In vitro őssejtkezelés hatásmechanizmusának és a metabolikus memória szerepének vizsgálata oxidatív stressz okozta sejtkárosodásban Doktori értekezés
Cselenyák Attila Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető:
Dr. Lacza Zsombor, tudományos főmunkatárs
Hivatalos bírálók:
Dr. Pongrácz Judit, egyetemi docens Dr. Mócsai Attila, egyetemi docens
Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Tretter László, egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Papp Zoltán, egyetemi tanár Dr. Cervenak László, tudományos főmunkatárs
Budapest 2011
Tartalomjegyzék: Tartalomjegyzék: .............................................................................................................. 2 Rövidítések jegyzéke ........................................................................................................ 4 1. Irodalmi áttekintés ........................................................................................................ 6 1.1. Kardiovaszkuláris betegségek ............................................................................... 6 1.2. Diabétesz mellitusz ................................................................................................ 7 1.3. Szabad gyökök; az oxidatív és nitrozatív stressz fogalma .................................... 8 1.3.1. Reaktív oxigén származékok .......................................................................... 8 1.3.2. Reaktív nitrogén származékok...................................................................... 10 1.3.3. Szabad gyökök elleni védekezés .................................................................. 11 1.3.4. Szabad gyökök szerepe az élettani folyamatokban ...................................... 12 1.3.5. Az oxidatív/nitrozatív stressz sejtkárosító hatásai ........................................ 13 1.4. Oxidatív stressz iszkémiás szívbetegségben........................................................ 14 1.4.1. Iszkémia/reperfúzió okozta károsodások kezelése ....................................... 16 1.4.1.1. Konvencionális kezelési módszerek ...................................................... 17 1.4.1.2. Sejtalapú terápiák .................................................................................. 18 1.4.4.2.1. Őssejtek és differenciálódott testi sejtek a sejtalapú terápiában ..... 18 1.4.4.2.2. Hatásmechanizmus ......................................................................... 21 1.4.4.2.3. Sejtalapú terápiák alkalmazása a klinikai gyakorlatban ................. 23 1.5. Oxidatív stressz szerepe a diabétesz kialakulásában ........................................... 25 1.5.1. Hiperglikémia indukálta károsodások mechanizmusa ................................. 25 1.5.2. Metabolikus memória ................................................................................... 28 1.5.3. Új terápiás lehetőségek diabéteszben ........................................................... 30 2. Célkitűzések ............................................................................................................... 33 3. Módszerek .................................................................................................................. 34 3.1. In vitro iszkémia modell ...................................................................................... 34 3.1.1. Felhasznált sejttípusok.................................................................................. 34 3.1.2. A kísérletekben használt fluoreszcens festékek............................................ 35 3.1.3. Iszkémia modell beállítása............................................................................ 36 3.1.4. Iszkémia modell............................................................................................ 38
2
3.1.5. Iszkémia modell hozzáadott mezenhimális őssejtekkel ............................... 38 3.1.6. Sejtfúzió vizsgálata OGD során és normál körülmények között, valamint nanocsövek megfigyelése ....................................................................................... 39 3.1.7. Iszkémia modell hozzáadott H9c2 sejtekkel ................................................ 40 3.1.8. LDH enzimszint meghatározása ................................................................... 40 3.1.9. MDA meghatározása .................................................................................... 42 3.1.10. F16-tal kezelt, hozzáadott H9c2 sejtek alkalmazása .................................. 43 3.1.11. A konfokális képek kiértékelése ................................................................. 43 3.2. In vitro hiperglikémia modell .............................................................................. 44 3.2.1. Felhasznált sejttípusok.................................................................................. 44 3.2.2. Oxidatív/nitrozatív stressz kimutatására használt fluoreszcens festékek ..... 44 3.2.3. Kísérleti protokoll ......................................................................................... 45 3.3 Alkalmazott statisztikai módszerek ...................................................................... 46 4. Eredmények ................................................................................................................ 47 4.1. In vitro iszkémia modell ...................................................................................... 47 4.1.1. Megfigyelések OGD alatt ............................................................................. 47 4.1.2. Iszkémián átesett H9c2 kardiomioblasztok és mezenhimális őssejtek együtttenyésztése .............................................................................................................. 47 4.1.3. Iszkémia modell H9c2 hozzáadott sejtekkel ................................................ 53 4.1.4. LDH enzim szint meghatározása OGD után ................................................ 54 4.1.5. MDA szint meghatározása OGD után .......................................................... 55 4.1.6. F16-tal kezelt, hozzáadott H9c2 sejtek alkalmazása .................................... 56 4.2. In vitro hiperglikémia modell .............................................................................. 57 4.2.1. Metabolikus memória ................................................................................... 57 5. Megbeszélés ............................................................................................................... 59 6. Megállapítások ........................................................................................................... 66 7. Összefoglalás .............................................................................................................. 68 8. Summary..................................................................................................................... 69 9. Irodalomjegyzék ......................................................................................................... 70 10. Publikációs lista ........................................................................................................ 95 11. Köszönetnyilvánítás ................................................................................................. 97 12. Mellékletek ............................................................................................................... 98
3
Rövidítések jegyzéke 8-OH-G
8-hidroxi-2’-deoxiguanozin
AGE
késői glikációs végtermék
ALA
α-liponsav
APO
apocynin
ASC
zsírszövet eredetű őssejtek
BH4
tetrahidro-biopterin
BMMC
csontvelői mononukleáris sejtek
BMSC
csontvelői eredetű őssejtek
cGMP
ciklikus guanin-monofoszfát
CSC
szív eredetű őssejtek
CVD
kardiovaszkuláris betegség
DCCT
Diabetes Control and Complications Trial
DM
diabétesz mellitusz
DMEM
Dulbecco’s modified Eagle medium
EPC
endoteliális progenitor sejt
ESC
embrionális őssejt
FAD
flavin adenin dinukleotid
FMN
flavin mononukleotid
G-CSF
granulocita kolóniastimuláló faktor
GSH
glutation
HMEC
humán mikrovaszkuláris endotél sejtek
H2O2
hidrogén peroxid
HOCl
hipoklórossav
HUVEC
humán köldökzsinór véna endotél sejtek
IHD
iszkémiás szívbetegség
iPSC
indukált pluripotens őssejt
IR
iszkémia/reperfúzió
L˙
lipid gyökök
LDH
laktát-dehidrogenáz
LOO˙
peroxil gyök 4
LVEF
bal kamrai ejekciós frakció
MDA
malondialdehid
MGO
metilglioxál
MI
miokardiális infarktus
MPT pórus
mitokondriális permeabilitás tranzíciós pórus
MRI
mágneses magrezonancia képalkotás
MSC
mezenhimális őssejtek
NAD
nikotinamid-adenin-dinukleotid
NADPH
nikotinamid-adenin-dinukleotid foszfát
NO˙
nitrogén monoxid
NO·
nitrogén dioxid
NOS
nitrogén-oxid szintáz
O2
molekuláris oxigén
O·
szuperoxid anion
OGD
oxigén- és glükóz megvonás
OH˙
hidroxil gyök
ONOO
peroxinitrit
PARP
poli(ADP-ribóz)-polimeráz
PET
pozitron emissziós tomográfia
RO˙
alkoxil gyök
ROS
reaktív oxigén származékok
RNS
reaktív nitrogén származékok
SOD
szuperoxid diszmutáz
SP
„side population” sejtek
SPECT
single photon emission computed tomography
T1DM
1-es típusú diabétesz mellitusz
T2DM
2-es típusú diabétesz mellitusz
UCP-2
uncoupling protein 2
UKPDS
U.K Prospective Diabetes Study
XDH
xantin-dehidrogenáz
XO
xantin-oxidáz
5
1. Irodalmi áttekintés 1.1. Kardiovaszkuláris betegségek A kardiovaszkuláris betegségek (CVD) a szívet és az érrendszert érintő kórképek összessége. A legfontosabbak közé a szívkoszorúér-betegség, a stroke és a perifériás vaszkuláris betegségek tartoznak. A kardiovaszkuláris betegségek 2008-as adatok szerint közel 4,3 millió ember halálát okozták Európában, minden második halálesetért a CVD volt a felelős (1. ábra). A CVD-n belül az esetek felében az iszkémiás szívbetegség (IHD), az esetek harmadában pedig a stroke okozza a halált. A CVD 75 éves kor alatt a leggyakoribb halálok mind a nők (43%), mind a férfiak (38%) körében Európában (1. ábra). A halálozási arány regionális eloszlást mutat, Közép- és Kelet-Európában magasabb Észak-, Dél- vagy Nyugat-Európához viszonyítva. Az utóbbi három régióban a CVD incidenciája, mortalitása csökkenő tendenciát mutat, azonban Közép- és Kelet-Európában ezen mutatók stagnálnak vagy növekednek. A CVD rizikótényezői közé sorolható a magas vérnyomás, a magas koleszterinszint, a cukorbetegség, a dohányzás és az elhízás (a mozgás hiánya és az egészségtelen táplálkozás következtében is) [1].
1. ábra Főbb halálozási okok százalékos eloszlása férfiak és nők körében (2008-as európai adatok) [1]
6
1.2. Diabétesz mellitusz A diabétesz mellitusz (DM) kialakulásának oka a szervezet abszolút vagy relatív inzulin hiánya, vagyis a szervezet nem képes inzulin termelésre, vagy képes ugyan, de inzulinnal szembeni rezisztencia áll fenn. A DM fő típusait az 1. táblázat tartalmazza. Az értekezésben részletesen az 1-es és 2-es típusú diabétesz mellitusszal foglalkozom. 1. táblázat A diabétesz mellitusz főbb típusai [2] Főbb típusok 1-es típusú diabétesz mellitusz 2-es típusú diabétesz Egyéb speciális diabétesztípusok
Alcsoportok - immun eredetű diabétesz - idiopátiás diabétesz -
A β-sejt-funkció genetikai defektusa Az inzulin hatékonyságának genetikai defektusa Az exokrin pankreász betegsége Endokrinopátiák Gyógyszerek vagy kémia anyagok által indukált Fertőzéses eredetű Az immun-mediált diabétesz ritka formái Diabétesszel járó egyéb genetikai szindrómák
Gesztációs diabétesz
Az 1-es típusú DM (T1DM) vagy inzulinfüggő DM lehet autoimmun eredetű, amikor a szervezet a pankreász inzulintermelő β-sejtjeit támadja meg, vagy lehet idiopátiás, amikor autoimmun markerek nem mutathatóak ki. A T1DM az összes diabéteszes eset 5-10%-át teszi ki, ami körülbelül 11-22 millió embert jelent világszerte, a diagnosztizált T1DM-es betegek 50-60%-a 16-18 év alatti [3]. Incidenciája világszerte folyamatosan növekszik, az elmúlt tíz évben évi 3%-os emelkedés volt tapasztalható [46]. A 2-es típusú DM (T2DM) vagy nem inzulinfüggő DM relatív inzulinhiánnyal járó állapot, vagyis a termelődött inzulinnal szemben rezisztencia áll fenn. A T2DM prevalenciája és incidenciája fokozatosan nő a fejlett- és a fejlődő országokban. 2000ben 171 millióra becsülték, 2004-ben 220 millió embert érintett a T2DM világszerte, 2025-re elérheti a 380 milliót is [7-9]. A valós számok azonban még magasabbak lehetnek, mivel a T2DM akár 7 évvel a diagnózis előtt kialakulhat [10]. A T2DM kialakulása összefüggésbe hozható az életkorral, a túlsúly és az elhízottság mértékével, a fizikai inaktivitással és a dohányzással.
7
A DM akut szövődményei (hipoglikémia vagy diabéteszes ketoacidózis) a diabétesz okozta halálozások 6%-át teszik ki, a fennmaradó több mint 90% a diabétesz késői, krónikus szövődményeire, a nefro-, retino- és neuropátiára, valamint a mikro- és makroangiopátiára vezethető vissza [8].
1.3. Szabad gyökök; az oxidatív és nitrozatív stressz fogalma Szabad gyöknek nevezzük azokat az atom vagy molekula származékokat, melyek
egy
vagy
több
párosítatlan
elektront
tartalmaznak
valamelyik
molekulapályájukon, és képesek hosszabb-rövidebb időtartamú önálló létezésre. Fiziológiás körülmények között a szabadgyök-képződés, illetve az enzimatikus és nem enzimatikus antioxidánsok egyensúlyban vannak, így a szervezet védett a szabad gyökök káros hatásaitól. Kóros körülmények között ez az egyensúly felborul a szabad gyökök túltermelődése vagy az antioxidáns védelem sérülésének következményeként, és oxidatív/nitrozatív stressz alakul ki. A legutóbbi évek kutatásai bebizonyították, hogy a szabad gyökök fontos szerepet játszanak többek közt a szívelégtelenség, az ateroszklerózis, az iszkémiás szívbetegség, a magas vérnyomás, a diabétesz, a tumoros megbetegedések vagy az autoimmun kórképek és szövődményeinek kialakulásában [1120].
1.3.1. Reaktív oxigén származékok A reaktív oxigén származékok (ROS) alatt a molekuláris O2-ből kialakult reakcióképes termékeket értjük. Ide sorolhatjuk a szuperoxid aniont (O· ), a hidroxil gyököt (OH˙) vagy az alkoxil gyököt (RO˙). Vannak nem szabad gyök természetű reaktív oxigén származékok, például a hidrogén-peroxid (H2O2) és a hipoklórossav (HOCl) A O·
a molekuláris O2-ből képződik egy elektron felvételével. A O· -ot
tekintjük az elsődleges ROS-nak, ha más molekulákkal közvetlenül illetve enzim- vagy fém mediálta reakcióban reagál, akkor alakulnak ki a másodlagos ROS-ok [21]. Normál körülmények között a O· fő forrása a mitokondriális elektron transzport lánc I-es és IIIas komplexe, ahol a szivárgó elektronok miatt az O2 1-3%-a alakul át O· -dá [22]. A szuperoxid-termelődés azonban szoros kontroll alatt áll, és a mitokondriumon belül
8
marad. Számos enzim is képes O· termelésre, mint például a xantin-oxidáz (XO). Az enzim normál körülmények között dehidrogenázként (XDH) működik, és elektronokat ad át NAD+-ra. A purin katabolizmus során a hipoxantinÆxantin, és xantinÆhúgysav átalakulást katalizálja. A xantin és a húgysav fontos antioxidánsok és szabadgyök fogók. Azonban iszkémia/reperfúzió vagy szepszis során az enzim aktív helye oxidálódik, oxidázként működik és O· -ot termel [23]. A XO enzim mellett a NADH/NADPH oxidáz rendszer a szuperoxid másik fő forrása. Ez az enzim nagy mennyiségben van jelen a fagocitákban, fontos szerepet játszik a mikrobák elleni védekezésben. (2. ábra/1) A O·
vízzel reakcióba lépve H2O2-dá alakul, ezt a folyamatot katalizálja a
szuperoxid-diszmutáz enzim (SOD) (2. ábra/2). A H2O2 stabilabb, mint a O· és képes a membránon átdiffundálni, ezért sok reakcióban lényegében a O· hatását közvetíti. Fe2+ vagy Cu+ a H2O2-ot egy elektron leadása mellett a reakcióképes OH˙-ké redukálják, ezt a reakciót nevezik Fenton-reakciónak. A Fenton-reakciót a Haber-Weiss reakció előzi meg, amikor is a O· redukálja a Fe3+ vagy a Cu2+ ionokat (2. ábra/5).
9
2. áb bra A ROS képződés lehetséges l ú útvonalai, a lipid peroxidáció folyaamata, valam mint a különnböző antioxxidáns rendsszerek (glutation, C-vitaamin, E-vitaamin, α-lipoonsav) szerepe az oxidaatív stresszbeen [24]
1.3.22. Reaktív nitrogén származék s kok A reaktívv nitrogén származékook (RNS) alatt a a nitroogén-monoxxidot (NO) és az abbóól kialakult termékekett értjük. Az NO gáz haalmazállapootú molekulla, féléletideeje 610 másodperc. m I vivo L-aargininből keletkezik In k a nitrogén-oxid szintáz (NOS) enzzimek hatássára. A reeakció két lépésben játszódik le, a Nω-OH-L-argin nin köztiteermék
10
keletkezése mellett: az L-arginin guanidincsoportján oxidáció történik, az NO mellett a másik végtermék az L-citrullin. (3. ábra) A reakcióban öt kofaktor vesz részt: a hem, a NADPH, a FAD, az FMN és a BH4.
HN
HO
NH2 NH
H 2O
O2
NH
NADPH H2 N
O OH
L-arginin
H 2O
O2
NADPH H2 N O
OH
Nω-OH-L-arginin
NH2
O
NH2
N
NH
NO
+ H2 N O
OH
L-citrullin
3. ábra Az NO keletkezése in vivo L-argininből
A NOS enzimek dimerként fordulnak elő, három izoformája ismert, ezek közül kettő konstitutív, míg egy indukálható enzim. Az nNOS (NOS-1) és az eNOS (NOS-3) konstitutívan expresszálódnak, mindkettő enzim működéséhez Ca2+/kalmodulinfüggő komplex szükséges, melynek következtében rövid ideig kis mennyiségű NO képződik. Az iNOS (NOS-2) aktivitása nem Ca2+-függő, az enzim időben elhúzódó, nagy mennyiségű NO felszabadulást generál. Különböző stimulusok, mint citokinek vagy bakteriális LPS indukálhatják az enzimet. Az NO-szintáz L-arginin vagy tetrahidrobiopterin hiánya esetén mint NADPH-oxidáz működik, NO helyett O· -ot termel [2527]. Az NO és O· reakciója során létrejövő peroxinitrit (ONOO ) sokkal aktívabb oxidáló ágens, mint az NO vagy a O· , így az NO hatása a legtöbb esetben a ONOO toxikus hatásaként jelentkezik. A reaktív nitrogén származékok toxikus hatását nitrozatív stressznek hívjuk, DNS fragmentációt, lipid peroxidációt, fehérje nitrozilációt és nitrációt idézhet elő.
1.3.3. Szabad gyökök elleni védekezés A szabad gyökök elleni védekezésben fontos szerepet töltenek be az enzimatikus és a nem enzimatikus antioxidánsok. Az enzimatikus antioxidánsok közé tartozik a szuperoxid-diszmutáz (SOD), a glutation peroxidáz (GPx) és a kataláz. A nem
11
enzimatikus antioxidánsok közé soroljuk az aszkorbinsavat (C-vitamin), az α-tokoferolt (E-vitamin), a glutationt (GSH) és a flavonoidokat. Az SOD a O· és H2O reakcióját katalizálva H2O2-t állít elő. A H2O2-t a GPx vagy a kataláz vízzé redukálja. A GPx reakció esetében a glutation glutation-diszulfiddá (GSSG) oxidálódik. A GSSG redukcióját GSH-vá a glutation-reduktáz katalizálja NADPH felhasználásával, melynek fő forrása a pentóz–foszfát útvonal. A kataláz a H2O2-ot alakítja át vízzé és O2-né (2. ábra/3). A nem enzimatikus antioxidánsok egyik legfontosabb képviselője a glutation, amely egy tripeptid, glutamátból, ciszteinből és glicinből épül fel. Jelentős mennyiségben található meg a sejtek citoszóljában (1-11 mM), a sejtmagban (3-15 mM) és a mitokondriumban (5-11 mM). Szerepe többrétű az oxidatív stressz elleni védelemben: a GSH számos enzim kofaktora, amelyek az oxidatív stressz elleni védelemben vesznek részt (glutation-peroxidáz); a GSH aminosavak plazmamembránon keresztüli transzportját segíti; regenerálja a C-vitamint és az E-vitamint, a legfontosabb antioxidánsokat (2. ábra/3, 9-13) [28].
1.3.4. Szabad gyökök szerepe az élettani folyamatokban A kis vagy közepes koncentrációban termelt szabad gyökök fontos szerepet töltenek be különböző fiziológiai folyamatokban, mint például jelátvitel, értónus szabályozás, eritropoetin termelés [29]. Az NO neurotranszmitterként működik, az immunválasz és a vaszkuláris rendszer szabályozásában vesz részt [30]. Az NO az endotéliumfüggő relaxáció fő mediátora, amely. bradikinin, acetilkolin, a vaszkuláris nyíróerő vagy a citokin aktiváció hatására bekövetkező eNOS aktiváció révén szabadul fel [31]. Bizonyos kóros folyamatokban meggátolja a vaszkuláris simaizomsejtek abnormális proliferációját [32]. Az NO, a H2O2 vagy az O· aktiválja a simaizom sejtekben a szolúbilis guanilát cikláz enzimet és ciklikus guanin-monofoszfát (cGMP) keletkezik, ami relaxáló hatást fejt ki [33-35]. A guanilát-cikláz a heterodimér hem fehérjék családjába tartozik, a cGMP képződést katalizálja, amely számos élettani folyamatban intracelluláris „jelerősítő” vagy másodlagos hírvivő molekulaként fordul elő. A cGMP proteinkinázok, foszfodiészterázok, ioncsatornák, és más fontos célpontok működését
12
szabályozza. Legfontosabb feladata a simaizomtónus szabályozása és a vérlemezke adhézió gátlása [36, 37]. Oxidatív robbanásnak (angolul oxidative burst) nevezzük azt a folyamatot, amikor aktivált neutrofilek és makrofágok NADPH-oxidáz enzime nagy mennyiségű szuperoxidot vagy ROS-t termel, amely közvetlen toxikus hatással van a patogénekre. A NADPH-oxidázt bakteriális lipopoliszaharid, lipoproteinek vagy citokinek (interferonγ) aktiválhatják. A H2O2 koncentrációja ilyen esetekben elérheti akár a 10-100 µM-t is [38-40]. A fagocitákban a NADPH-oxidáz és a mieloperoxidáz enzim közösen hipoklórossavat (HOCl) termel, ami szintén hatékony antimikrobiális ágens [41, 42].
1.3.5. Az oxidatív/nitrozatív stressz sejtkárosító hatásai A különböző ROS/RNS-ek nagy koncentrációban károsíthatják a sejtek alkotóelemeit, mint például nukleinsavakat, lipideket és fehérjéket, DNS-törést, lipid peroxidációt vagy fehérje oxidációt okozva. A OH˙ és az RO˙ gyök a DNS minden összetevőjével reakcióba lép, például 8hidroxi-2’-deoxiguanozin (8-OH-G) képződik, amely a DNS károsodás egyik fő terméke (2. ábra/21-23) [43, 44]. A ROS/RNS-ek a DNS lánc törését is előidézhetik, ez ellen a sejt javító mechanizmusokkal védekezik. A DNS lánc egyszál-töréseit a sejtmagban található poli(ADP-ribóz)-polimeráz (PARP) enzim ismeri fel. Ha a PARP aktiválódik, energiaigényes folyamatban NAD+-ot felhasználva poli(ADP-ribóz) polimereket szintetizál a törés helyére. Ha a DNS sok helyen sérül, és a sejt NAD+/ATP készlete kimerül, akkor nekrózis következik be. A PARP enzim gátlásával az enzim túlaktiválódását lehet elkerülni, ennek védő hatását miokardiális iszkémia/reperfúziós károsodásban, kardiomiopátiában, stroke-ban, arthritiszben, diabétesz mellituszban, tumoros betegségekben bizonyították [45-50]. Lipidek esetén a módosulások a foszfolipidek többszörösen telítetlen zsírsav oldalláncait érintik. A OH˙ gyökök a kettős kötések mentén hidrogénatomokat szakítanak ki, lipidgyököket (L˙) hozva létre. Az L˙ O2-vel egyesülve peroxil gyökké (LOO˙)
alakul,
amely
ciklizációs
reakcióban
átalakulhat
endoperoxiddá,
a
malondialdehid (MDA) prekurzorává. Az MDA-ról bebizonyították, hogy mutagenezist és karcinogenezist okoz. Az MDA mellett 4-hidroxi-2-nonenal (HNE) is képződik,
13
amely a lipid peroxidáció során keletkező legtoxikusabb végtermék (2. ábra/15-20) [51, 52]. Az ROS/RNS-ek a fehérjéken módosíthatják a tiol csoportokat (R-SH), diszulfid kötéseket hozhatnak létre egymás közelében elhelyezkedő cisztein aminosavak között, illetve a tirozin oldalláncok nitrációját okozhatják (3-nitrotirozin képződése) [53]. Ezek a módosulások a fehérjék konformációváltozását okozhatják, amelyek vagy a funkció megváltozásával vagy a fehérjék inaktiválásával járhatnak.
1.4. Oxidatív stressz iszkémiás szívbetegségben Miokardiális iszkémia során az elégtelen vérellátás miatt a szívizom egyes részeihez nem jut el a glükóz vagy az oxigén, vagy más, a vérrel szállított metabolit illetve a keletkezett anyagcseretermékek nem szállítódnak el. Ez az állapot leggyakrabban a szívet ellátó koronáriaerek szűkülete vagy elzáródása miatt alakul ki. Ateroszklerózis során az érintett erekben fokozatos lipid, koleszterol, sejttörmelék lerakódás figyelhető meg, jellemző az endotél diszfunkció és a gyulladásos folyamatok. Az erek intimáján fibrózus szövet-felhalmozódás alakul ki, a lumen beszűkül, illetve plakk darabok törhetnek le, amelyek az érrendszerben szűkületeket vagy elzáródásokat okozhatnak. Iszkémiás károsodás során az alacsony O2 tenzió ellenére mérsékelt, mitokondriális forrásból származó ROS termelés megfigyelhető [54, 55]. Ez az iszkémia során bekövetkező O2- és tápanyaghiány miatti ATP szint csökkenésének a következménye. Az ATP mennyiség 50%-a az F1F0-ATPáz fordított működtetésére, azaz a mitokondriális membránpotenciál fenntartására használódik fel. ATP hiányában az energiaigényes folyamatok leállnak: a Na+/K+- pumpa és a Na+/H+-pumpa működése megszűnik, az intracelluláris térben megnő a Na+ koncentráció és a K+ ionok kifelé áramlanak. A sejtek nem képesek a nyugalmi membránpotenciáljukat biztosítani, depolarizálódnak, Ca2+ ionok jutnak be a sejtbe a koncentrációgrádiensnek megfelelően. A magas intracelluláris Ca2+ koncentráció sokféle Ca2+-függő folyamatot indít el, intracelluláris
proteázokat,
lipázokat,
endonukleázokat
és
protein
kinázokat/foszfatázokat aktivál. A mitokondriális membránpotenciál összeomlik, elektronok lépnek ki az elektrontranszport-láncról, szabad gyököket, ROS/RNS
14
termékeket létrehozva [56, 57]. A mitokondriális szabad gyök termelés mellett a xantinoxidáz enzim felelős még a szabad gyökök termeléséért [58]. Az intracelluláris Ca2+ aktiválta proteázok szelektív proteolízissel a XDH-t XO-vá alakítják át. Az XO a jelentős ATP-felhasználás miatt akkumulálódott purin katabolitokat O· -dá, majd H2O2vé alakítja át [59]. Reperfúzió során szintén jelentős ROS termelés figyelhető meg, amikor újraoxigenizált vér áramlik át az elzárt területeken, ezáltal fokozódik a O· termelés ADP hiányában [60, 61]. Iszkémia során a mitokondriális permeabilitás tranzíciós (MPT) pórusok kinyílását a savas pH meggátolja, azonban reperfúzió során normalizálódott pH-n az MPT pórusok kinyílnak, citokróm c, apoptózis indukáló faktor (AIF), SMAC/Diablo (Second Mitochondria derived Activator of Caspase) vagy Omi/HTRA2 (High Temperature Requirement Protein A2) kerül ki a sejt citoplazmájába, vagy transzlokálódik a sejtmagba. Ezeknek a fehérjéknek a szívizomsejtek apoptózisában van fontos szerepük. Iszkémia/reperfúzió során a ROS termelés mellett a védekező mechanizmusok sérülését is megfigyelték. Csökkent a NADH-dehidrogenáz, adenin-transzlokáz és SOD aktivitása, valamint a glutation koncentrációja is [62, 63]. A ROS termelődés és az endogén antioxidánsok koncentrációjának csökkenése között több tanulmány is korrelációt mutatott ki. [64, 65] Szintén indirekt bizonyíték a szabadgyök-fogók és a kívülről bejuttatott antioxidánsok kardioprotektív hatása [66, 67]. Az iszkémia/reperfúzió során felszabaduló ROS/RNS-ek okozta sejthalál lehet apoptózis [68, 69] és nekrózis is [70, 71]. Kajstura és mtsai azt találták, hogy az apoptotikus szívizomsejtek száma 4,5 órával a koronária elzárás után volt maximális, míg a nekrotikus sejtek száma 24 óra után mutatott maximális értéket [69]. Az I/R során lejátszódó folyamatokat a 4. ábra foglalja össze.
15
4. ábra Iszkémia/reperfúzió során a miokardium több, biokémiai és metabolikus változáson megy keresztül, amelyek egymásra is visszahatva végül az MPT pórusok kinyílásához és a szívizomsejt pusztulásához vezetnek: ROS termelődés (narancssárga), intracelluláris Ca2+ koncentráció emelkedése (zöld), mitokondriális reenergizáció (lila), fiziológiás pH visszaállása (kék) és gyulladás (piros) [57]
1.4.1. Iszkémia/reperfúzió okozta károsodások kezelése A miokardiális infarktus kezelésében a konvencionális terápiák mellett az elmúlt évtizedben a sejtalapú terápiák is szerepet kaptak, amelyeket randomizált, kontrollált klinikai vizsgálatok keretében folytattak le. A sejtalapú terápiák használata kombinálva a konvencionális módszerekkel - jelentheti a jövőt a különböző 16
szívbetegségek kezelésében. A kutatások célja azon sejtek, főleg őssejtek és faktorok meghatározása, melyek képesek direkt vagy indirekt módon aktiválni az angiogenezist és szívizomsejtek képződését a sérülés helyén, ezáltal javítani a szívizom funkciót [7274].
1.4.1.1. Konvencionális kezelési módszerek A konvencionális kezelés részét képezik a műtéti eljárások és a gyógyszeres kezelések. Kiválasztásánál fontos szempont a beteg általános állapota és a szívizomkárosodás mértéke. Az akut fázisú kezelés célja mindenképp a szívizom minél nagyobb részét megmenteni, és megelőzni a további szövődményeket, ami a vérellátás minél előbbi visszaállításával érhető el. A műtéti kezelések közé a következők tartoznak: •
koronária angioplasztika: angolul percutaneous coronary intervention, röviden PCI; az angioplasztika segítségével helyreállítható a koronáriaerekben az áramlás. Egy katétert juttatnak az elzáródott érig, leggyakrabban az a. femoralison, ritkábban az a. brachialis-on vagy az a.radialis-on keresztül. Ez a katéter általában speciális ballonnal van ellátva. A ballont gyorsan, rövid időre felfújják, ezáltal megnyitják az elzáródott koronáriaeret. Ezzel egyidejűleg sztentet helyezhetnek az artéria kitágított részébe, hogy az hosszútávon is nyitva maradjon.
•
bypass műtét: angolul coronary artery bypass graft, röviden CABG. A bypass műtét során egy ép vénával (v. saphena magna) vagy egy ép artériával (a. mammaria interna vagy a. radialis) hidalják át a sérült érszakaszt. Egyes szerzők ide sorolják az úgynevezett thrombendarterectomia műtétet, mely során eltávolítják az elzáródott koronária magvastagodott endotélium-rétegét és a plakkot.
A gyógyszeres kezelések közé a következők tartoznak: •
aszpirin: megakadályozza a trombociták aggregációját
17
•
trombolitikumok: segítenek az ereket elzáró véralvadék feloldásában. Minél hamarabb kap a páciens trombolitikus gyógyszert a szívinfarktust követően, annál nagyobb a valószínűsége a túlélésnek és a károsodás csökkentésének. Alkalmazása azonban fokozott vérzésre való hajlamot okoz
•
nitroglicerin vagy más nitrát tartalmú gyógyszer: csökkentik a szív terhelését és kedvezően hatnak a fájdalomra is
•
bétareceptor-blokkolók: ezek a gyógyszerek segítik a szívizom elernyedését, továbbá csökkentik a szívfrekvenciát és a vérnyomást, ami megkönnyíti a szív munkáját
•
ACE-inhibitorok: csökkenti az újabb iszkémiás tünetek kialakulásának esélyét
1.4.1.2. Sejtalapú terápiák A konvencionális terápiák mellett egyre gyakrabban előtérbe kerülnek a sejtalapú terápiák. Tekintve, hogy ez egy viszonylag új és gyorsan fejlődő terület, a sejtalapú terápiák felosztása nem egységes, hanem több szempont szerint is csoportosítható: milyen típusú sejtekkel történik a kezelés, milyen módon juttatják be az adott sejteket a sérült szervbe, illetve mennyi idővel az infarktus után adják a sejteket. A sejtalapú kezeléseket őssejtekkel vagy érett, differenciálódott testi sejtekkel végzik.
1.4.4.2.1. Őssejtek és differenciálódott testi sejtek a sejtalapú terápiában Az embrionális őssejteket a korai embrió blasztodermájából nyerik. A humán embrionális őssejtek az in vitro fertilizációhoz fel nem használt, lefagyasztott blasztocisztából származnak, közös jellemzőik a magas alkalikus foszfatáz, telomeráz aktivitás és bizonyos antigének (SSEA-3, Oct3/4 és Sox2) jelenléte. Pluripotensek, vagyis belőlük ekto-, endo- vagy mezoderma, illetve csírasejt irányú differenciálódás lehetséges, szemben a felnőtt szervezetből származó őssejtekkel, amelyek csak multipotensek. A sejtek in vitro tenyésztése speciális körülményeket igényel. A tenyésztőedényt osztódásukban gátolt egér vagy más fajból származó fibroblaszt sejtek borítják, melyek táplálják az embrionális őssejteket, és lehetővé teszik megtapadásukat. Klinikai használatuk tudományos, etikai és politikai viták tárgya. Embrionális őssejteket számos betegségmodellben alkalmaznak (az immunrendszer vagy a vérképzőrendszer 18
megbetegedései, kardiovaszkuláris- és neurológiai kórképek). Hátrányuk ezeknek a sejteknek, hogy teratómaképzésre hajlamosak, és mivel allogén módon kerülnek beültetésre, fennáll a kilökődés veszélye [75, 76]. Caspi és mtsai humán ESC-t és ESCből differenciáltatott szívizomsejteket ültettek be infarcerált patkányszívbe. Azt tapasztalták, hogy a nem differenciáltatott ESC teratómaképződést indukált, míg a szívizomsejtté differenciáltatott ESC be tudott épülni, javította a szívfunkciót [77]. Az indukált pluripotens őssejteket (iPSC) nem pluripotens sejtekből, legtöbbször felnőtt szervezetből származó sejtekből, például fibroblasztokból állítják elő géntranszfer (retrovírus, adenovírus transzfekció) alkalmazásával. Az így létrejött sejtek más, pluripotens sejtekkel megegyező tulajdonságokat mutatnak, azaz embrioid testet képesek létrehozni, őssejtekre jellemző géneket és fehérjéket expresszálnak, kiméra létrehozására alkalmasak és differenciáltathatóak [78]. Yamanaka és mtsai humán fibroblasztokból Oct3/4, Sox2, Klf4, és c-Myc gének retrovirális bejuttatásával hoztak létre pluripotens sejteket [79]. Az iPSC technológiát több betegségmodellben (sarlósejtes anémia, hemophilia A, Parkinson kór és iszkémiás szívbetegség) is sikeresen alkalmazták [80]. Nelson és mtsai egér fibroblasztokból humán “stemness” faktorokkal (Oct3/4, Sox2, Klf4, és c-Myc) embrionális őssejtekre jellemző fenotípusú sejteket hoztak létre. Ezen sejtek alkalmazása 8-12 hetes C57BL/6 egerekben miokardiális infarktus után helyreállította a szívfunkciót, csökkentette a hegszövet és a falvastagodás méretét. [81]. Az indukált pluripotens őssejtek alkalmazása előnyt jelenthet a gyakorlatban az embrionális őssejtekkel szemben, mivel nem támaszt etikai aggályokat, autológ módon használható, vagyis a páciens saját testi sejtjeiből előállítható. A felnőtt szervezetben található őssejtek már egy adott fejlődési irányba elkötelezettek, azaz ekto-, endo-, vagy mezodermális differenciáció útjára léptek, de ezen irányokon belül képesek különböző sejtvonalakká differenciálódni. Élettani szerepük a sérült sejtek, szövetek helyreállítása, illetve a szöveteket felépítő, véglegesen specializált működésű sejtek forrásainak biztosítása. Felnőtt őssejtek találhatók a csontvelőben, az agyban, a perifériás vérben, a bőrben, a májban, a szívben és a vázizmokban. Egyes feltételezések szerint a felnőtt szervezet őssejtjei a sérülés helyére
19
vándorolnak a károsodás következtében felszabaduló faktorok miatt. Ezt a folyamatot, az ún. homingot intenzíven kutatják, hiszen ennek megértésével, a saját regenerációs képességet lehetne felhasználni, kikerülve a tenyésztés nehéz, és bonyolult lépéseit valamint a kilökődési reakció kialakulását [82]. A csontvelői eredetű őssejtek (BMSC) karaktere a legtöbbet kutatott és leginkább ismert. [83-85] A csontvelő a különböző progenitor sejtek komplex választékát tartalmazza, köztük hematopoetikus őssejtek, mezenhimális őssejtek, ezen belül multipotens felnőtt progenitor sejtek és úgynevezett „side population” (SP) sejtek. A klinikai vizsgálatok döntő többségében a hematopoetikus és mezenhimális sejttípust alkalmazzák. Kísérleti eredmények azt mutatják, hogy ezek a sejtek iszkémián átesett szívbe juttatva funkciójavulást eredményeznek, részt vesznek a sérült szövet regenerációs folyamataiban [84, 86, 87]. Azt azonban ma is intenzíven kutatják, hogy a beültetett sejtek milyen mechanizmuson keresztül fejtik ki hatásukat (ezzel a kérdéssel részletesen a következő fejezetben foglalkozom). A zsírszövet szintén tartalmaz olyan sejteket, amelyek a mezenhimális őssejtekre jellemző karakterisztikát mutatnak (CD44+, CD73+, CD90+), és differenciálhatóak csont-, porc- és zsírszövet irányba [88, 89]. A felhasználását vonzóvá teszi a klinikai gyakorlatban az, hogy egyszerűen hozzáférhető, nagy mennyiségben áll rendelkezésre, autológ módon beültethető, és nem kell kilökődési reakcióval számolni. A miokardiális infarktus kezelésében eddig elért állatkísérletes eredmények bíztatóak, két klinikai vizsgálatban, az APOLLO-ban (AdiPOse-derived stem ceLLs in the treatment of patients with ST-elevation myOcardial infarction) és a PRECISE-ban (a randomized clinical trial of adiPose-deRived stEm & regenerative Cells In the treatment of patients with non revaScularizable ischEmic myocardium) is zsírszövet eredetű őssejteket (ASC) használnak [90]. Fontos szerepet töltenek be a kutatásokban a keringő endoteliális progenitor sejtek (EPC), amelyek endotél sejt irányba képesek differenciálódni. Mind a hematopoetikus
őssejtekre,
mind
az
endotél
sejtekre
jellemző
markerékkel
rendelkeznek, mint például a CD34, így könnyen szelektálhatók teljes vérből. A miokardiális infarktus kezelésére nem csak állatkísérletekben, hanem a klinikai gyakorlatban is alkalmazzák [91].
20
A szívizom a legújabb kutatások szerint csekély mértékű megújulásra képes [92], rendelkezik egy progenitor- és őssejt (CSC) készlettel. Ezeken a sejteken különböző, az őssejtekre jellemző marker megtalálható (Kit, Sca-1, Isl-1, és SP sejtekre jellemző tulajdonságok), szívizom-, endotél-, simaizomsejtekké vagy fibroblasztokká differenciálódhatnak [93-96]. Urbanek és mtsai kimutatták, hogy a humán szívben iszkémiás károsodás hatására CSC aktiváció történik. A károsodás következményeként azonban a CSC-k sérülést szenvednek, lelassul a sejtek osztódása, növekszik az apoptotikus sejtek száma [97]. Az amnionfolyadékból és köldökzsinórból nyert progenitor- és őssejtek egyértelműen nem sorolhatóak be sem az embrionális őssejtek, sem pedig a felnőtt szervezetből származó őssejtek közé. [98-100] Ezen sejtek terápiás célú felhasználása során bebizonyították, hogy pozitívan befolyásolják a miokardiális infarktus utáni regenerációs folyamatokat [101, 102]. Irodalmi közlések szerint történtek olyan klinikai vizsgálatok is, amelyekben biopsziával vett vázizomsejteket növesztettek fel in vitro körülmények között, és ezeket a sejteket juttatták be az infarktusos területre. Előnyük ezeknek a sejteknek, hogy autológok, nem váltanak ki immunológiai reakciót. Bizonyos fokú funkcionális javulást sikerült velük elérni, azonban ezek a sejtek nem voltak képesek beépülni a szívizomsejtek közé, ezért aritmiát okoztak. További kutatásuk jelenleg is folyamatban van [103-105]. Scorsin és mtsai nem csak vázizomsejtekkel, hanem fetális szívizomsejtekkel is végeztek olyan kísérleteket, melyben koronária artéria ligációval kiváltott miokardiális infarktus után patkányokba ültettek be fetális szívizomsejteket. Azt tapasztalták, hogy a bal kamrai ejekciós frakció (LVEF) nőtt a kontroll csoporthoz képest [106].
1.4.4.2.2. Hatásmechanizmus A beültetett sejtek/őssejtek feltételezett hatásmechanizmusa meglehetősen összetett, bonyolult folyamat. Három fő mechanizmust különböztetnek meg: a transzdifferenciációt, a parakrin hatásokat és a sejtfúziót. Emellett a legújabb kutatások beszámolnak még a közvetlen sejt-sejt kontaktus során bekövetkező citoplazma és organellum cseréről. E folyamatok nem egymástól elszigetelten jelennek meg, hanem
21
egymás hatását elősegítve zajlanak, megoszlásuk valószínűleg az alkalmazott sejttípustól és a sérült rész mikrokörnyezeti tényezőitől függ. Differenciálódáson azt a jelenséget értjük, amikor egy őssejt vagy egy szöveti prekurzor sejt elkötelezi magát egy bizonyos sejtvonal felé. A transzdifferenciáció során pedig egy nem őssejt egy másik sejttípussá transzformálódik, vagy egy már előzőleg differenciálódott őssejt az elkötelezettségétől különböző sejteket hoz létre. Több közleményben arról számolnak be, hogy endoteliális progenitor sejtek (EPC) vagy mezenhimális őssejtek transzdifferenciálódnak szívizomsejtekké [107, 108]. Badorff és mtsai kimutatták, hogy egészséges és koronáriaér-betegségben szenvedő páciensek véréből izolált EPC sejtek szívizomsejtekkel együtt tenyésztve szívizomsejtszerű morfológiát vesznek fel, funkcionális réskapcsolatok alakulnak ki a sejtek között [107]. Ezzel szemben Murry és mtsai azt tapasztalták, hogy hematopoetikus őssejtek nem transzdifferenciálódnak szívizomsejtekké miokardiális infarktust követően [109]. Ehhez hasonlóak Nygren és mtsai eredményei, akik nem frakcionált csontvelőt, illetve szelektált hematopoetikus őssejteket és progenitor sejteket ültettek be az infarcerált miokardiumba, de transzdifferenciácót nem találtak, csak kisszámú sejtfúziót a host és a graft sejtek között [110]. Sejtfúziónak nevezzük, ha két különálló sejt összeolvad, létrehozva ezzel egy többmagvú, nagyobb citoplazmával rendelkező sejtet. A sejtfúzió jelensége fiziológiás körülmények között is megfigyelhető például szatellita prekurzor sejtek esetén, melyek többmagvú izomsejteket hoznak létre. Metzele és mtsai bizonyítékot találtak arra, hogy zsírszövet eredetű őssejtek és szívizomsejtek fuzionálnak egymással, a sejtek megtartják a proliferációs képességüket, akciós potenciált tudnak létrehozni és spontán ritmikus összehúzódásra
is
képesek
[111].
Más
kutatócsoportok
cáfolják
ezeket
az
eredményeket, és sejtfúzió helyett transzdifferenciációval magyarázzák a tapasztalt jelenségeket [112]. A beültetett őssejtek szekretálhatnak olyan anyagokat, amelyek „odavonzzák” a vérben keringő őssejteket és más sejteket, hogy fokozzák az angiogenezist, antiapoptotikus hatást fejtsenek ki, csökkentsék a gyulladás mértékét, fokozzák a sejtek proliferációját, elősegítve ezzel a regenerációt. [113, 114] Sadat és mtsai kimutatták, hogy zsír eredetű őssejtek IGF-1-et és VEGF-et szekretáltak iszkémián átesett szívizomsejtek környezetében. Mind a IFG-1-nek, mind a VEGF-nek anti-apoptotikus
22
és angiogenetikus hatása van [115]. Az utóbbi évek kutatási eredményei azt a feltevést kezdik megerősíteni, hogy a három hatásmechanizmus közül a parakrin faktoroknak van a legjelentősebb hatása a tapasztalt regeneratív folyamatokban, a transzdifferenció és a sejtfúzió csak kis mértékben járul hozzá a hatás kialakulásához. Az irodalomban a három fő hatás mellett új mechanizmusokat is feltételeznek. Driesen és mtsai írták le a részleges sejtfúzió jelenségét. Fibroblasztokat és neonatális szívizomsejteket növesztettek együtt, a fibroblasztokat nagy molekulasúlyú dextránnal jelölték meg. Azt tapasztalták, hogy a dextrán átjutott a szívizomsejtekbe, de fúzionált sejteket nem találtak, vagyis részleges sejtfúzió jött létre, ameddig a dextrán átjutott egyik sejtből a másikba. A jelenséget in vivo elektronmikroszkópiával is megerősítették [116]. A legújabb kutatások során azt is megfigyelték, hogy immunsejtek, epiteliális progenitor sejtek és más sejtek között is ún. nanocsövek, nanotubulusok, illetve mikrotubulusok alakultak ki. Ezek a csövek 50-200 nm átmérőjűek, hosszuk több µm is lehet, bennük. mitokondriumok és egyéb sejtorganellumok áramlását figyelték meg [117-122]. Abban az esetben, amikor az egyik sejt mitokondriumait elpusztították, és így a sejt anaerob respirációra kényszerült, a „megmentő” sejtekből mitokondriumok jutottak a sérült sejtekbe ezeken a nanocsöveken keresztül. [123] Fukahara és mtsai és más csoportok is azt találták, hogy mezenhimális őssejtek csak abban az esetben kezdenek el differenciálódni, ha közvetlen sejt-sejt kapcsolatot tudnak kialakítani az együtt növesztett szívizomsejtekkel vagy vaszkuláris endotél sejtekkel [124-126]. Mindezek a megfigyelések arra engednek következtetni, hogy a parakrin faktorok mellett ezeknek a közvetlen sejt-sejt kapcsolatoknak fontos szerepük lehet abban, hogy a differenciáció mellett a szív progenitor- és őssejtjeinek önmegújuló képességét fenntartsák [127].
1.4.4.2.3. Sejtalapú terápiák alkalmazása a klinikai gyakorlatban A miokardiális infarktus kezelésének egyik lehetséges módja a csontvelői sejtek mobilizációja granulocita kolóniastimuláló faktor (G-CSF) segítségével. A G-CSF-et 410 napig folyamatosan adják az infarktuson átesett pácienseknek. Számos vizsgálatot folytattak, de ezek eredményei nem voltak meggyőzőek, mivel csak három vizsgálat mutatott pozitív eredményt (FIRSTLINE-AMI, RIGENERA és a Takano-féle vizsgálat) [128-130], más vizsgálatok esetében nem volt szignifikáns különbség az LVEF 23
értékekben a kontroll és a kezelt csoportok között [131, 132]. A fenti eredmények tanulsága alapján a csontvelői sejtek mobilizációja háttérbe szorult a közvetlen sejttranszplantációval szemben, ezt az eljárást inkább más kezelésekkel együtt alkalmazzák. A miokardiális infarktus kezelésének másik lehetséges módja a közvetlen sejt/őssejt transzplantáció. Az elmúlt évtizedben sok klinikai vizsgálat zajlott, pozitív vagy semleges eredménnyel. A legtöbb vizsgálat során intrakoronáriás őssejttranszplantációt hajtottak végre autológ csontvelői mononukleáris sejtek (BMMC) felhasználásával. Egyes vizsgálatok során nem a teljes BMCC frakciót használták, hanem a kiszelektált a CD133+ endoteliális progenitor sejteket vagy a CD34+ hematopoetikus őssejteket [133-135]. Csontvelői eredetű mezenhimális őssejteket egyetlen klinikai vizsgálatban alkalmaztak. Chen és mtsai az izolált őssejteket két hétig növesztették sejtkultúrában és ezután ültették be a sejteket intrakoronáriásan [136]. A vizsgálatok követési ideje 1 hónaptól 18 hónapig terjedt, monitorozták a LVEF-et, a végszisztolés térfogatot, a falmozgást, a hegszövet méretének csökkenését MRI-vel, PET-tel, SPECT-tel és ultrahanggal. Több vizsgálatban (BOOST, REPAIR-AMI, FINNCELL és REGENT) [134, 137-139] a kezelés hatására 2-5%-kal javult a bal kamra ejekciós frakció és a kontraktilitás az infarcerált régióban. Más vizsgálatok során, például a HEBE, az ASTAMI vagy a Janssens-féle vizsgálat, nem találtak szignifikánsan javuló LVEF értékeket a placeboval kezelt csoporthoz képest [140-142]. A fenti vizsgálatokat összesítve azt találták, hogy a bal kamrai ejekciós frakcióban közel 4%-os javulás volt kimutatható a kontroll csoporthoz képest, 5%-kal csökkent a hegszövet mérete az infarcerált területen és csökkent a bal kamrai végszisztolés térfogat. Továbbá bebizonyosodott, hogy a sejtalapú terápiák biztonsággal használhatóak: a sejtek beültetése nem okozott aritmiát vagy in-stent restenosist [143]. A jelenleg is zajló vizsgálatokban újfajta sejttípusok is kipróbálásra kerültek: az APOLLO vizsgálatban zsírszövet eredetű őssejteket transzplantálnak, a SCIPO vizsgálatban (Cardiac Stem Cell Infusion in Patients with Ischemic Cardiomyopathy) szíveredetű progenitor sejteket izoláltak a páciensekből a revaszkularizáció során a jobb szívpitvarból, és ezeket a sejteket néhány hét múlva ültették vissza a betegekbe [144]. Összegezve, az eredmények, amelyek a különböző módon kivitelezett vizsgálatokból származnak, azt mutatják, hogy a sejtalapú terápiák biztonsággal
24
használhatóak a gyakorlatban, kisfokú javulást eredményeztek a bal kamra ejekciós frakcióban, fokozták a miokardiális perfúziót és a kontraktilitást. A jótékony hatás mögött rejlő hatásmechanizmus alaposabb megismerésével fokozni lehetne a regeneráció mértéket.
1.5. Oxidatív stressz szerepe a diabétesz kialakulásában Diabéteszben az abszolút vagy relatív inzulinhiány következményeként a szénhidrát-, a fehérje- és a zsíranyagcsere alapvetően megváltozik, katabolikus folyamatok indulnak be. Fokozódik a glukogenolízis, ugyanakkor csökken a perifériás glükózfelhasználás. A fehérje- és zsírkatabolizmus miatt glukoplasztikus prekurzor anyagok keletkeznek, melyek a hepatikus glukoneogenezisben szintén cukorrá alakulnak. Ezek eredményeként hiperglikémia alakul ki. Több vizsgálatban (DCCT, UKPDS vagy Steno-2) is kimutatták, hogy a hiperglikémia a diabétesz során előforduló szöveti károsodások kiváltó oka [145-147].
1.5.1. Hiperglikémia indukálta károsodások mechanizmusa A hiperglikémia indukált sejt- és szövetkárosodásban öt fő metabolikus út érintett: 1) polyol út, 2) késői glikolizációs végtermékek (AGE) felhalmozódása, 3) AGE receptorok és aktiváló ligandok fokozott expressziója 4) a protein-kináz C izoformák aktivációja, 5) hexózamin út. 1) A polyol út kulcsenzime az aldóz-reduktáz. Normál körülmények között az enzim a toxikus aldehideket redukálja inaktív alkoholokká, azonban ha a glükózszint emelkedett, az aldóz-reduktáz a glükózt szorbitollá redukálja, amit a szorbitol-dehidrogenáz később fruktózzá oxidál. Ebben a folyamatban az aldóz-reduktáz NADPH-t használ, ami az antioxidáns tulajdonságú redukált glutation képződésében is alapvető fontosságú. Így a sejtek érzékenyebbek az intracelluláris ROS-ra. Az aldóz-reduktáz enzim több szövetben is megtalálható, például az idegekben, a retinában, a glomerulusokban és a vaszkuláris sejtekben [148]. A glükózfelvétel ezekben a szövetekben az inzulintól független GLUT-1 receptoron keresztül történik,
25
vagyis
az
intracelluláris
glükóz
koncentráció
a
hiperglikémiával
párhuzamosan emelkedik. 2) A nem enzimatikus glikolizáció során a glükóz aldehidcsoporton keresztül a fehérjék terminális aminocsoportjához kötődik, kialakul a Schiff-bázis, amely gyors és reverzibilis reakció. A Schiff-bázis átrendeződésével létrejön az Amadori termék, amelyből kialakulnak a glikolizált fehérjék [17]. Az intracellulárisan képződött AGE három módon képes károsodást okozni: 1) intracelluláris
fehérjék
glikálódnak,
amelyek
géntranszkripció
szabályozásáért felelősek; a glikolizáció megváltoztatja a fehérjék funkcióját [149]; 2) az AGE prekurzorok kikerülhetnek a sejtekből, megváltoztathatják az extracelluláris mátrix molekulákat, befolyásolva ezzel a mátrix és a sejt közötti szignalizációt [150, 151]; 3) az AGE prekurzorok által módosított plazmafehérjék
keringő
fehérjéket
modifikálhatnak
és
gyulladásos
folyamatokat indíthatnak el [152, 153]. Diabéteszes betegekben kevesebb kollaterális ér képződik az egészséges kontrollokhoz viszonyítva. Ez hozzájárul a neuropátia mellett az alsó végtagi amputációk és a szívelégtelenség arányának emelkedéséhez. Ez részben onnan ered, hogy a szervezet az iszkémiás károsodás kompenzálására nem tud megfelelő vaszkulogenezist indukálni. Az AGE termékeknek központi szerepük van ezekben a folyamatokban. [154]. 3) Az AGE receptorokról (RAGE) több tanulmány is kimutatta, hogy különböző szignáltranszdukciós útvonalakat aktiválnak, amelyek ROS termeléssel, NF-κB aktivációval járnak [155, 156]. Endotél sejtekben a RAGE-hoz kötődő ligandok több gén expresszióját is megváltoztatták, mint például thrombomodulin, VCAM-1, amelyek módosították az endotél sejtek prokoaguláns tulajdonságait és megnövelték a gyulladási folyamatokban szereplő sejtek kitapadását az endotéliumra [157]. Diabéteszes RAGE-//apoE-/- egerekben lassabban alakultak ki az ateroszklerózis szövődményei, kisebb volt a plakkosodás mértéke [158]. 4) A hiperglikémia fokozza a sejtekben a diacil-glicerol (DAG) termelődését, amely a protein-kináz C β, -δ, és -α izoformájának aktivációjához vezet. Ez az
enzim
felelős
több
gén
26
expressziójáért,
például
az
eNOS
downregulációjáért, a VEGF, az endothelin, TGF-β, NADPH-oxidáz upregulációjáért,
hozzájárulva
így
a
diabétesz
komplikációinak
kialakulásához [159, 160]. 5) Normál állapotban a sejtek által felvett glükóz 2-5%-a lép be a hexózamin útba, ahol a glutamin:fruktóz-6-foszfatáz-amidotranszferáz (GFAT) hatására fruktóz-6-foszfátból glükózamin-6-foszfát lesz. Hiperglikémia során a felesleges glükóz nagy része ebbe a metabolikus útba kerül. Az út végterméke
a
UDP-N-acetilglükózamin,
ami
számos
intracelluláris
transzkripciós faktor glikolizációs szubsztrátja, így gének átíródását is befolyásolja,
amelyek
részt
vesznek
a
diabétesz
mikrovaszkuláris
szövődményeinek kialakulásában [161]. A
különböző
metabolikus
utak
fontosságát,
a
hiperglikémia
okozta
szövetkárosodásban betöltött szerepüket az út egyes elemeinek gátlásával bizonyították. Sokáig nem volt tisztázott, hogy mi a közös ezen reakcióutakban. Mára bebizonyosodott, hogy a közös tényező a hiperglikémia során a mitokondriumok által termelt O·
növekvő mennyisége, mely emeli a ROS szintet. Ennek oka, hogy
hiperglikémia esetén a citrátciklusban több glükóz oxidálódik, vagyis több elektron kerül az elektron transzport láncra, növekszik az ATP/ADP arány és hiperpolarizálódik a mitokondrium membránja. A mitokondrium membránon az áramgrádiens egy pontig emelkedik, amikor is eléri a felső határt, és ekkor az elektron transzfer a III-as komplexen blokkolódik. Az elektronok a koenzim Q-ra, majd onnan a molekuláris O2re kerülnek, O· -ot kialakítva. Ez a folyamat az alapja a mitokondriális diszfunkciónak, ami közös a fent említett öt útban és fontos szerepet játszik a diabéteszt érintő anyagcserezavarban. Az öt reakcióútban a gliceraldehid 3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) enzim játssza a központi szerepet (5. ábra). A hiperglikémia indukálta O· termelés gátolja a GAPDH-t. Ha az enzim gátlódik, a glikolítikus intermedierek nagy mennyiségben állnak rendelkezésre az öt reakcióút enzimei számára. In vivo, a GAPDH gátlása ADPribóz polimerek modifikáló hatására is bekövetkezik. Azonban, ha a PARP enzimet gátolták, akkor a GAPDH enzim aktivitásában nem történt változás. Abban az esetben, ha a hiperglikémia indukálta O· termelést UCP-1-gyel vagy MnSOD-vel gátolták,
27
szinttén megtartoott maradt a GAPDH enzim aktiv vitása, és a PARP általli modifikáció is kivéddhető volt [162, 163].
5. ábra á A hiiperglikémia indukálta sejtkárosod dásban részztvevő fő reakcióút-vo onalak összeefoglalása, vaalamint a GA APDH közpoonti szerepe ezekben e a folyamatokbann [164]
1.5.22. Metabollikus mem mória A metabbolikus mem mória alatt azt a jelenséget értjüük, mely során a szö övetek m, vese, szzív) „emlékkeznek” arraa, hogy miilyen glikém miás környyezet vette körül (szem őket.. Az első vizsgálatot Engerman E é mtsai vég és gezték diabbéteszes kuttyák retinájáán. A kutyáákat 2 vagyy 30 hónap rossz r vércukkorszint szaabályozás uttán látták ell megfelelőeen, és 60 hóónap után vizsgálták, v h hogy kialakuult-e retinop pátia. Azt taalálták, hoggy a 2 hónap p után megffelelő vércuukorszint-szzabályozásbban részesüllő kutyáknáál nem alakuult ki retino opátia (ugyanúgy, minnt a konttroll csopoortnál). A 30 hónapoos csoporttnál ugyanolyan elválltozásokat találtak, t miint a 60 hóónapig rossszul kezelt csoportnál [165]. Haasonló megffigyelésekett tett Lorennzi és munkkacsoportja izolált endootél sejtekeen és diabétteszes patkáányokon [1666]. A metabbolikus mem mória lehetsséges szereepét a szövőődmények kkialakulásáb ban a DCC CT és az azt a követő EDIC klinnikai vizsgáálat eredméényeinek kkiértékelése után mutaatták ki, am melyet T1D DM betegeek körében n végeztek.. A betegeek egy résszénél
28
hagyományos kezelést, míg a többi betegnél szoros ellenőrzést alkalmaztak. A hagyományos kezelés azt jelentette, hogy a betegek napi egy vagy két inzulin injekciót kaptak, monitorozták a saját vizelet- és vércukorszintjüket, valamint diétáról és testmozgásról szóló oktatásban részesítették őket. A szoros ellenőrzés során a betegek napi három inzulin injekciót kaptak, vagy inzulinpumpát ültettek be nekik, naponta legalább négyszer mérték a vércukorszintjüket, diétás étkezésben részesültek és kötelező gyakorlatok voltak előírva számukra. 6,5 év után a hagyományosan kezelt csoport tagjai is áttértek a szoros ellenőrzésre [145]. 14 év után az EDIC vizsgálatban azt állapították meg. hogy jóllehet a HbA1c teszt hasonló eredményeket mutatott, az eredetileg hagyományosan kezelt csoport tagjai között nagyobb volt a mikrovaszkuláris szövődmények és a CVD incidenciája [167]. A szorosan ellenőrzött csoportban 42%-kal csökkent a CVD, 57%-kal a MI és a stroke kialakulásának az esélye [168]. A T2DM betegek körében végzett UKPDS vizsgálat esetében is hasonló eredményeket találtak [146]. Ebben az esetben is két csoportot alakítottak ki: a hagyományosan kezelt és az intenzív kezelésben részesített csoportot. A betegeket a vizsgálat előtt 3 hónapig nyomon követték, utána történt meg a randomizálás. Azokat a betegeket, akiknek az éhgyomri vércukorszintjük 6 mmol/l alatt volt, dietetikus látta el tanáccsal. Ha jelentkezett a hiperglikémia (>6 mmol/l), akkor sorolták be őket valamelyik konvencionális kezelésű csoportba, inzulint vagy szulfonilurea készítményeket kaptak. A konvencionális kezelésű csoportban a vércukor célértéke <15 mmol/l volt. Az intenzív kezelésben részesült csoport az éhgyomri vércukor szintet 6 mmol/l alatt tartották, ezek a beteg a vizsgálat kezdetétől fogva gyógyszeres kezelésben részesültek. A „metabolikus memória” jelenségét több in vitro és in vivo kísérletben vizsgálták: az egyik csoportot végig szorosan kontrollálták, a másik csoportot kezdetben nem, majd szorosan ellenőrizték [169, 170]. Összefoglalva azt találták, hogy a szorosan ellenőrzött csoportban a hagyományosan kezelthez képest csökkent az oxidatív stressz mértéke, az NO szintje és a hiperglikémia indukálta szövődmények is kivédhetőek voltak. Felmerülhet a kérdés, hogy milyen mechanizmusok állnak annak hátterében, hogy a normalizált vércukorszint ellenére is tapasztalhatóak a diabétesz szövődményei? Valószínűsíthető, hogy hiperglikémia során a mitokondriális fehérjék glikálódnak, megváltozik
a
funkciójuk.
Diabéteszben
29
emelkedik
a
metilglioxál
(MGO)
koncentrációja. Az MGO könnyen reagál argininnel, lizinnel és fehérjék szulfhidril csoportjával, nukleinsavakkal, AGE termékeket létrehozva. Gátolja a mitokondriális respirációt, emellett bizonyos mitokondriális fehérjéket is modifikál. Rosca és mtsai kimutatták, hogy a két folyamat közvetlen kapcsolatban van egymással. Vagyis azok a mitokondriális fehérjék, amelyek a légzési lánc tagjai, és glikálódtak, azok normoglikémiás körülmények között is termelik az O· -ot [171] (6 .ábra).
6. ábra A mitokondriális „ördögi kör”, amely a „metabolikus memória” kialakulásához vezet: hiperglikémia során megnövekszik a szabadgyök-termelés, AGE termékek képződnek. A mitokondriális fehérjék glikálódnak, megváltozik a funkciójuk. A mitokondriális légzési lánc tagjai is glikálódnak, normoglikémiás körülmények között is termelik az · -ot, vagyis hozzájárulnak a diabétesz szövődményeinek kialakulásához [172]
1.5.3. Új terápiás lehetőségek diabéteszben A legújabb eredmények alapján a kutatók olyan terápiás lehetőségeket keresnek, amelyek az öt reakcióút szintjén fejtik ki hatásukat, meggátolva ezzel a diabétesz szövődményeinek kialakulását.
30
Ilyen szerek lehetnek a transzketoláz aktivátorok. Két intermedier, a glicerinaldehid-3-foszfát és a fruktóz-6-foszfát a transzketoláz reakció végtermékei a pentóz-foszfát reakcióútban. A transzketoláz eliminálni tudja ezeket az intermediereket, hogy ne léphessenek be az öt káros reakcióútba. A transzketoláz kofaktora a tiamin, amely szükséges az enzim működéséhez, de ez az enzimek körülbelül 25%-át aktiválja. Egy tiamin származék, a benfotiamin alkalmazása azonban felerősítette ezt a hatást. Kimutatták, hogy a benfotiamin kezelés hatására egerekben nem alakult ki retinopátia és nefropátia, T2DM-ban szenvedő betegeknél pedig csökkent az albuminuria [173, 174]. A diabétesz következtében kialakult szövődmények kezelésére állatkísérletekben és a klinikai gyakorlatban is alkalmazzák az α-liponsavat (ALA), amely a piruvátdehidrogenáz enzim kofaktora. Az ALA-nak antioxidáns tulajdonsága van, apoliproteinE hiányos, diabéteszes egerekben lassította a diabéteszes neuropátia megjelenését és progresszióját [175]. Mijnhout és mtsai több vizsgálat eredményét összegezve azt találták, hogy 3 héten keresztül napi 600 mg intravénás ALA adása szignifikáns mértékben csökkentette diabéteszes betegekben a neurotikus fájdalom kialakulását [176]. A ROS egyik fő forrása a sejtekben a NADPH-oxidáz. Az enzim specifikus gátlószerének, az apocyninnek a terápiás alkalmazhatóságát több csoport is vizsgálta. Thallas-Bonke és mtsai diabéteszes nefropátiaban azt találták, hogy a NADPH-oxidáz gátlása apocyninnel csökkentette az albuminuriát és a glomeruloszklerózist [177]. Roe és mtsai az apocynin védő hatását mutatták ki a diabétesz következményeként létrejött miokardiális kontraktilis diszfunkcióban [178]. Terápiás szerként jöhetnek szóba a PARP gátlók. Artériából származó endotél sejteken a PARP inhibitor meggátolta a PKC- és NF-κB aktivációt, az AGE-képződést és a hexózamin útvonalat. Diabéteszes állatmodellben a PARP gátlás megakadályozta az endotél sejtsérülést és a podocita apoptózist, valamint a nefropátia kialakulását [49]. Meg kell azonban jegyezni, hogy a PARP gátlószerek hosszú távú terápiás alkalmazásáról ez idáig kevés klinikai tapasztalat van. Alkalmazásuk DNS sérülések felhalmozódásával járhat, krónikus adagolása gyógyszer rezisztencia kialakulásához is vezethet. A diabéteszes szövődmények kialakulását a O· termelés gátlásával is el lehet kerülni. Shen és mtsai a SOD expresszióját fokozva (10-20-szoros aktivitás emelkedés)
31
csökkentették a károsodás mértékét Az SOD overexpressziója a szívizomsejtek kataláz aktivitás-emelkedése mellett megnövelte a mitokondriális GSH szintet is. Ezek együtt fejtették ki hatásukat az oxidatív stresszel szemben [179]. Salvemini és mtsai kifejlesztettek egy SOD/kataláz enzim mimetikumot, amely ugyanúgy viselkedik, mint az SOD, azonban sokkal stabilabb és állatkísérletekben alkalmazva megakadályozta a diabétesz szövődményeinek kialakulását [180].
32
2. Célkitűzések Doktori kutatómunkám célja az oxidatív stressz okozta sejtszintű károsodások mechanizmusának vizsgálata volt két különböző kórképben. 1. Célunk az iszkémia/reperfúzió során bekövetkező károsodás sejtszintű mechanizmusainak tanulmányozása volt in vitro iszkémia modell használatával. Arra kerestük a választ, hogy a károsodott sejtek állapota javítható-e egészséges sejtek hozzáadásával. Vizsgáltuk: a. a
közvetlen
sejt-sejt
kapcsolatok
jelentőségét,
valamint
a
mitokondriumok lehetséges szerepét. b. a parakrin faktorok hatását, és hogy milyen mechanizmusok játszanak szerepet a regeneráció folyamatában. c. az oxidatív stresszre jellemző markerek változását sejtalapú terápia hatására. 2. A diabétesz mellitusz során kialakuló hiperglikémia sejtekre kifejtett hatását tanulmányoztuk in vitro hiperglikémia modellben. A metabolikus memória jelenségét vizsgáltuk különböző, az oxidatív stressz kimutatására alkalmas fluoreszcens festékkel. Arra kerestük a választ, hogyan alakul a mitokondriális ROS termelés, illetve a folyamat befolyásolható-e gátlószerek alkalmazásával.
33
3. Módszerek 3.1. In vitro iszkémia modell 3.1.1. Felhasznált sejttípusok Kísérleteinkhez patkányból származó H9c2 kardiomioblaszt sejtvonalat (ATCC, Wesel, Németország), és C57Bl/6 egérből izolált mezenhimális őssejteket használtunk. A kardiomioblasztokat 4,5 g/l glükóztartalmú DMEM-ben tenyésztettük, amely tartalmazott még 10% FCS-t, 2 mM L-glutamint, 100 U/ml penicillint és 100 μg/ml sztreptomicint. A H9c2 kardiomioblaszt sejtvonal embrionális patkány szívből származik, szívizomra és vázizomra is jellemző elektrofiziológiai és biokémiai tulajdonságokat mutat, ezért mind szívizom, mind vázizom in vitro modelljeként használatos. [181, 182] Szérummegvonás hatására a mononukleáris mioblasztok miotubulusokká
alakulnak.
A
differenciáció
során
a
sejtek
megtartják
a
szívizomsejtekre jellemző elektromos és hormonális szignalizációs útvonal néhány elemét, ezért lett elfogadott in vitro modell az iszkémiás szív vizsgálatára. A mezenhimális őssejtek izolálása C57Bl/6 egerek femurjából történt Tropel módszerével a következő protokoll szerint [183]: az egereket pentobarbitállal (ip, 50 mg/kg, Nembutal, Ovation, Deerfield, IL, USA) túlaltattuk, kipreparáltuk a femurt. A csont mindkét végéről eltávolítottuk a csontvéget, majd a csontot egy injekciós tű segítségével sejttenyésztő médiummal (1g/l glükóztartalmú DMEM, 10% FCS, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin és 100 μg/ml sztreptomicin) mostuk át, a csontvelőt centrifugacsőbe gyűjtöttük. 1200 RPM-en lecentrifugáltuk, majd T75-ös sejttenyésztő flaskába helyeztük. Négy-öt nap után a csontvelőben lévő mezenhimális őssejtek kitapadnak a sejttenyésztő edény aljára, a le nem tapadt sejteket PBS-es mosással eltávolítottuk. A sejtek korábbi vizsgálata kimutatta, hogy a kitapadt sejtek pozitívak voltak a jellegzetes MSC markerre (Sca-1), és negatívak a vérképző sejtfejlődési sorok tipikus markereire (CD34, CD3ε, CD45R/B220, CD11b, 6G, és TER-119), illetve differenciálhatóak voltak adipogén és oszteogén irányba (7. ábra) [184].
34
7. ábra Mezenhimális őssejtek karakterizálása. A-B. A kitapadt sejtek áramlási citometriás vizsgálata kimutatta, hogy pozitívak voltak a jellegzetes MSC markerre, a Sca-1-re, és negatívak a vérképző sejtfejlődési sorok tipikus markereire: CD34, CD3ε, CD45R/B220, CD11b, 6G, and TER-119. C. A kitapadt sejtek differenciálhatóak voltak adipogén és oszteogén irányba. (Urbán, V.S., et al.; Stem Cells, 2008. 26(1): p. 244-253.)
3.1.2. A kísérletekben használt fluoreszcens festékek Kísérleteinkben a konfokális mikroszkópiához és az áramlási citometriához a kardiomioblasztokat és az őssejteket különböző hullámhosszúságú fénnyel gerjeszthető fluoreszcens festékekkel jelöltük meg azonosításuk céljából. A sejteket a lipidoldékony Vybrant fluoreszcens festékcsaláddal festettük meg, amelynek tagjai a sejtek plazmamembránjába épülnek be az inkubálás során. A kardiomioblaszt sejteket Vybrant DiO-val jelöltük (excitáció/emisszió: 488/501 nm, zöld). Ez egy oxakarbocianin festék, vizes oldatban nem gerjeszthető, azonban a foszfolipid kettősrétegekben oldódik, és erős fluoreszcens jelet emittál megfelelő gerjesztés esetén. A mezenhimális őssejteket Vybrant DiD-del (excitáció/emisszió: 633/665 nm, távoli vörös) festettük meg. Ez az indokarbocianin festék szintén csak a foszfolipid kettősréteghez kötődve ad jelet. A sejttenyésztő médiumhoz 1:200 arányú koncentrációban hozzáadott festékeket 37°C-on 30 perces inkubáció után mostuk ki. Az élő sejtek jelölésére calcein AM-et (excitáció/emisszió: 494/517 nm, zöld) használtunk (koncentráció: 1:2000, 37°C, 30 perc), amely a négy negatív töltése miatt a sejtmembránon átdiffundálva a sejtek citoplazmájába kerül. Itt észterázok lehasítják az amino-metilészter csoportot, így szabaddá válik az erős fluoreszcens jelet kibocsátó calcein festék, amely már nem képes a plazmamembránon átjutni. Mivel észteráz aktivitása csak az élő sejteknek van, ezért a calcein alkalmazható az élő sejtek jelölésére és detektálására. Az iszkémia során elpusztult sejtek jelölésére ethidium homodimert
35
(excitáció/emisszió: 528/617 nm, vörös) használtunk (koncentráció: 1:500, 37°C, 30 perc), amely a sérült sejtmembránon átdiffundálva a sejtmaghoz kapcsolódik. Mivel a molekula erős pozitív töltéssel rendelkezik, az ép sejtmembránon nem képes átjutni, így az egészséges sejtek nem festődnek. A MitoTracker Red (excitáció/emisszió: 579/599 nm) a mitokondriumok jelölésére alkalmas festék. A MitoTracker Red kémiailag reaktív redukált rosamin, addig nem fluoreszcens, amíg nem lép be az aktív sejtbe, ahol az aktív mitokondriumok piros fluoreszcens termékké oxidálják. A sejtmagok megjelenítésére Hoechst festéket (excitáció/emisszió: 350/461 nm) használtunk. A lipofil molekula a DNS-hez kapcsolódva válik fluoreszcenssé.
3.1.3. Iszkémia modell beállítása Az in vitro iszkémia modell során a H9c2 sejteket egyidejű oxigén- és glükóz megvonásnak (OGD) tettük ki. Az értekezés további részében az OGD-t és az in vitro iszkémia/reperfúziós modellt szinonimaként használom. Az oxigénmegvonást a konfokális mikroszkóp sejtinkubációs rendszerével értük el, amellyel 0,3-0,4% O2 koncentrációt lehet beállítani. Abszolút nulla szintet a rendszerrel nem lehet elérni, de ez nem is szükséges a megfelelő hatás kiváltásához, a 0,4% O2 koncentráció, ami 3,25 Hgmm-nek felel meg, elegendő, hogy előidézzük a patológiás állapotot. A glükózmegvonást glükózmentes tenyésztő médium használatával értük el. Az iszkémia modell beállításánál első lépésként az iszkémia időtartamát határoztuk meg. Célunk az volt, hogy a sejtek ~80-90%-át elpusztítsuk, így ugyanis megfelelő mértékben lehet láthatóvá tenni a kontroll és az sejtekkel kezelt csoport közötti különbséget. A H9c2 kardiomioblaszt sejteket 42 mm-es tárgylemezre növesztettük, egy napig inkubátorban tartottuk. Egy nap múlva a sejteket calcein-AM-mel és ethidium homodimerrel festettük meg, majd az inkubációs rendszerbe helyeztük a Petri-csészét, és a kardiomioblasztokat oxigén- és glükóz megvonásnak tettük ki. A mikroszkóppal figyeltük a sejtek morfológiáját (20x DIC objektívvel), illetve a calcein és az ethidium homodimer intenzitásváltozását. Számos előkísérlet elvégzése után állapodtunk meg a 2,5 órás időtartamnál, mert az ennél rövidebb, 1-1,5 óráig tartó iszkémia nem okozott károsodást a sejtekben,a hosszabb (4-5 órás) pedig a sejttenyészet teljes pusztulását eredményezte.
36
Az iszkémia kezdetén a sejtekben csak calcein jel detektálható, ethidium homodimer jel nem látható. 75 perc múlva a sejtek morfológiája kezd megváltozni, az ethidium homodimer jel intenzitása emelkedni kezd. 150 perc múlva a kardiomioblasztok felkerekednek a tenyésztőlemez aljáról, megfigyelhető az ún. blebbing jelensége, ami a sejtmembrán
„hólyagosodását”
jelenti.
Ezek
a
folyamatok
összességében
a
kardiomioblasztok pusztulásához vezetnek. Megjelenik az erős ethidium homodimer jel, ami az elpusztult sejtek markere. Megfigyelésünket áramlási citometriával is megerősítettük. H9c2 sejteket 6 lyukú sejttenyésztő lemezen növesztettünk, elvégeztük a 150 perces OGD-t, majd ethidium homodimerrel festettük meg a sejteket, és vizsgáltuk a fluoreszcencia intenzitásváltozást. A kontrollhoz képest az OGD-n átesett sejtekben emelkedett volt az ethidium homodimer jele, vagyis a kardiomioblasztok nagy része károsodott (8. ábra).
8. ábra OGD modell beállítása A. A kardiomioblasztokat az élő sejteket jelölő calcein AM-mel (ex/em 494/517 nm) és az elpusztult sejteket jelölő ethidium homodimerrel (ex/em 528/617 nm) festettük meg. Videomikroszkópiával megállapítottuk, hogy 150 perc oxigén- és glükóz megvonás szükséges ahhoz, hogy a sejtek nagy része (~80-90%-a) iszkémiás károsodást szenvedjen. B. Áramlási citometriával megerősítettük, amit videomikroszkópiával megállapítottunk. Az ethidium homodimer festődés jobbra tolódása megmutatta, hogy az iszkémián átesett sejtek nagy része károsodott. Zöld vonal jelöli a kontroll kardiomioblasztokat (nem estek át OGD-n), míg piros vonal jelöli az iszkémián átesett sejteket.
Második lépésként a kialakult változás, vagyis a glükóz- és oxigénmegvonás utáni sejtszintű regenerációs folyamatok optimális detektálásnak idejét határoztuk meg. Szintén többszöri kísérletezés után a 24 óra mellett döntöttünk. Ennek magyarázata a
37
sejtek növekedési és szaporodási tulajdonságában keresendő. 4-6 óra alatt a később hozzáadott őssejtek lassan tapadnak le az edény aljára, tehát nem tudnak hatást kifejteni, míg 40-48 óra alatt a kardiomioblasztok és őssejtek benövik a tenyésztőedény felszínét, és az ekkor létrejövő ún. kontakt-gátlás miatt elpusztulnak, illetve nem tudunk megfelelő mértékben kiértékelhető mikroszkópos képet készíteni.
3.1.4. Iszkémia modell A modell beállítása után kísérleteinkben a glükóz- és oxigén megvonás során a kardiomioblaszt sejteket Vybrant DiO fluoreszcens festékkel jelöltük, és 2,5 óráig 0,5% O2 és 99,5% N2 atmoszférában tartottuk glükózmentes médiumban. Az OGD során történő morfológiai változások nyomon követése miatt videomikroszkópos megfigyeléseket végeztünk. A H9c2 kardiomioblasztokat 42 mm átmérőjű tárgylemezre növesztettük, majd OGD alatt 1 kép/perc gyakorisággal felvételeket készítettünk.
3.1.5. Iszkémia modell hozzáadott mezenhimális őssejtekkel A kardiomioblasztok és az őssejtek vizsgálata a következő kísérleti protokoll szerint történt: vizsgáltuk a kardiomioblasztok túlélését azután, hogy mesterséges iszkémiának tettük ki őket 2,5 óráig, majd 30 perccel az iszkémia után mezenhimális őssejteket adtunk a tenyészethez. A kísérleteket 12 lyukú tenyésztőlemezen végeztük, lyukanként 3x104 H9c2 sejttel, amihez 2x104 mezenhimális őssejtet adtunk. A kardiomioblasztokat minden esetben Vybrant DiO-val (zöld) jelöltük meg, a hozzáadott mezenhimális őssejteket pedig Vybrant DiD-del (piros) festettük. Ebben az esetben is három vizsgálati csoportot hoztunk létre (9.ábra): •
kardiomioblasztok, amelyek iszkémia után nem kaptak őssejtet (kontroll)
•
kardiomioblasztok, amelyek iszkémia után mezenhimális őssejtet kaptak
•
kardiomioblasztok, amelyek iszkémia után mezenhimális őssejtet kaptak inzertben (az inzertek 0,4 µm nagyságú membránpórusokkal rendelkeznek, amelyek nem teszik lehetővé a direkt sejt-sejt kapcsolatokat, de a sejtek által szekretált anyagok eljuthatnak a másik sejtig)
38
Iszkémia után 24 órával ethidium homodimerrel festettük meg a ko-kultúrákat, és konfokális mikroszkóppal képeket készítettünk, illetve áramlási citometriával vizsgáltuk a különböző sejtpopulációkat. A statisztikailag is megfelelő sejtszám eléréséhez a 10xes nagyítású objektívet használtuk, 2x2 látótérről készítettünk felvételt („tile scan” funkció).
9. ábra Három vizsgálati csoport iszkémiás körülmények között. Kísérleteink során három kísérleti csoportot különböztettünk meg: 1) H9c2 sejtek, amelyek OGD után nem kaptak sejteket 2) OGD után mezenhimális őssejteket adtunk „megmentő sejtekként” 3) OGD után a mezenhimális őssejteket inzertben adtuk, ami azt jelenti, hogy egy folyadéktérben voltak a sejtek, de fizikai kontaktus nem alakult ki köztük
3.1.6. Sejtfúzió vizsgálata OGD során és normál körülmények között, valamint nanocsövek megfigyelése 42 mm átmérőjű tárgylemezre 105 H9c2 sejtet növesztettünk, egy nap múlva megfestettük őket Vybrant DiO-val, és a jelölt sejteken oxigén- és glükóz megvonást végeztünk. OGD után 105 Vybrant DiD-del jelölt mezenhimális őssejteket adtunk hozzájuk, majd a sejttenyészetet a konfokális mikroszkópon található sejtinkubációs rendszerbe helyeztük. 24 óráig felvételeket készítettünk a sejttenyészetről 15 perces gyakorisággal. Ezeken a feltételeken vizsgáltuk a sejtfúzió jelenségét és nanocsövek kialakulásának folyamatát. Abban az esetben, amikor a sejtek mitokondriumait vizsgáltuk OGD után, a tenyészeteket MitoTracker Reddel festettük meg 1:2000-es hígításban 10 percig 37°C-on. A H9c2 és mezenhimális őssejt tenyészeteket normál körülmények között is vizsgáltuk konfokális mikroszkóppal és áramlási citométerrel. A Vybrant DiO-val jelölt H9c2 sejteket és a Vybrant DiD-del festett mezenhimális őssejteket 6 lyukú sejttenyésztő lemezen növesztettük együtt, és 24 órás ko-kultivációt követően vagy felvételeket készítettünk a sejtekről, vagy feltripszináltuk a tenyészeteket (0,05%
39
tripszin-EDTA), majd a sejtszuszpenziókat vizsgáltuk. A DiO-val jelölt H9c2 sejteket kapuztuk és 10.000-es sejtpopulációt vizsgáltunk.
3.1.7. Iszkémia modell hozzáadott H9c2 sejtekkel Ebben a kísérletsorozatban H9c2 kardiomioblasztok túlélését vizsgáltuk azután, hogy mesterséges iszkémiának tettük ki őket 2,5 óráig, majd H9c2 kardiomioblasztokat adtunk a tenyészethez. A kísérleteket 12 lyukú tenyésztőlemezen végeztük, lyukanként 3x104 H9c2 sejttel, amihez 30 perccel az iszkémia után 2x104 H9c2-t adtunk. Az OGDn
átesett
sejteket
Vybrant
DiO-val
(zöld)
jelöltük
meg,
a
hozzáadott
kardiomioblasztokat pedig Vybrant DiD-del (piros) festettük. Két vizsgálati csoportot hoztunk létre (10. ábra): • kardiomioblasztok, amelyek iszkémia után nem kaptak sejtet (OGD kontroll) • kardiomioblasztok, amelyek iszkémia után kardiomioblasztokat kaptak (OGD + H9c2) Iszkémia után 24 órával ethidium homodimerrel festettük meg a ko-kultúrákat, és konfokális mikroszkóppal képeket készítettünk. A statisztikailag is megfelelő sejtszám eléréséhez a 2x2 látótérről készítettünk felvételeket.
10. ábra Két vizsgálati csoport iszkémiás körülmények között. Vizsgálataink során két kísérleti csoportot különböztettünk meg: 1) H9c2 sejtek, amelyek OGD után nem kaptak sejteket 2) OGD után H9c2 sejteket adtunk „megmentő sejtekként”
3.1.8. LDH enzimszint meghatározása Sejtek károsodása esetén a sejtmembrán integritása sérül, a citoplazmában található enzimek kikerülhetnek a sejtből. A legtöbb, a citoplazmában lévő enzim vagy instabil, vagy csak kis mennyiségben van jelen. A laktát-dehidrogenáz (LDH) stabil enzim, és már kismértékű membránkárosodás hatására megtalálható a felülúszóban. Az 40
LDH aktivitásának mérésével következtetni lehet a plazmamembrán sérülésére, vagyis a sejt életképességére. Az LDH enzim aktivitás mérése egy kapcsolt reakcióval valósul meg: az LDH a laktátot piruváttá alakítja át, miközben NAD+-ból NADH képződik. A másik reakcióban a NADH felhasználása mellett indonitrotetrazóliumból formazán képződik. A formazán színes végtermék, abszorbanciája 490 nm-en spektrofotométerrel mérhető (11. ábra).
11. ábra Az LDH enzim aktivitásának meghatározása enzimkapcsolt reakcióban történik: az LDH a laktátot piruváttá alakítja át, miközben NAD+-ból NADH képződik. A másik reakcióban a NADH felhasználása mellett indonitrotetrazóliumból formazán képződik. A formazán színes végtermék, abszorbanciája 490 nm-en spektrofotométerrel mérhető.
Az LDH aktivitás meghatározásához 12 lyukú tenyésztőlemezen növesztettünk H9c2 sejteket (105 sejt/lyuk). Egy nappal később elvégeztük az OGD-t, és a következő kísérleti csoportokat hoztuk létre: 1. negatív kontroll (nem történt OGD) 2. pozitív kontroll LDH szint meghatározáshoz (nem történt OGD, 1% Triton X-szel kezelt csoport) 3. OGD 4. OGD + H9c2 sejtek (105 hozzáadott H9c2/lyuk) Az LDH aktivitásmérést az OGD után 24 órával végeztük. A felülúszókból 100100 µl-eket 96 lyukú lemezre pipettáztunk, majd hozzáadtuk a reakcióelegyet. A lemezt 30 percen át 37ºC-on inkubáltuk, majd leolvastuk az abszorbanciát 490 nm-en. A
41
citotoxicitást - vagyis hogy milyen mértékben sérült a plazmamembrán – a következő egyenlettel számoltuk:
á
í
%
í
· 100
í
3.1.9. MDA meghatározása Az MDA meghatározása tiobarbitursavval (TBA) adott reakcióján alapul, melyet magas hőmérsékleten, savas körülmények között kell véghezvinni. A TBA és MDA molekula
kondenzációjával
keletkező
MDA-TBA
addukt
532
nm-en
spektrofotométerrel detektálható (12.ábra). S HN
NH
O
H N
S
+
O
C H
C H2
C H
O
O
HN
MDA
O
H N
C C C H H H O
TBA
O
S NH
O
MDA-TBA addukt
12. ábra Az MDA és TBA kondenzációjával keletkező MDA-TBA addukt 532 nm-en spektrofotométerrel detektálható.
Az MDA meghatározásához 106 H9c2 sejtet növesztettünk 100 mm Ø Petri csészében. Egy nappal később elvégeztük az OGD-t, és a következő kísérleti csoportokat hoztuk létre: 1. kontroll (nem történt OGD) 2. OGD 3. OGD + H9c2 sejtek (106 hozzáadott H9c2) Az MDA mérését OGD után 5 órával végeztük, mivel irodalmi adatok szerint ebben az időpontban éri el a maximumát az MDA koncentráció [185]. A különböző csoportban található sejteket feltripszináltuk és lecentrifugáltuk a sejteken lévő médiummal együtt (1400 rpm, 5 perc). A felülúszóból 100-100 µl mintát vettünk. A pelletet 500 μl-ben felszuszpendáltuk, szonikáltuk. A feltárás hatására az intracelluláris MDA is kikerült a médiumba. 50 µl 8,1%-os SDS oldatot, majd 375 µl 20%-os ecetsav
42
oldatot mértünk be, majd hozzáadtunk 150 µl desztillált vizet. Ezután 50 µl-t adtunk az eddig bemért oldatokhoz az MDA kalibrációs sor elemeiből (0, 1, 2, 4, 8, 16 µM) vagy a mintákból (kontroll, OGD, OGD+H9c2 csoportokból felszuszpendált pellet és felülúszó). Végül a frissen készített, még forró 0,8%-os TBA-t (375 µl) adtuk hozzá. A csöveket 1 órán át 95ºC-on inkubáltuk. Az abszorbanciát 532 nm-en mértük a standardokból és a mintákból 96 lyukú lemezen.
3.1.10. F16-tal kezelt, hozzáadott H9c2 sejtek alkalmazása A sejtek mitokondriumainak károsítására F16-ot használtunk. Az F16 egy kis molekulasúlyú, lipofil kation, amely irreverzibilisen gátolja az oxidatív foszforilációt [186]. A H9c2 sejteket 48 óráig 137,5 µM, 275 µM és 550 µM F16-tal kezeltük. A sejtek mitokondriumait MitoTracker Reddel, a sejtmagot Hoechst fluoreszcens festékkel jelöltük, figyeltük a mitokondriális membránpotenciál és a sejtszám változását. Ezek alapján állapítottuk meg a megfelelő F16 koncentrációt a megmentő H9c2 sejtek előkezeléséhez. Az előzetes eredmények alapján 200 µM F16 előkezelést alkalmaztunk 48 óráig. Az iszkémia során Vybrant DiO-val jelöltük az iszkémián átesett H9c2 sejteket, az F16-tal előkezelt megmentő sejteket DiD-del jelöltük. A szimulált iszkémia protokollja a 3.1.7. fejezetben ismertetett módon zajlott.
3.1.11. A konfokális képek kiértékelése Az iszkémián átesett sejtekről készült konfokális képek kiértékelése ImageJ szoftverrel történt. A morfológia és a festődés alapján elkülönített élő és elpusztult kardiomioblasztokat, valamint az őssejteket a program segítségével számoltuk meg. A kardiomioblasztokat (zöld Vybrant DiO festés), amelyek ép morfológiával rendelkeztek, és nem volt detektálható ethidium homodimer festés, vagyis amelyek túlélték az OGD-t, piros ponttal jelöltük. Az elpusztult kardiomioblasztokat, amelyek felkerekedtek, és ethidium homodimert találtunk bennük, fekete ponttal jelöltük (13. ábra).
43
13. ábra Konfokális mikroszkóppal készült felvételek kiértékelése A. A konfokális felvételeken a sejteket morfológia és ethidium homodimer festődés alapján jelöltük: 1) a kardiomioblasztokat, amelyek ép morfológiával rendelkeztek, és nem volt detektálható ethidium homodimer festés, vagyis amelyek túlélték az OGD-t, piros ponttal jelöltük; 2) az elpusztult kardiomioblasztokat, amelyek felkerekedtek, és ethidium homodimert találtunk bennük, fekete ponttal jelöltük. B. Az így jelölt sejteket az ImageJ nevű program segítségével kvantifikáltuk.
3.2. In vitro hiperglikémia modell 3.2.1. Felhasznált sejttípusok Kísérleteinkhez humán köldökzsinór véna endotél (HUVEC) és humán mikrovaszkuláris endotél (HMEC) sejteket használtunk. A sejteket MCDB-131 médiumban
[15%
FCS,
epidermális
növekedési
faktor
(10
ng/ml)
és
penicillin/sztreptomicin] növesztettük. A sejteken kétnaponta cseréltük a médiumot, majd 80-90%-os konfluenciánál passzáltuk.
3.2.2. Oxidatív/nitrozatív stressz kimutatására használt fluoreszcens festékek A CM-H2DCFDA (excitáció/emisszió: 488/535 nm) (5-(és-6)-klorometil-2',7'diklorodihidrofluoreszcein diacetát, acetil észter) kémiailag redukált formája nem fluoreszcens, azonban ha oxidálódik ONOO , a H2O2 vagy OH˙ hatására, és az intracelluláris észterázok lehasítják az acetát csoportot, akkor a festék fluoreszcenssé válik. A CM-H2DCFDA a DCF-DA származéka, egy hozzáadott thiol reaktív klorometil csoporttal, amellyel a festék jobb hatékonysággal kötődik az intracelluláris sejtalkotókhoz, növelve ezzel a festék retencióját (14. ábra).
44
14. ábra CM-H2DCFDA redukált és oxidált formája
A hidroetidin (excitáció/emisszió: 420/605 nm) a szuperoxid kimutatására alkalmas. A festék át tud diffundálni a sejtmembránon, ahol a szuperoxid hatására átalakul ethidium-bromiddá, interkalálódik a DNS-sel és piros fluoreszcenciája lesz. A hidroetidin fő előnye, hogy különbséget tud tenni a szuperoxid és a hidrogénperoxid között. Abban az esetben, ha a sejtben nincs a hidroetidin által kimutatható szuperoxid termelés, akkor a citoszolikus festék kék fluoreszcenciát mutat.
3.2.3. Kísérleti protokoll Az intracelluláris reaktív oxigén származékok vizsgálatához a következő három vizsgálati csoportot alakítottuk ki (15. ábra): 1. a HUVEC vagy HMEC sejteket 3 hétig alacsony (5 mM; A) glükózt tartalmazó médiumban tenyésztettük 2. a HUVEC vagy HMEC sejteket 3 hétig magas (30 mM; M) glükózt tartalmazó médiumban tenyésztettük 3. a HUVEC vagy HMEC sejteket 2 hétig magas (30 mM), majd utáni 1 hétig alacsony (30Æ5 mM; MÆA) glükóztartalmú médiumban tartottuk őket
15. ábra Három vizsgálati csoport A mitokondriális ROS termelés vizsgálatára a HUVEC és HMEC sejtekben három csoportot alakítottunk ki: 1) a sejteket 3 hétig alacsony (5 mM; „A”)
45
glükóztartalmú médiumban növesztettük 2) a sejteket 3 hétig magas (30 mM; „M”) glükóztartalmű médiumban növesztettük 3) a sejteket 2 hétig magas, majd 1 hétig alacsony (30Æ5 mM; „MÆA”) glükóztartalmú médiumban növesztettük
A HUVEC sejtek esetében a 3. kísérleti csoportban a következő inhibitorokat alkalmaztuk a 3. héten: 62,5 µM antioxidáns tulajdonságú α-liponsavat (ALA), 10 µM NADPH-oxidáz gátló apocynint (APO) és a mitokondriális ROS termelést gátló UCP2 fehérjét. A kísérletsorozat végén a sejtekhez 2 µg/ml CM-H2DCFDA-t adtunk, 15 percig
37°C-on
inkubáltuk,
majd
a
fluoreszcencia
intenzitást
fluoreszcens
spektrofotométerrel olvastuk le, 488 nm-es excitációs és 530 nm-es emissziós szűrőket használva. A HMEC sejteken az alapjelenséget vizsgáltuk meg konfokális mikroszkóppal és áramlási citométerrel. A sejtekben termelődött ROS kimutatására hidroetidint alkalmaztunk. A hidroetidint DMSO-ban oldottuk fel, végkoncentrációja a sejttenyésztő médiumban 1mg/ml volt.
3.3 Alkalmazott statisztikai módszerek Az adatokat átlag ± átlag hibája (SEM, „standard error of the mean”) formában adtuk meg. A kapott adatokat két csoport esetén kétmintás t-próbával, kettőnél több csoport esetén ANOVA-val, Neumann-Keuls poszt hoc teszttel értékeltük ki. Ha ettől eltérő módszert használtunk, akkor azt az adott vizsgálatnál részletezem. A kezelési csoportok között szignifikáns különbséget akkor állapítottunk meg, ha p<0,05. (* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001).
46
4. Eredmények 4.1. In vitro iszkémia modell 4.1.1. Megfigyelések OGD alatt A 150 perces OGD során készült videomikroszkópos felvételek kiértékelése során azt találtuk, hogy azok a H9c2 sejtek, amelyek kapcsolódtak más sejtekhez, szignifikánsabban később kerekedtek fel, mint azok a sejtek, melyek nem alakítottak ki más kardiomioblasztokkal kapcsolatot (130,7±4,2 perc vs. 143,8±4,0 perc, N=5, n=24). A felkerekedés, más morfológiai elváltozásokkal együtt mint membránhólyagosodás és kromatinkondenzáció az apoptózis kialakulására utalnak (16. ábra) [182].
16. ábra Sejtek felkerekedése OGD alatt. A-B. A videomikroszkópos felvételek kiértékelése során megfigyeltük, hogy a 150 perces OGD alatt azok a sejtek, akik kapcsolódtak más sejtekhez, szignifikánsan később kerekedtek fel, mint azok a sejtek, akik nem tudtak más kardiomioblasztokkal kapcsolatot kialakítani. (130,7±4,2 perc vs. 143,8±4,0 perc, N=5, n=24, * p<0,05, átlag±SEM)
4.1.2. Iszkémián átesett H9c2 kardiomioblasztok és mezenhimális őssejtek együtt-tenyésztése Az in vitro iszkémia modell beállítása után azt vizsgáltuk. hogy megfigyelhető-e javulás a 2,5 óra hosszú iszkémiát követően őssejtekkel kezelt, károsodott kardiomioblasztok túlélésében. A 24 óráig tartó ko-kultivációt követően az ethidium homodimerrel jelölt tenyészetről a konfokális mikroszkóppal készített képeket értékeltük ki, illetve áramlási citometriás vizsgálatokat végeztünk. Konfokális 47
mikroszkóppal kimutattuk, hogy a kardiomioblasztok OGD után 24 órával a kontroll csoportban ugyanazt a felkerekedett, „hólyagosodott membránú” morfológiát (angolul blebbing) mutatták, mint rögtön OGD után (17/A ábra). Az áramlási citometriás vizsgálatokkal bebizonyítottuk, hogy OGD után emelkedett volt az elpusztult sejteket jelző festék, az ethidium homodimer jel intenzitása (medián fluoreszcencia intenzitás 19-ről 65-re emelkedett) (17/B ábra). Abban az esetben, amikor mezenhimális őssejteket adtuk a károsodott kardiomioblasztokhoz, a sejtek az egészséges sejtekre jellemző morfológiát mutatták (17/C ábra). Az áramlási citometriával megállapítottuk, hogy az iszkémia káros hatása kivédhető volt (medián fluoreszcencia intenzitás 24 vs 23) (17/D ábra).
17. ábra H9c2 sejtek morfológiája és életképessége 24 órával az OGD után A. Vybrant DiOval jelölt kardiomioblasztok 24 órával OGD után egyedül növesztve ugyanazt a felkerekedett, “hólyagosodott membránú” morfológiát mutatták, mint a kardiomioblasztok közvetlenül OGD után B. Az áramlási citometriás vizsgálat megállapította, hogy 24 órával az OGD-t követően az ethidium homodimer intenzitás emelkedett volt a kontrollhoz viszonyítva, vagyis az egyedül növesztett kardiomioblasztok elpusztultak (medián fluoreszcencia intenzitás: 19 vs 65) C. Vybrant DiO-val jelölt H9c2 sejtek (ex/em 488/501 nm) és DiD-del jelölt mezenhimális őssejtek (ex/em 633/665 nm) együtt növesztése során 24 órával az OGD után azt találtuk, hogy a H9c2 sejtek az egészséges sejtekre jellemző morfológiát mutatták. D. Az áramlási citometriás vizsgálat kimutatta, hogy az elpusztult H9c2 sejtek száma a kontroll szinten marad (median fluoreszcencia intenzitás: 24 vs 23)
48
A
mezenhimális
őssejtek
hatását
a
konfokális
mikroszkópos
képek
felhasználásával kvantifikáltuk. A csoportokat összehasonlítva arra az eredményre jutottunk, hogy a kontrollhoz képest szignifikánsan kevesebb az elpusztult sejtek aránya (0,85 ± 0,086 vs. 0,16 ± 0,035, p<0,05, n=6), ha az OGD után őssejtet adtunk a tenyészethez. Azonban ha az őssejteket a sejttenyésztő inzert segítségével adtuk a károsodott kardiomioblasztokhoz, akkor a kontrollhoz hasonló képet kaptunk (elpusztult sejtek aránya: 0,90 ± 0,055, p<0,05, n=6) (18. ábra).
18. ábra Az elpusztult sejtek arányának alakulása a különböző kísérleti csoportokban. Az elpusztult sejtek aránya szignifikánsan alacsonyabb volt abban az esetben, ha mezenhimális őssejteket adtunk a károsodott kardiomioblasztokhoz a kontrollhoz viszonyítva (0,85 ± 0,086 vs. 0,16 ± 0,035, n=5). Azonban ha az MSC-ket inzertben adtuk a H9c2 sejtekhez, vagyis a sejtek közötti fizikai kontaktust meggátoltuk, akkor az elpusztult sejtek aránya a kontrollhoz hasonló szintet mutatott (0,90 ± 0,055, n=5). Az adatok az ábrán: átlag ± SEM. *p < 0.05 C+MSC vs. C és C+MSC vs. C+MSC ins. (C: kardiomioblasztok egyedül OGD után, C+MSC: kardiomioblasztok és hozzáadott őssejtek, C+MSC ins: kardiomioblasztok és hozzáadott őssejtek inzertben)
Konfokális mikroszkóppal megvizsgáltuk, hogy az inzerteken az őssejtek milyen morfológiát mutatnak, és azt találtuk, hogy a sejtek alakja hasonló azokhoz a sejtekéhez, amelyeket a többlyukú tenyésztőlemezen növesztettünk (19. ábra).
49
19. ábra Vybrant DiD-del jelölt mezenhimális őssejtek a sejttenyésztő lemezeken és inzerteken. Az inzerteken a sejtek ugyanazt az egészséges sejtekre jellemző morfológiát mutatják, mint a hagyományos sejttenyésztő felületen.
Megvizsgáltuk azt is, hogy alakult az élő sejtek száma a különböző kezelt csoportokban a kísérlet kezdetén, és 24 órával az őssejtek hozzáadása után. Az élő sejteket morfológia és a fluoreszcens festődés alapján számoltuk meg, majd a sejtszámot a sejttenyésztő lemez egy cellájára vonatkoztatva adtuk meg. A kísérlet kezdetén a sejtek közel 80-90%-os konfluenciát értek el (63 120±7694), így 24 óra elteltével abban a csoportban, ahol nem történt oxigén- és glükóz megvonás, a sejtszám csak kismértékben emelkedett (76 116±3396). 24 órával OGD után, amennyiben a kardiomioblasztokhoz nem adtunk megmentő mezenhimális őssejteket vagy ezeket a sejteket inzertben adtuk, a túlélő sejtszám alacsony maradt (1 757±1081 és 990±608), azonban ha az őssejteket közvetlenül adtuk, akkor a túlélő sejtszám emelkedett (15 174±3975) (20. ábra).
20. ábra Az élő H9c2 sejtek abszolút számának alakulása az OGD előtt és után. OGD előtt a H9c2 sejtek közel 80-90%-os konfluenciát mutattak, számuk 24 órával később emelkedett,
50
amennyiben nem volt OGD. Az OGD után 24 órával az élő sejtszám alacsony volt, amennyiben a kardiomioblasztokat egyedül tenyésztettük OGD után, vagy ha az MSC-ket inzertben adtuk. Azonban ha az MSC-ket közvetlenül adtuk a károsodott kardiomioblasztokhoz, az élő H9c2 sejtszám magasabb volt. Az adatok az ábrán: átlag ± SEM.
A kardiomioblasztok és az őssejtek között OGD után gyakran megfigyelhető volt intercelluláris membránhidak, úgynevezett nanocsövek kialakulása. Ezek a nanocsövek több 10 µm hosszúságúak voltak, átmérőjük 200-500 nm között volt. MitoTracker Red festéssel kimutattuk, hogy a kardiomioblasztok és őssejtek közötti nanocsövekben funkcionálisan aktív mitokondriumok vannak. A videomikroszkópos felvételeken
nem
volt
megállapítható
az
intercelluláris
kapcsolatokban
a
mitokondriumok áramlásának iránya. Egy nanocső kialakulásához közel 2 órára volt szükség (21. ábra).
21. ábra Intercelluláris kapcsolatok kialakulása OGD után A. Nanocsöves hálózat kialakulása DiO-val jelölt H9c2 és DiD-del jelölt mezenhimális őssejt között OGD után 24 órával B. A sejtek között az intercelluláris kapcsolatokban MitoTracker Reddel jelölt (piros szín) aktív mitokondriumokat mutattunk ki (sárga nyilak) C. Nanocső kialakulás videomikroszkópos megfigyelése a DiO-val jelölt H9c2 és DiD-del jelölt mezenhimális őssejt között
51
Az intercelluláris kapcsolatok kialakulása mellett a kettősen festődött, kétmagvú sejtek jelezték, hogy a ko-kultiváció során sejtfúzió is történt. A sejtfúzió kialakulásához közel 4 órára volt szükség (22. ábra).
22. ábra Sejtfúzió egy kardiomioblaszt és őssejt között. Videomikroszkópiával figyeltünk meg sejtfúziót Vybrant DiO-val jelölt H9c2 sejt (zöld szín) Vybrant DiD-del jelölt őssejt (piros szín) között, a fuzionáló sejteket fehér nyíllal jelöltük az egyes időpontokban. A két sejtet A fuzionált sejt kétmagvú és sárga színben jelenik meg a felvételeken.
A H9c2 kardiomioblasztokat és őssejteket együtt tenyésztettünk normál körülmények között, hogy megvizsgáljuk a sejtfúzió jelenségét. Azt találtuk, hogy sejtfúzió előfordul egészséges sejtek között is. Az áramlási citometriás vizsgálat kimutatta, hogy a 59,4% DiO-val jelölt H9c2 és a 30,1% DiD-del jelölt MSC mellett volt 8,1% kettős festődésű sejtpopuláció is. Azonban a forward és side scatter plotokon látszik, hogy a kettős festődésű sejtek hasonló méretűek, mint a kardiomioblasztok vagy az őssejtek, ami azt jelenti, hogy a sejtek direkt sejt-sejt kapcsolatokon keresztül vették fel a festéket (23. ábra).
52
23. ábra H9c2 sejtek és őssejtek együtt tenyésztése normál körülmények között. A. Kardiomioblasztok (zöld) és őssejtek (piros) együtt növesztése 24 óráig. A tenyészetben megfigyelhetőek a piros és a zöld sejtek mellett sárga festődésű sejtek is. B. Reprezentatív felvétel egy kétmagvú, kettős festődésű sejtről (a sejtmag Hoechst festékkel festve) C. H9c2MSC tenyészet vizsgálata áramlási citometriával 24 óra után. Három populációt különböztettünk meg: 59,42% volt a DiO-val jelölt H9c2 sejt, 30,1% volt a DiD-del festett MSC, és 8,14% volt a közös festődésű sejt. D. A forward és side scatter plot szerinti eloszlás azt mutatja, hogy a kettős festődésű populáció méretben nem nagyobb, mint a zölddel jelölt H9c2 sejtek vagy a pirossal jelölt MSC-k, ami kizárja a teljes sejtfúzió lehetőségét.
4.1.3. Iszkémia modell H9c2 hozzáadott sejtekkel Eredményeink azt mutatják, hogy az iszkémia során károsodott H9c2 sejtekhez adott egészséges H9c2 sejtek is szignifikáns mértékben javították a sejtek túlélését, mint 53
a mezenhimális őssejtek (24. ábra). Annak érdekében, hogy csökkentsük az eredményeink variabilitását, minden további kísérletet egy sejtfajtával, a H9c2 kardiomioblasztokkal végeztünk el.
24. ábra Egészséges H9c2 sejtek szignifikánsan javítják az iszkémiában károsodott H9c2 sejtek túlélését (0,79±0,053 vs. 0,51±0,071). Az adatok az ábrán: átlag ± SEM, ** p < 0.01.
4.1.4. LDH enzim szint meghatározása OGD után Az OGD után elvégzett LDH enzim aktivitás mérés azt mutatta, hogy a H9c2 sejtek hozzáadása szignifikáns mértékben csökkent a citotoxicitás (17,42 ± 2,63% vs. 8,00± 2,48%), vagyis a nekrotizált sejtek száma (25. ábra).
25. ábra Az OGD után elvégzett LDH enzim aktivitás mérés azt mutatta, hogy a H9c2 sejtek hozzáadása szignifikáns mértékben csökkentette a citotoxicitást az OGD-n átesett csoporthoz képest (17,42 ± 2.63% vs. 8,00 ± 2,48%). Az adatok az ábrán: átlag ± SEM, * p < 0,05.
54
4.1.5. MDA szint meghatározása OGD után Az MDA hígítási sor abszorbanciaértékeit, és a rájuk illesztett kalibrációs egyenest a 26. ábra mutatja.
26. ábra Az MDA mérés során használt kalibrációs egyenes
OGD után a pellet és a felülúszó esetében is az MDA koncentrációja szignifikánsan magasabb volt a kontroll csoportban, mint az egészséges H9c2 sejtekkel kezelt csoportban (4,00±0,60 µM vs. 0,75±0,43 µM és 13,91±0,82 µM vs. 6,53±1,53 µM). A pellet esetében a sejtekkel kezelt csoportban az MDA koncentrációja a kontroll csoport értékeihez volt hasonló (0,75±0,43 µM vs 0,75±0,37 µM). A felülúszónál szintén csökkent az MDA szintje a sejtekkel kezelt csoportban az „OGD” csoporthoz képest, de a kontroll szintjét nem érte el (0,47±0,18 µM vs. 6,53±1,53 µM). Összefoglalva elmondhatjuk, hogy a hozzáadott H9c2 sejtek csökkentik a felszabaduló MDA koncentrációját (27. ábra).
27. ábra OGD után a pelletben és a felülúszóban is magasabb MDA koncentrációt mértünk az „OGD” csoportban az „OGD+H9c2” csoporthoz képest, vagyis a hozzáadott H9c2 hatására csökkent az MDA mennyisége (4,00±0,60 µM vs. 0,75±0,43 µM és 13,91±0,82 µM vs. 6,53±1,53 µM) Az adatok az ábrán: átlag ± SEM; ** p < 0,01; *** p < 0,001
55
4.1.6. F16-tal kezelt, hozzáadott H9c2 sejtek alkalmazása A megmentő sejtekként használt H9c2 kardiomioblasztokat F16-tal kezeltük elő, amely a légzési lánc irreverzibilis gátlásával károsítja a sejtek mitokondriumait. Az előkezelés eredményeképpen koncentrációfüggő mértékben csökkent a mitokondriális membránpotenciál és a sejtproliferáció mértéke. Amennyiben OGD után a kardiomioblasztokhoz F16-tal előkezelt H9c2 sejteket adtunk, az egészséges sejtek hozzáadáskor látott megmentő hatás elmaradt, jóllehet a sejtek száma ugyanaz volt mindkét esetben (28. ábra).
28. ábra Egészséges mitokondriumok szerepe a károsodott H9c2 sejtek túlélésében A-B. Az F16 koncentrációfüggő mértékben csökkenti a mitokondriális membránpotenciált, amit a csökkenő MitoTracker Red fluoreszcencia intenzitás mutat, illetve az előkezelés csökkentette a sejtproliferáció mértékét is. Az adatok az ábrán: átlag ± SEM; * p < 0,05; *** p < 0,001 (ANOVA, Tukey’s post hoc teszt C. 200 µM F16-tal 48 óráig előkezelt H9c2 sejtek alkalmazásakor a túlélt H9c2 sejtek száma a kontroll csoporttal egyezett meg; szignifikánsan több volt a túlélő sejtek száma az egészséges H9c2 sejtekkel kezelt csoportban (C+C vs. C+C(200µM F16): 97,0±21,3 vs. 39,8±12,5, n=6). Az adatok az ábrán: átlag ± SEM; * p < 0,05. (C: kardiomioblasztok egyedül OGD után, C+C: kardiomioblasztok és hozzáadott, egészséges kardiomioblasztok, C+C(200µM F16): kardiomioblasztok és hozzáadott, F16-tal előkezelt kardiomioblasztok)
56
4.2. In vitro hiperglikémia modell 4.2.1. Metabolikus memória Humán köldökzsinór véna endotél sejteken azt vizsgáltuk, hogy ha a sejteket 2 hétig magas glükóztartalmú, majd 1 hétig alacsony glükóztartalmú médiumban tenyésztjük (MÆA csoport), akkor hogyan változik meg a mitokondrium által termelt reaktív oxigén származékok szintje, és ezt különböző támadásponton ható gátlószerek hogyan befolyásolják. Azt találtuk, hogy MÆA csoportban, összehasonlítva az M csoporttal, ugyanúgy szignifikánsan magas maradt a termelt ROS mennyisége a kontrollhoz viszonyítva. Azonban ha inhibitorként α-liponsavat (ALA), apocynint (APO) vagy mitokondriális légzési lánc szétkapcsoló fehréjét (UCP-2) alkalmazunk, akkor szignifikáns mértékben csökkent a ROS termelés, de az A csoport szintjére nem tudott visszatérni (29. ábra).
29. ábra ROS termelés alakulása HUVEC sejtekben glükóz normalizáció után HUVEC sejteket 3 hétig alacsony (5 mM; A) vagy magas (30 mM; M) vagy 2 hétig magas és 1 hétig alacsony (MÆA) glükóztartalmú médiumban tenyésztettünk, az MÆA csoport esetében a következő gátlószereket alkalmazva: 62.5 μmol/l ALA, UCP2 fehérje vagy 10 μmol/l apocynin (APO). A sejteket 2 μg/ml CM-H2DCFDA-val inkubáltuk 15 percig 37°C-on, majd fluoreszcens plate readerrel mértük a fluoreszcencia intenzitást. Az eredményeket átlag±SEMként tüntettük fel az ábrán. **p<0,01; ***p<0,001 vs HUVEC sejtek 5 mM glükóztartalmú médiumban 3 hétig. ##p<0,01 vs MÆA
Humán mikrovaszkuláris endotél sejteken is elvégeztük ugyanazon protokollt, célunk az alapmegfigyelés megerősítése volt egy másik sejttípuson áramlási
57
citometriával és konfokális mikroszkópiával. A hidroetidinnel történt mérések hasonló képet mutattak, mint a CM-H2DCFDA-val elvégzett mérések: az MÆA csoportban emelkedett maradt a ROS termelés, ugyanúgy mint az M csoportban, a kontroll A csoporthoz viszonyítva. Vagyis a HUVEC és a HMEC sejtek „metabolikus memóriával” rendelkeznek, a ROS termelés fenntartott marad az alacsony glükóztartalmú médiumban is (30. ábra).
30. ábra A-C. Hidroetidin fluoreszcencia-változásának vizsgálata humán mikrovaszkuláris endotél sejteken áramlási citometriával és konfokális mikroszkóppal. Áramlási citometriás mérésekkel megállapítottuk, hogy a kontrollhoz képest (A) szignifikánsan emelkedett volt a hidroetidin intenzitása a 3 hétig magas glükóztartalmú médiumban tenyésztett sejtek esetében (M: 1,345±0,076), és szintén emelkedett maradt a 2 hétig magas, utána 1 hétig alacsony glükóztartalmú médiumban tartott sejtek esetén is (MÆA: 1,545±0,145). Az adatok az ábrán: átlag ± SEM; * p<0,05 A vs M és MÆA.
58
5. Megbeszélés Munkám során in vitro iszkémia modellben tanulmányoztam az I/R során bekövetkező károsodás sejtszintű mechanizmusait. Az I/R modellben H9c2 patkány embrionális kardiomioblaszt sejtvonalat használtunk. Korábbi tanulmányokban már alkalmazták a H9c2 sejteket doxorubicin [187], glükózglükóz-oxidáz [188], hidrogénperoxid [189] vagy iszkémia/reperfúzió [190, 191] vizsgálatára, ezért elfogadott in vitro modell az oxidatív stressz okozta károsodások vizsgálatára. A szimulált iszkémiát a H9c2 sejteken egyidejű glükóz- és oxigén megvonással értük el. A szimulált iszkémia időtartamát több előkísérlet alapján 150 percnek határoztuk meg, amit 30 perc reperfúzió követett. Az iszkémia után bekövetkező sejthalált vagy sejtkárosodást ethidium homodimer fluoreszcens festékkel vizsgáltuk, amely a sérült, integritását elvesztett sejtmembránon képes csak áthatolni, ekkor a sejtben található nukleinsavakhoz kötődik, és intenzitása 40-szeresére emelkedik. A későbbi vizsgálatokban mértük a sejtmembrán sérülésére utaló LDH enzim aktivitását a felülúszóban, valamint a lipid peroxidációra utaló malondialdehid szintet, amelyek az oxidatív stressz markerei. Ezekkel a módszerekkel bebizonyítottuk, hogy a 150+30 perces I/R modell alkalmas az oxidatív stressz okozta sejtkárosító hatások, valamint a hozzáadott sejtek regeneratív hatásának vizsgálatára. Kísérleteink első részében az I/R után hozzáadott, egészséges mezenhimális őssejtek regeneratív tulajdonságait, valamint a lehetséges hatásmechanizmust vizsgáltuk. A hozzáadott őssejtekkel 24 óráig növesztettük együtt a sérült kardiomioblasztokat, majd a sejtek morfológiája és ethidium homodimer festődésének segítségével néztük a sejtek pusztulásának mértékét. Megfigyeltük, hogy abban az esetben volt a legkisebb az elpusztult sejtek aránya a kontroll csoporthoz viszonyítva, ha az őssejteket közvetlenül adtuk a sérült kardiomioblasztokhoz. Amennyiben az őssejteket olyan inzertben adtuk a sérült sejtekhez, amelyben közös médiumban voltak, de a közvetlen sejt-sejt kapcsolatok kialakulását meggátolta, akkor az elpusztult sejtek aránya azonos volt a kontroll csoporttal. Ezekkel az inzertekkel azt lehetett vizsgálni, hogy a mezenhimális őssejtek által szekretált vegyületek, vagyis parakrin faktorok hozzájárulnak-e a megmentő, regenerációs folyamatokhoz. Az alkalmazott in vitro I/R modellel bemutattuk, hogy a károsodott kardiomioblasztok és őssejtek együtt-tenyésztésének jótékony hatása függ a közvetlen 59
sejt-sejt kapcsolatoktól. Ide sorolhatjuk a kísérleteinkben megfigyelt intercelluláris nanocsöveket is. Nanocsövek kialakulását endoteliális progenitor sejtek, szívizomsejtek [117, 192], immunsejtek és más sejttípusok között is kimutattak [118, 120, 193]. Jellemzésük feltárta, hogy ezek a filamentumok aktint tartalmaznak, mikroszómákat vagy mitokondriumokat találtak bennük [123]. A videomikroszkópos felvételeken megfigyeltük, hogy nanocsövek kialakulása gyakran megy végbe kardiomioblasztok és mezenhimális őssejtek között. MitoTracker-rel, a mitokondriumokat jelölő festékkel megfestve a sejteket, azt tapasztaltuk, hogy ezekben a csövekben funkcionális mitokondriumok is megtalálhatóak. A hozzáadott H9c2-vel végzett kísérletek során, amennyiben olyan sejteket alkalmaztunk, amelynek a mitokondriumait károsítottuk, a hozzáadott sejtek „megmentő” hatása elmaradt. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a mitokondriumok vagy a mitokondriumok egy része átjuthat egyik sejtből a másikba, és szerepük lehet az iszkémiában is károsodott kardiomioblasztok megmentésében. Spees
és
mtsai
kimutatták,
hogy
humán
mezenhimális
őssejtek
átadják
mitokondriumaikat az oxidatív foszforilációjukban károsított sejteknek [123]. Plotnikov és mtsai MSC-k és szívizomsejtek, illetve vese tubuláris sejtek között figyeltek meg mitokondriumáramlást,
aminek
feltételezhetően
szerepe
van
az
MSC-k
differenciálódásában a különböző fejlődési irányokba [192, 193]. A közvetlen sejt-sejt kapcsolatoknak nem csak az iszkémia után, hanem már iszkémia alatt is jelentőségük van. Az iszkémia alatt készült videomikroszkópos felvételeket kiértékelve azt találtuk, hogy azok a kardiomioblasztok, amelyek legalább két-három másik sejttel voltak kapcsolatban, szignifikánsan később kerekedtek fel és változott meg a morfológiájuk az egyedülálló sejtekhez képest. A megmentő hatás egyik lehetséges mechanizmusa az lehet, hogy a transzplantált sejtek parakrin faktorok szekréciójával fokozzák a regenerációt [194198]. Sadat és mtsai a zsírszövet eredetű őssejtek tenyésztő médiumát (kondicionált médium) használva mutatták ki az őssejtek kardioprotektív hatását [199]. Sejtinzerttel folytatott kísérleteink eredményei azonban azt mutatják, hogy a sejtek által szekretált parakrin faktorok szintje valószínűleg túl alacsony volt ahhoz, hogy megmentő hatást fejtsen ki a károsodott kardiomioblasztokra. Az alacsony koncentrációra magyarázat lehet, hogy csak egy napig tenyésztettük együtt a sejteket, ami kevés volt ahhoz, hogy a faktorok feldúsuljanak a tenyésztőmédiumban. A másik, in vivo kísérletekben is
60
gyakran megfigyelt jelenség a ko-kultivációs vizsgálatok során a sejtfúzió [110, 200202]. A videomikroszkópos felvételeken mi is találtunk néhány kettős festődésű, kétmagvú sejtet, ami azt jelzi, hogy sejtfúzió történt. Azonban, a sejtfúzió jelensége nagy variációt mutat a különböző tenyésztési és detektálási technikákkal, ezért a sejtfúzió mint egy in vitro artefakt jelenség nem zárható ki [194, 203]. Kísérleteink során csak néhány, megkérdőjelezhetetlen sejtfúziót figyeltünk meg, amely nem elégséges a nagyszámú károsodott kardiomioblaszt megmentéséhez [204]. Metzele és mtsai az általunk is használt Vybrant fluoreszcens festékkel azt mutatták ki, hogy 5 nap után az együtt tenyésztett szívizomsejtek és ASC-k 20%-a fúzionált [111]. Más csoportok is azt találták, hogy a sejtek 18%-a fúzionált egymással 4 nap után [203]. Vizsgálataink során szintén találtunk kettős festődésű, azonban egymagvú sejteket a kardiomioblasztok és az őssejtek együtt tenyésztése során, normál körülmények között is. Ez a kettős jelölődés a rövid idejű, direkt sejt-sejt kapcsolatok kialakulásának eredménye lehet. Ezen kapcsolatok kialakulása során a sejtek membránrészleteket cserélnek ki egymással, ezáltal a Vybrant festék az egyik sejtből a másik sejtbe kerülhet át. Feltételezhető lenne, hogy a Vybrant festékek réskapcsolatokon jutnak át. A réskapcsolatokon azonban legfeljebb 1000 Da nagyságú molekulák képesek átjutni, a Vybrant festékek pedig a foszfolipid kettős réteghez vannak kapcsolódva. Driesen és mtsai [116] kimutatták, hogy az alacsony molekulasúlyú sejtjelző anyagok, mint például a calcein réskapcsolatokon át tudnak jutni egyik sejtből a másikba, nagy molekulasúlyú anyagok pedig parciális sejtfúzió által, vagyis levonhatjuk a következtetést, hogy 24 óra után kísérleteinkben a „dye transfer” valószínűleg a rövid idejű, direkt sejt-sejt kapcsolatok következménye. A kísérleti protokoll időkerete szintén fontos. Kísérleteinkben az őssejteket iszkémia
után
30
perccel,
vagyis
korai
időpontban
adtuk
a
károsodott
kardiomioblasztokhoz, és a kísérleteket reperfúzió után 24 órával befejeztük, amíg még differenciáció nem történik. Fukahara és mtsai, illetve más kutatócsoportok is kimutatták, hogy csontvelői eredetű őssejtek úgy differenciálódnak szívizomsejtekké, ha a két sejttípust együtt növesztik 7 napig ko-kultúrában és a két sejttípus közvetlen sejt-sejt kapcsolatokat tud egymással kialakítani [124, 202, 205, 206]. He és mtsai azt tapasztalták, hogy a hozzáadott mezenhimális őssejtek a növekvő számú szívizomsejtek esetében koncentrációfüggő mértékben differenciálódtak, ha közvetlen sejt-sejt
61
kapcsolatot tudtak kialakítani. A differenciáció még kifejezettebb volt, ha a szívizomsejtekben előzőleg apoptózist indukáltak [202]. A kísérletek késői szakaszában a parakrin faktorok hatása valószínűleg nagyobb jelentősséggel bír, főleg a differenciációs folyamatokban [207, 208]. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az akut, regeneráló hatás kialakulásában nem a differenciáció játssza a fő szerepet. Az egészséges mezenhimális őssejtek tehát képesek közvetlen sejt-sejt kapcsolatok kialakításával javítani az iszkémiás sérülést szenvedett kardiomioblasztok túlélési esélyeit. Ez egy olyan mechanizmus, amit korábban nem említettek az őssejtek hatásai között iszkémiás állapotokban. Az őssejt-transzplantáció hatásossága nem csak a neovaszkularizációban és az elpusztult sejtek pótlásában nyilvánulhat meg, hanem abban, hogy az őssejtek megmentik a sérült sejteket. A hatás legvalószínűbb magyarázata az lehet, hogy az őssejtek javítják a károsodott kardiomioblasztok esélyét a túlélésre,
meggátolják
a
sejthalál
kialakulását,
aktiválják
a
regenerációs
mechanizmusokat a sérülés helyén [127, 209]. Kísérleteink másik részében az I/R modell kísérleti protokollját annyiban módosítottuk, hogy hozzáadott sejtekként a mezenhimális őssejtek helyett H9c2 kardiomioblasztokat használtunk. A hozzáadott H9c2 sejtek, az MSC-khez hasonlóan szignifikáns mértékben csökkentették az elpusztult H9c2 sejtek arányát a kontrollhoz viszonyítva. Kísérleteinkből kiderül, hogy nem csak a mezenhimális őssejtek, hanem más típusú sejtek is képesek csökkenteni az elpusztult sejtek számát. A klinikai vizsgálatok során a csontvelői eredetű hematopoetikus és mezenhimális őssejtek mellett alternatív sejtforrásként kipróbálták már a zsírszövet eredetű őssejteket, a szívből származó progenitor- és őssejteket illetve vázizomsejteket, amelyek szintén autológok és nagy mennyiségben izolálhatóak. A zsírszövet- és szíveredetű őssejtek esetében a klinikai vizsgálatok már lezajlottak, de az eredmények nem ismertek [90, 105, 144]. A vázizomsejtekkel már számos vizsgálatot folytattak, az egyik legismertebb a Menasché által végzett vizsgálat, amelyben a páciensek funkcionális eredményei nem mutattak javulást a kontroll csoporthoz képest, néha aritmia alakult ki a kezelt csoportban, de a kialakulás aránya nem tért el szignifikáns mértékben a kontrollhoz képest. Az oxidatív stressz markereit, az LDH és MDA szintet vizsgálva azt találtuk, hogy a hozzáadott H9c2 sejtek szignifikáns mértékben csökkentették mind a LDH enzim aktivitásával jellemezhető membránkárosodás mértékét, mind az MDA
62
koncentrációval jellemezhető lipid peroxidációt. Az MDA koncentráció a felülúszóban körülbelül háromszorosa volt a pelletben mérhető értékhez képest iszkémia után, vagyis nekrózis során a membránkárosodás hatására a képződött MDA nagy része kikerült a sejtből a felülúszóba. Ezt az eredményt az LDH enzimaktivitás mérés is megerősítette. Ezekkel a megfigyelésekkel azt a feltevést igazoltuk, hogy a hozzáadott sejtek jótékony hatása csökkenti az oxidatív stressz okozta károsodások mértékét, ami hozzájárulhat az I/R-ban sérült sejtek regenerációjához. Összefoglalva elmondhatjuk, hogy I/R-ban károsodott sejtek állapota javítható egészséges sejtek hozzáadásával. A hatás kialakulásában szerepe van annak, hogy a sérült
és
egészséges
sejtek
közvetlen
sejt-sejt
kapcsolatokat,
intercelluláris
nanocsöveket alakítanak ki egymás között és a „megmentő” sejtek megfelelő energiaállapotban vannak. Munkám során az I/R modell mellett in vitro hiperglikémia modellben vizsgáltam a mitokondriális ROS termelést, és szerepét a metabolikus memória kialakulásában. A metabolikus memória jelentősége abban áll, hogy hiperglikémiás periódus után normalizált glükózszint mellett is fenntartott marad a ROS termelés a sejtekben, és ez a diabétesz szövődményeinek kialakulásához vezethet. Kísérleteinket két endotél sejttípuson, humán köldökzsinór véna endotél sejteken és humán mikrovaszkuláris endotél sejteken végeztük. Azt találtuk, hogy 2 hétig magas, majd 1 hétig alacsony glükóztartalmú médiumban tenyészett sejtekben is fenntartott maradt a mitokondriális ROS termelés, ugyanúgy, mint a 3 hétig magas glükóztartalmú médiumban tenyésztett sejteknél. A jelenség kivédhető volt különböző gátlószerekkel, mint például az antioxidáns α-liponsavval, a mitokondriális ROS termelést gátló UCP2 fehérjével és a NADPH-oxidáz gátló apocyninnel. A kontroll szintjére azonban az értékek nem tértek vissza. Schisano és mtsai HUVEC sejteken kimutatták, hogy a 2 hétig naponta változtatott, magas és alacsony, majd egy 1 hétig alacsony glükóztartalmú médiumban („glükóz oszcilláció”) növesztett sejtek esetén még kifejezettebb volt az oxidatív stressz mértéke a 2 hétig magas, majd 1 hétig alacsony glükóztartalmú médiumban tenyészett sejtekhez képest [210]. Vagyis a metabolikus memória jelensége változó glükózkoncentráció után is megfigyelhető. A „glükóz oszcilláció” hatását korábban Quangliaro és mtsai mutatták ki HUVEC sejteken, azonban a metabolikus
63
memória jelenségét nem vizsgálták [211]. A „glükóz oszcilláció” jelenségét más kutatócsoportok is megfigyelték in vivo patkány diabétesz modellben. A kísérletekben alkalmazott, különböző inzulin kezelési frekvenciák eltérő vércukor ingadozásokat okoztak. A kifejezetten ingadozó csoportban az átlagos vércukorszint csökkenés ellenére magasabb fokú endotél diszfunkció, nitrotirozin szint emelkedés és PARP aktiváció volt kimutatható, mint a nem kezelt diabéteszes csoportban [212]. Ceriello és mtsai T2DM-es betegeket vizsgálva mutatták ki az oszcilláló vércukorszint endotél diszfunkciót előidéző hatásait [213]. A metabolikus memória jelenségére a klinikumban két, az 1990-es években 1-es és 2-es típusú diabéteszes betegek körében végzett, randomizált, kontrollált klinikai vizsgálat (DCCT/EDIC és UKPDS) eredményeinek kiértékelése után lettek figyelmesek [145, 146]. Mindkét vizsgálatban a betegeket két csoportba osztották, hagyományos vagy intenzív kezelésben részesültek. Kimutatták, hogy az intenzív kezelésben részesült betegekben (HbA1c ~7% a vizsgálat végén) szignifikánsan csökkent a mikrovaszkuláris szövődmények kialakulásának a kockázata a hagyományosan kezelt (HbA1c ~8-9% a vizsgálat
végén)
csoporthoz
képest.
Azonban
szignifikáns
összefüggést
a
kardiovaszkuláris szövődmények csökkenésével nem tudtak kimutatni. A 2000-es években több olyan klinikai vizsgálatot indítottak, amelyben célul tűzték ki annak megvizsgálását, hogy az intenzív kezelés (HbA1c célértéke <6% volt a vizsgálatok végén) hogyan befolyásolja a kardiovaszkuláris szövődmények alakulását. Azt mutatták ki, hogy az intenzív kezelésű csoportban hasonló volt vagy nőtt a mortalitás a hagyományosan kezelt csoporthoz képest [214]. Erre több magyarázat is született: az intenzív kezelésű csoportban megnőtt a hipoglikémiás esetek száma, súlygyarapodást melés, AGE termékek képél. Ezekből az eredményekből azt a következtetést vonták le, hogy a HbA1c célértéke 7% körül kell, hogy legyen. Az 1990-es években elkezdett vizsgálatok utánkövetése során is ez a célérték tűnik a megfelelőnek. Ezek az egymással ellentétes eredmények azt sugallják, hogy a vércukorszint szoros szabályozása önmagában nem elegendő a hosszútávon kialakuló szövődmények kivédésben, hanem más rizikófaktorok kontrollálása is szükséges. Meg kell azonban jegyezni, hogy a szövődmények létrejöttében a hagyományosan kezelt csoport esetében a metabolikus memória kialakulása mellett a napi vércukor-ingadozás is hozzájárulhat. Monnier és mtsai kimutatták, hogy 2-es típusú diabéteszes betegekben a napi vércukor-ingadozás
64
fokozottabb oxidatív stresszel jár, mint a tartósan fennálló hiperglikémiás állapot [215]. Ez egybecseng a fentebb említett, kísérletes körülmények között megfigyelt nagyobb mértékű oxidatív stressz kialakulásával „glükóz oszcilláció”-t követően. Összességében tehát elmondhatjuk, hogy a HbA1c szint ellenőrzése mellett, amely intenzív glikémiás kontrollal érhető el, az akut ingadozások korlátozására irányuló kezelés is csökkentheti a diabétesz szövődményeit. Mind az akut és a krónikus szövődmények kialakulásában a metabolikus memória fontos szerepet játszik. A vércukorszint helyreállítása mellett a másik fontos kérdés az AGE termékek szintjének és a RAGE expressziójának a csökkentése, mivel ezek a metabolikus memória kialakulásában közvetlen szerepet játszanak a mitokondriális fehérjék glikációjával, hozzájárulva ezzel a szövődmények kialakulásához [171]. Az AGE termékek képződését sikeresen gátolták in vitro metforminnal, pioglitazonnal [216]. A vérnyomáscsökkentő ACE-gátlókról vagy angiotenzin-1 receptor gátlószerekről pedig kimutatták, hogy megakadályozzák az AGE termékek képződését, sőt antioxidáns hatással is rendelkeznek [217]. Egy tiamin származékról, a benfotiaminról bebizonyították, hogy aktiválni képes a transzketolázt. Ez az enzim semlegesíteni tudja azokat az intermediereket, amelyek az emelkedett ROS termelésért felelősek. Kostolanska és mtsai T1DM-ben szenvedő gyerekeket vizsgáltak konvencionális vagy intenzív kezelést követően. Azt találták, hogy a glikációs végtermékképzés okozta oxidatív stressz kifejezettebb volt a konvencionális kezelés során a kontrollhoz képest [218]. Ez a tanulmány is azt sugallja, hogy a vércukorszint és a HbA1c ellenőrzése mellett más glikációs végtermékek koncentrációjának meghatározása is diagnosztikus értékű lenne.
65
6. Megállapítások 1. Eredményeink azt mutatják, hogy az iszkémia során károsodott szíveredetű sejtek túlélését a hozzáadott mezenhimális őssejtek fokozzák. a.
A hatásmechanizmust vizsgálva azt találtuk, hogy a regenerációs folyamatban fontos szerepük van a sejtek között kialakuló közvetlen kapcsolatoknak.
Ezek
során
részleges
membránkapcsolatok
vagy
intercelluláris nanocsövek jönnek létre. A két sejt között kialakult nanocsövekben mitokondriumokat figyeltünk meg. Ha a hozzáadott sejtek mitokondriumait károsítottuk, akkor ezek a sejtek nem javították a posztiszkémiás sejtek túlélési arányát. b.
A parakrin faktorok hatását vizsgálva 24 órával az iszkémia/reperfúzió után megállapítottuk, hogy a hozzáadott sejtek által szekretált anyagok mennyisége valószínűleg túl alacsony volt, hogy javítsa a sérült sejtek túlélését. A kísérlet időkerete a differenciációs folyamatok szempontjából is fontos. Irodalmi adatok szerint a mezenhimális őssejtek 5-7 nap után differenciálódnak szívizomsejtekké, vagyis modellünkben kizárható a differenciáció jelensége. Megfigyeltünk sejtfúziót is kardiomioblasztok és őssejtek között, azonban ez adataink és más közlemények szerint is olyan kis gyakorisággal fordul elő, hogy az összes megfigyelt jótékony hatás nem magyarázható ezzel. Modellünkben a hozzáadott sejtek akut regenerációs képessége vizsgálható, a kísérletek késői szakaszában a parakrin faktorok hatása és a differenciáció valószínűleg nagyobb jelentőséggel bír. Kimondhatjuk, hogy az őssejt-beültetés nem csak a sérült szívizom pótlásában vagy a neovaszkularizációban nyilvánulhat meg, hanem a sérült sejtek megmentésében is, az általunk bemutatott mechanizmusokon keresztül.
c.
Kísérleteink során kimutattuk az oxidatív stressz markereinek, az LDH enzim aktivitásnak és a malondialdehid koncentrációjának az emelkedését, amelyet a hozzáadott sejtek szignifikáns mértékben csökkentettek. A klinikai gyakorlatban a transzplantált őssejtek tehát azáltal is fokozzák a
66
regenerációt, hogy az iszkémia/reperfúzió során keletkező különböző reaktív oxigén és nitrogén származékokat eliminálni tudják. 2. Az in vitro hiperglikémia modellben az endotél sejteken kimutattuk a metabolikus memória jelenségét. A magas glükózkoncentráció perzisztáló hatásaként fennmaradó ROS termelést gátlószerekkel csökkenteni tudtuk, de az a kontroll szintre nem tért vissza. Ennek hátterében az állhat, hogy egyes mitokondriális fehérjék glikálódtak, amelyek tovább termelték normál körülmények között a reaktív származékokat, ezek pedig újabb AGE termékeket hoztak létre. Ez összhangban van a klinikai vizsgálatok során nyert eredményekkel is. Összefoglalva elmondhatjuk, hogy a metabolikus memória vizsgálata és a jelenség részletesebb megismerése fontos a diabétesz mikro- és makrovaszkuláris szövődményeinek megelőzésében.
67
7. Összefoglalás Az oxidatív és nitrozatív stressz szerepet játszik számos betegség, többek között az
iszkémiás
szívbetegség
és
a
diabétesz
mellitusz
és
szövődményeiknek
kialakulásában. Iszkémia/reperfúzió során a miokardium több metabolikus változáson megy keresztül, ami végül a szívizomsejtek elpusztulásához vezet. A miokardiális infarktus kezelése konvencionális és újabban sejtalapú terápiák alkalmazásával valósul meg. A több mint egy évtizede zajló vizsgálatok kimutatták, hogy a sejtalapú terápiák biztonsággal alkalmazhatóak, azonban sok esetben nem mutattak ki jelentős funkciójavulást. Ezért a károsodott és transzplantált sejtek között végbemenő élettani és molekuláris mechanizmusok részletesebb megismerése szükséges. Célunk a sejtek közötti hatásmechanizmus és az oxidatív stressz markereinek vizsgálata volt in vitro iszkémia modellben. Kísérleteinkben az iszkémiában károsodott kardiomioblasztok túlélését a hozzáadott mezenhimális őssejtek javították, ha közvetlen sejt-sejt kapcsolatokat
létesítettek.
Megfigyeltünk
nanocsőképződést,
amelyek
mitokondriumokat is tartalmaztak. Ha a hozzáadott sejtek mitokondriumait károsítottuk, akkor nem javították a posztiszkémiás sejtek túlélési arányát. Néhány esetben megfigyeltünk sejtfúziót, de ez olyan kis gyakorisággal fordult elő, hogy nem magyarázza az őssejtek jótékony hatását. A kísérlet időkerete kizárta a differenciáció, illetve a parakrin faktorok szerepét. Kimutattuk az oxidatív stressz markereinek, az LDH enzimaktivitásnak és a malondialdehid koncentrációjának az emelkedését iszkémia után, amelyet a hozzáadott sejtek szignifikáns mértékben csökkentettek. Diabétesz mellituszban a hiperglikémia indukálta oxidatív stressz hozzájárul a késői szövődmények kialakulásához. Egy elmélet szerint ennek hátterében a metabolikus memória jelensége áll. In vitro hiperglikémia modellben endotél sejteken a magas
glükózkoncentráció
perzisztáló
hatásaként
fennmaradó
ROS
termelést
vizsgáltuk, amelyet gátlószerekkel csökkenteni tudtuk, de az a kontroll szintre nem tért vissza. Ennek hátterében egyes mitokondriális fehérjék glikálódása állhat, amelyek normál körülmények között tovább termelik a reaktív származékokat. Összefoglalva
elmondhatjuk,
hogy
eredményeink
újabb
bizonyítékként
szolgálnak az oxidatív stressz iszkémiában és diabéteszben betöltött szerepéről, valamint hozzájárulhatnak ezen kórképek hatékonyabb kezeléséhez.
68
8. Summary Oxidative and nitrosative stress contributes to the development of several diseases and their complications such as ischemic heart disease or diabetes mellitus. The myocardium undergoes several metabolic changes during ischemia/reperfusion, which lead to the destruction of cardiomyocytes. Myocardial infarction can be treated using conventional and more recently cell based therapies. Investigations, ongoing for more than a decade, showed that cell based therapies are safe but in many cases no improvement in function were found. Therefore, more detailed knowledge of the physiological and molecular mechanisms between the injured and transplanted cells is required. Our aim was to investigate the mechanism of action of the added cells and the markers of the oxidative stress in an in vitro ischemia/reperfusion model. The transplanted mesenchymal stem cells improved the survival of the injured cardiomyoblasts via direct cell-to-cell interactions. Nanotube formation was observed and these tubes also contained mitochondria. If the added cells contained damaged mitochondria, these cells failed to improve the survival rate of the postischemic cells. Cell fusion was observed in some cases with low frequency, which could not explain the beneficial effect of stem cells. The time frame of the experiments ruled out the impact of paracrine factors and differentiation. There was an increase in the level of LDH enzyme activity and in the concentration of malondialdehyde after ischemia, which was significantly reduced by the addition of cells. Hyperglycemia induced oxidative stress in diabetes mellitus contributes to the development of late complications. It can be assumed that this phenomenon is driven by metabolic memory. The persistence of ROS production after high glucose incubation was investigated in an in vitro hyperglycemia model, which could be reduced with inhibitors but did not return to the control level. This could be explained with glycation of certain mitochondrial proteins, which continues to produce the reactive species in normal circumstances. In summary, our results provide further evidence of the role of oxidative stress in ischemic heart disease and diabetes and contribute to more efficient management of these disorders.
69
9. Irodalomjegyzék 1.
Allender, S., P. Scarborough, V. Peto, M. Rayner, J. Leal, R. Luengo-Fernández, and A. Gray, European cardiovascular disease statistics 2008. British Heart Foundation and University of Oxford, 2008.
2.
Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care, 2004. 27 Suppl 1: p. S5-S10.
3.
Daneman, D., Type 1 diabetes. The Lancet, 2006. 367(9513): p. 847-858.
4.
Karvonen, M., M. Viik-Kajander, E. Moltchanova, I. Libman, R. LaPorte, and J. Tuomilehto, Incidence of childhood type 1 diabetes worldwide. Diabetes Mondiale (DiaMond) Project Group. Diabetes Care, 2000. 23(10): p. 1516.
5.
Awdeh, Z.L., E.J. Yunis, M.J. Audeh, D. Fici, A. Pugliese, C.E. Larsen, and C.A. Alper, A genetic explanation for the rising incidence of type 1 diabetes, a polygenic disease. Journal of autoimmunity, 2006. 27(3): p. 174-181.
6.
Onkamo, P., S. Väänänen, M. Karvonen, and J. Tuomilehto, Worldwide increase in incidence of Type I diabetes – the analysis of the data on published incidence trends. Diabetologia, 1999. 42(12): p. 1395-1403.
7.
Wild, S., G. Roglic, A. Green, R. Sicree, and H. King, Global Prevalence of Diabetes. Diabetes Care, 2004. 27(5): p. 1047-1053.
8.
van Dieren, S., J.W.J. Beulens, Y.T. van der Schouw, D.E. Grobbee, and B. Neal, The global burden of diabetes and its complications: an emerging pandemic. European Journal of Cardiovascular Prevention & Rehabilitation. 17: p. S3-S8 10.1097/01.hjr.0000368191.86614.5a.
9.
Mathers, C., D.M. Fat, and J.T. Boerma, The global burden of disease: 2004 update. 2008: World Health Organization.
10.
Harris, M.I., R. Klein, T.A. Welborn, and M.W. Knuiman, Onset of NIDDM occurs at least 4-7 yr before clinical diagnosis. Diabetes Care, 1992. 15(7): p. 815.
11.
Mihm, M.J., C.M. Coyle, B.L. Schanbacher, D.M. Weinstein, and J.A. Bauer, Peroxynitrite induced nitration and inactivation of myofibrillar creatine kinase in experimental heart failure. Cardiovascular Research, 2001. 49(4): p. 798.
70
12.
Harrison, D., K.K. Griendling, U. Landmesser, B. Hornig, and H. Drexler, Role of oxidative stress in atherosclerosis* 1. The American journal of cardiology, 2003. 91(3): p. 7-11.
13.
Misra, M.K., M. Sarwat, P. Bhakuni, R. Tuteja, and N. Tuteja, Oxidative stress and ischemic myocardial syndromes. Medical science monitor: international medical journal of experimental and clinical research, 2009. 15(10).
14.
Dhalla, N.S., R.M. Temsah, and T. Netticadan, Role of oxidative stress in cardiovascular diseases. Journal of Hypertension, 2000. 18(6): p. 655.
15.
Elahi, M.M. and B.M. Matata, Free radicals in blood: Evolving concepts in the mechanism of ischemic heart disease. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2006. 450(1): p. 78-88.
16.
Fortuńo, A., S. Oliván, O. Beloqui, G. San José, M.U. Moreno, J. Díez, and G. Zalba, Association of increased phagocytic NADPH oxidase-dependent superoxide production with diminished nitric oxide generation in essential hypertension. Journal of Hypertension, 2004. 22(11): p. 2169.
17.
Rolo, A.P. and C.M. Palmeira, Diabetes and mitochondrial function: role of hyperglycemia and oxidative stress. Toxicol Appl Pharmacol, 2006. 212(2): p. 167-78.
18.
Giacco, F. and M. Brownlee, Oxidative Stress and Diabetic Complications. Circulation research. 107(9): p. 1058.
19.
Montagnier, L., R. Olivier, and C. Pasquier, Oxidative Stress in Cancer. AIDS and Neurodegenerative Diseases (New York, USA: Marcel Dekker, Inc), 1998.
20.
Ortona, E., P. Margutti, P. Matarrese, F. Franconi, and W. Malorni, Redox state, cell death and autoimmune diseases: a gender perspective. Autoimmunity reviews, 2008. 7(7): p. 579-584.
21.
Valko, M., H. Morris, and M.T. Cronin, Metals, toxicity and oxidative stress. Curr Med Chem, 2005. 12(10): p. 1161-208.
22.
Turrens, J.F., Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol, 2003. 552(Pt 2): p. 335-44.
23.
Ullrich, V. and M. Bachschmid, Superoxide as a Messenger of Endothelial Function. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000. 278(1): p. 1-8.
71
24.
Valko, M., D. Leibfritz, J. Moncol, M.T. Cronin, M. Mazur, and J. Telser, Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol, 2007. 39(1): p. 44-84.
25.
Xia, Y. and J.L. Zweier, Superoxide and peroxynitrite generation from inducible nitric oxide synthase in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997. 94(13): p. 6954-8.
26.
Xia, Y., V.L. Dawson, T.M. Dawson, S.H. Snyder, and J.L. Zweier, Nitric oxide synthase generates superoxide and nitric oxide in arginine-depleted cells leading to peroxynitrite-mediated cellular injury. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93(13): p. 6770-4.
27.
Schulz, E., T. Jansen, P. Wenzel, A. Daiber, and T. Munzel, Nitric oxide, tetrahydrobiopterin,
oxidative
stress,
and
endothelial
dysfunction
in
hypertension. Antioxid Redox Signal, 2008. 10(6): p. 1115-26. 28.
Masella, R., R. Di Benedetto, R. Vari, C. Filesi, and C. Giovannini, Novel mechanisms of natural antioxidant compounds in biological systems: involvement of glutathione and glutathione-related enzymes. J Nutr Biochem, 2005. 16(10): p. 577-86.
29.
Droge, W., Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev, 2002. 82(1): p. 47-95.
30.
Laursen, J.B., M. Somers, S. Kurz, L. McCann, A. Warnholtz, B.A. Freeman, M. Tarpey, T. Fukai, and D.G. Harrison, Endothelial regulation of vasomotion in apoE-deficient mice: implications for interactions between peroxynitrite and tetrahydrobiopterin. Circulation, 2001. 103(9): p. 1282-8.
31.
Boger, R.H., S.M. Bode-Boger, P.S. Tsao, P.S. Lin, J.R. Chan, and J.P. Cooke, An endogenous inhibitor of nitric oxide synthase regulates endothelial adhesiveness for monocytes. J Am Coll Cardiol, 2000. 36(7): p. 2287-95.
32.
Touyz, R.M. and E.L. Schiffrin, Reactive oxygen species in vascular biology: implications in hypertension. Histochem Cell Biol, 2004. 122(4): p. 339-52.
33.
Burke, T.M. and M.S. Wolin, Hydrogen peroxide elicits pulmonary arterial relaxation and guanylate cyclase activation. Am J Physiol, 1987. 252(4 Pt 2): p. H721-32.
72
34.
Mittal, C.K. and F. Murad, Activation of guanylate cyclase by superoxide dismutase and hydroxyl radical: a physiological regulator of guanosine 3',5'monophosphate formation. Proc Natl Acad Sci U S A, 1977. 74(10): p. 4360-4.
35.
White, A.A., K.M. Crawford, C.S. Patt, and P.J. Lad, Activation of soluble guanylate cyclase from rat lung by incubation or by hydrogen peroxide. J Biol Chem, 1976. 251(23): p. 7304-12.
36.
Ignarro, L.J. and P.J. Kadowitz, The pharmacological and physiological role of cyclic GMP in vascular smooth muscle relaxation. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 1985. 25: p. 171-91.
37.
Radomski, M.W., R.M. Palmer, and S. Moncada, The anti-aggregating properties of vascular endothelium: interactions between prostacyclin and nitric oxide. Br J Pharmacol, 1987. 92(3): p. 639-46.
38.
Keisari, Y., L. Braun, and E. Flescher, The oxidative burst and related phenomena in mouse macrophages elicited by different sterile inflammatory stimuli. Immunobiology, 1983. 165(1): p. 78-89.
39.
Lander, H.M., D.P. Hajjar, B.L. Hempstead, U.A. Mirza, B.T. Chait, S. Campbell, and L.A. Quilliam, A molecular redox switch on p21(ras). Structural basis for the nitric oxide-p21(ras) interaction. J Biol Chem, 1997. 272(7): p. 4323-6.
40.
Nathan, C.F. and R.K. Root, Hydrogen peroxide release from mouse peritoneal macrophages: dependence on sequential activation and triggering. J Exp Med, 1977. 146(6): p. 1648-62.
41.
Hampton, M.B., A.J. Kettle, and C.C. Winterbourn, Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood, 1998. 92(9): p. 3007-17.
42.
Schoonbroodt, S., S. Legrand-Poels, M. Best-Belpomme, and J. Piette, Activation of the NF-kappaB transcription factor in a T-lymphocytic cell line by hypochlorous acid. Biochem J, 1997. 321 ( Pt 3): p. 777-85.
43.
Beckman, K.B. and B.N. Ames, Oxidative Decay of DNA. Journal of Biological Chemistry, 1997. 272(32): p. 19633-19636.
44.
Dizdaroglu, M., Oxidative damage to DNA in mammalian chromatin. Mutation Research/DNAging, 1992. 275(3-6): p. 331-342.
73
45.
Roesner, J.P., J. Mersmann, S. Bergt, K. Bohnenberg, C. Barthuber, C. Szabo, G.E.F. Nöldge-Schomburg, and K. Zacharowski, Therapeutic injection of PARP inhibitor INO-1001 preserves cardiac function in porcine myocardial ischemia and reperfusion without reducing infarct size. Shock. 33(5): p. 507.
46.
Pacher, P., J.G. Mabley, F.G. Soriano, L. Liaudet, and C. Szabó, Activation of poly (ADP-ribose) polymerase contributes to the endothelial dysfunction associated with hypertension and aging. International journal of molecular medicine, 2002. 9: p. 659-664.
47.
Gonzalez-Rey, E., R. MartĂ-nez-Romero, F. O'Valle, R.o. Aguilar-Quesada, C. Conde, M. Delgado, and F.J. Oliver, Therapeutic Effect of a Poly(ADP-Ribose) Polymerase-1
Inhibitor
on
Experimental
Arthritis
by
Downregulating
Inflammation and Th1 Response. PLoS ONE, 2007. 2(10): p. e1071. 48.
Lord, C.J. and A. Ashworth, Targeted therapy for cancer using PARP inhibitors. Current Opinion in Pharmacology, 2008. 8(4): p. 363-369.
49.
Szabó, C., A. Biser, R. Benkő, E. Böttinger, and K. Suszták, Poly (ADP-ribose) polymerase inhibitors ameliorate nephropathy of type 2 diabetic Leprdb/db mice. Diabetes, 2006. 55(11): p. 3004.
50.
Abdelkarim, G.E., K. Gertz, C. Harms, J. Katchanov, U. Dirnagl, C. Szabo, and M. Endres, Protective effects of P34, a novel, potent inhibitor of poly (ADPribose) polymerase (PARP) in in vitro and in vivo models of stroke. International journal of molecular medicine, 2001. 7: p. 255-260.
51.
Marnett, L.J., Lipid peroxidation--DNA damage by malondialdehyde. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 1999. 424(1-2): p. 83-95.
52.
Marnett, L.J., Oxy radicals, lipid peroxidation and DNA damage. Toxicology, 2002. 181: p. 219-222.
53.
Dalle-Donne, I., A. Scaloni, D. Giustarini, E. Cavarra, G. Tell, G. Lungarella, R. Colombo,
R.
Rossi,
and
A.
Milzani,
Proteins
as
biomarkers
of
oxidative/nitrosative stress in diseases: the contribution of redox proteomics. Mass spectrometry reviews, 2005. 24(1): p. 55-99. 54.
Becker, L.B., New concepts in reactive oxygen species and cardiovascular reperfusion physiology. Cardiovascular Research, 2004. 61(3): p. 461.
74
55.
Lombardi, V., L. Valko, S. Štolc, M. Valko, O. Ondreji ková, L. Horáková, J. Pla ek, and A. Troncone, Free radicals in rabbit spinal cord ischemia: Electron spin resonance spectroscopy and correlation with SOD activity. Cellular and molecular neurobiology, 1998. 18(4): p. 399-412.
56.
Morin, D., R. Assaly, S. Paradis, and A. Berdeaux, Inhibition of mitochondrial membrane
permeability
as
a
putative
pharmacological
target
for
cardioprotection. Current medicinal chemistry, 2009. 16(33): p. 4382. 57.
Yellon, D.M. and D.J. Hausenloy, Myocardial reperfusion injury. New England Journal of Medicine, 2007. 357(11): p. 1121.
58.
Chambers, D.E., D.A. Parks, G. Patterson, R. Roy, J.M. McCord, S. Yoshida, L.F. Parmley, and J.M. Downey, Xanthine oxidase as a source of free radical damage in myocardial ischemia. Journal of molecular and cellular cardiology, 1985. 17(2): p. 145-152.
59.
Granger, D.N., K.Y. Stokes, T. Shigematsu, W.H. Cerwinka, A. Tailor, and C.F. Krieglstein, Splanchnic ischaemia–reperfusion injury: mechanistic insights provided by mutant mice. Acta Physiologica Scandinavica, 2001. 173(1): p. 8391.
60.
Hess, M.L. and N.H. Manson, Molecular oxygen: friend and foe. The role of the oxygen free radical system in the calcium paradox, the oxygen paradox and ischemia/reperfusion injury. Journal of molecular and cellular cardiology, 1984. 16(11): p. 969.
61.
Park, J.L. and B.R. Lucchesi, Mechanisms of myocardial reperfusion injury. The Annals of thoracic surgery, 1999. 68(5): p. 1905-1912.
62.
Ferrari, R., C. Ceconi, S. Curello, C. Guarnieri, C.M. Caldarera, A. Albertini, and O. Visioli, Oxygen-mediated myocardial damage during ischameia and reperfusion: Role of the cellular defences against oxygen toxicity. Journal of molecular and cellular cardiology, 1985. 17(10): p. 937-945.
63.
Palace, V., D. Kumar, M.F. Hill, N. Khaper, and P.K. Singal, Regional differences in non-enzymatic antioxidants in the heart under control and oxidative stress conditions. Journal of molecular and cellular cardiology, 1999. 31(1): p. 193-202.
75
64.
Godin,
D.V.
and
M.E.
Garnett,
Altered
antioxidant
status
in
the
ischemic/reperfused rabbit myocardium: effects of allopurinol. The Canadian journal of cardiology, 1989. 5(7): p. 365. 65.
Leichtweis, S. and L.L. Ji, Glutathione deficiency intensifies ischaemia reperfusion induced cardiac dysfunction and oxidative stress. Acta Physiologica Scandinavica, 2001. 172(1): p. 1-10.
66.
Alberola, A., L. Such, F. Gill, R. Zaragozaz, and E.J. Morcillo, Protective effect of N-acetylcysteine on ischaemia-induced myocardial damage in canine heart. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology, 1991. 343(5): p. 505-510.
67.
Nishinaka, Y., S. Sugiyama, M. Yokota, H. Saito, and T. Ozawa, The effects of a high dose of ascorbate on ischemia-reperfusion-induced mitochondrial dysfunction in canine hearts. Heart and vessels, 1992. 7(1): p. 18-23.
68.
Gottlieb, R.A., K.O. Burleson, R.A. Kloner, B.M. Babior, and R.L. Engler, Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation, 1994. 94(4): p. 1621.
69.
Kajstura, J., W. Cheng, K. Reiss, W.A. Clark, E.H. Sonnenblick, S. Krajewski, J.C. Reed, G. Olivetti, and P. Anversa, Apoptotic and necrotic myocyte cell deaths are independent contributing variables of infarct size in rats. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology, 1996. 74(1): p. 86.
70.
Baines, C.P., R.A. Kaiser, N.H. Purcell, N.S. Blair, H. Osinska, M.A. Hambleton, E.W. Brunskill, M.R. Sayen, R.A. Gottlieb, and G.W. Dorn, Loss of cyclophilin D reveals a critical role for mitochondrial permeability transition in cell death. Nature, 2005. 434(7033): p. 658-662.
71.
Nakagawa, T., S. Shimizu, T. Watanabe, O. Yamaguchi, K. Otsu, H. Yamagata, H. Inohara, T. Kubo, and Y. Tsujimoto, Cyclophilin D-dependent mitochondrial permeability transition regulates some necrotic but not apoptotic cell death. Nature, 2005. 434(7033): p. 652-658.
72.
Dimmeler, S., J. Burchfield, and A.M. Zeiher, Cell-Based Therapy of Myocardial Infarction. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2007.
73.
Antonio Giordano, U.G.I.R.M., From the laboratory bench to the patient's bedside: An update on clinical trials with mesenchymal stem cells. Journal of Cellular Physiology, 2007. 211(1): p. 27-35.
76
74.
Jawad, H., A.R. Lyon, S.E. Harding, N.N. Ali, and A.R. Boccaccini, Myocardial tissue engineering. Br Med Bull, 2008. 87(1): p. 31-47.
75.
Nussbaum, J., E. Minami, M.A. Laflamme, J.A.I. Virag, C.B. Ware, A. Masino, V. Muskheli, L. Pabon, H. Reinecke, and C.E. Murry, Transplantation of undifferentiated murine embryonic stem cells in the heart: teratoma formation and immune response. The FASEB Journal, 2007. 21(7): p. 1345-1357.
76.
Das, S., M. Bonaguidi, K. Muro, and J.A. Kessler, Generation of embryonic stem cells: limitations of and alternatives to inner cell mass harvest. Neurosurg Focus, 2008. 24(3-4): p. E4.
77.
Caspi, O., I. Huber, I. Kehat, M. Habib, G. Arbel, A. Gepstein, L. Yankelson, D. Aronson, R. Beyar, and L. Gepstein, Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Improves Myocardial Performance in Infarcted Rat Hearts. Journal of the American College of Cardiology, 2007. 50(19): p. 1884-1893.
78.
Thomson, J.A., J. Itskovitz-Eldor, S.S. Shapiro, M.A. Waknitz, J.J. Swiergiel, V.S. Marshall, and J.M. Jones, Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science, 1998. 282(5391): p. 1145-1147.
79.
Takahashi, K., K. Tanabe, M. Ohnuki, M. Narita, T. Ichisaka, K. Tomoda, and S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 2007. 131(5): p. 861-72.
80.
Nelson, T.J., A. Martinez-Fernandez, S. Yamada, Y. Ikeda, C. Perez-Terzic, and A. Terzic, Induced pluripotent stem cells: advances to applications. Stem cells and cloning: advances and applications. 3: p. 29.
81.
Nelson, T.J., A. Martinez-Fernandez, S. Yamada, C. Perez-Terzic, Y. Ikeda, and A. Terzic, Repair of Acute Myocardial Infarction by Human Stemness Factors Induced Pluripotent Stem Cells. Circulation, 2009. 120(5): p. 408-416.
82.
Shim, W., A. Mehta, S.Y. Lim, G. Zhang, C.H. Lim, T. Chua, and P. Wong, GCSF for stem cell therapy in acute myocardial infarction: friend or foe? Cardiovascular Research. 89(1): p. 20-30.
83.
Weissman, I.L., Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell, 2000. 100(1): p. 157-68.
77
84.
Orlic, D., J. Kajstura, S. Chimenti, I. Jakoniuk, S.M. Anderson, B. Li, J. Pickel, R. McKay, B. Nadal-Ginard, D.M. Bodine, A. Leri, and P. Anversa, Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature, 2001. 410(6829): p. 701.
85.
Dittmar, T., J. Seidel, K.S. Zaenker, and B. Niggemann, Carcinogenesis driven by bone marrow-derived stem cells. Contrib Microbiol, 2006. 13: p. 156-69.
86.
Silva, G.V., S. Litovsky, J.A.R. Assad, A.L.S. Sousa, B.J. Martin, D. Vela, S.C. Coulter, J. Lin, J. Ober, W.K. Vaughn, R.V.C. Branco, E.M. Oliveira, R. He, Y.J. Geng, J.T. Willerson, and E.C. Perin, Mesenchymal Stem Cells Differentiate into an Endothelial Phenotype, Enhance Vascular Density, and Improve Heart Function in a Canine Chronic Ischemia Model. Circulation, 2005. 111(2): p. 150-156.
87.
Kudo, M., Y. Wang, M.A. Wani, M. Xu, A. Ayub, and M. Ashraf, Implantation of bone marrow stem cells reduces the infarction and fibrosis in ischemic mouse heart. Journal of molecular and cellular cardiology, 2003. 35(9): p. 1113-1119.
88.
Madonna, R. and R. De Caterina, Adipose tissue: a new source for cardiovascular repair. Journal of Cardiovascular Medicine. 11(2): p. 71-80.
89.
Wilson, A., P.E. Butler, and A.M. Seifalian, Adipose-derived stem cells for clinical applications: a review. Cell Proliferation. 44(1): p. 86-98.
90.
Mazo, M., J. Gavira, B. Pelacho, and F. Prosper, Adipose-derived Stem Cells for Myocardial Infarction. Journal of Cardiovascular Translational Research: p. 1-9.
91.
Kuliczkowski, W., R. Derzhko, I. Prajs, M. Podolak-Dawidziak, and V.L. Serebruany, Endothelial Progenitor Cells and Left Ventricle Function in Patients
With
Acute
Myocardial
Infarction:
Potential
Therapeutic
Considertions. Am J Ther. 92.
Anversa, P., A. Leri, M. Rota, T. Hosoda, C. Bearzi, K. Urbanek, J. Kajstura, and R. Bolli, Concise review: stem cells, myocardial regeneration, and methodological artifacts. Stem Cells, 2007. 25(3): p. 589-601.
93.
Barile, L., E. Messina, A. Giacomello, and E. Marbán, Endogenous Cardiac Stem Cells. Progress in Cardiovascular Diseases. 50(1): p. 31-48.
78
94.
Anversa, P., M. Rota, K. Urbanek, T. Hosoda, E.H. Sonnenblick, A. Leri, J. Kajstura, and R. Bolli, Myocardial aging--a stem cell problem. Basic Res Cardiol, 2005. 100(6): p. 482-93.
95.
Bearzi, C., M. Rota, T. Hosoda, J. Tillmanns, A. Nascimbene, A. De Angelis, S. Yasuzawa-Amano, I. Trofimova, R.W. Siggins, N. Lecapitaine, S. Cascapera, A.P. Beltrami, D.A. D'Alessandro, E. Zias, F. Quaini, K. Urbanek, R.E. Michler, R. Bolli, J. Kajstura, A. Leri, and P. Anversa, Human cardiac stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(35): p. 14068-73.
96.
Oh, H., S.B. Bradfute, T.D. Gallardo, T. Nakamura, V. Gaussin, Y. Mishina, J. Pocius, L.H. Michael, R.R. Behringer, D.J. Garry, M.L. Entman, and M.D. Schneider, Cardiac progenitor cells from adult myocardium: Homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003. 100(21): p. 1231312318.
97.
Urbanek, K., D. Torella, F. Sheikh, A. De Angelis, D. Nurzynska, F. Silvestri, C.A. Beltrami, R. Bussani, A.P. Beltrami, F. Quaini, R. Bolli, A. Leri, J. Kajstura, and P. Anversa, Myocardial regeneration by activation of multipotent cardiac stem cells in ischemic heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005. 102(24): p. 8692-7.
98.
Walther, G., J. Gekas, and O.F. Bertrand, Amniotic stem cells for cellular cardiomyoplasty: Promises and premises. Catheterization and Cardiovascular Interventions, 2009. 73(7): p. 917-924.
99.
Da Sacco, S., R.E. De Filippo, and L. Perin, Amniotic fluid as a source of pluripotent and multipotent stem cells for organ regeneration. Curr Opin Organ Transplant.
100.
Lee, M., I. Jang, K. Yoo, K. Sung, and H. Koo, Stem and progenitor cells in human umbilical cord blood. International Journal of Hematology. 92(1): p. 4551.
101.
Yeh, Y.-C., W.-Y. Lee, C.-L. Yu, S.-M. Hwang, M.-F. Chung, L.-W. Hsu, Y. Chang, W.-W. Lin, M.-S. Tsai, H.-J. Wei, and H.-W. Sung, Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immunesuppressed rat model. Biomaterials. 31(25): p. 6444-6453.
79
102.
Sondergaard, C.S., D.A. Hess, D.J. Maxwell, C. Weinheimer, I. Rosova, M.H. Creer, D. Piwnica-Worms, A. Kovacs, L. Pedersen, and J.A. Nolta, Human cord blood progenitors with high aldehyde dehydrogenase activity improve vascular density in a model of acute myocardial infarction. J Transl Med. 8: p. 24.
103.
Horackova, M., R. Arora, R. Chen, J.A. Armour, P.A. Cattini, R. Livingston, and Z. Byczko, Cell transplantation for treatment of acute myocardial infarction: unique capacity for repair by skeletal muscle satellite cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2004. 287(4): p. H1599-1608.
104.
Kristen,
F.,
F.
Brian,
M.
Niladri,
L.
Jinqiu,
and
R.L.
Kenneth,
Electrophysiological consequence of skeletal myoblast transplantation in normal and infarcted canine myocardium. Heart rhythm : the official journal of the Heart Rhythm Society, 2006. 3(4): p. 452-461. 105.
Menasche, P., O. Alfieri, S. Janssens, W. McKenna, H. Reichenspurner, L. Trinquart, J.-T. Vilquin, J.-P. Marolleau, B. Seymour, J. Larghero, S. Lake, G. Chatellier, S. Solomon, M. Desnos, and A.A. Hagege, The Myoblast Autologous Grafting in Ischemic Cardiomyopathy (MAGIC) Trial: First Randomized Placebo-Controlled Study of Myoblast Transplantation. Circulation, 2008. 117(9): p. 1189-1200.
106.
Scorsin, M., A. Hagege, J.-T. Vilquin, M. Fiszman, F. Marotte, J.-L. Samuel, L. Rappaport, K. Schwartz, and P. Menasche, Comparison of the effects of fetal cardiomyocyte and skeletal myoblast transplantation on postinfarction left ventricular function. J Thorac Cardiovasc Surg, 2000. 119(6): p. 1169-1175.
107.
Badorff, C., R.P. Brandes, R. Popp, S. Rupp, C. Urbich, A. Aicher, I. Fleming, R. Busse, A.M. Zeiher, and S. Dimmeler, Transdifferentiation of Blood-Derived Human
Adult
Endothelial
Progenitor Cells Into Functionally Active
Cardiomyocytes. Circulation, 2003. 107(7): p. 1024-1032. 108.
Labovsky, V., E.L. Hofer, L. Feldman, V. Fernández Vallone, H. García Rivello, A. Bayes-Genis, A. Hernando Insúa, M.J. Levin, and N.A. Chasseing, Cardiomyogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal cells: Role of cardiac extract from neonatal rat cardiomyocytes. Differentiation. 79(2): p. 93-101.
80
109.
Murry, C.E., M.H. Soonpaa, H. Reinecke, H. Nakajima, H.O. Nakajima, M. Rubart, K.B. Pasumarthi, J.I. Virag, S.H. Bartelmez, V. Poppa, G. Bradford, J.D. Dowell, D.A. Williams, and L.J. Field, Haematopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts. Nature, 2004. 428(6983): p. 664-8.
110.
Nygren, J.M., S. Jovinge, M. Breitbach, P. Sawen, W. Roll, J. Hescheler, J. Taneera, B.K. Fleischmann, and S.E. Jacobsen, Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med, 2004. 10(5): p. 494-501.
111.
Metzele, R., C. Alt, X. Bai, Y. Yan, Z. Zhang, Z. Pan, M. Coleman, J. Vykoukal, Y.-H. Song, and E. Alt, Human adipose tissue-derived stem cells exhibit proliferation potential and spontaneous rhythmic contraction after fusion with neonatal rat cardiomyocytes. The FASEB Journal.
112.
Kajstura, J., M. Rota, B. Whang, S. Cascapera, T. Hosoda, C. Bearzi, D. Nurzynska, H. Kasahara, E. Zias, M. Bonafe, B. Nadal-Ginard, D. Torella, A. Nascimbene, F. Quaini, K. Urbanek, A. Leri, and P. Anversa, Bone marrow cells differentiate in cardiac cell lineages after infarction independently of cell fusion. Circ Res, 2005. 96(1): p. 127-37.
113.
Nguyen, B.-K., S. Maltais, L. Perrault, J.-F. Tanguay, J.-C. Tardif, L.-M. Stevens, M. Borie, F. Harel, S. Mansour, and N. Noiseux, Improved Function and Myocardial Repair of Infarcted Heart by Intracoronary Injection of Mesenchymal Stem Cell-Derived Growth Factors. Journal of Cardiovascular Translational Research. 3(5): p. 547-558.
114.
Gnecchi, M., H. He, O.D. Liang, L.G. Melo, F. Morello, H. Mu, N. Noiseux, L. Zhang, R.E. Pratt, J.S. Ingwall, and V.J. Dzau, Paracrine action accounts for marked protection of ischemic heart by Akt-modified mesenchymal stem cells. Nat Med, 2005. 11(4): p. 367-8.
115.
Sadat, S., S. Gehmert, Y.H. Song, Y. Yen, X. Bai, S. Gaiser, H. Klein, and E. Alt, The cardioprotective effect of mesenchymal stem cells is mediated by IGF-I and VEGF. Biochem Biophys Res Commun, 2007. 363(3): p. 674-9.
116.
Driesen, R.B., G.D. Dispersyn, F.K. Verheyen, S.M. van den Eijnde, L. Hofstra, F. Thone, P. Dijkstra, W. Debie, M. Borgers, and F.C. Ramaekers, Partial cell
81
fusion: a newly recognized type of communication between dedifferentiating cardiomyocytes and fibroblasts. Cardiovasc Res, 2005. 68(1): p. 37-46. 117.
Koyanagi, M., R.P. Brandes, J. Haendeler, A.M. Zeiher, and S. Dimmeler, Cellto-Cell Connection of Endothelial Progenitor Cells With Cardiac Myocytes by Nanotubes: A Novel Mechanism for Cell Fate Changes? Circ Res, 2005. 96(10): p. 1039-1041.
118.
Onfelt, B., S. Nedvetzki, K. Yanagi, and D.M. Davis, Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. J Immunol, 2004. 173(3): p. 1511-3.
119.
Gerdes, H.-H. and R.N. Carvalho, Intercellular transfer mediated by tunneling nanotubes. Current Opinion in Cell Biology, 2008. 20(4): p. 470.
120.
Onfelt, B., M.A. Purbhoo, S. Nedvetzki, S. Sowinski, and D.M. Davis, Longdistance calls between cells connected by tunneling nanotubules. Sci STKE, 2005. 2005(313): p. pe55.
121.
Gurke, S., J.F.V. Barroso, E. Hodneland, N.V. Bukoreshtliev, O. Schlicker, and H.-H. Gerdes, Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells. Experimental Cell Research, 2008. 314(20): p. 3669.
122.
He, K., W. Luo, Y. Zhang, F. Liu, D. Liu, L. Xu, L. Qin, C. Xiong, Z. Lu, X. Fang, and Y. Zhang, Intercellular Transportation of Quantum Dots Mediated by Membrane Nanotubes. ACS Nano. 4(6): p. 3015-3022.
123.
Spees, J.L., S.D. Olson, M.J. Whitney, and D.J. Prockop, Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(5): p. 1283-8.
124.
Fukuhara, S., S. Tomita, S. Yamashiro, T. Morisaki, C. Yutani, S. Kitamura, and T. Nakatani, Direct cell-cell interaction of cardiomyocytes is key for bone marrow stromal cells to go into cardiac lineage in vitro. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 2003. 125(6): p. 1470.
125.
Rangappa, S., J.W. Entwistle, A.S. Wechsler, and J.Y. Kresh, Cardiomyocytemediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg, 2003. 126(1): p. 124-32.
82
126.
Ball, S.G., A.C. Shuttleworth, and C.M. Kielty, Direct cell contact influences bone marrow mesenchymal stem cell fate. Int J Biochem Cell Biol, 2004. 36(4): p. 714-27.
127.
Mazhari, R. and J.M. Hare, Mechanisms of action of mesenchymal stem cells in cardiac repair: potential influences on the cardiac stem cell niche. Nat Clin Pract Cardiovasc Med, 2007. 4 Suppl 1: p. S21-6.
128.
Ince, H., M. Petzsch, H.D. Kleine, H. Schmidt, T. Rehders, T. Korber, C. Schumichen, M. Freund, and C.A. Nienaber, Preservation from left ventricular remodeling by front-integrated revascularization and stem cell liberation in evolving acute myocardial infarction by use of granulocyte-colony-stimulating factor (FIRSTLINE-AMI). Circulation, 2005. 112(20): p. 3097.
129.
Leone, A.M., L. Galiuto, B. Garramone, S. Rutella, M.B. Giannico, S. Brugaletta, M. Perfetti, G. Liuzzo, I. Porto, and F. Burzotta, Usefulness of granulocyte colony-stimulating factor in patients with a large anterior wall acute myocardial infarction to prevent left ventricular remodeling (the rigenera study). The American journal of cardiology, 2007. 100(3): p. 397-403.
130.
Takano, H., H. Hasegawa, Y. Kuwabara, T. Nakayama, K. Matsuno, Y. Miyazaki, M. Yamamoto, Y. Fujimoto, H. Okada, and S. Okubo, Feasibility and safety of granulocyte colony-stimulating factor treatment in patients with acute myocardial infarction. International journal of cardiology, 2007. 122(1): p. 4147.
131.
Zohlnhofer, D., A. Dibra, T. Koppara, A. de Waha, R.S. Ripa, J. Kastrup, M. Valgimigli, A. Schomig, and A. Kastrati, Stem Cell Mobilization by Granulocyte Colony-Stimulating Factor for Myocardial Recovery After Acute Myocardial Infarction: A Meta-Analysis. J Am Coll Cardiol, 2008. 51(15): p. 1429-1437.
132.
Sanz-Ruiz, R., E. Gutierrez Ibanes, A.V. Arranz, M.E. Fernandez Santos, P.L. Fernandez, and F. Fernandez-Aviles, Phases I-III Clinical Trials Using Adult Stem Cells. Stem Cells Int. 2010: p. 579142.
133.
Adler, D.S., H. Lazarus, R. Nair, J.L. Goldberg, N.J. Greco, T. Lassar, M.J. Laughlin, H. Das, and V.J. Pompili, Safety and efficacy of bone marrow-derived autologous CD133+ stem cell therapy. Front Biosci (Elite Ed). 3: p. 506-14.
83
134.
Tendera, M., W. Wojakowski, W. Rużyłło, L. Chojnowska, C. Kępka, W.a. Tracz, P. Musiałek, W.a. Piwowarska, J. Nessler, P. Buszman, S. Grajek, P. Bręborowicz, M. Majka, and M.Z. Ratajczak, Intracoronary infusion of bone marrow-derived selected CD34+CXCR4+ cells and non-selected mononuclear cells in patients with acute STEMI and reduced left ventricular ejection fraction: results of randomized, multicentre Myocardial Regeneration by Intracoronary Infusion of Selected Population of Stem Cells in Acute Myocardial Infarction (REGENT) Trial. European Heart Journal, 2009. 30(11): p. 1313-1321.
135.
Mansour, S., D.-C. Roy, V. Bouchard, B. Nguyen, L. Stevens, F. Gobeil, A. Rivard, G. Leclerc, F. Reeves, and N. Noiseux, COMPARE-AMI Trial: Comparison of Intracoronary Injection of CD133<sup>+ Bone Marrow Stem Cells to Placebo in Patients After Acute Myocardial Infarction and Left Ventricular Dysfunction: Study Rationale and Design. Journal of Cardiovascular Translational Research. 3(2): p. 153-159.
136.
Shao-liang, C., F. Wu-wang, Y. Fei, L. Yu-Hao, Q. Jun, S. Shou-jie, Z. Jun-jie, C. Robert Zhao, L. Lian-ming, L. Song, and S. Jing-ping, Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology, 2004. 94(1): p. 92-95.
137.
Wollert, K.C., G.P. Meyer, J. Lotz, S. Ringes Lichtenberg, P. Lippolt, C. Breidenbach, S. Fichtner, T. Korte, B. Hornig, D. Messinger, L. Arseniev, B. Hertenstein, A. Ganser, and H. Drexler, Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. The Lancet, 2004. 364(9429): p. 141-148.
138.
Schächinger, V., S. Erbs, A. Elsässer, W. Haberbosch, R. Hambrecht, H. Hölschermann, J. Yu, R. Corti, D.G. Mathey, C.W. Hamm, T. Süselbeck, B. Assmus, T. Tonn, S. Dimmeler, and A.M. Zeiher, Intracoronary Bone Marrow–Derived Progenitor Cells in Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine, 2006. 355(12): p. 1210-1221.
139.
Huikuri, H.V., K. Kervinen, M. Niemelä, K. Ylitalo, M. Säily, P. Koistinen, E.-R. Savolainen, H. Ukkonen, M. Pietilä, J.K.E. Airaksinen, J. Knuuti, and
84
T.H. Mäkikallio, Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. European Heart Journal, 2008. 29(22): p. 2723-2732. 140.
van der Laan, A., A. Hirsch, R. Nijveldt, P.A. van der Vleuten, W.J. van der Giessen, P.A. Doevendans, J. Waltenberger, J.M. Ten Berg, W.R. Aengevaeren, J.J. Zwaginga, B.J. Biemond, A.C. van Rossum, J.G. Tijssen, F. Zijlstra, and J.J. Piek, Bone marrow cell therapy after acute myocardial infarction: the HEBE trial in perspective, first results. Neth Heart J, 2008. 16(12): p. 436-9.
141.
Lunde, K., S. Solheim, S. Aakhus, H. Arnesen, M. Abdelnoor, T. Egeland, K. Endresen, A. Ilebekk, A. Mangschau, J.G. Fjeld, H.J. Smith, E. Taraldsrud, H.K. Grogaard, R. Bjornerheim, M. Brekke, C. Muller, E. Hopp, A. Ragnarsson, J.E. Brinchmann, and K. Forfang, Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N Engl J Med, 2006. 355(12): p. 1199-209.
142.
Janssens, S., C. Dubois, J. Bogaert, K. Theunissen, C. Deroose, W. Desmet, M. Kalantzi, L. Herbots, P. Sinnaeve, J. Dens, J. Maertens, F. Rademakers, S. Dymarkowski, O. Gheysens, J. Van Cleemput, G. Bormans, J. Nuyts, A. Belmans, L. Mortelmans, M. Boogaerts, and F. Van de Werf, Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. The Lancet, 2006. 367(9505): p. 113-121.
143.
Abdel-Latif, A., R. Bolli, I.M. Tleyjeh, V.M. Montori, E.C. Perin, C.A. Hornung, E.K. Zuba-Surma, M. Al-Mallah, and B. Dawn, Adult bone marrowderived cells for cardiac repair: a systematic review and meta-analysis. Arch Intern Med, 2007. 167(10): p. 989-97.
144.
D'Alessandro, D.A. and R.E. Michler, Current and future status of stem cell therapy in heart failure. Curr Treat Options Cardiovasc Med. 12(6): p. 614-27.
145.
The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. N Engl J Med, 1993. 329(14): p. 977-86.
85
146.
Intensive blood-glucose control with sulphonylureas or insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patients with type 2 diabetes (UKPDS 33). UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. Lancet, 1998. 352(9131): p. 837-53.
147.
Gaede, P., H. Lund-Andersen, H.H. Parving, and O. Pedersen, Effect of a multifactorial intervention on mortality in type 2 diabetes. N Engl J Med, 2008. 358(6): p. 580-91.
148.
Ramasamy, R. and I.J. Goldberg, Aldose Reductase and Cardiovascular Diseases, Creating Human-Like Diabetic Complications in an Experimental Model. Circulation research. 106(9): p. 1449.
149.
Giardino, I., D. Edelstein, and M. Brownlee, Nonenzymatic glycosylation in vitro and in bovine endothelial cells alters basic fibroblast growth factor activity. A model for intracellular glycosylation in diabetes. The Journal of Clinical Investigation, 1994. 94(1): p. 110-117.
150.
McLellan, A.C., P.J. Thornalley, J. Benn, and P.H. Sonksen, Glyoxalase system in clinical diabetes mellitus and correlation with diabetic complications. Clin Sci (Lond), 1994. 87(1): p. 21-9.
151.
Charonis, A.S., L.A. Reger, J.E. Dege, K. Kouzi-Koliakos, L.T. Furcht, R.M. Wohlhueter, and E.C. Tsilibary, Laminin alterations after in vitro nonenzymatic glycosylation. Diabetes, 1990. 39(7): p. 807-14.
152.
Schmidt, A.M., O. Hori, J.X. Chen, J.F. Li, J. Crandall, J. Zhang, R. Cao, S.D. Yan, J. Brett, and D. Stern, Advanced glycation endproducts interacting with their endothelial receptor induce expression of vascular cell adhesion molecule1 (VCAM-1) in cultured human endothelial cells and in mice. A potential mechanism for the accelerated vasculopathy of diabetes. J Clin Invest, 1995. 96(3): p. 1395-403.
153.
Skolnik, E.Y., Z. Yang, Z. Makita, S. Radoff, M. Kirstein, and H. Vlassara, Human and rat mesangial cell receptors for glucose-modified proteins: potential role in kidney tissue remodelling and diabetic nephropathy. J Exp Med, 1991. 174(4): p. 931-9.
86
154.
Abaci, A., S. Kahraman, N.K. Eryol, H. Arinc, and A. Ergin, Effect of diabetes mellitus on formation of coronary collateral vessels. Circulation, 1999. 99(17): p. 2239.
155.
Lander, H.M., J.M. Tauras, J.S. Ogiste, O. Hori, R.A. Moss, and A.M. Schmidt, Activation of the receptor for advanced glycation end products triggers a p21 ras-dependent mitogen-activated protein kinase pathway regulated by oxidant stress. Journal of Biological Chemistry, 1997. 272(28): p. 17810.
156.
Li, J. and A.M. Schmidt, Characterization and functional analysis of the promoter of RAGE, the receptor for advanced glycation end products. Journal of Biological Chemistry, 1997. 272(26): p. 16498.
157.
Schmidt, A.M., O. Hori, J.X. Chen, J.F. Li, J. Crandall, J. Zhang, R. Cao, S.D. Yan, J. Brett, and D. Stern, Advanced glycation endproducts interacting with their endothelial receptor induce expression of vascular cell adhesion molecule1 (VCAM-1) in cultured human endothelial cells and in mice. A potential mechanism for the accelerated vasculopathy of diabetes. Journal of Clinical Investigation, 1995. 96(3): p. 1395.
158.
Soro-Paavonen, A., A. Watson, J. Li, K. Paavonen, A. Koitka, A.C. Calkin, D. Barit, M.T. Coughlan, B.G. Drew, and G.I. Lancaster, Receptor for advanced glycation end products (RAGE) deficiency attenuates the development of atherosclerosis in diabetes. Diabetes, 2008. 57(9): p. 2461.
159.
Feener, E.P., P. Xia, T. Inoguchi, T. Shiba, M. Kunisaki, and G.L. King, Role of protein kinase C in glucose-and angiotensin II-induced plasminogen activator inhibitor expression. Contributions to nephrology, 1996. 118: p. 180.
160.
Williams, B., B. Gallacher, H. Patel, and C. Orme, Glucose-induced protein kinase C activation regulates vascular permeability factor mRNA expression and peptide production by human vascular smooth muscle cells in vitro. Diabetes, 1997. 46(9): p. 1497.
161.
Gabriely, I., M. Xiao, J.A. Cases, H. Xiao, L. Rossetti, and N. Barzilai, Hyperglycemia induces PAI-1 gene expression in adipose tissue by activation of the hexosamine biosynthetic pathway. Atherosclerosis, 2002. 160(1): p. 115-122.
162.
Du, X., T. Matsumura, D. Edelstein, L. Rossetti, Z. Zsengellér, C. Szabó, and M. Brownlee, Inhibition of GAPDH activity by poly (ADP-ribose) polymerase
87
activates three major pathways of hyperglycemic damage in endothelial cells. Journal of Clinical Investigation, 2003. 112(7): p. 1049-1057. 163.
Nascimento, N.R.F., L.M.A. Lessa, M.R. Kerntopf, C.M. Sousa, R.S. Alves, M.G.R. Queiroz, J. Price, D.B. Heimark, J. Larner, X. Du, M. Brownlee, A. Gow, C. Davis, and M.C. Fonteles, Inositols prevent and reverse endothelial dysfunction in diabetic rat and rabbit vasculature metabolically and by scavenging superoxide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006. 103(1): p. 218-223.
164.
Brownlee, M., The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes, 2005. 54(6): p. 1615-25.
165.
Engerman, R.L. and T.S. Kern, Progression of incipient diabetic retinopathy during good glycemic control. Diabetes, 1987. 36(7): p. 808.
166.
Roy, S., R. Sala, E. Cagliero, and M. Lorenzi, Overexpression of fibronectin induced by diabetes or high glucose: phenomenon with a memory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1990. 87(1): p. 404.
167.
Complica, H.E.M., Effect of intensive therapy on the microvascular complications of type 1 diabetes mellitus. Jama, 2002. 287: p. 2563-2569.
168.
Nathan, D.M., P.A. Cleary, J.Y. Backlund, S.M. Genuth, J.M. Lachin, T.J. Orchard, P. Raskin, and B. Zinman, Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1 diabetes. 2005.
169.
Kowluru, R.A., Effect of reinstitution of good glycemic control on retinal oxidative stress and nitrative stress in diabetic rats. Diabetes, 2003. 52(3): p. 818.
170.
Kowluru, R.A., S.N. Abbas, and S. Odenbach, Reversal of hyperglycemia and diabetic nephropathy:: Effect of reinstitution of good metabolic control on oxidative stress in the kidney of diabetic rats. Journal of Diabetes and its Complications, 2004. 18(5): p. 282-288.
171.
Rosca, M.G., T.G. Mustata, M.T. Kinter, A.M. Ozdemir, T.S. Kern, L.I. Szweda, M. Brownlee, V.M. Monnier, and M.F. Weiss, Glycation of mitochondrial proteins from diabetic rat kidney is associated with excess
88
superoxide formation. American Journal of Physiology- Renal Physiology, 2005: p. 00415.2004. 172.
Ceriello, A., M.A. Ihnat, and J.E. Thorpe, The "Metabolic Memory": Is More Than Just Tight Glucose Control Necessary to Prevent Diabetic Complications? J Clin Endocrinol Metab, 2009. 94(2): p. 410-415.
173.
Rabbani, N., S.S. Alam, S. Riaz, J.R. Larkin, M.W. Akhtar, T. Shafi, and P.J. Thornalley, High-dose thiamine therapy for patients with type 2 diabetes and microalbuminuria: a randomised, double-blind placebo-controlled pilot study. Diabetologia, 2009. 52(2): p. 208-212.
174.
Hammes, H.P., X. Du, D. Edelstein, T. Taguchi, T. Matsumura, Q. Ju, J. Lin, A. Bierhaus, P. Nawroth, and D. Hannak, Benfotiamine blocks three major pathways of hyperglycemic damage and prevents experimental diabetic retinopathy. Nature Medicine, 2003. 9(3): p. 294-299.
175.
Yi, X., V. Nickeleit, L.R. James, and N. Maeda, [alpha]-Lipoic acid protects diabetic apolipoprotein E-deficient mice from nephropathy. Journal of Diabetes and its Complications. In Press, Corrected Proof.
176.
Mijnhout, G.S., A. Alkhalaf, N. Kleefstra, and H.J.G. Bilo, alpha lipoic acid: a new treatment for neuropathic pain in patients with diabetes? editorial inforMation, 2009. 24: p. 157.
177.
Thallas-Bonke, V., S.R. Thorpe, M.T. Coughlan, K. Fukami, F.Y.T. Yap, K.C. Sourris, S.A. Penfold, L.A. Bach, M.E. Cooper, and J.M. Forbes, Inhibition of NADPH Oxidase Prevents Advanced Glycation End Product–Mediated Damage in Diabetic Nephropathy Through a Protein Kinase C-α–Dependent Pathway. Diabetes, 2008. 57(2): p. 460-469.
178.
Roe, N.D., D.P. Thomas, and J. Ren, Inhibition of NADPH oxidase alleviates experimental diabetes-induced myocardial contractile dysfunction. Diabetes, Obesity and Metabolism: p. no-no.
179.
Shen, X., S. Zheng, N.S. Metreveli, and P.N. Epstein, Protection of cardiac mitochondria by overexpression of MnSOD reduces diabetic cardiomyopathy. Diabetes, 2006. 55(3): p. 798.
180.
Salvemini, D., Z.Q. Wang, J.L. Zweier, A. Samouilov, H. Macarthur, T.P. Misko, M.G. Currie, S. Cuzzocrea, J.A. Sikorski, and D.P. Riley, A nonpeptidyl
89
mimic of superoxide dismutase with therapeutic activity in rats. Science, 1999. 286(5438): p. 304. 181.
Kimes, B.W. and B.L. Brandt, Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental Cell Research, 1976. 98(2): p. 367-381.
182.
Sardao, V.A., P.J. Oliveira, J. Holy, C.R. Oliveira, and K.B. Wallace, Vital imaging
of
H9c2
myoblasts
exposed
to
tert-butylhydroperoxide--
characterization of morphological features of cell death. BMC Cell Biol, 2007. 8: p. 11. 183.
Tropel, P., D. Noel, N. Platet, P. Legrand, A.L. Benabid, and F. Berger, Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from adult mouse bone marrow. Exp Cell Res, 2004. 295(2): p. 395-406.
184.
Urbán, V.S., J. Kiss, J. Kovács, E. Gócza, V. Vas, Edot, v. Monostori, and F. Uher, Mesenchymal Stem Cells Cooperate with Bone Marrow Cells in Therapy of Diabetes. Stem Cells, 2008. 26(1): p. 244-253.
185.
Qian, H. and D. Liu, The time course of malondialdehyde production following impact injury to rat spinal cord as measured by microdialysis and high pressure liquid chromatography. Neurochemical research, 1997. 22(10): p. 1231-1236.
186.
Fantin, V.R., M.J. Berardi, L. Scorrano, S.J. Korsmeyer, and P. Leder, A novel mitochondriotoxic small molecule that selectively inhibits tumor cell growth. Cancer Cell, 2002. 2(1): p. 29-42.
187.
Sardao, V.A., P.J. Oliveira, J. Holy, C.R. Oliveira, and K.B. Wallace, Morphological alterations induced by doxorubicin on H9c2 myoblasts: nuclear, mitochondrial, and cytoskeletal targets. Cell Biol Toxicol, 2009. 25(3): p. 22743.
188.
Kumar, S. and S.L. Sitasawad, N-acetylcysteine prevents glucose/glucose oxidase-induced oxidative stress, mitochondrial damage and apoptosis in H9c2 cells. Life Sciences, 2009. 84(11-12): p. 328-336.
189.
Park, C., H.S. So, C.H. Shin, S.H. Baek, B.S. Moon, S.H. Shin, H.S. Lee, D.W. Lee, and R.K. Park, Quercetin protects the hydrogen peroxide-induced apoptosis via inhibition of mitochondrial dysfuntion in H9c2 cardiomyoblast cells. Biochemical Pharmacology, 2003. 66(7): p. 1287-1295.
90
190.
Borchi, E., M. Parri, L. Papucci, M. Becatti, N. Nassi, P. Nassi, and C. Nediani, Role of NADPH oxidase in H9c2 cardiac muscle cells exposed to simulated ischaemia-reperfusion. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2009. 13(8b): p. 2724-2735.
191.
Zhang, Y., Y. Kakinuma, M. Ando, R.G. Katare, F. Yamasaki, T. Sugiura, and T. Sato, Acetylcholine inhibits the hypoxia-induced reduction of connexin43 protein in rat cardiomyocytes. J Pharmacol Sci, 2006. 101(3): p. 214-22.
192.
Plotnikov, E.Y., T.G. Khryapenkova, A.K. Vasileva, M.V. Marey, S.I. Galkina, N.K. Isaev, E.V. Sheval, V.Y. Polyakov, G.T. Sukhikh, and D.B. Zorov, Cell-tocell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in coculture. J Cell Mol Med, 2008. 12(5A): p. 1622-31.
193.
Plotnikov, E.Y., T.G. Khryapenkova, S.I. Galkina, G.T. Sukhikh, and D.B. Zorov, Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. Exp Cell Res. 316(15): p. 2447-55.
194.
Menasche, P., You Can't Judge a Book by Its Cover. Circulation, 2006. 113(10): p. 1275-1277.
195.
Gnecchi, M., Z. Zhang, A. Ni, and V.J. Dzau, Paracrine Mechanisms in Adult Stem Cell Signaling and Therapy. Circ Res, 2008. 103(11): p. 1204-1219.
196.
Paul, W.M.F., Paracrine Effects of Cell Transplantation: Modifying Ventricular Remodeling in the Failing Heart. Seminars in thoracic and cardiovascular surgery, 2008. 20(2): p. 87.
197.
Takahashi, M., T.S. Li, R. Suzuki, T. Kobayashi, H. Ito, Y. Ikeda, M. Matsuzaki, and K. Hamano, Cytokines produced by bone marrow cells can contribute to functional improvement of the infarcted heart by protecting cardiomyocytes from ischemic injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006. 291(2): p. H886-93.
198.
Uemura, R., M. Xu, N. Ahmad, and M. Ashraf, Bone marrow stem cells prevent left ventricular remodeling of ischemic heart through paracrine signaling. Circ Res, 2006. 98(11): p. 1414-21.
199.
Sadat, S., S. Gehmert, Y.-H. Song, Y. Yen, X. Bai, S. Gaiser, H. Klein, and E. Alt, The cardioprotective effect of mesenchymal stem cells is mediated by IGF-I
91
and VEGF. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007. 363(3): p. 674-679. 200.
Ishikawa, F., H. Shimazu, L.D. Shultz, M. Fukata, R. Nakamura, B. Lyons, K. Shimoda, S. Shimoda, T. Kanemaru, K. Nakamura, H. Ito, Y. Kaji, A.C. Perry, and M. Harada, Purified human hematopoietic stem cells contribute to the generation of cardiomyocytes through cell fusion. Faseb J, 2006. 20(7): p. 9502.
201.
Lacza, Z., E. Horvath, and D.W. Busija, Neural stem cell transplantation in cold lesion: a novel approach for the investigation of brain trauma and repair. Brain Research Protocols, 2003. 11(3): p. 145.
202.
He, X., M. Chen, S.H. Li, S. Liu, Y. Zhong, H.Y. McDonald Kinkaid, W.Y. Lu, R.D. Weisel, and R.K. Li, Co-culture with cardiomyocytes enhanced the myogenic conversion of mesenchymal stromal cells in a dose-dependent manner. Molecular and cellular biochemistry. 339(1): p. 89-98.
203.
Garbade, J., A. Schubert, A.J. Rastan, D. Lenz, T. Walther, J.F. Gummert, S. Dhein, and F.-W. Mohr, Fusion of bone marrow-derived stem cells with cardiomyocytes in a heterologous in vitro model. European Journal of CardioThoracic Surgery, 2005. 28(5): p. 685.
204.
Rose, R.A., H. Jiang, X. Wang, S. Helke, J.N. Tsoporis, N. Gong, S.C. Keating, T.G. Parker, P.H. Backx, and A. Keating, Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells express cardiac-specific markers, retain the stromal phenotype, and do not become functional cardiomyocytes in vitro. Stem Cells, 2008. 26(11): p. 2884-92.
205.
Xu, M., M. Wani, Y.S. Dai, J. Wang, M. Yan, A. Ayub, and M. Ashraf, Differentiation of bone marrow stromal cells into the cardiac phenotype requires intercellular communication with myocytes. Circulation, 2004. 110(17): p. 2658-65.
206.
Wang, T., Z. Xu, W. Jiang, and A. Ma, Cell-to-cell contact induces mesenchymal stem cell to differentiate into cardiomyocyte and smooth muscle cell. Int J Cardiol, 2006. 109(1): p. 74-81.
207.
Dai, W., S.L. Hale, B.J. Martin, J.-Q. Kuang, J.S. Dow, L.E. Wold, and R.A. Kloner, Allogeneic Mesenchymal Stem Cell Transplantation in Postinfarcted Rat
92
Myocardium: Short- and Long-Term Effects. Circulation, 2005. 112(2): p. 214223. 208.
Kinnaird, T., E. Stabile, M.S. Burnett, C.W. Lee, S. Barr, S. Fuchs, and S.E. Epstein, Marrow-derived stromal cells express genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms. Circ Res, 2004. 94(5): p. 678-85.
209.
Moore, K.A. and I.R. Lemischka, Stem cells and their niches. Science, 2006. 311(5769): p. 1880-5.
210.
Schisano, B., G. Tripathi, K. McGee, P.G. McTernan, and A. Ceriello, Glucose oscillations, more than constant high glucose, induce p53 activation and a metabolic memory in human endothelial cells. Diabetologia: p. 1-8.
211.
Quagliaro, L., L. Piconi, R. Assaloni, L. Martinelli, E. Motz, and A. Ceriello, Intermittent High Glucose Enhances Apoptosis Related to Oxidative Stress in Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Diabetes, 2003. 52(11): p. 2795-2804.
212.
Horvath, E.M., R. Benko, L. Kiss, M. Muranyi, T. Pek, K. Fekete, T. Barany, A. Somlai, A. Csordas, and C. Szabo, Rapid 'glycaemic swings' induce nitrosative stress, activate poly(ADP-ribose) polymerase and impair endothelial function in a rat model of diabetes mellitus. Diabetologia, 2009. 52(5): p. 952-61.
213.
Ceriello, A., K. Esposito, L. Piconi, M.A. Ihnat, J.E. Thorpe, R. Testa, M. Boemi, and D. Giugliano, Oscillating glucose is more deleterious to endothelial function and oxidative stress than mean glucose in normal and type 2 diabetic patients. Diabetes, 2008. 57(5): p. 1349.
214.
Dluhy, R.G. and G.T. McMahon, Intensive Glycemic Control in the ACCORD and ADVANCE Trials. New England Journal of Medicine, 2008. 358(24): p. 2630-2633.
215.
Monnier, L., E. Mas, C. Ginet, F. Michel, L. Villon, J.P. Cristol, and C. Colette, Activation of oxidative stress by acute glucose fluctuations compared with sustained chronic hyperglycemia in patients with type 2 diabetes. JAMA: The Journal of the American Medical Association, 2006. 295(14): p. 1681.
216.
Rahbar, S., R. Natarajan, K.K. Yerneni, S. Scott, N. Gonzales, and J.L. Nadler, Evidence that pioglitazone, metformin and pentoxifylline are inhibitors of glycation. Clinica Chimica Acta, 2000. 301(1-2): p. 65-77.
93
217.
Miyata, T., C. van Ypersele de Strihou, Y. Ueda, K. Ichimori, R. Inagi, H. Onogi, N. Ishikawa, M. Nangaku, and K. Kurokawa, Angiotensin II receptor antagonists and angiotensin-converting enzyme inhibitors lower in vitro the formation of advanced glycation end products: biochemical mechanisms. Journal of the American Society of Nephrology, 2002. 13(10): p. 2478.
218.
Kostolanska, J. and V. Jakus, HbA1c and Serum Levels of Advanced Glycation and Oxidation Protein Products in Poorly and Well Controlled Children and Adolescents with Type 1 Diabetes Mellitus. Journal of pediatric endocrinology & metabolism, 2009. 22(5): p. 433-442.
94
10. Publikációs lista
A PhD értekezés tárgyát képező közlemények: 1.
A. Cselenyak, E. Pankotai, E.M. Horvath, L. Kiss, and Z. Lacza, Mesenchymal stem cells rescue cardiomyoblasts from cell death in an in vitro ischemia model via direct cell-to-cell connections. BMC Cell Biol, 2010. 11: p. 29.; IF:2,654
2.
Ihnat, M.A., J.E. Thorpe, C.D. Kamat, C. Szabo, D.E. Green, L.A. Warnke, Z. Lacza, A. Cselenyak, K. Ross, S. Shakir, L. Piconi, R.C. Kaltreider, and A. Ceriello, Reactive oxygen species mediate a cellular 'memory' of high glucose stress signalling. Diabetologia, 2007. 50(7): p. 1523-31.; IF: 5,822
3.
Cselenyák A., Benkő Zs., Szepes M., Horváth EM, Lacza Zs., Kiss L.: Az őssejtek
szerepe
a
szívinfarktus
kezelésében:
kísérletes
módszer
a
hatásmechanizmus vizsgálatára, Érbetegségek, 2011/1. 3-11.
Egyéb lektorált tudományos közlemények: 1.
A. Csordas, E. Pankotai, J.A. Snipes, A. Cselenyak, Z. Sarszegi, A. Cziraki, B. Gaszner, L. Papp, R. Benko, L. Kiss, E. Kovacs, M. Kollai, C. Szabo, D.W. Busija, and Z. Lacza, Human heart mitochondria do not produce physiologically relevant quantities of nitric oxide. Life Sci, 2007. 80(7): p. 633-7; IF: 2,257
2.
D. Horváthy, P. Nardai, T. Major, K. Schandl, A. Cselenyák, G. Vácz, L. Kiss, M. Szendrői, and Z. Lacza, Muscle regeneration is undisturbed by repeated polytraumatic injury. European Journal of Trauma and Emergency Surgery, 2010: p. 1-7.; IF: 0,207
3.
Kiss L., Dongó E., Janicsek Z., Szepes M., Benkő Zs., Cselenyák A., Lacza Zs.: Őssejtterápia alkalmazásának eredményei perifériás artériás érbetegségben, Érbetegségek, 2010/03. 33-38.
4.
A. Méndez-Vilas, J. Díaz: Microscopy Book Series: Microscopy: Science, Technology, Applications and Education, Nr. 4, Volume 1: A. Cselenyák, E. Pankotai, A. Csordás, L. Kiss, and Z. Lacza: “Live-Cell Fluorescent Imaging of 95
Membrane or Mitochondrion Transfer between Connected Cells in Culture, p764-771, Formatex (2011), Spain
96
11. Köszönetnyilvánítás Doktori értekezésem végén szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Dr. Lacza Zsombornak, aki az elmúlt évek során sok hasznos gyakorlati és elméleti tapasztalatot adott át nekem, mindvégig segítette a munkámat. Szeretném megköszönni Dr. Kollai Márknak és Dr. Benyó Zoltánnak, hogy a Klinikai Kísérleti Kutató- és Humán Élettani Intézetben biztosították számomra a PhD kutatómunkámhoz szükséges feltételeket. Köszönöm a segítséget Csordás Attilának, Dr. Horváth Eszter Máriának, Dr. Kiss Leventének, Dr. Pankotai Eszternek, a többi munkatársamnak a laborban, a tudományos diákköri hallgatóknak, az összes társszerzőnek és az intézet összes dolgozójának. Végül köszönettel tartozom szüleimnek, feleségemnek és barátaimnak, akik mindig mellettem álltak, segítettek a munkámban és támogattak a döntéseimben.
97
12. Mellékletek
98
