J. Sains & Teknologi, Agustus 2016, Vol.16 No.2 : 101 – 106
ISSN 1411-4674
POTENSI BAKTERI PENGHASIL EKSOPOLISAKARIDA ASAL RHIZOSPHER TANAMAN KENTANG UNTUK MEMPRODUKSI EKSOPOLISAKARIDA The Potensial of Producing Bacteria Exopolysaccharide from Rhizosphere Potato for Produce Exopolysaccharide Mu'minah1*, Baharuddin2, Hazarin Subair3, Fahruddin4 Baso Darwisah5 *Corresponding Author:
[email protected] Jurusan Budidaya Tanaman Perkebunan, Politeknik Pertanian Negeri Pangkep, 90655 Indonesia 2 Pusat Penelitian Bioteknologi, Universitas Hasanuddin Makassar, 90245 Indonesia 3 Jurusan Ilmu Tanah, Fakultas Pertanian, Universitas Hasanuddin Makassar, 90245 Indonesia 4 Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Hasanuddin Makassar, 90245 Indonesia 5 Jurusan Budidaya Tanaman Perkebunan, Politeknik Pertanian Negeri Pangkep, 90655 Indonesia
1
ABSTRAK Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji bakteri yang terdapat di rhizosfer tanaman kentang untuk menghasilkan eksopolisakarida. Sampel tanah diambil dari tiga kelerengan yang berbeda yaitu 15%, 25% dan 35% , pada ketinggian > 1500 m di atas permukaan laut di Malino, Sulawesi Selatan. Sampel tanah serial diencerkan dan dikultur pada media ATCC No. 14 untuk memilih bakteri EPSTerdapat 34 isolat bakteri EPS yang berhasil diisolasi dari rhisosfer tanaman kentang dan dikelompokkan ke dalam bakteri gram negatif. Namun, hanya 6 isolat membentuk lendir tebal atau berlendir ketika dikultur pada media MacConcey. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat 6 isolate yang mempunyai potensi menghasilkan EPS yang terbaik dalam kisaran 0.10 to 1.07 mg/mg protein. Isolat tersebut berasal dari kelerengan 25 % dan 35 %. Kata Kunci: Eksopolisakarida, Bakteri Rizosfer, Kentang, Mac Concay
ABTRACT This study aims to assess the bacteria found in the rhizosphere of potato plants to produce exopolysaccharide. Soil samples were taken from three different gradients of 15%, 25% and 35%, at an altitude > 1500 m above sea level in Malino, South Sulawesi. Soil samples were serial diluted and cultured on media ATCC No. 14 to choose EPS- There are 34 bacterial isolates EPS was isolated from potato plants rhizosphere and classified into gram-negative bacteria. However, only 6 isolates formed a thick mucus or slimy when cultured on media Mac Concey. The results showed that there were 6 isolates that have the potential to produce the best EPS in the range of 0:10 to 1:07 mg / mg protein. The isolates came from a slope of 25% and 35%. Keywords: Exopolysaccharide, Bacteria, Rhizosphere, Potato, Mac Concey
piruvat, suksinat dan fosfat. Struktur dan komposisi eksopolisakarida yang dihasilkan oleh bakteri tergantung pada beberapa faktor lingkungan seperti media, sumber karbon dan nitrogen, sistem fisiologis bakteri dan kondisi fermentasi (Bueno & Garcia-cruz, 2006; Sutherland, 2001). Beberapa bakteri penghasil eksopolisakarida telah dilaporkan adalah Pseudomonas aeruginosa, Erwinia,
PENDAHULUAN Di dalam tanah, bakteri menghasilkan eksopolisakarida untuk melindungi sel dari kekeringan atau melekat pada substrat untuk memenuhi kebutuhan nutrisinya. Eksopolisakarida adalah polimer dengan berat molekul tinggi yang terdiri dari monosakarida dan beberapa bahan non-karbohidrat seperti asetat,
101
Mu'minah
ISSN 1411-4674
Ralstonia, dan Azotobacter vinelandii (Lynch and Elliot, 1983; Sunil et.al, 2013). Di dalam tanah bakteri berasosiasi dengan bahan organik, selain bahan organik eksopolisakarida bakteri mendapat perhatian yang cukup tinggi untuk meningkatkan kemantapan aggregat tanah. Eksopolisakarida dihasilkan oleh bakteri Gram negatif dan Gram positif. Lebih lanjut Wingender et al. (1999) mengatakan bahwa eksopolisakarida sering ditemukan di sekeliling struktur membran sel bagian luar bakteri, baik pada eukariota maupun pada prokariota. Struktur fisik eksopolisakarida berupa kapsul sampai dengan dinding sel slime masif yang terbentuk di luar membran sel bakteri (Steinmetz et al. 1995). Mikroorganisme tanah berperan terhadap pembentukan, kemantapan, dan degradasi agregat telah diteliti oleh (Drazkiewicz 1994; Amellal et al. 1998; CaesarTonThat & Cochran 2001). Akumulasi sel dan pembentukan koloni bakteri yang melapisi butir partikel primer dan sekunder (agregat) memiliki pengaruh penting dalam struktur tanah (Tisdall 1994). Mekanisme yang terjadi adalah dalam kondisi alami, bakteri tanah menghasilkan senyawa organik berupa eksopolisakarida (EPS). Eksopolisakarida bakteri dapat berinteraksi dengan partikel tanah melalui pembentukan jembatan polimer sehingga memiliki peran dalam pembentukan mikroagregat dan yang lebih utama adalah kemampuan eksopolisakarida tersebut dalam memantapkan agregat tanah. Lynch & Elliot (1983) berpendapat bahwa jumlah partikel tanah yang tererosi tergantung pada jenis dan populasi mikroorganisme yang ditambahkan.
sekitar 15%, 25% dan 35% pada rizosfer kentang. Tanah diambil dari kedalaman 0-20 cm. Sebanyak satu gram sampel tanah disuspensikan ke dalam larutan garam fisiologis (0,85%) lalu dibuat seri pengenceran sampai 10 -6 dan diinkubasi pada media ATCC No. 14 (American Type Culture Colection), (per liter medium) : 0,2 g KH2PO4; 0,8 g K2HPO4; 0,2 g MgSO4.7H2O; 0,1 g CaSO4.2H2O; 2,0 mg FeCl3; Na2MoO4.2H2O (jejak); 0,5 g Yast ekstrasi; 20 g sukrosa; dan 15 g bakto bahwa dengan pH 7,2 dan selama tujuh hari pada suhu 28oC (Remel 2005, Santi et.al, 2008). setiap bakteri yang diisolasi, dikulturkan di media Macconcay yaitu medium selektif untuk bakteri negatif gram, (per liter media): 17 g pepton,, 3 g protease, 10 g laktosa, 1, 0,5 g garam empedu, 5 g Natrium Clorida, 0,03 g Netral -merah, 0,001 g kristal violet, 13,5 g Bacto agar dan air selama tujuh hari 28oC. Bakteri yang menghasilkan lendir tebal (slime) kemudian dipilih dan dimurnikan dengan melesat pada empat kuadran untuk mendapatkan koloni tunggal. (Santi et.al, 2008). Screening Isolat bakteri EPS Scerening dari bakteri yang berpotensi menghasilkan EPS dilakukan dengan memilih berat kering terbaik EPS yang dihasilkan oleh bakteri dalam medium cair. Produksi bakteri penghasil EPS dilakukan dengan menggunakan metode Emtiazi et.al, (2004); 0.8 g KH PO ; 3,2 g K HPO ; 0.4 g 2
4
2
4
MgSO4.7H2O; 0,2 g NaCl; 0,02 g FeSo4; 0,03 g Na MoO .2H O; 00.5 g CaCO3; 20 2 4 2 g sukrosa; (pH 7.2)(Emtiazi et.al, 2004, Remel, 2005). Bakteri yang membentuk lendir tebal (slime) pada media ATCC No. 14, kemudian ditumbuhkan dalam medium cair 30 ml. untuk menghasilkan EPS pada 28 0C selama tiga hari. Bakteri penghasil EPS dipanen dengan menambahkan 500 ml 1mM EDTA, dan kemudian disentrifugasi pada 9000 g selama 10 menit. Supernatan diambil dan
BAHAN DAN METODE Isolasi dan Pemurnian Bakteri penghasil EPS Isolasi bakteri memproduksi EPS, tanah diambil berasal dari kelerengan 102
Mu'minah
ISSN 1411-4674
kemudian menambahkan aseton dingin rasio 1: 1. Setelah sentrifugasi pada 15.000 g selama 30 menit, EPS dimurnikan dan dikeringkan pada 60 ° C selama 24 jam.
masing P1, P2, P3) dari Malino, Kecamatan Tinggi Kecamatan Moncong, Gowa, Sulawesi Selatan, Indonesia. Bakteri tersebut ditumbuhkan pada media Mac Concey yang dipilih menghasilkan EPS yang ditandai dengan adanya slime yang tebal dan semua bakteri dikelompokkan dalam bakteri gram negatif (Mu'minah et.al, 2015) dan bakteri tersebut diukur bobot kering EPS pada setiap isolat yang ditemukan (Tabel 1) . Setelah dilakukan screening lebih lanjut, hasil penelitian menunjukkan bahwa Enam isolat (disebut sebagai P1-6, P2-34, P3-46, P3-49, P3-50 dan P3-60) Isolat code P3-50 menghasilkan EPS yang terbaik yaitu sekitar 1,072 mg berat kering/mg protein, disusul isolat kode P2-34 dan P3-46.(Gambar 1). Tiga bakteri potensil untuk menghasilkan EPS yaitun P2-34, P346- dan P3-50 (Gambar 1) dengan berat kering 0,10-1,07 mg / mg protein, lebih tinggi dibandingkan dengan isolat lainnya.
Optimasi produksi EPS Untuk penelitian optimalisasi produksi EPS beberapa parameter yang dilakukan seperti masa inkubasi (1-3 hari), sumber karbon (sukrosa, glukosa dan manitol) dengan berbagai konsentrasi (1, 2 dan 3%). Sebanyak 6 sampel bakteri d dalam 100 ml media produksi (g / l): pepton 10 g, Yeast ekstrasi 3 gram, 5 gram NaCl dan 20 g sukrosa. Medium disterilkan pada 121 0 C selama 20 menit, pH diatur menjadi 6,5 - 7. Dan diinkubasi pada shaker pada suhu kamar selama 72 jam (Sunil et.al, 2013). HASIL Screnning bakteri memproduksi EPS gram-negatif Terdapat 34 isolat diperoleh dari risosper tanaman kentang pada kelerengan 15%, 25% dan 35% (masing-
Tabel 1. Bobot kering eksopolisakarida pada media produksi eksopolisakarida selama 72 jam inkubasi No
Kode Isolat
No
Kode Isolat
P2 (67) P1 (7) P3 (70) P3 (53) P3 (42) P3 (68) P2 ((20) P2 (65) P2 (56) P2 (32) P2 (27) P2 (21) P2 (33) P3 (49)
Bobot Kering EPS (mg/ml) 0,87 0,45 1,67 0,30 0,10 0,45 0,45 0,45 0,50 0,43 0,48 0,28 0,49 0,91
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
P2 (16) P3 (51) P2 (66) P2 (34) P3 (50) P2 (37) P3 (69) P1 (6) P2 (58) P3 (41) P3 (46) P3 (38) P3 (39) P2 (57)
Bobot Kering EPS (mg/ml) 0,40 0,30 0,22 1,30 1,67 1,79 2,24 1,04 0,54 1,52 1,17 1,70 0,8 1,75
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
P3 ((72)
0,32
32
P2 (60)
1,96
16 17
P3 (48) P3 (73)
0,33 0,57
33 34
P1 (4) P2 (15)
0.76 0,64
103
EPS Production (mg/mg protein)
Mu'minah
ISSN 1411-4674
1.500 1.000 0.500 0.000 P1 P3 P3 P2 P3 P3 6 49 63 34 46 50
Gambar 2. Diameter eksopolisakarida pada sumber karbon Sukrosa
Gambar 1. Produksi eksopolisakarida bakteri EPS
2015). Bakteri membutuhkan energi untuk menghasilkan eksopolisakarida. Oleh karena itu, kehadiran sumber karbon dalam media pertumbuhan memiliki fungsi sebagai komponen pembentuk sel Juga bisa berfungsi sebagai sumber energi yang dibutuhkan untuk sintesis dan ekskresi eksopolisakarida (Povolo dan Casella, 2004). Struktur dan komposisi eksopolisakarida yang dihasilkan oleh bakteri tergantung pada beberapa faktor lingkungan seperti media, karbon dan sumber nitrogen, sistem fisiologi bakteri (aerobik atau anaerobik), dan kondisi fermentasi (pH, suhu, konsentrasi oksigen). Secara umum, eksopolisakarida yang dapat diperoleh di optimum pada pH 7, suhu 30-37 oC menggunakan sukrosa atau glukosa sebagai sumber karbon (Sutherland 2001b;. Duta et al, 2004; Bueno & Garcia-Cruz 2006) .
Optimalisasi pertumbuhan setiap bakteri Terdapat enam bakteri yang ditumbuhkan pada tiga sumber karbon yaitu sukrosa, glukosa dan manitol selama tiga hari ditumbuhkan pada medium pertumbuhan produksi EPS dan dilakukan pengukuran diameter EPS (Gambar 2). Sumber karbon yang terbaik untuk produksi EPS adalah sukrosa. Setiap bakteri menghasilkan diameter EPS yang berbeda-beda dan isolat bakteri P3-50 mempunyai diameter EPS yang lebih tinggi pada medium sumber karbon sukrosa dibandingkan dengan isolat lainnya, lalu diikuti dengan isolat bakteri lainnya yaitu : bernama P234, P3-46 dan P1-6, P3-49 dan P3-63. PEMBAHASAN Screnning bakteri memproduksi EPS gram-negatif Tiga bakteri potensil untuk menghasilkan EPS yaitun P2-34, P346dan P3-50 dengan berat kering 0,10-1,07 mg / mg protein, lebih tinggi dibandingkan dengan isolat lainnya. Bakteri yang memproduksi EPS dapat berasal dari gram negatif dan gram positif, lanjut Wingender et al (1999) mengatakan bahwa eksopolisakarida sering ditemukan di sekitar bagian luar struktur membran sel, baik pada eukariota dan prokariota. Struktur fisik eksopolisakarida bentuk kapsul dengan dinding sel lendir besar yang terdapat pada bagian di luar membran sel bakteri (Steinmetz et al. 1995). Jumlah dan komposisi EPS ini sangat bervariasi tergantung pada spesies (Mu'minah et.al,
Optimalisasi pertumbuhan setiap bakteri Isolat bakteri penghasil EPS di rizosfir tanaman kentang banyak tersedia dalam matriks tanah, dimana dalam matriks tanah populasi bakteri sangat banyak dan memproduksi eksudat metabolik senyawa karbon dan dikenal sebagai tempat biota tanah untuk tumbuh. Seperti yang dikemukakan oleh Bertin et.al, (2003) eksudat akar mengandung beberapa senyawa organik dengan berat molekul rendah seperti gula sederhana dan polisakarida (arabinosa, laktosa, glukosa, maltosa, mannose), oligosakarida, asam amino (arginin, 104
Mu'minah
ISSN 1411-4674
parangin, aspartat, sistein, sistin, glutamin), asam organik (asetat, askorbat, acidandmalic benzoat) dan senyawa fenolik. Senyawa ini dapat meningkatkan pertumbuhan dan perkembangan mikroorganisme tanah.
soil. Brazilian J. Microbiol. 37: 296301. Caesar-TonThat TC, Cochran VL. 2001 Role of a saprophytic Basidiomycete soil fungus in aggregate stabilization. In, D.E Stott, R.H. Mohtar & G.C. Steinhardt (eds.). Sustaining the Global Farm. p. 575-579. Duta FP, Da Costa ACA, Lopes LMDA, Barros A, Servulo EFC, de Franca FP. 2004. Effect of process parameters on production of a biopolymer by Rhizobium sp. Appl. Biochem. Biotechnol. 114 (1): 639652. Drazkiewicz M. 1994. Distribution of microorganisms in soil aggregates: effect of aggregate size. Folia Microbiol 39(4): 276-282. Emtiazi G, Ethemadifar Z, Habibi MH. 2004. Production of Extracellular Polymer in Azotobacter and Biosorption of Metal by Exopolymer. African J. Biotechnol. 3(6): 330-333 Lynch JM, Elliot LF. 1983. Aggregate stabilization of volcanic ash and soil during microbial degradation of straw. Appl. Environ. Microbiol. 45(4): 1398-1401. Mu’minah, Baharuddin, Subair. H, Fahruddin. 2015. Isolation and Screening Bacterial Exopolysaccharide (EPS) from Potato Rhizosphere in Highland and The Potential as a Producer Indole Acetic Acid (IAA). J. Procedia Food Science Elsevier ( 3 ) : 74 – 81 Povolo S, Casella S. 2004. Poly-3hydroxybutyrate has an important role for the survival of Rhizobium tropici under starvation. Annals Microbiol. 54(3): 307-316. Remel (2005). Microbiology Products: Instructions for use of MacConkey Agar. http://www.remelinc.com. [28 Jun 2013] Santi. L.P, Ai Dariah, dan Goenadi DH. 2008. Peningkatan kemantapan agregat tanah mineral oleh bakteri
KESIMPULAN Tiga isolat yang memiliki nilai potensial untuk menghasilkan eksopolisakarida setiap P3 (50), P2 (34), dan P3 (46), isolat kode P3 (50) menghasilkan eksopolisakarida dalam jumlah tinggi 1.072mg / mg protein dibandingkan dengan isolat lainnya . Dari tiga sumber karbon diuji sumber karbon sukrosa memproduksi eksopolisakarida terbaik. Dilihat dari asal sampel bakteri, berasal dari lereng P2 (25%) dan P3 (35%). UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih kepada Kementrian Riset, Teknologi dan Pendidikan tinggi Direktorat Jenderal Sumber Daya Ilmu Pengetahuan, Teknologi dan Pendidikan Tinggi yang telah memberikan beasiswa PKPI (Sandwich-Like) ke Jepang untuk publikasi jurnal Internasional dan penyusunan Disertasi program S3 dan juga kepada Professor Mika Nomura sebagai pembimbing di Laboratorium Molecular Plant Nutrition, Agriculture Faculty, Kagawa University, Japan. DAFTAR PUSTAKA Amellal N, Burtin G, Bartoli F, Heulin T. 1998. Colonization of wheat roots by an exopolysaccharideproducing Pantoea agglomerans strain and its effect on rhizosphere soil aggregation. Appl. Environ. Microbiol. 64(10): 3740- 3747. Bertin C, Yang X, Weston LA. 2003. The Role of Root Exudates and Allelochemicals in the Rhizosphere. Plant and Soil. 256: 67–83. Bueno SM, Garcia-cruz CH. 2006. Optimization of polysaccharides production by bacteria isolated from 105
Mu'minah
ISSN 1411-4674
penghasil eksopolisakarida. J. Plantation Tower : 76 (2), 93 – 103 Steinmetz I, Rohde M, Brenneke B. 1995. Purification and characterization of exopolysaccharide of Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei. Infection Immunity. 63(10): 39593965. Subba Rao, N. S. 1982. Biofertilizer in Agriculture. Oxford and IBH Publishing Co. New Delhi. Bombai. 186 pp. Sunil T. Pawar, Amarsinh A. Bhosale, Trishala B. Gawade and Tejswini R. Nale. 2013. Isolation, Screening and optimalization of exopolysacharide producing bacterium from saline soil. J. Microbiology and Biotechnology Research :3 (3) : 24-31
Sutherland IW. 2001. Microbial polysaccharides from Gram negative bacteria. Int .Dairy. J. 11(9): 663– 674. Sutherland IW. 2001b. Microbial polysaccharides from Gram negative bacteria. Int .Dairy. J. 11(9): 663–674. Tisdall JM. 1994. Possible role of soil microorganisms in aggregation in soils. Plant Soil. 159 (1):115-121. Wingender J, Neu TR, Flemming HC. 1999. What are Bacterial Extracellular Polymeric Substances? In. Microbial Extracellular Polymeric Substances: characterization, structure and function. Wingender J, Neu TR, Flemming HC (Eds.). SpringerVerlag, Berlin. pp. 1-15.
106
