1632 UMU Laporan Akhir Penelitian Risbin Iptekdok 2012
Analisis Molekuler Resistensi Isoniazid, Rifampisin, Pirazinamid, Etambutol dan Streptomisin dari Isolat Mycobacterium tuberculosis Pada Penderita Tersangka TB Paru Resistensi Ganda di Aceh
dr. Tristia Rinanda, M.Si dr. Yunita Arliny, Sp.P
FAKULTASKEDOKTERAN UNIVERSITAS SYIAH KUALA
2013
•
t
Laporan Akhir Penelitian Risbin Iptekdok 2012
Analisis Molekuler Resistensi Isoniazid, Rifampisin, Pirazinamid, Etambutol dan Streptomisin dari lsolat Mycobacterium tuberculosis Pada Pen derita Tersangka TB Paru Resistensi Ganda di Aceh
dr. Tristia Rinanda, M.Si dr. Yunita Arliny, Sp.P
I '1<-·'.
..
--- _ _
� .......
---_
T
--.-'1
1
N.� --
FAKULTASKEDOKTERAN UNIVERSITAS SYIAH KUALA
2013
t
-
KA.J'A PENGA.NTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT karena dengan berkah dan petunjukNya penulis dapat merampungkan penelitian yang berjudul "Analisis
Molekuler
Resistensi
Isoniazid,
Rifampisin,
Pirazinamid,
Etambutol dan Streptomisin dari lsolat Mycobacterium tuberculosis Pada Penderita Tersangka TB Paru Resistensi Ganda di Aceh". Penelitian ini merupakan bagian dari Riset Pembinaan Ilrnu
Pengetahuan dan Teknologi
Kedokteran (RISBIN IPTEKDOK) Tahun 2012 yang dibiayai oleh
Badan
Penelitian dan Pengernbangan Kesehatan (Balitbangkes), Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. Terirnakasih yang sebesar-besamya penulis ucapkan kepada Balitbangkes Kementerian Kesehatan Republik Indonesia yang telag membiayai penelitian ini. Demikian juga kepada Tim Panel Pakar Penyakit Menular yang telah memberikan masukan
dan
araban
yang
sangat berarti
dalam
penyempurnaan
protokol
penelitian, DR. dr. Mulyadi, Sp.P (K) selaku konsultan dalam penelitian ini, DR. Andriansjah
Rukmana,
S.Si,
M.Biomed
serta
seluruf
staf
Departemen
Mihobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Seluruh dokter dan perawat yang bertugas di Ruang Rawat Paru serta Poliklinik Paru/DOTS Rumah Sakit Urnum Daerah (RSUD) Dr. Zainoel Abidin Banda Aceh, serta Kepala Bagian dan tenaga teknis Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Syiah Kuala. Ucapan terima kasihjuga saya ucapkan kepada keluarga tercinta atas dukungan serta doa yang menjadi motivasi bagi penulis dalam merampungkan penelitian serta semua pihak yang telah mcmbantu terlaksananya penelitian ini. Penelitian pendeteksian
ini
diharapkan
mampu
memberikan
kontribusi
dalam
kasus Tuberkulosis Paru Resistensi Ganda!MultiDrug Resistant
Tuberculosis (MDR-TB) di Aceh .
•
t
I
-
ABSTRAK
Latar Bclakang dan tujuan: Rendahnya tingkat kepatuhan minum obat serta konilik
dan
bencana
tsunami
membuat
Aceh
memiliki
potensi
untuk
berkembangnya kasus MDR-TB. Namun hingga saat ini data mengenai MDR-TB di Aceh tidak tersedia. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan pendeteksian kasus MDR-TB di aceh serta melakukan pemetaan pola mutasi pada gen
katG,
pncA, embB
serta
rpsL
yang berperan dalam
rpoB,
resistensi Rifampisin,
Isoniazid, Pirazinarnid; Etambutoi serta Streptomisin. Metode: Sampel penelitian adalah penderita TB paru yang memenuhi kriteria klinis MDR-TB menurut Perhimpunan Dokter Ahli Paru Indonesia (PDPI). Sputum tersangka MDR-TB dikultur dan dilakukan uji sensitivitas terhadap Obat Anti Tuberkulosis (OAT) lini pertama setelah sebelumnya dilakukan pemeriksaan Basil Tahan Asam (BTA). Hasii uji sensitivitas yang menunjukkan resistensi dilanjutkan dengan analisis molekuler melalui isolasi DNA, amplifikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) serta penentuan urutan nukleotida dengan rnetode sekuensing. Urutan nukleotida yang diperoleh lalu ditentukan titik dan pola mutasinya dengan l!rutan nukleotida
Mycobacterium tuberculosis H37Rv
sebagai pembanding atau wild type menggunakan �oftware DNAstar. Hasil: Berdasarkan basil pemeriksaan BTA dan kultur diperoleh bahwa 52% (13 sam pel) BTA negatif dan kultur negatif, 36% positif,
4% (1 sampel)
(9 sampel) BTA positif dan kultur
BT A negatif dan kultw positif, 4% (1 sampel) BTA
positif dan masih menunggu hasil kultur serta 4% (1 sarnpel) belum diketahui hasil pemeriksaan BTA dan kultur. Basil uji sensitivitas/Drug Suceptibility Test (DST) dari 21 sarnpel yang terhadap
Rifampisin
Isoniazid
ditemukan
telal1 diketahui menunjulkan bahwa resistensi
ditem'Jkan pada 28% (7 pada
32%
(8
sarnpel),
sampel), resistensi resistensi
terhadap
terhadap
Etambutol
ditemukan pada 4% (1 sampel) dan resistensi terhadap Streptomisin ditemukan pada
20% (5 sampel). Sekitar
35% (7 sampel) merupakan MDR-TB dengan 5
sampel yang discrtai dengan resistensi terhadap Streptomisin dan 5% (1 sarnpel) rnerupakan poliresisten dengan resistensi
terhadap Isoniazid dan Etambutol.
Seluruh kasus resi�tensi baik MDR-TB maupun polircsisten mcrupakan kasus resistensi sekunder. Faktor ko-morbid yang ditemukan pada pasien tersangka TB paru resistensi ganda pada penelitian ini adalah Diabetes Melitus, yang ditemukan pada 24% (6 sarnpel) dan 16% (4 sarnpel) pada MDR-TB. Kata kunci: analisis molekuler, MDR-TB, sekuensing, Aceh
•
ii
t
I
DAFTA RISI
ABSTRAK ................................................................................................. . KATA PENGANTAR...................................................................................
11
DAFTAR lSI...... .......................................................... ................................
111
..........
1v
DAFTAR TABEL DAN GAMBAR................................................. DAFTAR LAMPIRAN . :
................................
:................ ·.......................... . . . .
BAB I
Latar Belakang ... ........... .. .... ..................... .. .......... ...... ....... .... ........
1
BAB II
Tinjauan Pustaka .... ........ .......... ............ ........................................
4
2.1 Multidrug Resistant Tuberculosis ........................ . .........................
2.2
4
Karakteristik dan Organisasi Genom Mycobacterium tuberculosis serta Kaitannya dengan Ekspresi Resistensi....................... . .. . . .
6
BAB III Tujuan dan Manfaat ......................................................................
13
3.1 Tujuan Penelitia.l ' ....... .... ........... ............ .................. .... ................. .
10
3.2 Manfaat Penelitian........................................................................
10
BAB IV Metode Penelitian ........................... ....... ......................... .............
11
BAB V
Hasil .. ........... ...... ....... ......... .............. ............ ..................... ... .......
22
BAB VI Pembahasan .............. ........ ........... . ............... ................... ..........
30
BAB VII Kesimpulan dan Saran ..................................... ............................
35
7.1 Kesimpulan ... ................................... ............ ........... .............. .....
35
7.2 Saran ........ .......................................... ................ ..........................
35
UCAPAN TERIMA K.ASIH. ............................................................... .......
36
DAFTAR PUS'fAKA .................................................................................
37
.
.
.
.
.
•
v
iii
.
t
-
DAFTAR TABEL DAN GAMBAR
Tabcl
2.1
Lokus gen yang terlibat
Mycobacterium tuberculosis ......... ............... ............. . ... ... ..... 7 .
Tabel
4.1
Tempat dan waktu penelitian . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
Tabel
4.2
Reaksi dan Kondisi PCR......................... .. ....... ...... ... ... ... .. . ... . ....
19
Tabel
4.3
Ukuran Produk PCR.................................................................
19
TabeJ
5.1
Distribusi frekuensi subjek penelitian berdasarkan
.
.
jenis kelamin............................................................................... Tabel
5.2
19
Distribusi frekuensi berdasarkan kategori tersangka MDR-TB. . .......... ........................ ... ......................... . . ......... . ..
Tabel
5.3
.
.
.
.
.
.
20
.
Sebaran lokasi asal subjek penelitian....................................................................................
'!abel
5.4
Basil pemeriksaan BTA, kultur dan Uji Sensitivitas..... ..... ... .... . ... ... .... ... ... . .... ... . . ... ..... .... .. ..................
Tabel
5.5
23
24
HL'l.sil Spektrofotometti hasil isolasi DNA menggunakan Kit komersial dan metode heatblock.................................................
25
Garnbar
5.6
Elektroforcgram Hasil PCR-nested gen katG ....................... ......
27
Gambar
5.7
Elektroforegram Hasil PCR-nested gen rpoB.... .................. .....
27
Gambar
5.8
Elektroforegram Hasil PCR-nested gen pncA ............................. 28
Gambar
5.9
Elektroforegram Hasil PCR-nested gen embB .. ............... ..........
Gambar
5.10 Elektroforcgram Hasil PCR-nestcd gen rpsL. ... ......... ................. 29
.
.
..
.
.
.
iv
.
.
28
.
t
I
DA.FTAR LA.i"IPIRAN
Lampiran
1 Naskah Penjelasan untuk Mendapatkan Persetujuan Subjek dan Inform Consent .. .... ... .. ......... ....... .....
40
2 Realisasi Anggaran
44
.
Lampiran
Biaya Risbin Iptekdok 2012
v
....................
-
BABI
PENDAHlJLUAN
Tuberkulosis
(TB)
adalah
penyakit
infeksi
yang
Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis) masalah kesehatan yang penting di dunia. pada tahun
disebabkan
oleh
dan saat ini menjadi (WHO)
World Health Organization
1992 telah mencanangkan TB sebagai global emergency. Saat ini
sepertiga penduduk
dunia
telah
terinfeksi
Mycobacterium tuberculosis
menurut WHO jumlah kasus terbesar terdapat di Asia Tenggara, yaitu seluruh kasus TB di dunia. Penderita TB di Indonesia rnerupakan penderita TB
dunia
kematian mencapai
dan diperkirakan
terdapat
dan
33% dari
5,8%
dari
528.000 kasus baru dengan
91.000 jiwa per tahun. Selain tingginya m0rtalitas dan
morbiditas, TB juga rnenimbulkan beban sosial ekonomi yang cukup tinggi dimana hampir
70% pendcritanya mempakan usia prcduktif 1•
Di Tahun
1995, pemerintah mencanangkan progtam Directly Observed
Treatment Shortcourse
(DOTS). Berkat implementasinya yang sangat intensif di
Indonesia, rnortalitas dan morbidit3S TB 111enumn secara drastis. Di Tahun tercatat mortalitas TB mencapai mencapai
2008
253 per 100.000 penduduk dengan mortalitas
38 per 100.000 penduduk. Meskipun dernikian, saat ini muncu]
permasalahan yang lain yang cukup serius dan mengancarn, yaitu rneningkatnya kasus ko-infeksi HIV serta fenomena TB
Multidrug Resistant Tuberculosis
(MDR-
l Berdasarkan
tahun
Early Drug Resistant Survey
(EDRS) di jawa tengah pada
2006, MDR-TB terjadi pada 1 ,9% kasus baru dan 16,3% pada kasus yang
telah mendapat pcngobatan. Kernatian akibat MDR-TB cenderung Jebih tinggi dan progresif dimana terjadi dalarn waktu
80% kasus mengarah pada kematian dan 50-80% kernatian
4-16 minggu. Selain itu MDR-TB juga menimbulkan beban
ekonomi yang sangat tinggi akibat lamanya masa rawat<·n dan per.�obatan3 .
•
�
I
-
Resesi ekonomi, konfiik, bencana alam, industrialisasi adalah sosioekonomi yang mendukung munculnya
falctor-fclctor
4 MDR-TB . Provinsi Aceh pasca
konflik dan bencana tsunami memiliki potensi yqng mendukung munculnya fenomena MDR-TB. Konflik aceh yang berlangsung sejak tahun bencana tsunami pada tahun
1998-2004 serta
2004 telah memberikan dampak terhadap kepatuhan
penderita minum obat serta pengawasan dari petugas kesehatan/pengawas minum obat. Selain itu konflik dan bencana juga mempengaruhi ketersediaan/suplai obat ·
(OAT) ke· daerah konfliklbencana serta sulitnya penyelenggaraan pelayanan kesehatan, penyuluhan, pengawasan minum obat dan pelaporan kasus. Keadaan ini memungkinkan terjadinya resistensi OAT bahkan MDR-TB. Prevalensi kasus TB paru di Aceh pada tahun
2011 mencapai 96 orang per 100.000 pendududu.k,
namun yang sangat disayag n kan data mengcnai MDR-TB di Aceh tidak ada. 5 Dengan kata lain hingga saat bel urn ada pelaporan kasus MDR-TB di Aceh . Data mengenai penderita TB sangat penting karena beberapa hal berikut: (1) Indonesia merupakan negara dengan
succeptibility data
menjadi
indikator
sehingga
high burden program
yang
sangat
baseline drug penting
(2)
Berdasarkan data dari beberapa wilayah, identifikasi dan pengobatan TB melalui Rumah Sakit mencapai
20-50% dari kasus BT A positif, dan lebih banyak lagi
untuk kasus BT A negatif. Jika tidak bekerja sama dengan Puskesmas, maka banyak. pasien yang didiagnosis oleh RS memiliki risiko tinggi dalam kegagaJan pengobatan, dan mungkin menimbulkan kekebalan obat (3) karena belurn adanya jaringan laboratorium nasional dengan standar dan kualitas yang memadai, 6 generalisasi dan kualitas dari data yang tersedia tidak dapat ditentukan . Resistensi
Mycobacterium tuberculosis
terhadap obat discbabkan oleh
mutasi yang terjadi di gen tertentu pada genom, seperti
katG dan inhA
untuk Isoniazid,
embB
untuk etambutol,
rpoB pncA
untuk Rifampisin,
untuk pirazinamid.
Secara garis besar, pevalensi resistcnsi terhadap OAT bervariasi di seluruh dunia. Beberapa titik mutasi yang telah diketahui tidak dapat menjelaskan mekanisme resistensi secara keseluruhan. Selain itu prevalensi mutasi dapat berbeda karena 7 dipengaruhi oleh d1stribusi geografis . Analisis PCR sebaiknya ditunjang dengan
direct sequencing
terhadap gen-gen yang rclevan atau terlibat dalam MDR-TB. 2
t
I
Data mengenai hubungan antara fenotip, rcspon klinis dan jenis serta posisi mutasi
akan
menjamin
tindakan
cepat
yang
diperlukan
untuk
membatasi
8 meluasnya transmisi dan infeksi MDR-TB • Pada penelitian ini akan dilakukan pendcteksian kasus MDR-TB di Aceh dan dilanjutkan dengan analisis molekuler terhadap sejumlah gen pada genom
Mycobacterium tuberculosis
yang terlibat dalam resistensi Isoniazid, Rifampisin,
Etambutol, Pirazinarnid dan Streptomisin yang merupakan komponen lini pertama pengobatan TB. Pada penelitian ini dilakukan pemetaan mutasi pada gen-gen pengkode resistensi yaitu penentuan jenis dan lokasi mutasi pada tiap-tiap gen dari penderita MDR-TB di Aceh yang belum pemah dilakukan sebelumnya. Hal ini sangat
penting karena
mengenai jenis
mutasi dipengaruhi
oleh
distribusi
geografis.
Data
dan lokasi mutasi pada isolat Aceh bisa saja berbeda dengan isolat
di daerah lain. Data mengenai pola mutasi berperan penting dalam penelusuran transmisi infeksi untuk mencegah penyebaran MDR-TB.
3
t
BABII TINJAUAN PUST AKA
2.1 Multidrug Resistant Tuberculosis
Multidrug Resistant Tuberculosis disebabkan
oieh
(MDR-TB) adalah tuberkuJosis yang
Mycobacterium tuberculosis
yang
secara
in vitro
telah
menunjukkan resistensi terhadap OAT ini pertarna, yaitu Isoniazid dan Rifampisin dengan atau tanpa resistensi terhadap obat lainnya. Kasus resistensi obat ini terbagi atas kasus baru, yaitu ditemukannya
Mycobacterium tuberculosis
galur
yang resisten pada penderita yang baru didiagnosis mengidap tuberkulosis, belum pemah mengkonsumsi OAT sebelumnya atau sudah mengkonsumsi OAT kurang dari
1 bulan. Kasus ini disebut juga resistensi primer. Selain itu terdapat kasus
resistensi OA.T pada penderita yang telah mendapatkan terapi tuberkulosis dimana pada pasien tersebut ditemukan setelah
pasien
mendapatkan
Mycobacterium tuberculosis terapi
tuberkulosis
minimal
yang telah resisten selama
1
bulan.
juga
dapat
Resistensi ini juga disebut resistensi sekunder (dapatan)1•6•9. Berdasarkan diklasifikasikan
jenis
obatnya,
dalam monoresisten
res1stensi
terhadap
(resistcns terhadap
OAT
isoniazid
saja
atau
rifampisin saja), poliresisten (resisten terhadap salah satu Isoniazid atau rifampisin dan disertai dengan resistensi terhadap OAT lainnya), MDR (resisten terhadap isoniazid adan Rifampisin) serta terhadap
Isoniazid
dan
Extensively Drug Resistant/XDR (resisten
Rifarnpisin
serta
salah
satu
obat
dari
golongan
florokuinolon dan salah satu obat OAT lini kedua/·5·6•9. Prevalensi kasus TB di Indonesia pada tahun penduduk dengan angka kematian mencapai TB diperkirakan muncul sebanyak
2006 mencapai 25311 00.000
38/100.000 penduduk. Kasus MDR
2% dari kasus baru dan 19% dari kasus lama.
World Health Organization memperkirakan kasus MDR-TB akan meningkat sebanyak tahun4•
2% setiap tahunnya dengan prevalensi total secara global 4,3 % per Prevalensi
kasus
MDR-TB
di
Indonesia
cenderung
mengalami 4
•
t
.
pen!ngkl:!ta!l. Penelitian Adicamei dau Wi_jar..arkv (1996) menunjukkan jumlah resistensi primer sebanyak 6,8% dan resistensi sekunder 15,61% 10 . Penenlitian Aditama dan Soepandi (2000) mcnunjukkan resistensi primer sckitar 4,6-5,8% dan resistensi sekunder yang meningkat mencapai 22,95-26,09%11• Fenomena
resistensi
adalah
fenomena
buatan manusia
(man-made
phenomenon). Resistensi ini umumnya disebabkan oleh pengobatan yang tidak adekuat dan penderita MDR-TB menjadi sumber penul::rran di masyarakat. Terdapat sejumJah kondisi yang menciptakan celah dan kesempatan untuk berkernbangnya MDR-TB, yaitu 9,12: 1.
Pernberian terapi yang tidak adekuat
2. Keterlambatan diagnosis menyebabkan masa infeksius yang panjang sehingga rr.emungkinkan penyebaran Mycobacterium tuberculosis galur resisten 3.
Pasien MDR-TB diobati dengan pemberian OAT jangka pendek dan monoterapi, Hal ini berakibat juga pada tidak adekuatnya pengobatan, bertambahnya daftar obat yang resisten (amplifier effects) dan memungkinkan penyebaran Mycobacterium tuberculosis galur resisten
4.
HIV merupakan infeksi penyulit yang akan memperpanjang waktu infeksius dan memungkinkan terjadinya penyebaran
Mycobacterium tuberculosis
resisten Resistensi terhadap OAT dapat terjadi akibat adanya sejumlah faktor berikut: 1 . Faktor mikrobiologi, meliputi adanya resitensi primer dan sekunder, amplifier
effects, derajat virulensi bakteri (kemampuan bertahan hidup lebih baik) serta penularan Mycobacterium tuberculosis galur resisten 2. Faktor klinik, terbagi atas A. Penyelenggara kesehatan, meliputi keterlambatan diagnosis, pengobatan yang tidak adekuat (tidak sesuai pedoman), pelaksanaan DOTS yang tidak baik/optimal serta tidak ada/kurangnya pelatihan mengenai Tuberkulosis. B. Faktor Obat, meliputi efek samping obat yang berat serta jangka waktu minum obat yang cukup lama akan menurunk:an tingkat kepatuhan pasien dan penyerapan obat yang kurang baik akibat kondisi tcrtcntu (diare, 5 •
t
i
gangguan penyerapan,
tc li), kualitas ohat yang km·ang baik, regimcr. cbat
yang tidak tepat serta ketersedian obat yang sulit dijangkau.
C. Pasicn, meliputi tidak adanya Pengawas Minum Obat (PMO) yang baik, transportasi
sulit,
biaya
pemeriksaan
penunjang
yang
mahal/tidak
terjangkau. D. Faktor Program meliputi tidak adanya DOTS-PLUS, tidak tersedianya fasilitas pemeriksaan uji kepekaan yang memadai, biaya pelaksanaan program yang cukup besar 3.
Faktor ko-infeksi HIV. Penderita TB-HIV akan lebih rnudah tertular dan mengembangkan TB-MDR karena kondisi dasar adanya gangguan penyerapan obat
2.2 Karaktcristik dan Organis�si Genom Mycobacterium
tuberculosis serta
Kaitannya dengan Ekspresi Resistensi
Mycobacterium tuber cuiosis
memiliki karakteristik pertumbuhan yang
lambat, dorman, memiliki komponen dinding sel yang kompleks, merupakan organisme
intraseluler serta
memiliki
homogenitas genetik
13 .
Karakteristik
pertumbuhan yang lambat dan dorman sangat bcrkontribusi dalam kronisitas infeksi yang ditimbulkan. Hal ini juga berdampak pada larnanya masa terapi selain
juga
menjadi
kendala
bagi
para
peneliti
terutama
dalarn
hal
menumbuhkannya bakteri Basil Gram positif ini. Keadaan dormansi merupakan akibat dari ditekannya jalur mctabolik bakteri akibat aktivasi sistem imun seluler. Mekanisme ini merupakan bentuk pertahanan terhadap infeksi narnun tidak dapat mengeradikasi
infeksi.
Apabila
ter:jadi penurunan
sistem
imun dan
proses
penuaan, maka infeksi akan teraktivasi dan menimbulkan infeksi dalam waktu 14 yang cukup lama dengan infeksi awal •
Mycobacterium tuberculosis
memiliki kemampuan untuk mengembangkan
resistensi secara alamiah terhadap berbagai antibiotika. Resistensi ini dapat disebabkan oleh struktur dinding sel yang yang sangat hidrofobik dan berperan
6 •
,
-
dalam mempertahankan permeabil itas dinding serta dikodekan oleh gen-gen tertentu dalam genom 15. Resistensi yang terjadi pada MDR-TB disebabkan oleh karena adanya sejumlah mutasi pada sejumlah gen yang mengkode sensitivitas Mycobacterium
tuberculosis terhadap OAT atau terjadinya titrasi obat akibat adanya overproduksi target. Sebagian rt:sistensi terjadi akibat adanya mutasi yang bersifat spontan pada 16 gen target • Jenis OAT dan gen yang terlibat dalarn resistensi terhadap OAT tcrsebut dapat dilihat pada tabel 2..1
Tabel 2 . 1 Lokus gen yang terlibat dalam resistensi pada Mycobacterium
tuberculosis Obat
Gen
Rifampisin
rpoB
Isoniazid
katG
Streptomisin
rpsL
Pirazinamid Etambutol Sumber: Rattan et al, 1998
pncA embB
Frekuensi dalam
Produk
strain resisten
B-subunit RNA J20lymerase Katalase2eroksidase Ribosomal 12 rotein S12 Amidase EmbB
> 95 % 60-70% 60% 70-100% 69%
Probabilitas untuk terjadinya resistensi sangat tinggi pada jenis obat dengan tingkat efektifitas yang rendah seperti etionamid,
tiasetazon,
viomisin
kapreomisin dan sikloserin (1 o-3); intermediet terhadap Isoniazid, Etambutol, kanami sin dan p-amino salisilic acid (1 o-6) serta sangat rendah terhadap Rifampisin (1 o-8). Kemungkinan untuk terjadinya resistensi juga terkait dengan kadar/kandungan bakteri3J 6• Mutasi yang terkait dengan resistensi OAT bersifat kromosomal, sehingga pola mutasi bersifat individual. Kemungkinan suatu mutan untuk menunjukkan rcsistensi terhadap lebih dari 1 jenis obat juga bersifat individual. Hal ini juga yang menyebabkan mutan MDR dapat berkembang lebih cepat. Resistensi hanya akan menguntungkan bakteri pada saat terpapar dengan obat target. Dalam 7 •
t
I
ktaJaar. tertentu, bakkri yang sensitif akan mati dan mutan akan berkembang biak dengan pesat tanpa adanya persaingan yang berarti dalam hal nutrisi. Ketika
penderita dipaparkan pada obat lain yang tidak efektif atau adekuat dalam membunuh
Mycobacterium tuberculosis,
obat tersebut. Tuberkulosis pada menjadi
kasus kronik
kasus MDR cenderung akan berkembang
dan kondisi
Mycobacterium tuberculosis galur
maka akan te.rjadi resistensi terhadap
ini semakin mempermudah
penyebaran
6 17 MDR 1 • •
Berikut ini adalah . seju.. 11la.� gen yang terlibat dalam mekanisme resistensi terhadap sejumlah OAT3•16'17 1.
Gen
katG.
Gen ini berperan daJam mengkode enzim katalase-peroksidase
yang dibutuhkan untuk mengaktivasi Isoniazid (INif) yang masuk ke dalan1 tubuh
sebagai pro drug. Dalam
mekanisme kerjanya
INH mengharnbat
biositesis mycolic acid sehingga bakteri menjadi rentan terhadap paparan radikal bebas dan faktor lingkungan lainnya. Dari sejumlah penelitian yang dilakukan terhadap sekuens gen katG pada isolat yang
resisten
terhadap
INH
Mycobacterium tuberculosis
menunjukkan bahwa
mutasi
yang
terjadi
terdistribusi secara acak, meliputi mutasi satu titik, delesi dan insersi lebih dari 1 hingga
3 basa. Salah satu titik yang paling sering terpetakan adalah rnutasi
basa G menjadi T pada kodon 483 sehingga asam amino Leusin berubah menjadi Arginin. 2.
Gen
1poB.
Gen
rpoB
adalah gen yang mengkode sub unit beta, salah satu
struktur penyusun enzim DNA
polymerase. Gen ini bertanggung jawab
terhadap rcsistensi Rifampisin. Rifampisin bekerja dengan berikatan pasa sub unit beta DNA polymerase. Mutasi yang terjadi pada gcn rpoB akan merubah struktur sub unit beta sehingga Rifampisin kehilangan
site of action.
Mutasi
umumnya terjadi pada 81 pasang basa di daerah core dan biasanya berupa perubal1an nukleotida tunggal yang akan mengakibatkan perubahan susunan asarn amino. Mutasi berupa delesi inframe serta insersi juga dapat teljadi pada frekuensi yang lebih rendah. Perubahan asam amino serin pada kodon serta Histidin pada kodon
531
526 ditemukan pada 70% isolat resisten terhadap
Rifampisin. 8 •
3.
Gen €mbB. Gen i11i mewpakan salah satu dari sejumlah gen yang menyusun kerangka baca terbuka yang mengkodekan protein penting yang berperan sebagai target dari Etambutol. terhadap
isolat
resisten
substitution di gen
embB
Dari sejumlah penelitian yang dilakukan
Etambutol,
ditemukan
mutasi
berupa
missense
pada kodon 306 yang mengkode metionin menjadi
Isoleusin, Valin atau Leusin. 4.
Gen
pncA.
Gen
pncA
adalah gen yang mengkode enzim amidase. Sejumlah
penelitian terhadap isolat
Mycobacterium tuberculosis
yang resisten terhadap
Pirazinamid m�nunjukkan bahwa telah terjadi sejumlah mutasi berupa insersi dan delesi nukleotida, imssense alteration dan mutasi terminasi di sepanjang gen
pncA .
5. Gen rpsL. Gen ini memperaniarai resistensi terhadap Streptomisin. Umumnya resistensi
terhadap
Streptomisin
am;noglycoside modifYing enzyme. Mycobacterium tuberculosis.
terj: adi
akibat
asetilasi
rpsL
rrs
oleh
Namun mekanisme ini tidak terjadi pada
Pada bakteri ini resistensi terjadi akibat adanya
mutasi titik pada protein S 12 ribosomal yang dikode oleh gen mutasi pada operon
obat
rpsL
serta
yang mengkode protein 16S rRNA. Mutasi pada gen
merupakan dua pertiga dari keseluruhan resistensi terhadap Streptomisin.
Mutasi yang terjadi pada gen
rpsL
berupa perubahan residu Lisin menjadi
Arginin pada posisi 43 dan 88 serta perumahan Lisin menjadi Treonin pada posisi 43 .
•
t
GAB HI TUJUAN DAN M��FAAT
3.1 Tujuan Penelitian 1.
Melakukan pendeteksian kasus MDR-TB di Aceh.
2. Melakukan pemetaan pola mutasi gen katG, rpoB, pncA, embB dan rpsL y:mg merupakan gen-gen yang terlibat dalam resistcnsi Isoniazid, Rifampisin, Pirazinanlid, Etambutol dan Streptomisin pada isolat Mycobacterium tuberculosis dari tersangka TB paru resistensi ganda di Aceh
3.2 Manfaat PeneJitian
l. Hasil kultur dan uji sensitivitas dijadikan sebagai acuan terapi bagi penderita MDR-TB 2.
Memberikan informasi data MDR-TB bagi institusi yang terkait dalam pelaksanaan program DOTS dan DOTS PLUS.
10 •
,
I
BABIV METODE PENELITIAN
1.
Rancangan Penelitian Penelitian
tm
merupakan
penelitian
desk:riptif
dengan
pendekatan
observasional laboratoris.
2.
Tempat dan Waktu Penelitian Tempat dan waktu penelitian dapat dili hat pada tabe! 4.1 Tabel. 4.1 Tempat dan waktu penelitian Kcgiatan Penelitia.-=n :._
T a:.._ t e m __:: :...: = ::Jpc.:: =.: _ RS Kabupaten dan Poli
__ _
.:....:
Wak t u == :::.:=:.
__ _ _ __
-
--
Penjaringan penderita
DOTS RSUD dr.
Maret 2012-Desember
tersangka MDR-TB
Zainoel Abidin Banda
2012
Aceh Pemeriksaan BTA, kultur serta uji sensitivitas
Laboratorium M ikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas
Maret 201 2-sekarang
Indonesia Laboratorium
lsolasi DNA
Mikrobiologi Fakultas
September 2012-
Kedokteran Universitas
sekarang
Indonesia Laboratorium PCR
Mikrobiologi/Biologi Molekuler Fakultas
Oktober 20 12-sckarang
Kedokteran UNS YIAH Sekuensing
P.T Genetika Science
Desember 2012-
Indonesia
sekarang
Laboratorium Analisa Data
Mikrobiologi!Bioplogi Molekuler Fakultas
Desember 2012
Kedokteran UNSYIAH
11 •
3.
Populasi dan Sampel Populasi pada penelitian ini adalah seluruh penderita TB paru tersangka
MDR-TB
di Aceh.
Sampcl pada penclitian ini adalah penderita
TB yang
memenuhi kriteria secara klinis sebagai tersangka MDR-TB. Sampel diambil dengan metocie
purposive sampling,
dimana seluruh penderita TB paru yang
memenuhi kriteria MDR-TB, dari sejumlah daerah di Aceh atau yang datang memeriksakan dirinya di Poli DOTS RSUD dr. Zainoel Abidin Banda Aceh, akan dirninta untuk mengeluarkan sputwnnya untuk kemudian diperiksa lebih lanjut. . Penentuan rnasuk-tidaknya penderita ke dalam kriteria klinis MDR-TB ditentukan oleh dokter �li paru di masing-masing daerah dan dokter paru yang bertugas di Poli DOTS RSUD dr. Zainoel Abidin Ban.da Aceh. Kriteria MDR-TB 9 1l! menurut Perhimpunan Dokter Paru Indonesia (PDPI) antara lain • •
Kasus TB Paru dengan gagal pengobatan pada katagori
2, dibuktikan
dengan rekam medis sebelumnya dan riwayat penyakit terdahulu. •
Pasien TB Paru dengan hasil pemeriksaan dahak tetap positif setelah sisipan dengan katagori
•
2
Pasien TB yang pemah diobati di fasilitas non DOTS, termasuk yang mcndapat OAT lini kedua seperti kuinolon dan kanamisin.
•
Pasien TB Paru yang gagal pengobatan katagori l.
•
Pasien TB Paru dengan hasil pcmeriksaan dahak tetap positif setelah sisipan dengan katagori
1.
•
TB Paru kasus kambuh.
•
Pasien TB yang setelah !alai pada pengobatan katagori
1 dan atau katagori
2 •
Suspek TB dengan keluhan, yang tinggal dekat dengan pasien TB MDR konfirmasi, tennasuk petugas kesehatan yang bertugas di bangsal TB MDR.
•
TB-HIV
12 •
I
4.
Prosi'dur .Pcnditian
1.
Pengambilan spesimen (sputum) Pengumpulan
sputum terbaik
adalah
sputum pagi hari atau
sputum
se:malam sebanyak 3-5 mL yang ditampung dalam wadah penampung. Wadah penampung bempa wadah yang bemmlut lebar, mempunyai tutup berulir, tidak mudah pecah, suci hama, tidak bocor dan sekali pakaildisposable. Pasien diminta berkumur terlebih dahulu. Pasien dalam posisi berdiri, jika tidak memungkinkan, bisa dalam keadaan duduk dengan agak membungkuk. Pagi hari setdah bangun tidm-, biasanya rangsangan untuk batuk terasa lebih kuat, pasien dirninta untuk menahannya dan menarik nafas da1am. Kemudian segera disuruh batuk sekuat kuatnya sehingga terasa sputum keluar dari tenggorokan. Sputum yang keluar ditampung di wadah yang telah disediakan. .Tika penderita sulit mengeluarkan sputum, maka
dapat dilakukan
induksi sputum.
Induksi dilakukan
dengan
memberikan cairan hipertonik (NaCl 3%) me!alui nebulizer selama 15-20 menit. Induksi sputum tidak boleh dilakukan pada penderilli yang hip�rsensitif terhadap bahan induksi. Mulut wadah penampung dibersihkan dari tetesan sputum atau liur lalu ditutup rapat dengan kertas parafilm serta dibungkus dengan plastik yang tertutup rapat untuk mencegah kebocoran. Wadah diberi label yang bertuliskan nama pasien,
alamat
Laboratorium
dan
tanggal
Tubcrkulosis,
pengambilan.
Departcmen
Spesimen
Mikrobiologi
lalu
dikirimkan
ke
Fakultas Kedokteran
Universitas Indonesia.
2.
Pembuatan preparat Basil Tahan Asam dan pembacaan Pcmbuatan prcparat BTA dilakukan dengan cara sebagai berikut:
a.
Tulis nomor identitas pasien pada bagian ujung kaca objek.
b.
Ambil bahian dahak yang purulen dengan menggunakan ose atau lidi yang telah dipipihkan bagian ujungnya lalu sebarkan di kaca objek secara merata hingga mencapai ukuran pulasan 2x3
em.
13 •
t
c.
Sediaan :sh1 dikeringkaii. di udars. Setd"h kering sediaan difiksasi dengan cara pemanasan (dilewatkan di atas api Bunsen selama
1 detik sebanyak 3
kali). Apusan siap diwarnai. d.
Letakkan kaca objek dengan apusan menghadap ke atas, lalu dibubuhi carbol fuschin hingga menutupi seluruh bagian apusan, lalu dipanasi dari bagian bawah sediaan hingga keluar uap (namun tidak boleh sampai mendidih).
e.
Sediaan lalu didiamkan selama
f.
Bilas secara hati-hati dengan air mengalir lalu keringkan.
g.
Berikan asam alkohol di atas preparat hingga tidak terlihat lagi warna dari
5 menh..
carbol fuschin kemudian bilas dengan air mengalir. h.
Tambahkan methylene blue di atas pcnnukaan sediaan, biarkan selarna
10-20
detik. 1.
Bilas sediaan dengan air mengalir. Sersihkan bagian tepi preparat dari sisa zat wama, lalu diamati di bawah mikroskop.
Preparat yang telah selesai diwarnai dapat dibaca dengan cara sebagai berikut: a.
Jika tidak ditemukan B TA minimal dalam
1 00 lapang pandang, maka
dilaporkan sebagai negatif. b.
Jika ditemukan
1-9 BTA dalarn 100 lapang pandang ditulis sebanyak BTA
yang ditemukan per c.
Jika ditemukan sebagai
d.
100 lapang pandang.
10-99 BTA dalam I 00 lapang pandang, rnaka dilaporkan
1+
Jika ditemukan
1-10 BTA dalarn 1 Japang pandang, periksa minimal 50 lapang
pandang, maka dilaporkan sebagai e.
Jika ditemukan lebih dari
2+
10 BTA dalam 1 lapang pandang, periksa minimal
20 lapang pandang, maka dilaporkan sebagai 3+
3.
Dekontaminasi Sputum Sebelum diperiksa lebih lanjut, sputum harus didekontaminasi terlebih
dahulu dengan cara sebagai berikut:
l4 •
t
a.
Sputum dimasukkan ke dalam tabung befsih bertutup ullr laiu ditair.bahlca..! akuades hingga mencapai volum 2 mL. Penambahan akuades dimasukkan untuk menurunkan viskositas, terutama pada sputum yang sangat mukoid. Campuran ini lalu dihomogenkan dengan cara divorteks.
b.
Sputum lalu ditambahkan larutan NaOH 4% sebanyak 2 mL lalu divorteks kembali agar homogen.
c.
Campuran tersebut lalu disentrifus dengan. kecepatan 300
x
g selama
1 5 menit
- pada suhu 4°C, setelah sebelumnya bagian luar tabung yang berisi sputum dibersihkan dengan alkohol 70%. Setelah selesai alat sentrifus jangan dibuka dulu melainkan ditunggu hingga 1 0 menit untuk mengantisipasi terbentuknya aerosol dari proses sentrifugasi. d.
Supematan yang dibentuk dibuang sebanyak 2 mL.
e.
Supematan yang tertinggal di dalam tabung ditambahkan dengan Jarutan HCL
1 N hingga terjadi perubahan warna dari wama basa (pink) menjadi wama asam (kekuningan) lalu divorteks agar homogen. f.
Untuk selanjutnya dilakukan penambahan NaOH 4% dan HCL
1 N sesuai
kebutuhan untuk mencapai kondisi pH netral (7) yang dapat ditentukan dengan menggunakan pH indikator. Tahapan mencapai pH netral ini tidak boleh dilakukan lebih dari 30 menit karena dapat mematikan bakteri (akibat terpapar asam atau basa terlal u lama) g.
Sputum yang telah didekontaminasi dapat ditumbuhkan di media Lowenstein Jensen (LJ) atau MGIT.
4.
Kultur dan uj i sensitivitas Kultur ditumbuhkan pada dua media, yaitu media padat LJ serta media
cair MGIT. Prosedur kultur pada media LJ adalah sebagai berikut: a.
Sejumlah sputum yang telah didekontaminasi diambil dengan ose lalau digores di media agar miring LJ.
b. Media dibiarkan dalam posisj ditidurkan selama 24 jam. c.
Media diinkubasi pada suhu 37°C. Prosedur kultur di media MGIT adalah sebagai berik.ut:
15 •
t
I
a. Ke dalam
supplement MOlT yang telah ter$edia di dalam
tabur.g
ditambahkan 800 �L PANTA. b. Lalu ditambahkan 500 �--tL sputum yang telah didekontarninasi. c . Bagian Juar tabung dibersihkan dengan alkobol 70%, lalu dirnasukkan ke dalam rnesin BACTEC-MGIT 960 (BD) d. Sampel yang rnenunjukkan basil positif akan dilanjutkan dengan perneriksaan BTA dari kultur MGIT. Jika basil positif, dilanjutkan dengan uji resistensi. Jika basil kultur MGIT negatif dan hasil pemeriksaan BTA juga negatif, maka tidak dilanjutkan ke uji resistensi.
Uji resistensi dilakukan terbadap OAT lini pertama, yaitu Streptomisin, Isoniazid, Rifampisin dan Etambutol (SIRE) dengan proscdur sebagai berikut: a. Untuk setiap sampel disiapkan sejurnlah wadah dengan tutup ulir yang berisi glass heeds, 4 rnL NaCl 0,9 %, 10
rnL NaCl
0,9% serta 6 tabung MGIT untuk
kempatjenis OAT, kontrol dan PNB. b. Sebanyak 1 mL suspensi bakteri dimasukkan ke dalam wadah berisi glass beeds, lalu divorteks selarna 2 rnenit. c.
Suspensi lalu didiamkan selama 10 menit.
d. Arnbil
l
mL bagian yang jemih, lalu dimasukkan ke dalam wadah berisi 10
mL NaCJ 0,9% dan dihomogenkan. e. Sebanyak 1 00 �L larutan dari wadah berisi 10 mL NaCl 0,9% dimasukkan ke dalam wadah yang berisi 4 mL NaCl 0,9% lalu dihomogenkan. f.
Kc dalam tiap tabung MGIT terdiri dari komposisi sebagai berikut: •
Tabw1g kontrol : 800 �L suplemen MGIT dan 500 J.!L suspensi dari wadah yang berisi 4 mL NaCl 0,9%.
•
Tabung untuk uji resistensi: 800 �L suplemen MGIT, 500 J.!L suspensi dari wadah berisi 1 0 mL NaCI 0,9%
dan
100 �L antibiotik SIRE (Dosis;
Streptomisin 83 J.!giJ.lL, Isoniazid 8,3 J..tg/�L, Rifampisin 83 J.!g/J.!L
dan
Etanlbutol 4 1 5 J.!giJ.!L).
16 •
i
Tablmg
•
untuk uji PNB
:
800 J.!L PANTA, 500 J.!L suspensi dari wadah
yang berisi 4 mL NaCI 0,9% DAN 166 J.!L PNB. g. Keenam tabung dimasukkan ke dalam mesin BACTEC MGJT 960.
5.
Isolasi DNA Prosedur
Isolasi
DNA
Mycobacterium
tuberculosis
dilakukan
menggunakan kit QIAamp DNA mini Kit (Qiagen) dengan langkah sebagai berikut: a. Masukkan 1 mL kultur cair MGIT ke dalam tabung mikrosentrifus dengan tutup ulir. b. Sentrifus 5000 x g selama 1 0 men it untuk mendapatk:an pelet sel, kemudian buang supernatant. c. Tambahkan 20 J.ll Proteinase K. d. Tambahkan 200 )..tl Buffer AL, lalu divorteks agar homogen e . Suspensi lalu diinkubasi pada suhu 56°C selama 30 menit dan dila!'ljutkan dengan inkubasi pada suhu 95°C selama 1 5 menit. f.
Sentrifus beberapa detik
g. Tambahkan 200 J.ll etanol 96% lalu homogenkan suspensi dengan cara vortex. dan disentrifus beberapa saat. h. Pindahkan suspensi ke dalam kolom QIAamp yang telah diberi tabung pengumpul dibawahnya, lalau sentrifus 6000 x g selama 1 menit lalu buang filtratnya. 1.
Tambahkan 500 J.ll Buffer AWl lalu sentrifus 6000 x g selama 1 menit dan buang filtratnya.
J.
Tambahkan 500 J.ll Buffer A W2, lalu sentrifus dengan. kecepatan tinggi 20.000 x g selama 3 menit. Filtrat yang terbentuk dibuang dan kolom dipindahkan ke tabung mikrosentrifus.
k. Sentrifuss lagi dengan kecepatan 20.000 x g selama 1 menit lalau buang filtratnya. Pindahkan kolom ke tabung mikrosentri fus baru. 1.
Tambahkan 200 J.ll buffer AE, lalu inkubasi di suhu ruangan selama 5 menit.
m. Sentrifus dengan kecepatan 6000 x g selama 1 menit.
17 ,
u.
Ulangi penan1bahan Buff�r AE sebanyak 2 kali.
o. Simpan DNA pada suhu -20 °C. Isolasi DNA juga dilakukan dengan metode heatblock. Prosedur kerja
heatblock adalah sebagai bcrikut: ,d dari tabung MGIT dihomogenkan dengan cara memipet naika. Diambil 500 . turun .
b. Suspensi lalu disentrifus l O.OOOxg selama 15 menit, lalu supernatant dibuang. c. Ditambahkan akuades steril sebanyak 300 �l lalu divorteks. . d. lnkubasi dengan waterbath/heatblock selama 15 menit pada suhu 25°C e. Sentrifus pada kecepatan 13.000 x g selama 5 menit, lalu ambit supemata11t>
6. Polymerase Chain Reaction(PCR)-nested Amplifikasi DNA Mycobacterium tuberculosis dilakukan dengan metode PCR-nested, menggunakan 2 pasang primer untuk tiap-tiap gen yang diamati. Amplifikasi dilakukan dalam 2 tahap (first round dan second round). Pemilihan gen yang akan diamati dalam peneliti�"l ini didasarkan pada gen yang paling banyak dijumpai!mengalami mutasi pada isolat klinis dari berbagai penelitian yang telah dilakukan sebelumnya. Rattan et al ( 1998) telah merangkum gen-gen yang terlibat dalam resistensi Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT serta frekuensi ditemukannya dalam strain yang resisten. Primer yang digunakan pada penelitian ini sebagian besar merupakan primer yang digunakan pada penelitian sebelumnya oleh Choi, et al (201 0) untuk pasangan primer untuk gen katG, rpoB, pncA dan embB serta Ozturk (2005) untuk pasangan primer untuk gen rpsL pada tahap 1 (first round)3•7• 19. Untuk kepentingan nested-PCR tahap 2 maka pada penelitian ini dilakukan perancangan primer untuk gen rpsL untuk amplifikasi pada tahap 2. Perancangan
primer
Mycobacterium
ini
menggunakan
urutan
H37Rv
yang
tuberculosis
(www.ncbi.nih.nlm.gov/genbank)
sebagai
nukleotida gen rpsL tersedia
templat.
di
Perancangan
dari
GenBank pnmer
menggunakan program PrimerSelect (Software DNAstar). Karakteristik kandidat primer yang dihasilkan juga dapat dianalisa menggunakan program yang sama.
Spesifitas
primer
dianaiisis
men
ggunakan
progr::t:n
BLAST
(www.ncbi.nih.nlm.gov/blast). Reaksi dan kondisi PCR yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 4.1 berikut ini. Tabel 4.2 Reaksi dan Kondisi PCR Primer KA-JF:
ggtcgacattcgcgagacgtt KA-2F:
catgaacgacgtcgaaacagc KA-1 R: ttgttcctgcgacgcatcgtg KA-2R:
ggcccggggtgaagggcaccg RP-1 F: gcagacgctgttggaaaa RP-2F:
ggagaagcgctacgacctggc RP-1 R: tacggcgtttcgateaacc RP-2R:
gttgacccgcgcgtacaccga EM-IF: ccgaccacgctgaaactg EM-2F:
gcgatcgtggccaccgtcgtc EM-IR: aggcgcatccacagactg EM-2R:
tccacagactggcgtcgctga PN-1 F: gtcggtcatgttcgcgatcg PN-2 F:cgtcatggaccctatatctgt PN-1 R: gctttgcggcgagcgctcca PN-2R:
cgccgccaacll!,>tlCatcccg
(Ozturk et at, 2005)
STR- 1 f: ggccgacaaacagaacgt
STR- lR: gttcaccaactgggtgac
Reaksi
Kondisi
20 J.!l reaksi yang terdiri dari: PCR tahap 1 • 1 JlL (I 0 pmol) ma sing-ma sing primer tahap I 0,5 Jll dNTP (20 mM) JlL 0,2 Taq Polymerase (SUI JlL) 2,5 r.tL Ruffer Taq • 1,5 J.lL MgC12 25 mM • 2 Jll DNA hasil isolasi
PCR tahap 1 : Pre denaturasi 5 ', 96°C Denaturasi 20", 96°C Annealing 30'', 58°C Elongasi 60' ', 72°C Post elongasi 1 0 ' , 72°C PCR tahap 2: Sarna dengan tahap 1 Jumlah Siklus : 30
PCR tahap 2 2 r.tl produk PCR tahap I • 1 JlL (10 pmol) masing-masing primer tahap 1 • 0,5 Jll dNTP (20 mM) r.tL 0,2 Taq l'olymerase (5U/ f!L) • 2,5 flL Buffer Taq 1,5 JlL MgC12 25 mM •
STR-2F:
cagcagctggtccgcaagggtc STR-2R:
accaactgcgatccgtagacc
Produk PCR kemudian akan dikarakterisasi dcngan Elektroforesis DNA menggunakan gel Agarosa 1% dalam buffer TAE l X dan interkalasi dengan Ethidium Brornida. Ukuran produk PCR yang diharapkan dapat dilihat pada Tabel 4.2 berikut.
19 •
,
- ----
-
Tabel 4.3. Ukuran Produk PCR
Primer
Gen Target
Rentang Amplifikasi
Ukuran (Pb)
732- 1 7 19 768-1 7 1 1 1 1 0 1 - 1 772 1 1 3 1 - 1 746 640-1055 676-1 048 -105-616 -77-596 1 5 1 7-2003 1 575-1 984
988 944 672 616 416 373 720 673 486 409
KA-JF&KA-lR KA-2F&KA-2R RP-I F&RP-lR RP-2F&RP-2R EMlF&EMlR EM-2F&EM-2R PN-lF&PN-lR PN-2F&PN-2R STR-1 F&STR-1 R STR-2F&STR-2R
katG
rpoB
embB pncA
1 Primer telah digunakan dalam pcnelitian Ozturk et a!, (2005). Untuk nested PCR dirancang
sepasang primer
lain
yang akan menempcl pada gen rpsL. Perancangan dilakukan
menggunr.kan software DNAstar menggunakan tern plat Mycobacterium tuberculosis H3 7R v .
7.
Sekuensing Penentuan urutan nukleotida dilakukan dengan metode
Primer yang digunakan adalah primer forward dan PCR tahap pertama (Rl dan arab).
reverse
direct sequencing.
yang digunakan dalam
F l ) dari masing-masing gen target (pembacaan 2
Primer-primer ini digunakan berdasarkan pertimbangan bahwa sekitar
1 0-
20 ba<>a pertama yang tidak terbaca pada saat pembacaan tidak akan mengenai gen target sehingga urutan nukleotida gen target dapat dianalisa sechra utu h. Hasil sekuensing akan dianalisa mutasi dengan cara membandingkan urutan nukleotida yang diperoleh dengan urutan nukleotida masing-masing gen yang terdapat pada genom
Mycobacterium tuberculosis
H37Rv sebagai sekuens acuan. Analisis
dilakukan dengan pensejajaran menggunakan program SeqMan pada software DNA star untuk penentuan pola mutasi lcbih lanjut.
5.
Analisa Data Data yang diperoleh dianalisis secara univariat. Data berupa basil UJ I
sensitivitas serta pola mutasi masing-masing gen dari tiap spesirnen dijabarkan dalam bentuk narasi dan tabel.
20 •
t
5.
Persetujuan Etik Penelitian ini menggunakan manus1a sebagai subjek penelitian, yaitu
penderita tersangka MDR-TB. Pengambilan spesimen berupa sputum dilakukan dengan cara yang tidak invasif. Dalam hal pengambilan spesimen, kerj asama yang baik dari penderita tersangka MDR-TB sangat diperlukan. Sebelum pengambilan sputum, pasien akan mendapatkan penjelasan terlebih dahulu serta harus bersedia untuk terlibat dalam penelitian dengan cara memahami dan . menandatangani inform· consent yang teJah disiapkan. Jika penderita sulit dalam mengeluarkan sputum, maka dapat dilakukan induksi sputum. Tindakan ini dilakuk:an dengan memegang teguh prinsip mengutamakan keselamatan dan kenyamanan penderita. Meskipun prosedur induksi sputum tidak invasif, namun bagi beberapa individu yang hipersensitivims akan dapat rnenirnbulkan bronkokonstriksi. Untuk itu sebelurn prosedur induksi sputum dilakukan, perlu dilakukan beberapa perneriksaan seperti spirometri serta perlu dipersiapkan obat-obatan yang bersifat bronkodilator. Unsur kerahasiaan mengenai identitas serta kondisi penyakit subjek penelitian juga akan sangat diutamakan. Penelitian ini dilakukan dengan persetujuan dan di bawah pengawasan dari Komisi Etik Penelitian Fakultas Kedokteran Universitas Syiah Kuala.
21 •
t
BAB V HASIL
Sejak penelitian dimulai pada bulan Maret 2012, telah ditemukan sebanyak 25 subjek penelitian yang memenuhi kriteria klinis tersangka TB Paru resistensi ganda. Sputum dari seruM subjek penelitian telah dikirimkan ke Laboratorium Tuberkulosis Departcmen Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia yang merupakan salah satu laboratoriurn rujukan untuk penegakan kasus MDR-TB di Indonesia. Dan 2 5 orang subjek penelitian, 52% adalah wanita (13 sampel) dan 48% adalah laki-laki (12 sampel). Sebanyak 40% (10 sampel) termasuk dalam kriteria Pasien TB Paru dengan basil pemeriksaan dahak tetap positif setelah sisipan dengan katagori 2, 1 6% (4 sarnpel) tennasuk katagori BTA positif setelah sisipan kategori 1, 12% (3 sampel) termasuk gagal terapi kategori 1, 1 2% (3 sampel) termasuk kasus kambuh, 8% (2 sampel) termasuk kasus gagal kategori sampel) termasuk kasus lalai pada pengobatan kategori
1,
2,
4% ( 1
4% (1 san1pel) adalal1
kasus TB-HIV dan 4% (1 sarnpel) adalah kasus baru (skrining BTA positif). Karakteristik subjek penelitian berdasarkan jenis kelamin dan kategori tersangka MDR-TB dapat dilihat pada tabel 5 . 1 dan 5.2 berikut.
Tabel 5 . 1 Distribusi frekuensi subjek penelitian berdasarkan jenis kelamin No 2
Perempuan Laki-laki
Jenis Kelamin
N=25 13
52
12
48
22 •
t
Tabel 5.2. Distrtbusi fre.kuensi heHlasarkan k.atcgori tcr::;a..J.gka MDR-TB No 1 2 3 4 5 6 7 8
N=25
%
BTA
positif
setelah
sisipan
c,Jengan
10
40
BTA
positif
setelah
sisipan
dengan
4
16
3 3 2
12 12 8 4 4 4
Kategori Tersangka MDR-TB katecrori 2 kate ori I
Gagal terapi kategori 1 Kambuh
Ga ga! tera pi kategori 2 Lalaipengobatanpada kategori 1 TB-HIV
1 .
Kasus Baru (skrining BTApositif)
Sampel penelitian diperoleh dari sejwnlah kabupaten/kota di Provinsi Aceh. Sebanyak 48% ( 1 2 sa:mpel) berasal dari Kota Banda Aceh, 36% (9 sa:mpel) berasal dari Kabupaten Aceh Besar, 4% ( 1
sampel), berasal dari Kota
Lhokseumawe, 4% (1 sampel) berasal dari Kabupaten Aceh Barat Daya dan 8% (2 sampel) berZ�.sal dari Kabupaten Pidie (tabel 5.3).
Tabel 5.3. Sebaran lokasi asal subjek penelitian No
Lokasi Banda Aceh
2A'-ceh---'Besar ---"'- --'--''---- ----- ----Pidie 3 4 5
N=25 12 9 2
48 36 8 4 4
Lhokseumawe Aceh Barat Da ya
Berdasarkan hasil pemeriksaan BTA dan kultur diperoleh bahwa 52% (13 sampel) BTA negatif dan kultur negatif, 36% (9 sampel) BTA positif dan kultur positif, 4% (1 sampel)
BTA negatif dan kultur positif, 4% ( 1 sampel) BTA
positif dan masih menunggu basil kultur serta 4% (1 sampel) belum diketahui hasil pemeriksaan BTA dan kultur. Hasil uji sensitivitas/Drug Suceptibility Test (DST) dari 21 sampel yang telah d iketahui menunjukkan bahwa resistensi terhadap Rifampisin ditemukan pada 28% (7 sarnpel), resistensi terhadap Isoniazid ditemukan pada 32% (8 sampcl), resistensi terhadap Etarnbutol ditemukan pada 4% (1 sampel) dan resistcnsi terhadap Streptomisin ditemukan pada 20% (5 sampel). Sekitar 35% (7 sampel) merupakan MDR-TB dengan 5 23
,
sampel yang disertai dengan resistcnsi terhadap Strcptomisin dan 5% ( 1 s31Tipe!) terhadap Isoniazid dan Etambutol.
merupakan poliresisten dengan resistensi
Seluruh kasus resistensi baik MDR-TB maupun poliresisten merupakan kasus resistensi sekunder. Faktor ko-morbid yang ditemukan pada pasien tersangka TI3 paru resistensi ganda pada penelitian ini adalah Diabetes Mehtus, yang ditemukan pada 24% (6 sampel) dan 16% (4 sampel) pada MDR-TB. Rekapitulasi hasil pemeriksaan BTA serta hasil uji sensitivitas terhadap OAT lini pertama dapat dilihat pada tabel 5.4 berikut:
Tabe1 5.4 Hasil pemeriksaan BTA, kultur dan Uji Sensitivitas sam pel
Basil Pemeril<..saan BTA MGIT
Hasil Kultur MGIT
1 2
Negatif Negatif
Negatif Ncgatif
No
Basil Uji Sensitivitas s
I
E
R
Mycobacterium
3
Positif (2+)
tuberculosis
Positif (3+)
5
Positif (3+)
6 7
Ncgatif Negatif
8
Positif ( 1+)
9
Positif (I+)
10
Positif ( l +)
11
Negatif
12 13
Negatif Negatif
tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis
R
R
s
s
R
R
s
s
R
R
s
R
R
R
s
MDR-TB
R
R
R
s
MDR-TB
s
R
s
R
Negatif Negatif Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium
tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis
BAH
BAH BAH
Positif(3+)
15
Positif (I+)
Poliresisten
BAH
Negatif Negatif Mycobacterium
14
MDR-TB dengan Diabetes Melitus MDR-TB dengan Diabetes Melitus MDR-TB
R
Mycobacterium
4
Ket
tuberculosis
s
R
R
s
A1ycobacterium
R
R
R
s
tuberculoss i
MDR-TB dengan Diabetes Melitus MDR-TB dengan 24
•
, --------·
Diabetes Melitus
16
21
Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif Ncgatif
22
Positif (3 +)
23
Negatif Positif ( 1 +) BAH
17 18
19
20
24 25 Ket:
S=
streptomtsm,
BAH=Belwn Ada
Negatif Negatif N egatif Negatif Negatif Negatif Mycobacterium tuber"culosis
Negatif BAH BAH !=Isoniazid,
DM (+)
BAH BAH BAH BAH BAH BAH BAH ·BAH BAH BAH BAH BAH
R=R. ifampisin,
E=Etambutol;
R=resisten,
S=Sensitif,
Hasil
Pada tahapan selanjutnya dilakukan isolasi DNA dari 6 sampel, yaitu sampel 3, 4, 5, 8, 1 0 dan 1 1 . Iso!asi DNA menggunakan kit QIAamp DNA mini kit dan metode heatblock. Hasil isolasi DNA dianalisis secara kuantitatif menggunakan
spektrofotometri
DNA (NANODROP
1 000)
pada
panjang
gelombang 260/280 nrn. Hasil analisa kuantitatif dapat dilihat pada tabel berikut:
Tabel 5.5. Hasil Spektrofotometri hasil isolasi DNA menggunakan Kit komersial dan metode hcatblock Kadar DNA (Jlglpl) No sampel
Kit komersial (dalam 200 J.d Buffer AE)
Hcatblock (dalam 300 J.d ddH20)
2
2,8
1 1 ,4
4
7
13,4
5
7,5
8,6
8
2,7
6,2
10
1 ,9
1 1 ,6
11
7 ,3
6
Primer yang digunakan untuk amplifikasi
gen rpoB, katG, pncA dan
embB, merupakan primer yang digunakan pada PCR-nested dalam penelitian Choi et al (2010). Primer yang digunakan tmtuk mengampli:fi kasi gen rpsL adalah primer dari penelitian Ozturk (2005). Ur :uk kepentingan PCR-nested dari gen rpsL, pada penelitian ini dilakukan perancangan primer rpsL yang digunakan pada 25
I
i1ca11gan primer menggunakan progran1 Primer Select (DNAstar) tahHp kedua. I>cr& menghasilkan primer STR2F: 5 ' -CAG CAG CTG GTC CGC AAG GGT C
dan
STR2R: 5'sACC AAC TGC GAT CCG TAG ACC. Pada tahap ampliftkasi dilakukan sejumlah langkah optimasi reaksi dan kondisi PCR. Optimasi dilakukan terhadap jumlah templat DNA, jumlah enzim Taq Polimerase, konsentrasi MgCl2 serta suhu annealing. Reaksi dan kondisi PCR yang di.gunakan seagai baseline adalah sesuai dengan yang dilakukan oleh Choi (201 0)� Namun hasil karakterisasi . dengan elektroforesis menunjukkan tidak terbentuknya pita di ukuran yang diinginkan. Pita DNA terbentuk di ukuran di bawah pita ukuran terkecil dari marka. Hal ini menunjukkan bahwa templat tidak Leramplifikasi. Hal ini bisa disebabkan karena jumlah templat terlalu sedikit. Pada optimasi berikutnya dilakukan penambahan jumlah templat menjadi 6 111 dan 8 11L Jumlah enzim Taq Polimerase juga ditingkatkan hingga 1 ,2 Unit. Suhu annealing yang digunakan adalah 55°C. Sampel yang digunakan sebagai templat adalah sampel DNA 04 dengan metode heatblock (asumsi kadar DNA lebih banyak). Pada karakterisasi dengan elektroforesis gel agarosa 1 % terlihat bahwa tidak terbentuk pita di ukuran yang diinginkan. Terbentuknya pita di bawah ukurau terkecil marka DNA ukuran 1 00 pb kern bali menunjukkan bahwa templat tidak teramplifikasi. Untuk itu dilakukan optimasi konsentrasi MgCl2 yang digunakan. Pada reaksi PCR oleh Choi et al, digunakan MgC12 1,5 mM. Pada langkah optimasi konsentrasi MgC12 yang digunakan ditingkatkan menjadi 25mM dan suhu annealing juga dinaikkan mencapai 58°C .Hasil karakterisasi produk PCR dari gen katG, rpoB, pncA, embB dan rpsL dapat dilihat pada gambar 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 dan 5 . 1 0
26 •
t ---
- -
-
-
Gambar 5.6 Elektroforegram Hasil PCR-nested gen katG. 1 .
Marka DNA 100
pb; 2. Gen katG sampel 3; 3. Gen katG sampel 4; 4. Gen katG sampel 5 ; 5 . Gen katG sampel 8; 6. Gen katG sampel 10; 7. Gen katG sam pel 1 1 ; 8. Kontrol negatif
1000 500
Gambar 5.7 Elektroforegram Hasil PCR-nested gen rpoB . 100
.
l . Marka DNA
pb; 2. Gen rpoB sarnpel 3; 3. Gen rpoB sarnpel 4; 4. Gen rpoB
sampel 5 ; 5. Gen rpoB sampel 8; 6. Gen rpoB sampel 1 0 ; 7. Gen rpoB sampel 1 1 ; 8. Kontrol negatif
27
•
t ------
1000 500
Gambar 5.8 Elektroforegram Hasil PCR-nested gen pncA.
pb;
2.
1 . Marka DNA 100
Gen pncA sampel 3; 3. Gen pncA sampel
4; 4.
Gen pncA
sampel 5; 5. Gen pncA sampel 8; 6. Gen pncA sampel I 0; pncA sampel 1 1 ;
8.
7.
Gen
Kontrol negatif
1000
Gambar 5.9 Elektroforegram Hasil PCR-nested gen embB. 1 .
Marka DNA
1 00 pb; 2. Gen embB sampel 3; 3. Gen embB sampel embB sampel
5; 5 .
4; 4.
Gen
Gen embB sampel 8; 6. Gen embB sampel 10; 7.
Kontrol ncgatif; 8 . Gen embB sampel 1 1
28
•
t ---
I
1000 500
Gambar 5.10
Elektroforegram Hasil PCR-nested gen rpsL. 1 . 100
Marka DNA
pb; 2. Gen rpsL sampel 3; 3. Gen rpsL sampel 4; 4. Gen rpsL
sampel 5; 5. Gen rpsL sampel 8; 6. Gen rpsL sampel 10; 7. Gen rpsL sampel l l ; 8. Kontrol negatif
29
•
!lAP, V! PEMBAHASAN
Hasil
karakterisasi
subjek
mem.rnjukka.'l bahwajumlah perempuan
penelitian
berdasarkan
jenis
kelamin
(52%) dibandingkan laki-laki (48%) tidak
berbeda secara signifikan, meskipun secara teoritis laki-laki dengan mobilitas yang ce.nderung lebih tinggi dibandingkan perempuan mempunyai resiko yang lebih tinggi untuk terinfeksi
Mycobacterium tuberculosis.
Namun di sisi lain,
aspek ekonomi dan sosiokultural juga menempatkan perempuan di daerah tertentu lebih sulit dalam mengakses pelayanan ke sehatan yang menyebabkan timbulnya 20 kasus ya..-1g tidak terdeteksi . Dari sejumlah kriteria MDR-TB, kategori tersangka MDR-TB berupa BTA positif setelah
s1s1pan
dengan
kategori
2
menempati
urutan
teratas.
Pengobat::m kategori 2 merupakan pengobatan T B untuk kasu s kambuh, gagal pengobatan dan putus berobat. Pengobatan pada kategori ini menggunakan
5 jenis
OAT lini pertama, yaitu Isoniazid, Rifampisin, Pirazinamid, Etambutol dan ditambah dengan injeksi Streptomisin. Fase sisipan adalah pemanjangan masa pcmberian
OAT pada fase inisial (yaitu Isoniazid, Rifampisin, Pirazinamid,
Etambutol) yang diindikasikan pada kasus dimana sputum penderita tidak mengalami konversi. Idealnya sebagian besar kasus BT A positif akan mengalami konversi setelah
8 minggu. Hanya sebagian kecil yang membutuhkan waktu lebih
2 lama 1 . Sputum yang tidak mengalami konversi merupakan salah satu penanda kegagalan pengobatan secara k linis bcserta dengan sejumlah gejala klinis lain, yaitu batuk masih ada atau berulang, dcmam masih berlanjut , keringat malam 9 hari serta tidak ada kenaikan berat badan . Dengan demikian kategori BT A positif setelah sisipan dengan kategori
2
memang merupakan suatu kondisi yang sangat
mengarah pada telah terjadinya rcsistcnsi terhadap OAT. Sebagian besar subjck penelitian hcrasal dari Kota Banda Acch dan Aceh Besar. Hal ini dikarenakan Poli DOTS RSUD Dr. Zainoel Abidin seb agai tempat primer pengamhilan sampel mempakan rumah sakit rujukan untuk Provinsi Aceh.
30
•
t -
--
Rumah sakit ini terletak di KotCl Bamla Acch d:}.__rl uapat diakses deli.gan mudal1 oleh masyarakat yang berdom isili di Kabupaten Aceh Besar, Lhokseumawe dan Kanupaten Pidic. Berdasarkan
Profil Kesehatan Provinsi Aceh Tahun
201 1 ,
prevalensi T B paru di Kota Banda Aceh dan Kabupaten Aceh Besar mencapai dan
62
jiwa per
100.000
58
penduduk. Prevalensi tertinggi justru terdapat di
sejumlah daerah lain seperti Kabupaten Aceh Barat Daya penduduk) dan Kabupaten Simeulu demikian jauhnya jarak antara
(168
jiwa per
sejumlah
1 00.000
daerah
(198 jiwa
per
/.
penduduk
100.000
Meskipun
tersebut dengan RSUDZA
mungkin menjadi penyebab tidak diternukannya banyak kasus rujukan. Selain itu rendahnya angka pencarian kasus tersangka MDR-TB mungkin juga menjadi penyebab rendahnya kasus rujukan dari daerah. Hal ini dikarenakan belum dilaksanakannya sosialisasi pengenalan kasus MDR-TB secara dini pada petugas kesehatan di daerah. Kasus resistensi terhadap OAT dan MDR-TB sebenarnya mud
identifikasi
kasus
dan
pemeriksaan
lanjutan
(DST)
yang
21 menimbulkan banyak kasus MDR-TB yang tidak terdetek si dan terdiagnosa • Provinsi Aceh hingga saat ini belum memiliki data MDR-TB dan hal ini tentu saja mencerminkan rendahnya tingkat identifikasi, pelaporan dan pencatatan kasus. Dari total TB, sekitar
25
subjek penelitian yang memenuhi kriteria tersangka MDR
52% ( 1 3
sampeJ) merupakan BTA negatif dan kultur negatif.
Meskipun subjek penelitian memenuhi sejumlah k:riteria untuk tersangka MDR TB, pengobatan sesuai standar tetap dijalankan hingga dipero leh hasil kultur dan uji sensitivitas. Hasil BTA dan kultur negatif menunjukkan bahwa pengobatan yang dijalani oleh penderita memberikan efek teurapeutik yang cukup adekuat sehingga pada saat pemeriksaan sputum tidak lagi didapatkan
Mycobacterium
tuberculosis. Pola resistensi yang ditemukan pada penelitian ini menunjukkan bahwa resistcnsi terhadap Isoniazid
dan Rifarnpisin lebih tinggi dibandingkan OAT
lainnya. Hal ini berkorelasi dengan ditemukannya kasus MDR-TB sebanyak
35%.
Isoniazid merupakan OAT yang memiliki aktivitas dominan sebagai bakterisid dini dan pencegahan resistensi. Rifan1pisin adalah OAT yang bekerja dominan
31 •
. . .
pada pencegahan resistensi dan kegiatan sterilisasi Resistensi pada
Mycobacterium tuberculosis
]vfycobacterium tuberculcsis.
terhadap OAT disebabkan oleh
mutasi genetik yang terjadi pada baktcri itu sendiri. Hingga saat ini belum diketahui
adanya
memperantarai
transfer
transmisi
materi
sifat
genetik
resistensi
dalam
antar
bentuk
plasmid
yang
Mycobacterium tuberculosis.
Penyebaran resistensi lebih disebabkan karena kumulasi obat yang tidak adekuat untuk membunuh
Mycobacterium tuberculosis.
Mutasi genetik tidak terjadi di
bawah pengaruh atau tekanan dari pemberian OAT melainkan terjadi secara spontan dan alamiah
22 . Aceh pasca konflik dan bencana alam tsunami mengalarni
pe!'iode dimana di sejumlah daerah terjadi kesulitan akses terhadap pelayanan kesehatan yang adekuat, terganggu dan terputusnya suplai obat serta terganggunya pelaksanaan kegiatan pelayanan kesehatan baik. dari segi infrastruktur maupun sumber daya manusia. Kesemua faktor ini sangat mendukung timbulnya suatu fase ketidakpatuhan bahkan terputusnya siklus pemakaian obat oleh penderita TB paru di daerah yang terkena dampak konflik dan bencana. Faktor ko-morbid yang ditemukan pada subjek penelitian, terutama yang teridentiflkasi MDR-TB adalah Diabetes Melitus. Penderita DM memiliki resiko 1 ,5 hingga
7,8 kali lebih tinggi untuk menderita TB paru. Meskipun TB paru
diketahui berkorelasi kuat dengan berbagai penyakit imunokompromise lainnya seperti HIV, namun semakin banyaknya penderita DM yang menderita TB paru dibandingkan penyakit imunokompromised lainnya menyebabkan DM menjadi faktor resiko yang cukup
23 signifikan . Dari
sebuah penelitian metaanalisis
diketahui bahwa kasus BTA positif berkorelasi erat dengan DM dibandingkan BTA negatif yang menunjukkan penderita DM memiliki rcsiko relatif yang lebih besar menderita TB paru
24 .
Perubahan metabolik pada DM mempengaruhi farmakokinetik obat-obatan anti tuberkulosis (OAT) melalui perubahan pada proses absorbsi, distribusi, metabolisme dan ekskresi. Efektivitas OAT dipengaruhi oleh kadar obat d i dalan1 plasma sehingga pada kasus DM tetjadi penurunan efektifltas OAT dan berakibat 23 26 negatif bagi kesembuhan pasien TB ' . Kadar yang rendah pada plasma dapat menginduksi terjadinya resistensi terhadap OAT dan berakibat pada timbulnya 32 •
t ••
Lerbagai komplikasi pada kasus TB paru dengan DM. Penelitian di Amerika Serikat menunjukkan bahwa Multidrug resistant (MDR) TB berhubungan dengan DM pada odds ratio 2, 1
23
•
Resiko relati f TB paru berkaitan dengan DM segara garis besar hampir sama di seluruh dunia, hanya saja implikasinya pada sektor kesehatan masyarakan masih sangat dipengaruhi oleh prevalensi TB di daerah tertentu. Diabetes melitus banyak dijumpai di daerah eropa, namun tentu saja sangat sulit untuk menemukan kasus DM dengan komplikasi TB paru. Sementara eli daerah lain, terutama di negara berkembang, kasus TB paru dapat mencapai 20-100 kali lebih tinggi dan penderita DM mengalami resiko 1 kali yang lebih tinggi mengidap TB paru. Dengan demikian proporsi kasus TB paru dengau DM sebenarnya cukup tinggi 26 dalam populasi • Amplifikasi DNA pada penelitian ini menggunakan PCR-Nested. Metode ini dipilih karena cukup
besar.
Mycobacterium
PCR-nested
dapat
tuberculosis memiliki ukuran genom yang meningkatkan
spesifisitas
dan
sensitivitas
ampliflkasi dengan cara mengeliminasi berbagai produk amplifikasi yang tidak spesifik. Primer pada tahap pertama akan menjadi templat yang dikenali oleh primer tahap kedua sehingga sejumlah gen target dapat teramplifikasi dengan baik. Meskipun demikian, metode ini sangat rentan terhadap kontaminasi DNA asing
karena
harus
dilakukan
dengan
2
tahap
27 .
Hal
ini
terlihat
pada
elektroforegram hasil PCR gen rpoB dimana pita DNA pada kontrol negatif menunjukkan adanya kontaminasi DNA asing. Hasil
karakterisasi
produk
PCR
menunjukkan
bahwa
berdasarkan
ukurannya, scmua gen target terampli fikasi. Gen katG secara teoritis berukuran ... 944-988 pb, gen rpoB berukuran 6 1 6-672 pb, gen embB berukuran 4 16-646 pb, gen pncA berukuran673-720 pb dan rpsL berukuran 409-486 pb. Reaksi dan kondisi
PCR yang digLmakan sudah mencapai optimal untuk amplifikasi gen
katG, rpoB, embB dan rpsL. Tercapainya kondisi optimal untuk amplifikasi juga menunjukkan bahwa primer-primer yang digunakan mampu mengenali gen target dengan baik, tem1asuk
primer STR-2F dan
STR-2R yang
dirancang pada
penelitian ini untuk kepentingan PCR-nested.
33 •
t ---·---�-
---
-------
I
Untuk gen pncl'. banyalny a pita DNA yang terhentuk menunjukkan kondisi annealing yang belum optimal. Suhu annealing yang digunakan adalah 58°C.
Untuk mendapatkan kondisi yang ideal
ditingkatkan
rnencapai
59-60°C.
Suhu
maka
annealing
suhu annealing dapat yang
terlalu
rendah
menyebabkan pengenalan primer rnenjadi tidak spesifik sehingga peningkatan suhu annealing dapat meningkatkan spesifisitas primer dan menghasilkan produk yang sesuai target. Meskipun demikian, suhu annealing yang terlalu tinggi juga membuat primer tidak mengenali daerah target. Penelitian ini akan dilanjutkan pada tahap sekuensing dan pemetaan pola mutasi dari gcn katG, rpoB, pncA, embB dan rpsL. Kendala yang dihadapi dalam pelaksanaan mendapatkan
penelitian hasil
adalab
lamanya
kultur dan DST.
waktu
Kultur dan
yang
dibutuhkan
untuk
DST pada penelitian
ini
menggunakan BACTEC-MGIT 960 (BD). Secara teoritis hasil akan diperoleh dalam rentang waktu 1 7±7 hari dari sputum baik dengan BTA positif maupun negatif. Namun pada penelitian ini hasil kultur dan DST diperoleh dalam waktu rata-rata mencapai 3 bulan untuk setiap sampelnya.
Selain itu masih perlu
dilakukan optimasi kondisi PCR, terutama untuk mengamplifikasi gen pncA.
34 •
t
BABVH KES�PULAN DAN SARAN
7.1 Kesimpnlan l.
Pada
penelitian
ini
telah dilakukan
pendeteksian kasus MDR-TB
dari
tersangka penderita TB paru re�istensi ganda di Aceh. Saat ini telah diperoleh
7 penderita 2.
MDR-TB.
Penentuan pola mutasi akan dilakukan seteiah diperoleh rea.ksi dan kondisi PCR optimal (terutama untuk gen rpsl) dan dilakukan penentuan urutan nukltotida dengn m�tode sekuensing.
7.2. Saran 1.
Perlu dilakukan sosiaiisasi pengenalan ka<>us MDR-TB secara dini bagi para petugas kesehatan untuk meningkatkan kewaspadaan, idcntifikasi, pencatatan serta pelaporan kasus MDR-TB
2.
Diperlukan peningkatan kesiapan Dinas Kesehatan Provinsi Aceh serta RSUD Dr. Zainoel
Abidin sebagai RS rujukan dalam identifikasi, diagnosis dan
pengobatan pasien MDR-TB.
35 •
t ----
--
-
£
UCAPAN TERIMA KASIH
Pcnelitian ini merupakan salah satu penelitian Riset Pembinaan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi Kedokteran (Risbin lptekdok) Tahun 2012. D�ngan ini kami tim peneliti dari Fakultas Kedokteran Unsyiah ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1 . - Badan Perielitian dan Pengemba.•1gan Kesehatan (Balitbangkes) Kementerian Kesehatan Republik Indonesia yang telah mendanai penelitian ini. 2.
Tim Panel Pakar Penyakit Menular, yang telah memberikan masukan dan perbaikan sehingga penelitian ini dapat terlaksana dengan baik.
3.
Rektor Universitas Syiah Kuala
4.
Dekan Fakultas Kedokteran Unsyiah serta konsultan dalam penelitian ini, Dr. dr. Mulyadi, Sp. P (K)
5. dr. Syahrul, Sp.S (K) selaku Dekan FK Unsyiah periode 2008-20 1 2 6.
Ketua Departemen Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia
7.
Dr. Andriansjah Rukmana, M.Si, Biomed, selaku ketua divisi Tuberculosis beserta seluruh staf Departemen Mikrobiologi F K U l
8.
Dr. Mudatsir, M.Kcs, selaku Kepala Bagian beserta seluruh tenaga teknis Mikrobiologi FK Unsyiah
9.
Seluruh dokter dan perawat yang bertugas di Ruang Rawat Paru serta Poliklinik Paru/DOTS Rumah Sakit Umum Daerah (RSUD) Dr. Zainoel Abidin Banda Aceh
1 0 . Semua pihak yang telah membantu terlaksananya penelitian ini
36 •
t
DAFTAR PUSTAKA
1.
Syahrini,
H . Tuberkulosis Paru
Resistensi Ganda. e�repository.
Medan:
Universitas Sumatcra Utara. 2008. h. 1 � 1 9. 2.
Kementerian Kcsehatan Republik Indonesia. TB control Approaching
MDG
Target.
in Indonesia i s
Diunduh
dari
http://www .depkes.go.id/enlindex.php/news/press-release/628-tb-control�in�
indonesia-is-approaching-mdg-tiuget.html. Diakses tanggal 30 Oktober 201 1 . 3.
Ratan
A,
Awdhes
tuberculosis:
K,
Nishat
A.Multidrug-Resistant
Mycobacterium
Molecular Perspective. Emerging Infectious Diseases. 1998; 4:
195-207 4.
Organ ization The Global MDR-TB and XDRTB Response Plan. 2007. Diunduh dari http://www.searo.who.int/linkfiles/publications global mdr-tb xdr tb response plan 07�08.pd f. Diakses tanggal lO November 201 1 World Health
.
5. Dinas Kesehatan Provinsi Aceh. 201 1 . Profil Kesehatarr A�eh Tahun 201 1 6.
Gerdunas
TB.
Epiderniologi
TBC
di
Indonesia.
Diunduh
dari
http://www .tbindonesia.or.idltbnew/epidemiologi-tb-di-indonesia!article/55/000 1 00150017/2.
Diakses tanggal 20 Juni 2012 7.
Choi JH et
al.
Clinical Efficacy of Direct DNA Sequencing Analysis on
Sputum Specimens for Early Detection of Drug- Resistant
tuberculosis 8.
Syaifuddin M, Rosilawati M, Irawan H, Bela B. ldentiflkasi
tuberculosis Ganda
Mycobacterium
in a C linical Setting. Chest. 201 0; 1 37: 393-400
Mycobacterium
dan Analisis Mutasi gen rpoB dan KatG penyebab Resistensi
dengan
Teknik
Molekuler.
2006.
Diunduh
www .batan.g o.id/ptkmr/ .. ./Mukh%20Syaifudin.dkk-2006.pdf.
dari Diakses
tanggal 1 0 j uni 201 2 9.
Soepandi PZ. Diagnosis dan Faktor yang Mernpengaruhi Terjadinya TB MDR. Jumal Tuberkulosis Indonesia. 2010; 7: 1 6 - 1 8
1 0 . Aditama TY, Wijanarko P . Resistensi Primer dan Sekunder Mycobacterium tuberculosis di RSUP Persahabatan Tahun 1 994. J. Respir Indo. 1994; 16: 1 2�4 1 1 . Aditama
TY,
masalahnya.
Soepardi Edisi
III.
PZ.
2000.
Jakarta:
Tuberkulosis Laboratoriurn
diagnosis,
terapi
Mikrobiologi
Persahabatan!WHO collaborator Center for Tuberculosis. p.l -4
dan
J{SUP
.
37 •
t
12. Riyanto BS, wiJhan. Management of MDR TB Current and future dalam Buku Program dan Naskah Lengkap Konferensi Kerja Pertemuan Ilmiah Berkala. PERPARI. Bandung. 2006 1 3. Wheeler PR, Ratledge C. In Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control (Ed. Bloom BR). Am Sci Microbiol. Washington DC.1994: 353-85 14. Chan J, Kaufmann SH. In Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control (Ed. Bloom BR). Am Sci Microbiol. Washington DC.l 994: 271-84 1 5 . Cole ST. Deciphering The Biology of Mycobacteium tuberculosis from The Complete Genome. Nature.l 998; 393: S37-44 16. Johnson R, Streicher EM, Louw GE, Warren RM, Van Heiden, PD, Victor TC. Drug Resistance in Mycobacterium tuberculosis. Curr. Issues. Mol. Bioi. 2007; 8 : 97- 1 12 17. Blanchard J. Molecular Mechanism of Drug Resistance in Mycobacterium tuberculosis. Annu. rev. Biochem. 1996; 65: 215-39 18. Perhimpunan Dokter Paru Indonesia. Tuberkulosis : Pedoman Diagnosis dan Penatalaksanaan di Indonesia. Jakarta. 2006 19. Ozturk CE, Sauic A, Kaya D, Ceyhan I. Molecular Analysis of Isoniazid, Rifampin and Streptomycin Resistance in Mycobacterium Isolates from Patients with Tuberculosis in Duzee, Turkey. Jpn. J. Infect. Dis. 2005; 58: 309- 3 1 2 20. Christopoulos AI, Diamantopoulos AA, Dimopoulos PA, Goumenos DS, Barbalias GA. Male-female differences in the risk of tuberculosis ini dialysis patients. Int Urol Nephrol. 2009; 4 1 :671 -77 2 1 . Sutoyo DK. Multidrug resistant pada tuberkulosis. J Respir Indo. 201 0; 30 (2): 7 1 -74 22. Sjahrurachman A. Diagnosis Multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis. Jurnal Tuberkulosis Indonesia. 201 0; 7: 8-10 23. Niazi, AK dan Sanjay, K. Diabetes and tuberculosis: A review of the role of optimal glycemic control. Journal of Diabetes & Metabolic Disorder. 2012; 1 1 (8): 1-4 24. Gnanasan, S, Kang, NT, Kok, TW, Salmiah, MD, Abdul RM , Claire, A. Convergence of tuberculosis: time to individualise pharmaceutical care. Int. J. Clin. Pharm. 2010;33:44-52
38 t
25. Stevenson, CR, et aL Diab�tes and tubeTCL!losi:::; : The Impact of the diabetes epidemic on t11berculosis incidence. 2007; 234(7): 1 -8
26. Newton CR dan Graham A. PCR. Oxford: Bios Scientific Publishers. 1 994 27. Pandini M, Francis V, Maryline B , Graziella 0, Marco RO, Lafranco F. Usefulness
of
the
BACTEC
Mycobacterium tuberculosis
MGIT
960
System
for
Isolation
of
from Sputa Subjected to Long Term Storage. J.
Clin. MicrobioL 2007; 45(2): 575-576
39 •
Lampiran 1. Naskah Penjelasan Untuk Mendapatkan Persetujuan Subjek dan Inform Consent
NASKAH PENJELASAN UNTUK MENDAPATKAN PERSETUJUAN SUB.TEK DAN FORMULIR PERSETUJUAN SETELAH PENJELASA.J� (INFORMED CONSENT)
Kami metninta Anda untuk berpartisipasi dalam penelitian kami yang berjudul "Analisis Molekuler Resistensi Isoniazid, Rifampisin, Pirazinamid, Etambutol dan Streptornisin dari Isolat Mycobacterium tuberculosis pada Penderita TB Paru Resistensi Ganda" yang
bcrtujuan untuk pemetaan kasus serta analisis molekuler terhadap resistensi yailg terj ad i pada tcrsangka Tuberculosis Paru Resistensi Ganda!Mutidrug Resistant Tuberculosis (MDRTB) d i Aceh.
TB Paru
TB Paru adalah suatu penyakit yang berupa infeksi pada
jaringan paru yang disebabkan oleh
bakteri Mycobacterium tuberculosis.
TB paru Resistensi Ganda/ Multidrug Resistant Tuberculosis (MDR-TB)
Resistensi ganda adalah bakteri Mycobacterium tuberculosis yang
resisten minimal terhadap
rifampisin dan isoniazid (INH) dengan atau tanpa OAT lainnya (Pirazinamid, Etambutol dan Streptom isin) Rifampisin dan .
(TB). Pasien yang dicurigai
INH merupakan 2 obat penting pada pengobatan Tuberculosis
kemungkinan TB Paru Resistensi Ganda adalah:
I . Kasus TB Paru dengan gaga) pengobatan pada katagori 2, dibuktikan dengan rekam medis sebelumnya dan riwayat penyakit te rdah u lu 2.
.
Pasien TB Paru dengan hasil pemeriksaan dahak tetap positif setelah sisipan dengan katagori 2
3.
P as ien TB yang pernah diobati
di fasilitas non DOTS, termasuk yang mendapat OAT lini
kedua sepcrti kuinolon dan kanamisin. 4.
Pasien TB Paru yang gaga! pengobatan katagori l . 40
•
5.
Pasien TB Paru dengan hasil pemeriksaan dahak tetap positif setclah sisipan dengan katagori l.
6.
TB Paru kasus kambuh.
7.
Pasien TB yang setelah ialai pada pengobatan katagori 1 dan atau katagori 2
8.
Suspck TB dengan keluhan, yang tinggal dekat dengan pasien TB :rviDR konfirmasi, termasuk petugas kesehatan yang bertugas di bangsal TB MDR.
9.
TB-HIV
Pasien yang memenuhi kriteria suspek harus dirujuk ke laboratorium dengan jaminan mutu ekstemal yang ditunjuk untuk pemeriksan biakan dan uji kepekaan obat.
Pengambilan Sputum Anda dimintakan untuk mengeluarkan/membatukkan dahak A�da ke dalam sebuah botol yang sudah kami sediakan. Sebelum batuk, Anda diminta untuk berkumur dengan air terleb ih dahulu. Anda dalam posisi berdiri, jika tidak memungkinkan, bisa dalam keadaan duduk dengan agak membungkuk. Jika rangsangan untuk batuk terasa lebih kuat, Anda harus menahannya terlebih dahulu sesat lalu menarik nafas dalam, kemudian batuklah sekuat-kuatnya sehingga terasa sputum keluar dari tenggorokan. Jika Anda sulit mengeluarkan dahak, maka kami akan melakukan prosedur tertentu untuk merangsai1g Anda mengeluarkan dahak (induksi). Induksi dilakukan dengan memberikan cairan hipertonik yang dihirup melalui alat tertentu (nebulizer) selama 1 5-20 menit. Prosedur !ni tidak akan kami lakukan j ika Anda terlalu sensitive dengan bahan yang kami gunakan dalam induksi. Dahak yang Anda keluarkan akan kami periksakan ke laboratorium dengan jaminan mutu eksternal yang ditunj uk.
Manfaat Penelitian Melalui penelitian ini akan dapat dideteksi apakah Anda benar termasuk dalam katagori TB MDR.
Jika
memberikan
hasil
pcmeriksaan
rekomendasi
menunjukkan
agar Anda segera
An.da
positif TB
MDR,
maka
kami
mendapatkan pengobatan yang tepat.
akan Biaya
pemeriksaan untuk mcnegakkan diagnosa TB MDR sepenuhnya adalah tanggungan kami. Anda tidak akan dipungut biaya apapun.
41
I
Resiko dan Usaha Pen_j1:1gaan Pada prosedur pengambilan dahak, bagi Anda yang tidak dalam keadaan berdahak, mungkin Anda akan merasa sedikit tidak nyaman karena harus memaksakan dahak Anda keluar. Namun hal ini akan terbantu dengan merninum air putih sebclurn Anda mengeluarkan dahak. Bagi Anda yang sulit mengeluarkan dahak, akan dilakukan induksi. Prosedur ini tidak invasif, narnun bagi Anda yang sensitif terhadap bahan/cairan yang kami gunakan mungkin akan terjadi reaksi seperti sesak nafas akibat saluran nafas Anda rncnyempit. Untuk rnengantisipasi hal tersebut kami telah menyediakan obat-obatan yang dapat segera mengantisipasi apabila reaksi ini terjadi pada Anda. Penelitian ini dilakukan dengan persetuj uan dan di bawah pengawasan dari Kornisi Etik Penelitian Fakultas Kedokteran Un iversitas Syiah Kuala
Kerahasiaar. Catatan mengenai pemeriksaan Anda akan kami rahasiakan. Jika dikaji kembat: oleh badan pemerintah, maka Anda hanya dikenal sebagai nomor saja dan tidak akan diketahui siapa yang turut berpartisipasi dalam penelitian ini.
Pertanyaar.-pe:· tanyaan J ika Anda rnemiliki pertanyaan lebih lanjut mengenai penelitian serta hak-hak Anda dalam penelitian ini, maka Anda dapat menghu!Jungi dr. Tristia Rinanda (081360365000) dan dr. Yunita Arliny, Sp. P (081 26983578) atau dengan mengirirnkan
surat ke alamat Bagian
Mikrobiologi Fakultas Kedokteran UNSYJAH, Jalan Tanoh Abee, Darussalam, Banda Aceh.
Partisipasi Sukarela Anda tidak dapat dan tidak akan dipaksa untuk berpartisipasi dalam penelitian ini bila Anda tidak menghendakinya. Anda hanya dapat ikut berpartisipasi atas kemauan Anda sendiri. Bila Anda menolak untuk berpartisipasi tidak boleh seorang pun melakukan diskriminasi terhadap Anda. Dalam penelitian ini keamanan dan kenyamanan Anda menjadi prioritas utama.
42
•
Tanda Tangan Saya tclah membaca penjelasan ini dengan baik serta telah
diberikan kesempatan untuk
mengajukan pertanyaan-pertanyaan seputar penelitian. Saya telah memahami maksud, resiko dan manfaat dari penelitian ini.
Tanda tangan dan nama jelas partisipan
Tanda Tangan Saksi dan nama saksi
Tanda tangan peneliti dan nama pencliti
Tanggal
T?.nggal
Tanggal
Lampiran 2 Realisasi Anggaran Biaya Risbin Iptckdok 2012
43
Anal isis Molekuler Resistensi Isoniazid, Pirazinamid, Rifampisin, Etambutol dan Streptomisin pada Isolat Mycobacterium tuberculosis dari Penderita Tersan gka TB Paru Resistensi Ganda di Aceh dr. Tristia Rinanda, M.Si Rp. l24.0ll.OOO,-
Judul Penelitian Ketua Penelitian : Pagu Penelitian :
URAlAN REALTSASl (Rp) NO
1
REALJSASI TOTAL
104,1 50,750,-
1
HONOR TETAP
BELANJA BAHAN
BNO
PERJADIN
12,360,000,-
55,659,650,-
3 1 ,885,000,-
4,246,1 00,-
BELANJA MODAL
DST.
-
-
44
•
t
LEMBAR PENGESAHAN
Dengan ini kami: •
menyatakan persetuj uan atas laporan akhir penelitian sesuai judul penelitian yang diajukan oleh institusi kami dan bersedia untuk bertanggung jawab terhadap substansi yang terdapat dalarn Japoran akhir penelitian tersebut.
•
menyatakan bahwa penelitian ini adalah benar telah dilakukan sesuai dengan kemampuan dan fasilitas yang ada pada institusi kami dan kami telah mendukung pelaksanaan
Nama Dekan!Direktur/Kepala
Tanggal
Dr.dr. Mulyadi, Sp.P (K)
1 Mei 2013
Institusi
Fakultas Kedokteran Universitas Syiah Kuala
•
t
