Gecertificeerde technieken: 1. Virus antigeen test (IDAS-ELISA) 2. Virus isolatie (VI) op gevoelige cellen (+ IDAS-ELISA) 3. Virus specifieke antistoftest (virus-neutralisatie tets, VNT) Niet gecertificeerd: 1. Aantonen erfelijk materiaal van virus (rt-PCR) 2. Virus inoculatie van proefdier (niet erkend door EU en OIE)
Laboratoriumonderzoek ELISA
IDAS-ELISA Blanco: OD < 0.1 Negatief: OD < 0.2 (- blanco) Positief: OD > 0.2 (- blanco)
Laboratoriumonderzoek Virus isolatie en CPE
mengovirus
rhinovirus
Laboratoriumonderzoek VI met overlay techniek
6 wells plaat
Laboratoriumonderzoek real time PCR
CT waarde
Laboratoriumtest Positief en negatief voorspellende waarden Laboratorium onderzoek is nooit 100% betrouwbaar • specificiteit van >95% (p<0.05) ~ 5% fout positief • sensitiviteit van >95% (p<0.05) ~ 5% fout negatief Specificiteit bepaalt de kans dat een negatief monster als fout positief wordt getest (0.05) Sensitiviteit bepaalt de kans dat een positief monster als fout negatief wordt getest (0.05)
Laboratoriumtest Positief en negatief voorspellende waarden Laboratorium onderzoek is nooit 100% betrouwbaar • specificiteit van >95% (p<0.05) ~ 5% fout positief • sensitiviteit van >95% (p<0.05) ~ 5% fout negatief Specificiteit bepaalt de kans dat een negatief monster als fout positief wordt getest (0.05) Sensitiviteit bepaalt de kans dat een positief monster als fout negatief wordt getest (0.05) A-priori kans Is de kans klein dat een monster positief is (1:1.000) dan wordt de kans dat een uitslag werkelijk positief is zeer klein; in dit voorbeeld 0.001/0.05= 1:50 De kans dat een test werkelijk negatief is , wordt dan juist zeer groot.
Conclusie van dit voorbeeld met kleine a-priori kans: • dan is de positief voorspellende waarde (PVW gering • dan is de negatief voorspellende waarde (NVW juist zeer groot
Laboratoriumonderzoek Voorbeeld HIV diagnostiek in de praktijk
HIV positief in NL: 1:1000 (a-priori kans) Belang van een juiste uitslag is bijzonder groot 1. ELISA screeningstest specificiteit 98%, ~ 2% fout positief (PVW 1:20) 2. Confirmatietest (immunoblot) 99.8%, ~ 0.2% fout positief Gecombineerd: specificiteit 99.996%, ~0.004% fout positief PVW is nu 25.000:1, dwz op 25.000 testen is er één fout positief! Stelling 1:
wanneer de uitslag verstrekkende gevolgen heeft vormt een gecertificeerde confirmatietest een noodzakelijk onderdeel van de uitslag
Laboratoriumonderzoek Voorbeeld HIV diagnostiek in de praktijk
HIV positief in NL: 1:1000 (a-priori kans) Belang van een juiste uitslag is bijzonder groot! Naast de betrouwbaarheid van de test zelf spelen menselijke fouten een rol • administratieve verwisseling • pipetteren; monsterverwisseling • besmet raken van monsters (direct of tijdens vermeerdering in VI of PCR) Gunstig geschat, liggen dergelijke risico’s rond 1:1000
In het geval van een HIV test, wordt daarom een 2e monster van de patiënt gevraagd voor bevestiging, ondermeer om een verwisseling uit te sluiten. Stelling 2:
wanneer de uitslag verstrekkende gevolgen heeft is controle op verwisseling en contaminatie noodzakelijk
Kootwijkerbroek 2001: een unieke situatie
De a-priori kans was klein kleine kans dat een positieve uitslag correct is grote kans dat een negatieve uitslag correct is • ligging, bovenwinds en >30 km van uitbraakgebied in Oene • geen duidelijk klinisch beeld passend bij MKZ (prof Breukink) • geen eerdere gevallen van MKZ in de regio • geen epidemiologische band met andere MKZ uitbraken • praktijkgeval 1.26 hep-1 betreft het eerste (en uiteindelijk het enige) monster
Conclusies: de kleine a-priori kans noodzaakt tot: 1. Gecertificeerde confirmatietest 2. Uitsluiten van verwisseling en van kruisbesmetting
Bedrijf van Teunissen: De uitslag fax van 28 maart 2001 Besmetverklaring volgens het Ministerie gebaseerd op: Gecertificeerde test Virus isolatie (overlay) met IDAS-ELISA op plaque met lage OD: 0.3 (onverdund) 0.1 (1:5) negatief
Bedrijf van Teunissen: De uitslag fax van 28 maart 2001 Besmetverklaring volgens het Ministerie gebaseerd op: Gecertificeerde test Virus isolatie (overlay) met IDAS-ELISA op plaque met lage OD: 0.3 (onverdund) 0.1 (1:5) negatief Niet gecertificeerde bepalingen • real-time rt-PCR • dier-inoculatie
Bedrijf van Teunissen: De uitslag fax van 28 maart 2001 Besmetverklaring volgens het Ministerie gebaseerd op: Gecertificeerde test Virus isolatie (overlay) met IDAS-ELISA op plaque met lage OD: 0.3 (onverdund) 0.1 (1:5) negatief Niet gecertificeerde bepalingen • real-time rt-PCR • dier-inoculatie
Bedrijf van Teunissen: De uitslag fax van 28 maart 2001 Besmetverklaring volgens het Ministerie gebaseerd op: Gecertificeerde test Virus isolatie (overlay) met IDAS-ELISA op plaque met lage OD: 0.3 (onverdund) 0.1 (1:5) negatief Niet gecertificeerde bepalingen • real-time rt-PCR • dier-inoculatie • geen gecertificeerde confirmatietest • geen controle op verwisseling, kruisbesmetting, etc.
Bedrijf van Teunissen: De uitslag fax van 28 maart 2001 Besmetverklaring volgens het Ministerie gebaseerd op: Gecertificeerde test Virus isolatie (overlay) met IDAS-ELISA op plaque met lage OD: 0.3 (onverdund) 0.1 (1:5) negatief Niet gecertificeerde bepalingen • real-time rt-PCR • dier-inoculatie • geen gecertificeerde confirmatietest • geen controle op verwisseling, kruisbesmetting, etc.
Ondeugdelijke basis voor besmetverklaring met MKZ virus
VI (net zo lang) herhaald tot deze positief was: waarom? Hierdoor introduceert men een type 1 error: Waarom werd wél waarde gehecht aan positieve uitslagen en niet aan negatieve? 6-well platen geven meer kans op kruisbesmetting dan gesloten buizen IDAS-ELISA is diverse keren uitgevoerd op een plaque (overlay). Wat is gedaan om risico’s van kruisbesmetting of verwisseling te achterhalen?
VI (net zo lang) herhaald tot deze positief was: waarom? Hierdoor introduceert men een type 1 error: Waarom werd wél waarde gehecht aan positieve uitslagen en niet aan negatieve? 6-well platen geven meer kans op kruisbesmetting dan gesloten buizen IDAS-ELISA is diverse keren uitgevoerd op een plaque (overlay). Wat is gedaan om risico’s van kruisbesmetting of verwisseling te achterhalen?
VI (net zo lang) herhaald tot deze positief was: waarom? Hierdoor introduceert men een type 1 error: Waarom werd wél waarde gehecht aan positieve uitslagen en niet aan negatieve? 6-well platen geven meer kans op kruisbesmetting dan gesloten buizen IDAS-ELISA is diverse keren uitgevoerd op een plaque (overlay). Wat is gedaan om risico’s van kruisbesmetting of verwisseling te achterhalen?
VI (net zo lang) herhaald tot deze positief was: waarom? Hierdoor introduceert men een type 1 error: Waarom werd wél waarde gehecht aan positieve uitslagen en niet aan negatieve? 6-well platen geven meer kans op kruisbesmetting dan gesloten buizen IDAS-ELISA is diverse keren uitgevoerd op een plaque (overlay). Wat is gedaan om risico’s van kruisbesmetting of verwisseling te achterhalen?
Bedrijf van Teunissen: Praktijk geval 1.26 hep-1 systematisch werken:
Bedrijf van Teunissen: Praktijk geval 1.26 hep-1 rt PCR: was deze operationeel?
Toepassing was formeel onjuist: de test was in ontwikkeling en niet gecertificeerd Uitkomsten waren zo inconsistent dat de uitslag geen enkele rol had mogen spelen Dit voldeed niet aan de gangbare wetenschappelijke standaard!
Bedrijf van Teunissen: Praktijk geval 1.26 hep-1 dier inoculatie: meer vragen dan antwoorden
Formeel geen valide test (EU en OIE), dus niet gecertificeerd Informeel misschien bruikbaar, maar er is weinig inzicht in borging van dit experiment Vragen bij dier inoculatie: Was dit dier tevoren gezond en zonder MKZ virus? Was er PA op dit dier verricht en wat is er gevonden? Wat was de status van de materialen die zijn ingespoten? Waarom is geen enkele stalgenoot van geval 1.26 hep-1 positief geworden? Besmetting van stalgenoten zou een grondig bewijs vormen voor aanwezigheid van MKZ op het bedrijf van Teunissen. Omgekeerd pleit het uitblijven van verspreiding sterk tegen de aanwezigheid van MKZ en tegen de betrouwbaarheid van het dierexperiment.
Bedrijf van Teunissen: HAM vraag: was er MKZ op het bedrijf?
Op 28 maart 2001 (datum uitslag) was deze vraag niet beantwoord. Voor die vaststelling was nader onderzoek noodzakelijk dat toen ontbrak
Of er uiteindelijk MKZ heerste is hier en nu niet aan de orde. Het feit dat U dat graag zou willen weten om een oordeel te kunnen vormen illustreert hoe groot het manco in de betreffende uitslag was.
