Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta
Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie
Jednonukleotidové polymorfismy ve vztahu k chronickému zánětlivému střevnímu onemocnění
RIGORÓZNÍ PRÁCE
Brno 2008
Jan Hošek
Na tomto místě bych rád poděkoval studentům – diplomantům 5. ročníku (2006/2007) Farmaceutické fakulty Veterinární a farmaceutické univerzity Brno, kteří v rámci svých diplomových prací určili genotyp velké části vzorků. Jmenovitě se jedná o Janu Svobodovou, Elišku Vechetovou, Michala Kolorze a Petera Loučku.
Dále bych rád poděkoval doc. RNDr. Milanu Bartošovi, Ph.D., svému školiteli, za jeho odborné vedení a RNDr. Ladislavě Bartošové, Ph.D. za její pomoc se získáváním vzorků.
-2-
OBSAH
1
Seznam použitých zkratek ..................................................................................... - 5 -
2
Úvod ...................................................................................................................... - 6 2.1
Crohnova nemoc .................................................................................................... - 7 -
2.2
Patologie Crohnovy choroby ................................................................................. - 8 -
2.3
Ulcerózní kolitida .................................................................................................. - 9 -
2.4
Etiologie IBD......................................................................................................... - 9 Autoimunitní teorie ..................................................................................... - 10 -
2.4.2
Mykobakteriální teorie ................................................................................ - 10 -
2.4.3
Imunodeficientní teorie................................................................................ - 10 -
2.5
2.4.1
Susceptibilní geny IBD........................................................................................ - 11 -
3
Cíle Rigorózní práce ............................................................................................ - 13 -
4
Materiál a metody ................................................................................................ - 14 4.1
Výrobci ................................................................................................................ - 14 -
4.2
Roztoky a media .................................................................................................. - 14 -
4.3
Biologický materiál ............................................................................................. - 15 -
4.4
Pacienti a zdravé kontroly ................................................................................... - 16 -
4.5
Izolace DNA z krve ............................................................................................. - 16 -
4.6
Standardní metody ............................................................................................... - 17 4.6.1
Primery ........................................................................................................ - 18 -
4.6.2
PCR programy a reakční směsi ................................................................... - 18 -
4.7
Genotypování vzorků DNA ................................................................................. - 20 -
4.8
Příprava pozitivních kontrol ................................................................................ - 21 -
4.9
Statistické vyhodnocení ....................................................................................... - 22 -
5
Výsledky .............................................................................................................. - 23 5.1
5.1.1
Varianty v genu NOD2 ................................................................................ - 24 -
5.1.2
Varianty v genu ICAM1............................................................................... - 26 -
5.1.3
Varianty v genu CCR5................................................................................. - 26 -
5.1.4
Komplexní analýza genových variant ......................................................... - 26 -
5.2 6
Určení genotypu vyšetřovaných jedinců ............................................................. - 23 -
Příprava pozitivních kontrol ................................................................................ - 28 Diskuse ................................................................................................................ - 30 -3-
6.1
Genové variace v NOD2 ...................................................................................... - 30 -
6.2
Genové variace v ICAM-1 ................................................................................... - 32 -
6.3
Genové variace v CCR5 ...................................................................................... - 33 -
6.4
Multiplexová analýza .......................................................................................... - 33 -
7
Závěr .................................................................................................................... - 34 -
8
Summary.............................................................................................................. - 35 -
9
Literatura ............................................................................................................. - 36 -
10
Seznam příloh ...................................................................................................... - 40 10.1
Konference vztahující se k práci ......................................................................... - 40 -
10.2
Publikace vztahující se k práci ............................................................................ - 40 -
-4-
1 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ASCA = Anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies (protilátky proti Saccharomyces cesevisiae) CCR5 = CC chemokinový receptor 5 CD = Crohn’s disease (Crohnova choroba) IBD = Inflammatory bowel disease (zánětlivé střevní onemocnění) ICAM 1 = Intercelular adhesive molecule 1 (mezibuněčná adhezivní molekula 1) IL = Interleukin LB = Luria-Bertani (médium) MAP = Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis MDR 1 = Multidrug resistance protein 1 NF-κB = Nuclear factor-kappa B (jaderný faktor kappa B) NOD2 = Nucleotide-binding oligomerization domain 2 (nukleotidy-vázající oligomerizační doména 2) pANCA = Perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies (perinukleární cytoplazmatické protilátky proti neutrofilům) PCR = Polymerase chain reaction (polymerázová řetězová reakce) PCR-REA = PCR-restriction enzyme analysis (PCR po níž následuje štěpení produktů pomocí restriktáz) SNP = Single nucleotide polymophism (jednonukleotidový polymorfismus, jednoduchý nukleotidový polymorfismus) TLR4 = Toll-like receptor 4 UC = Ulcerative colitis (ulcerativní kolitida)
-5-
2 ÚVOD Zánětlivé střevní onemocnění (IBD) je nemoc charakterizovaná chronickým zánětem gastrointestinálního traktu. Rozlišují se dva klinické subtypy, Crohnova choroba (CD) a ulcerózní kolitida (UC), které se od sebe odlišují na základě rozdílných klinickopatologických znaků (Podolsky, 2002; Mathew a Lewis, 2004; Bamis et al., 2005) (Tab. 1). V České republice je prevalence CD 18 až 22 případů na 100 000 obyvatel a UC 40 až 45 případů na 100 000 obyvatel (Lukáš, 2003). Kumulace onemocnění v rodinách, konkordance mezi monozygotními dvojčaty či etnické rozdílnosti podávají důkaz o vlivu genetických faktorů na rozvoj nemoci (Podolsky, 2002; Braat et al., 2005). Tyto dědičné predispozice mají větší význam u CD než u UC (Podolsky, 2002). Z toho, že neexistuje jednoduchá mendelistická dědičnost vyplývá, že do rozvoje nemoci jsou zapojeny produkty více genů (Podolsky, 2002). Na vzniku IBD se podílí environmentální faktory spolu s genetickou predispozicí (Podolsky, 2002). Symptomy se začínají objevovat v každém věku, s vrcholy v brzké a pozdní dospělosti. Přibližně 30 % pacientů tvoří lidé ve věku 10 až 30 let. Ačkoliv je tato nemoc neléčitelná, její nepříznivý vliv na kvalitu života lze ovlivnit adekvátní léčbou (Rampton, 1999, Bamias et al., 2005). Chirurgický zákrok u CD je nutný u 50 až 80 % a u UC pouze u 20 % pacientů (Bamias et al., 2005).
Tab. 1 Tabulka hlavních symptomatologických znaků majoritních forem IBD. Znak
UC
CD
Horečka
Dosti běžná
Běžná
Bolest břicha
Různá
Běžná
Průjem
Velmi běžný
Dosti běžný
Rektální krvácení
Velmi běžné
Dosti běžné
Úbytek na váze
Dosti běžné
Běžné
Známky podvýživy
Dosti běžné
Běžné
Perianální nemoci
Absence
Dosti běžné
Poruchy růstu u dětí a
Občasný
Běžný
Klinické znaky
adolescentů -6-
Tab. 1 – Pokračování Znak
UC
CD
Colon
Výhradně
2/3 pacientů
Ileum
Nikdy
2/3 pacientů
Jejunum
Nikdy
Zřídka
Žaludek a duodenum
Nikdy
Zřídka
Jícen
Nikdy
Zřídka
Distribuce
Kontinuální
Diskontinuální, segmentovaná
Tvorba vředů
Drobné povrchové
Hluboké, se submukózní extenzí
Stenózy nebo píštěle
Vzácně
Běžně
Místo
Další znaky
Převzato z: Podolsky, 2002
2.1 CROHNOVA
NEMOC
Nejčastější klinickou manifestací CD jsou průjmy (z porušené resorpční funkce tlustého nebo tenkého střeva, z nepřiměřené střevní sekrece a zvýšené motility nebo po resekci střev), bolesti břicha, enteroragie a extraintestinální projevy. Vedle toho se může CD manifestovat nespecifickými znaky, jimiž jsou úbytek tělesné hmotnosti, sideropenická anémie a zvýšené teploty. Klinická manifestace CD je závislá na lokalizaci, rozsahu a formě choroby. Nejdříve byla popsána CD v oblasti napojení tenkého střeva na tlusté (ileocekální oblast), resp. na konci tenkého střeva (terminální ileum), podle kterého byly popsány první případy jako zánět konečné části tenkého střeva (ileitis terminalis) (Lukáš, 1998). Postižení ileocékální oblasti je nejčastější formou zánětu (45 %), poslední úsek ilea je zasažen v 25 až 35 % a tračník asi v 30 % případů, jejunoileitida se vyskytuje asi v 5 % případů, méně často je postižena gastroduodenální část (0,5 až 4 %) a zbylé úseky gastrointestinálního traktu. Výskyt projevů CD v ústech a jícnu je velmi vzácný a je popsán u několika málo případů na celém světě (Lukáš, 1998). Průběh a prognóza nemoci záleží nejen na anatomické lokalizaci choroby, ale též na její morfologické formě. Podle toho se rozlišuje perforující typ a neperforující typ Crohnovy choroby. -7-
Podle klinického průběhu je rozeznávána agresivní („maligní“) forma, kterou představuje perforující typ CD s tendencí k častým komplikacím, nutností operací a četnými relapsy a „indolentní“ typ („benigní“) probíhající bez perforace trávící trubice, ale s tendencí ke vzniku stenóz. Tato forma má dobrou prognózu, má relativně malý počet relapsů a nemá tak časté komplikace jako předcházející forma nemoci. Klinický průběh CD ve vyšším věku vykazuje celou řadu odchylek, jako je častější postižení tlustého střeva, zvláště rekta, vyšší incidence u žen a celkově příznivější průběh nemoci (Lukáš, 1998).
2.2 PATOLOGIE CROHNOVY
CHOROBY
Crohnova choroba je popisována jako transmurální (v celé šířce stěny) granulomatózní zánět. Charakteristicky postihuje vždy pouze určitý úsek tenkého či tlustého střeva (tzv. „skip lesions“) a ostatní úseky mohou být zcela zdravé. Z histopatologického hlediska dochází v časném období k iniciální změně v lymfatických folikulech a Peyerových placích, které zduřují a vředovatí. Vznikají tak typické aftoidní vředy obsahující granulomy, jež se ovšem vyskytují dispergované i v jiných vrstvách střevní stěny. V pozdějších stadiích se zánětlivé změny vyvíjejí a rozšiřují. Fisury (větší vředovité útvary až trhliny) bývají pravidelně pravoúhle situovány k dlouhé ose střeva. Sliznice sama je zřetelně hypertrofická a edematózní, nejčastěji ve formě podélných řas (spolu s vředy připomínají koleje). Celá stěna postiženého úseku je mimořádně tlustší a již makroskopicky lze rozlišit edém a skutečnou fibrózu. Dochází tak k extrémnímu zúžení a rigiditě postiženého úseku. Zhruba u 30 % pacientů s CD vznikají píštěle - abnormální kanálky tvořící komunikaci mezi dutinou a jejím povrchem, skrz kterou odchází hnis či jiný obsah dutiny, který může poškozovat jiné orgány a přispívat k šíření zánětu. Vnitřní píštěle mohou propojit jednotlivé kličky střeva. Mohou se však vyvinout (nejčastěji po chirurgickém výkonu či ruptuře abscesu) také píštěle vnější, ze střev na povrch kůže na břiše nebo v okolí řitě. V takových případech pak stolice proniká na povrch těla. Abscesy (chorobné dutiny vzniklé zánětem a vyplněné hnisem) se tvoří u asi 20 % postižených. Většina jich vzniká v okolí řitě, ale některé i v dutině břišní. Střevní kličky postižené zánětem mají tendenci se spojovat, čímž vznikají pruhovité až plošné srůsty mezi jednotlivými střevními úseky a dochází k dalšímu zužování vnitřního průsvitu. Tento proces může vést až k obstrukci (přerušení průchodnosti). Výskyt dysplazie ve sliznici tlustého střeva u nemocných s CD je sice mimořádně významný, ale do značné míry obtížně rozlišitelný od reaktivních zánětlivých změn (Lukáš, 1998). -8-
2.3 ULCERÓZNÍ
KOLITIDA
Ulcerózní kolitida je zánětlivé onemocnění tlustého střeva. Vždy postihuje konečník, proto se jí také říká idiopatická proktokolitida a dále celou plochu tlustého střeva (bez zdravých meziúseků). Zánětlivé místo je od zdravé sliznice vždy ostře odděleno. Podle rozsahu postižení se rozeznává lehký tvar, při kterém je postižen konečník a esovitá klička (u asi 50 % pacientů), středně těžký tvar s postižením i tlustého střeva včetně sestupného tračníku (u 20 % pacientů) a těžký tvar, při kterém je postižen i příční tračník či tračník vzestupný i s oblastí tenkého střeva (zbylých 30 % pacientů). U ulcerózní kolitidy není taková tendence ke vzniku píštělí či abscesů jako v případě CD; většinou je postižena pouze sliznice střevní bez hlubší části střevní stěny. Při každém těžkém průběhu nemoci však dochází k zjizvení střeva, jeho zkrácení a ztrátě funkce (Lukáš, 1998). Pro rozlišení mezi Crohnovou chorobou a ulcerózní kolitidou může sloužit přítomnost sérologických markerů. Např. ASCA (protilátky proti Saccharomyces cerevisiae)/pANCA (perinukleární antineutrofilní cytoplazmatické protilátky) status. Sérologické vyšetření na tyto markery může také pomoci odhalit lokalizaci nemoci. ASCA+/pANCA- status se častěji objevuje u Crohnovy choroby (a lokalizace nemoci v tenkém střevě), ASCA-/pANCA+ status je typičtější pro ulcerózní kolitidu (a lokalizaci nemoci v tlustém střevě) (Yacyshyn et al., 2005).
2.4 ETIOLOGIE IBD
IBD se objevuje jako následek neadekvátní a déletrvající aktivace mukózního imunitního systému, která je vyvolaná přítomností normální střevní mikroflóry. Tato aberantní odpověď je nejpravděpodobněji usnadněna defekty jak funkce střevní epiteliální bariéry, tak i mukózního imunitního systému (Podolsky, 2002). V současné době jsou již známé mnohé z patogenetických mechanismů působících při rozvoji IBD, ale vlastní etiologie stále uniká našemu poznání. V případě CD můžeme na základě obrovského množství informací a hypotéz koncipovaných v posledních třiceti letech rozlišit čtyři okruhy etiopatogenetických faktorů: faktory imunologické, genetické, infekční a faktory zevního prostředí. Existují tři teorie o etiologii CD, které mají mnoho společného. Hlavní rozdíl mezi nimi je ten, že zdůrazňují odlišné aspekty komplexního procesu vzniku nemoci.
-9-
2.4.1 AUTOIMUNITNÍ
TEORIE
Tato teorie vychází ze skutečnosti, že u pacientů trpících CD se vyskytují dysregulované destruktivní imunitní procesy. Jelikož musí být zapojena antigenní stimulace, a protože normální střevní flóra zcela zřejmě ovlivňuje aktivitu slizničního imunitního systému, autoimunitní teorie předpokládá, že iniciující antigeny pocházejí z normální střevní flóry. Dále předpokládá, že v geneticky predisponovaném hostiteli může dysregulované imunitní odpovědi spouštět neznámé environmentální agens. Strategie léčby jsou zaměřeny na potlačení zánětu a imunity (Chamberlin et al., 2006).
2.4.2 MYKOBAKTERIÁLNÍ
TEORIE
Podle této teorie existuje možnost, že u CD je majoritním etiologickým agens Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP). Možná není jediným infekčním agens, ale určitě je nejobvyklejší. Tato teorie přijímá všechno, co je popsáno o imunitní dysregulaci, predisponujících genetických faktorech, imunodeficienci, o roli střevní flóry a poškozené slizniční epiteliální bariéře. MAP se pravděpodobně chová podobně jako M. tuberculosis nebo M. leprae; může tedy narušovat imunitní signalizaci, což je jedna ze strategií mykobakterií v boji o přežití (Chiodini, 1989; Hermon-Taylor a Bull, 2002). Ačkoliv existuje významné zastoupení infekcí MAP mezi pacienty s CD, kritici tvrdí, že MAP infekce a CD koexistují, ale není mezi nimi souvislost. Jiní autoři předpokládají jednoduchý vztah, kdy infekce MAP v geneticky náchylném hostiteli mají za následek rozvinutí Crohnovy choroby (Chamberlin et al., 2006).
2.4.3 IMUNODEFICIENTNÍ
TEORIE
Tato teorie naznačuje, že hlavní roli v patogenezi CD hraje porucha vrozené imunity. Terapie by tedy mohla být zaměřena spíše na posílení vrozené imunity než na její potlačení. Teorie předpokládá, že nepřiměřená, dysregulovaná a destruktivní imunitní odpověď představuje kompenzační procesy v důsledku selhání vrozených mechanizmů ničících invazivní mikroby. Podle této teorie mohou podskupiny střevní flóry uplatnit imunosupresivní efekt na neutrofily, pravděpodobně skrze exotoxiny. Nepředpokládá však existenci specifického invazivního infekčního agens (Chamberlin et al., 2006).
- 10 -
2.5 SUSCEPTIBILNÍ
GENY
IBD
Vazebnou analýzou byl v roce 1996 (Hugot et al., 1996) nalezen lokus IBD1, o kterém se předpokládalo, že je asociován s Crohnovou chorobou. Avšak až později se podařilo identifikovat specifický predisponující gen – NOD2 (Hugot et al., 2001). Protein kódovaný tímto genem patří do skupiny receptorů rozpoznávajících strukturu (pattern recognition receptors) vrozeného imunitního systému, který váže konzervativní struktury přítomné na patogenu (pathogen-associated molecular pattern) (Braat et al., 2005; Zelinkova et al., 2005). Jeho doména bohatá na opakující se sekvence leucinu (leucine-rich repeats) slouží jako intracelulární receptor pro bakteriální muramyl dipeptid a následně spouští imunitní odpověď aktivací nukleárního faktoru NF-κB (Ogura et al., 2001a; Pauleau a Murray, 2003). V genu NOD2 byly popsány tři významné jednonukleotidové polymorfismy (single nucleotide polymophisms) - SNP - přímo uvnitř a nebo v blízkosti leucinových repetic. Dvě z nich mění smysl kodonu [SNP 8 (R702W) a SNP 12 (G908R)] a jedna z nich je inzerční (posunuje čtecí rámec) [SNP 13 (1007fs)] (Hugot et al., 2001; Ogura et al., 2001b). Inzerční mutace SNP 13 je zajímavá tím, že po inzerci cytozinu vzniká nesmyslný kodón, který zkrátí výsledný protein o 33 aminokyselin. Tyto tři mutace představují 81 % mutantních alel (Lesage et al., 2002). Nositelé jedné mutantní alely mají 2 až 4× vyšší riziko propuknutí CD a recesivní homozygoti dokonce 20 až 40× vyšší (Bonen a Cho, 2003). ICAM-1 má klíčovou roli v migraci neutrofilů k místu zánětu a mohl by mít spojitost s některými zánětlivými onemocněními (Matsuzawa et al., 2003). Tento protein se vyskytuje na povrchu aktivovaných endoteliálních buněk, kde usměrňují pohyb lymfocytů. Neutrofily se pohybují podél povrchu endotelu, kde se váží na ICAM-1 exprimovaný endotelovými buňkami. Po vazbě může začít diapedéza a pohyb zánětlivých neutrofilů z kapiláry do tkáně (Springer, 1990) . V kódující oblasti genu ICAM-1 byly identifikovány dva SNP. Vzácnější je mutace G241R, četnější pak K496E (Vora et al., 1994; Özen et al., 2006). Do patogeneze různých zánětlivých onemocnění jsou zapleteny chemokiny a jejich membránové receptory, které plní důležitou roli v usměrnění migrace a aktivace leukocytů (Sallusto et al., 2000). CC chemokiny a jejich receptory, kam patří i CCR5, mají vliv na funkci monocytů, eosinofilů, basofilů a také T-lymfocytů (Herfarth et al., 2001). Herfarth et al. (2001) navrhli hypotézu, že polymorfismus v CCR5 receptoru může participovat na průběhu nemoci a její lokalizaci. Nositelé deleční mutace CCR5∆32 mají méně častou lokalizaci CD v horní části intestinálního traktu a tato mutace by je mohla zároveň chránit před agresivní formou CD. Vyšší výskyt CCR5+ buněk poblíž granulomů CD zaznamenali - 11 -
i Oki et al. (2005). Toto pozorování vede k myšlence, že nefunkčnost receptoru CCR5, způsobená deleční mutací CCR5∆32, vede ke snížené migraci pro-zánětlivých lymfocytů k místu zánětu a tím i ke snížení jeho projevů. Kromě genů popsaných v této práci se na vzniku a průběhu IBD mohou podílet i další známé geny (MDR-1, TLR4, aj.) či dosud neidentifikované geny v IBD susceptibilních lokusech IBD1-9 (Obr. 1).
Obr. 1 Idiogram znázorňující hlavní lokusy a geny s vazbou na IBD identifikované genomovými scany.
Červené sloupečky značí signifikantní vazbu a modré předpokládanou vazbu k IBD. IBD1-9 = IBD susceptibilní lokusy. Převzato a upraveno z: Mathew a Lewis, 2004
- 12 -
3 CÍLE RIGORÓZNÍ PRÁCE V této práci jsem se zaměřil na určení alelových frekvencí pěti vybraných jednonukleotidových polymorfismů (SNP), které jsou v literatuře popisovány jako susceptibilní k IBD. Jedná se o tři SNP v genu NOD2 (R702W, G908R a 1007fs), jeden v genu ICAM-1 (K469E) a jeden v genu CCR5 (CCR5∆32) v malém vzorku české a slovenské populace. Zároveň jsem se snažil najít závislost vzniku nemoci a přítomnosti daných polymorfismů. Dílčím cílem byla příprava PCR-REA pozitivních kontrol, které byly používány k validaci používaných metod.
- 13 -
4 MATERIÁL A METODY 4.1 VÝROBCI
V práci nejsou uváděné plné názvy některých výrobců, ale pouze jejich stručné označení. Z toho důvodu jsou uvedeny kompletní názvy výrobců na tomto místě:
Bio-Rad = Bio-Rad Laboratories, Inc., USA DIFCO = DIFCO™, USA Invitrogen = Invitrogen Corporation, USA NEB = New England Biolabs, Inc., USA Qiagen = QIAGEN GmbH, Německo
4.2 ROZTOKY
A MEDIA
6×GLB: množství
výsledná koncentrace
destilovaná voda
70 ml
-
bromofenolová modř
0,25 g
0,25 % (w/v)
glycerol
30 ml
30 % (v/v)
množství
výsledná koncentrace
destilovaná voda
10 ml
-
LB – Broth (DIFCO)
0,25 g
2,5 % (w/v)
množství
výsledná koncentrace
destilovaná voda
10 ml
-
LB – Broth (DIFCO)
0,25 g
2,5 % (w/v)
ampicilin (100 mg/ml)
10 µl
100 µg/ml
LB bujón:
LB bujón s ampicilinem:
- 14 -
LB agar, na 1 Petriho misku: množství
výsledná koncentrace
destilovaná voda
10 ml
-
LB – agar (DIFCO)
0,40 g
4,0 % (w/v)
množství
výsledná koncentrace
destilovaná voda
10 ml
-
LB- agar (DIFCO)
0,40 g
4,0 % (w/v)
ampicilin (100 mg/ml)
10 µl
100 µg/ml
X – gal (20 mg/ml)
40 µl
80 µg/ml
IPTG (23,8 mg/ml)
10 µl
23,8 µg/ml
množství
výsledná koncentrace
destilovaná voda
965 ml
-
Tryptone
20 g
2 % (w/v)
kvasniční extrakt
5g
0,5 % (w/v)
NaCl
0,50 g
0,05 % (w/v) (8,56 mM)
KCl (250 mM)
10 ml
2,5 mM
glukóza (1 M)
20 ml
20 mM
MgCl2 · 6H2O (2 M)
5 ml
10 mM
LB agar selekční, na 1 Petriho misku:
SOC medium (Sambrook a Russell, 2001):
4.3 BIOLOGICKÝ
MATERIÁL
DNA markery: L100 - Malamité, Česká republika (100bp ladder) Buňky: Escherichia coli TOP 10F´ genotyp: F´ {lacIq Tn10 (TetR)} mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ∆M15 ∆lacΧ74 recA1 araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG
- 15 -
4.4 PACIENTI
A ZDRAVÉ KONTROLY
Do této studie bylo zahrnuto 45 pacientů s CD, 22 pacientů s UC a 59 zdravých (bez diagnostikované CD) nepříbuzných kontrol (Tab. 2). Diagnóza byla pacientům stanovena na Gastroenterologickém oddělení FN Bohunice v Brně (GAEK FN Brno) a na Endoskopickém pracovišti III. interní kliniky FNsP v Bratislavě-Kramároch pomocí klasických vyšetřovacích metod. Jako zdravá kontrola byli použiti dobrovolníci z řad studentů a zaměstnanců Farmaceutické fakulty VFU a jejich známí. Všichni pacienti i kontroly podepsali písemný souhlas s poskytnutím vzorků k této studii. Tab. 2 Charakteristika vyšetřovaných jedinců. Pacienti s CD
Pacienti s UC
Zdravá kontrola
45
22
59
Počet Pohlaví Věk (± S.D.) (udaný v letech)
Muži
29 (64,4 %)
Muži
12 (54,5 %)
Muži
12 (20,3 %)
Ženy
16 (35,6 %)
Ženy
10 (45,5 %)
Ženy
47 (79,7 %)
Muži
33,7 (±10,8)
Muži
42,8 (±13,8)
Muži
24,6 (±1,3)
Ženy
39 (±12,1)
Ženy
43,8 (±13,8)
Ženy
29,3 (±11,4)
Lidská krev: Pro izolaci DNA pacientů a zdravé kontroly byla použita periferní krev. Každému jedinci bylo odebráno cca 8 ml krve do sterilní zkumavky, jako protisrážlivý agens bylo použito roztoku Na-citrátu.
4.5 IZOLACE DNA
Z KRVE
DNA z lidské periferní krve byla izolována komerční soupravou QIAamp DNA Blood Kit (Qiagen) dle výrobního manuálu. Takto izolovaná DNA byla po celou dobu výzkumu skladována v lednici při 4 °C a pro dlouhodobější účely byla část zamražena na -20 °C.
- 16 -
4.6 STANDARDNÍ
METODY
Standardní elektroforéza v agarózovém gelu: 1. na přípravu gelů a jako elektrolyt v elektroforéze byl použit 0,5× TBE pufr (Bio-Rad) 2. koncentrace ethidium bromidu v gelu byla 0,15 µg/ml 3. nanášené vzorky byly barveny 2 µl 6×GLB (gel loading buffer) 4. konstantní napětí v elektroforéze bylo 5 V/cm délky gelu 5. vizualizace produktů na gelu bylo provedeno na transiluminátoru (Spectroline, Spectronics Corp., USA) UV světlem o vlnové délce 312 nm
Komerční klonování: 1. byla použita soupravu TA Cloning® Kit (Invitrogen) dle manuálu verze V (7. dubna 2004) 2. pro transformaci byly použity buňky E. coli TOP10F´ dodané v klonovací soupravě TA Cloning® Kit (Invitrogen) 3. transformaci byla provedena tepelným šokem dle manuálu výrobce
Kultivace buněk E. coli: buňky byly kultivovány v tekutém LB bujónu nebo na LB agaru při teplotě 37 °C 16 hodin transformované buňky byly pěstovány na selekčním LB agaru při teplotě 37 °C 16 hodin
Izolace celkové DNA z E. coli varem: 1. byla odebrána klička (cca. 1 µl) buněčné hmoty, která se resuspendovala v 50 µl destilované vody 2. suspenze byla zahřátá na 80 °C/5 min. 3. zlyzované buňky byly zcentrifugovány 7000 g/2 min. Do následných PCR reakcí byly přidávány 2 µl supernatantu, který obsahoval DNA.
- 17 -
4.6.1 PRIMERY
Sekvence
Detekovaný polymorfismus ICAM1 K469E
NOD2 1007fs
NOD2 G908R
NOD2 R702W
CCR5∆32
primer F
5´- GGA ACC CAT TGC CCG AGC -3´
primer R
5´- GGT GAG GAT TGC ATT AGG TC -3´
primer F
5´- CCT GCA GTC TCT TTA ACT GG -3´
primer R
5´- CTT ACC AGA CTT CCA GGA TG -3´
primer F
5´- AAG TCT GTA ATG TAA AGC CAC -3´
primer R
5´- CCC AGC TCC TCC CTC TTC -3´
primer F
5´- CTT CCT GGC AGG GCT GTT GTC -3´
primer R
5´- CAT GCA CGC TCT TGG CCT CAC -3´
primer F
5´- TGG TGG CTG TGT TTG CGT CTC -3´
primer R
5´- AGC GGC AGG ACC AGC CCC AAG -3´
4.6.2 PCR
PROGRAMY A REAKČNÍ SMĚSI
Veškeré polymerázové řetězové reakce byla prováděna na termocykleru MJ Research PTC-200 (USA).
Program ICAM1 1.
94 °C
5 min.
2.
94 °C
0:20 min.
3.
64 °C
0:50 min.
4.
72 °C
1 min.
6.
72 °C
5 min.
1.
94 °C
1 min.
2.
94 °C
0:20 min.
3.
45 °C
0:20 min.
4.
72 °C
0:30 min.
6.
72 °C
5 min.
30×
Program 1007fs
- 18 -
34×
Program G908R 1.
94 °C
1 min.
2.
94 °C
0:20 min.
3.
60 °C
0:20 min.
4.
72 °C
0:30 min.
6.
72 °C
5 min.
1.
94 °C
1 min.
2.
94 °C
0:20 min.
3.
68 °C
0:20 min.
4.
72 °C
0:30 min.
6.
72 °C
5 min.
1.
94 °C
15 min.
2.
94 °C
0:20 min.
3.
55 °C
0:20 min.
4.
72 °C
1 min.
6.
72 °C
5 min.
34×
Program R702W
34×
Program CCR5
34×
PCR reakční směsi Směs pro programy ICAM1, 1007fs,
Směs pro program CCR5
G908R, R702W Taq PCR Master mix 10× (Qiagen)
10 µl
HotStart Taq PCR Master mix 10× (Qiagen)
10 µl
destilovaná voda
7,8 µl
destilovaná voda
7,8 µl
primer F (0,1 mM)
0,1 µl
primer F (0,1 mM)
0,1 µl
primer R (0,1 mM)
0,1 µl
primer R (0,1 mM)
0,1 µl
2 µl
DNA Σ
2 µl
DNA
20 µl
Σ
- 19 -
20 µl
4.7 GENOTYPOVÁNÍ
VZORKŮ
DNA
Alelová konstituce jednotlivých polymorfizmů byla stanovena metodou PCR-REA (PCR-restriction enzyme analysis). Jednotlivé úseky DNA nesoucí patřičný polymorfismus byly amplifikovány dle PCR programů uvedených v Tab. 3. Výsledné amplikony v PCR reakční směsi byly následně štěpeny restriktázou, která působila v místě výskytu polymorfismu. Produkty amplifikace a štěpení byly detekovány pomocí elektroforézy v agarózovém gelu. V Tab. 3 jsou také uvedeny velikosti štěpných produktů standardní alely i IBD susceptibilní alely. Heterozygoti obsahovali směsi obou typů štěpných produktů.
Tab. 3 Detekované polymorfismy, použité PCR programy a restriktázy. Detekovaný
PCR
polymorfismus
program
ICAM1 K469E
ICAM1
NOD2/CARD15 1007fs NOD2/CARD15 G908R NOD2/CARD15 R702W CCR5∆32
Restriktáza
Délka amplikonů po štěpení restriktázami Standardní alela
IBD susceptibilní alela
BstU I
223 bp
136 bp + 87 bp
1007fs
Nla IV
168 bp
128 bp + 40 bp
G908R
Hha I
380 bp
242 bp + 138 bp
R702W
Msp I
CCR5
-
76 bp + 54 bp + 24 bp + 22 bp 162 bp
130 bp + 24 bp + 22 bp
130 bp
Štěpení restrikční endonukleázou BstU I: sterilní voda
7 µl
pufr NEB2 10× (NEB)
2 µl
PCR reakční směs s amplikony
10 µl
BstU I (10 U/µl) (NEB)
1 µl
Σ
20 µl
- 20 -
inkubace 60 min./60 °C
Štěpení restrikční endonukleázou Nla IV: bovinní sérový albumin 10×
2 µl
pufr NEB4 10× (NEB)
2 µl
PCR reakční směs s amplikony
15 µl
Nla IV (1 U/µl) (NEB)
1 µl
inkubace 60 min./37 °C
20 µl
Σ
Štěpení restrikční endonukleázou Hha I: bovinní sérový albumin 10×
2 µl
pufr NEB4 10× (NEB)
2 µl
PCR reakční směs s amplikony
15 µl
Hha I (20 U/µl) (NEB)
1 µl
inkubace 120 min./37 °C
20 µl
Σ
Štěpení restrikční endonukleázou Msp I: sterilní voda
2µl
pufr NEB2 10× (NEB)
2 µl
PCR reakční směs s amplikony
15 µl
Msp I (20 U/µl) (NEB)
1 µl
Σ
4.8 PŘÍPRAVA
inkubace 60 min./37 °C
20 µl
POZITIVNÍCH KONTROL
V rámci této práce byly připraveny PCR pozitivní kontroly pro obě alely genových polymorfismů ICAM1 K469E, NOD2 G908R a NOD2 1007fs. Kontroly pro NOD2 R702W a CCR5 ∆32 byly připraveny již dříve. V pilotním pokusu byl stanoven genotyp několika jedinců. PCR produkty obou alel (obou homozygotů nebo heterozygota, pokud se nevyskytli homozygoti) byly naklonovány do plasmidového vektoru pCR2.1 (Invitrogen) a tento konstrukt byly transformován do buněk Escherichia coli TOP 10F‘ dle návodu výrobce (Invitrogen, ver. V). U kolonií, které obsahovaly inzert (určeno podle blue-white testem podle doporučení výrobce soupravy), byla provedena testovací PCR-REA reakce, která určila, jakou alelu obsahují. Správnost testu byla - 21 -
ověřena sekvencováním inzertu (MGW, Německo). Otestované kolonie byly pomnoženy a byl z nich izolován čistý plasmid soupravou QIAprep Spin (Qiagen). Tento plasmid posloužil jako pozitivní kontrola do dalších PCR a pro štěpení restriktázami.
4.9 STATISTICKÉ
VYHODNOCENÍ
Tento experiment byl koncipován jako porovnání zdravé a nemocné skupiny dobrovolníků („case-control study“). K statistickému vyhodnocení byl použit χ2 test a kontingenční tabulky. Veškeré zpracování získaných dat bylo provedeno v programu Microsoft® Office Excel 2003.
- 22 -
5 VÝSLEDKY 5.1 URČENÍ
GENOTYPU VYŠETŘOVANÝCH JEDINCŮ
Byl stanoven genotyp pro tři mutace v genu NOD2 (R702W, G908R a 1007fs), mutaci K469E v genu ICAM-1 a deleční mutaci ∆32 v genu pro CCR5 u 45 pacientů s CD, 22 pacientů s UC a 59 zdravých kontrol. Zastoupení jednotlivých genotypů a alelové četnosti jsou shrnuty v Tab. 4. Frekvence všech sledovaných mutací u zdravých jedinců, pacientů s CD a pacientů s UC jsou uvedeny v Grafu 1.
Tab. 4 Výsledné genotypy.
NOD2 R702W R/R genotyp R/W W/W R alelová frekvence W
Zdravá kontrola n = 59
CD pacienti n = 45
UC pacienti n = 22
47 (79,66 %) 12 (20,34 %) 0 (0 %) 0,90 0,10
33 (73,33 %) 12 (26,67 %) 0 (0 %) 0,87 0,13
21 (95,45 %) 1 (4,55 %) 0 (0 %) 0,98 0,02
59 (100 %) 0 (0 %) 0 (0 %) 1 0
42 (93,33 %) 3 (6,67 %) 0 (0 %) 0,97 0,03
22 (100 %) 0 (0 %) 0 (0 %) 1 0
53 (89,83 %) 5 (8,47 %) 1 (1,69 %) 0,94 0,06
30 (66,67 %) 10 (22,22 %) 5 (11,11 %) 0,78 0,22
17 (77,27 %) 5 (22,73 %) 0 (0 %) 0,89 0,11
36 (61,02 %) 21 (35,59 %) 2 (3,39 %) 0,79 0,21
14 (31,11 %) 21 (46,67 %) 10 (22,22 %) 0,54 0,46
7 (31,82 %) 13 (59,09 %) 2 (9,09 %) 0,61 0,39
NOD2 G908R genotyp alelová frekvence
G/G G/R R/R G R
NOD2 1007fs* wt/wt genotyp wt/fs fs/fs wt alelová frekvence fs ICAM-1 K469E K/K genotyp K/E E/E K alelová frekvence E
- 23 -
Tab. 4 - Pokračování Zdravá kontrola n = 59
CD pacienti n = 45
UC pacienti n = 22
41 (69,49 %) 18 (30,51 %) 0 (0 %) 0,85 0,15
34 (75,56 %) 11 (24,44 %) 0 (0 %) 0,88 0,12
15 (68,18 %) 6 (27,27 %) 1 (4,55 %) 0,82 0,18
CCR5 wt/wt wt/∆32 ∆32/ ∆32 wt* alelová frekvence ∆32 * wt = wild-type (standardní alela) genotyp
Graf 1 Alelové četnosti mutantních alel (u polymorfismu NOD2 R702W alela W702, u NOD2 G908R alela R908 a u NOD2 1007fs alela 1007fs) ve skupině pacientů s CD, UC a u zdravých dobrovolníků. 50% **
45% 40% 35% 30% 25%
*
20% 15% 10% 5% 0% R702W
G908R
1007fs
NOD2
kontrola
CD
K469E
del32
ICAM-1
CCR5
UC
Alelová frekvence u CD a UC byla srovnána s frekvencemi alel v kontrolní skupině, hladina významnosti (p) je zde označena hvězdičkami: *, p < 0,05; **, p < 0,005 5.1.1 VARIANTY
V GENU
NOD2
U polymorfismu R702W byla frekvence rizikové alely W702 u zdravé kontroly 10 %, u pacientů s CD 13 % a u pacientů s UC 2 %. Všichni jedinci s IBD susceptibilní alelou byli heterozygoti, homozygotní stav se nevyskytoval. Mezi zdravou kontrolou a pacienty s CD a mezi kontrolou a pacienty s UC nebyl zaznamenán žádný statistický rozdíl. Ale pacienti s UC mají méně častý výskyt této mutace oproti CD (p = 0,0315). - 24 -
Genová varianta s mutací G908R byla nalezena jen u 3 případů CD a to vždy v heterozygotním stavu. Nebyla u ni zaznamenána vazba s CD ani UC. Nejčastější mutací v genu NOD2 byla 1007fs. Četnost této mutace mezi zdravými dobrovolníky byla 6 %, u pacientů s CD 22 % a s UC 11 %. Byla nalezena vazba této mutace k CD (p = 0,0203). Bylo objeveno 5 homozygotů s IBD susceptibilní alelou mezi pacienty s CD a dokonce jeden mezi kontrolou. Žádná ze zkoumaných mutací v genu NOD2 nebyla asociována s UC. Dále byla provedena analýza závislosti počtu mutací v genu NOD2 a projevu nemoci. Nikdo neměl 3 a více mutací v obou alelách, všichni, kdo nesli 2 mutace byli buď homozygoti nebo heterozygoti ve dvou nezávislých lokusech (dvojitý heterozygot). Bez mutace v NOD2 bylo jen 46,7 % pacientů s CD. Zdravá kontrola a pacienti s UC nenesli mutace v NOD2 ve srovnatelném počtu případů, a to kolem 72 %. Jednu mutaci v genu pro NOD2 nesl ve svém genomu podobný počet jedinců ze všech tří sledovaných skupin, a to 25,4 % až 28,9 %. U zdravých jedinců se objevil pouze jeden dvojitý heterozygot a jeden homozygot pro mutaci 1007fs, kteří měli dvě IBD susceptibilní alely genu NOD2. Oproti tomu 6 pacientů s CD bylo dvojitými heterozygoty (5 případů R702W+1007fs a 1 případ G908R+1007fs) a 5 jich bylo homozygoty, opět pouze v mutaci 1007fs. Žádný pacient s UC nenesl 2 mutace v genu NOD2. Pacienti s CD nesli signifikantně více mutací než zdravá kontrola (p = 0,0029) a pacienti s UC méně mutací než pacienti s CD (p = 0,0272). Situaci přesněji vystihuje Graf 2.
Graf 2 Distribuce IBD susceptibilních mutací v genu NOD2 u pacientů ve skupině pacientů s CD, UC a u zdravých dobrovolníků. 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 0
1
2
suma mutací v NOD2 kontrola
- 25 -
CD
UC
5.1.2 VARIANTY
V GENU
ICAM1
Alela E469 genu ICAM-1 měla u zdravých jedinců četnost 21 %, u nemocných CD 46 % a u UC 39 %. Mezi pacienty s UC a zdravou kontrolou se našlo po dvou homozygotech, kdežto u CD to bylo 10 homozygotů. Velmi silná vazba byla prokázána mezi výskytem této mutace a CD (p = 0,0024). Zároveň byl prokázán slabý vztah mezi touto mutací a UC (p < 0,06).
5.1.3 VARIANTY
V GENU
CCR5
U deleční mutace ∆32 v genu CCR5 měly všechny sledované skupiny podobnou alelovou četnost, tj. 12 až 18 %. Nebyl prokázaný vztah mezi ní a CD nebo UC. V celém souboru se vyskytl pouze jeden deleční homozygot a to mezi pacienty s UC.
5.1.4 KOMPLEXNÍ
ANALÝZA GENOVÝCH VARIANT
Ve sledované skupině zdravých dobrovolníků neslo aspoň jednu IBD susceptibilní mutaci 72 % jedinců, u nemocných s CD to bylo 93 % a s UC téměř 82 %. Počet mutací v rámci všech skupin je sumarizován v Grafu 3. Rozdíly mezi skupinami zdravých dobrovolníků a CD pacientů jsou statisticky průkazné (p = 0,0009). U pacientů s UC nebyl pozorován žádný rozdíl oproti kontrolní skupině zdravých dobrovolníků. Byla provedena i analýza počtu mutovaných genů. Jako mutovaný gen byl chápán stav, kdy daný jedinec nesl aspoň jednu IBD susceptibilní mutaci v daném genu (byl homozygot, heterozygot, nebo dvojitý heterozygot v případě genu NOD2). Byly analyzovány 3 geny, takže maximální počet genů s IBD susceptibilní mutací mohl být 3. V Grafu 4 je znázorněno rozložení počtu genů s IBD susceptibilní mutací v rámci sledovaného souboru. Pacienti s CD měli významně více genů s IBD susceptibilní mutací než zdravá kontrola (p = 0,0101).
- 26 -
Graf 3 Celkový počet IBD susceptibilních mutací ve skupině pacientů s CD, UC a u zdravých dobrovolníků. 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 0
1
2
3
4
5
suma mutací kontrola
CD
UC
Graf 4 Celkový počet genů s alespoň jednou mutací ve skupině pacientů s CD, UC a u zdravých dobrovolníků. 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 0
1
2
suma mutovaných genů kontrola
- 27 -
CD
UC
3
5.2 PŘÍPRAVA
POZITIVNÍCH KONTROL
Plasmidy, které měly sloužit jako pozitivní kontroly, byly před prvním experimentem testovány na svou validitu. Výsledky testů (kopírují reálnou situaci při genotypování) jsou znázorněny na Obr. 2.
Obr. 2 PCR-REA analýza pozitivních kontrol.
L100
Standardní alela Š
N
Š
| IBD susceptibilní alela N |
Š
N
Š
N ICAM-1 K469E
L100
Standardní alela | IBD susceptibilní alela N
Š
|
N
Š NOD2 G908R
- 28 -
Obr. 1 - Pokračování L100
Standardní alela | IBD susceptibilní alela Š
N
|
Š
N
NOD2 1007fs
L100 = DNA hmotnostní standard (jednotlivé pruhy po 100 bp => 100, 200, 300, … bp) Š = PCR amplikon po štěpení restriktázou N = PCR amplikon neštěpený restriktázou
- 29 -
6 DISKUSE Crohnova choroba (CD) patří mezi tzv. idiopatické střevní záněty, jejichž etiologie, jak už název naznačuje, zatím není známá. CD je lokalizována izolovaně nebo kombinovaně jak v tenkém, tak i tlustém střevě, a to segmentárně. Chronický zánět postihuje v průběhu onemocnění střevní stěnu transmurálně s typickou, ne vždy však prokazatelnou komponentou nekrotických granulomatózních lézí. Vzácně postihuje i vyšší partie trávící trubice. Má výraznou tendenci k častým klinickým relapsům, eventuálně recidivám. Incidence CD ve světové populaci je mezi 0,08 až 20 novými případy na 100 000 obyvatel za rok, prevalence se pohybuje v širokém rozmezí mezi 35 až 75 případů na 100 000 obyvatel, nejvyšší prevalence je v oblasti Rochestru (Minnesota; USA), kde dosahuje hodnoty 90,5 (Sandler, 1995). Incidence v České republice je 1,7 až 2,0 nové případy na 100 000 obyvatel, prevalence je 18 až 22 případů na 100 000 obyvatel (Lukáš, 1998). V současné době jsou již známé mnohé z patogenetických mechanismů působících při rozvoji CD, o vlastní příčině vzniku se však vedou spory. Mohla by spočívat v autoimunitní odpovědi, přítomnosti infekčního agens (podezřelé jsou mykobakterie, paramyxoviry, Listeria monocytogenes,…) nebo v imunodeficienci. Na základě obrovského množství informací a hypotéz koncipovaných v posledních třiceti letech jsou rozlišovány čtyři okruhy etiopatogenetických faktorů u CD: faktory imunologické, genetické, infekční a faktory zevního prostředí. Výsledky imunogenetických studií svědčí pro to, že nutnou podmínkou rozvoje a chronického průběhu zánětu je geneticky determinovaná odchylka v imunitní reaktibilitě. Dalšími faktory, které mohou sehrát významnou roli při rozvoji onemocnění, jsou např. dieta, kojení a perinatální infekce, extraintestinální projevy, kombinovaná orální kontracepce, kouření cigaret, nesteroidní antiflogistika, pracovní zařazení, psychické a sociální faktory.
6.1 GENOVÉ
VARIACE V
NOD2
V genu NOD2 odhalila Lesage et al. (2002) 67 sekvenčních variant. V této práci byly studovány tři hlavní varianty, které jsou nejčastěji asociovány s CD (Braat et al., 2005; Özen et al., 2006; Pauleau a Murray, 2003). U první z nich, mutace R702W v genu NOD2, byla nalezena poměrně vysoká četnost alely W702 jak u kontrolní skupiny (10,2 %), tak u pacientů - 30 -
s CD (13,3 %). Naopak pacienti s UC měli velmi nízkou frekvenci této IBD susceptibilní alely (2,3 %). Tato hodnota je sice signifikantně nižší než u pacientů s CD, ale to může být dáno malým vzorkem pacientů s UC a tím i zkreslenou statistikou. Podobně vysokou frekvenci mutantní alely (17,6 %) zaznamenali Alvarez-Lobos et al. (2005) u španělských pacientů, Laghi et al. (2005) u italských pacientů, kde se tato mutace vyskytovala s četností 10 %. V celoevropské studii (Lesage et al., 2002) byla frekvence stanovena na 11 % u nemocných Crohnovou chorobou. Pozoruhodným momentem je nepřítomnost recesivních homozygotů, které bychom při podobné alelové frekvenci očekávali. Tento fakt si zatím neumíme vysvětlit, ale předpokládáme, že je to dáno pouze malou velikostí našeho vzorku. Zarážející je pouze vysoká četnost alely s IBD susceptibilní mutací u zdravých dobrovolníků. I přestože byla dříve prokázána (Lesage et al., 2002) asociace této mutace s CD, není vyloučeno, že bude mít pouze malý význam v etiopatogenezi onemocnění. Proto by se mohla v běžné populaci vyskytovat v takové míře. Propuknutí nemoci by pak záviselo na přítomnosti dalších faktorů, a to jak zevního prostředí, tak i genetických. Jako velmi vzácná varianta se jeví mutace G908R genu NOD2. Byly nalezeny jen 3 alely R908 u pacientů s CD, což odpovídá alelové četnosti 3,3 %. Takto nízká frekvence není v Evropě nikterak vzácná. Ve Španělsku je 4,7 % (Alvarez-Lobos et al., 2005), v Itálii 4,6 % (Laghi et al., 2005) a v Turecku dokonce 2,1 % (Özen et al., 2006). Celoevropský průměr je však 6 % v populaci s CD (Lesage et al., 2002). Mutace jednoznačně asociovaná s CD je 1007fs. Jako jediná mutace v genu NOD2 byla nalezena v homozygotním stavu. U pacientů s CD byla frekvence dokonce 22,2 %, což je nejvyšší hodnota zjištěná v Evropě a odpovídá dvojnásobku evropského průměru (11 %) (Lesage et al., 2002). I u kontrolní skupiny, kde byla četnost 5,9 %, je tato hodnota velmi vysoká. Dokonce byl nalezen jeden jedinec z kontrolní skupiny, který byl homozygot pro mutantní alelu 1007fs. Nebyl sice diagnostikován jako CD ani UC, ale projevují se u něj podobné příznaky – průjmy, špatný příjem potravy a dokonce byl podroben operaci tlustého střeva. Původně byl u něj diagnostikován dráždivý tračník, ale je možné, že byla špatně určena diagnóza. Vzhledem k přetrvávajícím potížím navštívila pacientka v průběhu studie specializované vyšetření na gastroenterologii; na nové výsledky čekáme. Celková analýza mutací v genu NOD2 prokázala, že pacienti s CD daleko častěji nesou 2 mutace než zdraví dobrovolníci (24,4 % u CD vs. 3,4 % u zdravé kontroly). Alelové četnosti u kontrolní skupiny se shodují s výsledky autorů Braat et al. (2005), kteří označili za nositele dvou rizikových alel 2,2 % zdravých jedinců. Naopak žádnou mutaci v NOD2 mělo v naší skupině 46,7 % pacientů s CD a 71,2 % dobrovolníků. Braat et al. (2005) nalezli pouze - 31 -
7,4 % pacientů s CD, kteří byli dvojití heterozygoti nebo homozygoti pro rizikové alely. Naopak Lesage et al. (2002) popsali, že přibližně 50 % CD pacientů nese aspoň jednu IBD susceptibilní mutaci, z toho 17 % pacientů nese 2 mutace. Tyto hodnoty odpovídají i našim výsledkům, kdy 53,3 % pacientů s CD neslo minimálně jednu alelu s IBD susceptibilní mutací a z toho 24,4 % pacientů alely dvě. V kontrolní zdravé skupině byl objeven jediný dvojitý heterozygot. U tohoto dvojitého heterozygota se domníváme, že měl obě mutace na jedné alele, tudíž měli jednu kompletně funkční. Naopak u nemocných s dvojitou heterozygotní konstitucí se domníváme, že nesli vždy jednu mutaci na jedné alele. Z toho důvodu neměl žádný gen plně funkční a projevil se u něj CD.
6.2 GENOVÉ
VARIACE V
ICAM-1
Jedním z cílů této práce bylo určit susceptibilní alelu genového polymorfismu K469E v genu ICAM-1 v české a slovenské populaci. Výsledky, kterých bylo dosaženo, ukazují na vliv alely E469 na vznik CD. Souvislost IBD s touto alelou dokládají i další evropské studie (Braun et al., 2001; Papa et al., 2004). U turecké populace nebyla zaznamenána asociace polymorfismu K469E s IBD, ale je patrná vyšší frekvence alely E469 u pacientů s CD (Özen et al., 2006). Na druhou stranu v japonské populaci (Matsuzawa et al. 2003) byla zjištěna u pacientů s Crohnovou chorobou signifikantně vyšší frekvence alely K469 (65,2 % u nemocných, 49,5 % u kontrol). Kupodivu obdobný výsledek měla i studie na Britských pacientech, kterou provedli Low et al. (2004). V obou případech se jedná o ostrovní státy, takže lze usuzovat, že z důvodu relativně vyšší izolace se zde ustanovila rozdílná HardyWeinbergova rovnováha než na kontinentu. Podle této studie je frekvence alely E469 u zdravé populace 21,2 %, oproti 45,6 % u CD a 38,6 % u UC. Výskyt homozygotního stavu E/E u zdravých dobrovolníků je 3,4 %, což je velmi malá četnost. Braun et al. (2001) v Německu našel tento genotyp u 9,5 % zdravé populace a Papa et al. (2004) v Itálii u 11,8 %. Podobné genotypové složení zdravé populace zjistili i Özen et al. (2006) v Turecku, kde se genotyp E/E vyskytoval u 2,8 % jedinců. Ale heterozygotní stav K/E byl nalezen u 63,2 % zdravé populace ve srovnání s 35,6 % v české a slovenské populaci. Toto rozdílné zastoupení genotypů u relativně příbuzných populací nedovedeme vysvětlit. U pacientů s IBD (CD a UC dohromady) byla zjištěna frekvence E/E 17,9 % (CD 22,2 % a UC 9,1 %). Tyto výsledky odpovídají pracím Brauna et al. (2001)
- 32 -
a Papa et al. (2004), kteří stanovili genotyp u 26 % pacientů s CD a 21,2 % s UC, respektive u 24,9 % pacientů s IBD. U polymorfismu K462E genu ICAM-1 byla pozorována silná asociace alely E469 k CD. Výrazně vyšší frekvence této alely byla nalezena také u pacientů s UC, ale byla statisticky neprůkazná. To potvrzuje skutečnost, že mutace v ICAM-1 mají vliv na rozvoj řady chronických zánětlivých onemocnění (Vora et al., 1994; Low et al., 2004) včetně IBD. I naše pozorování potvrzují tuto domněnku. Část zdravých dobrovolníků, kteří nesli ve svém genomu alelu E469, trpí některou z chronických zánětlivých onemocnění, např. astma, atopický exém či revmatoidní artritida.
6.3 GENOVÉ
VARIACE V
CCR5
V této práci měly všechny tři zkoumané skupiny podobnou četnost alely CCR5∆32 (12,2 až 18,2 %). V práci Herfartha et al. (2001) byla frekvence této alely u zdravých dobrovolníků a pacientů s CD také srovnatelná (9,2 %, respektive 9,8 %). Četnost této alely je sice vyšší, ale odpovídá Hardy-Weinbergově rovnováze. Celkově je frekvence alely CCR5∆32 v české a slovenské populaci 14,7 %. Tato hodnota přibližně odpovídá severo-jižnímu gradiendu rozšíření této alely v Evropě (Novembre et al., 2005).
6.4 MULTIPLEXOVÁ
ANALÝZA
U pacientů s CD byl zaznamenán signifikantně vyšší počet mutantních genů (p = 0,0101) a zároveň s tím i vyšší počet IBD susceptibilních mutací (p = 0,0009). Tato skutečnost potvrzuje domněnku, že CD je polygenní onemocnění a uplatňuje se zde efekt genové dávky („gene-dosage effect“). U pacientů s UC nebyl statistiky prokázán vyšší počet mutací či rizikových alel. Z Grafů 2 a 3 je ale patrný trend zvyšování se jejich počtu. UC pacienti leží svým počtem mutací a rizikových alel mezi CD a zdravou kontrolou. To potvrzuje názor, že genetické predispozice (alespoň u polymorfismů, které jsme sledovali v této práci) hrají u UC menší roli než u CD.
- 33 -
7 ZÁVĚR V této práci se podařilo potvrdit, že mutace v genech NOD2 a ICAM1 participují na propuknutí Crohnovy choroby. Deleční mutace v genu kódující CCR5 nemá vliv na vznik Crohnovy choroby. Zároveň se potvrdilo, že genetické predispozice hrají menší roli u ulcerózní kolitidy než u Crohnovy choroby.
- 34 -
8 SUMMARY Title: Single-nucleotide polymorphisms associated to chronic inflammatory bowel disease
Background and Aim: Involvement of genetic factors in aetiology of the inflammatory bowel disease has been known for a long time. Aim of this work was to investigate the prevalence of polymorphisms in NOD2, ICAM-1 and CCR5 genes in Czech and Slovak patients with IBD in comparison with healthy controls. Method: The frequency of well-known mutations (R702W, G908W and 1007fs in NOD2 gene; K469E in ICAM-1 gene and ∆32 in CCR5 gene) involved in inflammatory bowel disease was tested on 45 patients with the Crohn’s disease and 22 patients with the ulcerative colitis. The allele frequency of these mutations was determined and genotype-phenotype correlation was specified. Isolated DNA was genotyped and allele frequency was counted and statistically verified. Results: Significant differences between healthy control group and Crohn’s disease patients were observed in mutation 1007fs of NOD2 gene (p = 0.0203). We also associated allele E469 of ICAM-1 gene with the Crohn’s disease (p = 0.0024). No significant association between other alleles and Crohn’s disease was found, and no gene variation was linked to the ulcerative colitis. The number of mutations and mutated genes was higher among patients with the Crohn’s disease than among patients with the ulcerative colitis. Conclusion: Our results support previous findings about participations of mutations of NOD2 and ICAM-1 genes in the inflammatory bowel disease. We confirmed that both the Crohn’s disease and the ulcerative colitis are polygene diseases with gene-dosage effect. This observation strengthens the opinion that genetic factors play more important role in the Crohn’s disease than in the ulcerative colitis.
- 35 -
9 LITERATURA 1. Alvarez-Lobos, M., Arostegui, J. I., Sans, M., Tassies, D., Plaza, S., Delgado, S., Lacy, A. M., Pique, J. M., Yagüe, J., Panés, J. 2005. Crohn’s disease patients carrying Nod2/CARD15 gene variants have an increased and early need for first surgency due to stricturing disease and higher rate of surgical recurrence. Ann. Surg. 242: 693-700. 2. Bamias, G., Nyce, M. R., De La Rue, S. A., Cominelli, F. 2005. New concepts in the pathophysiology of inflammatory bowel disease. Ann. Intern. Med. 143: 895-904. 3. Bonen, D. K., Cho, J. H. 2003. The genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 124: 521-536. 4. Braat, H., Stokkers, P., Hommes, T., Cohl, D., Vogels, E., Pronk, I., Spek, A., van Kampen, A., van Deventer, S., Peppelenbosch, M., Hommes, D. 2005. Consequence of functional Nod2 and Tlr4 mutations on gene transcription in Crohn’s disease patients. J. Mol. Med. 83: 601-609. 5. Braun, C., Zahn, R., Martin, K., Albert, E., Folwaczny, C. 2001. Polymorphisms on the ICAM-1 gene are associated with inflammatory bowel disease, regardless of the pANCA status. Clin. Immunol. 101: 357-360. 6. Chamberlin, W.M., Naser, S. A. 2006. Integrating theories of the etiology of Crohn‘s disease on the etiology of CD: Questioning the hypotheses. Med. Sci. Monit. 12: RA2733. 7. Chiodini, R. J. 1989. Crohn's disease and the mycobacterioses: a review and comparison of two disease entities. Clin. Microbiol. Rev. 2: 90-117. 8. Eckmann, L., Karin, M. 2005. NOD2 and Crohn’s Disease: Loss or Gain of Function?. Immunity. 22: 661–667. 9. Herfarth, H., Pollok-Kopp, B., Göke, M., Press, A., Oppermann, M. 2001. Polymorphism of CC chemokine receptors CCR2 and CCR5 in Crohn’s disease. Immunol. Lett. 77: 113-117. 10. Hermon-Taylor, J., Bull, T. 2002. Crohn's disease caused by Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis: a public health tragedy whose resolution is long overdue. J. Med. Microbiol. 51: 3-6. 11. Hugot, J. P., Laurent-Pulg, P., Gower-Rousseau, C., Olson, J. M., Lee, J. C., Beaugerie, L., Naom, I., Dupas, J. L., van Gossum, A., Groupe d’Etude Thérapeutique des Affections Inflammatoires Digestives, Orholm, M., Bonalti-Pellie, C., Weissenbach, J., Mathew, C. G., Lennard-Jones, J. E., Cortot, A., Colombel, J. - 36 -
F., Thomas, G. 1996. Mapping of susceptibility locus for Crohn’s disease on chromosome 16. Nature. 379: 821-823. 12. Hugot, J. P., Chamaillard, M., Zouali, H., Lesage, S., Cezard, J. P., Belaiche, J., Almer, S., Tysk, C., O'Morain, C. A., Gassull, M., Binder, V., Finkel, Y., Cortot, A., Modigliani, R., Laurent-Puig, P., Gower-Rousseau, C., Macry, J., Colombel, J. F., Sahbatou, M., Thomas, G. 2001. Association of NOD2 leucine-rich repeat variants with susceptibility to Crohn's disease. Nature. 411: 599-603. 13. Laghi, L., Costa, S., Saibeni, S., Bianchi, P., Omodei, P., Carrara, A., Spina, L., Contessini Avesani, E., Vecchi, M., de Franchiss, R., Malesci, A. 2005. Carriage of CARD15 variants and smoking as risk factors for resective surgery in patients with Crohn’s ileal disease. Aliment. Pharmacol. Ther. 22: 557-564. 14. Lesage, S., Zouali, H., Cézard, J.-P. and the EPWG-IBD group, Colombel, J.-F. and the EPIMAD group, Belaiche, J. and the GETAID group, Almer, S., Tysk, C., O’Morain, C., Gassull, M., Binder, V., Finkel, Y., Modigliani, R., Gower-Rousseau, C., Macry, J., Merlin, F., Chamaillard, M., Jannot, A.-S., Thomas, G., Hugot, J.-P. 2002. CARD15/NOD2 mutational analysis and genotype-phenotype correlation in 612 patients with inflammatory bowel disease. Am. J. Hum. Genet. 70: 845-857. 15. Low, J. H., Williams, F. A., Yang, X., Cullen, S., Colley, J., Ling, K. L., Armuzzi, A., Ahmad, T., Neville, M. J., Dechairo, B. M., Walton, R., Lench, N. J., Jewell, D. P. 2004. Inflammatory bowel disease is linked to 19p13 and associated with ICAM-1. Inflamm. Bowel Dis. 10: 173-181. 16. Lukáš M. 1998. Idiopatické střevní záněty: nejistoty, současné znalosti a klinický přístup. Galén, Praha. 17. Lukáš, M. 2003. Kolitida granulomatózní, p. 294. In L. Houdek (ed.), Lékařské repetitorium. Galén, Praha. 18. Marek J. 1998. Farmakoterapie vnitřních nemocí. (2. přeprac. a rozš. vyd.), Grada, Praha. 19. Mathew, C. G., Lewis, C. M. 2004. Genetics of inflammatory bowel disease: progress and prospects. Hum. Mol. Genet. 13: R161–R168. 20. Matsuzawa, J., Sugimura, K., Matsuda, Y., Takazoe, M., Ishizuka, T., Mochizuki, T., Seki, S. S., Yoneyama, O., Bannnai, H., Suzuki, K., Honma, T., Asakura, H. 2003. Association between K469E allele of intercellular adhesion molecule 1 gene and inflammatory bowel disease in a Japanese populatio. Gut. 52: 75-78. 21. Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. 2005. The geographic spread of the CCR5 D32 HIV-resistance allele. PLoS Biol. 3: e339. - 37 -
22. Ogura, Y., Inohara, N., Benito, A., Chen, F. F., Yamaoka, S., Núñez, G. 2001a. Nod2, a Nod1/Apaf-1 family member that is restricted to monocytes and activates NF-κB. J. Biol. Chem. 276: 4812-4818. 23. Ogura, Y., Bonen, D. K., Inohara, N., Nicolae, D. L., Chen, F. F., Ramos, R., Britton, H., Moran, T., Karaliuskas, R., Duerr, R. H., Achkar, J. P., Brant, S. R., Bayless, T. M., Kirschner, B. S., Hanauer, S. B., Nunez, G., Cho, J. H. 2001b. A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn's disease. Nature. 411: 603606. 24. Oki, M., Ohtani, H., Kinouchi, Y., Sato, E., Nakamura, S., Matsumoto, T., Nagura, H., Yoshie, O., Shimosegawa, T. 2005. Accumulation of CCR5+ T cells around RANTES+ granulomas in Crohn’s disease: a pivotal site of Th1-shifted immune response?. Lab. Invest. 85: 137-145. 25. Özen, S. C., Dağli, Ü., Kiliç, M. Y., Törüner, M., Çelik, Y., Özkan, M., Soykan, I., Çetinkaya, H., Ülker, A., Özden, A., Bozdayi, A. M. 2006. NOD2/CARD15, NOD1/CARD4, and ICAM-1 gene polymorphisms in Turkish patients with inflammatory bowel disease. J. Gastroenterol. 41: 304-310. 26. Papa, A., Pola, R., Flex, A., Danese, S., Armuzzi, A., Gaetani, E., Guidi, L., De Vitis, I., Urgesi, R., Grillo, A., Serricchio, M., Proia, A. S., Fedeli, G., Gasbarrini, G., Pola, P., Gasbarrini, A. 2004. Prevalence of the K469E polymorphism of intercellular adhesion molecule 1 gene in Italian pationts with inflammatory bowel disease. Dig. Liver. Dis. 36:528-532. 27. Pauleau, A. L., Murray, P. J. 2003. Role of Nod2 in the response of macrophages to Toll-Like receptor agonists. Mol. Cell. Biol. 23: 7531-7539. 28. Podolsky, D. K. 2002. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 347: 417-429. 29. Rampton, D. S. 1999. Management of Crohn’s disease. BMJ. 319: 1480-1485. 30. Sallusto, F., Mackay, C. R., Lanzavecchia, A. 2000. The role of chemokine receptors in primary, effector, and memory immune responses. Annu Rev Immunol. 18: 593-620. 31. Sambrook, J., Russell, D. W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual. 3th ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 32. Sandler R.S. 1995. Epidemiology of inflammatory bowel disease. In Targan S.R., Shanahan F. (ed.), Inflammatory bowel disease. From bench to bedside, Williams & Wilkins, Baltimore. 33. Springer, T. A. 1990. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346: 425-434.
- 38 -
34. Vora, D. K., Rosenbloom, C. L., Beaudet, A. L., Cottingham, R. W. 1994. Polymorphisms and linkage analysis for ICAM-1 and the selectin gene cluster. Genomics. 21: 473-477. 35. Yacyshyn, B. R., Schievella, A., Sewell, K. L., Tami, J. A. 2005. Gene polymorphisms and serological markers of patients with active Crohn's disease in a clinical trial of antisense to ICAM-1. Clin. Exp. Immunol. 141: 141-147. 36. Zelinkova, Z., Stokkers, P., Hommes, D. W. 2005. NOD2 in Crohn’s disease – loss or gain of funtion mutation? Neth. J. Med. 63: 286-287.
- 39 -
10 SEZNAM PŘÍLOH 1. Konference vztahující se k práci 2. Publikace vztahující se k práci
10.1 KONFERENCE
VZTAHUJÍCÍ SE K PRÁCI
1. VII. Mezioborové setkání mladých biologů, biochemiků a chemiků (poster) •
Hošek, J., Bartošová, L., Svobodová, J., Vechetová, E., Kolorz, M., Loučka, P., Bartoš, M. 2007. Frekvence vybraných genových polymorfismů asociovaných se zánětlivým střevním onemocněním – studie pacientů z ČR a SR. Chem. Listy. 101: 438–439.
2. III. Česko-slovenská konference klinické farmakologie (přednáška – Dr. Bartošová) •
Bartošová, L., Hošek, J., Kolorz, M., Strnadová, V., Bartoš, M. 2007. Genotypizace
pacientů s nespecifickými střevními záněty - možnosti včasné
diagnostiky a individualizace farmakoterapie. Sborník abstrakt III. česko-slovenské konference Klinické farmakologie; ISBN 978-80-7368-333-7. 3. 8th Congress of the European Association for Clinical Pharmacology and Therapeutics (poster) •
Bartošová, L., Strnadová, V., Svobodová, J., Vechetová, E., Kolorz, M., Loučka, P., Hošek, J., Bartoš, M. 2007. Gene polymorphisms associated with inflammatory bowel disease – study of patients from Czech and Slovak Republics. Basic Clinical Pharmacol. and Toxicol. 101 (Suppl.1): 200.
10.2 PUBLIKACE
VZTAHUJÍCÍ SE K PRÁCI
1. Hošek, J., Bartošová, L., Gregor, P., Kolorz, M., Dítě, P., Bátovský, M., Bartoš, M. 2008. Frequency of representative single nucleotide polymorphisms associated with inflammatory bowel disease in the Czech Republic and Slovak Republic. Folia Biol.Prague. 3. (in press)
- 40 -
