt

�

7,9 kD.-.

1

�

os:x i

1 00)j � .. "

:;

.. :! . m

0�

....,...

�

d i

1

0.9CXXl

oem

c .e:ro ,

.,mj

' ,.;::J"C"':j

I CSJ li: Oo
I 7�tOe•ISCOM

Kelornpok

•

I 49,8k0 • • 7,9t0a• ISCOM

I

Oneway

Oescriptives SlqA 95% Confidence Interval for

N

A (ISCOM) B (46,9+!SCOM)

C (7,9+1SCOM)

D (49,8+7,9+1SCOM)

Mean Me:n

Std. Error

Lower Bound

Upper Bound

Minimum

Maximum

5

1,4160

.26102

,1 1673

1,0919

1,7401

1 ,26

1,88

5

3,3140

1,36977

,61256

1,6132

5,01 46

1 ,90

5,10

5

1 ,9120

,06907

,03089

1,8262

1,9976

1 ,79

1,96

5

4.6220

1 ,53446

,68623

2,7167

6,5273

1 ,89

5,55

2.61 60

1,60015

,35781

2,0671

3,5649

1,26

5,55

20

Total

Std. Deviation

Test of Homogeneity of Variances S lg A Levene

Statistic

5,275

df1

df2

3

16

Sig.

,010

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test SlgA

N

20

Normal Parametersa,b

Mean Std. Deviation

Most Extreme Differences

Kolmogorov-Smirnov Z

2,8160 1 ,60015

Absolute

,354

Positive

,354

Negative

Asymp. Sig. (2-tailed)

-,173 1,582 ,013

a. Test distribution is Nonnal. b. Calculated from data.

Kesimpulan : homogenitas varians tidak normal Analisis : Kruskall Walis

(0,010 < 0,05) dan distribusi tidak no rmal (0,013 < 0,05)

Kruskai-Wallis Test

Ranks

SlgA

Kelompok

Mean Rank

N

A (ISCOM)

5

3,20

B (48,9+1SCOM)

5

13,10

C (7,9+1SCOM)

5

9,50

5

16,20

D (49,8+7,9+1SCOM)

Total

20

b Test Statistic�·

Chi-Square df

SlgA 13,383 3

Asymp. Sig.

,004

a . Kruskal Wallis Test b. Grouping Variable: Kelompok

Kesimpulan : Ada pebedaan signifikan antar kelompok Untuk mengetahui kelompok mana saja yang berbeda signifikan � Post Hoc tes (Uji Tukey)

•

,

Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable: SlgA

Tu key HS D I

Mean

95% Confidence lnteNal

Difference (I)Kelompok.

A (ISCOM)

(J) Kelompok B (48,9+1SCOM) C (7,9+1SCOM)

8 (48,9+1SCOM)

D (49.8+7,9+1SCOM)

A (ISCOM) C (7,9+1SCOM)

D (49,8+7,9+1SCOM) C (7,9+1SCOM)

0 (49,8+7,9+1SCOM)

•.

A (ISCOM)

(1-J)

Std. Error

Sig.

Lower Bound

Upper Bound

- 1 , 89800.

,65603

,047

-3,7749

-,02 1 1

-,49600

,65603

,873

-2,3729

1 ,3809

-3.20600.

,65603

,001

-5,0829

-1 ,3291

1 .898oo·

,65603

,047

,0211

3,7749 3,2789

1 .40200

,65603

,184

-,4749

- 1 , 30800

,65603

,231

-3,1849

,5689

,65603·

,873

- 1 ,3809

2,3729

.49600

B (48,9+1SCOM)

-1 ,40200

,65603

,184

-3,2789

,4749

D (49,8+7,9+1SCOM)

-2,71000.

,65603

,004

-4,5869

-,8331

A (ISCOM)

3,20600.

,65603

,001

1 , 3291

5,0829

B (48,9+1SCOM)

1 , 30800

,65603

,231

-,5689

3,1849

C (7,9+1SCOM)

2,71 ooo·

,65603

,004

,8331

4,5869

The mean difference is significant at the .05 leveL

•

I

LAMPIRAN 4 DOKUMENTASI PENELITIAN

II

•

I

-

DOKUMENTASI PENELITIAN

Hasil re-isolasi bakteri Shigella dysenteriae pada media Me. Conkey

Pemotougan pili bakteri

•

I

Pembedaban mencit

Pemotongan usus balus mencit

•

I

Preparasi mukus

Injeksi bakteri Shigella dysenteriae

•

I

...

Pengikatan usus halos pada alat uji diare

Uji diare (uji protektivitas)

•

t

r····· ..-��:V-•-······ .

If

'j

u

I '" .., • .... -.-.. . .. J f.;, ' A-5 ·. 111 : A;;. l B , Y Bz '( 6, X,. �'; f.'">( C( ! � ., / � ..:< z:-_-t,/.... .. , >-\'-;...- ·, = . . /-- --.!v� . vo,f k j i..1t), / - }, - ' . ·' c� (s ' 0, :'o'!. > -....... ..... �·.?

�

- - ,/

•' •

'

--

•-

'·

' ../'

�-u .,_

�·-·•

· :" .-..... v '

�--··�

(

-·

,, -

,,�-..

. .(�'1«-

\.

'"!---·-•!'

.:.,·

{\ !--·r: __'�·... ...�...._...._,.,-.:, 1 ; 'J : ' X '"·-" k�>---· ....<> . ... ·< >- ..! ' ., ; -�>--.

·: -• .

!

'

�

I ·

.�:,:!y�,:m..

;:t-ii.� il;

.

_ · - ·J: · : !:i::. r

..

:: .

.,

,.

-

·

Lay out dan basil uji Elisa s-lgA

•

I

LAI\'IPIRAN 5 FORMAT JURNAL

II

•

t

RESPON IMUN s-lgA MOLEKUL ADHESIN SHIGELLA DYSENTERIAE 49,8 KDA DAN 7,9 KDA TERHADAP SEKRESI CAIRAN USUS MENCIT

I.

2.

Yuliao Wiji Uta mi1, Wiwik Ag ustio a2, Dwi Setyoriu e

Program Studi S l Ilmu Keperawatan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Program Studi S i Ilmu Keperawatan STIKES Maharani Malang

3.

Program Studi S I

Ilmu Keperawatan STIKES Karya Husada Kediri

Shigella dysenteriae merupakan bakteri yang menimbulkan disentri basiler, rnemiliki patogenesis yang sangat kompleks. Langkah awal dalam berkembangnya kolonisasi oleh permukaan

Shigella dysenteriae adalah kemarnpuan mereka untuk melekat dengan

mukosa

dengan

fimbriae

atau

pili.

Tujuan

penelitian

ini

adalah

membuktikan molekul adhesi S

dyseteriae 49,8 kDa dan 7,9 kDa terhadap adhesi S. dysenteriae pada enterosit mencit serta untuk mengetahui daya protektivitas molekul adhesin S. dyseteriae 49,8 kDa dan 7,9 kDa terhadap pengeluaran cairan ke lumen usus.

Penelitian ini menggunakan hewan coba mencit Balb/C yang diimunisasi dengan protein sub unit pili

49,8 kDa, 7,9 k.Da dan ISCOM, diberikan pada hari ke 0, 7 dan 28.

Pada hari ke 35 mencit dimatikan dan dilihat kadar S-lgA usus halus dengan metode ELISA dan dilakukan uji protektifitas dengan metode mice ligated ileal loop dalam waktu 3 jam, dan dievaluasi berat usus tiap

30 menit yang menggambarkan peningkatan

ekskresi cairan di lumen usus. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Protein adhesi sub unit pili S.

Dysenteria 49,8 kDa dan 7,9 kDa adalah molekul adhesi dan dapat

menghambat sekresi cairan usus mencit melalui peningkatan respon imun s-IgA

Keywords: Protein pili, Shigella dysenteriae, s-IgA

Latar belakaog Shigellosis disebabkan

oleh

merupakan

penyakit

utama

(diare

yang

Shigella

spp.)

endemis

yang

terutama terjadi di negara berkembang dan penyebab tetsering penyakit diare yang berdarah. Di seluruh dunia paling sedikit ditemukan

80 juta kasus diare

dengan perdarahan. Dari angka tersebut diperkirakan

700.000

menyebabkan

kematian. Kasus kematian tersebut yang terbanyak sekitar

60% diderita oleh anak 1). Di

dibawah usia lima tahun (WHO 201

Indonesia, diare adalah penyebab ketiga rnorbiditas dan penyebab utama kematian bayi (Nazir et al.

1985). Shigella dysenteriae merupakan

bakteri

yang

menimbulkan

disentri

basiler, memiliki patogenesis yang sangat kompleks.

Terdapat

beberapa

langkah

untuk

itu

patogenitasnya.

untuk

Langkah

mendapatkan awal

berkembangnya kolonisasi oleh

dalam

Shigella

dysenteriae adalah kemampuan mereka untuk

melekat

dengan

permukaan

mukosa dengan fimbriae atau pili, yang merupakan salah satu kelompok utama adhesin bakteri

(Fuchs,

1998). Tanpa

langkah ini, tidak ada kolonisasi atau infeksi yang disebabkan oleh Shigella dysenteriae. Banyak protein adhesin telah terbukti

hemaglutinin,

yaitu

sebagai reseptor untuk adhesin

rnenjadi

dalam

berbagai jenis sel (termasuk enterosit) yang

sifatnya

sangat

mirip

dengan

reseptor dalam eritrosit. Hasil

penelitian

kami

sebelumnya menemukan bahwa molekul adhesin

Shigella dyseteriae pada bagian

pilinya

yang mempunyai berat molekul

1

•

I

7.9 k.Da merupakan protein yang dapat menghambat mencit

aglutinasi

bila

erythrocyte

direaksikan

dengan

asal

vaksin JCniS dikonjugasikan dengan sub

49,8

mr

kDa

hemaglutinin molekul

(Avanita,

adalah

yang

adhesin

juga

Shigella

201 1 ).

molekul merupakan

dyseteriae

Pemberian

protein

Tujuan membuktikan

dyseteriae tcrhadap

penelitian

rnt

molekul

adhesi

49,8

kDa

S

adbesi

49,8

terhadap pengeluaran

halus

yaitu

usus.

untuk

dilakukan penelitian

mengenai

respon

imun

S.

7,9

kDa

dysenteriae

pada

kDa

respon imun humoral pada mukosa usus menarik

dan

adalah

daya protektivitas molekul adhesin S

dyseteriae

sehingga

B

enterosit mencit serta untuk mengetah ui

tersebut diharapkan mampu meningkatan s-lgA,

unit

shigatoxin.

protein yang sama dengan berat molekul yang berbeda yaitu 49,8 kDa. Protein

yang

terutama

dan

7,9

kDa

cairan ke lumen

selanjutnya

Metode Peoelitian

terutama daya

proktektivitasnya dalam hal menghambat Metode yang digunakan dalam

pcngeluaran cairan ke lumen usus halus. Vaksin Shigellos s i yang terakhir adalah:

diujicobakan

Parenteral

conjugate vaccines yang berasal dari Shige.lla purifikasi hasil lipopolysaccharide (LPS) yang dikonjugasikan dengan

tetanus toxo id,

101

penelitian

adalab

eksperimental

laboratorium. Penel itian bertujuan untuk membuktikan

Shigella

protein

sub

unit

pili berat

dengan

dysenteriae

molekul 49,8 kDa dan 7,9 kDa adalah protein adhesi, untuk

mengetahui daya

recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A (PsA) dan CRM9 mutant diphtheria toxin. Vaksin i n i menunjukkan

protektifitas protein sub unit pili Shigella

daya lindungnya sekitar

cairan ke lumen usus.

74% (WHO

dysenteriae dengan

berat molekul 49,8

kDa dan 7,9 kDa terhadap pengeluaran

2011). Jenis vaccine lain adalah live attenuated vaccines yaitu substansi hidup dari strain Shigella yang telah

Kultur Shigella spp. Bakteri S, dysenteriae didapat dari

dilemahkan yang mengekspresikan baik

Laboratorium

S. jlexneri 2a dan 0-antigen S. sonnei

Surabaya

telab

dikembangkan

Setelab

diujikan,

sebagai

daya

China menunjukkan

vaksin.

proteksinya

di

6 1 -65% untuk S.

jlexneri 2a dan 57-72% untuk S. sonnei (WHO 20 1 1 ). Kandidat vaksin Shigella yang lain adalab: A formalin-inactivated S sonnei vaccine (SsWC) yang dikembangkan

dalam

bentuk

oral,

tergolong jenis killed, whole-cell vaccine oleh

Jolms

Hopkins

University

in

Baltimore, MD, USA, sampai phase

I

tetapi

(

hasilnya

belum

ada

laporan

WHO, 2 0 1 1 ) . CaJon yang

ingin

vaksin kami

untuk

Shigellosis

kembangkan

adalah

dan

Mikrobiologi digunakan

Kesehatan dikembangkan FKUB

adalah

Daerah di

Medium

tm

yang

TCG yang dapat

memperkaya pertumbuhan pili Medium

Lab.

bakteri.

mengandung

0,02%

thioproline, 0,3% NaHC03, 0,1% mono sodium 1-glutamat, 1 % bactotryptone, 0,2% yeast extract, 0,5% NaCl, 2% bacto agar dan I m M {3-amino ethyl ether -N,N,N,"n",-tetra acetic acid (EGTA) Metode yang digunakan seperti merujuk pada penelitian Ebara ( Ebara, et al., 1989).

Metode is o lasi pili

Shigella spp

Isolasi pili yang akan dikerjakan

berbasis molekul adbesin. Berdasarkan

meruj uk pada penelitian Ebara

hasil penelusuran pustaka diatas temyata

dalam

Prabowo

masib belum ditemukan mengenai vaksin

menggunakan

yang akan kami kembangkan tersebut,

Sumamo

(2011).

alat pili

(2000)

yang

(1988) dengan

cutter dibuat

desain oleh

2

•

...

:::x;-atorium

politeknik

Brawijaya

Malang.

tersebut

dicukur

Universitas

Suspensi dengan

bakteri

Kecepatan

digunakan

adalah

coomassie brilliant sigma low

blue dan molekul standar

range marker.

mencukur bakteri 5000 rpm selama 30 detik pada potongan ke-satu. Sedangkan potongan

ke-dua

sampai

ke-empat

Prosed ur

lmunisasi protein

dengan kecepatan I 0.000 rpm selama I menit dan masing-masing hasil cukuran

7,9

dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu ° 4 C. Cukuran diulang dan dihentikan

dengan

�1etode

IOO�g/1 00�1 ISCOM

dikonjugasi

l2flg/25�1

sebagai

adjuvan.

Shigella dysenteriae ditumbuhkan

dalam BHI broth selama 24 jam pada

Petunjuk

protein

isolasi

hemaglutinin pili seperti Ehara dengan modiflkasi

(Sumamo dkk,

dilakukan

I).

pili Shigella

Uji adhesi bakteri te rbad ap enterosit

49,8 k.Da

(20 I

kDa

isolasi Protein Pili S.dysentriae

Winarsih

Protein

dysenteriae 49,8 k.Da 100�g/100�1 dan

dilakukan sentrifugasi selama 30 menit

setalah supematan kelihatan jemih.

Penggabungan

adhesi (49,8 kDa dan 7,9 kDa + Iscom )

dkk,

1 998),

pada Hasil

seperti

penelitian koleksi

PBS yang mengandung l % BSA sampai 8 sekitar 10 / mi. Seratus

1991;

konsentrasi

yang

mikro1iter dari suspensi bakteri dicampur 6 dengan 100 ml suspensi dari l 0 enterosit

Prabowo

pili

3rC dipanen dan disuspensikan dalam

tersebut

mencit

per

ml

dalam

SDS-PAGE.

dibiarkan untuk diinkubasi pada 37°C

elektroforesis

yang

BSA.

yang

mengandung

Hasil

1%

PBS

dilakukan elektroforesis dengan metode

Campuran

berbentuk gel dipotong lurus pada bobot

selama 30 rnenit goyang dengan lembut,

molekul

hasil

selanjutnya bakteri yang

lurus

(melekat)

akan

berulang dengan PBS yang mengandung

49,8

potongan sehingga

m1

dipotong

tiap

mengandung Elektroelusi

pita

dialisis

adhesi

pencucian

l% BSA. Enterosit dikumpulkan dengan

alat

apparatus

elektroelusi

tidak

melalui

sentrifugasi 1500 rpm selama 2 menit dan

120 V selama 60 menit.

dari

dibuang

protein.

menggunakan

horisontal

aliran listrik dilakukan

tegak

potongnya tiga

electrofo ress i

Hasil

kDa. Kemudian

kemudian

dengan

cairan

disuspensikan dalam 300 mikroliter PBS. Ekstrak 20 mikroliter dari suspensi dan letakkan pada

slide kaca

membentuk

sebuah smear. Smear diwamai dengan

penyangga PBS pH 7,4.

Gram dan indeks adhesi dihitung dengan

Sodium Dodec y! Sulfate Polyacrylamid

al 1 993).

pengamatan

mikroskopis (Kobayashi

et

Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) Monitoring dikeijakan dengan

bobot

molelcul

menggunakan SDS­

PAGE metode Laemli (1970). protein

dipanaskan

100° C

Sampel selama

menit dalam larutan penyangga

5

yang

lmunisasi Imunisasi diberikan pada hari ke 0, 7 dan 28 secara oral (berdasarkan petunjuk dari Ab!SCO dari JSCONOVA). Kelompok A merupakan kelompok yang

mengandung 5 mM Tris HCI pH 6,8, 5%

tidak

2- m ercapto ethanol, 2,5% w/v sodium dodecyl sulfate, 10% v/v glyserol dengan

control.

menggunakan

pemberian vaksin berat molekul 49,8 kDa

wama

pelacak

bromophenol blue. Dipilih 12,5%

mini

dikenai

per1akuan

Kelompok

B

atau

sebagai

merupakan

kelompok yang dikenai perlakuan yaitu sub unit pili S.

slab gel dengan tracking ge/ 4%. Voltase

Kelompok

�!iran listrik yang digunakan adalah 120

pemberian vaksin protein molekul adhesi

mV.

dengan berat molekul 7,9 kDa dari sub

Sebagai

bahan

wama

yang

C

dysenteriae + Iscom. dikenai

perlakuan

3

•

unit pil: S d y sen!eriae + Iscom. Dan

keenam standart well dan 50 111 sampel

Kelompok D merupakan kelompok yang

ke

dikenai perlakuan yaitu pemberian vaksin

ditambahkan

protein molekul adhesi subunit pili berat

1 00111

molekul

49,8

kDa

dan

7,9

kDa

S

dalam

sample

HRP-conjugated antibody

pada

dishaker,

Kemudian

well.

tiap

ditutup

dysenreriae + I scorn. Pada hari ke 3 5

suhu 37°C selama

mencit dimatikan dan diambil 2 potongan

dilakukan

selanjutnya

well,

dan

diinkubasi

pada

1 jam. Setelah

washing

dengan

itu

washing

usus masing-masing sepanjang 10 em.

solution

Potongan

usus

ditambahkan chromogenic substrat A 50

mukusnya

untuk

pertama

diambil

pemeriksaan

s-IgA

111

sebanyak

5

kali.

Kemudian

dan Substrat B 50JII pada tiap-tiap

menggunakan metode ELISA, sedangkan

well, selanjutnya dishaker dan diinkubasi

potongan usus kedua digunakan untuk uji

pada suhu 37° selama 1 5 menit, lindungi

diare.

dari cahaya. Kemudian tambahkan stop solution 50 J!l dan segera diamati OD

Preparasi �lukus

larutan

Preparasi mukus adalah sebagai berikut: PBS

potongan

dingin.

sehingga

usus dicuci dengan

Kemudian

usus

dibuka

terlihat bagian mukosa usus

halus. Lapisan mukus diambil dengan cara

scraping

menggunakan

secara spatel

longitudinal

dan

ditampung

didalam tabung yang berisi PBS steril

/..,

pada

450

=

nm

menggunakan

ELISA

(Manufactured

by:

dengan reader.

immunology

Consultants Laboratory, inc.USA). Uji

Protektivitas Metode ini kami kembangkan di

laboratorium

sentral

biomedik

Pengujian

Protektivitas

dan protease inhibitor. Suspensi dikocok,

percobaan

dengan

kemudian disentrifus 1 2 .000 rpm pada

kelompok

perlakuan

FKUB.

menggunakan

usus

halus

dan

mencit

kelompok

4°C selama 1 0 menit. Supematan diambil

kontrol.

dilakukan pemumian. Disuspensi dengan

perlakuan untuk uji kadar s-lgA, yaitu

dilakukan

dan

PBS

menggunakan

PBS

dialysis

dan

digunakan

sebagai sample untuk pemeriksaan s-IgA

de0gan metode ELISA (Hem andez.et al., 1997; Santoso, 2002).

Perlakuan

menggunakan

dengan

ke-0,

7

dan

ELISA

Secretory

S-lgA

menggunakan

Immunoglobulin

A,

28,

dan

suntik

mencit

pada

minggu

dimatikan,

diambil

Usus halus

lambung dipotong

Pemeriksaan metode

metode

jarum

khusus. Imunisasi diberikan pada minggu berikutnya

S-IgA

pada

Imunisasi diberikan peroral pada rnencit dengan

ususnya.

Pemeriksaan ELISA

sama seperti

hingga

sepanjang

ujung

sepanjang

usus

ujung besar

1 0 em; kemudian

dengan

kedua ujungnya diikat dengan benang

Mouse

(MLIL!Mice Ligated Jlleal Loop) (Desain

S-lgA

ELISA kit dari NovaTeinBio. Parameter

Sumamo, yang

2007).

diikat

Masing-masing tersebut

usus

disuntikkan

yang diamati adalah kadar lgA di dalam

S.dysenteri ae sebat)yak

mukus usus halus mencit. Kit dikeluarkan

ditimbang

dari suhu 2-8°C dan dibiarkan pada suhu

Setelah ditirnbang usus dililitkan kedalam

ruang

alat

selama

30

menit

sebelum

sebagai

khusus

I OOJ!l kemudian

berat

(desain

awal

Sumamo)

usus. dan

digunakan. Kemudian well disusun ke

kemudian

dalam

diluent

Roswell Pack Medium Institute (RPMI)

sebagai

dan diputar diatas stirer dengan suhu

blanko sebanyak 50 �1, dan ke semua

3 7°C. Usus ditimbang setiap 30 men it

plate/strip.

dimasukkan standort

ke

well

masing-masing

Sampel

well pertama dan

sampel

50�1.

sebanyak

dimasukkan kedalam

media

sekali sampai 3 jam.

Ditambahkan

standart masing-masing 50�1 ke dalam 4

...

� [2] 12] �1':\X.'*-. ....�-�260k0a ._

Analisis Data Analisis

statistik

.

menggunakan

ANOVA. Penelitian ini bermakna bila p < 0,05. Kemudian dilakukan analisis Post

•v.ei:Va

Hoc dengan uji Tukey apabila terdapat

,....;.. 1151:0•

· :·'�·�,

.

'

lanjut

dengan Mann Whitney.

S. dysenteriae

penelitian

ekperimental dengan subyek penelitian mencit Balb/C sebanyak 20 ekor yang dibagi

menjadi 4 kelompok, masing­

masing kelompok terdiri dari

5 ekor

mencit.

Protein pili Shige/la dysenteriae 49,8

kDa

sebagai

Untuk bahan vaksin berupa protein pili S.dysenteriae 49,8 kDa yang cara

sebelumnya

lmunisasi

Isolasi protein pili 49,8 kDa

yang sama dengan

metode yang dilakukan prabowo, 201 0. Protein tersebut seperti yang ditunj uk pada Gambar 1 .

tersebut bahan

kemudian untuk

dipakai

imunisasi'

sedangkan protein pili Shigella dysenteriae 7,9 kDa menggunakan bahan yang

diisolasi dengan

171:0a

Gambar 2 Protein Pili BM 49,8 kDa

Hasil penelitian merupakan

:uk'O�

'

homogenitasnya maka menggunakan uji

mt

521:0a """' 1 •noa

. ....... I

""''· i 26k0a

tidak memenuhi syarat normalitas dan

Penelitian

-

•£M"

perbedaan yang signifikan. Apabila data

Kruskall Wallis kemudian diuji

9S�na 72�0•

�...., ·4>�

dysenteriae

protein

sudah

diproduksi.

pili

Shigella

lOOj.!g/lOOj.ll

tersebut

dikonj ugasi dengan ISCOM l2flg/25j.ll sebagai adjuvan yang diberikan melalui oral dengan sonde seperti jarum berujung bulat. Imunisasi diberikan 3 kali pada hari ke 0, 7 dan 28. Pada hari ke 35 mencit dimatikan dan dilakukan uji protektivitas dan pengukuran kadar s­ IgA. Hasil pengukuran tersebut dibandingkan antar keempat kelompok.

--. 49,8kDa

Hasil konfirmasi uji Adhesi bakteri

Hasil konfirmasi uji adhesi sel enterosit terhadap

menunjukkan bahwa molekul adhesin sub unit pili Shigella dysenteriae 49, 8 kDa

' �:'. Gambar 1 Profil Fraksi�asi Pili

dan 7,9 kDa adalah molekul adhesi. Berikut ini adalah gambar hasil uj i adhesi bakteri terhadap set enterosit.

S.dysenteri ae

Untuk lebih meyakinkan bahwa yang diisolasi benar-benar protein pili 49,8 kDa maka protein yang telah diisolasi tersebut dilakukan elektroforesis kembali dengan SDS PAGE (Gambar 2).

Gambar 3 Adhesi bakteri terhadap sel eoterosit A = Kelompok control (ISCOM) B

=

perlakuan protein 7,9 kDa+ISCOM

C = perlakuan protein 49,8 kDa+ISCOM

5

•

t

...

A

Hasil pengukuran S-lgA

Materi untuk pemeriksaan S-IgA

adalah mukus usus halus mencit pada 4

kelompok penelitian yang diukur dengan

metode ELISA. Hasil

Kruskall

analisis

Wallis

=

perlakuan

basil

=

dengan

protein

7,9

kDa+ISCOM, D = kelompok perlakuan

dengan

protein

kD+ISCOM

statistik dengan

didapatkan

kelompok control (ISCOM), B

perlakuan protein 49,8 kDa+ISCOM, C

49,8

kDa

+

7,9

Gambar 4 menunjukkan bahwa

signifikansi 0,04, karena nilai signifikansi

kadar s-lgA usus halus paling rendah ada

bahwa

diberikan !scorn).

< a (0,04 < 0,05), maka dapat di nyatakan signifikan

terdapat

perbedaan

antar

perlakuan.

keempat

yang

kelompok

Tabel 1 . Kadar s-IgA pada masingmasingkelompok Rerata N Kelomp (ftg/anl)±SD 0 ok

1

A

1,415±0,2618

2

B

3,313±1,368bc

D

Uji

Kruskall

Wallis

sig

merupakan kelompok · dengan kadar s­ lgA tertinggi.

Hasil Uji Protektivitas Uji

protektivitas

dilakukan

dengan cara menimbang berat usus mencit, yang sebeiumnya sudah diberikan perlakuan imunisasi dan di injeksi dengan Gambar

3.5. menunjukkan potongan usus halus kelompok mencit masing-masing

4,623±1,535b

4

Sedangkan kelompok

D (kelompok perlakuan imunisasi protein adhesin 49,8 kDa + 7,9 kDa + !scorn)

bakteri Shigella dysenteriae.

1 ,9 13±0,067ac

3

pada kelompok A (kelompok yang hanya

perlakuan.

0,04

(p<0,05) Keterangan: Kode huruf yang berbeda berbeda menunjukkan bermakna,

sedangkan huruf yang sama berarti tidak berbeda bermakna, dengan p<0.05. Kadar masing-masing kelompok

dapat dilihat pada Gambar 4. 7.000

6.000 '

'

.

...-...................

I f 5Jl00 > ----- ··--------!- ··

!I i l 4Jl00 :

�j

i

lJlOO uao

----

-1-

· ,· � ··-------

B.

49,s k6a, ' . ,_:; · · C. Protein 7,9 kDa,

D. Protein

I·

49,8 1<1)a + Protein 7,9 kDa .

L

1

::L:;; ='·-':, - .

Gambar 5. Potongan usus halos mencit 3 jam setelah uji protektifitas

----1 ..-1

uao ..

; 0.000 '

A kelompok control (ISCOM), B perlakuan protein 49,8 kDa+ISCOM, C perlakuan dengan protein 7,9 =

"

Protein

A;Ko�t{ol,

•

(

p

=

kDa+ISCOM, D

Gambar 4 Kadar S-IgA usus halos mencit (ELISA)

dengan

protein

kD+ISCOM

=

kelompok perlakuan 7,9 49,8 kDa +

6

•

I

...

Hasil analisis statistik dengan

Anova didapatkan basil signifikansi 0,000 (p < 0,05), maka dapat di nyatakan bahwa

signifikan

terdapat

perlakuan.

perbedaan

antar

keempat

yang

kelompok

Tabel 2. Berat usus mencit pada masing-masing kelom�ok Rerata NO Kelompok {Jlg/mi}±SD

A

yang telah dibuktikan Prabowo (20 I I ) sebagai protein adhesin. Pemberian

teori

imunisasi

kebanyakan

tidak

imunogenik,

sehingga diperlukan ajuvan yang dapat

merangsang respon imun yang lebih besar daripada apabila antigen diberikan sendiri. Dalam penelitian ini ajuvan yang adalah

dipakai

(Immunostimulating AbiSCO

1,000±0,4528

vaksin

dengan antigen protein per oral secara

dari

ISCOM

Complex)

ISCONOVA

yaitu

ISCOM

B

0,877±0,516

b

merupakan ajuvan golongan inert vaccine

3

c

b 0,900±0,459

dalam bentuk partikel. Antigen partikel

4

D

0,839±0,425

2

delivery yang membuat antigen terlarut

Keterangan: Kode huruf yang berbeda

lebih efektif sebagai imunogen oral dikarenakan (i) lebih tahan terhadap pengaruh pH di lambung, asam empedu dan enzim proteolitik di saluran cema (ii) partikel diabsorbsi melalui sel M ke

berbeda bermakna, dengan p<0.05.

sehingga menghasilkan konsentrasi antigen yang tinggi di tempat tersebut

b

U ji Anova sig0,00 (p<0,05)

menunjukkan

berbeda

bermakna, sedangkan huruf yang sama berarti tidak

Rata- rata basil penimbangan usus mencit pada masing-masing kelompok dapat dilihat pada gambar berikut :

dalam

Peyer

Patches

lebih

efisien,

(iii) tidak menimbulkan toleransi mukosal (McGhee, 1999). Sehingga dengan pemberian antigen yang dikonjugasi ISCOM dapat melindungi antigen dari degradasi dalam traktus gastrointestinal, disamping itu ISCOM mengandung saponin yang dapat

meningkatkan efektifitas melalui peningkatan

vaksin oral permiabilitas

mukosa usus (Mowat, 200 I ; I 998; Winarsih, 2005). imunogenik

Cheeke,

Untuk mengetahui potensi protein tersebut dalam

menginduksi respon imun mukosa (S­ IgA) maka dilakukan pemberikan imunisasi protein adhesin 49,8 kDa dan

7,9

Gambar 6 Rata-rata basil penimbangan usus mencit

kDa

dengan

dosis

pemberian

100 �g/lOO�l. Dosis protein adhesin tersebut berdasarkan penelitian Prabowo

(20 1 1) bahwa dengan pemberian protein

49,8 kDa dan 7,9 kDa dengan konsentrasi

Pembahasan mt

Penelitian

IOO�g dapat menghambat adhesi bakteri

merupakan

penelitian vaksinasi Shigella dysenteriae

berbasis molekul adhesin. Penelitian ini menggunakan

protein

7,9

protein

kDa

49,8

kDa

dan

Shigella dysenteriae

pada enterosit mencit dibanding kontrol

(p<0,05). Hal ini sesuai dengan basil

konfirmasi uji adhesi yang kami lakukan. 101 penelitian Hasil

menyatakan bahwa terdapat perbedaan

7

•

I -

•

s-IgA

kadar

kelompok

yang

2.:; :..:.:­

signifikan

kontrol

dan

kelompoi\

perlakuan dengan nilai signifikansi 0.0-i. Nilai signifikansi tersebut

< o. (0,0�

<

permukaar. mukosa dan selanjutnya akan dengan

dikeluarkan

pergerakan

mukosiliar dan peristaltik yang disebut immune

(Ogra,

exclution

2005;

Due,

0,05), maka dapat di nyatakan bahwa

2009). Adhesi bakteri merupakan tahap

terdapat perbedaan yang signifikan antar

terpenting

keempat

tanpa melewati tahap ini, bakteri tidak

kelompok

perlakuan.

Hasil

analisa Kruskal Wallis menunjukkan ada

perbedaan

kelompok

antara

A

dan

dapat

dalam

invasi

ke

lumen

usus

perbedaan

sesuai

dengan

kelompok

kelompok

A

dan

C (p=0,873). Kelompok B

dalam

Shigella,

sel

enterosit

sehingga inflamasi dan sekresi cairan ke

kelompok B (p=0,047), tetapi tidak ada antara

patogenesis

dapat dihambat.

menunjukkan

hasil

Hal

penelitian

bahwa

pada

ini

yang

kelompok

merupakan kelompok perlakuan dengan

dengan

pemberian imunisasi berupa protein 49,8

kelompok D, berat usus lebih ringan di

k.Da

banding kelompok lainnya.

dan

C

kelompok

merupakan

kelompok perlakuan dengan pemberian imunisasi

berupa

Menurut

Parslow

bahwa

protein

7,9

(200 1 ),

protein dengan

kDo..

dikatakan

berat molekul

kadar

Pada

s-IgA

tertinggi

kelompok +

D,

yaitu

pemberian

protein

49,8 k.Da

protein

7,9

kDa

mampu

meningkatkan respon imun

s­

lgA. Uji adhesi juga menunjukkan bahwa

lebih dari 10 f<Pa sampai dengan I 00

protein

k.Da memiliki sifat imunogenik. Apabila

adhesi bakteri tetapi masih ada bakteri

kurang

yang

dari

10

kDa

biasanya

tidak

berhasil

mampu

menghambat

menempel

pada

sel

enterosit yang kemungkinan masih dapat

bersifat imunogenik. Hasil

tersebut

penelitian

ini

juga

menyebabkan inflamasi. Oleh karena itu

p1enunjukkan bahwa kadar s-IgA usus

perlu penelitian lebih

halus paling rendah ada pada kelompok

pengaruh protein sub unit pili Shigella

A

dysenteriae terhadap respon imun seluler.

(kelompok

Iscom).

yang

hanya

Sedangkan

diberikan

kelompok

D

(kelompok perlakuan imunisasi protein

adhesin 49,8 kDa + 7,9 kDa + Iscom)

Peningkatan diharapkan

antara

kelompok

imun

seluler

menghambat

proses

Pemberian vaksin dengan materi molekul

adhesin

ini

mempunyai

B

keuntungan selain memberikan antibodi

(imunisasi dengan protein 49,8 kDa) dan

terhadap adhesin yang dapat menghambat

kelompok D (Imunisasi den gan protein

perlekatan bakteri juga antibodi

yang

signifikan

respon dapat

inflamasi akibat invasi bakteri patogen.

merupakan kelompok dengan kadar s­ IgA tertinggi tetapi tidak ada perbedaan

lanjut mengenai

49,8 kDa + protein 7,9 kDa). Dari basil

yang

terbentuk akan meningkatkan eliminasi

tersebut dapat disimpulkan bahwa protein

melalui

sub unit pili Shigella dysenteriae 49,8

mukosiliari yang disebut sebagai immune

k.Da dapat meningkatkan respon imun s­

exclusion

IgA.

Selain S-IgA

perlindungan terhadap

berperan utama

dalam

pada

mikroorganisme bersama-sama

mekanisme

pertahanan

mukosa

(Ogra,

itu

atau

2005;

vaksin

pergerakan Due,

berbasis

2009). molekul

adhesin memiliki efek samping reaksi

mukosa

lokal dan sistemik yang lebih ringan dari

patogen

pada

(Brandtzaeg, 2007; Boullier et al, 2009). S-IgA

peristaltik

whole-cell

(Centers for

Pemberian vaksin melalui oral

dengan innate

vaksin

Disease Control and Prevention, 2006). berdasarkan

pada

patogenesis Shigella

dapat menghambat kolonisasi dan invasi

dysenteriae adalah melalui oral. Selain

patogen (Everett et al, 2004). Mekanisme

itu pemberian vaksin melalui oral juga

S-lgA dalam pertahanan mukosa dengan

lebih

cara

mencegah

adhesi

bakteri

efektif

dibandingkan

melalui

ke 8

parenterai karena tidak perlu steril, mudah pemberiannya, dan tidak iritatif. Kesimpulan dan saran Protein adhesi sub unit pili S. molekul adhesi. Protein adhesi sub unit pili S. Dysenteria 49,8 kDa dan 7,9 kDa dapat menghambat sekresi cairan usus mencit melalui peningkatan respon imun s-IgA, sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pengaruh protein adhesi tersebut terhadap respon imun seluler ·

Daftar Pustaka

Ashkenazi S., J.H. Passwell, E. Harlev, D. miron, R. Dagan, N. Farzan, R. Ramon, F. Majadly, D.A. Bryla, A.B. Karpas J.B. Robbins and R. Schneerson. 1999. Saftty and immunogenicity of Shigellasonnei and Shigellaflexneri2a 0-specifi-c in conjugate polysaccharide children. J Infec Dis 179 (3): 325-

45. Tinny 201 1 .

and

Van Nnieu . 1 999. Rho GTP­ binding protein as targets for pathogens. microbial

PogMolSubcell Bioi. 22: m l 83-99

Dysenteria 49,8 kDa dan 7,9 kDa adalah

Avanita P., E.H. Sumarno.

3-��'..! et. P., P.J. Sansonettiand G. Trans

R.P.

Partial characterization of adhesionspili Shigelladysentriae( on

Unpublished). Boullier, S., M. Tanguy, K.A. Kadaoui, C. Caubet, P. Sansonetti, B. Corthesy and Annelle, Phalipoo, 2009. Prevents Intestinal Tissue Destruction by Secretory lgA Mediated Neutralization of Shigella Prevents flexneri Intestinal Tissue Destruction by Down-Regulating Inflammatory Circuits, J !mmunol, 1 83;5879-

5885. Brandtzaeg, P., 2010 Update on mucosal immunoglobulin in A gastrointestinal disease, Current Opinion in Gastroenterology 26:554-563.

Coker A.O, R.D, Isokpehi, B.N. Thomas, K.O. Amisu and C.L. Obi. Human Campylobacteriosis in developing countries.Emerg Infect Dis. 8 (3):

237-44. Everen, M.L., D. Palestranta, S.E. �1illerb,c, R.R. Bollingera,d, W. Parkera 2004. Immune exclusion and immune inclusion: A new model host-bacterial of interactions in the gut, Clinical

Immunology and Applied Reviews 4: 321-332. Hanh E., P. Wild, U. Hermans, P. Sebbel, R. Glockshuber, M. Haner, N. Taschner, P. Burkhard, U. Aebi and S.A. Muller. 2002. Exploring the 3D molecu/erarchitechture of Escherichiae coli type I pili. J

MolBio1 323 (5): 845-57. Kosek M., C. Bern and L.R Guerrant. 2003. The global burden of diarrhoeal disease, as estimated from studies between 1992 and 2000. Bull World Health Organ.

81 (3): 1 97-204 Lee Lerner K and B.W. Lerner. 2003. World of Microbiology and Immunology. Ed. Gale Thomson

Levine O.S and M.M. Levine. 1991. Hauseflies (Muscadomestica) as mechanical vectors of shigellosis.

Rev Infect Dis. 13 (4): 688-96. Nazir M., N. Pardede and R. Ismail. (1985). The incidence diarrhoeal diseases and diarrhoeal related mortality in rural sawpy low�land area ofSouth Sumatra Indonesia.

J Trop Pediatr. 3 1 (5): 268-72.

9

•

I

....

Niyogi,

S.K

.2005.

J.

Shigellosis.

Nhieu G.T. and P.J. Sansonetti.

I 999.

Mechanism of Shigella entry into epithelial

cells.

Curr0pinMicrobiol 2 (1): 5 1 -5.

Subekti, P.

Chaniadi, N.

Machfud,

S.

Komalarini.,

B.

Setiawan,

C.

Simanjuntak,

N.

Punjabi, A.L. Corwin, M . Wasfy, J.R. Cambell and M. Lesmana. 2002. Enteropathogens associated

with acute diarrhea in community and hospital patient in Jakarta, Indonesia. FEMS Immunol Med Microbial 34 (4): 139-46. Phalipon A., M. Tanguy, C. Granjean, C. Guerriro, F. Belot, D. Cohen, P.J. Sansonetti

and

L.A.

Mulard.

2009. A synthetic carbohydrate­ vaccine protein-conjugate candida!� aganst Shigellajlexneri

2a infection. J Immunol 182 (4): 2241-7.

2000.

Sansonetti.

The

pathogenesis of Shigellaflexneri infection: lesion on in vitro and in vivo studies. Philos Trans

R

SocLond B Bioi Sci. 355(1397): 2241-57.

Robbins

and R. Schneerson.

1999.

Protein conjugate of synthethic saccharides elicit levels

of serum

IgG

lipopolysaccharide antibodies in mice than do those of the 0specific

Protein

Adhesi

typhi

sebagai

virulensi berpotensi imunogenik rahadap produksi s-IgA protektif. Disertasi

Program

PascaSarjana

Univ. Airlangga Surabaya Sadorge C., A. Ndiaye, N. Beverdge, S. Frazer,

R.

Giemza, N. Jolly, J.

Johnson,

Liddy.

H.

Cos�rrove.

MarJov�i,

P.

C.A.

Allavena,

A.

Bechet,

A.

S.

Fontaine-Thomson, G.E. Griffin, F.

Dupont.

P.J. Sansonetti and

D.J. Lewis. 2008. Phase 1 clinical

trial of live Shigelladyseteriae

attenuated

type-! DeltaicsA.DeltaentDeltafepDeltast xA:HgR oral vaccine SC599 in healthy human adult volunteers. Vaccine. 26 (7): 978-87. Sasakawa C. 2010. A new paradigm of

bacteria-gut interplay brought of through the study B

Shigella. ProcJpnAcadSer

Sumamo., Noorhamdani A., Samsul 1., Sjoekoer M., 1992.

dan

Purifikasi

Hambatan Vibriocholerae Majalah

Ichinose Y.,

El

Protein Aglutinasi Tor

Kedokteran

179-6. Univ.

B rawij aya Malang 8 : 1 1 - 1 4 .

Pozgay V., C. Chu, L. Panel!, J. Wolfe,

higher

:OO].

PhysBiol Sci. 86 (3): 229-43.

Philpott D.J., J.D. Edgeworth and P.J.

J.B.

S..

Sdrr.onei!c

Microbial 43(2):m 133-43.

Oyofo B.A., D.

Santoso

polysaccharide

from

Shigelladyseteriae type I. Sansonetti P.J., C. Egile .1998. Moleculer

basic ofepithelial cell invasion by Shigellajlexneri. Antonie Leeuwenhoek 74 (4): 1 9 1-7.

Van

Sumamo. . 2000. Karakterisasi Molekuler

;

P orein Adhesi Vibriocholerae OJ dan Protein Reseptomya Pada Sel Epirel Usus Halus Tikus Putih srudi (Wiscar), Vibriocholerae 0I Program

Pasca

patogenitas

.

Disertasi

Sarjana

Univ.

Airlangga Surabaya. Sur D, T.

Ramamurthy

,

J. Deen and S.K.

Bhattacharya (2004). Shigelloss: i

chalenges

and

management

ssues. i Indian J Med Res. 120 (5): 454-62

10

•

...

Torres A.G.

2004.Currents aspects of

Shigella

pathogenesis.

Rev

LatinoamMicrobiol. 46 (34): 8997. WHO.

20 I

I.

Diarrhoeal

Diseases

(Updated February 2009)

11

•

I