KEMENTERIAN KESEHATAN RI

Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Identifikasi, Dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis pada Media Padat

KEMENTERIAN KESEHATAN RI

DIREKTORAT JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN

ii

Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan Media Padat

DIREKTORAT JENDERAL PENGENDALIAN PENYAKIT DAN PENYEHATAN LINGKUNGAN 2012

KATA PENGANTAR Kekebalan Mycobacterium tuberculosis

terhadap Obat Anti TB merupakan

permasalahan yang harus segera ditanggulangi di Indonesia. Laporan global ke-3 tentang surveilans resistensi OAT menunjukkan beberapa daerah di dunia menghadapi endemi dan epidemi TB-MDR, dan di beberapa wilayah terdapat angka resistensi yang sangat tinggi. Saat ini menurut WHO Indonesia menduduki peringkat ke delapan dari 27 negara dengan jumlah kasus MDR tertinggi. Peran laboratorium dalam menegakkan mendiagnosis dan melakukan follow up dengan pemeriksaan sensitifitas OAT lini pertama dan kedua sangat diperlukan, sehingga laboratorium harus meningkatkan kemampuan pemeriksaan biakan dan DST. Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis pada media padat. Pemeriksaan biakan, identifikasi dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT disusun untuk menjadi acuan laboratorium pemeriksa TB agar terjamin mutunya, disamping untuk memudahkan perencanaan, pelaksanaan, pengawasan dan pengembangan laboratorium. Kami mengucapkan terima kasih kepada Kelompok Kerja Laboratorium TB dan semua pihak yang telah bekerja sama untuk menyusun Pedoman Pemeriksaan Biakan dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dari saluran pernapasan. Harapan kami semoga petunjuk teknis ini bermanfaat bagi semua laboratorium khususnya laboratorium pemeriksa biakan dan uji kepekaan M.TB dalam Katalog Dalam Terbitan. Kementerian Kesehatan RI 616.995 1 Ind p

Indonesia. Kementerian Kesehatan RI. Direktorat Jenderal Bina Upaya Kesehatan Petunjuk teknis pemeriksaan biakan, indentifikasi, dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis pada media padat,-- Jakarta : Kementerian Kesehatan RI. 20121

menjamin mutu pemeriksaannya.

Jakarta, Desember 2011 Direktur Jenderal Bina Upaya Kesehatan

ISBN 978-602-235-144-3 1. Judul I. TUBERCULOSIS - DIAGNOSIS II. TUBERCULOSIS - LABORATORY MANUALS III. MICROSCOPY - LABORATORY MANUALS IV. MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

dr. Supriyantoro, SpP, MARS


i

KATA SAMBUTAN

Bina Upaya Kesehatan tentang petunjuk teknis pemeriksaan biakan, identifikasi dan uji kepekaan M.tuberculosis pada media padat; Mengingat

: 1.

2.

Undang-Undang Nomor 29 Tahun 2004 tentang Praktik Kedokteran (Lembaran Negara Republik Indonesia Tahun 2004 Nomor 116, Tambahan Lembaran Negara Republik Indonesia Nomor 4431); Undang-Undang Nomor 36 Tahun 2009 tentang Kesehatan (Lembaran Negara Republik Indonesia Tahun 2009 Nomor 144, Tambahan Lembaran Negara Republik Indonesia Nomor 5063);

3.

Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 411/Menkes/Per/III/ 2010 tentang Laboratorium Klinik;

4.

Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 1144/Menkes/Per/ XI/2010 tentang Organisasi dan Tata Kerja Kementerian Kesehatan RI;

5.

Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 1647/Menkes/SK/ XII/2005 tentang Pedoman Jejaring Pelayanan Laboratorium Kesehatan;

6.

Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 364/Menkes/SK/V/ 2009 tentang Pedoman Penanggulangan Tuberkulosis;

7.

Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 831/Menkes/SK/IX/ 2009 tentang Standar Reagen Ziehl Neelsen;

8.

Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 835/Menkes/SK/IX/ 2009 tentang Pedoman Keselamatan dan Keamanan Laboratorium Mikrobiologik dan Imunologik.

Manajemen Terpadu Pengendalian TB Resisten Obat bertujuan untuk menemukan sebanyak mungkin pasien TB MDR sehingga dapat pemutus rantai penularan pasien TB MDR. WHO memperkirakan terdapat 440.000 kasus TB MDR pada tahun 2008 dengan angka kematian sekitar 150.000. Di Indonesia, diperkirakan terdapat 6.100 pasien TB MDR setiap tahunnya. Sesuai dengan data survei resistensi OAT yang dilaksanakan di Jawa Tengah, diperoleh data resistensi sebesar 1,9% untuk kasus baru dan 17,1% untuk kasus dengan pengobatan ulang. Laboratorium TB merupakan unit terdepan dalam diagnosis dan evaluasi penatalaksanaan pasien TB MDR. Diagnosis pasien TB MDR dilakukan melalui pemeriksaan biakan dan uji kepekaan kuman Mycobacterium tuberculosis. Laboratorium yang melaksanakan pemeriksaan biakan dan uji kepekaan harus mengikuti standar internasional dan terpantau mutunya. Saat ini terdapat banyak metode pemeriksaan biakan, identifikasi, dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan keunggulan dan kelemahan masing-masing. Pemeriksaan laboratorium yang tidak terstandarisasi menimbulkan kerugian yang besar bagi pasien, keluarga, masyarakat, dan pemerintah. Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Identifikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan media padat ini disusun untuk memberikan panduan bagi laboratorium agar dapat melaksanakan pemeriksaan biakan, identifikasi dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis lini pertama sesuai standar. Kami mengucapkan terima kasih kepada Kelompok Kerja Laboratorium TB dan semua pihak yang telah bekerja sama untuk menyusun petunjuk teknis ini. Semoga buku ini bermanfaat bagi semua laboratorium khususnya laboratorium yang melakukan pemeriksaan biakan dan uji kepekaan TB dalam menjamin mutu pemeriksaannya. Jakarta, Agustus 2012 Direktur Jenderal PP dan PL

Prof Dr. Tjandra Yoga Aditama NIP. 195509031980121001

vi



iii

TIM PENYUSUN

Prof. Dr. Agus Sjahrurachman, Sp.MK, PhD

- Dept. Mikrobiologi FKUI

Dra. Ning Rintiswati, MSc

- Bag. Mikrobiologi FK UGM

Dr. Tintin Gartinah, Sp.PK

- BLK Provinsi Jabar

Drs. Isak Solihin

- BLK Provinsi Jabar

Dr. Endang Woro, Sp.PK

- RS Persahabatan

Dr. Renaldi Panjaitan, Sp.MK

- RS Persahabatan

Dr. Endriyana Soerjat, Sp.PK

- BBLK Surabaya

Dr. Koesprijanti, Sp.PK

- BBLK Surabaya

KEPUTUSAN DIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA NOMOR : HK.02.04/V/1808/2012 . TENTANG PETUNJUK TEKNIS PEMERIKSAAN BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS PADA MEDIA PADAT DENGAN RAHMAT TUHAN YANG MAHA ESA DIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN, Menimbang

Dr. I Wayan Diantika

- Subdit TB, Dit. P2ML

Dr. Irfan Ediyanto


Dr. Retno Kusuma Dewi


Dr. Sri Widyastuti

- Subdit MI, Dit. BPPM

Dr. A.W. Praptiwi


Dr. Wiwi Ambarwati


Agus Susanto, SKM


Dr. Harini Janiar, Sp.PK

- KNCV

Roni Candra, S.Si, M.Biomed

- KNCV

: a.

bahwa penyakit Tuberkulosis merupakan penyakit menular yang masih menjadi masalah kesehatan masyarakat dan salah satu penyebab kematian sehingga perlu dilaksanakan program pengendalian secara berkesinambungan;

b.

bahwa pelayanan laboratorium Tuberkulosis merupakan komponen kunci pengendalian Tuberkulosis yang diselenggarakan oleh berbagai jenis laboratorium pada berbagai tingkat pelayanan laboratorium;

c.

bahwa peran laboratorium dalam menegakkan diagnosis dan melakukan follow up dengan pemeriksaan OAT lini pertama dan kedua sangat diperlukan; d. bahwa untuk menjamin mutu pelayanan laboratorium dalam pemeriksaan biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tb perlu adanya acuan yang bisa segera digunakan bagi petugas teknis laboratorium dalam melakukan pemeriksaan;

e.

iv


bahwa berdasarkan pertimbangan sebagaimana dimaksud pada huruf a, b, c dan d perlu ditetapkan Keputusan Direktur Jenderal


v

VI. ALUR KERJA BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN Mycobacterium tuberculosis ..............................................................................43 VII. PRAKTEK LABORATORIUM .............................................................................51 A. Pengambilan, Pengiriman dan Penerimaan Spesimen .................................51 B. Pembuatan Media Lowenstein-Jensen...........................................................54 C. Biakan Mycobacterium tuberculosis ..............................................................57 D. Pembacaan Hasil Biakan .................................................................................62

MEMUTUSKAN : Menetapkan

:

Kesatu

: KEPUTUSAN DIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN TENTANG PETUNJUK TEKNIS PEMERIKSAAN BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN MYCOBACTERIUM TUBERKULOSIS PADA MEDIA PADAT. : Petunjuk Pelaksanaan sebagaimana dimaksud dalam Diktum Kesatu sebagaimana terlampir dalam Lampiran Keputusan ini. : Petunjuk Pelaksanaan sebagaimana dimaksud dalam Diktum Kedua agar digunakan sebagai acuan bagi petugas teknis laboratorium yang terkait dalam melakukan pemeriksaan biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis. : Pembinaan dan pengawasan pelaksanaan Keputusan ini dilakukan oleh Direktur Jenderal Bina Upaya Kesehatan, Direktur Jendaral Pengendalian Penyakit dan Penyehatan Lingkungan, Dinas Kesehatan Provinsi dan Dinas Kesehatan Kabupaten/ Kota sesuai tugas dan fungsinya masing-masing. : Keputusan ini mulai berlaku pada tanggal ditetapkan.

E. Subkultur Isolat Mycobacterium tuberculosis ..............................................63 F. Identifikasi Mycobacterium tuberculosis .......................................................69 G. Pembuatan Media untuk Uji PNB dan Resistensi .........................................75 H. Pembuatan Suspensi Kuman untuk Uji Kepekaan........................................79 I. Uji Resistensi Mycobacterium tuberculosis Cara Proporsi ..........................81

Kedua Ketiga

J. Interpretasi Hasil Uji Kepekaan .......................................................................84 K. Preservasi Kuman pada Suhu -70oC..............................................................87 L. Resusitasi Mycobacterium tuberculosis dari -70oC .....................................89

Keempat

M. Pengiriman Isolat ke Laboratorium Rujukan .................................................89 N. Pengelolaan Limbah.........................................................................................90 VIII. PEMANTAPAN MUTU BIAKAN DAN UJI KEPEKAAN .....................................93 A. Tujuan Pemantapan Mutu ................................................................................93

Kelima

B. Komponen Pemantapan Mutu Laboratorium Tuberkulosis .........................93 IX. PENCATATAN DAN PELAPORAN .....................................................................103 Ditetapkan di : Jakarta Pada tanggal : 27 September 2012 DIRJEN BINA UPAYA KESEHATAN;

SUPRIYANTORO

x



vii

DAFTAR ISI KATA PENGANTAR .......................................................................................................i KATA SAMBUTAN .......................................................................................................iii TIM PENYUSUN ..........................................................................................................iv KEPUTUSAN DIRJEN BINA UPAYA KESEHATAN KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA NOMOR : HK.02.04/V/1808/2012 ......................................v DAFTAR ISI .................................................................................................................ix DAFTAR TABEL ..........................................................................................................xi DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................xii DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................................xiii DAFTAR SINGKATAN ...............................................................................................xiv I. PENDAHULUAN .......................................................................................................1 A. Latar Belakang ....................................................................................................1 B. Tujuan Petunjuk Teknis ......................................................................................4 II. MANFAAT PEMERIKSAAN BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN PADA PROGRAM PENGENDALIAN TB .................................................................5 A. Biakan Mycobacterium tuberculosis ................................................................7 B. Uji kepekaan ( Drug Susceptibility Test/ DST) .................................................9 III. KARAKTERISTIK MYCOBACTERIA .................................................................... 11 IV. SUMBER DAYA LABORATORIUM .......................................................................15 A. Ruang laboratorium .........................................................................................15 B. Peralatan dan penjaminan kinerja alat, termasuk kalibrasi .........................23 V. KEAMANAN KERJA UNTUK BIAKAN DAN UJI KEPEKAAN ............................29 A. Desain Laboratorium........................................................................................29 B. Pedoman Umum Keamanan Laboratorium ....................................................29 C. Pedoman Khusus .............................................................................................32 D. Penanganan Limbah. .......................................................................................38 E. Penanganan Tumpahan Infeksius ...................................................................39

viii



ix

DAFTAR SINGKATAN AKMS Am APD BSC BTA CPC DOTS DST E EQA Fasyankes Gerdunas TB HEPA HIV ISTC INH (H) Km LJ MDR MGIT MODS MOTT NASBA NRA NTM OAT PCR PME PMI PMO PNB PPE R RAN S SDA PCR TB WHO XDR Z

xiv

: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :

Advokasi, Komunikasi, Mobilisasi Sosial Amikasin Alat Pelindung Diri Biological Safety Container Bakteri Tahan Asam Cetyl Piridium Chloride Directly Observed Treatment Shortcourse Drug Susceptibility Test Ethambutol External Quality Assurance Fasilitas Pelayanan Kesehatan Gerakan Terpadu Nasional TB High Efficiency Particulate Air Human Immunodeficiency Virus International Standar for TB Care Isoniazid Kanamisin Lowenstein Jensen Multiple Drugs Resistance Mycobacteria Growth Indicator Tube Mycroscopic Observation of Drug Susceptibility Mycobacterium Other Than Tuberculosis Nucleic Acid Sequence Based Amplification Nitrate Reduction Assay Non Tuberculosis Mycobacteria Obat Anti Tuberkulosis Polymerase Chain Reaction Pemantapan Mutu Eksternal Pemantapan Mutu Internal Pengawas Menelan Obat Para Nitro Benzoic Acid Personal Protective Equipment Rifampisin Rencana Aksi Nasional Streptomisin Strand Displacement Amplification Tuberkulosis World Health Organization Extremely Drugs Resistance Pyrazinamid


DAFTAR TABEL

Tabel 1 Tabel 2 Tabel 3 Tabel 4 Tabel 5 Tabel 6 Tabel 7 Tabel 8 Tabel 9

Jumlah BTA apusan, konsentrasi basil dalam spesimen dahak, dan kemungkinan mendapatkan hasil positif................................................ Mycobacteria yang dapat menyebabkan penyakit pada manusia.......... Kisi-kisi hubungan antar ruang di laboratorium dan laboratorium Mycobacterium tuberculosis………………..…....................................... Peralatan laboratorium biakan dan uji kepekaan dengan media padat untuk beban kerja 6000 uji/tahun ……………………………................... Alat pendukung (beban kerja 6000 uji/tahun) ………………………....... Bahan habis pakai untuk Biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis …………………………………………................................. Diferensiasi diantara Mycobacterium tuberculosis complex .................. Pendugaan Spesies Mycobacteria ……………………………………..... Pembuatan larutan sesuai dengan kebutuhan ……………………........


5 13 18 24 25 27 45 46 60

xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1

Gambar 2

Gambar 3 Gambar 4 Gambar 5 Gambar 6 Gambar 7 Gambar 8

xii

Contoh denah laboratorium sederhana untuk biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis ( WHO 1998).. Contoh lay out laboratorium pemeriksaan Mycobacterium tuberculosis dengan fasilitas biomolekuler…..……….….. Tanda baku biohazard international ……………………… Skema wadah spesimen rujukan …………………………. Skema aliran udara pada BSC Kelas II …………………. Alur Biakan dan Identifikasi Mycobacterium tuberculosis Alur Kerja Identifikasi Rutin ………………………………… Alur Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis ………….


DAFTAR LAMPIRAN

16

20 30 34 36 43 47 48

Lampiran 1 Lampiran 2

Log Book Pembacaan Uji Kepekaan ………………………. Format Pembacaan Hasil Uji Resistensi ...........................

104 105

Lampiran 3 Lampiran 4 Lampiran 5 Lampiran 6 Lampiran 7 Lampiran 8

Form TB.05 MDR (Permohonan Lab TB MDR) ................. Form TB 04 MDR (Register Laboratorium TB MDR) ......... Form TB.06 MDR (Register Suspek TB MDR) .................. Rekapitulasi hasil biakan ................................................... Rekapitulasi hasil uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis ..... Tabel Pemeliharaan dan Kalibrasi Alat ......................................

106 107 108 109 110

Lampiran 9

111 Formulir Pemantapan Mutu Internal .......................................... 113


xiii

pemeriksaan biakan dan uji kepekaan; pengelolaan pasien TB MDR menggunakan

LAMPIRAN KEPUTUSAN DIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN NOMOR : HK.02.04/V/1808/2012 TANGGAL : 27 SEPTEMBER 2012

strategi pengobatan yang tepat dengan OAT lini kedua; jaminan ketersediaan OAT lini kedua yang berkualitas dan tidak terputus serta pencatatan pelaporan secara baku.

I. PENDAHULUAN

Diagnosis yang akurat dan tepat waktu merupakan tulang punggung program TB. Resistensi OAT harus didiagnosis secara tepat sebelum dapat diobati secara efektif. penemuan kasus TB MDR dilakukan dengan pemeriksaan apusan dahak mikroskopis, biakan dan uji kepekaan di laboratorium yang terjaga mutunya. Selain itu, dengan meningkatnya kasus HIV/AIDS, diagnosis TB secara mikroskopik tidak memadai. Hal ini memerlukan upaya pengembangan kemampuan laboratorium yang mampu melakukan biakan, identifikasi, dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT atau Drug Sensitivity Test (DST).

A. Latar Belakang Tuberkulosis (TB) adalah suatu penyakit infeksi yang menular, disebabkan oleh kuman Mycobacterium tuberculosis. Penularan langsung terjadi melalui aerosol yang mengandung kuman TB. Penyakit ini dapat menyerang semua kelompok umur dan semua organ tubuh manusia, terutama paru. Gejala umum TB paru pada orang dewasa adalah batuk yang terus-menerus dan berdahak, selama 2 - 3 minggu atau lebih. Bila tidak diobati maka setelah lima tahun sebagian besar (50%) pasien akan meninggal.

Uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap obat bermanfaat bagi klinisi dalam mengarahkan jenis obat yang akan diberikan kepada penderita. Ini sangat penting

Sejak tahun 1995 Indonesia mulai menerapkan strategi DOTS (Directly Observed

karena pemberian OAT yang tidak tepat, tidak hanya akan menyebabkan kegagalan

Treatment Shortcourse) untuk digunakan sebagai satu-satunya strategi pengendalian

pengobatan, tetapi juga menyebabkan penularan terus berlangsung dan mempercepat

TB di Indonesia, yang dimulai pelaksanaannya di Puskesmas sebagai ujung tombak

kejadian dan penyebaran TB MDR dan XDR.

pelayanan kesehatan di Indonesia.

Saat ini terdapat banyak metode pemeriksaan biakan, identifikasi, dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan keunggulan dan kelemahan masing-masing. Namun hasil uji kepekaan dengan cara yang tidak terstandarisasi menimbulkan kerugian yang besar bagi pasien, keluarganya, masyarakat, dan pemerintah. Oleh karena itu perlu disusun Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Identifikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis yang meliputi : sumber daya manusia, fasilitas laboratorium,

Strategi DOTS telah dibuktikan dengan berbagai uji coba lapangan dapat memberikan angka kesembuhan yang tinggi. Strategi DOTS merupakan strategi kesehatan yang paling cost effective. Satu studi cost benefit yang dilakukan oleh WHO di Indonesia menggambarkan bahwa setiap satu dolar Amerika yang digunakan untuk membiayai program penanggulangan TB, akan menghemat sebesar 55 dolar Amerika selama 20

bahan habis pakai, metode pemeriksaan, pemantapan mutu serta pencatatan dan

tahun. Agar berhasil baik, diperlukan implementasi dari lima komponen strategi DOTS,

pelaporan.

yaitu :

B. Tujuan Petunjuk Teknis

1. Komitmen politis dari para pengambil keputusan, termasuk dukungan dana.

1. Pemeriksaan biakan, identifikasi dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT terjamin mutunya. 2. Memudahkan perencanaan, pelaksanaan, pengawasan dan pengembangan laboratorium 3. Memudahkan pengembangan program baru berbasis data yang akurat.

2. Diagnosis TB dengan pemeriksaan dahak secara mikroskopik. 3. Kesinambungan persediaan OAT jangka pendek. 4. Pengobatan dengan paduan Obat Anti Tuberkulosis (OAT) jangka pendek dengan pengawasan langsung oleh Pengawas Menelan Obat (PMO). 5. Pencatatan dan pelaporan secara baku untuk memudahkan pemantauan dan evaluasi program TB.

4



1 1

Untuk menjamin keberhasilan penanggulangan TB kelima komponen tersebut di atas

HDL). Titik berat manajemen program meliputi: perencanaan, pelaksanaan,

harus dilaksanakan secara bersamaan.

monitoring dan evaluasi serta menjamin ketersediaan sumber daya (dana, tenaga,

Kebijakan DOTS di Indonesia :

1. Penanggulangan TB di Indonesia dilaksanakan sesuai dengan asas desentralisasi dengan Kabupaten/Kota sebagai titik berat program yang meliputi: perencanaan, pelaksanaan, monitoring dan evaluasi, serta menjamin ketersediaan sumber daya (dana, tenaga, sarana dan prasarana).

2. Upaya penanggulangan dilaksanakan secara terintegrasi di Fasilitas Pelayanan Kesehatan (Fasyankes) berdasar kemitraan, dengan menggunakan strategi DOTS, peningkatan mutu pelayanan, Obat Anti TB (OAT) diberikan secara cuma-cuma, serta mempertahankan dan meningkatkan mutu pelayanan laboratorium TB.

3. Kebijakan lain untuk mendukung keberhasilan Program Pengendalian TB (P2TB)

sarana dan prasarana) 2. Penanggulangan TB MDR dilaksanakan dengan menggunakan strategi DOTS dimana setiap komponen yang ada lebih ditekankan kepada penata laksanaan TB MDR dan disebut sebagai PMDT (Programmatic Management of Drug Resistant TB). 3. Penguatan kebijakan untuk meningkatkan komitmen para pelaksana terhadap program penanggulangan TB MDR 4. Penguatan PMDT dan pengembangannya ditujukan terhadap peningkatan mutu pelayanan, kemudahan akses untuk penemuan dan pengobatan sehingga mampu memutuskan rantai penularan dan mencegah terjadinya TB XDR.

adalah mempertahankan dan meningkatkan komitmen daerah, advokasi, komunikasi

5. Tatalaksana penanggulangan TB MDR mengacu kepada strategi DOTS dan ISTC.

dan mobilisasi sosial (AKMS) terhadap sektor terkait, dalam wujud Gerakan Terpadu

6. Pengembangan wilayah disesuaikan dengan rencana pengembangan PMDT yang

Nasional Penanggulangan TB (Gerdunas TB).

4. Diagnosis kasus terutama didasarkan atas pemeriksaan mikroskopik BTA, kecuali untuk kasus pada anak.

5. DOTS mengasumsikan bahwa semua Mycobacterium tuberculosis yang menjadi penyebab masih peka terhadap semua OAT lini primer.

ada dalam Stranas TB dan RAN PMDT, secara bertahap sehingga seluruh wilayah Indonesia dapat mempunyai akses terhadap pelayanan TB MDR yang bermutu. 7. Titik berat pelayanan pasien TB MDR adalah pada fasyankes rujukan dan jejaringnya. 8. Pembiayaan penatalaksanaan pasien TB MDR menjadi tanggung jawab Pemerintah pusat dan daerah, melalui mekanisme yang ada.

Tingginya angka default serta penggunaan obat-obat TB lini pertama dan kedua yang

9. Laboratorium TB merupakan unit yang terdepan dalam diagnosis dan evaluasi

tidak rasional khususnya oleh rumah sakit dan sektor swasta serta kecenderungan

penata laksanaan pasien TB MDR sehingga kemampuan dan mutu laboratorium

peningkatan kasus HIV memberikan tantangan ke depan yang besar dalam masalah

harus sesuai standar internasional dan selalu dipertahankan kualitasnya untuk

TB-MDR. Dewasa ini kasus TB-MDR dan bahkan TB-XDR telah ditemukan di Indonesia.

biakan dan uji kepekaan M. Tuberculosis. Diagnosis TB MDR harus berdasarkan

Menurut perkiraan WHO secara nasional angka MDR sekitar 2-3% untuk kasus baru. Dari

hasil pemeriksaan uji kepekaan, tidak boleh berdasarkan klinis saja

data survei resistensi OAT yang dilaksanakan di Jawa Tengah, diperoleh data resistensi sebesar 1,9% untuk kasus baru dan 17,1% untuk kasus dengan pengobatan ulang. Penatalaksanaan kasus TB MDR (Manajemen Terpadu Pengendalian TB Resisten Obat) dimulai dengan suatu uji pendahuluan di 2 wilayah pada tahun 2009, yang saat ini telah menjadi bagian dari Program Nasional TB dengan mengambil kebijakan sebagai berikut:

10. Pemerintah menyediakan OAT TB MDR yang berkualitas untuk pasien TB MDR. 11. Mempersiapkan sumber daya manusia yang kompeten dalam jumlah yang memadai untuk meningkatkan dan mempertahankan kinerja program. 12. Meningkatkan dukungan masyarakat bagi pasien TB dan keluarga. 13. Memberikan kontribusi terhadap komitmen global.

1. Penanggulangan TB MDR di Indonesia dilaksanakan sesuai tatalaksana

2

penanggulangan TB yang berlaku saat ini dengan mengutamakan tata hubungan

Strategi penerapan Manajemen Terpadu TB Resisten Obat membutuhkan komitmen yang

sarana kesehatan rujukan dan sarana kesehatan dasar (Hospital DOTS Linkage/

berkesinambungan dari semua pihak; penemuan pasien TB MDR yang rasional melalui



3

Dengan meningkatnya kasus-kasus HIV/AIDS maka masalah NTM juga meningkat. Diagnosis NTM pada kasus HIV/AIDS secara mikroskopis mempunyai sensitivitas yang rendah, karena itu diperlukan pemeriksaan biakan. Pemeriksaan biakan dapat meningkatkan sensitivitas untuk diagnosis dan sekaligus membedakan Mycobacterium tuberculosis dan NTM. Ada peningkatan kepekaan untuk mendeteksi BTA dengan biakan, secara mikroskopis

II. MANFAAT PEMERIKSAAN BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN PADA PROGRAM PENGENDALIAN TB Pengunjung poliklinik dengan gejala saluran pernafasan merupakan kelompok prioritas penemuan pasien, karena pasien BTA (+) yang merupakan sumber penularan, terdapat pada kelompok tersebut. Saat ini pasien BTA positif adalah kelompok terbesar pasien TB yang ditemukan dan dilaporkan di negara berkembang.

untuk mendapatkan 50% kesempatan BTA positif diperlukan kuman BTA dalam dahak 5000 kuman per ml jika diperiksa 300 Lapang Pandang, sementara dengan teknik biakan

Dalam buku Pedoman Nasional Pengendalian TB pada tahun 2011 yang diterbitkan

yang baik hasil positif dapat terjadi walau kuman hidup berkisar antara 10-100 kuman

Kementerian Kesehatan, diagnosis TB paru dilakukan dengan pemeriksaan 3 spesimen

per ml. Pada umumnya biakan dahak akan meningkatkan penemuan kasus sekitar 20–

dahak, salah satu di antaranya adalah dahak pagi hari, yang lain adalah dahak sewaktu

30 % dari jumlah keseluruhan TB Paru BTA positif. Oleh sebab itu pemeriksaan biakan

yang diambil saat pasien datang ke Fasyankes. Dahak pagi biasanya lebih sering

sangat bermanfaat untuk kasus pausibasiler (kasus dengan jumlah kuman sedikit)

memberikan hasil BTA positif dibanding dengan dahak sewaktu.

seperti pada TB ekstra paru, TB anak dan TB pada kondisi penekanan sistem imun.

Pemeriksaan dahak secara mikroskopis adalah metode pemeriksaan yang paling

Biakan dahak merupakan suatu metode pemeriksaan yang kompleks, membutuhkan

sederhana, cepat, terpercaya dan paling murah untuk diagnosis pasien TB. Sekitar

sarana, prasarana dan peralatan yang lebih mahal serta sumber daya manusia dengan

70 – 80 % TB Paru BTA positif dapat terdeteksi, bila penemuan tersangka TB dilaksanakan

keterampilan khusus.

sesuai pedoman yang telah dikeluarkan oleh Kementerian Kesehatan. Pada negara yang

Indikasi utama pemeriksaan biakan dan uji kepekaan adalah sebagai berikut : Sesuai kriteria suspek TB MDR 1. Pasien TB pengobatan kategori 2 yang gagal (Kasus kronik) 2. Pasien TB pengobatan kategori 2 yang tidak konversi 3. Pasien TB yang pernah diobati pengobatan TB Non DOTS 4. Pasien TB gagal pengobatan kategori 1 5. Pasien TB pengobatan kategori 1 yang tidak konversi setelah pemberian sisipan. 6. Pasien TB kambuh 7. Pasien TB yang kembali setelah lalai/default 8. Suspek TB yang kontak erat dengan pasien TB-MDR 9. ODHA dengan gejala TB/ koinfeksi TB. Evaluasi pengobatan MDR/ XDR

8


kasus Non Tuberculosis Mycobacterium (NTM) masih rendah, spesifisitas pemeriksaan berkisar 99%. Uraian lebih lengkap dapat dilihat pada tabel 1. Tabel 1. Jumlah BTA dalam sediaan apus, konsentrasi basil dalam dahak, dan kemungkinan mendapatkan hasil positif. Jumlah basil ditemukan secara mikroskopik (ZN) 0 dlm ≥ 100 l.p 1-2/ 300 l.p 1-9/ 100 l.p 1-9/ 10 l.p IUATLD 1-9/ l.p ≥ 10/ l.p

Perkiraan konsentrasi basil/ ml,dlm spesimen Kurang dari 1.000 5.000 – 10.000 ~ 30.000 ~ 50.000 ~ 100.000 500.000

Kemungkinan hasil positif Kurang dari 10 % 50 % 80 % 90 % 96,2 % 99.95 %


5

Pada tahun 2011 angka keberhasilan pengobatan yang dicapai oleh program DOTS

2. Kesalahan yang biasa terjadi pada pengelolaan pengobatan TB adalah :

untuk Indonesia adalah 86.7% dengan angka kesembuhan adalah 80.4% (Data :

Manajemen kasus yang buruk (pengobatan tidak dengan pengawasan penuh

Laporan situasi terkini perkembangan Tuberkulosis di Indonesia, Januari-Desember

=DOT/ Directly Observed Treatment, terutama pada tahap intensif).

2011). Sedangkan kesimpulan National TB Program Managers Meeting European

Pasien kesulitan mendapatkan semua OAT yang diperlukan secara adekuat.

Region tahun 2000 menyatakan bahwa untuk meminimalisasi kejadian MDR (Multiple

3. Pengetahuan pasien kurang karena informasi kurang atau penjelasan yang tidak

Drug Resistant) diperlukan angka kesembuhan minimal 95%. Oleh karena itu pendataan tentang prevalensi TB MDR dan TB XDR harus dilaksanakan secara berkesinambungan. Multiple Drug Resistance TB MDR (Multiple Drug Resistance) adalah suatu keadaan dimana Mycobacterium tuberculosis telah resisten terhadap INH dan Rifampisin saja atau resisten terhadap INH dan Rifampisin serta OAT lini pertama lainnya.

adekuat sebelum mulai pengobatan. Pengobatan kasus TB MDR sangat sulit, selain biayanya sangat mahal, efek samping obat lebih besar juga angka kesembuhannya lebih rendah dibandingkan dengan hasil pengobatan kasus bukan TB MDR. Karena itu strategi terbaik untuk mengendalikan TB MDR adalah mencegah kejadian TB MDR dengan melaksanakan pengobatan kasus bukan TB MDR sebaik-baiknya dan melaksanakan program pengendalian TB MDR sesuai pedoman. Agar terlaksana dengan baik, diperlukan komitmen semua pihak dan

Fenomena amplifikasi dan penyebaran kasus resistensi TB atau TB MDR seluruhnya

mobilisasi sumber daya. Perlu diingat bahwa dalam 1 tahun satu kasus TB MDR dapat

adalah akibat perbuatan manusia. Telah dibuktikan bahwa kejadian resistensi

menularkan pada 6 orang lain.

Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT adalah akibat mutasi alami. Amplifikasi Mycobacterium tuberculosis yang resisten selanjutnya terjadi akibat kesalahan manusia, seperti tersebut di bawah ini : 1. Kesalahan pengelolaan OAT. 2. Kesalahan manajemen kasus TB. 3. Kesalahan proses penyampaian OAT kepada pasien. 4. Kesalahan hasil uji DST 5. Pemakaian OAT dengan mutu rendah Kesalahan medis yang biasa terjadi yang menyebabkan resistensi basil, adalah : 1. Pemberian pengobatan yang tidak adekuat, baik dosis, kombinasi OAT maupun lama pengobatan. Misalnya hanya 2-3 OAT pada tahap intensif untuk penderita BTA positif dengan kuman yang resisten primer terhadap INH hanya menambahkan satu jenis OAT pada kasus gagal terus menambahkan OAT lain, pada saat pasien kambuh setelah pengobatan

Extremely Drug Resistant TB XDR merupakan TB MDR disertai resistensi terhadap salah satu obat golongan fluorokuinolon dan salah satu dari OAT injeksi lini kedua (kapreomisin, kanamisin dan amikasin) Hasil berbagai kajian di luar negeri memperlihatkan bahwa terdapat kecenderungan peningkatan insidensi TB MDR dan TB XDR. TB XDR juga sudah dikonfirmasi keberadaannya di Indonesia. Jalan untuk menghambat laju kenaikan masalah TB XDR dimulai dengan keharusan menjalankan program DOTS sebaikbaiknya dan tidak dengan mudah menjalankan pengobatan dengan OAT lini kedua. Jika akan melakukan pengobatan dengan OAT lini kedua, hendaknya konsisten mengacu pada pedoman yang telah terbukti validitasnya. A. Biakan Mycobacterium tuberculosis Untuk mendiagnosis TB MDR dan TB XDR diperlukan pemeriksaan biakan, identifikasi yang kemudian dilanjutkan dengan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT.

dengan obat tunggal.

6



7

Dari sudut pandang kecepatan tumbuh dan jenis pigmen, dua parameter yang mudah diamati pada pemeriksaan biakan, Mycobacterium dapat secara sederhana dibagi atas : 1.

2.

3.

Uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT berguna untuk mengarahkan

Photochromogen dengan pigmen koloni kuning .

jenis obat yang akan diberikan kepada pasien. Ini sangat penting karena pemberian OAT

Kuman golongan ini koloninya akan berwarna jika inkubasi dilakukan dengan

yang tidak tepat, tidak hanya akan menyebabkan kegagalan pengobatan, tetapi juga

pencahayaan. Termasuk dalam golongan ini adalah M. kansasii, M. marinum, M.

menyebabkan penularan terus berlangsung dan mempercepat kejadian dan penyebaran

simiae, M. asiaticum.

TB MDR dan TB XDR.

Non photochromogen ( tanpa pigmen pada koloni ).

Banyak metode untuk melakukan uji kepekaan; menggunakan media padat atau

Termasuk dalam golongan ini adalah : M. tuberculosis complex, M. terrae complex,

cair, metode radiometrik atau nir radioisotop, metode seluler atau molekuler. Semua

M. gastrii, M. malmoense, M. avium complex, M. haemophilum, M. xenopi.

metode mempunyai keunggulan dan kelemahan. Karena itu apapun caranya, hasil

Scotochromogen ( dengan pigmen koloni jingga )

akan mempunyai arti jika cara yang dipakai telah terstandarisasi. Di antara cara yang

Kuman golongan ini koloninya akan berwarna jika inkubasi dilakukan dalam

terstandarisasi adalah cara proporsi pada media LJ, cara radiometric dengan alat Bactec,

keadaan gelap. Termasuk dalam golongan ini adalah : M. szulgai, M. flavesens,

cara end point inhibition pada media semi solid, cara “break point “ pada media cair

M.thermoresistible, M. gordonae, M. scrofulaceum, M. xenopi 4.

B. Uji kepekaan ( Drug Susceptibility Test/ DST)

Rapid grower. Diantaranya adalah M. flavescens, M. thermoresistible, M. marinum, M. fortuitum-

seperti MGIT, NRA ( Nitrate Reduction Assay), MODS, kalorimetrik. Hasil uji kepekaan dengan cara yang tidak terstandarisasi menimbulkan kerugian yang besar bagi pasien, keluarga, masyarakat, dan pemerintah.

chelonae complex. Kebanyakan kuman dari golongan ini tidak patogen bagi

Pada saat ini Kementerian Kesehatan mengambil kebijakan untuk melakukan uji

manusia

kepekaan menggunakan cara proporsi pada media LJ dan cara break point (MGIT) dengan mempertimbangkan berbagai faktor termasuk ketersediaan sumber daya

Kuman yang tidak termasuk rapid grower mempunyai waktu pembelahan puluhan jam, karena itu koloni yang diisolasi dari spesimen biasanya mulai tampak setelah 2 (dua) minggu. Sementara koloni kuman yang termasuk rapid grower biasanya akan tampak dalam waktu kurang atau sampai 1 (satu) minggu.

laboratorium. Catatan : Uji diagnosis lain yang tersedia di pasaran sudah banyak. Diperlukan kehati-hatian yang sangat tinggi agar uji tersebut tidak disalahgunakan untuk diagnosis. Banyak uji yang belum terstandarisasi atau sangat selektif penggunaannya. Di antaranya adalah : 1. Uji serologi untuk mendeteksi/mengukur kadar antibodi terhadap komponen mycobacteria. Pada tahun 2011, WHO mengeluarkan pernyataan bahwa uji serologis yang tersedia tidak direkomendasikan untuk diagnosis paru dan ekstra paru 2. Uji serologi untuk mendeteksi antigen. Sampai saat ini belum ada kit yang direkomedasikan oleh W.HO untuk diagnosis TB paru dan ekstra paru.

12



9

3. Uji deteksi/pengukuran interferon gamma. Uji ini dapat dilakukan dengan jalan mengukur kadar interferon gamma pada serum atau

III. KARAKTERISTIK MYCOBACTERIA

plasma dan mengukur kadar interferon gamma yang dihasilkan oleh sel limfosit T yang

Mycobacteria merupakan mikroba tahan asam, serupa dengan Rhodococcus dan

diisolasi dari pasien dan direaksikan dengan komponen M. tuberculosis. Sensitifitas

Nocardia. Tingkat ketahanan Mycobacteria terhadap asam bervariasi. Mycobacteria ada

dan spesifisitas uji ini dalam menegakkan diagnosis TB paru dewasa juga masih lebih

yang bersifat patogen dan ada juga yang tidak patogen. Mycobacteria tidak patogen

rendah dibandingkan dengan pemeriksaan BTA mikroskopis SPS. Sampai saat ini uji

ditemukan di lingkungan manusia, khususnya dalam air. Mycobacteria lingkungan ini

deteksi interferon gama tak dapat membedakan antara sakit dan infeksi TB laten.

merupakan kontaminasi yang harus diantisipasi agar tak mengacaukan hasil pemeriksaan

4. Amplifikasi asam nukleat M. tuberculosis dari spesimen. Sudah banyak cara yang dikembangkan. Misalnya dengan cara reaksi rantai

biakan dan uji kepekaan. Termasuk dalam Mycobacteria yang secara medis penting adalah :

polimerasa konvensional (konventional PCR), realtime PCR, NASBA, SDA PCR, PCR isothermal dan sebagainya. Untuk TB paru uji amplifikasi asam nukleat yang bukan

1.

M. tuberculosis

“real time“ telah dibuktikan tidak lebih sensitif dibandingkan dengan pewarnaan BTA

2.

M. bovis

tiga kali. Kelebihan cara amplifikasi asam nukleat adalah kemampuannya mendeteksi

3.

M. africanum

4.

M. microtii

kasus TB MDR. Pada tahun 2011, WHO merekomedasikan penggunaan teknologi

5.

M. ulcerans

PCR real time yaitu GenXpert yang lebih sensitif dibandingkan dengan pemeriksaan

6.

M. leprae

mikroskopik. Namun baru digunakan untuk kasus TB pada HIV dan dugaan TB

7.

M. kansasii

MDR. Apabila dibandingkan dengan GeneXpert, LPA lebih sukar pelaksanaannya,

8.

M. marinum

9.

M. simiae

10.

M. scrofulaceum

11.

M. szulgai

ketahanannya tertinggi pada mycobacteria. Dengan demikian pewarnaan BTA dengan

12.

M. xenopi

cara Ziehl-Neelsen ataupun auramin juga akan mendeteksi spesies mycobacteria

13.

M. gordonae

lain. Namun karena prevalensi infeksi oleh mycobacteria yang bukan Mycobacterium

14.

M. flavescens

tuberculosis (MOTT/ NTM) saat ini sangat rendah, maka hasil positif lebih mengarah

15.

M. fortuitum-chelonae complex

16.

M. thermoresistible

17.

M. avium-intracellulare complex

18.

M. terra-triviale complex

beberapa species Mycobacteria lain dengan cepat. Pada tahun 2012, WHO merekomendasikan LPA (Line Probe Assay) untuk penapisan

tetapi memiliki kelebihan dibanding GeneXpert yaitu mampu mendeteksi kekebalan terhadap obat lini kedua. 5. Pewarnaan BTA. Mycobacteria, Nocardia dan Rodococcus merupakan kuman tahan asam. Derajat

pada Mycobacterium tuberculosis. Yang perlu diwaspadai adalah BTA lingkungan yang banyak mencemari air.

Nomor 1 sampai 4 digolongkan sebagai M. tuberculosis complex.

10



11

dalam 30-45 menit. Resiko infeksi akan sangat dikurangi jika pengerjaan spesimen dan

Tabel 2. Mycobacteria yang dapat menyebabkan penyakit pada manusia

isolat dilakukan dalam Bio Safety Cabinet (BSC) dikerjakan sesuai dengan baku praktek laboratorium minimal untuk baku praktek laboratorium dengan tingkat keamanan 3

Mycobacteria

Habitat

(tiga). Jika menggunakan exhaust fan, gunakan yang mempunyai kapasitas minimal 23.6 liter per detik. Gambar 1: contoh denah laboratorium paling sederhana untuk biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis ( WHO 1998 )

Keterangan: 1. Biosafety Cabinet 2. Sentrifuse 3. Deep freezer -70 0C 4. Wastafel 5. Bak pewarnaan 6. Timbangan analitik (nefelometer) 7. Mikroskop 8. Meja 9. Inkubator 10. Meja 11. Meja cuci 12. Lemari Es (refrigerator) 13. Analitikal Balans 14. Penangas air 15. Lemari Bakar 16. Autoclave 17. Heat sterilisator 18. Lemari Administrasi 19. Meja Administrasi

16

A :Ruang administrasi, penerimaan contoh uji B : Ruang kerja lab C : Ruang Cuci dan sterilisasi D : Ruang pembuatan media

Mycobacterium tuberculosis complex M. tuberculosis M. bovis M. canetti Photochromogen M. kansasii M. marinum M. simiae M. asiaticum Scotochromogen M. scrofulaceum M. szulgai M. gordonae M. flavescens M. xenopi Non photochromogen M. avium-intracellulare M. ulcerans M. gastri M. terrae

E : Exhause L : Loket penerima bahan AC : Air Conditioner


Rapid grower M. fortuitum M. abcessus M. chelonae M. smegmatis M. leprae

Organ yang umum diserang

Manusia Manusia,ternak Hewan

Semua organ Usus dan jaringan lunak Kelenjar limfe

Air,ternak Ikan,air

Tulang Kulit dan jaringan lunak Bronkopulmonal Paru

Primata Primata Tanah,air,ternak,burung Tak jelas Air Air,tanah Air

Kelenjar limfe Bronkopulmonal Paru Paru Bronkopulmonal

Tanah,air,ternak,burung

Paru,kel limfe,sistemik

Tidak jelas

Kulit dan jaringan lunak Paru Paru

Tanah,air Tanah,air Tanah,air,hewan darat dan laut Tanah,air,hewan darat dan laut Tanah,air,hewan darat dan laut Permukaaan lembab, flora urogenital Manusia

Kulit, jaringan lunak, sistemik Kulit, jaringan lunak, sistemik Kulit, jaringan lunak, sistemik Paru Kulit, jaringan lunak,sistemik


13

Dalam pedoman ini akan dijelaskan bagaimana melakukan biakan dan uji kepekaaan untuk Mycobacterium tuberculosis complex. Walaupun demikian masih terdapat pertanyaan-pertanyaan yang tidak dijelaskan dalam pedoman ini yaitu : 1) Bagaimana membedakan Mycobacterium tuberculosis dengan anggota Mycobacterium tuberculosis complex lainnya?

IV. SUMBER DAYA LABORATORIUM Laboratorium TB yang melakukan pemeriksaan biakan dan uji kepekaan harus memiliki sumber daya laboratorium yang memungkinkan proses kegiatan praktik laboratorium dapat berjalan lancar, berkualitas dan aman bagi pekerja serta lingkungan. Sumber Daya Manusia disusun berdasarkan kompetensi teknis/latar belakang pendidikan dan

2) Apakah galur isolat Mycobacterium tuberculosis satu sama lainnya sama?

beban kerja

3) NTM mana yang perlu-tidak perlu dilaporkan?

Penanggung Jawab

: 1 orang Dokter Spesialis Mikrobiologi Klinik/ Patologi Klinik

Tenaga Teknis : a. Mikroskopis

:

b. Media

:

c. Biakan

:

d. Petugas pencatatan dan : pelaporan e. Pekarya :

DIII Ahli Madya Analis Kesehatan terlatih Lab.TB Beban kerja : 20 Sediaan/hari/teknisi D III Ahli Madya Analis Kesehatan terlatih Lab.TB Jumlah tenaga disesuaikan dengan beban kerja biakan dan uji kepekaan. D III Ahli Madya Analis Kesehatan terlatih Lab.TB Beban kerja : 20 biakan/ hari/teknisi 1 orang, minimal SLTA Minimal SLTP, 1 (satu) orang Tugas : pencucian alat dan sterilisasi

A. Ruang laboratorium Ruang laboratorium harus menjamin keamanan petugas dan orang lain di sekitarnya dari spesimen dan isolat yang ditangani. Infeksi

oleh Mycobacterium tuberculosis

bersifat airborne melalui mikrodroplet, maka pengaturan aliran udara menjadi

sangat

penting. Udara harus mengalir dari area bersih ke area kotor/ tercemar. Udara yang dikeluarkan dari laboratorium ke lingkungan sebaiknya telah melalui filter bakteri dengan arah menjauhi tempat berkumpul orang banyak, pemukiman dan lalu lalang. Sirkulasi udara di laboratorium harus dilakukan melalui pertukaran udara minimal 6 (enam) sampai 12 (dua belas) kali per jam, dengan cara ini 99 % partikel akan dibuang

14



15

Gambaran aliran udara pada laboratorium di atas adalah sebagai berikut

Gambar 2. Contoh lay out laboratorium pemeriksaan Mycobacterium tuberculosis dengan fasilitas biomolekuler

Keterangan Denah : -

Ruang A : Pintu masuk ke laboratorium melalui ruang yang dapat dimanfaatkan untuk administrasi, penyimpanan laporan, buku register, alat tulis dll. Di ruang ini terdapat juga loket penerimaan dan penilaian spesimen secara makroskopik. Misalnya tentang data spesimen, volume, tanggal dan cara pengambilan, kondisi wadah dan sebagainya. Ruangan ini berfungsi sebagai ruang persiapan pekerja laboratorium, menggunakan Alat Pelindung Diri (APD).

-

Ruang B : Ruang ini adalah tempat melakukan pemeriksaan, terdapat fasilitas pengolahan dan inokulasi contoh uji/spesimen. Sebaiknya tempat cuci tangan di ruang ini menggunakan kran yang dapat dibuka dengan siku atau kaki atau sensor outlet. Pada bagian terkotor ditempatkan BSC dan sentrifus. Pada bagian lain di ruang ini disediakan meja kerja untuk pemeriksaan mikroskopis, pengamatan dan pencatatan hasil biakan.

-

Ruang C : Di ruang ini dilakukan sterilisasi, pencucian alat dan pembuangan limbah sementara. APD dilepaskan dan disterilisasi di ruang ini.

20



17

-

Ruang D

Untuk mengetahui hubungan antar ruang dengan menggunakan tabel III,adalah dengan

Ruang ini tempat menyiapkan dan membuat media,

menyimpan peralatan yang

sudah steril dan reagensia.

mencari titik temu antara kategori ruang Misalnya :

Dengan bagan tata ruang seperti diatas diharapkan kegiatan di laboratorium biakan

Ruang penerimaan spesimen (1) dan ruang miroskopis (2)

dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis dilaksanakan dengan mudah dan

langsung (HL)

menjamin keamanan kerja. Jika petugas laboratorium kidal, pengaturan dapat ditata seperti bayangan kaca. Catatan: Sejalan dengan kebutuhan akan kemanan kerja (biosafety), modifikasi

Tabel 3.

berhubungan secara

Ruang sterilisasi (4) dengan ruang tempat inkubator berhubungan dekat (DK) Ruang penerimaan spesimen(1) dan ruang biakan (3) harus terpisah (TP).

rancangan ruang laboratorium sebaiknya dilakukan dengan memperhatikan

Gambar dibawah merupakan contoh “ lay out “ laboratorium pemeriksaan Mycobacterium

kaidah-kaidah keamanan kerja. Prinsip dasarnya dapat dilihat pada tabel 3.

tuberculosis dengan fasilitas pemeriksaan biomolekuler dan menggunakan tata aliran

Kisi-kisi hubungan antar ruang di laboratorium dan laboratorium

udara yang diatur secara mekanik.

Mycobacterium tuberculosis Kategori ruang

(1)

Penerimaan spesimen (1)

(2)

(3)

HL

TP

Ruang mikroskopi (2)

HL

Ruang biakan (3)

TP HL

Ruang sterilisasi (4) Ruang media (5)

HL DK

TP HL

Ruang inkubator (8)*

DK

Penyimpanan gas (10)

DK

HL

DK

(6)

(7)

HL

(8)

(9)

HL

HL

DK DK

HL HL

(10)

HL

DK

HL

DK

DK

DK

HL

DK

DK

DK

HL DK

Gudang (9)

(5) TP

HL HL

Ruang mikroskop fluoresen (6) Ruang pendingin (7)

(4)

HL

HL

DK

DK

HL

DK

DK

DK

DK

Keterangan : DK : dekat HL : hubungan langsung TP : terpisah *) walk in incubator

18



19

Tabel 4. Peralatan laboratorium biakan dan uji kepekaan dengan media padat untuk beban kerja 6000 uji/tahun No

Alat

1

9 10

“mixed load pressure cooker type “ atau 1 gravity displacement type “ dengan pembuangan uap otomatik Timbangan Top loading. Untuk membuat media 1 Biological safety cabi- Kelas II dan sesuai standar 2 net Smart flame/incenera3 tor electric Sentrifus Biocontained type ( rotor miring, bertutup 1 rapat ) dengan daya endap minimal 3000 g. Lebih diutamakan yang “ refrigerated “ Homogenizer/mixer Untuk homogenisasi telur, dapat diotoklaf/ 1 dsiterilkan Inspisator/hot oven Pengatur suhu pada 80-85oC Kapasitas 1 double blower tergantung beban kerja, Mikroskop Binokuler, pembesaran total 1000 kali. 1 Dianjurkan menggunakan lensa anti jamur dan kondensor bukan plastik. Sediaan lampu cadangan Refrigerator Suhu 2-8oC 1 Vortex 3

11

Inkubator

2 3 4 5

6 7 8

Spesifikasi/penggunaan

Gambar berikut adalah contoh lay out laboratorium biakan dan uji kepekaan tanpa fasilitas biomolekuler dengan pengaturan aliran udara secara mekanik

Jumlah

Otoklaf

Rak dari alumunium atau stainless steel. 1 ( walk in Jika beban kerja tinggi maka digunakan “ incubator ) walk in incubator “ dengan kipas pengatur udara Dilengkapi dengan termometer dan 2 termostat 1

Ruang laboratorium TB harus memenuhi syarat sbb.: Lantai : Tidak mempunyai sambungan, dengan demikian tidak memakai bahan keramik. Sebaiknya memakai bahan epoksi yang tahan asam dan basa kuat. Pertemuan lantai dan dinding tidak bersudut. Dinding : Terbuat dari bahan yang mudah dibersihkan, permukaan rata, cat dinding berwarna terang, tidak mengkilat. Pertemuan antar dinding tidak bersudut agar mudah dibersihkan.

12

Penangas air

13

Freezer -20oC

14

Freezer -70 C

1

minimal 23.6 liter per detik.Udara yang dikeluarkan dari laboratorium ke lingkungan

15 16

Laminary airflow Untuk membuat media 1 Destilator/water purifier Destilator tidak menggunakan “metal type 1 “. Sumber air memenuhi persyaratan.

sebaiknya telah melalui filter bakteri dengan arah menjauhi tempat berkumpul orang

24

o


Exhauster : Ditempatkan di area kotor, berlawanan dengan air condition dan mempunyai kapasitas

banyak, pemukiman dan lalu lalang. Air Condition : Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan Media Padat

21

Daya disesuaikan dengan luasan ruang. Penempatan AC harus memperhatikan posisi

Shower dan eye wash

teknisi saat bekerja dan tidak mengganggu tirai udara BSC.

Alat ini harus ditempatkan di ruang kerja laboratorium TB, digunakan untuk melakukan

Pintu :

netralisasi bila terjadi kecelakaan kerja berupa percikan larutan asam atau basa kuat

Dilengkapi dengan alat yang dapat otomatis menutup pintu, dibuat dari bahan yang

dan bahan infeksius. Karena biasanya dalam laboratorium tidak digunakan asam atau

mudah dibersihkan dan memudahkan evakuasi dalam keadaan darurat.

basa kuat dalam jumlah banyak, shower tidak merupakan keharusan

Bila ruang laboratorium TB terletak dilantai atas, maka tangga harus aman untuk dilalui

Meja kerja

orang ( pegangan pada kedua sisi, tidak licin, ruang tangga terang dan dapat dilalui paling

Dibuat permanen dari beton, tinggi 75 cm dari lantai, permukaan rata, tidak mempunyai

sedikit oleh 2 orang secara berdampingan). Sebaiknya ruang laboratorium memiliki pintu

sambungan, sebaiknya dilapisi epoksi.

darurat atau ada bagian dinding yang dapat dipakai sebagai jalan keluar dalam keadaan darurat.

Kursi

Pasokan listrik

yang mudah dibersihkan dan tidak menyerap cairan (plastik/kulit), bersifat ergonomik

Rangka terbuat dari bahan logam yang tidak mudah berkarat dan dudukan dari bahan

Harus tersedia 24 jam, karena itu harus dilengkapi dengan generator listrik yang dapat berfungsi secara otomatis dengan daya yang mencukupi untuk alat-alat yang harus

Lemari penyimpan bahan media dan reagensia :

selalu operasional (deep freezer, incubator, refrigerator)

Dibuat dari logam yang tidak mudah berkarat dan kaca.

Pasokan Air

Catatan :

Harus tersedia dengan kualitas baik dan kuantitas yang cukup.

Bangunan dan peralatan laboratorium harus dirancang berdasarkan “ hazard risk

Bak cuci tangan

assesment “. Risiko lebih besar saat melakukan uji kepekaan dibandingkan melakukan

Diletakkan di dekat pintu, dilengkapi dengan kran yang dibuka/tutup dengan siku atau

biakan, risiko akan bertambah besar bila melakukan biakan dan uji kepekaan TB MDR,

kaki atau sensored outlet

pemeliharaan sarana tidak sesuai, dan beban kerja tinggi. Karena itu WHO menganjurkan

Bak cuci alat

biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis dilakukan dalam laboratorium

Bak ini harus cukup besar dan dalam untuk menampung alat-alat yang sedang dicuci

dengan standard keamanan BSL 3 dan dilakukan dengan baku praktek laboratorium

(panjang 1m, lebar 75cm, dalam 50 cm) ,dibuat dari bahan yang kuat agar tidak mudah

tingkat 3. Karena mahalnya biaya pembuatan dan pemeliharaan laboratorium BSL 3.

bocor (porselin, stainles), permukaan rata dan mudah dibersihkan.

Di Indonesia laboratorium yang mengisolasi TB khususnya TB MDR sebaiknya bukan laboratorium sederhana tetapi sesuai kategori BSL 2 plus dan dikerjakan dengan baku

Bak pewarnaan

praktek laboratorium BSL 3.

Bak ini khusus dipakai untuk proses pewarnaan sediaan BTA. Kedalaman bak sedemikian rupa sehingga mencegah percikan air keluar ( 30-50 cm)

B. Peralatan dan penjaminan kinerja alat, termasuk kalibrasi

Dibuat dari bahan yang tidak mudah bocor, kuat dan mudah dibersihkan dengan

Peralatan yang penting untuk laboratorium biakan yang menggunakan media padat

permukaaan yang rata tanpa sambungan dan tidak bersudut.

dengan beban kerja 6000 uji per tahun tertera dalam tabel 4.

22



23

Peruntukan

Nama Gliserol

Volume/batch 30 ml

Telur yang sudah homogen dan 1000 ml disaring Final pH 6.2 Uji kepekaan

a. Rifampicin b. Isoniazid

40 mg/L 0,2 mg/L

c. Ethambutol

2 mg/L

d. Streptomycin sulphate

4 mg/L

e. Dimetil formamide

(sesuai konsentrasi rifampicin)

f. Aquades Identifikasi • Larutan PNB

a. PNB b. Dimetil formamide

0,1 g 3 ml

• Uji Niacin dengan paper strip

a. Aquades

2 ml

b. 1 Paper strip/tabung Pengawet dahak Dekontaminasi Homogenisasi

10 mg CPC + 20 gr NaCl dalam ana, bila pekat 2 x volume 1000ml aquades dahak NaOH 4%(1N) Ana atau 2x volume dahak Aquadest atau Tween 80,0,1% (1 ml Tween 80 + 99 ml aquades)

Penyimpanan koloni Skim milk bubuk dalam PBS pada -700C

28

2 tetes/isolat 100 mg dalam 1 L


No

Alat


Jumlah

17 18 19

Dessicator Dry sterilizer Timbangan analitik (nefelometer) Magnetic stirrer Blender stainless steel

Untuk menyimpan bahan higroskopis Suhu mencapai 200oC. Tidak mutlak ada Kepekaan mencapai minimal 0,1 mg (4 desimal) Untuk mempermudah pelarutan Untuk homogenisasi telur, volume 1,8 L

2 1 1

20 21

2 1

Tabel 5. Alat pendukung (beban kerja 6000 uji/tahun) No

Alat

1 2 3

Kertas aluminium Yang kuat ( heavy duty ) Label/spidol Untuk identitas pot dahak Kertas indikator otoklaf

8 gulung 7000/ sc 12 gulung

4 5

Botol bertutup ulir 50, 100 ml Mangkok gerusan dan 30 x 50 cm mortir Wadah pipet (stainless Tempat sterilisasi pipet steel)

@ 10 4

7 8 9 11

Tabung sentrifus Kapas Rak botol biakan Rak tabung

@ 7000 2 kg 10 5

12 13 14

Wadah limbah Nampan limbah Corong

15 16 18 19 20

Kertas saring Desinfektan Labu erlenmeyer Sarung tangan Kaca pembesar

6


Tutup ulir bukan logam, 15 ml dan 50 ml Absorben Kapasitas 50 botol Kapasitas 48 tabung, polipropilen atau metal Tahan tusuk, tidak mudah bocor, bertutup polipropilen Gelas, 45-60 mm dan 90-125 mm garis tengahnya Diameter 15 mm, Whatman no 4, no1. Lisol 5% atau hipoklorit 5% 250 dan 500 ml Sekali pakai


Jumlah

5

2 3 @2 @ 4 kotak 40 l @2 400 1

25

No

Alat


Jumlah

No

Alat


Jumlah

21 22

Ose disposable Buku register

bahan plastik

7000 2-4

51

Glass beads

Diameter 1,5 – 3 mm

23

7000

52 53

Kain kasa Mikropipet

Penyaring telur

24

Formulir permintaan pemeriksaan Formulir laporan

Secukup nya 1 roll

25

Kertas lensa

Untuk membersihkan lensa mikroskop

26 27 28 29

Masker Botol Mc Cartney Gelas ukur Gelas objek

N95 14 atau 28 ml,bertutup minimal 3 ulir 25,100,250 dan 1000 ml

30

Baju lab

7000 Secukup nya 400 9000 @2 7000

Tabel 6. Bahan habis pakai untuk Biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis Peruntukan Nama Media Lowenstein a. Potasium dihidrogen fosfat Jensen b. Magnesium sulfat heptahidrat

Volume/batch 2,4 gram 0,24 gram

2 per orang per tahun 2 gulung

c. triMgdisitrat 14-hidrat

0,6 gram

d. L asparagin

3,6 gram

e. Potato meal

30 gram

f. Malachite green 2%

20 ml

g. Aquades

600 ml

h. Gliserol

12 ml

31

Kertas tissue

32 34 37 36 37

Pipet Pasteur Volume Pipet Rak untuk inspisasi Botol reagensia Pippet bulb

Disposable, 1 dan 2,5 cc 1ml , 5 ml, 10 ml Stainless steel kemiringan 30o Kapasitas 50-1000 ml

@7000 @5 10 @ 25 @5

38 39 40

Gunting Rak gelas objek Kotak sediaan

Stainless steel, 25 cm Plastik, kapasita 25 slide

4 4 20

41 42

Spatula Pot dahak

Natrium glutamate

0.5g

Glycerol

4ml

Distilled water

100ml

Homogenised whole eggs

200ml

2% Malachite green solution

4ml

Final pH

6.4

43 44

Botol reagen Rak pewarnaan

Stainless steel 4 Bening, diameter minimal 4 cm, bertutup 6000 ulir, volume 50 ml Gelas berwarna gelap 3 2

45 46 47 48 49 50

Keranjang Batang pengaduk Tabung reaksi Tutup tabung Termometer Stopwatch

Stainless steel, diameter sesuai otoklaf Gelas, panjang 20-30 cm Gelas, 16 x 152 mm Alumunium, Cap O o C (uji suhu inkubator, refrigerator) 0-60 menit

26


2 5 200 600 2 tiap alat 2

i. Telur yang sudah homogen dan 1000 ml disaring Modified Ogawa 3% Kalium dihydrogen phosphate 2g (untuk kultur) Magnesium citrate (KH2PO4) 0.1g

Acidified Ogawa 3% Mono Kalium dihidrogen fosfat (untuk kultur) (KH2PO4) Natrium glutamat

15 gram 5 gram

Malachite green 2%

30 ml

Aquades

500 ml


27

8. Petugas harus mencuci tangan dengan sabun dan air mengalir dan selanjutnya

V. KEAMANAN KERJA UNTUK BIAKAN DAN UJI KEPEKAAN

dengan alkohol 70% atau antiseptik untuk kulit lainnya, setiap masuk ke laboratorium, selesai menangani bahan tercemar, dan setelah

bekerja. Untuk mengeringkan

tangan dilarang memakai handuk, pakailah pengering sekali pakai. 9. Petugas harus menanggalkan baju laboratorium saat akan meninggalkan ruang laboratorium. 10. Pekerjaan yang beresiko menimbulkan aerosol seperti membuka wadah, mengocok, menggerus, waktu membuat sediaan apus, dan memipet bahan tercemar harus dilakukan dalam BSC dengan blower dinyalakan 11. Pemusingan dilakukan dengan alat biocontained centrifuge yang tidak memungkinkan aerosol keluar dari alat. Lakukan sentrifugasi dalam fixed angle rotor (sudut rotor tidak berubah pada saat dilakukan pemusingan). Dilarang menggunakan rem mesin sentrifus, biarkan berhenti sendiri. 12. Penggunaan semprit dan jarum harus dibatasi. Hanya semprit dengan jarum yang dapat ”dikunci”/ berulir yang boleh dipakai. Jarum dilarang dibengkokan, dilepas

A. Desain Laboratorium Kegiatan Laboratorium untuk biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis harus mengikuti standar keamanan yang ada. Menurut pedoman WHO, terdapat beberapa ketentuan pada kemanan tingkat 3, yakni: 1. Sebelum masuk ruang laboratorium, sebaiknya terdapat dua ruang pemisah, yaitu vestibulum (ruang bersih, tempat alat pelindung diri bersih dikenakan) dan anteroom (ruang bersih, tempat alat pelindung diri dilepaskan). 2. Pintu ruang antara dapat menutup otomatik dan interrlocking, sehingga hanya satu pintu yang terbuka pada suatu saat. 3. Permukaan dinding, lantai dan atap harus kedap air dan mudah dibersihkan. 4. Ruang laboratorium harus tahan desinfektan. Pipa udara harus tahan terhadap dekontaminasi dengan gas.

dari sempritnya ataupun ditutup ulang. Semprit dan jarum yang telah dipakai harus

5. Jendela selalu ditutup, terbuat dari kaca dan kedap udara.

diletakkan pada wadah tahan tusukan dan disterilisasi dengan otoklaf atau insinerator.

6. Didekat pintu keluar ruang laboratorium

Sebelum disterilkan, jarum dapat direndam dalam desinfektan selama 24 jam.

disediakan tempat cuci tangan yang

dilengkapi dengan pengaturan otomatis tanpa menggunakan tangan.

13. Sebelum memakai alat, selalu perhatikan dan ikuti petunjuk pemakaian alat tersebut.

Sistem ventilasi dibuat sedemikian rupa sehingga tidak mengalir ke dalam ruang

14. Jangan membuka langsung wadah yang baru saja dikocok atau disentrifugasi,

lain dalam gedung. Sebaiknya digunakan filter high efficiency particulate air

biarkan dahulu selama minimal 10 menit. C. Pedoman Khusus

(HEPA), sehingga udara setelah bersih dapat dialirkan kembali di dalam ruang laboratorium. Bila udara dari laboratorium (selain dari BSC) akan dialirkan kearah luar

Kesalahan petugas, teknik kerja yang tidak benar dan penggunaan alat yang salah akan menyebabkan kecelakaan kerja infeksi akibat kerja. Teknik-teknik kerja yang perlu diperhatikan untuk menghindari atau mengurangi masalah yang timbul akibat kerja pada pelaksanaan kultur dan DST-TB : 1. Alat pelindung diri / Personal Protective equipment (PPE) Baju laboratorium harus dipakai setiap saat bekerja di laboratorium. Baju laboratorium harus menutup seluruh permukaan depan mulai leher sampai

32


gedung harus tidak mengenai bagian lain dalam gedung dan terpisah

dari udara masuk. Ventilasi dan air-conditioning (AC) dapat dipasang dengan menjaga agar tekanan udara negatif tetap ada di laboratorium. Sistim pengaliran udara dalam laboratorium tidak boleh mengganggu tirai aliran udara BSC 7. Semua filter HEPA harus dipasang dengan memungkinkan bagi dekontaminasi menggunakan gas dan mudah di cek. 8. Biological Safety Cabinet (BSC) sebaiknya tidak ditempatkan di tempat untuk lalu lalang petugas laboratorium dan tidak menghadap ke pintu dan sistem ventilasi.


29

B. Pedoman Umum Keamanan Laboratorium Laboratorium harus memiliki peraturan dan pedoman keselamatan kerja yang komprehensif. Keselamatan kerja di laboratorium merupakan tanggung jawab semua anggota baik supervisor maupun pekerja laboratorium. Perlu dibentuk komite keselamatan kerja yang bertanggungjawab mengembangkan kebijakan institusional tentang keselamatan kerja, melakukan penilaian terhadap resiko kerja dan memastikan pedoman praktek kerja di laboratorium dilaksanakan oleh setiap pekerja laboratoium.

Prosedur kerja merupakan unsur terpenting dalam keamanan di laboratorium. Tim keamanan kerja harus dibentuk untuk mengelola keamanan kerja di laboratorium. Ketentuan di bawah ini harus diketahui dan dilaksanakan oleh setiap petugas: 1. Akses laboratorium : tanda pada gambar 1 diatas harus dipasang pada pintu masuk. Laboratoriun TB hanya boleh dimasuki oleh petugas yang telah terlatih dalam hal prosedur penanganan mikroorganisme patogen. Orang dan petugas yang tak terkait, tidak diperkenankan masuk ke dalam ruang laboratorium. Petugas kebersihan dan teknisi alat atau orang lain dengan alasan kuat hanya diperkenankan masuk setelah

Laboratorium biakan dan uji kepekaan harus ditandai sebagai lokasi yang infeksius

mendapat penjelasan, mematuhi penjelasan dari petugas laboratorium dan izin dari

dan harus terpasang lambing biohazard untuk membatasi akses ke laboratorium.

penanggung jawab laboratorium.

Tanda baku biohazard international yang ditempel pada Laboratorium yang menangani mikroorganisme beresiko klas 2 atau diatasnya, menyebutkan tingkat keamanan, penanggung jawab, alamat yang harus dihubungi bila terjadi kedaruratan.

2. Dilarang memakai perhiasan pada tangan selama bekerja. Gunakan sarung tangan jika menangani dahak dan bahan tercemar. 3. Pekerjaan harus mengikuti prosedur tetap (Protap/ SOP) yang ada dan dikerjakan hati-hati. 4. Semua permukaan tempat kerja harus didesinfeksi tiap selesai bekerja dan segera setelah terjadi tumpahan kecil . Desinfeksi permukaan kerja segera setelah pekerjaan selesai dengan handuk/kertas yang telah dibasahi oleh larutan 5 % senyawa fenol (lysol, kresol, karbol) atau 70% etanol atau larutan natrium hipoklorit 1 : 100 - 200 (natrium hipoklorit terdapat pada larutan pemutih pakaian. Untuk membuat larutan 1 : 100 - 200 yang benar, perhatikan konsentrasi natrium hipoklorit pada label pemutih tersebut).

Lantai laboratorium secara berkala (tiap hari segera setelah selesai

bekerja) harus dipel dengan desinfektan. 5. Semua limbah infeksius dan bahan lain yang tercemar harus di otoklaf atau insenerasi/ karbonisasi sebelum dibuang. Jika proses ini oleh suatu sebab menjadi tertunda maka bahan-bahan limbah tersebut harus dikemas dalam container yang kedap bocor. Semua limbah infeksius dibuang sesuai dengan Protap. Barang dan bahan (berpotensi) tercemar yang tidak dipakai lagi harus segera disterilisasi dengan Gambar 3. Tanda baku biohazard international

otoklaf, pemanasan kering atau insenerator/ carbonizer. Pencucian barang boleh dilakukan setelah dilakukan sterilisasi.

Seperti telah disebutkan diatas, penularan TB terjadi melalui inhalasi partikel infektif. Bahaya terjadinya partikel infektif terutama terjadi saat pengumpulan dahak, pencampuran larutan lain dan dahak/biakan, homogenisasi, penggunaan sengkelit, pemipetan serta sentrifugasi.

30

6. Dilarang memakai kosmetik di dalam laboratorium. Demikian juga dengan menyimpan makanan dan minuman dalam lemari es di laboratorium. 7. Ruang laboratorium harus selalu bersih, rapi dan bebas dari bahaya fisik (misalnya : sengatan listrik, tergelincir, dsb).



31

melewati lutut, tanpa kerah dan tidak menggunakan tali yang panjang sebagai

5. Penggunaan BSC kelas II Dianjurkan menggunakan BSC yang dasarnya tak berpori dan alasnya terbuat dari stainless steel Digunakan untuk melakukan tindakan pada bahan (tersangka) tercemar, seperti saat membuka wadah bahan, membuat sediaan mikroskopis, melakukan sentrifugasi (jika alatnya tidak bio-contained), melakukan pengocokan/ pengguncangan, melakukan inokulasi bahan pada media, dsb. Prosedur tetap pemakaian BSC harus tertulis dan tersedia di laboratorium serta mudah dibaca oleh tiap pekerja. Harap selalu diperhatikan bahwa BSC tidak dirancang untuk melindungi pekerja dari tumpahan yang luas, pecahan atau tehnik laboratorium yang buruk. BSC yang rusak jangan dipakai. Skema aliran udara pada BSC klas 2 menjamin agar udara dari ruangan (kotor) masuk ke arah bawah di dalam kabinet, sebagian akan dimasukkan kembali kedalam ruang kabinet setelah difiltrasi, sebagian yang lain dilepas keatas setelah melalui filter. Kabinet ini melindungi petugas dan spesimen dari kontaminasi.

pengikat. Panjang lengan harus mencapai pergelangan tangan dan pada bagian pergelangan tangannya, digunakan karet. Baju laboratorium harus ditanggalkan saat keluar laboratorium dan dimasukkan dalam kantong tertutup atau direndam dalam desinfektan sebelum disterilkan dan selanjutnya dicuci. Sarung tangan harus dipakai saat bekerja di laboratorium. Setelah selesai setiap tindakan, sarung tangan dilepas secara aseptik. Ganti sarung tangan jika terkontaminasi, sobek atau jika diperlukan. Gunakan 2 pasang sarung tangan jika perlu misalnya dalam penanganan tumpahan. Sarung tangan yg sudah dipakai tidak boleh dicuci dan digunakan lagi. Buang sarung tangan bersama limbah laboratorium lain. Selanjutnya cuci tangan sesuai protokol yang tepat. Dianjurkan pula memakai

masker. Masker harus mempunyai kemampuan

menyaring 95% partikel dengan ukuran 1-5 mikrometer. Ukuran masker disesuaikan dengan hasil “fit test“. Masker yang tidak “fit“ tidak ada gunanya. Tidak boleh mengenakan alas kaki terbuka di laboratorium Kacamata pelindung, pelindung muka atau alat pengaman lain hanya dipakai jika perlu untuk melindungi mata dan wajah dari percikan pada saat terjadi tumpahan. Semua alat pelindung diri tidak boleh dipakai di luar laboratorium . 2.

Penanganan dan Pengiriman Spesimen

Pengumpulan spesimen, pengiriman dan penanganan spesimen yang tidak benar merupakan risiko penularan infeksi. Wadah Spesimen Sebaiknya dari plastik dengan tutup ulir rapat dan tahan pecah atau bocor, ukuran sesuai anjuran agar contoh uji tidak tumpah. Diberi label dengan benar sebelum digunakan Pengiriman spesimen ke laboratorium lain Wadah spesimen yang tertutup rapat ditempatkan di wadah kedua untuk mengantisipasi Gambar 5. Skema aliran udara pada BSC klas 2

36


pecah atau bocor. Sebagai wadah kedua dapat digunakan kotak kardus, atau plastik


33

tahan pecah dan bocor yang besarnya tepat dengan wadah pertama sehingga dapat tetap tegak dan tidak bergoyang, dilengkapi dengan kertas yang dapat menyerap tumpahan yang berasal dari wadah spesimen. Ditutup rapat dan diseal. Wadah kedua harus dapat di-dekontaminasi. Selanjutnya wadah kedua dimasukan dalam wadah ketiga yang terbuat dari karton dengan tanda seperti dalam gambar. Antara wadah kedua dan wadah ketiga harus mempunyai jarak. Bila pengiriman menempuh waktu yang lama dan dikhawatirkan terjadi kekurangan daya hidup kuman maka tambahkan dry ice dalam wadah ketiga dan tempatkan kemasan sedemikian rupa sehingga proses penguapan tidak terganggu. Informasikan pemakaian dry ice pada kurir.

kontaminasi pada alat bantu pipet. Sumbat kapas (stopper) harus cukup padat dan kapas tidak keluar dari ujung pipet Sebaiknya dipakai pipet berskala agar pemipetan tak perlu sampai habis benar (ujung pipet biasanya lebih kecil dan ada kecenderungan penekanan kuat agar semua cairan keluar sehingga resiko terjadinya droplet lebih besar). Saat mengeluarkan cairan dari pipet, sentuhkan ujung pipet pada permukaan dalam wadah dan alirkan perlahan-lahan. Jangan meniupkan udara di atas bahan yang akan dipipet. Rendam pipet dalam wadah berisi desinfektan segera setelah selesai tindakan. Biarkan semalam (minimal 12 jam) sebelum disterilkan. Sediakan kapas dibasahi desinfektan di dekat tempat kerja agar jika terjadi tumpahan dapat segera didesinfeksi. Untuk bahan tercemar, dilarang mengganti fungsi pipet dengan semprit karena resiko aerosolisasi lebih besar. Jika memakai mikropipetor, gagang mikropipetor tidak boleh menyentuh atau menempel bagian dalam dan mulut dari wadah tercemar. Hanya “tip” yang boleh masuk ke dalam wadah tercemar Pemipetan bahan infeksius dilakukan dalam BSC 4. Penggunaan sengkelit/ ose/ loop Bahaya penggunaan sengkelit adalah aerosolisasi

Gambar 4. Skema wadah spesimen rujukan Penerimaan Spesimen Laboratorium rujukan harus memiliki ruang khusus penerimaan spesimen. Membuka kemasan spesimen Harus dilakukan di dalam BSC Spesimen dibuka diatas kertas yang dibasahi desinfektan Tersedia pula larutan disinfektan untuk menangani tumpahan 3. Penggunaan pipet Pada saat memipet selalu gunakan alat bantu pipet (pipet aid), dilarang menggunakan mulut. Semua pipet harus diberi sumbat kapas di ujungnya untuk mengurangi

34


Lingkaran sengkelit hendaknya penuh, lingkaran yang tidak penuh lebih berisiko menggores media/gelas dan menimbulkan percikan. Makin panjang gagang sengkelit, makin besar potensinya menimbulkan aerosol. Upayakan hanya bagian lingkarannya yang menyentuh bahan yang (berpotensi ) tercemar bahan infeksius. Dianjurkan menggunakan sengkelit sekali pakai sehingga mencegah terjadinya aerosol. Untuk mencegah terjadinya droplet, sengkelit yang telah dipakai, dimasukkan ke dalam botol berisi pasir-lysol, dibersihkan dengan jalan memutarnya di dalam pasir dan tidak langsung pada pembakar Bunsen. Dapat juga dicelupkan pada pasir-alkohol sebelum dibakar dengan pembakar bunsen. Lakukan desinfeksi setiap selesai melakukan tindakan. Inokulasi bahan atau pembuatan sediaan dengan sengkelit hendaknya dilakukan dalam BSC. Lakukan dengan hati-hati. Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan Media Padat

35

Komposisi “Kit tumpahan biologi” Laboratorium penelitian biomedis dan mikrobiologi harus menyediakan “kit tumpahan biologis”. Kit tumpahan adalah alat keamanan penting untuk kerja laboratorium dengan agen mikrobiologi yang termasuk dalam BSL 2 atau diatasnya. Alat dan bahan berikut harus ada dalam kit tumpahan: 1. Desinfektan (periksa tanggal kadaluwarsa setiap tahunnya) 2. Forsep, sapu dan serok autoclavable, atau alat mekanik lain untuk menangani benda tajam. 3. Kertas tissue atau bahan penyerap lainnya 4. Kantong Biohazard untuk membuang tumpahan yang terkontaminasi 5. Tempat sampah benda tajam yang kosong 6. Sarung tangan 7. Pelindung wajah (kacamata dan masker atau pelindung wajah) 8. Sepatu boots kedap air Pedoman Umum pada Insiden tumpahan

Pembukaan panel kaca kabinet saat bekerja sesuai dengan petunjuk pemakaian. Nyalakan exhaust fan sebelum bekerja sesuai dengan petunjuk pemakaian sampai dengan 5 menit setelah pekerjaan selesai. Gunakan lampu UV sesuai petunjuk. jangan menggunakan pembakar Bunsen dalam kabinet karena mempermudah kerusakan filter. Pakailah mikro-incenerator atau ose sekali pakai. Batasi jumlah bahan dan alat dalam kabinet sesedikit mungkin dan letakkan di belakang daerah kerja. Bahan dan pengendali alat yang digunakan harus terlihat melalui panel kaca. Bahan dan alat tidak boleh menghalangi aliran udara BSC Lakukan pekerjaan di bagian tengah. Pisahkan barang bersih dengan kegiatan yang dapat menghasilkan aerosol minimal 12 cm. Pisahkan peletakkan bahan dalam tiga urutan, bersih ( misalnya larutan pengencer steril), tempat pengerjaan, kotor (misalnya tempat pembuangan tip mikropipet). Jangan biarkan botol dan tabung berisi bahan infektif terbuka. Segera tutup kembali setelah dibuka. Letakkan wadah berisi desinfektan dalam BSC untuk menampung limbah

Hindari menghirup material yang terkandung di udara dan segera tinggalkan

kegiatan atau wadah limbah lain yang dapat diotoklaf.

ruangan. Beritahu yang lain untuk meninggalkan ruangan

Hindari berkali-kali memasukkan dan mengeluarkan tangan. Hindari seminimal

2.

Tutup pintu dan pasang tanda bahaya

mungkin gerakan tangan menyamping dan berputar.

3.

Lepas pakaian yang terkointaminasi, balik bagian yang terkontaminasi ke dalam

Dilarang lalu lalang di muka kabinet bila sedang tak bekerja.

dan masukkan ke kantong biohazard.

Setelah selesai bekerja, kabinet dikosongkan, didesinfeksi, dan UV dinyalakan

4.

Cuci semua bagian kulit yang terpapar dengan sabun dan air.

selama 2 jam atau sesuai dengan petunjuk produsen lampu.

5.

Informasikan pada supervisor dan tim keamanan kerja

Fan kabinet harus dihidupkan 5 menit sebelum bekerja dan setelah pekerjaan di

1.

kabinet selesai Pembersihan tumpahan 1. Biarkan aerosol hilang/ mengendap selama setidaknya 30 menit sebelum masuk kembali laboratorium. Persiapkan alat untuk pembersihan (spill kit) 2. Kenakan alat pelindung diri (baju lab, pelindung wajah, sarung tangan lapis ganda

40

Kalibrasi BSC dilakukan secara berkala minimal 1x per tahun. 6. Penggunaan lemari pendingin. Lakukan defrosting secara teratur.

dan sepatu boot). Buat demarkasi wilayah tumpahan dengan kertas tissue. Tutupi

Semua wadah harus diberi label yang jelas mencakup antara lain tanggal

daerah yang menuju pintu keluar lab. Tutup tumpahan dengan kertas tissue yang

pembuatan dan kadaluwarsa, nama bahan, nama penyimpan. Wadah berisi

mengandung disinfektan dan tuangkan desinfektan hati-hati ditempat tumpahan.

dahak harus tertutup rapat, berdiri tegak.

Gunakan desinfektan yang lebih tinggi konsentrasinya karena anak diencerkan oleh

Dilarang menyimpan makanan, minuman, kosmetika serta barang lain yang tak

tumpahan tersebut. Biarkan kontak selama 20 menit.

berkaitan dengan pekerjaan laboratorium.



37

Jangan menyimpan cairan yang mudah terbakar.

5. Insenerasi merupakan cara mengolah limbah sebelum atau setelah diotoklaf.

Jika ada percikan/tumpahan bahan tercemar, keluarkan barang yang pecah

Insenerasi idealnya dilakukan pada alat dengan dua ruang bakar, di mana

dengan memakai sarung tangan karet. Selanjutnya desinfeksi bagian dalam

pada ruang bakar pertama suhu mencapai 8000C dan pada ruang bakar kedua

lemari pendingin

mencapai 10000C. Waktu retensi gas dalam ruang bakar kedua minimal 0,5 detik.

Jangan mengisi wadah penuh jika akan dibekukan.

Insenerator yang hanya memiliki satu ruang bakar kurang efektif untuk menangani bahan infektif. Jika memakai carbonizer pakailah sesuai petunjuk pemakaian.

D. Penanganan Limbah. 1. Limbah infektif dan tidak infektif, baik padat maupun cair harus dikumpulkan pada tempat terpisah dalam wadah yang tidak bocor. Wadah untuk limbah tajam harus kuat terhadap tusukan. 2. Wadah spesimen dan tutupnya, kaca sediaan yang sudah tak terpakai dan limbah padat lain harus direndam dalam larutan lysol 5% atau desinfektan lain yang cocok untuk desinfeksi Mycobacterium tuberculosis selama minimal 12 jam. 3. Limbah cair bekas pewarnaan ditampung dalam wadah yang mengandung lysol sebelum dibuang ke saluran limbah. Limbah zat pewarna hanya dibuang ke saluran air kotor yang tak akan mencemari badan air/ sungai untuk konsumsi. Informasi lebih lanjut dapat ditanyakan kepada Badan Pengendalian Dampak Lingkungan (Bapedal) daerah masing-masing. 4. Untuk membersihkan tumpahan dahak , petugas harus memakai sarung tangan ganda dan sepatu kedap air, selanjutnya tutupi dahak dan wadah yang pecah tersebut dengan kain atau kertas. Tuang larutan lysol 5% atau desinfektan lain yang sesuai untuk Mycobacterium tuberculosis sampai

membasahi semua

kertas/kain dan biarkan selama 2 jam dalam keadaan basah. Lepas sarung tangan terluar dan kumpulkan bersama wadah yang pecah, kertas/kain yang dipakai tempatkan dalam wadah tertutup dan sterilkan. Pakai sarung tangan lapis kedua baru, selanjutnya pel lantai dengan desinfektan. Sepatu baru dilepas

6. Untuk sterilisasi dengan otoklaf dibutuhkan suhu 1210C dengan tekanan udara 1,5 sampai 2 atmosfer selama minimal 20 menit (perhitungan waktu dimulai saat suhu dan tekanan udara tersebut tercapai; jangan membuka otoklaf jika belum dingin benar dan jangan mengisi air berlebihan). Jika jumlah yang di otoklaf banyak, dianjurkan minimal 30 menit dan 45 menit untuk sterilisasi biakan. Pastikan bahwa ada ruang kosong diantara barang yang di otoklaf. Pada saat melakukan otoklaf, pastikan bahwa tidak ada wadah yang tertutup rapat. Wadah harus sedikit dilonggarkan agar uap air mudah masuk ke dalam wadah. Dianjurkan melakukan uji fungsi otoklaf secara berkala sebaiknya dengan memakai spora B.thermophilus sebagai indikator dan ditempatkan di bagian paling tengah dari bahan yang akan disterilkan. Jika menggunakan pemanasan kering, lakukan pada suhu 1800C selama minimal 2 jam. 7. Tersedia “spill kit” yang berisi semua peralatan untuk menanggulangi kecelakaan kerja berupa tumpahan bahan infeksius (terdiri atas : tissue, lap tebal, forcep, desinfektan, sapu kecil dengan skop sampah yang bisa didesinfeksi, google, respirator, sarung tangan, kantong plastik). Spill kit harus disimpan di tempat yang mudah terjangkau, disertai dengan tulisan “spill kit” dan prosedur penggunaannya. 8. Tersedia kotak PPPK yang berisi kapas, antiseptik, plester dll E. Penanganan Tumpahan Infeksius

setelah alasnya diinjakkan pada kain yang dibasahi desinfektan. Jika percikan terjadi dalam BSC, jangan matikan blower-nya. Biarkan tetap menyala agar filter HEPA dapat membantu mengurangi cemaran dan tindakan desinfeksi dilakukan seperti di atas. Untuk BSC yang tutup dasarnya berpori, lakukan desinfeksi untuk

Tumpahan limbah harus dibersihkan dengan cepat berdasarkan prosedur pembersihan tumpahan sesuai jenis limbahnya. Harus tersedia “Spill kit “atau kit penanggulangan tumpahan biologi.

tutup berpori dan setelah tutup diangkat, lakukan untuk permukaan dibawah tutup

38



39

Catatan : •

3. Ambillah jika ada benda tajam dengan forsep dan buang dalam wadah benda tajam.

Pada sampel dahak SPS atau SP, kerjakan pemeriksaan biakan dalam

Tutup desinfektan dan tumpahan dengan menggunakan kertas tissue atau kain lap.

tabung yang sama. Kumpulkan dahak menjadi satu atau ambil dahak

Karena kemungkinan ada benda tajam dibawah kertas tissue, gunakan sapu dan

dengan hasil BTA terbanyak

serok autoclavable untuk membersihkan tumpahan dan letakkan dalam wadah

•

Identifikasi dikerjakan pada koloni murni dan jumlah memadai (confluent)

benda tajam. Pecahan kecil gelas dapat diambil dengan menggunakan kapas atau

•

Untuk bahan yang steril, misalnya cairan liquorserebrospinal, bronkolaveolar

kertas tissue yang dipegang dengan forsep. Jika tidak ada benda tajam dalam

lavage tidak perlu dilakukan dekontaminasi dan homogenisasi, cukup

tumpahan, buang material dalam kantong autoclave. Tanggalkan sarung tangan

dilakukan konsentrasi dengan sentrifugasi minimum 3000 g selama 15

terluar, ganti dengan yang baru

menit •

Untuk bahan bilasan lambung biarkan sisa makanan mengendap, kemudian

desinfektan. Gerakan pembersihan dilakukan secara sirkuler dimulai dari bagian

dilakukan sentifugasi 3000g selama 15 menit terhadap supernatannya.

terluar menuju ke pusat tumpahan

Selanjutnya identifikasi Mycobacterium mengikuti langkah-langkah sebagai berikut : 1.

Pengamatan makroskopis a. Amati keberadaan satu atau lebih jenis koloni. Deskripsikan ukuran koloni dan sifat-sifat lain seperti: kasar, halus, cembung, menyebar, tepi bergerigi, transparan, keruh, dan sebagainya b. Amati pigmen pasca inkubasi (kuning, oranye, kuning muda, kuning-oranye). Jika tak berpigmen, sebut sebagai “buff”. c. Jika terdapat lebih dari satu jenis koloni, lakukan subkultur untuk tiap jenis koloni.

2.

5. Buang semua kertas tissue dan alat pelindung yang terkontaminasi dalam kantong biohazard atau kantong autoclave. 6. Cucilah tangan dan area kulit yang terpapar dengan sabun cair dan air mengalir. Pembersihan tumpahan di BSC. 1. Biarkan blower BSC menyala dan segera mulai membersihkan. 2. Bersihkan cabinet dari tumpahan, tutup daerah tumpahan dengan kertas tissue atau kertas tissue yang mengandung disinfektan, jaga supaya wajah tetap dibalik kaca. 3. Jika perlu, genangi permukaan meja juga drain pans dan catch basins dibawah meja

Pewarnaan BTA dengan Ziehl-Neelsen.

kerja berisi disinfektan. Pastikan katup pengering tertutup sebelum menggenangi

Yakinkan tak ada cemaran mikroba yang tahan asam selain Mycobacteria.

area permukaan meja.

Rhodococcus spp, Nocardia spp, Legionella micdadei, kista Cryptopsoridium spp dan Isospora spp juga tahan asam walau pada tingkat lebih rendah. Dengan cara ini tidak dapat dibedakan MTB dan MOTT. 3.

4. Bersihkan area sekitarnya (dimana mungkin tumpahan terpercik) dengan

4. Bersihkan dinding kabinet, permukaan meja dan bagian dalam kaca dengan desinfektan. 5. Jika permukaan meja dan drain pans dan catch basins dibawah permukaan meja

Kecepatan tumbuh.

telah digenangi dengan desinfektan tuanglah disinfektan pada permukaaan meja

Rapid grower akan tumbuh dalam 7 hari atau kurang, sedangkan slow grower akan

kerja. Letakkan wadah dibawah katup pengering dan keringkan disinfektan dibawah

tumbuh setelah itu. Namun hal tersebut tak selalu jelas batasnya. M. chelonae

meja kerja ke wadah tersebut.

subspesies chelonae atau M. thermoresistible pada suhu 35-37oC akan tampak

6. Bersihkan area dibawah permukaan kerja untuk membersihkan sisa disinfektan.

sebagai slow grower. M. chelonae subspesies chelonae menjadi rapid grower pada

7. Cucilah tangan dan kulit yang terpapar dengan sabun dan air.

suhu 25-30 oC dan M. thermoresistible pada suhu 45-52 oC. 4.

44

Pencahayaan. Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan Media Padat


41

Pembersihan tumpahan sentrifugasi 1. Selalu gunakan safety buckets yang tertutup atau rotor dengan cincin O yang tertutup. Periksa cincin-O dan ganti jika sudah digunakan, pecah atau hilang. Periksa tabung atau botol apakah terdapat tanda-tanda pecah dan kelainan bentuk sebelum digunakan. 2. Selalu gunakan sentrifuse biocontainment dengan safety bucket yang berfungsi baik. 3. Tunggu 5 menit sebelum membuka sentrifus yang mengandung material biologis yang berbahaya. Jika ditemukan tumpahan setelah sentrifus dibuka, tutup kembali secara

VI. ALUR KERJA BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN Mycobacterium tuberculosis Biakan Mycobacterium tuberculosis dilakukan untuk konfirmasi diagnosis, pemantauan terapi dan penentuan kesembuhan. Pedoman ini memberikan petunjuk untuk melakukan biakan, identifikasi dan uji kepekaan menggunakan media padat berbahan telur. Adapun langkah-langkah untuk melakukan biakan dapat dilihat pada alur di bawah ini. Gambar 6. Alur Biakan dan Identifikasi Mycobacterium tuberculosis

hati-hati dan kosongkan laboratorium dan tutup pintu laboratorium. Petugas tetap diluar laboratorium setidaknya selama 30 menit. Pasang tanda di pintu laboratorium menunjukkan bahwa ada tumpahan biohazard dan dilarang masuk. 4. Lepaskan semua alat pelindung diri yang terkontaminasi dan masukkan dalam kantong biohazard. Cuci tangan dan kulit yang terpapar dengan sabun dan air. 5. Masuklah ke laboratorium setelah 30 menit dengan APD dan spill kit. 6. Pindahkan rotor dan bucket ke dalam BSC. Rendam rotor dan bucket dalam alkohol 70% atau disinfektan non korosif yang efektif membunuh Mycobacterium tuberculosis. Biarkan setidaknya 30 menit untuk kontak. Tabung yang utuh dapat dibersihkan dan diletakkan dalam wadah yang baru. Ambil pecahan gelas dengan forsep dan buang dalam wadah benda tajam berisi desinfektan. 7. Pecahan gelas yang lebih kecil dapat diambil dengan kapas atau kertas tissue yang dipegang dengan forsep. Bersihkan dengan hati-hati bagian dalam centrifus dengan disinfektan dan biarkan mengering. Jika digunakan pemutih, lanjutkan dengan alkohol 70% untuk mencegah korosif. 8. Simpan bahan terkontaminasi dan APD yang sekali pakai dalam kantong autoclave dan lakukan autoclave. 9. Cuci tangan dengan sabun dan air bersih mengalir.

42



43

Apabila terdapat indikasi untuk melakukan uji kepekaan maka uji kepekaan dapat dilakukan bersamaan atau setelah uji identifikasi. Gambar 8. Alur Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis

Mycobacteria yang termasuk photokromogen akan menghasilkan pigmen jika dipaparkan cahaya. Namun pigmen hanya optimal jika koloni kuman terpisah. Jika pertumbuhannya sangat padat, pigmen tak akan muncul. 5.

Identifikasi Mycobacteria yang lebih rinci dilakukan dengan berbagai cara : a. Uji biokimia Misalnya uji niasin, uji reduksi nitrat, uji katalase, uji katalase tahan panas, uji hidrolisa tween, uji urease, uji arilsulfatase, uji iron uptake, uji penggunaan sitrate, uji penggunaan inositol, uji penggunaan manitol, uji pirazinamidase dan uji reduksi telurit. b. Uji toleransi pada 5% NaCl atau hambatan oleh thiophene 2 carboxylic acid hydrazide (TCH) c. Uji pertumbuhan pada media McConkey tanpa kristal violet d. Uji molekuler e. Kromatografi cair atau tekanan tinggi.

Perbedaan diantara Mycobacterium tuberculosis complex dapat dilihat pada tabel dibawah Tabel 7. Diferensiasi diantara Mycobacterium tuberculosis complex

Urease

Hidrolisa tween 10 hari

Kepekaan pada TCH

Species

Niasin

Nitrat

Katalasa tahan panas

M. tuberculosis

Pos

Pos

Neg/pos

Pos

Pos/Neg

Neg/Pos

Resisten

M. bovis

Neg

Neg

Neg

Neg

Pos/Neg

Neg/Pos

Peka

Pyrazinamidase

Pos/ Neg Neg Pos Pos Neg Variabel Neg Neg/ Pos/ Pos Pos/Neg Neg/Pos Variable Neg M. microti Pos Neg Untuk keperluan praktis, diferensiasi spesies Mycobacterium tuberculosis complex tidak harus dilakukan M. africanum

48



45

Sebagian besar Mycobacterium tuberculosis complex dapat dibedakan dengan Mycobacterium lain menggunakan uji Niasin dan PNB, sehingga untuk melakukan identifikasi Mycobacterium tuberculosis minimum menggunakan 2 uji tersebut.

Gambar 7. Alur Kerja Identifikasi Rutin

*Subkultur hanya dilakukan apabila • jumlah koloni tidak memadai (<1+) atau • bila ditemukan beberapa koloni dengan bentuk yang berbeda

46



47

d. Periksa kekentalan, warna dan volume dahak. dahak yang baik untuk pemeriksaan adalah berwarna kuning kehijau–hijuan (mukopurulen), kental, dengan volume 3 – 5 ml.

e. Jika dahak tidak dapat diinokulasikan dalam 3 (tiga) hari, tambahkan bahan pengawet CPC 1% dalam NaCl 2%, sama banyak dengan dahak ke dalam pot. Tutup pot dengan rapat. Dahak harus disimpan pada suhu ruang dan diproses untuk biakan dalam waktu kurang dari seminggu. Untuk dahak yang dapat diperiksa dalam 3 x 24 jam, tidak perlu memakai CPC, cukup disimpan dalam keadaan dingin dengan suhu 6-100C. • • • • •

Catatan : •

Hasil yang dilaporkan adalah hasil pembacaan hari yang ke-28 apabila isolat menunjukkan resisten pada semua OAT. Hasil yang sensitif untuk laporan harus menunggu pembacaan hari ke-42.

Hasil uji kepekaan yang benar sangat bermanfaat sebagai panduan pengobatan penderita. Telah dibuktikan bahwa jika proporsi isolat

Mycobacterium tuberculosis

resisten lebih dari 1% terhadap satu obat, maka pemakaian obat tersebut untuk tujuan pengobatan tidak akan tercapai.

Bubuk CPC adalah senyawa higroskopis, bubuk yang telah menjadi basah harus dianggap kadaluwarsa, CPC merupakan desinfektan turunan amonium quartener, Dahak yang dicampur CPC akan menjadi encer setelah paparan 24 jam, CPC residu yang tidak dinetralisasi akan menghambat pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis terutama pada media berbahan dasar agar. Sedapat mungkin, hindari pemakaian CPC. Mycobacterium tuberculosis akan mati jika terlampau lama terpapar pada CPC atau jika konsentrasi CPC lebih dari 1%

f. Dahak SPS diperiksa secara mikroskopis dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen g. Bila yang terkumpul diduga bukan dahak (hanya air liur/ ludah) atau dahak volumenya kurang, petugas harus meminta agar penderita batuk lagi sampai volumenya mencukupi. Catatan: 1) Setelah mengolah spesimen petugas harus cuci tangan dengan sabun dan air mengalir 2) Jika tidak ada dahak yang keluar, pot dahak dianggap sudah terpakai. Masukkan dalam kantong plastik dan harus dimusnahkan untuk menghindari kemungkinan terjadinya kontaminasi oleh kuman TB

Terdapat dua pendekatan untuk melakukan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT, yaitu: uji fenotifik dan uji genotipik (molekuler). Uji fenotifik merupakan pengujian atas fakta biologis dari kuman Mycobacterium tuberculosis, sedangkan uji genotipik merupakan pengujian atas keberadaan gen-gen Mycobacterium tuberculosis yang telah mutasi pada tempat tertentu. Saat ini telah ditemukan berbagai cara untuk melakukan uji kepekaan, setiap cara mempunyai kekurangan dan kelebihan. Dari berbagai cara yang tersedia, tujuh cara yang paling sering digunakan adalah : 1. Cara proporsi, 2. Cara konsentrasi absolut, 3. Cara rasio resisten, 4. Cara media cair, 5. Cara deteksi perubahan metabolik, 6. Cara mycobacteriophaga dan 7. Cara molekuler. Dari semua cara tersebut, cara proporsi, konsentrasi absolut dan rasio resisten merupakan cara yang paling banyak dipakai. Ketiga cara tersebut menggunakan media

Tata cara merujuk spesimen : 1) Sebelum dikirim, hubungi dahulu laboratorium rujukan 2) Pengemasan dan pengiriman bahan rujukan dilakukan sesuai standar. Apabila tidak tersedia bahan kemasan sesuai standar, maka lakukan:

52


padat yaitu dengan membandingkan pertumbuhan isolat Mycobacterium tuberculosis dengan kuman kontrolnya. Hal yang paling kritis untuk ketiga cara tersebut adalah jumlah dan viabilitas kuman dan homogenitas inokulum.


49

Cara proporsi

unggul dalam hal pengendalian besaran inokulum, dengan catatan

proses homogenisasi inokulum

yang diambil dari koloni yang kering harus lebih

lama atau melakukan subkultur lebih dahulu. Cara proporsi kurang mengantisipasi potensi kesalahan konsentrasi obat. Untuk OAT lini pertama, ketiga cara diatas telah terstandarisasi dengan baik. Tingkat ketepatannya sangat tinggi untuk rifampisin dan isoniazid diikuti oleh etambutol dan streptomisin. Saat ini berbagai penelitian terus berlangsung untuk mendapatkan cara biakan dan uji resistensi Mycobacteria yang hasilnya cepat. Media yang dipakai merupakan media cair, sebagian diantaranya menggunakan faktor yang mempercepat pertumbuhan kuman. Pertumbuhan pada media cair lebih cepat dibandingkan media padat, namun kemungkinan adanya cemaran harus dibuktikan dengan pewarnaan dan biakan lanjutan

VII. PRAKTEK LABORATORIUM Praktek laboratorium akan dititikberatkan pada biakan dan identifikasi Mycobacterium tuberculosis complex dari spesimen dahak dengan menggunakan media padat berbahan telur. Dipilih sasaran Mycobacterium tuberculosis complex karena spesies terbanyak dari Mycobacterium tuberculosis complex pada dahak adalah Mycobacterium tuberculosis dan identifikasi sampai tingkat spesies tidak mudah. Dipilih spesimen dahak karena merupakan spesimen terbanyak dan menjadi titik berat program pengendalian TB di Indonesia dan menggunakan media padat berbahan telur, karena media ini yang paling banyak digunakan di Indonesia serta relatif murah. A. Pengambilan, Pengiriman dan Penerimaan Spesimen Spesimen dahak

dengan agar darah. 1. Alat dan bahan yang diperlukan

a. b. c. d. e. f.

Pot dahak steril bertutup ulir dan mulut lebar (diameter 4-5 cm) Formulir permintaan pemeriksaan Kantong plastik dengan pengaman (Clipped) Stiker atau penanda tahan luntur Pipet dengan bulb Bahan pengawet Cetyl Piridinium Chloride (CPC) 1% digunakan apabila kultur dikerjakan setelah 72 jam tanpa adanya fasilitas pendingin

2. Cara pengumpulan dahak :

a. Persiapkan pot dahak dengan nomor identitas pada stiker atau pada dinding pot sebelah luar. Nomor identitas sesuai dengan pedoman nasional. b. Pada waktu pasien datang, lakukan pengambilan dahak sewaktu. Pasien dibekali dengan 2 pot dahak dan instruksikan untuk mengumpulkan dahak pagi hari, dahak ke 3 (SPS) dikumpulkan pada saat pasien datang keesokan harinya. c. Instruksikan pasien mengeluarkan dahak serta menampungnya dalam pot dahak di ruang terbuka yang jauh dari pemukiman atau dalam ruang khusus pengumpulan dahak. Dahak terbaik untuk biakan adalah dahak yang dikeluarkan pertama kali saat bangun pertama di pagi hari.

50



51

dalam inspisator yang telah dipanaskan sampai suhu 850C selama

a)

c)

Masukkan pot dahak dalam kantong plastik, kemudian “sealed”. Tiap pot dahak memerlukan satu kantong plastik Letakkan/masukkan pot dahak yang sudah berada dalam kantong plastik pada kotak / box (styrofoam, plastik atau bahan lain yang tidak mudah pecah) dengan posisi tegak, menghadap ke atas. Masukkan formulir kedalam kantong plastik, sealed masukkan kedalam kotak/ box tadi, dan selanjutnya dikirim ke laboratorium rujukan. Kotak/box harus ditutup rapat dan diberi seal serta cantumkan nama

d)

dan alamat laboratorium rujukan dan laboratorium tanda peringatan agar jangan dibalik. Rujukan spesimen dahak

45 menit (lakukan optimasi inspisator) Keluarkan dari inspisator, b)

tutup botol dikencangkan dan diamkan sampai suhu kamar c)

Bila kualitas media tidak baik : terlalu lembek, terjadi perubahan warna, berlubang-lubang, atau terdapat gelembung-gelembung pada permukaan, maka media tersebut tidak dapat dipakai.

Catatan :

1. 2. 3.

Media LJ dapat memakai potato meal atau tidak Jika membuat dari media komersial, ikuti petunjuk dari pabrik Untuk membuat larutan malachite green tersendiri. Lakukan sebagai berikut : a. Timbang 2 gram Malachite green kristal dalam gelas kimia.

-

Bila dirujuk ke lab rujukan biakan/uji kepekaan yang dapat ditempuh dalam 48 jam, kemasan dahak dikirim dalam suhu kamar.

-

Bila dirujuk ke lab rujukan biakan/ uji kepekaan yang berjarak tempuh 72 jam, kemasan dahak dikirim dalam suhu 4-80C dengan cara memasukkan pot dahak kedalam kemasan yang berisi ice pack.

-

Bila dirujuk ke lab rujukan biakan/ uji kepekaan yang memakai mesin MGIT, dahak tidak boleh diawetkan dengan CPC 10% karena akan mengganggu pembacaan oleh mesin.

-

Apabila memungkinkan, laboratorium dapat menjamin kualitas contoh uji dengan menjaga suhu pada 4-8 0C segera setelah contoh uji diterima oleh laboratorium.

a. Tuang ke dalam mortir, gerus sampai halus, masukkan kembali ke dalam gelas kimia dan tambah aquadest 100 ml.

b. Masukkan magnetic stirrer, tempatkan di atas stirring hot plate , inkubator selama 2 jam atau suhu kamar semalaman agar larut sempurna

c. Saring dengan kertas saring Whatmann no 4. d. Simpan dalam botol coklat, catat tanggal pembuatan pada label. e. Larutan tahan 1 bulan pada suhu kamar, tetapi sebaiknya digunakan dalam waktu 1 minggu c. Kultur Mycobacterium tuberculosis dapat pula dilakukan pada media Ogawa 3% yang telah dimodifikasi ( inokulasi pada media ini tak perlu netralisasi dengan HCl atau PBS, cukup homogenisasi dengan NaOH 4%)

1)

Bahan Modified a. b. c. d. e. f.

56

KH2PO4 Magnesium sitrat Na Glutamat Glyserol 2% Malachite green Aquadest steril

10.0 gr 0.5 gr 2.5 gr 20 ml 20 ml


Acidified 15 gr Tidak ada 5 gr 30 ml 30 ml 500 ml

pengirim. Beri

3. Cara penerimaan spesimen rujukan :

a. b. c. d.

Spesimen diterima di bagian penerimaan di laboratorium Periksa kesesuaian identitas pada kemasan dan formulir permintaan Catat data dalam buku register Bila ada ketidak sesuaian identitas dan kualitas, segera hubungi pengirim untuk klarifikasi. Jika perlu mintakan lagi dahak pagi hari e. Kemasan dibuka dalam BSC f. Gunakan sarung tangan saat menerima dan membuka kemasan contoh uji g. Periksa apakah ada kebocoran pada kemasan contoh uji, jika terlihat ada kebocoran kemasan harus langsung dibuang ke tempat sampah yang sudah Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan Media Padat

53

diberi desinfektan dan selanjutnya di otoklaf. h. Bila pot dahak ada yang pecah, lakukan desinfeksi pot dahak yang lain dengan kapas yang sudah dibasahi desinfektan.

2) Bilas dengan air mengalir hingga bersih, kemudian keringkan 3) Rendam dalam alkohol 70% selama 15 menit 4) Cuci dan desinfeksi tangan sebelum memegang telur yang telah bersih dan kering

B. Pembuatan Media Lowenstein-Jensen

5) Pecahkan telur dan tampung dalam gelas ukur steril 1. Alat dan bahan yang diperlukan untuk membuat media : Alat : a. Timbangan analitik b. Spatula / sendok c. Gelas ukur 1000 ml steril d. Gelas beaker 1000 ml steril e. Pipet 10 ml, 25 ml steril f. Labu Erlenmeyer 250 ml, 1000 ml steril g. Botol McCartney h. Bunsen i. Power pipet/pipetor Bahan :

6) Homogenisasi dengan blender, atur kecepatan sedemikian rupa agar tidak terbentuk gelembung. 7) Saring larutan telur menggunakan corong steril yang telah dialasi kasa

j. pH meter k. Otoklaf l. Inspisator/ Hot Air Oven m. Blender stainless steel n. Magnetic stirrer & magnetic bar steril o. Corong steril p. Kain kasa steril q. Lap pembersih telur

a. Bahan dasar Medium LJ dengan komposisi : 1) Potassium dihydrogen phosphate 2) Magnesium sulfate heptahydrate 3) Tri-magnesium dicitrate 14-hydrate 4) L-asparagin 5) Potato meal 6) Malachite green2 % b. Aquadest c. Glyserol d. Telur homogen sampai dengan

steril. 8) Ukur dengan gelas ukur steril sampai didapatkan 1 liter. 9) Catatan : a)

Tidak diperkenankan menggunakan telur dari peternakan yang menggunakan antibiotika dalam pakannya. Karena umumnya peternakan bebek dilakukan secara tradisional, telur bebek lebih kecil kemungkinannya mengandung antibiotika.

b)

Homogenisasi telur agar dilakukan dalam laminar flow/ BSC, untuk meminimalisasi pencemaran oleh mikroba udara.

b. : : : : : : : : :

2,5 gr 0.24 gr 0.6 gr 3.6 gr 30 gr 20 ml 600 ml 12 ml 1000 ml

Pembuatan media LJ : 1) Larutkan garam-garam, L-Asparagine ( dan potato meal ) media LJ dalam 600 ml aquades, pH 6.8-7.0 2) Tambahkan 12 ml glycerol 3) Tambahkan 20 ml larutan malachite green 2% 4) Setelah tercampur sempurna, sterilkan dalam otoklaf selama 15 menit pada suhu 1210C 5) Dinginkan sampai suhu + 500C 6) Tambahkan telur homogen 1 liter yang telah dipersiapkan secara steril, aduk perlahan-lahan, hindari terbentuknya gelembung. Jika ada

Cara pembuatan Media LJ : a.

Homogenisasi telur : 1) Bersihkan telur ayam/bebek segar yang berumur tidak lebih 7 hari dengan cara menggosoknya dengan lap, air dan sabun

54


gelembung, diamkan beberapa waktu lamanya untuk menghilangkan gelembung. a)

Tuangkan ke dalam botol McCartney steril sebanyak 6 – 8 ml.

b)

Tutup botol dengan longgar dan letakkan pada kemiringan 300 Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan Media Padat

55

media. Hal ini dianjurkan jika pengolahan dahak dilakukan pada

g.

Telur bebek (homogenisasi dengan blender dan disaring melalui kain kasa) pH akhir

tabung 15 ml. d. Pengolahan dengan dengan N-Acetyl –L-cystein-NaOH( NALC-NaOH)

h.

1000 ml

6,4

6,2

1) Tuang contoh uji ke dalam tabung sentrifus 50 ml

2) Cara kerja a) Pembuatan larutan garam

2) Ditambah NALC – NaOH sama banyak 3) Kocok sampai homogen, tidak lebih dari 30 detik dan diamkan selama 15 menit pada suhu kamar.

(1) Masukkan KH2PO4 dan Na Glutamat ke dalam labu

4) Tambah PBS sampai volume 45 ml. Bolak-balik tabung beberapa kali

erlenmeyer, larutkan dengan aquadest.

5) Timbang agar posisi pada waktu sentrifus seimbang.

(2) Homogenkan di atas hot plate dengan magnetic stirrer

6) Centrifuge selama 20 menit, 4 C, 3000 g o

sampai larut sempurna.

7) Buang supernatant kemudian ditambah 1 ml PBS

(3) Otoklaf 121oC selama 15 menit, biarkan dingin

8) Inokulasi pada 2 media LJ sebanyak 100 μl (4 tetes pipet plastik vol 1 ml)

(4) Ke dalam erlenmeyer yang telah berisi beberapa glass beads

9) Inkubasi pada suhu 37oC.

(diameter 3mm) masukkan glyserol dan malachite green kemudian lakukan homogenisasi.

Catatan :

(5) Campurkan larutan (1) ke dalam larutan (4)

Pembuatan larutan Natrium sitrat i.

Timbang 29 g Natrium sitrat dihidrat atau 26 g Na-sitrat anhidrat,

b) Pembuatan media

larutkan dalam 1000 ml aquades

(1) Campur 1000 ml telur yang telah dihomogenisasi dengan

ii.

Buat larutan NaOH 4% seperti di atas

iii.

Campur sama banyak larutan Natrium sitrat dan NaOH.

larutan garam dengan magnetic stirrer, diamkan selama 30

iv.

Otoklaf 121oC selama 15 menit. Dinginkan di suhu ruang

menit.

v.

Simpan di lemari es

(2) Tuang ke dalam botol Mac Cartney kira - kira 6-8 ml, letakkan botol dalam rak dengan kemiringan 30o.

Larutan NALC-NaOH dibuat sbb :

(3) Masukkan dalam inspisator 80-85oC selama 45 menit.

Larutan ini harus selalu dibuat baru setiap kali akan melakukan

(4) Dinginkan pada suhu kamar.

pemeriksaan (tidak bisa disimpan > 24 jam ). Pembuatan sesuai kebutuhan, dan sesuai dengan tabel :

C. Biakan Mycobacterium tuberculosis

Tabel 9. Pembuatan larutan sesuai dengan kebutuhan: N-Acetyl cystein Stok A ( ml ) Stok B ( ml ) ml ( gr ) NaOH 4% Na Citrat 2,9%

60

Alat dan bahan yang diperlukan: 1. Untuk pengolahan bahan pemeriksaan a. Tabung sentrifus 50 ml

5

0,025

2,5

2,5

50

0,25

25

25

b. Rak tabung

100

0,5

50

50

c.


Biocontained-centrifuge pada gaya gravitasi 3000 g (bukan 3000 rpm)


57

2. Untuk inokulasi a.

Media LJ

b.

Pipet pasteur steril atau mikropipet 100 ul

c.

Tip mikropipet

Catatan : •

timbang bahan 10 kali lipat. Larutan kerja dibuat dengan jalan menambahkan 1 bagian volume PBS 10 x dengan 9 bagian volume aquades,pH 7.0

3. Inkubator

•

4. BSC Class II c.

1. Dahak tanpa CPC diolah sebagai berikut :

Pengolahan dengan NaOH 4% 1) Tuangkan dahak ke dalam tabung sentrifus 50 ml. Jika lebih dari 10 ml, pilih 10 ml bagian yang purulen.

Pembuatan larutan NaOH 4% (1 N) 1) Timbang 4 g pelet NaOH kering (jangan biarkan botol NaOH terbuka karena NaOH sangat higroskopis). Gunakan APD (kaca mata, lab jas, sarung tangan) saat menimbang NaOH karena NaOH bersifat kaustik kuat.

2)

menjadi panas.

Tambahkan NaOH 4% sama banyak

3) Campur dengan vortex mixer sampai homogen. Diamkan dalam suhu ruang tidak lebih dari 15 menit (jika lebih lama, kuman akan mati 4) Tambahkan larutan PBS sampai volumen > 45 ml dengan menggunakan pipet. (Jika menuang PBS dari botol, gunakan botol dengan volumen 100

2) Masukkan ke dalam beaker yang berisi 100 ml akuades. Beaker akan

ml, buang sisa PBS.) 5) Tutup tabung dengan rapat, sentrifus minimal 3000 g selama 15-20 menit

3) Biarkan menjadi dingin

6) Tuangkan supernatan ke dalam wadah berisi desinfektan. Usap bibir

4) Pindahkan ke dalam botol dan masukkan ke dalam otoklaf 121oC selama 15 menit. Volume NaOH tiap botol upayakan tidak lebih dari 100 ml 5) Simpan di suhu ruang b.

tabung dengan 95% etanol (jangan sampai masuk ke dalam tabung ). 7)

Tambahkan 1 ml PBS ke dalam sedimen, kocok agar homogen.

8)

Olahan contoh uji siap diinokulasikan. Jangan lupa membuat sediaan untuk diwarnai dengan ZN pada sisa inokulum

Pembuatan 0.067 M PBS pH 6.8 1) Timbang Na2HPO4 anhidrat 9.47 g, larutkan dalam 1000 ml aquades atau timbang Na2HPO4 12H2O 23.68 gr dan dilarutkan dengan 1000 ml aquadest

Catatan : •

2) Timbang 9.07 g KH2PO4, larutkan dalam 1000 ml aquades, campur, Atur pH dengan menambahkan

Jika dalam evaluasi ternyata 4% NaOH terlampau kuat, ganti dengan NaOH 2%. Selalu gunakan larutan steril untuk mencegah

masukkan dalam botol bertutup ulir. 3)

HCl adalah asam kuat. Jika terjadi tumpahan, segera siram dengan air sebanyak mungkin

Cara pengolahan dahak a.

PBS dapat dibuat dalam bentuk konsentrat 10x. Untuk itu

cemaran Mycobacteria lingkungan. NaOH adalah senyawa sedikit asam atau basa agar

higroskopis. Bubuk yang sudah lembab sebaiknya tak dipakai.

mencapai pH 6.8

Apabila menggunakan NaOH 4% dan angka cemaran mencapai >5% ganti menjadi NaOH 6%

4) Otoklaf 121 oC selama 15 menit, dinginkan di suhu ruang, simpan di lemari es

•

Jika menggunakan medium Ogawa 3% untuk inokulasi, setelah dihomogenisasi dengan NaOH 4% dan didiamkan selama 15 menit, contoh uji yang sudah diolah langsung ditanam pada

58



59

Mycobacterium tuberculosis mempunyai sifat :

200

1,0

100

100

Tidak terjadi perubahan warna koloni setelah terpapar cahaya

300

1,5

150

150

Uji akumulasi niasin positif

500

2,5

250

150

Uji reduksi nitrat positif

1000

5

500

500

Uji katalase tahan panas 68°C negatif Uji PNB negatif F. Identifikasi Mycobacterium tuberculosis

2. Dahak dengan CPC diolah sebagai berikut : a.

Tuangkan dahak yang sudah bercampur CPC ke dalam tabung sentrifus.

b.

Campur sampai homogen dengan menggunakan vortex, tunggu 10 menit agar tidak terjadi aerosol. Dahak yang telah seluruhnya mencair dan homogen, tak

Identifikasi Mycobacterium tuberculosis harus dikerjakan pada isolat subkultur yang

perlu di vortex

berumur 2-3 minggu. Bila koloni terkontaminasi, lakukan dekontaminasi dan subkultur

c.

Tambahkan PBS steril sampai tanda batas tertinggi pada tabung sentrifus.

ulang atau subkultur saja jika koloni terduga Mycobacterium tuberculosis terpisah dari

d.

Sentrifus pada 3000 g selama 15 menit, tunggu/diamkan sampai 15 menit

e.

Buang supernatan.

f.

Campur endapan dengan menggunakan vortex, tunggu 10 menit agar tidak

koloni cemaran. Tidak satupun uji tunggal yang dapat dengan pasti membedakan Mycobacterium tuberculosis dengan Mycobacteria lainnya, teknik molekuler paling spesifik untuk hal ini.

Jika kondisi laboratorium masih tidak memadai, identifikasi

Mycobacterium tuberculosis minimal didasarkan pada hasil pewarnaan, kecepatan tumbuh, morfologi koloni, uji PNB dan uji niasin. Beberapa uji identifikasi yang dapat digunakan adalah sebagai berikut : 1. Uji Niasin Semua mycobacteria menghasilkan asam nikotinat waktu tumbuh. Kebanyakan

terjadi aerosol. g.

sentrifus. h.

Sentrifus pada 3000 g selama 15 menit , tunggu/diamkan sampai 15 menit.

i.

Buang supernatan.

j.

Tambahkan 1ml larutan PBS pH 7,2, campur sampai homogen dengan menggunakan vortex, diamkan 10 menit untuk menghindari adanya aerosol.

galur Mycobacterium tuberculosis dan beberapa galur M. simiae dan M. chelonae tidak mampu memetabolisme asam nikotinat tersebut. Asam nikotinat terakumulasi dalam media. Jumlah asam nikotinat yang dibentuk terbanyak pada media LJ dan bukan media lain. Karena itu uji niasin memerlukan isolat yang koloninya penuh

k.

Sedimen siap digunakan untuk diinokulasikan pada media.

Inokulasi bahan pada media :

pada media LJ. Udara saat biakan sangat penting dalam metabolisme niasin, karena

1. Pipet 100 ul sedimen ke dalam media LJ, buat duplo

itu tutup tabung biakan harus sedikit longgar selama proses inkubasi.

2. Tutup botol, tetapi jangan terlalu rapat

Uji Niasin dengan Chloramine T Alat dan bahan yang diperlukan

a. b. c. d. 64

Tambahkan PBS dengan pH 7,2 sampai tanda batas tertinggi pada tabung

Tabung reaksi 5 ml Ose/sengkelit Pipet steril dengan bulb Otoklaf


3. Sebar secara merata bahan pemeriksaan tersebut di atas permukaan media dengan cara menggerak-gerakkan botol 4. Letakkan botol-botol pada rak dengan kemiringan 300 selama 24 jam pada incubator dengan suhu 35 - 370C. 5. Setelah 24 jam, kencangkan tutup botol dan letakkan botol pada rak tabung dengan posisi tegak dan lanjutkan inkubasi. Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan Media Padat

61

6. Amati pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis setiap minggu. Pengamatan dilakukan sampai 8 minggu. Hasil negatif dinyatakan jika tak ada pertumbuhan setelah 8 minggu. Untuk contoh uji yang berasal dari kasus yang telah mendapat OAT atau pausibasiler, dianjurkan diinkubasi sampai 12 minggu Tanda khas koloni Mycobacterium tuberculosis adalah : a. Akan tampak pertumbuhan dalam waktu 2 – 4 minggu b. Koloni bewarna putih kekuning-kuningan (buff coloured), permukaan kering dan rapuh dengan tepi yang tidak beraturan (seperti bunga kol) c. Konfirmasi dengan membuat sediaan dari koloni dengan pewarnaan Ziehl Neelsen. Mycobacterium tuberculosis akan memberikan gambaran BTA yang bergerombol berbentuk khas (serpentine cord, typical cord). Bila hasil BTA negatif, tidak dilanjutkan dengan subkultur 7. Lakukan pengamatan pertumbuhan koloni setiap minggu 8. Catat hasil pengamatan setiap minggu pada buku catatan biakan

E. Subkultur Isolat Mycobacterium tuberculosis Subkultur diperlukan untuk memurnikan koloni dan meremajakan kuman sebelum dilakukan uji kepekaan terhadap OAT, uji identifikasi dan jika akan disimpan pada -70oC Alat dan bahan yang diperlukan : 1.

Media LJ

2.

Tabung reaksi dengan tutup ulir

3.

Glass beads, diameter 1.5-3 mm

4.

Vortex mixer

5.

Aquades steril

6.

Micropipette 100 μl

7.

Tip mikropipet

Cara kerja : 1. Pilih hasil biakan dengan pertumbuhan koloni yang paling baik untuk dilakukan subkultur, minimal satu untuk tes niacin, satu untuk uji PNB, satu untuk disimpan

D. Pembacaan Hasil Biakan PEMBACAAN

PENCATATAN

> 500 koloni 200 – 500 koloni 100 – 200 koloni 20 – 100 koloni 1 – 19 koloni Tidak ada pertumbuhan

4+ 3+ 2 + 1 + Jumlah koloni Negatif

Keterangan : - Bila terdapat kontaminasi pada biakan, laporkan segera dan ulangi pembuatan biakan - Bila biakan POSITIF dan pertumbuhan dinilai sebagai Mycobacterium tuberculosis, laporkan segera pada pihak yang berkepentingan - Pada minggu ke 4 dapat dibuat laporan sementara - Pada minggu ke 8 dibuat laporan akhir (final)

pada -70 oC dan satu untuk uji kepekaan. 2. Ambil koloni sebanyak 1 (satu) sengkelit penuh 3. Masukkan dalam tabung reaksi yang telah diisi dengan 1 ml aquadest steril dan glass bead, tutup tabung reaksi. 4. Homogenisasi dengan menggunakan vortex mixer selama ± 1 menit 5. Diamkan minimal selama 15 menit 6. Ambil suspensi kuman dari bagian terbawah 1/3 atas sebanyak 100 μl. Lakukan inokulasi pada setiap botol Mc Cartney yang telah berisi media LJ, botol ditutup kembali. 7. Sebarkan inokulum secara merata di atas permukaan media dengan cara menggerak-gerakkan botol 8. Tutup botol dilonggarkan, letakkan pada rak dengan kemiringan 300, simpan dalam inkubator dengan suhu 35 - 370C selama 24 jam 9. Setelah 24 jam, kencangkan tutup botol dan letakkan botol pada rak tabung dengan posisi tegak dan lanjutkan inkubasi sampai 2-3 minggu 10. Amati pertumbuhan tiap minggu

62



63

3.

Dalam cairan

asam, sianogenbromida akan menghidrolisis

hydrocyanic acid yang mudah menguap dan sangat toksik. Buanglah semua tabung reaksi ke dalam larutan disinfektan yang alkalis dengan menambahkan sama banyak larutan 10 % NaOH

e. f. g. h.

Larutan KCN 1% NaOH 4 % Kontrol positif biakan Mycobacterium tuberculosis H37RV

Cara kerja :

a.

Catatan pembuatan larutan sianogen bromida dapat juga dilakukan dengan menambahkan 50 ml air dalam botol berisi 25 gr

b. c.

Gores media LJ dengan menggunakan ose steril sampai terbelah Masukkan pada otoklaf 1210 C selama 60 menit dengan posisi horizontal sehingga semua cairan menutupi permukaan media

sianogen bromida dan dibiarkan minimal semalam. Sianogen bromida yang terlarut mempunyai konsentrasi sekitar 10%

Tambahkan 1 ml aquadest steril pada subkultur Mycobacterium tuberculosis dengan jumlah koloni penuh/hampir penuh

Kristal sianogen bromida sangat sukar larut. Karena itu

d.

Keluarkan botol dari otoklaf dan letakkan pada posisi tegak, diamkan selama 5 menit

Cara kerja 1. Tambah 1-2ml aquades atau 0.85% NaCl kedalam botol biakan

Larutan Chloramin T 5%

yang

koloninya penuh 2. Gores media sampai terbelah 3. Biarkan selama satu malam

e. f. g. h.

4. Ambil 1 ml cairan , tambah sama banyak berturut-turut larutan 4% anilin dan larutan 10% sianogen bromida 5. Amati timbulnya warna kuning setelah 5 menit

Tambahkan 0,5 ml larutan Chloramin T 5% Tambahkan 0,5 ml larutan KCN 1% Campur sampai homogen. Amati perubahan warna sampai 5 menit Positif

: terbentuk warna kuning

Negatif

: tidak berwarna

Sebelum isi tabung dibuang, lakukan netralisasi dengan menambahkan NaOH 4%

Catatan : Gunakan kontrol pada tiap pengerjaan. Kontrol positif menggunakan biakan

Pipet 0,5 ml cairan ekstrak dan masukkan ke dalam tabung reaksi 5ml

i.

Mycobacterium tuberculosis H37RV. Kontrol negatif menggunakan media

Bila koloni mempunyai ciri-ciri spesifik tetapi hasil tes Niacin negatif, maka tes Niacin diulang

LJ yang tidak ditanami spesimen/media steril Asam nikotinat akan berdifusi ke dalam media. Jika permukaan media penuh dengan koloni kuman, maka proses ekstraksi asam nikotinat dengan aquades/dapar akan terganggu. Itu sebabnya media harus tergores. Jumlah koloni yang terlampau sedikit juga menyebabkan negatif palsu. Pakailah subkutur dengan jumlah koloni minimal 50 Warna kuning akan lebih jelas jika pencampuran reagensia dan suspensi kuman dilakukan perlahan-lahan. Warna kuning akan tampak sebagai cincin diantara kedua larutan. Jika terkocok, warna kuning akan terencerkan menjadi lebih pudar.

68


Uji Niasin dengan Paper Strip a.

Pilih paper strip yang telah direkomendasikan oleh WHO atau yang hasil meta analisisnya paling sensitif

b.

Ikuti prosedur dari pabrik.

Uji Niasin dengan Anilin atau Benzidine Bahan 1.

Larutan anilin 4% atau benzidine 3% dalam etanol 95% a. Catatan cara pembuatan


65

•

Oleh karena anilin atau benzidine dapat berubah warna

alumunium foil, tulis berat yang tertera pada secarik kertas

bila terpapar dengan udara dan cahaya, sebaiknya larutan

3. Masukkan 5 g kristal sianogenbromida dalam gelas beaker

dipersiapkan dengan segar sewaktu diperlukan.Gunakan anilin

berpenutup allumunium foil tersebut

atau benzidine yang jernih dan tidak berwarna. •

4. Tambahkan akuades dalam gelas beaker sejumlah 10x berat

Campur dan kocok anilin atau benzidine dengan etanol dalam

kristal sianogenbromide yang tertimbang

botol berwarna coklat untuk menghindari udara dan cahaya .

5. Tutup gelas beaker dengan alumunium foil dan letakkan pada lemari asam pada suhu kamar selama 24 jam sampai kristal

b. Penyimpanan reagen

sianogenbromide larut dalam air

1. Simpan dalam botol coklat

6. JANGAN lewatkan larutan pada api bunsen

2. Label tiap botol dengan nama reagen, dan tanggal pembuatan

7. Tuangkan hati-hati dalam botol warna coklat kemudian tutup

reagen

rapat

3. Simpan ditempat yang gelap dan dalam lemari pendingin

8. Simpan dalam lemari pendingin.

4. Jangan gunakan larutan anilin yang warnanya telah berubah

9. Bila akan dipakai, hangatkan dahulu pada suhu kamar untuk

menjadi kuning

melarutkan presipitat yang terjadi selama penyimpanan. 10. Buatlah larutan secukupnya oleh karena sianogenbromide

c. Kendali mutu 1. Reagen tidak berwarna

mudah menguap dan akan kehilangan potensinya selama

2. Buang reagen bila larutan berubah warna menjadi kuning atau

penyimpanan

terdapat endapan

c. Penyimpanan reagen 1. Simpan dalam botol coklat dan botol harus ditutup dengan rapat

d. Keamanan kerja 1. Anilin merupakan onkogenik dan dapat penetrasi melalui kulit.

oleh karena larutan ini mudah menguap. Penguapan dapat

2. Bekerjalah dengan memakai sarung tangan dan dengan hati-

mengurangi potensi larutan ini dan akan memberikan hasil negatif palsu.

hati

2. Label tiap botol dengan nama reagen dan tanggal pembuatan

3. Kerjakan dalam lemari asam

reagen 2.

SianogenBromida 10% a.

Bahan 1. Kristal sianogenbromide 2. Akuades

b.

3. Simpan dalam lemari es 5

gr

50

ml

1.

Sianogenmerupakan lacrimator kuat dan toksik bila dihirup;

Cara pembuatan

bekerjalah dalam lemari asam selama pembuatan reagen dan

1. Kerjakanlah dalam lemari asam atau dalam BSC dengan

dalam BSC selama melakukan uji biokimiawi

penghisap udara. Hindari kontak yang terlalu lama dengan kristal sianogenbromide selama proses penimbangan 2. Timbang gelas beaker kosong yang sudah ditutup dengan

66

d. Keamanan kerja


2.

Sianogenbersifat onkogenik dan dapat penetrasi melalui kulit, oleh karena itu bekerjalah dengan memakai sarung tangan dan dengan hati-hati


67

1)

Larutan stok 0.067M Na2HPO4 anhidrat (9.47 g dalam 1000 ml aquades) 0.067M KH2PO4 (9.07 g dalam 1000 ml aquades) 0.067M Na3PO4 (25.47 Na3PO4.12H2O dalam 1000 ml aquades) 1% phenophtalein (1 g dalam 100 ml aquades) 1% bromthymolblue (1 g dalam 100 ml etanol 95%) 0.01% bromthymolblue (1 ml larutan no 5 dalam 99 l aquades)

2)

Dapar kerja Campur 35 ml larutan stok 1 dengan 1.5 ml larutan stok 2 dan 100 ml larutan stok 3 diatas

3)

Cara membuat larutan standar Deretkan 8 tabung bersih yang sama dengan tabung uji. Masukkan 2 ml dapar kerja dalam tiap tabung, kecuali tabung 1 Buat larutan 7 dengan cara mencampur 0.1ml larutan stok 4 dengan 0.2 ml larutan stok 6 dan 9.7 ml dapar kerja ( ini standar +5 ) Kedalam tabung nomor 2, masukkan 2 ml larutan stok 7, kocok ( ini menjadi standar +4 ). Ambil 2 ml dan pindahkan ke tab no 3, kocok ( standar +3). Ambil 2 ml dari standar+3, pindahkan ke tabung no 4, kocok ( standar +2 ). Lakukan hal sama untuk standar +1 dan 0. Buang kelebihan 2 ml dari standar 0. Otoklaf dan simpan pada lemari es

Cara kerja a Masukkan 0,2 ml 0.85% larutan NaCl dalam tabung b Ambil 2 sengkelit penuh koloni , c Masukkan 2 ml reagen nitrat dalam tabung, suspensikan kuman d Inkubasi dalam penangas air ( bukan inkubator ) pada suhu 37 oC selama 2 jam e Tambah 1 tetes HCl 50% , campur sampai rata f Tambah 2 tetes Sulfanilamide 0,2% + 2 tetes N-Naphtylenediamine 0,1%, campur g Baca segera dengan membandingkan pada larutan standar Pembacaan :

72


Metode ekstraksi asam nikotinat dari medium bermacam-macam. Ada yang mengekstraksi pada suhu ruang selama 30 menit atau 24 jam dalam inkubator, pendidihan bahkan otoklaf. Tiap lab dapat melakukan optimasi dengan kuman standar. Uji niasin dengan menggunakan anilin dan sianogen bromida merupakan cara terbaik dibandingkan kedua cara lain. 2. Uji Katalase Tahan Panas Katalase akan menghidrolisis hirogen peroksida menjadi air dan oksigen. Gas oksigen akan menyebabkan timbulnya gelembung-gelembung dalam larutan. Semua Mycobacteria, kecuali beberapa galur Mycobacterium tuberculosis yang resisten isoniazid dan M. bovis menghasilkan katalase dalam jumlah dan sifat tahan panas yang berbeda. Pengujian jumlah dilakukan dengan uji katalase semikuantitatif, sedangkan sifat tahan panasnya diuji pada suhu 68oC. Mycobacterium tuberculosis dan beberapa mycobacteria lainnya kehilangan aktifitasnya jika dipanaskan sampai 68 oC. Alat a. Tabung reaksi 20 x 125 mm b. Aplikator steril/ ose c. Waterbath/ penangas air d. Pipet ( otomatik ) Reagen a. Buffer Phosphat 0,067 M pH 6.8 1) Timbang 9.47 g Na2HPO4, larutkan dalam 1000 ml aquades, sterilkan dengan otoklaf 2) Timbang 9.07 g KH2PO4, larutkan dalam 100 ml aquades, sterilkan dengan otoklaf 3) Campur sama banyak, tera pH dan atur sampai pH 6.8. Bekerjalah dengan cara aseptik b. H2O2 30% 1) Tersedia di pasaran dalam bentuk larutan 30%. Larutan ini dapat menyebabkan terbakarnya kulit dan mata 2) Simpan dalam lemari pendingin dengan tutup rapat Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan Media Padat

69

c. Tween 80, 10%

Alat

1) Hangatkan Tween 80 dan 90 ml aquades pada penangas air 50 C

a. Tabung reaksi plastik ( beberapa tabung gelas mengandung residu nitrit )

2) Pipet 10 ml Tween 80. Buang kelebihan Tween pada permukaan luar pipet

b. Ose/ sengkelit

3) Masukkan Tween ke dalam aquades hangat. Bilas Tween dalam pipet

c. Inkubator

o

sampai bersih. Biarkan dalam penangas air sampai semua Tween terlarut 4) Simpan pada lemari es Cara kerja

d. Pipet pasteur e. Pipet ukur Reagen

a. Buat campuran H2O2 30% dan Tween 80 10% sama banyak.

a. Reagen nitrat 0,01M

b. Pipet 1 ml PBS pH 7,0 kedalam tabung reaksi. c.

NaNO3 ..................................................................0,085 gr

Tambahkan beberapa sengkelit penuh koloni bakteri umur 2-3 minggu

KH2PO4 ..............................................................0,117 gr

d. Pindahkan 0.5 ml kedalam tabung lain. Sehingga akan didapat dua set tabung

Na2HPO4 ............................................................0.193 gr

berisi kuman.

Aquadest .............................................................100 ml

e. Tabung pertama diinkuba si pada suhu 68oC dalam penangas air selama 20

Atur pH sampai 7.0

menit. Tabung kedua diinkubasi pada suhu ruang. f.

Sterilkan dengan otoklaf

Keluarkan dan biarkan sampai suhu kamar.

Simpan pada lemari es

g. Tambah 0,5 ml campuran H2O2 dan Tween 80 segar. Jangan digoyang karena akan terbentuk gelembung, amati selama 20 menit. Pembacaan :

b. HCl 50% 50 ml konsentrat HCl ditambah 50 ml aquadest c. Sulphanilamide 0,2%

Positif : terbentuk gelembung, walau kecil Negatif : tidak terbentuk gelembung sampai 20 menit

Larutkan dengan sempurna di dalam botol coklat 0,2 gr sulphanilamide dengan 100 ml aquades . Untuk memudahkan pelarutan, lakukan dalam penangas air 47-50 oC. Jangan gunakan sulphanilamide yang tak larut sempurna. Reagensia

3. Uji Nitrat

dapat dipakai

Spesies Mycobacteria mempunyai kemampuan berbeda dalam mereduksi nitrat. Mycobacterium tuberculosis merupakan spesies terkuat dalam mereduksi nitrat dibandingkan mycobacteria lain. Uji harus dilakukan pada kuman terduga Mycobacterium tuberculosis yang tumbuh subur usia 3-5 minggu. Jangan menggunakan biakan yang lebih dari 5 minggu. Media yang dianjurkan untuk menumbuhkan Mycobacterium tuberculosis untuk uji nitrat adalah LJ.

selama 1 bulan

d. N-naptyl ethylenediamine dihydrochloride 0,1% Larutkan dalam botol coklat 0,1 gr N-naptyl ethylenediamine dihydrochloride dengan 100 ml aquades. Simpan dalam lemari es. Larutan dapat dipakai selama 1 bulan. e. Bubuk Zink f. Standar warna

70



71

-

Potassium dihydrogen phosphate ……….

2,4 gr

-

Magnesium sulfate heptahydrate ………….

0.24 gr

Positif : warna pink dengan standar minimal +3. Ulangi pengujian jika hasilnya +2.

-

Tri-magnesium dicitrate 14-hydrate ………

0.6 gr

Negatif : hasil sesuai dengan standar warna 0 atau +1

-

L-asparagin ……………………………………3.6 gr

-

Potato meal …………………………………… 30 gr

-

Malachite green

-

Aquadest …………………………………..600

b. Glyserol

Kontrol negatif ditambah bubuk zink, jika berubah menjadi pink berarti kontrol negatif benar

……………………………… 0.4 gr

Catatan: Uji nitrat dalam bentuk paper strip tersedia di pasaran. Ikutilah petunjuk pabrik dalam pengerjaannya.

ml

…………….…………………………… 12 ml 4. Uji Paranitro-Benzoic Acid ( PNB )

c. Telur homogen….……..……………………… 1000 ml 2.

Untuk membuat stock solution OAT & working solution obat

Alat : a. Labu ukur steril b. Filter membrane 0.22 micron disposable c. Cryo tube 1 ml steril + rak tube d. Pipet steril + bulb e. Micropipet + tip steril Bahan : a. Rifampicin (susceptibility test grade ) ……………… 40 mg/lt b. Isoniazid (susceptibility test grade)

……………………0.2 mg/lt

c. Ethambutol (susceptibility test grade ) ………………. 2 d. Streptomycin sulfate (susceptibility test grade)

mg/lt

……4

e. Dimethyl formamide (Analytical grade ) f. Aquades

mg/lt

Alat dan bahan : 1. Media LJ yang mengandung PNB ( cara pembuatan media mengandung PNB dapat dilihat pada cara pembuatan media dengan obat ) 2. Inkubator 3. Rak tabung Cara kerja : 1. Ambil 100 ul suspensi 1 mg/ml stok dan inokulasi pada media LJ yang mengandung PNB dan satu tabung tanpa PNB 2. Tutuplah botol agak longgar. 3. Sebarkan bahan pemeriksaan tersebut secara merata di atas permukaan media dengan cara menggerak-gerakkan botol. 4. Letakkan botol-botol pada rak dengan kemiringan 300 selama 24 jam pada incubator dengan suhu 35 - 370C 5. Setelah 24 jam, kencangkan tutup botol dan letakkan botol pada rak tabung dengan posisi tegak dan lanjutkan inkubasi (copy paste) 6. Amati pertumbuhan M. tuberculosis setiap minggu. Jika sesudah minggu ke 4 tidak terlihat adanya koloni, pengamatan dilakukan sampai 8 minggu sebelum hasilnya dinyatakan tidak ada pertumbuhan. 7. Catat hasil pengamatan setiap minggu pada buku catatan biakan 8. Pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis akan dihambat oleh PNB Catatan: Uji PNB langsung dari hasil olahan dahak tidak dianjurkan. Uji PNB dianjurkan dilakukan dari isolat terduga Mycobacterium tuberculosis 5. Uji Pyrazinamide

76



73

Uji resistensi terhadap pyrazinamide sukar pelaksanaannya. Hasil uji pyrazinamidase dapat memperkirakan apakah Mycobacterium tuberculosis masih sensitif atau resisten terhadap pyrazinamide. Selain itu dapat digunakan untuk membedakan antara M. avium complex, M. marinum dengan M. kansasii dan M. bovis yang negatif pada uji niasin. Bahan

Timbulnya warna merah jambu

: Positif

Warna tak berubah

: Negatif

Catatan :

1. Media

Positif menunjukkan bahwa isolat Mycobacterium tuberculosis mungkin resisten

a. Larutkan 6.5 g kaldu Dubois base dalam 1000 ml aquades

terhadap pyrazinamide

b. Tambahkan Pyrazinamide murni

Selalu sertakan kontrol positif ( M. intracellulare ATCC 13950 ) dan kontrol negatif

…….. 0.1 g

( M. Kansasii ATCC 12478 ), medium tanpa inokulum dan reagen saja

Natrium piruvat …………… 2.0 g Agar ……………………….. 15.0 g

G. Pembuatan Media untuk Uji PNB dan Resistensi

c. Larutkan dalam penangas air d. Masukkan 5 ml dalam tabung tutup ulir dalam posisi tegak e. Otoklaf 121oC selama 15 menit f. Simpan pada lemari es. Medium dapat tahan selama 6 bulan

Alat dan bahan yang diperlukan : 1.

Untuk membuat media :

Alat :

bila tidak kering atau tercemar

a. Timbangan analitik 2. Reagen 1 % amonium ferosulfat

b. Spatula / sendok

a. Masukkan 0.1 g amonium ferosulfat dalam tabung tutup ulir b. Larutkan dalam 10 ml aquades steril c. Reagen tidak dapat disimpan, harus dibuat segar

d. Gelas beaker e. Pipet 10 ml, 25 ml steril f.

Cara kerja 1. Inokulasikan satu sengkelit penuh isolat usia 2-3 minggu pada permukaan media secara duplo.

Labu Erlenmeyer 250 ml, 1000 ml steril

g. Botol Mc Cartney h. Elpiji & Bunsen

2. Tutuplah tabung agak longgar, inkubasi pada suhu 37 C

i.

Power pipet

3. Setelah 4 hari, keluarkan 1 tabung dan tambahkan 1.0 ml reagen.

j.

pH meter / kertas pH

4. Amati warna merah jambu yang terbentuk pada perbatasan permukaan agar dan

k. Otoklaf

o

reagen setelah 30 menit pada suhu ruang. Jika tidak ada warna, masukkan ke

l.

lemari es selama 4 jam, kemudian baca ulang.

m. Blender stainless steel

5. Jika masih tak muncul warna, lanjutkan inkubasi sampai 7 hari dan ulangi 6. Pengamatan. Jika tidak terbentuk warna berarti negatif. Pembacaan

74

c. Gelas ukur


Inspisator

n. Magnetic stirrer & magnetic bar steril Bahan : a. Bahan Medium LJ base dengan komposisi : Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan Media Padat

75

Cara kerja :

Cara pembuatan :

1. Isi tabung bertutup ulir dengan 10-15 glass beads diameter 1.5 mm atau 5-10 jika

1. Buat stock solution (SS) dan working solution (WS) obat dengan cara :

diameternya 3 mm, kemudian tambah Tween 80, 0.1% 2 tetes untuk membasahi glass beads kemudian disterilkan dalam otoklaf. 2. Timbang tabung tsb, misalnya M1 3. Ambil satu ose penuh koloni bacilli yang berumur 2 – 4 minggu dan masukkan dalam tabung di atas. Tutup tabung dengan rapat 4. Timbang tabung, misalnya M2. Jadi berat bacilli adalah M2 – M1 = M3 5. Vortex 2 menit, kemudian diamkan 15 menit 6. Tambahkan aquades steril sesuai dengan volume M3 ml 7. Homogenkan dengan menggunakan vortex mixer selama maximum 2 menit

a. Contoh Rifampicin murni dengan potensi bahan hanya 95% : Konsentrasi 10.000 mg/lt (SS) : 105.26 mg obat + 10 ml dimethyl formamide Konsentrasi 8.000 mg/lt (WS) : 4 ml + 1 ml dimethyl formamide (buat tabel) SS disterilkan dengan filter membrane yang disposable, kemudian pengenceran selanjutnya dilakukan secara steril Semua larutan obat, terutama untuk SS dimasukkan dalam cryo tube Cryo tube diberi catatan nama obat, pengenceran & tanggal pembuatan WS dibagi dalam aliquot sesuai kebutuhan Catatan : SS yang disimpan pada -70oC dapat bertahan 2 tahun WS yang disimpan pada -20oC dapat bertahan 3 bulan

8. Diamkan 15 menit. Yakinkan suspensi telah homogen. 9. Ambil suspensi dari bagian terbawah 1/3 atas dan buat pengenceran serial 10 kali lipat (lihat uji kepekaan) Jika metode penimbangan tidak dapat dilakukan, gunakan kepekatan kuman menurut Mc

b. Contah isoniazid murni dengan potensi bahan 100% Cara kerja dan penyimpanan sama seperti Rifampicin Cara membuat pengenceran adalah sebagai berikut :

Farland untuk inokulum. Gunakan kepekatan antara 0.5-1.0 skala Mc Farland. Kepadatan

-

Konsentrasi 10.000 mg/lt (SS) : 100 mg obat + 10 ml aquades steril

kuman dalam suspensi terbaik dilakukan dengan nefelometer atau penimbangan. Jika

-

Konsentrasi 1.000 mg/lt

: 0.5 ml + 4.5 ml aquades steril

tidak ada, lakukan standarisasi makroskopik seperti dibawah

-

Konsentrasi 100 mg/lt


-

Konsentrasi 20 mg/h (WS)

: 1 ml + 4 ml aquades steril

Cara penyediaan kuman untuk mencapai standar Mc Farland dapat dilihat dibawah : a. Bahan 0.1 g BaCl2 H2SO4 pekat 1.0 ml b.

80

Cara membuat 1) Larutkan 0.1 g barium klorida dalam 10 ml aquades (larutan 1) 2) Campur 1.0 ml asam sulfat pekat dengan 10 ml aquades (larutan 2). Bekerjalah seperti menangani asam klorida. Asam sulfat adalah asam kuat 3) Campur larutan 1 dan larutan 2 dengan komposisi seperti dalam tabel dibawah Standar 0.25 0.5 1.0 2.0 3.0 Larutan 1 ( ml ) 0.025 0.05 0.1 0.2 0.3 Larutan 2 ( ml ) 9.975 9.95 9.9 9.8 9.7 Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan Media Padat

c. Contoh ethambutol murni dengan potensi bahan 100% Cara kerja dan penyimpanan sama seperti Rifampicin Cara membuat pengenceran adalah sebagai berikut : -


-



-

Konsentrasi 200 mg/lt (WS)


d. Contoh streptomycin murni dengan potensi bahan 100% Cara kerja dan penyimpanan sama seperti Rifampicin Cara membuat pengenceran adalah sebagai berikut : -


-



-

Konsentrasi 800 mg/lt (WS)



77

Catatan :

Isoniazid 20 mg/lt diambil 1.5 ml lalu tambahkan ke erlemeyer II

Sediaan obat banyak yang tersedia dalam bentuk konjugat atau terhidrasi,

Ethambutol 200 mg/lt diambil 1.5 ml lalu tambahkan ke erlemeyer III

maka diperlukan faktor koreksi.

Streptomycin 800 mg/lt diambil 0.75 ml lalu tambahkan ke erlemeyer IV PNB diambil 2.25 ml lalu tambahkan ke erlemeyer V

Misal : streptomisin sulfat dan dihidro streptomisin. Jika sediaan adalah streptomosin sulfat anhidrat dengan potensi 100%, maka jumlah obat yang

h. Putar perlahan-lahan erlemeyer I – V dengan menggunakan magnetic stirrer

ditimbang harus dilebihkan menjadi 120%. Untuk perhitungan koreksi, lihat rumus faktor koreksi pada lampiran.

supaya obat merata. i.

2. Pembuatan larutan PNB : a.

Timbang 0.1 gr PNB dan larutkan dalam 3 ml dimethyl formamide

b.

Pada setiap 150 ml media LJ tambahkan 2,25 ml larutan PNB atau Timbang dan larutkan 250 mg PNB dalam 10 ml propylene glycol.

dengan jenis obat. Hindari terjadinya gelembung dengan cara mengalirkan media melalui dinding botol tanpa menyentuhkan ujung pipet pada dinding botol. j.

a. Larutkan 37.5 gr LJ medium base dalam 600 ml aquades

Tutup botol rapat dan letakkan pada nampan dengan kemiringan 300, masukkan ke dalam inspisator yang telah dipanaskan 850C selama 45 menit.

Dalam hal ini media dibuat dengan menambahkan 2 ml larutan PNB dalam 98 ml LJ 3. Pembuatan media dengan obat dan media dengan PNB :

Bagikan media @ 7 ml kedalam botol-botol steril yang telah diberi kode sesuai

k. Keluarkan dari inspisator dan diamkan pada suhu kamar. l.

Bila kualitas media tidak baik (terjadi perubahan warna, berlubang-lubang, atau

b. Tambahkan 12 ml glycerol

terdapat gelembung-gelembung pada permukaan) maka media tersebut tidak

c. Setelah tercampur sempurna, sterilkan dengan otoklaf selama 15 menit pada

dapat dipakai.

suhu 1210C d. Dinginkan sampai suhu + 500C e. Tambahkan telur homogen 1 liter yang telah dipersiapkan secara steril, campur perlahan-lahan agar tidak terbentuk gelembung. f.

Tuangkan dalam erlenmeyer steril yang masing-masing telah diisi magnetic bar steril : Erlenmeyer I : 150 ml media LJ kurangi 0.7 ml untuk Rifampicin

a. Media dengan kualitas yang baik dicatat tanggal pembuatannya dan disimpan dalam refrigerator (suhu 4 – 80C ) b. Penyimpanan dapat sampai 4 minggu dengan tabung ditutup rapat. H. Pembuatan Suspensi Kuman untuk Uji Kepekaan

Erlenmeyer II : 150 ml media LJ kurangi 1.5 ml untuk Isoniazid

Alat dan bahan yang diperlukan :

Erlenmeyer III : 150 ml media LJ kurangi 1.5 ml untuk Ethambutol

1. Tabung tutup ulir steril atau botol Mc Cartney

Erlenmeyer IV : 150 ml media LJ kurangi 0.75 ml untuk Streptomycin

2. Glass beads steril diameter 1.5-3 mm

Erlenmeyer V : 150 ml media LJ kurangi 2.25 ml untuk PNB

3. Timbangan

Erlenmeyer VI : 850 ml media LJ tanpa obat

4. Vortex mixer

g. Siapkan WS dari obat : Rifampycin 8.000 mg/lt diambil 0.75 ml, lalu masukkan ke erlemeyer I

78

4. Penyimpanan media


5. Koloni berumur 2 – <4 minggu. 6. Aquades steril 7. Tween 80, 0.1% Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan Media Padat

79

tabung kuman jika tidak sedang diperlukan.

4)

c. Jangan meneteskan inokulum. Tempelkan ujung tip pada permukaan media, keluarkan

inokulum

dari

tip

perlahan-lahan.

Aerosolisasi

tidak

Masukkan 5-10 ml standar ke dalam tabung dengan dinding bening, rata dan cukup lebar dan sama dengan tabung yang akan dipakai untuk

hanya

membuat inokulum. Tutup dengan rapat.

membahayakan keselamatan petugas tetapi dapat juga menyebabkan bias hasil

5)

uji resistensi.

Untuk membandingkan kepekatan inokulum dan standar, letakkan tabung berisi kuman diantara standar 0.5 dan 1.0 dengan latar belakang hitam

d. Jika menggunakan mikropipet, yakinkan gagang pipet melekat erat pada tip.

yang tidak mengkilat. Volume pembanding dan yang dibandingkan harus

Jangan pakai tip yang lnggar atau ujungnya telah meruncing, yakinkan tidak ada

sama. Amati titik tengah larutan sejajar mata pengamat Kocok dahulu

gelembung pada tip.

standar sebelum dibandingkan dengan suspensi inokulum

J. Interpretasi Hasil Uji Kepekaan

6)

Standar harus diganti tiap 6 bulan atau jika telah ada gumpalan.

Pembacaan Pembacaan pertama kali dilakukan pada hari ke 28, jika hasilnya adalah “resisten” tidak perlu diadakan pembacaan ulang. Kuman tersebut dapat diklasifikasikan

I. Uji Resistensi Mycobacterium tuberculosis Cara Proporsi 1. Timbangan dengan sensitivitas 0.1 mg.

Alat:

sebagai “resisten”. Jika hasilnya adalah “sensitive” maka perlu diadakan pembacaan

1. Sengkelit

ulang pada hari ke 42 untuk meyakinkan hasil pembacaan pada hari ke 28. Jadi

2. Tabung 10 ml bertutup ulir steril

pembacaan pada hari ke 42 berfungsi pula sebagai alat kontrol.

3. Tabung 15 ml bertutup ulir steril 4. Glass beads diameter 1.5-3 mm steril

Jumlah koloni pada permukaan media harus dihitung dengan tepat. Pada botol Mc

5. Vortex mixer

Cartney dengan volume 14 ml, jumlahnya kurang dari 100 koloni. Hasil ini mungkin

6. Pipet volumetrik 1 ml dan 10 ml steril

teramati pada media tanpa obat pada pengenceran 10-5 atau pada media dengan

7. Automatic pipette 100 μl dan tip pipet

obat pada pengenceran 10-3. Idealnya jumlah koloni antara 50-100 terdapat pada

8. Botol Mc Cartney

salah satu pengenceran yang ditanam pada media tanpa obat. Hindari pendugaan

9. Inkubator

jumlah koloni pada permukaan media, kecuali sangat padat. Skala pembacaan dapat dilihat pada tabel dibawah ini : Pembacaan

Laporan

> 500 koloni 4 + ( konfluen) 200 – 500 koloni 3 + (hampir konfluen) 100 - 200 koloni 2+ 20 – 100 koloni 1 + (hitung jumlah koloni) 1 – 19 koloni Tulis jumlah koloni Tidak tumbuh Negatif Jika jumlah koloni pada pengenceran 10-5 lebih dari 100, uji kepekaan harus diulang.

84


10. Inspisator Bahan 1.

Aquades steril

2.

Media LJ

3.

Media LJ yang mengandung OAT dengan konsentrasi sbb: a. Isoniazid (INH)

: 0.2 μg/ml

b. Streptomycin

: 4 μg/ml (bila menggunakan Dihydrosteptomycin, konsentrasi harus sebanding dengan 4 mg/ml basa)

c. Rifampicin

: 40 μg/ml

d. Ethambutol

: 2 μg/ml


81

d.

Cara kerja : 1.

Siapkan suspensi kuman dengan konsentrasi 1 mg/ml atau Mc Farland 0.5-1.0

baru dan inokulasi pada botol media yang mengandung INH, kemudian

2.

Buat pengenceran 10-3 dan 10-5 dari suspensi kuman tersebut sebagai berikut:

ratakan inokulum pada seluruh permukaan media dengan menggerakkan botol perlahan-lahan

a.

Ambil 5 buah tabung reaksi steril

b.

Masing-masing tabung isi dengan 4.5 ml aquades steril

c.

Ambil 0.5 ml suspensi kuman konsentrasi 1 mg/ml

baru dan inokulasi pada botol media yang mengandung INH , kemudian

d.

Masukkan dalam tabung reaksi I dan campur dengan melakukan pemipetan

ratakan inokulum pada seluruh permukaan media dengan menggerakkan

minimal 10 kali sampai homogen, sehingga dihasilkan larutan kuman

botol perlahan-lahan

e.

pengenceran 10-1. Goyang-goyang tabung diantara pemipetan. e.

f.

f.

g.

Larutan kuman pengenceran 10 :

4.

a.

Masukkan botol-botol tersebut dengan posisi horizontal dengan sudut kemiringan 300 dalam incubator suhu 370C selama satu malam dengan tutup longgar.

b.

Setelah inkubasi satu malam, perhatikan permukaan media harus sudah kering, eratkan tutup botol dan tegakkan posisi botol.

Larutan kuman pengenceran 10-5 : dalam tabung V, homogenisasi dengan pipet

5.

Lakukan pembacaan pertumbuhan koloni pada hari ke 28 dan 42 serta dicatat dalam Tabel Pembacaan seperti terlampir

Inokulasi pada media tanpa OAT dan media dengan OAT sebagai berikut : Siapkan 4 buah botol media LJ tanpa OAT dan media LJ mengandung OAT,

Catatan : a Untuk menjamin hasil uji kepekaan yang baik,

pada tiap kali pengerjaan harus

2 botol untuk setiap jenis OAT.

disertakan kuman kontrol : H37RV yang peka terhadap semua OAT lini pertama,

Homogenkan suspensi dengan pemipetan. Ambil 100 μl suspensi bacilli

Mycobacterium tuberculosis dengan tingkat resisten sedang terhadap streptomisin

pengenceran 10 , inokulasikan pada botol I dan II media tanpa OAT kemudian

dan rifampisin serta kuman Mycobacterium tuberculosis yang resisten sedang

ratakan inokulum pada seluruh permukaan media dengan menggerakkan

terhadap isoniazid dan etambutol. Tidak dianjurkan memakai kuman kontrol yang

botol perlahan-lahan

resisten terhadap isoniazid dan rifampisin. Usia kuman kontrol juga harus antara

-3

c.

Inkubasi dengan cara sebagai berikut :

Larutan kuman pengenceran 10-4 :

Ambil 0.5 ml larutan kuman pengenceran 10-4 dengan pipet baru, masukkan

b.

Tutuplah botol-botol tersebut agak longgar

-3

dalam tabung IV, homogenisasi dengan pipet

a.

yang

botol media yang mengandung Streptomycin


3.

untuk botol media


dalam tabung III, homogenisasi dengan pipet

h.

Lakukan hal yang sama pada butir d dan e

mengandung Rifampicin, botol media yang mengandung Ethambutol dan

Ambil 0.5 ml larutan kuman pengenceran 10-2 dengan pipet baru, masukkan g.

Ambil 100 μl suspensi bacilli pengenceran 10-5 dengan menggunakan tip

Larutan kuman pengenceran 10 : -2

dalam tabung II, homogenisasi dengan pipet

82

Ambil 100 μl suspensi bacilli pengenceran 10-3 dengan menggunakan tip

Ambil 100 μl suspensi bacilli pengenceran 10 dengan menggunakan tip -5

2-3 minggu

baru dan inokulasi pada botol III dan IV media tanpa OAT, kemudian ratakan

b. Hindari kontaminasi silang. Jangan sampai batang pipetor menyentuh bibir tabung

inokulum pada seluruh permukaan media dengan menggerakkan botol

berisi kuman. Ganti tip pipet setiap menginokulasikan tiap pengenceran dan tiap

perlahan-lahan

isolat. Dianjurkan menggunakan tip dengan “stopper” (komersial).



Selalu tutup

83

Hasil perhitungan koloni layak dilaporkan sebagai sensitif atau resisten jika :

Alat yang diperlukan : 1. Otoklaf

1. Jumlah koloni pada media tanpa obat pada pengenceran 10-3 dan 10-5

2. Botol Mc Cartney atau tabung bertutup ulir volume 10 ml

berbeda secara proporsional.

3. Glass beads

2. Jumlah koloni pada permukaan media dapat dihitung tepat.

4. Vortex mixer

3. Jumlah koloni minimal pada media tanpa obat adalah 5. Jika jumlahnya

5. Pipet 1 ml steril

kurang dari 5, hasil tidak dapat disimpulkan.

6. Cryo vial 2 ml steril

Untuk media tanpa obat, jumlah koloni berdasarkan prioritas sbb :

7. Ultra deep freezer ( -700C )

1. 20 – 100 koloni, jika tidak ada yang seperti ini, pilih yang ke 2

8. Biological Safety Cabinet II

2. 5 – 19 koloni 4. Untuk perhitungan, pakai jumlah koloni tertinggi, bukan jumlah rata-rata.

Cara kerja : 1. Suspensikan 100 gr bubuk susu skim dalam 1 liter PBS (volume dapat diperkecil tergantung kebutuhan, tetapi perbandingan tetap seperti di atas) masukkan ke dalam botol bertutup ulir, tutuplah botol jangan terlalu rapat

Catatan. a. Koloni yang sangat kecil ( pin point ) pada media yang mengandung etambutol atau streptomisin jangan diperhitungkan.

2. Sterilkan botol tersebut dalam otoklaf pada tekanan 15 lbs dan suhu 121 C selama 0

10 menit (jangan lebih dari 10 menit sebab akan terjadi „caramel“) 3. Setelah dingin tutup botol dikencangkan 4. Siapkan biakan Mycobacterium tuberculosis pada media LJ yang berumur 2 – 3 minggu 5. Kerok koloni tersebut dan masukkan ke dalam botol Mc Cartney yang telah berisi larutan PBS steril dan glass beads secukupnya 6. Homogenkan dengan menggunakan vortex mixer selama + 30 detik 7. Diamkan selama minimal 15 menit supaya gelembung yang terbentuk dapat mengendap. Sesuaikan kekeruhan suspensi kuman sama dengan Mc Farland 1.0 8. Pipet suspensi kuman tersebut sebanyak 0.5 ml dan masukkan dalam cryo vial yang

b. Jika jumlah koloni pada hari ke 28 dan ke 42 berbeda mencolok, hasil tidak boleh disimpulkan. Uji kepekaan harus diulang Perhitungan penetapan resistensi Jumlah koloni pada permukaan media yang mengandung obat menandakan jumlah kuman yang resisten. Jumlah koloni pada permukaan media yang mengandung obat dibagi dengan jumlah koloni pada permukaan media yang tanpa obat akan menghasilkan proporsi kuman yang resisten untuk galur tersebut. Jika proporsi kuman terhadap obat tertentu dibawah 1 (satu) persen, maka kuman dinyatakan sensitif terhadap obat tersebut. Jika proporsinya ≥ 1 % maka kuman dinyatakan resisten terhadap obat tersebut. Untuk menilai proporsi kuman yang resisten, tetapkan angka tertinggi pada media tanpa

telah berisi 0.5 ml suspensi susu skim. Simpanlah sebanyak-banyaknya, minimal 50

obat, baik yang didapat pada hari ke 28 atau hari ke 42.

vial

Untuk media yang mengandung obat, pilih pengenceran yang menghasilkan jumlah

9. Simpan dalam ultra deep freezer. Kuman dapat bertahan puluhan tahun sepanjang suhunya stabil. Ini merupakan generasi 1 10. Lakukan hal yang sama untuk mendapatkan generasi ke 2. Simpanlah lebih banyak

koloni antara 20-100 sebagai prioritas utama, jika tak ada pilih pengenceran dengan jumlah koloni 5-19. Berdasarkan kriteria diatas, proporsi dapat dihitung sbb ;

dari generasi 1 11. Untuk kuman kontrol, ambil dari vial generasi 2 dan lakukan subkultur bersamaan dengan subkultur kuman yang akan ditentukan kepekaannya

88


Jumlah koloni pada media dengan obat % resistensi =

X 100 % Jumlah koloni pada media tanpa obat


85

Secara teoritis perbedaan jumlah koloni antara pengenceran 10-3 dan 10-5 adalah 100

Contoh 1 : pembacaan jumlah koloni hari ke 42 Suspensi (1mg/ml – 107/ ml ) Pengenceran (estimasi jumlah kuman per ml ) (106) 10-1 10-2

(105)

10-3

(104)

10-4

(103)

(102) 10-5 Proporsi resistensi

Media bebas Obat

Obat/konsentrasi (mg/L) S (4)

H (0.2) R (40)

E (2)

4+, 4+

4 + 1 (>500)

3+

8

2+

36, 45*

45

0 <0.1%

12 27%

0 0.2%

20 44.4%

S

R

S

R

Hasil dilaporkan

kali. Jika dalam kenyataan, perbedaan itu terlalu jauh, hasil uji kepekaan seharusnya tak dibaca. Pemeriksaan harus diulang Contoh - 2 : pembacaan jumlah koloni hari ke – 42 Suspensi (1mg/ml – 107/ Media bebas obat ml ) Pengenceran ( estimasi jumlah kuman per ml ) (106) 10-1 10-2

(105)

10-3 10-4

(104) (103)

* pilih angka tertinggi dari jumlah koloni pada media tanpa obat sebagai dasar

(102) 10-5 Proporsi resistensi

perhitungan.

Hasil dilaporkan

Obat/Konsentrasi (mg/L) S (4)

H (0.2)

R (40)

E (2)

4+, 4+

4+ (>500) 1

30

8

2+

36, 45*

45

0 <0.1%

12

1

20 44.4%

S

?

?

R

Koloni yang dipakai dalam perhitungan pada tabel contoh diatas adalah : H (12) pada 10-5; E (20) pada 10-5 & R (8) pada 10-3) dan S (1) pada 10-3).

Interpretasi untuk Isoniazid:

Jika dihitung maka tampak sebagai berikut : Streptomycin Isoniazid Rifampicin Ethambutol

:1/4,500 :12/45 : 8/4,500 : 20/45

x 100% x 100% x 100% x 100%

Pada contoh ini kontradiksi terjadi pada interpretasi untuk isoniazid dan rifampisin.

= <0.1 % = 27.0% = 0.2% = 44.4%

(Sensitif) (Resisten) (Sensitif) (Resisten)

Hasil uji resistensi tidak selalu dapat dibaca sekali. Kadang-kadang perlu pengulangan pengujian, yaitu pada keadaan :

a. Isoniazid:

12/45

27.0% (Resisten)

b. Isoniazid:

30/4500

0.07% (Sensitif)

Kondisi ini biasanya dapat timbul karena petugas kurang teliti atau kurang terampil dalam homogenisasi inokulum. K. Preservasi Kuman pada Suhu -70oC Sub kultur kuman kontrol tidak boleh dilakukan terus menerus karena risiko mutasi

a.

Hasil pengujian pada kuman kontrol tidak sesuai

menjadi lebih besar. Sub kultur kuman kontrol paling banyak dilakukan tiga kali. Untuk

b.

Kriteria untuk pembacaan/interpretasi pertumbuhan pada media yang

mengatasi hal tersebut, kuman kontrol harus disimpan sebagai aliquot dalam jumlah

mengandung obat dan media yang tidak mengandung obat belum dicapai.

besar sehingga ketersediaannya terjamin. Preservasi juga mempunyai manfaat untuk

Jika terjadi perbedaan jumlah koloni yang terlalu besar pada duplo kontrol.

penelitian.

Misalnya lebih dari 10 kali

Bahan yang diperlukan :

Terjadi kontradiksi interpretasi (contoh – 2)

1. Bubuk susu skim (“ laboratory grade “)

c. d.

2. Aquades

86



87

8. NaOH adalah dekontaminan sekaligus mukolitik. Daya mukolitik maksimum pada konsentrasi akhir 2%. Namun harus diingat bahwa pada konsentrasi tersebut, NaOH juga berefek kurang baik untuk mycobacteria. Karena itu waktu paparan terhadap NaOH harus sangat terkendali. Jika dengan konsentrasi 2%, cemaran masih tinggi. naikkan konsentrasi akhir menjadi 3-4% dan jangan memanjangkan waktu paparan. Seandainya cemaran dengan Pseudomonas aeruginosa tetap menjadi masalah besar, gunakan cara dekontaminasi dengan asam oksalat 9. Untuk menilai kemampuan dekontaminasi reagen baru, lakukan dekontaminasi pada 4-6 spesimen dahak dan tanam hasilnya pada agar darah. Reagensia yang baik hanya menyebabkan pertumbuhan minimal dalam 24-48 jam. Angka cemaran yang baik berkisar antara 3-5%. Lakukan analisa bulanan/tahunan 10. Jika tersedia, penambahan fraksi V bovine albumin 0.2 % dalam inokulum akan memperkuat penempelan kuman pada media 11. Temperatur inkubator untuk isolasi Mycobacterium tuberculosis harus pada suhu 35-37oC. Idealnya mengngunakan inkubator CO2 dengan kadar 5-10%. Jika menggunakan inkubator tersebut, tutup botol dapat dikendorkan untuk minggu pertama dan setelah itu ditutup rapat untuk menghindari pengeringan. 12. Biakan baru dinyatakan negatif jika dalam 8 minggu tak ada pertumbuhan. Jika hasil pemeriksaan mikroskopis dahak BTA positif, biakan dinyatakan negatif setelah 12 minggu tak ada pertumbuhan 13. Adanya serpentine cord formation pada pemeriksaan mikroskopik mengarah pada Mycobacterium tuberculosis. Tetapi tidak boleh melakukan identifikasi hanya berdasar temuan mikroskopik tersebut

Catatan : a. Prosedur no 6-9 dilakukan dalam BSC b. Kuman yang belum dipasasi merupakan generasi ke 0, dan yang disimpan pertama kali merupakan generasi ke 1. Agar sifat kuman mencerminkan generasi asalnya, kuman hanya dapat dipakai sampai generasi ke 3. c. Suspensi susu skim dalam PBS dapat diganti dengan larutan steril gliserol 8% dalam larutan proteose pepton (Proteose peptone no 3 sebanyak 10g, gliserol 80 ml dan aqubidestilata 1000 ml kemudian sterilkan) L. Resusitasi Mycobacterium tuberculosis dari -70oC Cara : 1. Ambil satu atau secukupnya tabung berisi kuman dari -70oC 2. Biarkan pada suhu ruang sampai mencair 3. Buka cryo vial, masukkan sengkelit steril (diameter 3 mm) tegak lurus sampai dasar. Putar sengkelit beberapa kali perlahan-lahan. Tanam satu sengkelit pada seluruh permukaan media LJ dengan jalan menggoreskannya. Alternatifnya, homogenkan suspensi kuman dengan pipet dan tanamkan 0.1 ml pada seluruh permukaan media LJ 4. Selanjutnya amati biakan seperti biasa. Pertumbuhan dalam 7 hari mencurigakan cemaran. Konfirmasi dengan pewarnaan BTA, Gram dan penanaman pada agar darah Catatan : Suhu yang sangat dingin dapat membakar kulit. Pakailah sarung tangan Cryotube mengandung sangat banyak Mycobacterium tuberculosis. Berhatihatilah bekerja Sisa suspensi kuman dapat dikembalikan ke dalam -70 oC. Makin sering keluarmasuk -70oC, viabilitas kuman makin menurun. M. Pengiriman Isolat ke Laboratorium Rujukan Pengiriman subkultur ke laboratorium dilakukan untuk tujuan mengidentifikasi isolat, melakukan uji kepekaan dan uji silang dalam program pemantapan mutu (Quality Assurance).

92



89

Jika menggunakan pesawat terbang, pegiriman subkultur harus mengikuti aturan IATA (International Airline Transport Association). Secara umum sama dengan yang telah dijelaskan pada bab Keamanan Kerja. Hal yang sama untuk metode pengiriman dengan transportasi lain. Pada kondisi dengan fasilitas terbatas, pengiriman dahak dan subkultur dapat dilakukan seperti di bawah ini: Alat Yang Diperlukan 1. Wadah bahan infeksius (biohazard container) : box Styrofoam, pipa pralon 2. Bahan penyerap : kertas, tissue 3. Penahan guncangan : plastik, busa, gabus

CATATAN TAMBAHAN 1. Keberhasilan melakukan biakan sangat bergantung pada kualitas contoh uji yang diterima. Memberikan informasi yang rinci dan mudah dimengerti merupakan salah satu kunci keberhasilan pengumpulan dan pengiriman spesimen yang baik. 2. Idealnya contoh uji diharapkan sampai ke laboratorium dalam waktu 1 (satu) jam. Jika tidak dapat sampai dalam waktu 1 jam, dinginkan, jangan bekukan spesimen. Bila jarak tempuh ke laboratorium lebih dari 72 jam, maka contoh uji diawetkan dengan CPC. Spesimen yang sudah ditambah dengan CPC atau darah tidak boleh didinginkan. Untuk pembiakan pada MGIT dilarang menambahkan CPC, cukup dikirim dalam keadaan dingin.

4. Kantong plastik bersegel 5. Formulir identitas isolat 6. Parafilm, lakban 7. Stiker : Biohazard, Fragile,

3. Spesimen yang diawetkan dengan CPC harus dikelola secara khusus sebelum penanaman 4. Paparan kuman terhadap OAT dalam beberapa hari telah menyebabkan sebagian kuman mati dan viabilitasnya rendah.

Cara kerja : 1. Tutup Botol Mc Cartney dengan rapat kemudian segel dengan parafilm. Masukkan 2 botol dari 1 pasien kedalam kantong plastik bersegel. 2. Bungkus tiap kantong plastik dengan kertas tissue agar jika terjadi bocoran, tidak keluar dari wadah bahan infeksius 3. Catat identitas isolat yang akan dikirim pada Formulir 4. Masukkan kantong plastik yang berisi botol Mc Cartney ke dalam wadah bahan infeksius. 5. Tutup wadah, rekatkan dengan lakban 6. Masukkan Formulir identitas isolat dalam amplop 6. Masukkan wadah bahan infeksius dan formulir ke dalam kotak karton sedemikian rupa agar tidak terjadi guncangan, beri alamat yang dituju dan tempelkan stiker yang diperlukan

5. Tidak ada satu metodepun yang ideal untuk semua spesimen. Pilihan cara dekontaminasi tergantung pada jenis dan kondisi spesimen. Prinsip umum dekontaminasi adalah menggunakan cara yang paling ringan dalam membunuh mikroba. Toleransi kontaminasi 3% - 5% untuk media padat. 6. Untuk kebutuhan pemantapan mutu internal, sisa spesimen dapat disimpan pada refrigerator sampai hasil pewarnaan BTA hasil pemekatan didapat atau dicurigai timbulnya kontaminasi pada media. Spesimen tersebut masih dapat digunakan dalam 7-10 hari 7. Dekontaminasi dengan Nacetyl cystein ( NALC ) dan NaOH sangat baik untuk dahak, namun NALC sangat labil dan harus selalu dibuat segar. Hindari pengocokkan NALC-NaOH yang berlebih karena NALC mudah teroksidasi oleh oksigen udara.

7. Kirim melalui expedisi atau kurir N. Pengelolaan Limbah Semua bahan/ alat yang telah atau dianggap tercemar harus disterilisasi sebelum dibersihkan atau dibuang.

90



91

e. Pengambilan dan penanganan contoh uji dahak •

Dahak yang diperiksa harus mukopurulen yaitu dahak yang mukoid berwarna kuning kehijauan. Petugas harus dapat memotivasi pasien agar dapat mengeluarkan dahak yang baik. Untuk lebih jelasnya, lihat

•

•

Uji kualitas dahak dilakukan dengan cara melihat warna dan kekentalan

adalah suatu sistem yang dirancang untuk meningkatkan dan menjamin mutu serta

dahak tanpa membuka tutup pot dahak, karena itu pot dahak harus

efisiensi pemeriksaan laboratorium secara berkesinambungan sehingga hasilnya dapat

terbuat dari bahan yang transparan dan bening.

dipercaya. Pemantapan mutu laboratorium tuberkulosis sangat diperlukan agar diagnosis

Periksalah kualitas spesimen dan beri catatan bila spesimen seperti

penyakit tuberkulosis melalui pemeriksaan biakan dan pemeriksaan uji kepekaan dapat

saliva. Laporan hasil harus mencantumkan bahwa ”spesimen diperkirakan

dipertanggung jawabkan mutunya.

harus melakukan pemeriksaan dengan memilih bagian yang paling kental dan beri catatan bahwa ”spesimen tidak memenuhi syarat / air liur”

Reagen dan Pewarnaan

Tujuan pemantapan mutu uji kepekaan laboratorium TB adalah : a. Menjamin bahwa hasil pemeriksaan biakan dan uji kepekaan yang dilaporkan oleh suatu laboratorium akurat dan terpercaya. b. Mengidentifikasi berbagai tindakan yang berpotensi menimbulkan kesalahan. c. Menjamin bahwa tindakan-tindakan perbaikan yang tepat telah dilakukan.

Catat tanggal kadaluarsa tiap bahan dan reagen, buat label di wadahnya.

Setiap komponen di dalam pemantapan mutu tidak berdiri sendiri tetapi merupakan

Semua wadah pewarnaan dan reagen sebaiknya menunjukkan tanggal

bagian yang tidak terpisahkan dan saling terkait satu sama lain. Laboratorium yang akan

penerimaan dan pembukaan pertama. Semua bahan yang tidak memenuhi

melakukan pemantapan mutu eksternal tanpa melakukan pemantapan mutu internal

syarat harus dicatat dan segera dibuang. Stok sebaiknya dibatasi untuk

dengan baik (mendeteksi terjadinya kesalahan secara dini) maka usaha tersebut akan sia-

waktu 6 bulan dan urutan penggunaan stok sebaiknya sesuai tanggal paling

sia. Demikian pula bila kedua komponen tersebut dilakukan tanpa disertai pelaksanaan

awal, untuk menghindari kadaluwarsa.

komponen peningkatan mutu sebagai upaya untuk penyelesaian masalah.

g. Uji Biokimia Siapkan reagen untuk identifikasi dilengkapi dengan menggunakan kontrol positif dan negatif. Gunakan wadah dengan volume kecil untuk menghindari kontaminasi silang. h. Air Minimal air yang dipakai adalah aquabidestilata, pH 6.8-7.2 atau air yang telah mengalami filtrasi partikel, de-ionisasi dan osmosis terbalik. Aqua pro injeksi paling baik untuk dipakai

96

A. Tujuan Pemantapan Mutu

Buanglah wadah spesimen yang pecah atau bocor dengan diotoklaf dan mintalah spesimen ulangan.

f.

berkesinambungan untuk meningkatkan reliabilitas, dan efisiensi pemeriksaan biakan sebagai alat diagnostik dan pengelolaan pasien. Pemantapan mutu laboratorium

Bila dahak yang diperoleh tetap tidak memenuhi syarat, petugas lab tetap

•

Jaminan mutu untuk biakan TB merupakan suatu sistem yang disusun secara

pedoman pemeriksaan mikroskopis.

saliva”, laporkan negatif dengan catatan. •

VIII. PEMANTAPAN MUTU BIAKAN DAN UJI KEPEKAAN


B. Komponen Pemantapan Mutu Laboratorium Tuberkulosis Pemantapan

mutu

laboratorium tuberkulosis terdiri atas 3 komponen utama,

yaitu : 1. Pemantapan Mutu Internal (PMI) atau Internal Quality Control Pemantapan mutu internal adalah suatu proses pemantauan yang terencana, sistematik, dan efektif yang dilakukan oleh laboratorium itu sendiri untuk mendeteksi adanya kesalahan dan menganalisis kesalahan yang terjadi. Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan Media Padat

93

Kunci keberhasilan pemantapan mutu internal adalah : •

Pelatihan yang adekuat, motivasi dan komitmen petugas

•

Pelaksanaan prosedur/ SOP

•

Kemauan menerima dan memperbaiki kesalahan

•

Komunikasi efektif

buffer untuk pH 4.0 dan 7.0 sebelum digunakan. 3. Water bath : periksalah temperatur sebelum dan sesudah penggunaan. Bersihkan setiap bulan dengan larutan sabun. 4. Almari Pendingin 20-80C : periksa temperatur setiap hari, tempatkan termometer pada rak tengah, catat dalam buku PMI, bersihkan setiap bulan. Lakukan defrost atau periksa bagian almari pendingin dan

Pemantapan Mutu Internal merupakan tanggung jawab petugas laboratorium yang

freezer setiap 3 bulan.

meliputi :

5. Freezer : periksa setiap hari, bersihkan setiap 6 bulan.

1. Tahap Pra Analitik

6. Alat-alat gelas : pastikan bahwa alat-alat gelas bebas dari detergen.

a. Tata Ruang dan Administrasi Laboratorium •

Pastikan bahwa pintu laboratorium selalu tertutup. Area kerja, peralatan dan bahan-bahan sebaiknya disusun sedemikian rupa sehingga mendukung efisiensi alur kerja. Area kerja sebaiknya bebas debu. Meja kerja/ bench/ kabinet sebaiknya dibersihkan setidaknya sekali sehari dengan desinfektan (misalnya fenol 5%)

•

•

Jangan menggunakan

Setiap prosedur yang digunakan di laboratorium harus tercatat dan

minggu. Pemeliharaan dan kalibrasi alat yang digunakan dalam laboratorium biakan dan uji kepekaan dapat dilihat pada lampiran c. Permintaan pemeriksaan •

atau orang yang berwenang dan permintaan dengan lisan sebaiknya

supervisor/penanggung jawab laboratorium

tidak dilayani.

Semua dokumen hasil pemeriksaan tersimpan untuk 5 tahun.

•

•

Peralatan digunakan sesuai manual dan spesifikasi yang ditentukan

•

Pedoman penggunaan dan pemeliharaan semua alat harus tersedia dan Peralatan harus dimonitor secara teratur agar tercapai akurasi alat dan presisi yang tetap

dengan otoklaf. Salin ulang permintaan terlebih dahulu. •

yang identitasnya tidak jelas dan kualitas tidak memenuhi syarat. •

inkubator. 2. pH meter : Sesuaikan temperatur setiap penggunaan. Buatlah larutan buffer setiap hari, buanglah bila sudah tidak terpakai. Standarkan


Catatlah tanggal dan jam pengambilan serta kedatangan spesimen di laboratorium dan catatlah semua keterlambatan pengiriman pada formulir hasil, terutama pada hasil biakan negatif atau terkontaminasi

beberapa tempat dalam inkubator dengan

menempatkan termometer di dalam kotak kayu. Kontrol lampu dalam

Periksalah bahwa data-data pada formulir permintaan pemeriksaan sesuai dengan data pada label spesimen. Buanglah atau tolak spesimen

1. Incubator 35-370C: ukur temperatur setiap hari, sebaiknya pagi hari. Ujilah temperatur di

Formulir permintaan pemeriksaan dipisahkan dari spesimen. Bila formulir terkontaminasi spesimen, harus dilakukan dekontaminasi atau disterilkan

tersimpan

94

Pemeriksaan hanya dilakukan bila ada permintaan tertulis dari dokter

disimpan. Setiap perubahan prosedur harus dikonsultasikan pada

b. Peralatan laboratorium

•

alat gelas yang telah disterilkan lebih dari 3

d. Persiapan pasien •

Memberikan bimbingan kepada pasien tentang cara pengumpulan dahak, waktu pengumpulan dahak dan lokasi pengumpulan dahak. Lakukan demonstrasi di depan pasien.


95

o

Recovery Rate yang baik

o

Semua dahak BTA pos seharusnya memberikan hasil pemeriksaan

i.

Media Biakan •

Dianjurkan telur bebek yang bukan dari peternak besar.

biakan pos (>97%) o

Sebanyak 20 - 30% dahak BTA neg dapat memberikan hasil biakan

Gunakan telur segar (kurang dari 7 hari) untuk penyiapan media LJ.

•

Periksa waktu koagulasi dan temperatur untuk pembuatan media telur.

pos

Buang media yang mengalami dekolorisasi, mengandung gelembung

o

2-3% dahak BTA pos memberikan hasil biakan negatif

atau tanda-tanda pemanasan berlebih.

o

Angka indikator di atas dihitung untuk contoh uji dahak dari suspek

•

Ciri-ciri umum media yang baik o

saja, sehingga pencatatan untuk pasien suspek dan pasien follow up sebaiknya dipisahkan

terjadi perbedaan warna berarti proses homogenisasi tidak baik

o

Buat analisa indikator di atas tiap tahun dan selama 3 tahunan.

atau adanya materi residu yang tertinggal dalam botol tsb. Warna

o

Untuk mempertahankan kemampuan petugas lab, minimal sebanyak

hijau yang lebih gelap disebabkan karena terlalu banyak malachite

5.000 pemeriksan biakan harus dilakukan per tahun.

green atau medium terlalu asam (pH rendah), sebaliknya warna medium yang kekuningan disebabkan karena kualitas malachite

c. Pemantapan mutu/ indikator internal uji kepekaan o o

Gunakan isolat yang berumur tidak lebih dari 4 minggu (dianjurkan

green yang jelek atau medium yang terlalu basa/alkalis (pH tinggi)

2-3 minggu)

atau pemanasannya terlampau tinggi. Medium yang berbeda warna

Selalu sertakan kuman kontrol H37RV, Mycobacterium tuberculosis

tersebut sebaiknya segera dibuang. o

yang resisten S dan H/R, Mycobacterium tuberculosis yang resisten

o o

o

Bila temperatur inspisator terlalu rendah, medium dapat mudah luruh.

E dan R/H. Umur kuman kontrol harus sama dengan kuman yang

Cara memeriksa kualitas tekstur medium adalah dengan mengambil

akan diuji.

secara acak 1 atau 2 medium dan mengetukkannya pada telapak

Jika hasil uji kepekaan kuman kontrol tidak dapat dibaca, hasil uji

tangan 2-3 kali. Media yang telah cukup padat tidak akan luruh.

kepekaan isolat dari pasien tidak boleh dibaca.

Medium yang tidak cukup padat harus segera dibuang. o

Selalu bekerja dengan mematuhi Petunjuk Teknis yang telah

Munculnya gelembung udara selama proses inspisasi disebabkan

diuraikan sebelumnya. Perhatian khusus saat homogenisasi

oleh temperatur inspisator terlalu tinggi. Tidak ratanya proses

inokulum dan pengenceran. Lakukan homogenisasi dengan baik

homogenisasi juga dapat menyebabkan terbentuknya gumpalan.

mulai saat penyiapan inokulum awal, selama proses pengenceran

Medium yang berwarna kuning dan mengandung gelembung udara

dan saat inokulasi.

tidak layak dipergunakan dan harus segera dibuang. o

Simpan bubuk obat pada suhu yang sesuai dengan anjuran pabrik

Medium yang baik tidak kering. Adanya sedikit air dalam wadah media

bersangkutan. Bubuk obat harus selalu tertutup rapat, dianjurkan

merupakan hal baik. Jika jumlah air terlalu banyak, harus dibuang

untuk disimpan dalam desikator dengan gel silika di dalamnya.

secara aseptik. Adanya sedikit air akan mencegah pengeringan saat

Panaskan gel silika minimal 1 bulan sekali. Jangan menggunakan

media yang telah diinokulasi diinkubasi dalam keadaan tutup longgar.

obat yang telah lewat masa kadaluarsa atau telah bergumpalgumpal.

100

Pada batch yang sama harus mempunyai warna yang sama. Bila


•

Periksa sterilitas setiap batch dengan cara sebagai berikut: Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan Media Padat

97

-

Ambil sampel 5% -10 % dari jumlah tiap batch pembuatan. Inkubasi

terkontaminasi dan dievaluasi setiap bulan dengan standar kisaran

0

pada suhu 35 - 37 C selama 2 x 24 jam. Dapat juga dilakukan

3-5%. Kontaminasi < 3% mengindikasikan proses dekontaminasi

inkubasi semua media dalam 1 x 24 jam

terlalu kuat, berarti terlalu banyak tuberkel yang mati. Keterlambatan

-

Bila tidak tumbuh koloni, media dapat dipakai.

pengiriman spesimen dapat menyebabkan kontaminasi > 5%.

-

Bila tumbuh koloni, buang seluruh media dan buat yang baru.

Kontaminasi > 5% juga menunjukkan proses dekontaminasi terlalu

0

•

lemah. Dalam hal ini gunakan konsentrasi dekontaminasi lebih tinggi

Uji Kesuburan Media

tanpa memperpanjang waktu paparan. Pastikan bahwa seluruh

Untuk media tanpa obat, uji kesuburan media dapat dilakukan dengan

spesimen telah terdigesti sempurna untuk mengetahui penyebab

menggunakan M. fortuitum atau mycobacterium lain yang termasuk rapid

kontaminasi. Campurkan dengan benar isi tabung agar seluruh

grower dengan standar Mc Farland 0.5 - 1.0 pada pengenceran 10 -3.

spesimen terdekontaminasi.

Jika dalam waktu 5 (lima) hari tidak terdapat pertumbuhan M. fortuitum, media dikategorikan tidak baik dan tidak layak dipakai. Pada media yang

e. Prosedur Biakan •

baik akan tampak pertumbuhan yang cukup rapat. •

ose/loop dan terapkanlah teknik aseptik

Penyimpanan media

•

Media dengan kualitas yang baik dilabel dan dicatat tanggal

Penempatan tabung tidak boleh menghalangi outlet udara dingin. Jangan menggunakan media yang berumur lebih dari 4 minggu atau media yang kering 2. Tahap Analitik. a. Memastikan prosedur tetap di laksanakan dengan baik pada setiap

tinggi. f.

Pengukuran turbiditas dengan menggunakan standar kepekatan kuman menurut Mc Farland untuk inokulum. Gunakan kepekatan antara 0.5-1.0 skala Mc Farland.

Catatan: 1) Kontaminasi silang umumnya terjadi melalui aerosol yang mengendap karena gaya gravitasi ke wadah lain, gagang pipet yang menyentuh

pemeriksaan b. Menggunakan alat sesuai standar. Kelengkapan alat dapat dibuat dalam bentuk daftar tilik. c. Proses pengerjaan, dekontaminasi, inokulasi dilaksanakan sesuai prosedur tetap d. Digesti dan dekontaminasi •

Pemrosesan spesimen dahak diurutkan, sesuai kapasitas sentrifus. Gunakan semua rotor saat pemusingan.

•

98

Buatlah catatan persentase hasil biakan spesimen klinik yang


Perlu curiga pada spesimen-spesimen yang positif secara berturutturut atau biakan dengan beberapa koloni yang diikuti biakan positif

pembuatannya dan disimpan dalam refrigerator (5-8oC) Penyimpanan dapat sampai 4 minggu tetapi tutup tabung harus rapat

Hindarkan kontaminasi silang biakan dengan penggunaan pipet atau

wadah tercemar. 3. Tahap Post analitik a. Menjamin bahwa pelaksanaan tahap pasca analisis sesuai protap yaitu pelaksanaan dekontaminasi alat dan bahan infeksius; pengelolaan limbah infeksius dan non infeksius; dan pemeliharaan alat. b. Indikator keberhasilan : o

Angka kontaminasi di setiap laboratorium harus selalu terpantau. Toleransi kontaminasi yang masih bisa diterima adalah 3% - 5% untuk media padat. Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, IdenƟfikasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan Media Padat

99

d. Pelaporan. o

Periksa kembali pencatatan dan pelaporan sesuai dengan standar.

o

Lakukan

pelaporan

biakan

dan

identifikasi

segera

setelah

mendapatkan hasil positif dan setelah hasil uji kepekaan selesai. o

Untuk dahak dengan hasil BTA pos, hasil biakan negatif dapat dilaporkan sampai dengan 8 minggu, sedangkan untuk dahak BTA neg, sebaikya menunggu sampai 12 minggu.

2. Pemantapan Mutu External (PME) atau External Quality Assurance (EQA) Pemantapan Mutu External (PME) atau External Quality Assurance (EQA) adalah suatu proses yang terencana dan berkesinambungan yang dilakukan oleh laboratorium pembanding untuk menilai mutu hasil pemeriksaan biakan dan uji kepekaan. Jejaring laboratorium uji kepekaan terdiri atas lab supranasional dan lab nasional dan laboratorium di Fasilitas pelayanan kesehatan lain yang mampu melaksanakan uji kepekaan. Pemantapan mutu eksternal laboratorium uji kepekaan dilakukan secara berjenjang ke laboratorium di bawahnya Metode yang dipakai untuk melaksanakan pengkajian mutu eksternal uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis: a. Tes panel (panel testing/ proficiency testing) yaitu pengiriman isolat dari laboratorium rujukan untuk diperiksa dan diinterpretasi. Gunakan isolat yang benar-benar telah terstandarisasi untuk panel, dianjurkan isolat dari WHO. Jumlah isolat minimal 30 dan terdiri dari berbagai pola kepekaan. Minta laboratorium yang diuji melakukan upaya rutin dan bukan dengan upaya khusus. b. Supervisi/ on site evaluation/ pembinaan yaitu pemantauan mutu dan bimbingan teknis kegiatan laboratorium TB pada waktu kunjungan supervisor. c. Uji Silang (cross check). Cara ini lebih jarang dipakai dibandingkan dengan panel. 3. Peningkatan mutu (Quality Improvement) Peningkatan mutu atau quality improvement merupakan proses yang terus menerus dilakukan oleh laboratorium dengan cara menganalisis setiap aspek dalam pemeriksaan laboratorium dan sebagai tindak lanjut hasil supervisi dan tes panel.

104



101

Komponen kunci dalam proses ini meliputi pengumpulan data, analisis data dan penyelesaian masalah secara kreatif dengan cara pemantauan yang terus menerus, identifikasi masalah yang terjadi yang ditindaklanjuti dengan upaya perbaikan untuk mencegah dan menghindari terulangnya kembali masalah yang sama. Secara umum masalah dapat terjadi akibat faktor tunggal, namun umumnya gabungan dari beberapa faktor diantaranya: a. Kualitas bahan dasar dan bahan kerja (working dilution/ media) yang tidak baik. b. Kualitas dan pemakaian alat yang tidak memenuhi syarat. c. Kualitas dan kuantitas dahak dan pot dahak yang tidak memenuhi syarat. d. Kurangnya keterampilan petugas. e. Kepatuhan terhadap petunjuk teknis yang tidak konsisten. f.

Kesalahan administrasi (transcription error) misalnya kesalahan penulisan dan penyalinan.

IX. PENCATATAN DAN PELAPORAN Laboratorium TB harus melakukan pencatatan dan pelaporan hasil biakan dan uji kepekaan. Hal-hal yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut : 1. Apabila hasil biakan terkontaminasi, harus segera dilaporkan dan perlu dilakukan pemeriksaan spesimen ulang. 2. Apabila hasil biakan positif dan diidentifikasi sebagai Mycobacterium tuberculosis segera dicatat dan dikirim hasilnya. 3. Tanggal tumbuhnya dan karakteristik koloni dari biakan positif dicatat pada register laboratorium. Biakan negatif dan biakan yang terkontaminasi juga dicatat berdasarkan tanggal pelaporan. 4. Hasil yang dilaporkan menurut kriteria kualitatif dan kuantitatif. 5. Harus ada kesesuaian antara nomor register laboratorium dengan nomor yang ditulis pada tabung. 6. Laporan hasil menggunakan format standar sesuai program TB 7. Salinan laporan hasil akhir disimpan di laboratorium selama 2 tahun.

Catatan : Supervisor laboratorium harus memahami semua aspek teknis laboratorium TB dan setiap bulan memonitor pembuatan reagen, media, penanganan sampel, pencatatan dan pelaporan. Misalnya catatan pembacaan pH larutan garam pada pembuatan media, sterilisasi, dan monitoring temperatur alat.

Format laporan hasil seperti pada lampiran.

102



103

Lampiran 2. Tabel Penghitungan Hasil Uji Kepekaan

No Spesimen

OAT

………….

S

Jml koloni tertinggi dlm media dengan OAT

Estimasi/Jml Proporsi koloni tertinggi (%) dlm media (c/d) x 100 tanpa OAT

HASIL

I R E Ofl Am Kn ………….

S I R E Ofl Am Kn

108



105

Lampiran 3. Form TB 05 MDR (Formulir permohonan lab TB MDR) TB.05 MDR

PENANGGULANGAN TB NASIONAL

FORMULIR PERMOHONAN LABORATORIUM TB MDR UNTUK PEMERIKSAAN DAHAK Nama RS Rujukan TB MD : ___________________________

No. Telp. : _______________________

Nama suspek/ pasien

: ___________________________

Umur

Jenis Kelamin

: Laki-laki

Alamat lengkap

:________________________________________________________________ ________________________________________________________________ :____________________________ :____________________________

Kabupaten/ Kota Propinsi

No. Identitas Sediaan (sesuai no.Reg Suspek di TB.06 MDR)

tahun

Alasan Pemeriksaan : Diagnosis

……/………/………/……… Tgl. Pengambilan dahak terakhir

: ______________

Tanggal pengiriman sediaan

: ______________

Tanda tangan pengambil sediaan

: ______________

Jenis & Jumlah Pemeriksaan BTA x ………….

:

Perempuan

Follow up pengobatan : Bulan ke : Follow up pasca pengobatan : Bulan ke :

Klasifikasi Penyakit Paru

Biakan x ................

Extra Paru

Uji Kepekaan Lini 1

Lokasi :

No.Reg.TB MDR UPK

: ________

No.Reg.TB MDR Kab

: ________

Uji Kepekaan Lini 2

Secara visual dahak tampak

Uji cepat

Nanah lendir : S

Bercak darah : S

Air liur : S

P

P

P

HASIL PEMERIKSAAN LABORATORIUM No. Register Lab. (sesuai dengan Formulir di TB.04 MDR) : ………………………… Spesimen dahak*)

Hasil BTA**)

Tanggal Hasil +++

++

+

Tanggal Hasil

1-9***)

Neg

Hasil Biakan M.TB

Neg

Sewaktu

Pagi

Spesimen dahak*)

Tanggal Hasil

H

R

E

S

Hasil Uji Kepekaan**** Lfx Km Ofx Cs

PAS

Cm

Eto

Sewaktu Pagi

Tanda tangan pemeriksa

Mengetahui Dokter PJ pemeriksaan

(………………………….)

(………………………….)

*)

Diisi sesuai dengan kode huruf sesuai identitas sediaan/ w aktu pengambilan dahak. **) Beri tanda rumput pada hasil pemeriksaan/ tingkat positif yang sesuai. ***) Isi dengan jumlah BTA yang ditemukan ****) Diisi sesuai kode : R : resisten S : sensitif TD : Tidak dilakukan Ke te rangan : Nomor identitas sediaan terdiri dari 4 kelompok angka dan 1 huruf , sebagai berikut : o Kelompok angka pertama terdiri dari 2 angka, misalnya 02 yang merupakan kode RS rujukan MDR o Kelompok angka kedua terdiri dari 3 angka, misalnya 015 yang merupakan nomor urut suspek. o Kelompok angka ketiga terdiri dari 2 angka, misalnya 10 yang merupakan kode bulan oktober. o Kelompok angka keempat terdiri dari 2 angka, misalnya 08 yang merupakan kode untuk tahun 2008. o Kode huruf : - Penegakan diagnosis A = dahak sew aktu pertama, B = dahak pagi - Follow up bulan ke 1, C - Follow up bulan ke 2, D - dan seterusnya sampai akhir pengobatan o Contoh nomor identitas sediaan : 02/015/10/08 A, 02/015/10/08 B dan 02/015/10/08 C

106



107

No. Alat

Pemeliharaan

7

Suhu : setiap hari

Deep freezer200Cdan -700C

Dilakukan oleh Teknisi lab

Dihubungkan dengan alarm untuk mengetahui suhu dan sirkulasi udara.

REKAPITULASI HASIL BIAKAN Mycobacterium tuberculosis

Bersihkan setiap 6 bulan 8

Inkubator

Lampiran 6. Rekapitulasi hasil biakan

Suhu: setiap hari

Teknisi lab

Nama Laboratorium

: ………………………….......…………………………….

Provinsi

: …………………………………………………………….

Tahun

: …………………………………………………………….

Penanggungjawab

: …………………………………………………………….

Sterilitas/indikator biologi 9

Vortex

Frekuensi getaran : 1x/th

Lab. kalibrasi

10

Air Condition

Suhu, kelembaban,aliran udara: 1x/3 bulan

Teknisi AC

11

Refrigerator

Suhu: diukur dengan thermometer setiap hari , defrost setiap 3 bulan

Teknisi lab

12

Nefelometer

Tera Skala McFarland:1x/tahun

Teknisi Alat

13

pHmeter

Uji dengan larutan buffer stándar pH 4.0 dan 7.0 Dilakukan setiap akan digunakan

Triwulan Hasil BTA Inokulasi

Hasil Biakan Suspek, tidak dalam pengobatan Kontaminasi Neg

TW 1

Pos

Total

Follow Up Kontaminasi Neg

Pos

Total

Positif Scanty Negatif Tidak Diketahui Total

TW 2


TW 3


TW 4

Positif Scanty Negatif Tidak Diketahui Total Total

112



109

Lampiran 7. Rekapitulasi Hasil Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis KASUS BARU JML %

PUTUS OBAT JML %

GAGAL JML

%

Lampiran 8. Tabel Pemeliharaan dan Kalibrasi Alat

KAMBUH JML

No. Alat

Pemeliharaan

1

- Cek harian BSC meliputi :

BSC

%

Pastikan bahwa laju aliran udara yang melewati bagian depan yang terbuka adalah 75 linier feet/ menit (22.86 meter/detik) untuk klas I dan 75 sampai 100 linier feet//menit (22.86 sampai 30.48 meter/detik) untuk kabinet klas II

Jumlah pemeriksaan Sensitif dengan 4 macam obat Resisten terhadap Isoniazid (H)

- HEPA filter, tekanan udara : 1x/6 bulan

Rifampicin ( R )

- kecepatan aliran udara memakai anemometer

Ethambutol (E)

Teknisi bersertifikat

- arah aliran udara dengan asap

Streptomycin (S)

- lampu UV : 1x/6 bulan, periksa dengan UV light meter, diganti bila <70%

Monoresisten Isoniazid (H) Rifampicin ( R )

- kebocoran kabinet

Ethambutol (E)

- aliran listrik

Streptomycin (S)

- tes getaran

Multi Drug resistance

- tes kebisingan

H+R H+R+E

2

Sentrifus

H+R+S

- Uji kecepatan dengan tachometer RPM : 1x/6 bulan

Teknisi lab.terlatih

- Tekanan udara : setiap hari

H+R+S+E Kombinasi lain

- Suhu: setiap hari

H+E

3

Pipet

1x/tahun, volumetrik

H+S

4

Autoclave

tekanan, suhu : 1x/tahun

Lab,kalibrasi

Sterilitas: dengan spora strip : 1x/bulan

Teknisi lab.

H+E+S R+E

5

R+S

Hot Air oven / Inspisator

R+E+S E+S

110

Dilakukan oleh

6


Analitycal balance

- Suhu: setiap hari

Lab.kalibrasi

Teknisi lab

- Bersihkan alat ini setelah selesai penyiapan setiap batch media Berat massa /tera: 1x/th

Metrologi


111

Lampiran 9. FORMULIR PEMANTAPAN MUTU INTERNAL Pembuatan Media TB (…………………………………..) No

Tangal Pembuatan

Jenis Media

Jumlah (Volume)

Uji Sterilitas (5%)

Hasil Uji

Keterangan


Paraf

113

114


KEMENTERIAN KESEHATAN RI

Recommend Documents