65
LAMPIRAN
Lampiran 1. Sequence primer ISSR yang digunakan
No 1 2 3 4 5
Tabel Sequence primer ISSR yang digunakan Primer Sequence primer SBLT 2 (AG)8T SBLT 3 (AG)8C SBLT 5 (GA)8C SBLT 8 (CT)8G SBLT 13 (GAA)6
Tm 52 50 53 52 50
66
6 7 8 9 10
SBLT 14 SBLT 15 SBLT 17 SBLT 18 SBLT 19
(GACA)4 (GA)8 (TG)8G (CCCT)4 (GATA)2(GACA)2
50 50 52 51 51
Lampiran 2. Tahapan isolasi DNA genom daun tanaman sambiloto Tahapan isolasi DNA genom tanaman sambiloto adalah: daun dibersihkan dari kotoran yang menempel dan ditimbang sebanyak 200 mg. Daun yang telah ditimbang dimasukkan dalam mortal dan dipotong kecil-kecil kemudian ditambahkan 1% PVPP sebanyak 100 µL, larutan 2% merkaptoetanol hangat sebanyak 100 µL dan bufer ekstraksi sebanyak 250 µL. Daun tersebut ditumbuk
67
sampai halus menggunakan pestle sampai membentuk pasta. Kemudian pasta daun dimasukkan dalam tabung mikrotube 1,5 mL dan ditambahkan bufer ekstraksi sebanyak 250 µL. Larutan DNA divortex dan diinkubasi selama 30 menit dalam waterbath suhu 60 oC. Larutan ditambahkan larutan CIAA dengan perbandingan 24:1 sebanyak 500 µL. Tabung dibolak balik selama 15 menit dan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 800 rpm selama 10 menit pada suhu 25 oC. Supernatan yang didapatan dipindahkan pada tabung mikrotube baru dan ditambahkan larutan 5M NaCl sebanyak 250 µL sambil dibolak balik perlahanlahan. Supernatan ditambahkan larutan isopropanol dingin sebanyak 0,6 volume supernatan dan dibolak balik perlahan-lahan. Larutan tersebut kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 60 menit. Setelah itu larutan disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit pada suhu 25oC. Supernatan dibuang dan pelet yang didapatkan dicuci dengan menggunakan 80% etanol dingin sebanyak 200 µL dan dibolak balik perlahan. Supernatan dibuang dan pelet DNA dikeringkan dengan membalikkan tutup mikotube pada kertas tissu sampai tidak tercium bau etanol. Pelet ditambahkan larutan Tris-EDTA (TE) sebanyak 100 µL kemudian dihomogenkan. Larutan DNA ditambahkan 1 µL RNAse kemudian diinkubasi dalam waterbath suhu 37oC selama 30 menit. Larutan ditambahkan larutan CIAA (24:1/v:v) dengan volume yang sama dan dibolak balik tabung perlahan-lahan. Larutan disentrifugasi 8000 rpm selama 10 menit pada suhu 25 oC. Supernatan dipindah pada tabung mikrotube baru dan ditambahkan isopropanol dingin dengan volume yang sama kemudian diinkubasi pada suhu -20oC selama semalam (overnight). Larutan disentrifugasi 10000 rpm selama 10 menit pada suhu 25oC. Supernatan dibuang dan pelet DNA yang didapat dikeringkan kemudian dilarutkan dalam larutan TE sebanyak 20 µL. Lampiran 3. Analisa variasi (ANOVA) pada mutan tanaman sambiloto generasi M1V0-M1V3 1.
ANOVA mutan generasi M1V0
Analysis of Variance for tinggi, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Dosis 18 2960.58 2960.58 164.48 2.09 0.007 Error 257 20253.46 20253.46 78.81 Total 275 23214.04
68
Analysis of Variance for daun, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Dosis 18 607.15 607.15 33.73 2.33 0.002 Error 257 3713.61 3713.61 14.45 Total 275 4320.77 Analysis of Variance for pdaun, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Dosis 18 59.8806 59.8806 3.3267 4.39 0.000 Error 257 194.5512 194.5512 0.7570 Total 275 254.4318 Analysis of Variance for ldaun, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Dosis 18 5.27920 5.27920 0.29329 3.39 0.000 Error 257 22.23708 22.23708 0.08653 Total 275 27.51628 Analysis of Variance for Nodus, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P Dosis 18 146.162 146.162 8.120 2.23 0.003 Error 257 937.356 937.356 3.647 Total 275 1083.518
2.
ANOVA mutan generasi M1V1
Analysis of Variance for tinggi, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 151.195 151.195 8.400 1.53 0.082 Error 217 1191.936 1191.936 5.493 Total 235 1343.130 Analysis of Variance for daun, using Adjusted SS for Tests
69
Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 12322.7 12322.7 684.6 3.04 0.000 Error 217 48882.0 48882.0 225.3 Total 235 61204.7 Analysis of Variance for pdaun, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 114.681 114.681 6.371 2.90 0.000 Error 217 477.134 477.134 2.199 Total 235 591.814 Analysis of Variance for ldaun, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 5.0152 5.0152 0.2786 2.08 0.007 Error 217 28.9986 28.9986 0.1336 Total 235 34.0137 Analysis of Variance for Nodus, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 4375.48 4375.48 243.08 3.83 0.000 Error 217 13761.51 13761.51 63.42 Total 235 18137.00 Analysis of Variance for cabang, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 279.194 279.194 15.511 2.32 0.002 Error 217 1449.700 1449.700 6.681 Total 235 1728.894
3.
ANOVA mutan generasi M1V2
Analysis of Variance for tinggi, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 620.42 620.42 34.47 1.26 0.215 Error 204 5563.59 5563.59 27.27 Total 222 6184.01 Analysis of Variance for daun, using Adjusted SS for Tests
70
Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 13701.2 13701.2 761.2 1.15 0.308 Error 204 135202.2 135202.2 662.8 Total 222 148903.4 Analysis of Variance for pdaun, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 93.861 93.861 5.214 1.72 0.038 Error 204 618.926 618.926 3.034 Total 222 712.787 Analysis of Variance for ldaun, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 6.6270 6.6270 0.3682 3.31 0.000 Error 204 22.6685 22.6685 0.1111 Total 222 29.2955 Analysis of Variance for Nodus, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 13271.6 13271.6 737.3 2.19 0.005 Error 204 68527.2 68527.2 335.9 Total 222 81798.8 Analysis of Variance for cabang, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 906.82 906.82 50.38 1.89 0.018 Error 204 5429.04 5429.04 26.61 Total 222 6335.86
4.
ANOVA mutan generasi M1V3
Analysis of Variance for tinggi, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 1832.20 1832.20 101.79 3.40 0.000 Error 178 5328.04 5328.04 29.93 Total 196 7160.24 Analysis of Variance for daun, using Adjusted SS for Tests
71
Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 6006.8 6006.8 333.7 1.25 0.228 Error 178 47579.7 47579.7 267.3 Total 196 53586.5 Analysis of Variance for pdaun, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 31.762 31.762 1.765 1.21 0.260 Error 178 260.326 260.326 1.463 Total 196 292.088 Analysis of Variance for ldaun, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 2.6430 2.6430 0.1468 0.54 0.938 Error 178 48.8179 48.8179 0.2743 Total 196 51.4610 Analysis of Variance for Nodus, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 2306.2 2306.2 128.1 0.35 0.993 Error 178 64446.6 64446.6 362.1 Total 196 66752.7 Analysis of Variance for jcabang, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dosis 18 289.59 289.59 16.09 0.37 0.991 Error 178 7678.48 7678.48 43.14 Total 196 7968.07
Lampiran 4. Data pertumbuhan tanaman sambiloto hasil irradiasi secara ex vitro
72
Lampiran 5. Data kuantitatif dan kemurnian DNA genom mutan sambiloto
73
74
Lampiran 6. Data biner pola pita pada 32 mutan sambiloto dengan 5 primer ISSR
75
Lampiran 7. Jarak genetik 32 mutan tanaman sambiloto hasil irradiasi
76
Lampiran 8. Data standarisasi andrographolide dan waktu retensi mutan pada HPLC Regresi Linier standar andrographolide ppm 250 500 750 1000
Retention Time 4.971923968 4.994918778 4.978254027 4.968053394
Area 5858290 9575152 14350260 19771197
% Area 100 100 100 100
Height 646962.9 1065955 1600516 2150917
Waktu retensi mutan sambiloto 1.
1 2 2.
1 2 3 4 3.
1 2 3
Kontrol (DN) Retention Time 2.823090225 4.818476889
Area 1861861.514 4892482.193
% Area 27.56539487 72.43460513
Height 97692.4 543826.21
Mutan DB60 Retention Time 2.837396317 5.014180356 6.806577459 9.379480134
Area 1523590.334 5114262.905 3191345.091 1361599.775
% Area 13.61467091 45.70060917 28.51758258 12.16713734
Height 109453.261 561110.371 127796.787 57697.5233
Mutan DG70 Retention Time 5.011101732 6.703964926 9.330870871
Area 5875924.93 4196888.018 1605577.449
% Area 50.31451022 35.93721288 13.7482769
Height 642067.004 166663.524 63852.8362
77
4.
1 2 3
5.
1 2
Mutan DG275 Retention Time Area 2.863723425 1571788.16 5.01736578 7419753.562 6.875634151 1776290.502
% Area 14.59707142 68.9066602 16.49626838
Height 99541.418 821102.33 91691.5583
Mutan DK300 Retention Time 2.882225007 5.023570077
Area 1338851.365 8159309.129
% Area 14.09590169 85.90409831
Height 84003.0064 900142.6
